CN114456953B - 一种虎奶菇菌核的平板培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种虎奶菇菌核的平板培养方法，属于食用菌培养技术领域。本发明所述平板培养方法：(1)PDA培养基的配置：用酸或碱将PDA培养基的pH值调节为4‑9，配置PDA培养基，灭菌冷却至60‑75℃，加入双氧水溶液，得到含有双氧水的PDA培养基；(2)将虎奶菇菌种接种在装有步骤(1)所述的含有双氧水的PDA培养基的平板上，置于恒温培养箱A中培养，至菌丝长满PDA平板，转接至恒温培养箱B中恒温培养。本发明所述方法不需要木屑、棉籽壳等复杂的袋料固体培养基，具有接种方便、培养周期短、易于控制等优点。

Description

一种虎奶菇菌核的平板培养方法
技术领域
本发明属于食用菌培养技术领域，尤其是指一种虎奶菇菌核的平板培养方法。
背景技术
虎奶菇(Pleurotus tuber-regium)，担子菌，侧耳属，是一种能产生大型菌核和子实体的食药用真菌，广泛分布于世界热带和亚热带地区，包括非洲、亚洲和大洋洲。虎奶菇在民间用于治疗头痛、胃痛、哮喘、天花、高血压等多种疾病。虎奶菇子实体和菌核含有挥发油、氨基酸以及多糖类物质，其主要活性成分为虎奶菇多糖。目前，有研究报道从PTR菌核和菌丝体细胞壁中提取的非淀粉多糖和多糖蛋白复合物具有免疫调节和直接杀伤肿瘤的活性。虎奶菇不同发育阶段的细胞壁含量有很大差异，虎奶菇菌核细胞壁含量高达78.4±0.7％DW，远高于其他阶段。菌核细胞壁含有大量糖蛋白，在菌丝和子实体细胞壁中均未发现糖蛋白。且研究发现菌核通常具有良好的药理活性(如抗癌、免疫调节、抗炎等)，这可能与其特有的超支化β-1,4,6-葡聚糖含量高有关。
菌核是某些真菌在生长过程中的一种特殊生长阶段，虎奶菇菌核的生成还是通过袋料培养，其具体的形成机制还不明确。由于培养周期长(菌丝长满袋料后3个月)，因此虎奶菇菌核的生产受到了较大限制，也严重影响了其中超支化β-葡聚糖和糖蛋白等活性成分的研究与开发。因此，寻找一种快速便捷的虎奶菇菌核的培养方法迫在眉睫。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种虎奶菇菌核的平板培养方法。本发明所述方法不需要木屑、棉籽壳等复杂的袋料固体培养基，具有接种方便、培养周期短、易于控制等优点。
本发明的目的是提供一种虎奶菇菌核的平板培养方法，包括以下步骤：
(1)PDA培养基的配置：用酸或碱将PDA培养基的pH值调节为5-9，配置PDA培养基，灭菌冷却至60-75℃，加入双氧水溶液，得到含有双氧水的PDA培养基；
(2)将虎奶菇菌种接种在装有步骤(1)所述的含有双氧水的PDA培养基的平板上，置于恒温培养箱A中培养，至菌丝长满PDA平板，转接至恒温培养箱B中恒温培养。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述酸选自盐酸、草酸、柠檬酸或乙酸。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或碳酸钠。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述含有双氧水的PDA培养基中双氧水浓度为10-5-10-2mol/L。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述虎奶菇菌种接种中，在所述PDA平板中接种(1-1.5)cmⅹ(1-1.5)cm的长满菌丝的PDA琼脂块，并使带菌丝面接触所述PDA培养基。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，恒温培养箱A中温度为25-32℃。