SK282870B6

SK282870B6 - Spôsob izolácie imunostimulačného glukánu z hlivy ustricovej

Info

Publication number: SK282870B6
Application number: SK548-2001A
Authority: SK
Inventors: Leona Gabri�Ov�
Original assignee: Pleuran, S. R. O.
Priority date: 2001-04-23
Filing date: 2001-04-23
Publication date: 2003-01-09
Also published as: HU228643B1; ES2247104T3; SK5482001A3; ATE301678T1; EP1397389A1; DE60112623D1; WO2002085950A1; CZ293310B6; DE60112623T2; CZ20031404A3; HUP0303916A3; EP1397389B1; HUP0303916A2

Abstract

Spôsob izolácie imunostimulačného glukánu z plodníc hlivy ustricovej (Pleurotus ostreatus), výhodne z hlúbikov defibráciou, následným bielením peroxidom vodíka pri teplote 15 až 25 °C počas 15 až 24 hod. v prostredí roztoku hydroxidu sodného a dehydratáciou, spočíva v tom, že defibrácia, ktorá predchádza bieleniu peroxidom vodíka v prostredí roztoku hydroxidu sodného pri hustote nerozpustného glukánu 4 až 5 % hmotn. a dehydratácii, sa uskutočňuje do 26 hod. po zbere hlivy ustricovej skladovanej pri teplote 4 až 8 °C. Defibrácia sa uskutočňuje v prostredí najmenej dvojnásobného množstva vodného roztoku uhličitanu sodného alebo draselného s koncentráciou 0,05 až 0,15 % hmotn., pri pH roztoku 8 až 9, počas 1 až 8 min. za vzniku reakčnej suspenzie, ktorá sa ďalej bieli peroxidom vodíka v prostredí roztoku hydroxidu sodného s koncentráciou 0,05 až 0,09 % hmotn. a získaný nerozpustný glukán sa dehydratuje etanolom alebo acetónom, alebo lyofilizáciou.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu izolácie imunostimulačného glukánu z hlivy ustricovej (Pleurotus ostreatus), výhodne z hlúbikov defibráciou, následným bielením peroxidom vodíka a dehydratáciou.

Doterajší stav techniky

Je dostatočne známe, že niektoré prírodné polysacharidy sa vyznačujú imunostimulačnými a inými farmakologickými vlastnosťami. Sú to spravidla tie polysacharidy, ktoré majú v hlavnom polysacharidovom reťazci prísne 0-(l,3)-D-glykozidickú väzbu, ktorá je hlavným nositeľom ich imunostimulačnej aktivity.

Imunostimulačné polysacharidy sa vyskytujú v bunkových stenách baktérií, kvasiniek a viacerých húb, hlavne rodu Basidiomycetes /Di LUZIO, N.R., CHIHARA, G.:Adv. Imunopharmacol. 1, 477 (1981); JAQUES, P.J.: Imunomodulator polysacharides, str. 429 - 438 v Current conceptprs in human immunology and cancer immunomodulation: Eds SCRRON, B. et al.: Elsevier Biomed. Press B.V. (1982); CHIHARA, G.: EOS riv. Immunol. Immunofarm. 4, 85 (1984).

Imunofarmakologicky aktívne látky, t. j. aj fl-(l,3)-D-glukány pôsobiace na základné obranné systémy hostiteľa môžu pozitívne ovplyvniť počet, funkčnú aktivitu a interakcie makrofágov T a B lymfocytov, NK buniek, ako i ich humorálne a sekrétorické komponenty. Môžu teda nešpecifický modifikovať rozsiahly súbor bakteriálnych, hubových, parazitárnych a vírusových infekcií. Mechanizmus pôsobenia glukánov sa teda výrazne odlišuje od mechanizmu pôsobenia chemoterapeutík a antibiotík (TRNOVEC a spol.: Farm. obzor 56, 271 (1987); OSTAD, E., SELJELICH, R.: Actapath. Microbiol. Scand.88, 97, (1980); LEHNBORG, G., HEDSTRÓM, K.G., NORD, C.E.: J. Reticuloendothel. Soc. 32, 347(1982).

