CZ281220B6

CZ281220B6 - Sodná sůl karboxymetyl-beta-/1,3/-D-glukan-chitozanu, způsob její přípravy a použití

Info

Publication number: CZ281220B6
Application number: CZ931259A
Authority: CZ
Inventors: Jozef Rndr. Csc. Šandula; Dagmar Doc. Rndr. Drsc. Vraná; Eva Rndr. Csc. Machová; Adolf Mudr. Kocna
Original assignee: Mikrobiologický Ústav Avčr; Chemický Ústav Sav
Priority date: 1993-06-24
Filing date: 1993-06-24
Publication date: 1996-07-17
Also published as: CZ125993A3

Abstract

Sodná sůl karboxymethyl-beta-(1,3)-D-glukan-chitosanu. Připraví se tak, že se mycelium Aspergillus niger podrobí hydrolyse hydroxidem alkalického kovu při teplotě 80 - 100 .degree. C po dobu 0,5 - 2 hodin a získaný polysacharid se aktivuje, například působením koncentrovaného hydroxidu alkalického kovu při teplotě 40 - 70 .degree. C po dobu 1 - 3 hodin nebo působením ultrazvuku na vodnou suspenzi polysacharidu. Aktivovaný polysacharid se resuspenduje v roztoku 10 - 25 % hmot. hydroxidu alkalického kovu, přidá se chloroctan sodný v množství odpovídajícím 1 - 2 násobku množství aktivovaného polysacharidu a smě se ponechá 2 - 4 hodiny při laboratorní teplotě. Potom se zneutralizuje anorganickou kyselinou, nízkomolekulární podíl se odstraní dialysou a získaná sodná sůl karboxymethyl-beta-(1,3)-D-glukan-chitosanu se vysuší. Sloučeninu lze s výhodou použít jako prostředku k inhibici adherence patogenních mikroorganismů na slizniční epiteliální buňky. ŕ

Description

(57) Anotace:

Sodná sůl karboxymetyl-beta-( 1,3)-D-glukanchitosanu. Připraví se tak, že se mycelium Asperglllus niger podrobí hydrolyse hydroxidem alkalického kovu při teplotě 80 až 100 °C po dobu 0,5 až 2 hodin a získaný polysacharíd se aktivuje, například působením koncentrovaného hydroxidu alkalického kovu při teplotě 40 až 70 °C po dobu 1 až 3 hodin nebo působením ultrazvuku na vodnou suspenzi polysacharidu. Aktivovaný polysacharíd se resuspenduje v roztoku 10 až 25 % hmot, hydroxidu alkalického kovu, přidá se chloroctan sodný v množství odpovídajícím 1 až 2 násobku množství aktivovaného polysacharidu a směs se ponechá 2 až 4 h při laboratorní teplotě. Potom se zneutralizuje anorganickou kyselinou, nízkomolekulámí pódii se odstraní dlalysou a získaná sodná sůl karboxymetyl-beta-( 1,3)-D-glukan-chltosanu se vysuší. Sloučeninu lze s výhodou použít Jako prostředku k inhibici adherence patogenních mikroorganismů na sllzniční epitellální buňky.

Sodná sul karboxymetyl-beta-/l,3/-D-glukan-chitozanu a způsob přípravy

Oblast techniky

Vynález se týká sodné soli karboxymetyl-beta-/l,3/-D-glukanchitozanu, způsobu její přípravy a použiti.

Dosavadní stav techniky

Je známým faktem, že mykotických onemocnění v celém světě přibývá. Souvisí to s poruchami antiimunního a endokrinního systému po chemoterapii nádorových onemocnění, dlouhodobém podávání širokospektrálních antibiotik a radioterapií.

Invazivita patogenních kvasinek je podmíněna jejich schopností adherovat na sliznični epitelie. Na povrchu patogenních kandid se nachází protein, který se specificky váže na některé sacharidy na povrchu epiteliální buňky, jako fukóza, N-acetyl.D-glukozamin (Cutler J.E., Ann.Rev.Microbiol. 45, 187, 1991). Už Segal a spol (Exp. Cell Biol. 50,13,1982) zjistili, že adherenci kvasinek na lidské epitelie je možno inhibovat aminocukry. Dochází k nasycení vazebného místa příslušného proteinu a patogenní mikrob ztrácí schopnost zachytit se na povrchu epiteliální buňky.

Aminocukry se nacházejí u kvasinek a hub převážné ve formě chitinu, který je polymerem β-1,4-N-acetylglukosaminu (Gow N.A.R., Gooday G.W., Protoplasma 115,52,1983). Chitin se u ovoidni formy kvasinek nachází pouze v malém množství a pouze v septech, které zůstaly v buněčné stěně po oddělení buněk. Myceliální formy kvasničných buněk a plísně mají vyšší obsah chitinu, který je rozložený v celé buněčné stěně. Chitin je u těchto mikroorganismů vázán pevnou kovalentní vazbou na glukany. Tento glukan-chitinový komplex se vyznačuje velkou stabilitou vůči různým chemickým činidlům, zejména alkáliím (Mol P.C., Wessels

J.G.H., FEMS Microbiol. Letters 41,95,1987).