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，恒温培养箱A中培养5-14天。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，菌丝转接之后的恒温培养箱B中温度为22-30℃。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，菌丝转接之后的恒温培养箱B中培养时间为20-60天。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明所述通过研究温度和pH对虎奶菇菌核分化的影响，进一步通过测定菌丝和菌核的过氧化氢含量和过氧化氢酶活推断其分化机制，最后添加不同浓度的过氧化氢和抗坏血酸推断氧化剂和抗氧化剂对虎奶菇菌核形成的影响。发现虎奶菇菌核分化的最适温度时25℃，最适pH是5，且外界刺激会导致菌丝和菌核过氧化氢含量和过氧化氢酶活性的变化；适宜浓度的过氧化氢会促进菌核的形成，而抗坏血酸完全抑制菌丝分化形成菌核，且发现随着细胞的分化程度不同，细胞内过氧化氢的浓度和过氧化氢酶活亦随之改变，推断细胞的分化与胞内的氧化应激相关。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明不同温度对菌核分化的影响；其中，A、B、C、D分别为15℃、20℃、25℃、30℃。
图2是本发明pH对菌核分化的影响；其中，A为不同pH下对菌丝生长速度的影响，B为不同pH下生长30天的菌核重量，C为菌核表型观察。
图3是本发明不同pH下过氧化氢含量及过氧化氢酶活；其中，A为过氧化氢含量，B为过氧化氢酶活。
图4是本发明添加不同浓度的过氧化氢对菌核分化的影响；其中，A为菌丝的生长速度，B为生长30天菌核的重量，C为菌核表型观察。
图5是本发明添加不同浓度过氧化氢菌丝和菌核的过氧化氢含量和过氧化氢酶活；其中，A为过氧化氢含量，B为过氧化氢酶活。
图6是本发明添加不同浓度抗坏血酸对菌核分化的影响；其中，A为菌丝的生长速度，B为菌核表型观察。
图7是本发明添加不同抗坏血酸浓度下菌丝的过氧化氢含量和过氧化氢酶活；A为过氧化氢含量，B为过氧化氢酶活。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
1，本发明实施例所用材料：
虎奶菇(Pleurotus tuber-regium)由香港中文大学张志强教授所赠与。所用培养基为PDA培养基(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L)。过氧化氢检测试剂盒(S0038)，过氧化氢酶检测试剂盒(S0051)，均购自碧云天生物技术。
2，本发明实施例所用主要仪器和设备：
Enspire 2300型酶标仪，美国PerkinElmer公司；FAl004型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SW-CJ-IF型超净工作台，苏州净化设备有限公司；LDZX-40BI型高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；PB-10型pH计，季尔国际贸易上海有限公司；SPX-252B-Z型生化培养箱，上海博讯实业有限公司。
实施例1
一种虎奶菇菌核的平板培养方法：
(1)PDA培养基的配置：配置PDA培养基，用盐酸将PDA培养基的pH值调节至5，灭菌冷却至65℃，并加入过氧化氢溶液，得到含有过氧化氢的PDA培养基，且过氧化氢在PDA培养基中浓度为10-2mol/L；
