ES2247104T3 - Metodo para aislar glucan inmunoestimulante del hongo de la ostra. - Google Patents
Metodo para aislar glucan inmunoestimulante del hongo de la ostra.Info
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Abstract
Un método de aislamiento de glucano inmunoestimulante a partir de hongo de ostra (Pleurotus ostreatus) preferiblemente de sus tallos, por desfribración, con posterior blanqueado con peróxido de hidrógeno a una temperatura de 15 a 25°C durante 15 a 24 horas en un medio de una solución de hidróxido de sodio y deshidratación, caracterizado porque la desfibración que precede a la decoloración con peróxido de hidrógeno en un medio de una solución de hidróxido de sodio con una concentración de glucano insoluble de 4 a 5% de peso con la deshidratación, se lleva a cabo en el plazo de 26 horas, a más tardar, tras haber recogido el hongo de ostra a una temperatura de 4° a 8°C, en un medio de como mínimo una doble cantidad de solución acuosa de carbonato de sodio potasio con una concentración de 0, 05 a 0, 15% de peso, con un valor PH de la solución de 8 a 9 durante 1 a 8 minutos, de donde se produce una suspensión de reacción, con actividad enzimática eliminada de /3-(1, 3)-D-glucan a-sa presente, eliminando los componentes solubles en agua de la suspensión de reacción mediante filtración y mediante un lavado profundo con agua.
Description
Método para aislar glucán inmunoestimulante del
hongo de la ostra.
Esta invención se refiere a un método para aislar
glucano inmunoestimulante del hongo de la ostra (Pieurotus
ostreatus) preferentemente de sus tallos por desfribración, con
decoloración posterior con peróxido de hidrógeno y
deshidratación
Es bien conocido que algunos polisacáridos
naturales se caracterizan por sus propiedades farmacológicas
inmunoestimulantes y otras propiedades farmacológicas. Se trata
normalmente de polisacáridos que tienen en su cadena principal de
polisacáridos estrictamente un enlace
\beta-(1-3)-D-glucosídico
que es el principal soporte de su actividad inmunoestimulante.
Los polisacáridos inmunoestimulantes se producen
en las paredes celulares de la bacteria, levaduras y hongos varios,
especialmente de las especies Basidomicetos (DI LUZIO N.R.CHIHARA,
G.: Inmunofarmacología avanzada. 1. 477 (1981); Jacques P.J.,
Polisacáridos Inmunomodulador, p. 429-438 de
Conceptos actuales en inmunología humana y Inmunomodulación del
cáncer, y otros, Elsevier Biomed, B.V., (1982); Cihihara, G. EOS
riv. Inmunofarmacia Inmunológica 4.85 (1984).
Substancias activas inmunofarmacológicamente, por
ejemplo también \beta-(1,3)-D glucanos, actuando
sobre los sistemas de protección básicos de un huésped pueden
influenciar positivamente el número, la actividad funcional y las
interacciones de macrófagos de linfocitos Y y B de células NK así
como sus componentes humorales y secretores. Por tanto, pueden
modificar de forma no específica un número amplio de infecciones
bacterianas, por hongos, parasitarias y víricas. El mecanismo de
acción del glucano difiere, por consiguiente, considerablemente de
los quimioterapéuticos y antibióticos (TRNOVEC y otros, Farm. Obzor
56). 271(1987): OSTAD E. SELJELICH, r: CTA PATH
Microniol.Scand.88.97 (1980):J.Reticuloendothel Soc. 32.347
(1982).
Asimismo, ulteriores trabajos confirman también
que los glucanos inmunoestimulantes son substancias que merecen una
gran atención en el tratamiento y prevención de muchas
enfermedades. Por ejemplo, se ha demostrado que los inmunoglucanos
aumentan la inmunidad frente a diferentes enfermedades bacterianas y
víricas, actúan contra el cáncer, potencian el efecto de la
radioterapia de pacientes oncológicos (KOMASU, N, et al.
Ger.Offen 5.032636 (1981) Patente US 3.943.247 (1976) Miyachi M.
et al. Ger. Offen 3 032636 (1981) PATCHEM m.: Surv.Immunol.
