CZ298944B6

CZ298944B6 - Zpusob izolace chitin-glukanového komplexu z plísnových mycelií autolýzou a enzymovou hydrolýzou

Info

Publication number: CZ298944B6
Application number: CZ20060035A
Authority: CZ
Inventors: Beran@Miloš; Adámek@Lubomír; Urban@Marian; Molík@Petr
Original assignee: Výzkumný ústav potravinárský Praha, v.v.i.
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2006-01-17
Publication date: 2008-03-19

Abstract

Rešení se týká jednoduchého, levného a ekologického zpusobu izolace chitin-glukanového komplexu z plísnových mycelií autolýzou a enzymovou hydrolýzou, kdy autolýza mycelia probíhá pri koncentraci sušiny mycelia 1 až 20 % hmotn., za teploty 30 až 60 .degree.C, pri hodnote pH 4 až 9, po dobu 5 hodin až 2 týdnu, v jejímž prubehu probíhá enzymová hydrolýza, po které se oddelí nerozpustná cást s obsahem chitin-glukanového komplexu pro další zpracování. Získaný komplex obsahuje cenné látky pro další využití v potravinárství, medicíne i kosmetice.

Description

Vynález se týká způsobu izolace chitin-glukanového komplexu, chitosanu a jejich derivátů a degradačních produktů z odpadních průmyslových plísňových mycelií autolýzou a enzymovou hydrolýzou.

Dosavadní stav techniky

Při průmyslové výrobě kyseliny citrónové a jiných organických kyselin, antibiotik, enzymů, potravinářských barviv a některých dalších látek biotechnologickým procesem vznikají velká množství odpadního plísňového mycelia, která obvykle představují pro výrobce obtížný odpad. Přestože je tato odpadní biomasa zdrojem mnoha cenných sloučenin, je obvykle spalována bez jakéhokoli užitku, zaorávána do zemědělské půdy nebo dokonce ukládána na skládkách, kde se stává nezanedbatelnou ekologickou zátěží.

Buněčná stěna většiny průmyslově využívaných plísňových kmenů, pocházejících ze tříd Zygomycetes, Basidiomycetes, Ascomycetes nebo Deuteromycetes, je tvořena sítí polysacharidů, bílkovin a lipidů. Z odborné literatury je dobře známo, že převládajícími stavebními složkami jsou chitin a (1—>3, 1—>6)-P-D-glukany. Chitin je přítomen ve formě mikrovláken zakotvených v matrici tvořenou β-D-glukany. Oba polysacharidy jsou pravděpodobně spojeny kovalentní vazbou (Nwe N., and Stevens W. F. (2002) Biotechnology Letters, 24, 1461 - 64). Některé z plísňových kmenů mohou vedle chitinu obsahovat v buněčných stěnách také chitosan.

Chitin, systematickým názvem poly-N-acetyl-( 1-»4)^-D-glukosamin, je po celulóze druhým nejrozšířenějším biopolymerem na zeměkouli. Je přítomen v mnoha životních formách, včetně hmyzu, hub a schránek korýšů. Částečnou nebo úplnou deacetylací chitinu vzniká chitosan. Stupeň deacetylace komerčních chitosanů se obvykle pohybuje v rozsahu 70 až 95 %.

Komerční chitosan se vyrábí deacetylací chitinu získaného izolačním postupem ze schránek korýšovitých organismů, které jsou získávány jako odpadní materiál při jejich zpracování.

Polykationický charakter, velká tendence vytvářet chelatační komplexy, vysoká vazebná kapacita pro vodu a lipidy a výborná biokompatibilita činí tento materiál velmi atraktivním pro mnohá průmyslová odvětví. Mezi hlavní oblasti průmyslového využití chitosanu patří zpracování odpad40 nich vod, zemědělské materiály, potravinové a krmivářské doplňky, biomedicínské a farmaceutické materiály, chromatografická a imobilizační média, kosmetika a textilní a papírenský průmysl. Fyzikálně-chemické vlastnosti chitinu a chitosanu mohou být cíleně modifikovány žádoucími směry přípravou jejich různých chemických derivátů.

β-D-glukany jsou přírodní polysacharidy složené z rozvětveného řetězce jednotek glukózy, které jsou spojeny jiným typem vazby, než mnohem známějšími polysacharidy celulóza nebo škrob. V přírodě se β-D-glukany vyskytují zejména v obilovinách, kvasnicích a houbách. Jednotlivé βD-glukany se podle původu liší svou velikostí a biologickou aktivitou. Tyto polysacharidy patří mezi účinné nespecifické imunostimulátory, látky modulující imunitní systém člověka a antioxi50 danty. Používají se jako běžná součást potravních doplňků. Nejčastěji se izolují z pekařského droždí nebo hlívy ústřičné. Jejich pozitivní účinky jsou důkladně zdokumentovány v odborné literatuře.