(2)将虎奶菇菌种接种在装有步骤(1)所述的PDA培养基的平板上，置于恒温培养箱A中30℃恒温培养7天，至菌丝长满PDA平板，将其转移至恒温培养箱B中进行25℃恒温培养30天。
实施例2
一种虎奶菇菌核的平板培养方法：
其他制备方法同实施例1，区别点在于，实施例2中菌丝聚集和菌核形成的温度(即恒温培养箱B)分别设置为30℃。
(1)PDA培养基的配置：配置PDA培养基，用盐酸将PDA培养基的pH值调节至5，灭菌冷却至65℃，并加入过氧化氢溶液，得到含有过氧化氢的PDA培养基，且过氧化氢在PDA培养基中浓度为10-2mol/L；
(2)将虎奶菇菌种接种在装有步骤(1)所述的PDA培养基的平板上，置于恒温培养箱A中30℃恒温培养7天，至菌丝长满PDA平板，将其转移至恒温培养箱B中进行30℃的恒温培养30天。
实施例3-6
一种虎奶菇菌核的平板培养方法：
其他制备方法同实施例1，区别点在于，实施例3-6中PDA培养基的pH值分别为6、7、8、9。
(1)PDA培养基的配置：配置PDA培养基，分别用盐酸或氢氧化钠将PDA培养基的pH值调节为6、7、8、9；且过氧化氢在PDA培养基中浓度为10-2mol/L。
(2)将虎奶菇菌种接种在装有步骤(1)所述的PDA培养基的平板上，置于恒温培养箱A中30℃恒温培养7天，至菌丝长满PDA平板，将其转移至恒温培养箱B中进行25℃恒温培养30天。
实施例7-9
其他制备方法同实施例1，区别点在于，实施例7-9中PDA培养基中双氧水的浓度分别为10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L。
(1)PDA培养基的配置：配置PDA培养基，pH为5，灭菌冷却至65℃，并加入双氧水溶液，得到含有双氧水的PDA培养基；
(2)将虎奶菇菌种接种在装有步骤(1)所述含有双氧水的PDA培养基的平板上，置于恒温培养箱A中30℃恒温培养7天，至菌丝长满PDA平板，将其转移至恒温培养箱B中进行25℃恒温培养30天。
对比例1-3
其他制备方法同实施例1，区别点在于，对比例1-3中PDA培养基中添加抗坏血酸(Vc)，且在培养基中的浓度分别为：0.0001g/L、0.001g/L、0.003g/L。
(1)PDA培养基的配置：配置PDA培养基，pH自然，灭菌冷却至65℃，并加入抗坏血酸粉末，得到含有不同浓度抗坏血酸的PDA培养基；
(2)将虎奶菇菌种接种在装有步骤(1)所述含有抗坏血酸的PDA培养基的平板上，置于恒温培养箱A中30℃恒温培养7天，至菌丝长满PDA平板，将其转移至恒温培养箱B进行25℃恒温培养30天。
对比例4-6
其他制备方法同实施例1，区别点在于，对比例4-6中菌丝生长阶段所用恒温培养箱A的温度分别为：10℃、15℃、20℃。
(1)PDA培养基的配置：配置PDA培养基，pH自然；
(2)将虎奶菇菌种接种在装有步骤(1)所述的PDA培养基的平板上，置于不同的恒温培养箱A中分别以10℃、15℃、20℃恒温培养，至菌丝长满PDA平板。结果显示，在10℃时菌丝未见明显生长；15℃时菌丝生长非常缓慢，培养至30天时仍未长满平板直径的一半；20℃时菌丝生长缓慢，约30天长满平板，但菌丝活力较差，平板上菌丝密度较低。将其转移至恒温培养箱B中进行25℃恒温培养30天后，未见菌核生成。
对比例7-8
其他制备方法同实施例1，区别点在于，对比例7-8中恒温培养箱B的温度分别为：15℃、20℃。
(1)PDA培养基的配置：配置PDA培养基，pH自然；
(2)将虎奶菇菌种接种在装有步骤(1)所述的PDA培养基的平板上，置于恒温培养箱A中30℃恒温培养7天，至菌丝长满PDA平板，将其转移至恒温培养箱B中分别进行15℃、20℃恒温培养30天。
对比例9
其他制备方法同实施例1，区别点在于，对比例9中PDA培养基的pH值分别为4。