Aj ďalšie práce potvrdzujú, že imunostimulačné glukány sú látky, ktoré si zasluhujú mimoriadnu pozornosť pri liečbe i prevencii mnohých ochorení. Tak napríklad je overené, že imunoglukány zvyšujú imunitu proti rôznym bakteriálnym a vírusovým ochoreniam, majú protirakovinový účinok, potencujú účinok pri rádioterapii onkologických pacientov. (KOMASU, N. a spol.: US pat. 3, 943 247 (1976), MIYACH1, M. a spol.: Gcr. Offen 3, 032636 (1981), PATCHEM, M.: Surv. Imunol. Re. 2, 237 (1983), POSPÍŠIL a spol.: Experiencia38, 1232(1982).

V súčasnosti sa v priemyselnom meradle vyrábajú β(l,3)-D-glukány hlavne z kvasiniek a niektorých húb rodu Basidiomycetes.

Hlavnými nedostatkami glukánu z kvasníc je pomerne náročná technológia, nízky výťažok glukánu (okolo 5 % na sušinu kvasníc) a vysoké nároky na elimináciu odpadových alkalických roztokov. Výhodou fungálnych glukánov je predovšetkým technologická jednoduchosť a okolo 30 až 50 %-ný výťažok glukánu na sušinu vstupnej suroviny.

Momentálne sú známe dva spôsoby izolácie glukánu z hlivy ustricovej, a to buď studenou alebo horúcou extrakciou plodníc (KUNIAK, Ľ. A spol.: CS patent č. 274 918 a CS patent č. 276 192), pri ktorých možno dosiahnuť až 50 %-ný výťažok imunostimulačného glukánu na sušinu hlivy ustricovej.

Pri spôsobe podľa CS patentu č. 274 918, pri ktorom sa použije v prvom stupni na extrakciu neglukánových zložiek hydroxid sodný s koncentráciou 0,1 až 0,2 M/l, počas extrakcie sa rozpúšťa aj časť vodorozpustného glukánu v množstve 10 až 15 % na sušinu vstupnej suroviny.

Podrobnejším štúdiom chemických zmien proteínovej časti hlivy ustricovej, ktoré prebiehajú pri teplote 95 až 100 °C s 0,1 až 0,2 M roztokom NaOH sa zistilo, že časť proteínov sa denaturuje a stáva sa nerozpustná, t. j. zvyšuje sa obsah dusíka vo finálnom glukáne a časť sa alkalickou hydrolýzou transformuje na oligopeptidy, resp. na aminokyseliny za tvorby tmavých kondenzačných produktov, ktoré sa sorbujú na glukáne a znižujú belosť hotového nerozpustného glukánu.

Cieľom predmetného vynálezu je zvýšiť výťažok nerozpustného glukánu ajeho belosť pri minimálnej tvorbe odpadových alkalických roztokov.

Podstata vynálezu

Tento cieľ do značnej miery rieši spôsob izolácie imunostimulačného glukánu z hlivy ustricovej, výhodne z hlúbikov, defibráciou, následným bielením peroxidom vodíka pri teplote 15 až 25 °C počas 15 až 24 hod. v prostredí roztoku hydroxidu sodného a dehydratáciou, ktorého podstata spočíva v tom, že defibrácia, ktorá predchádza bieleniu peroxidom vodíka v prostredí roztoku hydroxidu sodného, sa uskutočňuje do 26 hod. po zbere hlivy ustricovej.

Dôkladnejším štúdiom glukánového podielu hlivy ustricovej sa zistilo, že tento sa skladá z dvoch častí, jedna časť je vodorozpustná, predstavujúca oligopeptidy, resp. aminokyseliny, a druhá časť je vo vode nerozpustná a je tvorená denaturovanými proteínmi, to znamená, že obsahuje zvýšený obsah dusíka. Pomer vodorozpustného glukánu k nerozpustnému glukánu je asi 1 : 2. Tento pomer však platí v čase, keď plodnicu oddelíme od substrátu, t. j. v čase bezprostredne po zbere. Ak však hliva ustricová po zbere je skladovaná, tak dochádza k autolýze glukánu prítomným enzýmom β-(1,3)-D-glukanázou. Aby sa spomalila autolýza glukánu defíbráciu hlivy ustricovej je potrebné uskutočniť najneskôr do 26 hod. po jej zbere.