-1 CZ 298944 B6

Způsobem přípravy chitosan-glukanového komplexu z průmyslového mycelia několika různých plísňových rodů, včetně Penicillium sp., popsal R. Muzzarelli v patentu publikovaném v r. 1981 (Muzzarelli R.: Chitosan-glucan complex, Method for its production and end uses, patent

IT 1104351 a související patenty BE 876990, DE 2923802, FR 2432046, GB 2026516,

NL 7904674, JP 55009691 a US 4282351). Chitosan-glukanový komplex je podle tohoto postupu získáván varem mycelia určitých rodů plísní v koncentrovaném roztoku silných alkálií (30 až 50 %, hmotn ./objem) po dobu 4 až 6 hodin při teplotách vyšších než bod varu těchto roztoků při normálním tlaku. Podstatná část chitinu obsaženého ve stěnách plísňové biomasy je za těchto podmínek deacetylována na chitosan.

Patenty RU 2043995 a US 6333399 popisují způsob přípravy chitosan-glukanového komplexu opakovaným opracováním mycelia alkalickým roztokem a roztokem minerální kyseliny při zvýšených teplotách, zahrnující nakonec alkalickou deacetylaci přítomného chitinu v 10 až 30% roztoku sodného či draselného louhu s následnou neutralizací a promytím pevného podílu nerozpustíš ného v alkalickém roztoku.

Patent US 4806474 popisuje způsob výroby chitosanové a glukanové frakce z mikrobiální biomasy zahrnující působení koncentrovaného louhu za horka a kyselou extrakci.

Přihláška vynálezu US 2005236328 popisuje způsob výroby chitosan - glukanového kopolymeru s poměrem glukosaminu a glukózy v rozsahu 1:5 až 5:1 z plísňové biomasy opět obvyklým způsobem kombinujícím alkalickou hydrolýzu koncentrovanými louhovými roztoky a kyselou extrakci.

Patentová přihláška WO 03068824 nárokuje přípravu derivátů buněčných stěn plísňové či kvasniěné biomasy a tyto produkty, chitin-glukanový komplex a chitosan, připravené popsaným postupem. Způsob sestává z přípravy chitinu nebo chitin-glukanového kopolymeru se zvýšeným obsahem chitinu a následné deacetylace chitinu na chitosan v následujících krocích:

- opracování biomasy alkalickým roztokem,

- vytvoření suspenze frakce biomasy nerozpustné v alkalickém prostředí v roztoku kyseliny,

- opracování této suspenze enzymy s β-glukanázovou aktivitou s cílem úplného nebo částečného odstranění β-glukanové frakce z chitin-glukanového kopolymeru,

- alkalická deacetylace získané chitinové nebo chitin-glukanové frakce při zvýšené teplotě kombinovaná s kyselou extrakcí nebo kombinovaná alkalická a enzymová deacetylace s pomocí deacetylačních enzymů v kyselém prostředí,

- vysrážení chitosanu z kyselého roztoku.

Patent CN 1629197 popisuje enzymovou metodu extrakce a separace chitosanu zplísňového mycelia po výrobě kyseliny citrónové s použitím proteázy produkované bakteriálním kmenem

Bacillus subtilis při předčišťování polysacharidového komplexu buněčných stěn a deacetylačních enzymů pro deacetylaci chitinu přítomného v tomto komplexu na chitosan s jeho následnou izolací.

Vzhledem k tomu, že deacetylační enzymy nejsou komerčně k dispozici k průmyslovému využití a také kjejich obecně známé nízké účinnosti, popisuje celá řada patentů postupy výroby chitosanu z mikrobiální biomasy založené na hydrolýze této biomasy a současné deacetylaci přítomného chitinu na chitosan v koncentrovaných roztocích alkalických louhů. Chitosan je izolován z pevného podílu po alkalické hydrolýze kyselou extrakcí a dále zpracován.

-2CZ 298944 B6

U chitin-glukanového komplexu izolovaného z průmyslového plísňového kmene Aspergillus niger byly zjištěny také antimutagenní, antimikrobiální a antivirální účinky (Kogan G., Rauko P., and Machová E (2003) Carbohydr. Res. 338 (9), 931-5; Kogan G., et al. Advances in Chitin Science. Vol. II (Eds. Domard A., Roberts G. A. F., and Varům K. M.), Jaques André Publisher,

Lyon 1998).