He 2 237 (1983) POSPISIL et al. : Experiencia 38 1232
(1982).
Los
\beta-(1,3)-D-glucanos se fabrican
a escala industrial a partir de levaduras y de algunos hongos de
las especie Basidiomicetos.
Las principales desventajas de los glucanos
obtenidos a partir de levaduras son la correspondiente tecnología
que exigen: baja producción de glucano (alrededor del 5% referido a
la materia seca de las levaduras) y las altas exigencias para la
eliminación de las soluciones alcalinas residuales. La principal
ventaja de los glucanos fúngicos es la simplicidad de la tecnología
y una producción de glucano del 30 al 50%, sobre la materia seca de
las materias primas de entrada.
En este momento se conocen dos métodos de
aislamiento de glucanos a partir de hongos de ostra, ya sea
extracción en frío o en caliente de esporangia (KUNIAK 1. et
al. Patente CS N° 274.918 y Patente CS N° 276.192), con los
cuales puede obtenerse una producción de hasta el 50% de glucano
inmunoestimulante sobre la materia seca del hongo de ostra.
En el método según la patente CS número 274 918,
en el que el hidróxido de sodio con una concentración de 0,1 a 0,2
M/l es utilizado en el primer paso de la extracción de componentes
no glucanos, se disuelve también una parte del glucano no soluble
en agua en una cantidad del 10 al 15% sobre la materia seca de la
materia prima de entrada.
Mediante un estudio más detallado de los cambios
químicos de la parte de proteína del hongo de la ostra que se
producen a temperaturas de 95 a 100°C con una solución de 0,1 a 0,2M
de NaOH, se ha visto que una parte de las proteínas se desnaturaliza
y se convierte en insoluble, esto es, el contenido de nitrógeno en
el glucano final aumenta y una parte del mismo se transforma por
hidrólisis alcalina en oligopéptidos o aminoácidos, formando
productos de condensación oscura que se absorben en glucano y que
disminuyen la blancura del glucano final insoluble.
La intención de la presente invención es
incrementar la producción del glucano insoluble y su blancura con
una formación mínima de soluciones alcalinas residuales.
Este objetivo se consigue en gran medida mediante
el método de aislamiento de del glucano inmunoestimulante a partir
del hongo de la ostra, preferiblemente a partir de sus tallos por
desfribración con decoloración posterior con peróxido de hidrógeno y
deshidratación a una temperatura de 15 a 25°C durante 15 a 24 horas
en un medio de una solución de hidróxido de sodio y deshidratación,
cuya naturaleza consiste en que la desfibración que precede al
aclarado con peróxido de hidrógeno en un medio de solución de
hidróxido de sodio, se realiza en el plazo de 26 horas a más tardar
después de haber recogido los hongos de las ostras.
Mediante un estudio más profundo de la parte de
glucano del hongo de la ostra, se ha visto que está formado por dos
partes, una de ellas es agua soluble y firmada por oligopéptidos o
aminoácidos y la otra parte es agua insoluble formada por proteínas
desnaturalizadas, esto es, contienen una elevada cantidad de
nitrógeno. La proporción de glucano soluble en agua frente al
glucano insoluble es de 1:2. Sin embargo, esta proporción es válida
en el momento de separar el esporangium del sustrato, es
decir inmediatamente después de haber recogido el hongo de la
ostra.
Pero si el hongo de la ostra es almacenado tras
la recogida, tiene lugar la autólisis del glucano por el enzima
presente de \beta(1,3) D-glucanasa. Para
enlentecer la autólisis del glucano, es necesario realizar la
desfibración del hongo de la ostra en el plazo de 26 horas a más
tardar después de haberla recogido.
También se ha descubierto que la hidrólisis del
glucano se incrementa considerablemente a una temperatura más
elevada. Si la temperatura de almacenamiento es de unos 20°C o
superior, el aumento de la hidrólisis es proporcional a la
temperatura y al tiempo de almacenamiento. En el transcurso de la
autólisis, la porción del glucano soluble en agua se incrementa a
costa de la porción soluble. Se ha observado que es necesario
conservar los hongos de ostra a una temperatura de 4 a 18°C.