(1)PDA培养基的配置：配置PDA培养基，用盐酸将PDA培养基的pH值调节为4。
(2)将虎奶菇菌种接种在装有步骤(1)所述的PDA培养基的平板上，置于恒温培养箱A中30℃恒温培养7天，至菌丝长满PDA平板，将其转移至恒温培养箱B中进行25℃恒温培养30天。
测试例1
观察实施例1-2和对比例7-8的菌核的形成情况，结果见图1。
虎奶菇主要生长与热带和亚热带地区，菌丝体适宜生长温度为28-32℃，平板培养和液态发酵的最适温度为30℃。菌核作为虎奶菇应对不良环境的休眠体，温度对其形成具有重要影响。首先探究菌核形成的最适温度，30℃时菌丝长满平板为7天，25℃菌丝铺满平板为14天左右，15℃及20℃菌丝生长过于缓慢，故选择在菌丝最适温度30℃生长至菌丝铺满平板，在分别放置30℃、25℃、20℃、15℃。由图1可知，30℃时有明显菌丝集结，25℃可见明显的小菌核生成，而对比例7-8中20℃和15℃无明显菌丝聚集和菌核形成现象。分别收取出30℃和25℃培养出的菌核进行称量和观测，30℃(30mg)的菌核含量明显低于25℃(76mg)，且形成的菌核不如25℃形成的致密。由于30℃为虎奶菇菌丝体生长的最适温度，更多的营养成分用于菌丝体的生长蔓延，而在25℃时，适当的低温胁迫更利于菌核的形成。继续降低温度则会显著减缓菌丝的生长，也不利于菌核形成，因此后续选择25℃作为菌核的培养条件，与菌核最适宜的温度为23-28℃相吻合。
测试例2
1，将实施例1、实施例3-6及对比例9所得菌丝的生长速度进行测定：菌丝培养四天后，每天采用十字交叉法测定菌丝直径，结果见图2。根据下列公式计算菌丝生长速度：
菌丝生长速度(mm/d)＝菌落直径(mm)/生长天数(d)。
2，将实施例1、实施例3-6及对比例9中观察菌核形成时间，对生长至20天的培养皿进行拍照记录，培养30天统计生成菌核的重量，结果见图2。
由图2可知，中性及偏碱性的pH(pH 7～9)对菌丝生长无明显影响，酸性环境则会明显抑制菌丝的生长(pH 4～6)。在pH为5时，菌核形成最多，随着pH的升高(pH 7除外)，菌核形成量减少，而pH为4时，菌核形成量最低。因此，弱酸性环境(pH～5)更利于菌核的形成，而过度的外界酸碱胁迫则不利于菌核的形成，这可能是因为pH过低会导致细胞内酶活受到抑制，因此代谢活动减弱，不利于菌丝的生长和分化。
3，将实施例1、实施例3-6及对比例9中挑取各处理组未分化阶段的菌丝和菌核形成阶段的菌核，参考碧云天试剂盒分别测定过氧化氢含量和过氧化氢酶活性，实验结果见图3。
由图3可知，不同阶段的过氧化氢含量和过氧化氢酶活有着较为显著的差异。所有pH情况下未分化的菌丝过氧化氢含量均明显高于菌核，且pH为5时菌核最多，菌核中过氧化氢含量最低。菌核过氧化氢酶活性基本明显高于菌丝，只有菌核量极少的pH为4时，菌丝过氧化氢含量略高于菌核，而产生菌核较多的pH为5，pH为7，实施例1的过氧化氢酶活差异更大。可推测当菌丝积累的过氧化氢含量超过其所能降解的含量时，致使细胞内产生氧胁迫，进而促进菌核形成，提高过氧化氢酶酶活，以阻止过氧化氢继续积累对细胞造成损害。
测试例3
测试实施例1和实施例7-9不同双氧水含量的菌核形成情况，并取培养30天的菌丝和菌核测量过氧化氢含量和过氧化氢酶活，利用碧云天试剂盒分别测定过氧化氢含量和过氧化氢酶活性。结果见图4-5。
由图4可知，由上述结果可发现，菌核分化中过氧化氢含量发生了明显的改变，过氧化氢在虎奶菇菌核分化过程中起着重要的作用。于是通过外源添加不同浓度的过氧化氢以观测氧化物质对菌核形成的影响。添加的过氧化氢浓度低于10-4mol/L时，菌丝的生长无明显影响，浓度为10-3mol/L时，对菌丝的生长有一定的抑制左右，浓度为10-2时，能够显著抑制菌丝的生长。过氧化氢浓度为10-2mol/L时，形成菌核的重量最高，随着过氧化氢浓度的降低，形成菌核的重量随之降低，由目前的结果可知高浓度的过氧化氢能更好的促进菌核分化。
