SK188490A3 - Substituted disulfide, conjugate thereof having a carrier and processes for preparing both disulfide and conjugate - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka disulfidových zlúčenín zložiek alfa_i, alfa^, alfa₃, alfa^, beta^, beta₂, gama, delta a pseudoglykónových zložiek komplexu LL-33288 a ich derivátov, ako aj disulfidových zložiek antibiotík BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD114759, PD115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D,

CL-1577E a CL-1724 a ich derivátov, pripravených reakciou antibiotika s nesubstituovaným alebo substituovaným alkylmerkaptánom. Tieto disulfidové zlúčeniny sú účinné protinádorové látky.

Vynález sa rovnako týka konjugátov účinnej látky s nosičom uvedených disulfidových analógov, pripravených z vyššie uvedených látok. Nosičovou časťou konjugátu je monoalebo polyklonálna protilátka, jej fragmenty, chemicky alebo geneticky manipulované homológy alebo rastové faktory alebo steroídy. Vynález sa rovnako týka spôsobov prípravy uvedených substituovaných disulfidov a uvedených konjugátov.

Doterajší stav techniky

Skupina antibakteriálno a protinádorovo účinných látok, známa pod spoločným označením komplex LL-E33288, je popísaná v európskej patentovej prihláške 0182152A3. Táto skupina látok sa používa na prípravu disulfidových protinádorovo účinných látok, pričom niektoré z nich sú východzími látkami pre nosičové formy protinádorových látok podľa vynálezu. Európska patentová prihláška 0182152A3 popisuje komplex LL-E33288 a jeho zložky, najmä LL-E33288alfa^-Br, LL-E33288alfa^-I, LL-E33288alfa₂-Br,

LL-E33288alfa -I,

LL-E33288alfa -Br,

LL-E33288beta -Br,

LL-E33288gama_;L-I, prípravy aerojjnou

LL-E33288alfa -Br,

LL-E33288beta -Br,

LL-E33288beta -I,

LL-E33288delta -I, fermentáciou za

LL-E33288alfa -I,

LL-E33288beta -I,

LL-E3 3 288gama^-Br, ako aj spôsoby ich použitia nového kmeňa

Micromonospora echinospora ssp. calichensis alebo jeho prirodzených alebo odvodených mutantov. Uvedená európska patentová prihláška rovnako uvádza navrhnuté štruktúry pre niektoré z vyššie uvedených zložiek. Tieto navrhnuté štruktúry sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 1.

Tabuľka 1.

izolované z orírodnvc.h

Navrhnuté štruktúry pre látky CH^-SSS-W

Daalfl-nat+orr	R1	r2	R?	r4	R5	R6	R7	X
E33288o2'	Αη	R2*	H	H ·	c2h5			I
E33288a/	Aľi	H	H	r4.				I
£332883/	Aľi	R2·	H	r4.	(ch3)2ch			I
£332887/	*h	R 2'	H	r4-	c2h5			I
Ε332Θ85/	Ah	R2*	H	r4.	ch3			I
Ε33288β1 ΒΓ	Aľi	R 2 ·	H	r4.	(CH3)2CH			Br
E33288y1 Br	Ah	R 2'	H	r4.	C2 h5			Br
E33288o2 Bf	Ári	R 21	H	H	c2h5			Br
E33288a3 Br	*h	H	H	r4.				Br
Esperamlcln A-|	ch3	R 2 ·	r3<		(CH3)2CH	H	Ar2
Esperamlcln A2	ch3	R 2 *	r3·		(Ch3)2ch	Ar2	H
Esparamlcln A1b	ch3	R 2*	r3·		ch3ch2	H	Ar2

Ďal’šie zložky komplexu LL-E33288 sú popísané v európskej patentovej prihláške 027485A2. Rovnako tieto zložky sú vhodné na prípravu disulfidových derivátov a nosičových foriem protinádorovo účinných látok podľa vynálezu. Uvedená patentová prihláška popisuje LL-E33288bróm a jód-pseudoglykóny radu, ktorý bol pripravený chemickou cestou. Táto prihláška rovnako popisuje dihydroderiváty, ktoré je možné pripraviť zo všetkých vyššie uvedených protinádorovo účinných antibiotík redukciou ketoskupiny na uhlíku C na hydroxylovú skupinu za použitia borohydridu sodného. Štruktúry navrhnuté pre tieto zložky sú uvedené v ďalej zaradenej tabuľke 2. Ďaľšie zložky skupiny protinádorových antibiotík LL-E33288 sú popísané v patente US 5,079,233. Rovnako tieto zložky sú vhodné pre prípravu nosičových foriem protinádorových látok podľa vynálezu. Táto prihláška popisuje N-acylderiváty niektorých zložiek komplexu LL-E33288, ktoré boli pripravené chemickou cestou. Rovnako navrhnuté štruktúry týchto derivátov sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 2.