La desfibración se realiza en un medio de como
mínimo el doble de solución acuosa de carbonato de sodio o de
potasio con una concentración de 0,05 a 0,15% de peso. La
desfibración tiene lugar a un valor de PH de la solución de 8 a 9
durante 1 a 8 minutos, tiempo durante el cual se firma una
suspensión de reacción. Una desfibración, realizada en un intervalo
de tiempo tan corto de 1 a 8 minutos, causa una eliminación máxima
de actividad enzimática de la
\beta-(1,3)-D-glucanasa presente.
Entonces la suspensión se filtra y se lava completamente con agua,
de forma que los componentes solubles en agua se eliminan.
La suspensión de reacción se blanquea a
continuación con peróxido de hidrógeno en presencia de hidróxido de
sodio o de potasio a una concentración de glucano insoluble de 4 a
5% en peso. La deshidratación se realiza con etanol, acetona o por
liofilización.
Se ha visto que la desfibración que se realiza en
5 minutos es preferible.
Se ha visto también que en el transcurso de la
filtración, los componentes solubles en agua, como, por ejemplo,
las proteínas, cenizas, enzimas, sacáridos y otros, son
eliminados.
También se ha visto que además de usar agentes
deshidratantes, como el etanol y la acetona, es preferible llevar a
cabo la deshidratación mediante liofilización. Si elegimos la
deshidratación, se obtiene el glucano de una pureza del 94%. El
glucano de esta pureza es adecuado para la preparación de
vacunas.
La principal ventaja del método según la presente
invención consiste en que nos permite obtener un rendimiento del 15
al 20% superior en relación con la materia seca de la materia prima
de entrada. Otra ventaja consiste en que se obtiene una blancura de
un 20 a un 30% superior del glucano obtenido en comparación con los
métodos hasta ahora conocidos. Una ventaja no menos importante
reside en la ventaja ecológica de este método, puesto que se
consigue una reducción máxima de costes de tratamiento de aguas
residuales. Según esta invención, el contenido de sustancias
orgánicas en las aguas residuales de lavado disminuye un 30% y el
contenido de glucano soluble en agua se reduce en un 15 a 20%.
En un mezclador industrial, 20 Kg de tallos de
hongos de ostra que fueron recogidos 5 horas antes, se desfibran en
un medio de solución acuosa de carbonato de sodio que consiste en
40 litros agua potable, y 60 gramos de carbonato de sodio. La
desfibración tiene lugar en el mezclador durante 3 minutos, de donde
resulta una suspensión homogeneizada.
El carbonato de sodio presente asegura que el
valor del PH del medio sea de 8, PH al cual la actividad enzimática
de la \beta-(1,3)-D-glucanada es
eliminada y simultáneamente se evita la posterior disolución de
glucano insoluble en agua. Tras la desfibración, la suspensión de
reacción se filtra a través de un filtro de tela y se lava
completamente con agua potable, eliminando todas las substancias
solubles en agua, tales como proteínas, cenizas, enzimas,
sacáridos, así como el glucano soluble en agua. La fase líquida
permite que se cuele la porción insoluble de glucano obtenido
mediante el procedimiento anterior, insertándose el mencionado
glucano en un reactor de 50 litros y lavándose con 200 ml de agua,
a los cuales se añaden 80 gramos de NaOH. Tras mezclar
perfectamente, se añaden 2 litros de 30% de peróxido de hidrógeno a
la mezcla de reacción bajo continua agitación, y la mezcla de
reacción se deja estática para que decolore durante 18 horas. Una
vez la decoloración ha concluido, el glucano obtenido se lava
continuamente con agua potable hasta que desaparece la coloración
roja por fenolftaleina. Se añaden 5 litros de agua potable
acidificados con 20 ml de ácido acético a la pastilla del filtro
que, tras haberse mezclado, se lava nuevamente con 10 litros de agua
potable. El glucano húmedo es prensado en una prensa hidráulica, y
se vierten 20 litros de etanol condensado en la pastilla prensada y
se deja para que permanezca durante 1 hora, trasladándose a
continuación la suspensión a una prensa con inserción de tela
después de secar con prensado. La deshidratación con fenol se repite
dos veces más, y entonces el glucano obtenido es secado a una
temperatura de 60°C. El glucano secado se deposita en una prensa
seca y se tamiza con un tamiz de una malla de 0,5mm.