Taktiež sa zistilo, že hydrolýza glukánu sa značne zvyšuje pri vyššej teplote. Ak teplota skladovania je okolo 20 °C a vyššia, potom rozsah hydrolýzy je úmerný teplote a dĺžke skladovania. Pri autolýze stúpa vodorozpustný podiel glukánu na úkor vodonerozpustného podielu. Zistilo sa, že je nevyhnutné hlivu ustricovú skladovať pri teplote 4 až 8 °C.

Defibrácia sa uskutočňuje v prostredí najmenej dvojnásobného množstva vodného roztoku uhličitanu sodného alebo draselného s koncentráciou 0,05 až 0,15 % hmotn. Defibrácia prebieha pri pH roztoku 8 až 9, počas 1 až 8 min. za vzniku reakčnej suspenzie. Defibrácia vykonávaná v takom krátkom časovom úseku 1 až 8 min. spôsobí maximálnú elimináciu enzýmovej aktivity prítomnej β (1,3)-D glukanázy. Potom sa suspenzia filtruje a dokonalé premyje vodou, čím dochádza k odstráneniu vodorozpustných zložiek. V ďalšom sa reakčná suspenzia bieli peroxidom vodíka v prítomnosti hydroxidu sodného alebo draselného pri koncentrácii nerozpustného glukánu 4 až 5 % hmotn. Dehydratácia sa uskutočňuje etanolom, acetónom alebo lyofilizáciou.

Zistilo sa, že je výhodné defíbráciu uskutočniť počas 5 min.

Ďalej bolo zistené, že sa pri filtrácii odstraňujú vodorozpustné zložky, ako napr. proteíny, popoloviny, enzýmy, sacharidy a iné.

Okrem doteraz používaných dehydratačných činidiel, ako je etanol a acetón, sa zistilo, že je výhodne dehydratá2 ciu uskutočňovať lyofilizáciou. Pri takto volenej dehydratácii sa získava glukán s čistotou 94 %. Glukán s touto čistotou je vhodný na prípravu vakcín.

Hlavnou výhodou spôsobu podľa vynálezu je, že umožňuje získať o 15 až 20 % vyšší výťažok na sušinu východiskovej suroviny. Ďalšou výhodou je o 20 až 30 % vyššia belosť získaného glukánu oproti doteraz známym spôsobom. Nie menej zanedbateľnou výhodou je ekologická výhoda tohto spôsobu, pri ktorom sa dosiahne maximálne zníženie nákladov na čistenie odpadových vôd. Podľa vynálezu sa obsah organických látok v pracích odpadových vodách zníži o 30 % a obsah vodorozpustného glukánu o 15 až 20 %.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

V priemyselnom mixéri sa defibruje 5 hod. po zbere 20 kg hlúbikov hlivy ustricovej v prostredí vodného roztoku uhličitanu sodného, ktorý pozostáva z pitnej vody v množstve 40 1 a uhličitanu sodného v množstve 60 g. Defibrácia sa uskutočňuje v mixéri počas 3 min. za vzniku zhomogenizovanej suspenzie.

Prítomný uhličitan sodný zabezpečuje pH prostredia 8, pri ktorom sa eliminuje enzýmová aktivita prítomnej B-(l,3)-D glukanázy a súčasne sa zabraňuje ďalšiemu rozpúšťaniu vodonerozpustného glukánu. Po defibrácii sa reakčná suspenzia prefiltruje cez textilný fdter a dokonale premyje pitnou vodou za odstránenia všetkých vodorozpustných látok, ako sú proteíny, popoloviny, enzýmy, sacharidy, ako aj vodorozpustný glukán. Takto získaný nerozpustný podiel glukánu sa nechá dobre odtiecť od kvapalnej fázy, vloží sa do 50 1 reaktora a zaleje sa 200 ml vody, do ktorej sa pridá 80 g NaOH. Po dokonalom premiešaní sa k reakčnej zmesi za nepretržitého miešania po častiach pridajú 2 1 30 %-ného peroxidu vodíka a reakčná zmes sa nechá staticky bieliť 18 hod. Po vybielení sa získaný glukán premýva pitnou vodou až do zmiznutia červeného zafarbenia fenolftaleinového indikátora na červeno. K filtračnému koláču sa pridá 5 1 pitnej vody okyslenej 20 ml kyseliny octovej, po premiešaní sa filtračný koláč opäť premyje 10 1 pitnej vody. Mokrý glukán sa lisuje v hydraulickom lise a odlisovaný koláč sa v reaktore zaleje 20 1 koncentrovaného etanolu, nechá sa 1 hod. odstáť, potom sa suspenzia premiestni do lisu s textilnou vložkou a po odtečení vylisuje. Dehydratácia s etanolom sa opakuje ešte dva razy, potom sa získaný glukán vysuší pri teplote 60 °C. Vysušený glukán sa ďalej melie na suchom mlyne a presituje cez sito s veľkosťou ôk 0,5 mm.