Tabuľka 2

Navrhnuté štruktúry pre látky CH₃-SSS-W navrhnuté chemickou cestou od zlúčenín z tabuľky 1 (všeobecným substituentom W je zvyšok pripojený ku skupine CH₃~SSS-)

OR,

CH, oct\

^0CtS OH

Tabuľka 2 (pokračovanie)

C:'2 íUtCÍ. vtcé Oaatgnatlon	R1	Rj	r3	r4	RS	r5.	r6	r7	r8	Rg	X
Dlhydro LL-E33288djl	Ar,	R,·	H	H	c,h5	u			r, u
N-Acyl L L-E3 3 2 8 8 α2'	Ar,	Rj.	H	H	CjH5	RCO				=o	I
Dlhydro LL-E33288QJ1	Ar,	H	H	r4-					OH	H	l
Dlhydro LĽ-E33288P,'	Ar,	Rj·	H	r4.	(CHjjjCH	H			OH	H	1
N-Acyl ΙΛ-Ε33288β,'	Ar,	Rj.	H	r4.	(CH3)jCH	RCO				=0	1
Dlhydro LL-E33288y1 l	Ar,	r2·	H	r4.	CjHs	H			OH	H	1
N-Acyl LL-E33288y,'	Ar,	Rj·	H	r4.	CjHs	RCO				=O	1
Dlhydro LL-E332885,1	Ar,	r2·	H	r4.	ch3	H			OH	H	1
N-Acyl LL-E332885,'	Ar,	r2·	H	r 4·	ch3	RCO				=o	1
lodo LL-E33288	Ar1	H	H	H						=o	1
paaudoaglyeon·
Dlhydro-lodo LL-E33288	Ar,	H	H	H					‘ OH	H	1
paeudoaglycon·
Olhydra LL-E33288£,“'	Ar,	Rj-	H	r4.	(CH3)2CH	H			OH	H	Br
N-Acyl LL-E33288p,er	Ar,	Rj·	H	r4'	(CH3)jCH	RCO				=O	Br
Dlhydro LL-E33288y,Br	Ar,	Rj-	H	r4.	c2h5	H			OH	H	Br
N-Acyl LL-E3328 8 γ, B '	Ar,	r2·	H	r4.	C2hS	RCO				=O	Br
Dlhydro LL-E33288tx;[ B'	Ar,	Rj·	H	H	c2hS	H			OH	H	Br
N-Acyl LL-E33288ctjBr	Ar,	r2·	H	H	c2hs	RCO				= O	Br
Dlhydro-E33288ajBr	Ar,	H	H	r4.					OH	H	Br
Bromo LL-E33288	Ar,	H	H	H						= O	Br
paaudoaglycon·
Dlhydro-bromo LL-E33288	Ar,	H	H	H					OH	H	Br
paaudoaglyoon·
N-Acatyl Eaparamlcln A,	ch3	R j·	r3.		(CH-j ) jC H	CH3C O	H	Arj
N-Acatyl Eaparamlcln Aj	ch3	Rj·	r3.		(CH3)jCH	CHjCO	Arj	H
N-Acatyl Eaparamlcln A·, j,	ch3	r2.	r3.		ch3ch2	CH3CO	H	Arj

.JlVÓCCťt.

R značí atóm vodíku alebo rozvetvenú alebo priamu alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 10 uhlíkových atómov, alkylénovú skupinu obsahujúcu 1 až 10 uhlíkových atómov, arylovú skupinu, heteroarylovú skupinu alebo arylalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 5 uhlíkových atómov, alebo heteroarylalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 5 uhlíkových atómov, pričom všetky tieto skupiny môžu byť prípadne substituované aspoň jedným substituentom zo skupiny zahrnujúcej hydroxylovú skupinu, aminovú skupinu, karboxylovú skupinu, atóm halogénu, alkoxylovú skupinu obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy a tioalkoxylovú skupinu obsahujúcu 1 až 5 uhlíkových atómov.