β-1,3-D-glukany kvasinek a hub jsou nespecifickými imunostimulátory. Zvyšuji resistenci hostitele proti bakteriálním virovým, fungálním a parasitárním onemocněním aktivací buněk imunitního systému hostitele, Imunopath. 8,387, 1985,

44,54,1988). Glukany se Potencují a prodlužují jejich účinnost (Kéry v.

Biochem. 22,1203, 1990). β-glukany nebo glukan-chitin se vyskytufibrilární formě. Obsah fibril 30 až 35 %, zatímco u kvasinek až 6 %. Nativní fibrilární glukan.chitin je nerozpustný Pro aplikační účely v medicíně forma. Glukan-chitin z plísní běžným postupům karboxymetylace působením chloroctanu glukan nebo

Chem. 3.

8,1,1988, zejména Williams ukázaly makrofágů (Di D.L. a spol. j ako výhodné

Luzio N.R., J.Surg. Res. nosiče léčiv, a spol. Int. J.

jí u kvasinek, plísní a hub ve v buněčné stěně u plísni dosahuje pouze 5 ve vodě. rozpustná a odolává sodného na Carbohydr. polymers 12,197,1990).

se však vyžaduje jeho má rigidní charakter chitin (Whistler R.L., Methods in sv. 322, 1963, Muzarelli R.A., Carbohydr.

Wirth S.J., Wolf G.H., J.Microbiol. Meth.

-1CZ 281220 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je nová látka sodná sůl karboxymetyl-beta (1,3)-D-glukan-chitosanu, která se podle vynálezu připraví tak, že se mycelium Aspergillus niger podrobí hydrolyse hydroxidem alkalického kovu při teplotě 80 až 100 ’C po dobu 0,5 až 2 hodin a získaný polysacharid se aktivuje, například působením koncentrovaného hydroxidu alkalického kovu při teplotě 40 až 70 ’C po dobu 1 až 3 hodin nebo působením ultrazvuku na vodnou suspenzi polysacharidu. Aktivovaný polysacharid se resuspenduje v roztoku 10 až 25 % hmot, hydroxidu alkalického kovu, přidá se chloroctan sodný v množství, odpovídajícím 1 až 2 násobku množství aktivovaného polysacharidu a směs se ponechá 2 až 4 h při laboratorní teplotě. Potom se zneutralisuje anorganickou kyselinou, nízkomolekulární podíl se odstraní dialysou a získaná sodná sůl karboxymetyl-beta-/l,3/-D-glukan-chitosanu se vysuší s výhodou lyofilisaci.

Z ekonomického hlediska je výhodné použití k výrobě sloučeniny podle vynálezu odpadní mycelium Aspergillus niger, které zůstává po výrobě kyseliny citrónové.

Sloučeninu podle vynálezu lze s výhodou použít jako prostředek k inhibici adherence patogenních mikroorganismů na slizniční epiteliální buňky. Protože sodná sůl karboxymetyl glukan-chitosanu vykazuje vysokou viskositu, má kromě uplatnění v humánní a veterinární medicíně možnost využití v kosmetice jako retenční činidlo, v potravinářském průmyslu jako zahuštovadlo, ve farmaceutickém průmyslu jako nosič léčiv a podobně. Produkt je netoxický. Jeho rozkladem vzniká glukosa a glukosamin, látky, které jsou součástí metabolických drah živých organismů.

Sodná sůl karboxymetyl glukan-chitosanu podle vynálezu je dobře rozpustná ve vodě a ve zředěných kyselinách. Poměr glukosy a glukosaminu po totální hydrolyse je 9:1 až 8:2. Látka dává charakteristické IČ spektrum pro glukan 920, 891, 774. pro chitin 1618, 1379 a 781. Molekulová hmotnost je 6 až 8.10⁵ Da, vnitřní viskosita = 1,2 až 2,0.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Příprava glukan-chitinového komplexu kg mokrého mycelia Aspergillus niger po výrobě kyseliny citrónové se digerguje 1 L 4 % hmot, hydroxidu draselného za varu. Zbytek se promyje vodou do neutrální reakce, odcentrifuguje, sediment se vysuší a rozdrtí na jemný prášek.

Aktivace glukan-chitinového komplexu g polysacharidu se suspenduje ve 125 ml 60 % hmot, hydroxidu sodného a při 60 °C se míchá 3 h. Směs se odcentrifuguje.