El glucano resultante con un rendimiento del 70%
sobre el peso de la materia seca de tallo de hongo de ostra no es
soluble en agua, en ácidos diluidos así como en disolventes
orgánicos. Contiene el 0,6% de nitrógeno de quitina, 1,5% de ceniza
y tiene una partícula de 0,5mm.
El procedimiento utilizado es el mismo que el del
Ejemplo 1 excepto que los 1,5 litros de peróxido de hidrógeno
tienen una concentración del 30% en peso utilizado para el
blanqueado y que ahora el blanqueado se realiza durante 24 horas a
una temperatura de 23°C.
El rendimiento y los parámetros de calidad de
glucano son comparables a los parámetros cualitativos del glucano
del Ejemplo 1.
El procedimiento utilizado es el mismo que en el
Ejemplo 2 excepto que la deshidratación de glucano húmedo se
realiza mediante liofilización de la cual se obtiene un glucano de
polvo fino adecuado para la preparación de vacunas en medicina
veterinaria.
El procedimiento utilizado es el mismo que en
ejemplo 3 excepto que durante el mezclado de los hongos de ostra
fresca se utilizan 80 gramos de carbonato de potasio en lugar de
carbonato de sodio.
El rendimiento y los parámetros de calidad del
glucano son comparables a los parámetros de calidad del glucano del
Ejemplo 1.
El glucano obtenido según el método de esta
invención puede ser utilizado como un suplemento de producto
alimenticio inmunoestimulante contra enfermedades bacterianas y
víricas o con un efecto de protección frente a radiación en
radioterapia de pacientes oncológicos.
Claims (7)
1. Un método de aislamiento de glucano
inmunoestimulante a partir de hongo de ostra (Pleurotus
ostreatus) preferiblemente de sus tallos, por desfribración, con
posterior blanqueado con peróxido de hidrógeno a una temperatura de
15 a 25°C durante 15 a 24 horas en un medio de una solución de
hidróxido de sodio y deshidratación, caracterizado porque la
desfibración que precede a la decoloración con peróxido de
hidrógeno en un medio de una solución de hidróxido de sodio con una
concentración de glucano insoluble de 4 a 5% de peso con la
deshidratación, se lleva a cabo en el plazo de 26 horas, a más
tardar, tras haber recogido el hongo de ostra a una temperatura de
4° a 8°C, en un medio de como mínimo una doble cantidad de solución
acuosa de carbonato de sodio potasio con una concentración de 0,05
a 0,15% de peso, con un valor PH de la solución de 8 a 9 durante 1
a 8 minutos, de donde se produce una suspensión de reacción, con
actividad enzimática eliminada de
\beta-(1,3)-D-glucanasa presente,
eliminando los componentes solubles en agua de la suspensión de
reacción mediante filtración y mediante un lavado profundo con
agua.
2. Un método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la decoloración con peróxido de
hidrógeno se realiza en un medio de solución de hidróxido de sodio
con una concentración de glucano insoluble de 0,05 a 0,09% de
peso.
3. Un método según la reivindicación 1 y 2
caracterizado porque la desfibración se realiza
preferiblemente durante 5 minutos.
4. Un método según las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque se prefiere realizar la desfibración en
un plazo de 24 horas después de recoger los hongos de ostra.
5. Un método según las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque se prefiere realizar la desfibración de
hongo de ostra que ha sido almacenado a una temperatura de 5°C.
6. Un método de conformidad con las
reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque la
deshidratación se ha realizado con etanol, acetona o por
liofilización.
7. Un método según las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque los componentes solubles en agua, como
proteínas, cenizas, enzimas, sacáridos, glucano soluble en se
eliminan de la suspensión por filtración.
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