V rámci vynálezu sú použiteľné aj niektoré ďalšie protinádorové a antibakteriálne zlúčeniny, najmä :

1) Esperamycín BBM-1675, účinných protinádorových vlastnosti a rapciálna M.Konishi-m a kol. v predstavujúci novú skupinu vysoko antibiotík, pričom fyzikálnochemické štruktúra týchto látok je popísaná J . Antibiotics , 38, ious iíjso ) a zodpovedajúci nový protinádorový antibiotický komplex popísal Konishi a kol. v patentovej prihláške GB 2,141,542A,

2) nové protinádorové antibiotiká popísané v patentových dokumentoch FR-900405 a FR-900406, pričom taxonómia produkčného kmeňa bola popísaná M.Iwami-m a kol. v J. Antibiotics 38, 835 (1985) a produkcia, izolácia, charakterizácia a protinádorová účinnosť bola popísaná S. Kiyoto-em a kol. v J. Antibiotics, 38, 340 (1985),

3) PD 114759 a PD 115028, predstavujúce nové protinádorové antibiotiká s fenomenálnou potenciou, pričom izolácia a charakterizácia týchto látok bola popísaná R.H.Bunge-m a kol., v J. Antibiotics, 37, 1566 (184) a biologická a biochemická účinnosť nového protinádorového antibiotiká PD 114759 a jeho derivátov bola popísaná D.W.Fry-om a kol. v Investigational New Drugs, 4, 3 (1986) ,

4) nové antibiotické komplexy CL-1577A, CL-1577B produkovanej kmeňom Streptomyces sp. ATCC 39363 a popísané v európskej patentovej prihláške 0,13 2,082-A2,

5) antibiotické protinádorové zlúčeniny CL-1577D a C1-1577E, ktoré sú spoločne s ich produkciou a použitím popísané v patente US 4,539, 203,

6) antibiotické zlúčeniny CL-1724, ktoré sú spoločné s ich produkciou a použitím popísané v patente US 4,554,162,

7) nové protinádorové antibiotiká BBM-1675-A3 a BBM-1675-A4, získané fermentáciou Actinomadura verrucosospora, kmeňov H9646

92(ATCC 39334) alebo AB27Y (ATCC 39638) a popísaná v patente US 4,675,187 a

ΓΊ1^—GS OSX*3>TQ1 C T ΤΊ <3 θ *» \,^rpí γ \7 A A ŕi A ä ' '‘'L * · * — ' · - --_χ f ~-₂ ” “ito antimikrobiálnou a protinádorovou účinnosťou, popísané v európskej patentovej prihláške 289,030.

Celkové štruktúry esperamicínov Α_χ, A^ a A^_fa (komplex BBM-1675) a ich N-acetylových derivátov už boli popísané a sú uvedené vo vyššie uvedených tabuľkách 1 a 2. Fyzikálne charakteristiky ostatných vyššie uvedených protinádorových antibiotík ukazujú, že všetky tieto látky majú podobnú alebo dokonca rovnakú štruktúru ako uvedené esperamicíny a že všetky obsahujú funkčnú metyltritioskupinu.

Z vyššie uvedených štruktúr zložiek alfa^, alfa^, alfa₃, alfa^, beta^, beta^, gama^, delta a pseudoglykónových zložiek komplexu LL-33288, ich N-acylových homológov, ako aj zo štruktúr antibiotík BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD114759,

PD115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E a CL-1724 a ich N-acylových homológov je zrejmé, že každá z týchto látok obsahuje vo svojej štruktúre metyltritioskupinu.

Podstata vynálezu

Teraz bolo novo zistené, že reakciou ľubovoľného z vyššie uvedených antibiotík s nesubstituovaným alebo substituovaným alkyl- alebo arylmerkaptánom sa dosiahne vytesnenie metylpertiolátového aniontu z trisulfidového zvyšku za vzniku stabilného disulfidu podľa nasledujúcej reakčnej schémy I. Ostatné zlúčeniny, ktoré môžu byť podrobené tejto transformácii, sú popísané v európskej patentovej jrpihláške publikovanej pod číslom 0313874A2.

Reakčná schéma I

Q-Sp-SH ch₃-sss-w ------------ Q-Sp-SS-W

Predmetom vynálezu je substituovaný disulfid všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, odvodený od zlúčenín CH₃SSS-W, označovaných ako LLE33288alfai-Br, LL-E33288alfa₁-I, LL-E33288alfa₂-Br, LL33288alfa₂-I, LL-E33288alfa₃-Br, LL-E33288alfa₃-I, LLE33288alfa₄-Br, LL-E33288betai~Br, LL-E33288betai-I, LĽE33288beta₂-Br, LL-E33288beta₂-I, LL-E33288gamai-Br, LLE33288gamai-I a LL-E33288deltai~I, od ich jód- alebo, bróm pseudoglykónov a ich dihydro- alebo N-acyl-homológov, od látok BBM-1675, FR-900405, FR-900406 a od ich antibiotík