Dosavadní uvedené technologické postupy jsou nákladné, produkují velká množství odpadních vod nebo nejsou dostatečně účinné.

ío Z výše uvedeného jasně vyplývá snaha po nalezení nových způsobů získávání cenných látek z odpadních zdrojů a po zvyšování výtěžku těchto látek u dosud známých výrob. Velmi důležité je i snižování ekologického rizika těchto výrob.

Podstata vynálezu

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob izolace chitin-glukanového komplexu z plísňových mycelií autolýzou a enzymovou hydrolýzou, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že autolýza mycelia probíhá při koncentraci sušiny mycelia 1 až 20 % hmotn., za teploty 30 až

60 °C, při hodnotě pH 4 až 9, po dobu 5 hodin až 2 týdnů, v jejímž průběhu probíhá enzymová hydrolýza, po které se oddělí nerozpustná část s obsahem chitin-glukanového komplexu pro další zpracování.

Způsob podle vynálezu se dále vyznačuje tím, že autolýza mycelia probíhá výhodně při koncent25 raci sušiny mycelia 3 až 8 = hmotn., za teploty 48 až 52 °C, při hodnotě pH 5 až 7, po dobu 24 až 48 hodin.

Způsob podle vynálezu se ještě vyznačuje tím, že účinnost autolýzy mycelia je případně zvýšena přídavkem podpůrných látek, zejména chloridu sodného, etanolu nebo etylacetátu.

Způsob podle vynálezu je dále vyznačen tím, že účinnost autolýzy mycelia je případně zvýšena přídavkem podpůrných enzymů z třídy hydroláz.

Vynález si klade za cíl dát k dispozici nový způsob izolace frakce buněčných stěn obsahujících chitin-glukanový komplex jednoduchým způsobem, totiž autolýzou mycelia ve vodném roztoku za vhodných podmínek, případně podpořenou přídavkem podpůrných enzymů z třídy hydroláz pro dokonalé rozložení bílkovin, lipidů, nukleových kyselin a dalších polysacharidů, s výjimkou chitin - glukanového komplexu. Poté se degradací převedou do roztoku, aby se oddělil nerozpustný podíl obsahující požadovaný produkt, který se dále zpracuje.

Podle doposud nepublikovaných výsledků původců vynálezu mají orálně aplikované chitinglukanové komplexy izolované z průmyslových mycelií Aspergillus niger nebo Penicillium oxalicum mimo jiné pozitivní vliv na metabolismus krevních lipidů a redukci tělesné hmotnosti, srovnatelný s komerčními chitosany, a na zvýšení snůšky a kvality vajec u nosných slepic. Tyto komplexy můžou být tudíž použity jako speciální potravinové či krmivářské doplňky s pozitivními zdravotními účinky. Kromě toho mohou být chitin—glukanové komplexy použity také jako surovina pro výrobu chitosanu deacetylací chitinu působením roztoků alkalických louhů za horka podle obecně známých postupů.

Optimální podmínky pro autolýzu plísňové biomasy či jednotlivých hydrolytických enzymů jsou známy z odborné literatury či z návodů producentů průmyslových enzymů.

Účinnost autolýzy může být zvýšena přídavkem podpůrných látek známých z odborné literatury, zejména chloridu sodného, etanolu nebo etylacetátu.

-3 CZ 298944 B6

Nerozpustný podíl získaný po autolýze, případně kombinované s hydrolýzou průmyslovými hydrolytickými enzymy, je po důkladném promytí vodou vhodným způsobem oddělen, např. dekantací či odstředěním, a usušen. Pro sušení se jeví jako nej vhodnější fluidní sušárna.

Získaný polysacharidový komplex buněčných stěn může být tabletován či jinak finálně upraven a použit jako potravinový, případně krmný doplněk - speciální vláknina se specifickými biologickými aktivitami. Polysacharidový komplex je zvláště vhodný pro snižování hladiny celkového cholesterolu, LD-cholesterolu a triacylglycerolů a pro snižování celkové tělesné hmotnosti. Kromě využití jako potravinový či krmný doplněk je chitin - glukanový komplex vhodný i jako surovina pro výrobu biomateriálů pro medicínské využití či biodegradovatelných plastů a pro výrobu kvalitního chitosanu alkalickou deacetylací.

Způsob podle vynálezu umožňuje využití stabilně dostupného zdroje biomasy stálého složení bez přítomnosti jakýchkoliv kontaminujících látek a bez sezónních výkyvů. Riziko přítomnosti bílko15 vin a jiných alergizujících složek a anorganických látek v případě využití izolovaného komplexu jako potravinového doplňku či jako přísady potravin je v tomto případě podstatně sníženo ve srovnání s komerčními chitosany vyrobenými z odpadů po zpracování korýšů.