由图5可知，类似于pH中测量的结果，添加不同浓度的过氧化氢，菌丝的过氧化氢含量均显著高于菌核，菌核的过氧化氢酶酶活均明显高于菌丝。且发现，当添加的过氧化氢浓度为10-2mol/L时，其菌核产量最高，菌丝细胞内过氧化氢含量最高，菌丝和菌核过氧化氢酶活差异也较为显著；当添加的过氧化氢浓度为10-5mol/L时，其过氧化氢含量菌丝偏低而菌核偏高，菌丝和菌核的过氧化氢酶变化很小。
测试例4
观察对比例1-3中菌核形成情况取培养30天的菌丝和菌核测量过氧化氢含量和过氧化氢酶活，结果见图6-7。
抗坏血酸(Vc)，是一种在代谢中能够有效清除生物体内ROS的抗氧化剂。用抗坏血酸处理PDA培养基后发现，抗坏血酸非常不利于菌核的分化。由图6得，当抗坏血酸浓度为10-4g/L时，对菌丝的生长影响较小，随着浓度的增高，对菌丝的生长抑制越大。对菌核的分化亦如此，当抗坏血酸浓度为10-4g/L时，菌核分化情况与对照组相比明显减少，当浓度为10-3g/L和3×10-3g/L时，完全抑制菌核的分化。
由于抗坏血酸基本抑制菌核的分化，无法收集菌核，故只能测定菌丝的过氧化氢浓度和过氧化氢酶活。可看出菌丝的过氧化氢含量和过氧化氢酶活并无显著性差别。
目前认为菌核的分化主要是由氧化胁迫造成，即外界不利环境会引起丝状真菌细胞内的氧化应激反应的发生，导致过氧化氢、超氧阴离子等活性氧物质的爆发及脂质过氧化浓度的增加，从而诱导菌核分化。过氧化氢酶广泛分布在生物体内，是微生物体内主要清除过氧化氢的酶。且发现过氧化氢酶在猪苓菌丝分化形成菌核过程酶活会发生变化。故选择测定未分化的菌丝和分化的菌核的过氧化氢含量以及过氧化氢酶活性探索过氧化氢在菌核分化中的作用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种虎奶菇菌核的平板培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）PDA培养基的配置：用酸或碱将PDA培养基的pH值调节为5-9，配置PDA培养基，灭菌冷却至60-75℃，加入双氧水溶液，得到含有双氧水的PDA培养基；所述含有双氧水的PDA培养基中双氧水浓度为10-5-10-2 mol/L；
（2）将虎奶菇菌种接种在装有步骤（1）所述的含有双氧水的PDA培养基的平板上，置于恒温培养箱A中培养，至菌丝长满PDA平板，转接至恒温培养箱B中恒温培养；恒温培养箱A中温度为25-32 ℃；菌丝转接之后的恒温培养箱B中温度为22-30 ℃。
2.根据权利要求1所述的平板培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酸选自盐酸、草酸、柠檬酸或乙酸。
3.根据权利要求1所述的平板培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或碳酸钠。
4.根据权利要求1所述的平板培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述虎奶菇菌种接种中，在PDA平板中接种(1-1.5) cmⅹ(1-1.5) cm的长满菌丝的PDA琼脂块，并使带菌丝面接触所述PDA培养基。
5.根据权利要求1所述的平板培养方法，其特征在于，步骤（2）中，恒温培养箱A中培养5-14天。
6.根据权利要求1所述的平板培养方法，其特征在于，步骤（2）中，菌丝转接之后的恒温培养箱B中培养时间为20-60天。
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