PD114759,· PD115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL1577E a CL-1724 alebo ich N-acetylhomológov pričom v uvedenom všeobecnom vzorci

W znamená

kde

OCH

Pú znamená

r

Rj znamená

R^ znamená

alebo H

Re alebo R₇ znamená

H alebo

Rs	znamená s kupinu	metylovú skupinu, etylcvú skupinu (CH3)2CH,	alebo
R 9	znamená	hydroxylovú skupinu,
r ,	Z Γ. Ξ ľíl Θ Π c.	atóm, vodíka alebo
	a P.9 sco	lu znamenajú karbonylcvú skúpim;,

znamená

Rs' znamená atóm jódu atóm vodíka alebo atóm brómu, znamená ktorá obsahuje 1 až alkylénovú skupinu, atómov, arylovú skupinu obsahujúcu atómov alebo heteroarylovú skupinu alebo rozvetvenú alkylovú skupinu, uhlíkových atómov alebo obsahujúcu 1 až až 11 uhlíkových zvolenú z množiny zahŕňajúcej furylovú skupinu, tienylovú skupinu, Nmetylpyrolylovú skupinu, pyridylovú skupinu, Nmetylimidazolylovú skupinu, pyrimidinylovú izochinolylovú aminokumarinylovú s kupinu, skupinu, skupinu a alebo arylalkylovú skupinu, až 11 uhlíkových oxazolylovú skupinu,chinclylovú skupinu, N-metylkarbazolylovú skupinu, fenazinylovú skupinu arylový a alkylový alebo obsahuj e v ktorej atómov zvyšok obsahuj e až 5 uhlíkových atómov, zvyšok heteroarylalkylovú skupinu, v ktorej

Sp vyššie uvedenej až môžu zvyšok zvolený zvyšok obsahuje uvedené skupiny jedným substituentom, hydroxylovú skupinu, skupinu, halogén, až 3 obsahujúcu obsahuj úcu až 5 množiny a a1kýlový uhlíkových atómov, pričom byť poprípade substituované zvoleným z množiny, ktorá aspoň zahŕňa aminovú skupinu, karboxylovú alkoxy-skupinu, a alkyltio-skupinu, uhlíkových atómov, nitro-skupinu, uhlíkové atómy znamená priamu skupinu, obsahujúcu 1 alebo rozvetvenú dvojvalenčnú až 18 atómov uhlíka, alkylovú dvojvalenčnú arylovú atómov uhlíka alebo dvoj val oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú skupinu, metylkarbazolylovú skupinu a fenazinyiovú skupinu alebo dvojvalenčnú r·' t arylový zvyšok obsahuje 6 až 11 acómov uhlíka a alkylový zvyšok obsahuje 1 až 18 atómov uhlíka, alebo heteroarylalkýlovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuj e 1 až 18 acómov uhlíka a heteroarylový zvyšok znamená zvyšok zvolený z množiny zahŕňajúcej furvlovú skupinu, tienylovú skupinu, N-metylpyrolylovú skupinu, pyridylovú skupinu, N-metylimidazolylovú s kupinu, oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú s kupinu, izochinolylovú skupinu, Nmetylkarbazolylovú skupinu, aminokumarinylovú skupinu a fenazinyiovú skupinu, alebo dvojvalenčnú alkenylovú alebo alkinylovú skupinu obsahujúcu 2 až 18 atómov uhlíka, pričom Sp môže byť dodatočne substituovaný amino-skupinou, alkylaminoskupinou , obsahujúcou 1 až 10 atómov uhlíka, arylamino-skupinou, obsahujúcou 6 až 11 atómov uhlíka, heteroarylamino-skupinou, v ktorej heteroarylový zvyšok znamená zvyšok zvolený z množiny zahŕňajúcej furylovú skupinu, tienylovú skupinu, N-metylpyrolylovú skupinu, pyridylovú skupinu, N-metylimidazolylovú skupinu, oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú skupinu, izochinolylovú skupinu, N-metylkarbazolylovú skupinu, aminokumarinylovú skupinu a fenazinyiovú skupinu, karboxylovú skupinu, a 1koxyskupinu, obsahujúcu 1 až 3 s 1K y 111 o - 3 .<up i nu 02 s s r. u j u c u 2. a z z .·. c c m o v u n. 1 c κ a ,

Q znamená atóm halogénu, aminovú skupinu, skupinu obsahujúcu dialkylaminovú s zvyšok obsahuje skupinu, v ktorej atómov uhlíka, je heteroarylový množiny, piperazinovú nitrofenylox a 1koxy-s kupinu, hydroxylovú dikarboxyalkylovú obsahuje 1 až 5 skupinu -HCONHNH oxykarbonylovú s v prípade, že je od zlúčenín