Způsob podle vynálezu je velmi jednoduchý, levný, ekologický, s minimální spotřebou chemiká20 lií a nenáročný na výrobní zařízení, kterým se izoluje hodnotná surovina chitin-glukanový komplex z odpadního materiálu.

Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.

Příklady provedení

Příklad 1

Příprava frakce buněčných stěn autolýzou mycelia Aspergillus niger kg vlhkého odstředěného mycelia Aspergillus niger (sušina 12 % hmotn./objem) bylo doplně35 no vodou na celkový objem 100 1. Hodnota pH vzniklé suspenze byla upravena na 6,0. Autolýza probíhala při teplotě 50 °C po dobu 48 h. Po ukončení autolýzy byl oddělen nerozpustný zbytek odstředěním, několikanásobně promyt destilovanou vodou a opět odstředěn. Bylo získáno 11,3 kg vlhkého pastovitého autolyzovaného mycelia (sušina 13 % hmotn./objem). Úbytek vložené sušiny mycelia v průběhu autolýzy byl tedy 38,8 %. Autolyzovaná biomasa obsahovala přibližně 65 % chitin — glukanového komplexu. Produkt byl usušen lyofilizací a tabletován s přídavkem sorbitolu a stearanu hořečnatého pro použití jako potravinový doplněk.

Příklad 2

Příprava frakce buněčných stěn autolýzu mycelia Aspergillus niger s přídavkem komerční proteázy Corolase L10 kg vlhkého odstředěného mycelia Aspergillus niger (sušina 12 % hmotn./objem) bylo doplně50 no vodou na celkový objem 50 1. Hodnota pH vzniklé suspenze byla upravena na 6,0 a suspenze byla doplněna 250 ml komerčního roztoku proteázy Corolase L10 (Barentz, spol. s.r.o., ČR) s minimální aktivitou 850 UHb.g ’. Autolýza společně s proteolýzou podporovanou přidaným enzymem probíhala při teplotě 50 °C po dobu 48 h. Po ukončení inkubace byl oddělen nerozpustný zbytek, důkladně promyt vodou a odstředěn. Bylo získáno 5,1 kg vlhkého pastovitého autoly55 zovaného mycelia (sušina 13 % hmotn./objem). Úbytek vložené sušiny mycelia v průběhu

-4CZ 298944 B6 kombinované autolýzy a proteolýzy byl tedy 44,75 %. Získaný produkt byl usušen ve fluidní sušárně. Bylo získáno 0,66 kg suchého prášku béžové barvy, obsahujícího minimálně 80 % chitin-glukanového kopolymerů. Produkt může být použit například jako speciální potravinářská vláknina se specifickými biologickými aktivitami ve formě potravinového doplňku nebo jako surovina k výrobě chitosanu alkalickou deacetylací.

Průmyslová využitelnost io Způsob podle vynálezu umožňuje jednoduché, levné a ekologické získávání chitin-glukanového komplexu z odpadního mycelia. Získaný komplex je zvláště vhodný jako potravinový či krmný doplněk pro snižování hladiny celkového cholesterolu, LD-cholesterolu a triacylglycerolů a pro snižování celkové tělesné hmotnosti, u kterého byly také prokázány antimikrobiální účinky.

Kromě využití jako potravinový či krmný doplněk je chitin - glukanový komplex vhodný i jako surovina pro výrobu biomateriálů pro medicínské využití či biodegradovatelných plastů a pro výrobu kvalitního chitosanu alkalickou deacetylací.

Claims

25 1. Způsob izolace chitin-glukanového komplexu z plísňových mycelií autolýzou a enzymovou hydrolýzou, vyznačující se tím, že autolýza mycelia probíhá při koncentraci sušiny mycelia 1 až 20 % hmotn. za teploty 30 až 60 °C při hodnotě pH 4 až 9 po dobu 5 hodin až 2 týdnů, v jejímž průběhu se provádí enzymatická hydrolýza, po které se oddělí nerozpustná část s obsahem chitin-glukanového komplexu pro další zpracování.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že autolýza mycelia probíhá výhodně při koncentraci sušiny mycelia
3 až 8 % hmotn. za teploty 48 až 52 °C při hodnotě pH 5 až 7 po dobu 24 až 48 hodin.

35 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že účinnost autolýzy mycelia je případně zvýšena přídavkem podpůrných látek, zejména chloridu sodného, etanolu nebo etylacetátu.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že účinnost autolýzy mycelia je případně zvýšena přídavkem podpůrných enzymů z třídy hydroláz.