Karboxymetylace

Sediment se resuspenduje ve 125 ml 20 % hmot, hydroxidu sodného, za stálého míchání se postupně přidá 15 g chloroctanu sodného a 3 h se míchá při laboratorní teplotě. Potom se směs doplní vo

-2CZ 281220 B6 dou do 500 ml, neutralizuje koncentrovanou kyselinou solnou (37 % hmot.) a centrifuguje. Supernatant, obsahující ve vodě rozpustný karboxymetylderivát glukan-chitosanu, se dialyzuje a lyofilizuje. Karboxymetylovaný glukan-chitosan je ve formě sodné soli, je dobře rozpustný ve vodě, výtěžek je 5,1 g, stupeň substituce 0,45, sacharidické složení po totální hydrolyse 90 % glukosy, 9,5 % glukosaminu. Vnitřní viskosita =1,7.

Příklad 2

Postup jako v příkladě 1 s tím rozdílem, že aktivace glukan-chitinového komplexu se uskuteční ultrazvukem.

g práškového glukan-chitinového komplexu se suspenduje v 125 ml 20 % hmot, hydroxidu sodného a 20 min. se působí ultrazvukovým přístrojem UGA 20452 (Tesla ČR), frekvence 20 kHz, výkon 150 W. Potom se přidá 15 g chloroctanu sodného. Další postup karboxymetylace jako v případě 1. Výtěžek 1,8 g sodné soli karboxymetyl glukan-chitosanu.

Příklad 3

Inhibice adherence buněk patogenní Candida albicans na epiteliální buňky polysacharidy.

Připraví se 1 ml suspense virulentního kmene Candida albicans ve fosfátovém pufru pH = 7 na hustotu 5 podle Mc Farlanda a smíchá se s 1 ml suspense testované látky (25 mg/ml). Směs se inkubuje 24 h při 5 °C za mírného třepání. Dále se připraví suspense bukálních epiteliálnich buněk ve fosfátovém pufru (pH = 7) a třikrát se tímtéž pufrem promyjí.

0,2 ml buněk Candida albicans po inkubaci s polysacharidem se smísí s 0,2 ml suspense epitelií a při teplotě 37 ’C se inkubuje 90 min. Následuje filtrace membránovým filtrem Synpor 1 a sediment na filtru se promyje 100 ml fosfátového pufru. Zhotoví se otiskový preparát na podložní sklo a po zaschnutí a fixaci plamenem se barví postupem podle Grama. Mikroskopicky se hodnotí počet G⁺ kvasinek, ležících, nebo se dotýkajících G“ epiteliálních buněk nepravidelného tvaru. Výsledky inhibice testovanými polysacharidy a kontrolu ukazuje tabulka č. 1.

V každém pokuse bylo hodnoceno 100 epitelií. Rozpustná sodná sůl karboxymetyl glukan-chitosanu (Na-KM-G-Ch) vykazuje inhibici adherence, a to i při nižších koncentracích. Směs polysacharidů po karboxymetylaci obsahuje vedle rozpustného derivátu a nerozpustného zbytku i částečně rozpustnou gelovitou látku.

-3CZ 281220 B6

Tabulka 1

preparát	koncentrace testované látky (mg/ml)	počet buněk Candida albicans/1 epitelii
kontrola	0	10,18
Na-KM-G-Ch	6	2,63
Na-KM-G-Ch	12	2,60
Na-KM-G-Ch	25	2,50
směs nerozp.
a rozp. G-Ch	25	3,93
nerozp. G-Ch	25	7,44
glukan Sacha-
romyces cerevisiae	! 25	9,58

G-Ch = glukan-chitosan

Průmyslová využitelnost

Látku podle vynálezu lze využít v medicíně, v kosmetice, potravinářství a ve farmaceutickém průmyslu.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Sodná sůl karboxymetyl-beta-/l,3/-D-glukan-chitosanu.

2. Způsob přípravy sodné soli karboxymetyl-beta-/l,3/-D-glukan-chitosanu podle nároku 1, vyznačující se tím, že mycelium Aspergillus niger podrobí hydrolyse hydroxidem alkalického kovu při teplotě 80 až 100 °C po dobu 0,5 až 2 hodin, získaný polysacharid se aktivuje, například působením koncentrovaného hydroxidu alkalického kovu při teplotě 40 až 70 “C po dobu 1 až 3 hodin nebo působením ultrazvuku na vodnou suspenzi polysacharidu, aktivovaný polysacharid se resuspenduje v roztoku 10 až 25 % hmot, hydroxidu alkalického kovu, přidá se chloroctan sodný v množství, odpovídajícím 1 až 2 násobku množství aktivovaného polysacharidu a směs se ponechá 2 až 4 h při laboratorní teplotě, potom se zneutralizuje anorganickou kyselinou, nízkomolekulární podíl se odstraní dialysou a získaná sodná sůl karboxymetyl-beta-/l,3/-D-glukan-chitosanu se vysuší.