LL-E33288alfa₁.I, LL-E33288alfa₃-Br, LL-E33288betai-Br, LL-E33288beta₂-I, LL-E33288deltai-I, až 10 uhlíkových atómov, kupinu, v ktorej každý alkylový až 10 atómov uhlíka, arylaminovú arvlový zvyšok obsahuje 6 až 11 heteroarylaminovú skupinu, v ktorej zvyšok zvolený z vyššie uvedenej piperidinovú skupinu, pyrolidir.ovú skupinu, skupinu, karboxylovú skupinu, ykarbonylovú skupinu, skupinu -CHO, obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové acómy, skupinu, tiolovú skupinu, skupinu, v ktorej alkylový zvyšok atómov uhlíka, skupinu -CCNHNH₂,

2, skupinu -CSNHNH₂, skupinu -NHCSNHNH₂ kupinu alebo skupinu -ONH₂, pričom uvedený substituovaný disulfid odvodený

CH3-SSS-W, zahŕňajúcich LL-E33288alfai_Br,

LL_E33288alfa₂-Br,

LL-E33288alfa₃-I,

LL-E33288beta₁-I,

LL-E332 8 8gamai~Br,

BBM-1675, FR-9004

LL-E33288alfa₂-I,

LL-E33288alfa₄-Br,

LL-E33288beta₂-Br,

LL-E3 32 8 8gamai-I,

05, ER-900406,

PD114759, PR115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D,

CL-1577E alebo CL-1724, potom Q neznamená atóm halogénu, aminovú skupinu, alkylaminovú skupinu, dialkylaminovú skupinu, arylaminovú skupinu, heteroarylaminovú skupinu, piperidinovú skupinu, pyrolidinovú skupinu, piperazinovú skupinu alebo karboxylovú skupinu.

Výhodne je predmetom vynálezu hore uvedený substituovaný disulfid všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom

W znamená

R2 znamená
	h3· h'
		OCH,

alebo Η,

R₄ znamená

alebo H,

Rs znamená metylovú skupinu, etylovú skupinu alebo skupinu (CHtJjCH,

X znamená atóm jódu alebo atóm brómu,

R;' znamená aróm vodíka alebo skupinu RC~, v kccrej

R znamená atóm vodíka, metylovú skupinu alebo mc.nosubstituovanú arylovú skupinu, ktorá obsahuje 6 a atómov uhlíka a

Sp a Q majú hore uvedené významy.

Predmetom vynálezu je rovnako konjugát hore uvedeného substituovaného disulfidu s nosičom, ktorý má všeobecný vzorec

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m (Y) n-m v ktorom

Tu

Sp majú hore uvedené významy.

znamená monokolonálnu protilátku alebo jej fragmenty, alebo jej chemicky alebo geneticky modifikované homológy, znamená aminovú kupinu, karboxylovú skupinu alebo tiolovú skupinu, tvoriacu bočný reťazec protilátky

Tu, aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteinových cukrových zvyškov protilátky Tu, amidoalkyltioskupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 2 až 18 uhlíkových atómov, skupinu -CH2NHNHCOCH3 alebo skupinu

-CH₂NHNHCOCH(nh₂) ch

OH

Z znamená skupiny -CONH-, -CONHN=CH-,-CONHNHCH₂-,

-NHCONHN=CH~, -NHCONHNHCH₂-, -NHCSNHN=CH-,

-NHCSNHNHCH₂-, -ON=CH-, -NH-, -NHCH₂~, -N=CH-,

-C0₂-, -NHCH₂CO₂-, -SS-, r>

O alebo

I

-N!ICOCR₂ -č h (CH )

I ^{Ĺ x}

CO₂H kde x = 0 alebo 1, znamená celé číslo od 1 do 100 a znamená 0,1 až 15.

Výhodne je predmetom vynálezu hore uvedený konjugát substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m v ktorom

W má hore uvedený význam,

Sp znamená priamu alebo rozvetvenú dvojvalenčnú alkylovú skupinu, obsahujúcu 2 až 10 uhlíkových atómov alebo dvojvalenčnú arylalkýlovú skupinu, v ktorej arylový zvyšok obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka a alkylový zvyšok obsahuje 2 až 5 uhlíkových atómov alebo heteroarylalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 2 až 5 uhlíkových atómov a heteroarylcvý zvyšok má významy uvedené v nároku 1, pričom Sp môže byť dodatočne substituovaný amino-skupinou, heteroarylamino-skupinou, v ktorej má ’neteroarylový zvyšok významy uvedené v nároku 1, hydroxy-skupincu alebo tiolovou skupinou, znamená mcnoklonálnu protilátku, ktorá vykazuje antigénom, í znamená aminovú skupinu tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu alebo aldehydovú skupinu odvodenú od giykoproteínových cukrových zvyškov protilátky Tu, Z znamená skupinu -CONH-, skupinu CCNHN=CH-, skupinu -CONHNHCH2- alebo skupinu

I

-NHCOCH--CH ² I (CH_ ) | 2 x

CO-H kde x znamená 0 alebo 1, ^z ' m znamená 0,1 až 15, n znamená celé číslo od 1 do 100.