Výsledný glukán s výťažkom 70 % na hmotnosť sušiny hlúbikov hlivy ustricovej je nerozpustný vo vode, v zriedených kyselinách, ako aj organických rozpúšťadlách, obsahuje 0,6 % chitínového dusíka, 1,5 % popola a má veľkosť častíc 0,5 mm.

Príklad 2

Postupuje sa ako v príklade 1 s tým rozdielom, že na bielenie sa použije 1,5 1 peroxidu vodíka s koncentráciou 30 % hmotn. a bielenie prebieha počas 24 hod. pri teplote 23 °C.

Výťažok a kvalitatívne parametre glukánu sú zrovnateľné s kvalitatívnymi parametrami glukánu v príklade 1.

Príklad 3

Postupuje sa ako v príklade 2 s tým rozdielom, že dehydratácia mokrého glukánu sa uskutočňuje lyofilizáciou, pričom sa získa veľmi jemný práškový glukán vhodný na prípravu vakcín vo veterinárnej medicíne.

Príklad 4

Postupuje sa ako v príklade 3 s tým rozdielom, že pri mixovaní čerstvej hlivy sa použije namiesto uhličitanu sodného 80 g uhličitanu draselného.

Priemyselná využiteľnosť

Glukán izolovaný spôsobom podľa vynálezu možno využiť ako imunostimulačný potravinový doplnok proti rôznym bakteriálnym a vírusovým ochoreniam, resp. s vysokým rádioprotektívnym účinkom pri rádioterapii onkologických pacientov.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob izolácie imunostimulačného glukánu z hlivy ustricovej (Pleurotus ostreatus), výhodne z hlúbikov defibráciou, následným bielením peroxidom vodíka pri teplote 15 až 25 °C počas 15 až 24 hod. v prostredí roztoku hydroxidu sodného a dehydratáciou, vyznačujúci sa t ý m , že defibrácia, ktorá predchádza bieleniu peroxidom vodíka v prostredí roztoku hydroxidu sodného pri koncentrácii nerozpustného glukánu 4 až 5 % hmotn. a dehydratácii, sa uskutočňuje do 26 hod. po zbere hlivy ustricovej, skladovanej pri teplote 4 až 8 °C v prostredí najmenej dvojnásobného množstva vodného roztoku uhličitanu sodného alebo draselného s koncentráciou 0,05 až 0,15 % hmotn., pri pH roztoku 8 až 9, počas 1 až 8 min. za vzniku reakčnej suspenzie s eliminovanou enzýmovou aktivitou prítomnej B-(l,3)-D glukanázy, za odstránenia vodorozpustných zložiek z reakčnej suspenzie filtráciou a dokonalým premytím vodou.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že bielenie peroxidom vodíka prebieha v prostredí roztoku hydroxidu sodného s koncentráciou 0,05 až 0,09 % hmotn.
3. Spôsob podľa nároku 1 a 2, vyznačujúci sa t ý m , že defibrácia sa výhodne uskutočňuje počas 5 min.
4. Spôsob podľa nároku 1 až 3, vyznačujúci sa t ý m , že je výhodné defibráciu uskutočniť do 24 hod. po zbere hlivy ustricovej.
5. Spôsob podľa nároku 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že je výhodné defibráciu uskutočniť pri hlive ustricovej skladovanej pri teplote 5 °C.
6. Spôsob podľa nároku 1 až 5, vyznačujúci sa t ý m , že dehydratácia sa uskutočňuje etanolom, acetónom alebo lyofilizáciou.
7. Spôsob podľa nároku 1 až 6, vyznačujúci sa t ý m , že sa zo suspenzie filtráciou odstránia vodorozpustné zložky, ako sú proteíny, popoloviny, enzýmy, sacharidy, vodorozpustný glukán.