Predmetom vynálezu je rovnako spôsob prípravy hore uvedeného substituovaného disulfidu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa zlúčenina všeobecného vzorca CH₃SSS-W, kde W má hore uvedený význam uvedie do reakcie so substituovaným merkaptánom všeobecného vzorca Q-Sp-SH, v ktorom Q a Sp majú hore uvedené výzr.amy, v acetonitrile alebo v zmesi acetonitrilu. a tetrahydrofuránu alebo acetonitrilu a dimetylformamidu pri teplote -20 až 40°C počas 1 hodiny až 6 dní.

Výhodne sa reakcia uskutočňuje v prítomnosti jedného ekvivalentu terciárnej amínovej bázy a jedného ekvivalentu organickej karboxylovej kyseliny.

Predmetom vynálezu je rovnako spôsob prípravy hore uvedeného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m v ktorom Sp, W, Tu, n am majú hore uvedené významy,

Y známe ná aminovú alebo karboxylovú skupinu tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu a Z znamená skupinu -CCNH-, skupinu

-NH-, skupinu -N=CH, skupinu -C0₂~

-NHCOCH -ch i

(CH )

I 2

CO H i 2 kde X = 0 alebo 1, ktorého podstata spočíva v tom, že sa s kupinu,

Sp a W majú vyššie všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, uvedené významy a Q znamená.atóm aminovú skupinu, alkylaminovú skupinu, karboxylovú karboxaldehydovú skupiu, hydroxylovú skupinu alebo skupinu anhydridu alkyldikarboxylovéj kyseliny, v ktorej s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu, Y a n majú vyššie uvedený význam, vo vodnom pufri s hodnotou pH

6,5 až 9 pri teplote 4 až 40 °C buď priamo alebo v prítomnosti vo vode rozpustného karbodiimidu.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob prípravy hore uvedeného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca v ktorom Sp, W, Tu, n a m majú hore mená aminovú skupinu tvoriacu bočný a Z znamená skupinu -CONH-, ktorého uvedené významy, Y reťazec protilátky podstata spočíva v znaTu tom

Sp a W majú vyššie uvedené významy íl L ľ id ) Ί pri vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom

Sp a W majú vyššie uvedené významy a Q znamená

alebo

potom sa získaná zlúčenina uvedie do reakcie s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu, Y a n majú vyššie uvedené významy, vo vodnm pufrovanom roztoku s hodnotou pH 6,5 až 9 a pri teplote 4 až 40 °C.

Predmetom vynálezu je d’alej spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W)_n <«n-_m v ktorom Tu, Z, Sp W, Y, m a n majú hore uvedené významy, ktorého podstata spočíva v tom, že sa zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú vyššie uvedené významy a Q znamená skupinu -CONHNH2, uvedie do reakcie s kyselinou dusitou vo vodnom roztoku acetonitrilu za vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca Q^Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú vyššie uvedené významy a Q znamená skupinu -CON₃, a hneď sa táto zlúčenina uvedie do reakcie so zlúčeninou všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu, Y a n majú vyššie uvedené významy.

Predmetom vynálezu je-rovnako spôsob prípravy hore uvedeného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca

Tu-(Z-So-SS-W)

I (Y) n-’ η -7

V ktorom Tu, Sp, W, n a m majú vyššie uvedené významy,

Z známena

-SS- , ,0.'

a Y znamená tiolovú skupinu, tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu alebo amidoalkyltio-skupinu, v ktorej .alkylový zvvšok obsahuje 2 až 18 uhlíkových atómov, ktorého podstata spočíva v tom, že sa zlúčenina všeobecného vzorca . QΞρ-SS-W, v ktorom Sp a W majú vyššie uvedený význam a Q znamená hydroxylovú skupinu, uvedie do reakcie s anhydridom kyseliny alfa-halogénoctovej za vzniku zodpovedajúcej zlúčeniny, v ktorej Q znamená alf a-halogér.acetyloxy-skupinu, a potom sa alfa-halogénacetyloxy-Sp-SS-W alebo zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú vyššie uvedené významy znamená

t

alebo

uvedie čo reakcie s molekulou látky všeobecného vzorca Tu(Y)-, v ktorom Tu má vyššie uvedený význam, Y znamená ic ur.iikových atómov, zavedenú na aminovú funkciu protilátky

Tu s použitím hydroxysukcinimidesteru kyseliny 3-(2ditiopyridyl)propiónovej a následnou redukciou diuiotreitolom alebo amidcalkyltio-skupinu zavedenú na aminovú funkciu prccilátky Tu s použitím 2-iminotiolanu, a n znamená 1 až 10, vo vodnom pufrovanom roztoku s hodnotou pH 4,4 až 7 a pri teplote 4 až 40 °C.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob prípravy hore uvedeného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W)I .

(Y^n-m v ktorom Sp, W a Tu majú hore uvedené významy, Y znamená aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteínových cukrových zvyškov protilátky Tu, Z znamená skupinu -GN=CH-, skupinu -N=CH-, skupinu -CONHN=CH-, skupinu -NHCONHN=CH- alebo skupinu -NHCSNHN=CH-, n znamená 1 až 20 a m znamená 0,1 až 15, vyznačujúci sa tým, že sa zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú vyššie uvedené významy a Q znamená skupinu ~NH₂, skupinu -CONHNH₂, skupinu NHCONHNH₂, skupinu -NHCSNHNH₂ alebo skupinu -ONH₂, uvedie do reakcie s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom má Tu vyššie uvedený význam a Y znamená aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteínových cukrových zvyškov protilátky Tu, v prítomnosti jodistanu kovu alkalických zemín vo vodnom pufri pri hodnote pH 4 až 6,6 pri teplote 4 až 40 °C.

Predmetom vynálezu je rovnako spôsob prípravy hore uvedeného konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W)_m (Y) n-m v ktorom Tu, Z, Sp, W, m a n majú predchádzajúce uvedené významy,

Z znamená skupinu -NH-CH₂~, skupinu -CONHNHCH₂~, skupinu -NHCONHNHCŕý- alebo skupinu -NHCSNHNHCH₂-, a Y znamená skupinu -CH₂NHNHCOCH₃ alebo skupinu

-CHjNHNHCOCH(NH₂)CH₂ ktorého podstata spočíva v tom, že zlúčenina všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W)

I m

v ktorom Tu, Z, Sp, W, Y, n a m majú významy uvedené hore pre túto zlúčeninu, uvedie do reakcie s acetylhydrazínom alebo tyrozinhydrazinom vo vodnom pufri pri pH 4 až 6,5 za teploty 4 až 40 °C za vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca

m v ktorom Tu, Z, Sp, W, n a m majú vyššie uvedené významy a Y znamená skupinu -CH=NHHCOCH₃ alebo skupinu

-CH=NNHCO-CH (NH₂) -CH₂

a potom sa táto zlúčenina uvedie do reakcie s kyanobórohydridom sodným alebo bórohydridom sodným vo vodnom pufri pri pH 4 až 6,5 pri teplote 4 až 40 °C.

Transformácia zlúčenín uvedených v tabuľkách la 2 na zodpovedajúce disulfidy môže byť uskutočnená organických látok obsahujúcich tiolovú skupinu protinádorových a antibakteriálnych činidiel, byť získané produkty ďalej transformované veľkým počtom za vzniku nových ORľSiTl toho ITiOZu. zavedením nových bočných reťazcov, pričom sa získajú ďaľšie nové zlúčeniny, vykazujúce biologickú účinnosť.

Okrem toho, že zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť použité ako protinádorové a antibakteriálne činidlá, sú tieto zlúčeniny tiež použiteľné pre vyhodnocovanie nových protirakovinných prístupov v celulárnej úrovni. Prírodné odovdené antibiotiká, popísané vo vyššie uvedených patentových prihláškach a patentoch, neobsahujú dostatočne silné chromoforné jednotky k tomu, aby ich intracelulárna lokalizácia mohla byť adekvátne popísaná. V prípade, že sa natívne tritiometylové deriváty uvedú v reakciu so zlúčeninami obsahujúcimi tiolovú skupinu, ktoré naviac obsahujú chromofornú jednotku, ktorá absorbuje alebo emituje svetlo v oblastiach elektromagnetického spektra a nie je clonená celulárnymi chromoforami, potom sa takto získa vhodný biochemický nástroj pre štúdium štiepenia dvojreťazcovej DNA a celulárnej lokalizácie tejto triedy zlúčenín. Do rozsahu vynálezu patrí aj zavedenie rádioizotopov (radičné značenie) do získaných produktov reakciou podľa reakčnej schémy 1. Tak napríklad, ak sa E-33288 gama-I uvedie v reakciu so 7-(2-tioetylamino)-4metylkumarínom, získa sa derivát, ktorý po ožiarení ultrafialovým svetlom javí intenzívnu fluoroscenciu, čo umožňuje lokalizáciu tejto zlúčeniny v bunečnom mechanizme.

V tomto uskutočnení vynálezu sa zlúčeniny uvedené v tabuľkách 1 a 2 transformujú organickými látkami obsahujúcimi tiolovú skupinu podľa reakčnej schémy I na nové zlúčeniny, ktoré sú naviac použiteľné ako molekulárne sondy, pričom vo všeobecnom vzorci týchto zlúčenín Q-Sp-SS-W

W,R,R,R,R,R,R,R,R,R,R,R , R , R , R >

2 3 ' 4 ' 5 ' <5 ' ~7 ' tí S ' 2 ' 3 ' -t S '

Ar^, Ar₂ a X majú významy uvedené v tabuľkách 1 a 2,

Sp znač-ír priamu alebo rozvetvenú dvojmocnú skupinu obsahujúcu 1 až 18 uhlíkových atómov, dvojmocnú arylovú alebo heteroarylovú skupinu, dvojmocnú cykloalkyl- alebo heterocykloalkylovú skupinu, dvojmocnú aryl- alebo heteroarylalkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 18 uhlíkových atómov, dvojmocnú cykloalkyl- alebo heterocykloalkylalkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 18 uhlíkových atómov a dvojmocnú nenasýtenú alkylovú skupinu obsahujúcu 2 až 18 uhlíkových atómov a

Q znapá? nesubstituované alebo substituované jadro dibenzooxazínu, rhodaminu, karbostyrilu, kumarínu, fluoresceínu alebo akridínu alebo substituent obsahujúci ako časť svojej štruktúry rádioizotop ³H, ¹⁴C, ³⁵S alebo ³²P.

Rovnako bolo zistené, že vytesnenie metyltritio-jednotky zlúčenín uvedených v tabuľkách 1 a 2, ilustrované reakčnou schémou I, môže byť použité k zavedeniu dištančnej jednotky (Sp, spacer), ktorej rozumná voľba uľahčí zavedenie cielených jednotiek do štruktúry disulfidového derivátu podľa vynálezu. Zavedenie cielených jednotiek do iných disulfidových derivátov je popísané v uverejnenej európskej patentovej prihláške 0313873A1 (úverej. 3.5.1989). Podľa reakčnej schémy I sa takto zlúčeniny všeobecného vzorca CH₃SSS-W, kde CH₃SSS-W značia protinádorové antibiotikum

LL-E33288alfa -Br,

LL-ESažSealfa -I,

LL-ESSZSSalfa -Br,

LL-E33288alfa -I,

LL-E33288alfa -Br,

LL-E33288alfa -I,

LL-E33288alfa -Br, '

LL-E33288beta -Br,

LL-E33288beta -I,

LL-E33288beta -Br,

LL-E33288beta -I,

LL-E33288oama -Br,

LL-E33288gama_;L-I,

LL-E33288delta -I,

jód alebo analógy,

brómpseudoáglykóny, ich dihydro- alebo N-acetylové

BBM-1675,	Λ'Τ,.-Ί -X / ! L \ f
FR-900405,	CL-1577B,
FR-900406,	CL-1577D,
PD114759,	CL-1577E,
PD115028,	CL-1724, alebo ich A-acetylové analógy,

najskôr uvedú v reakciu so zlúčeninou všeobecného vzorca

Q-Sp-SH za vzniku medziproduktu Q-Sp-SS-W v ktorom

Sp značí priamu alebo rozvetvenú dvojmocnú alebo trojmocnú skupinu obsahujúcu 1 až 18 uhlíkových atómov, dvojmocnú alebo trojmocnú arylovú alebo heteroarylovú skupinu, dvojmocnú alebo trojmocnú cykloalkylovú alebo heterocykloalkylovú skupinu obsahujúcu 3 až atómov, dvojmocnú alebo trojmocnú heteroarylalkylovú skupinu obsahujúcu 1 až uhlíkových aryl- alebo uhlíkových atómov, dvojmocnú alebo trojmocnú cykloalkyl- alebo heterocykloalkylalkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 18 uhlíkových atómov alebo dvojmocnú alebo trojmocnú nenasýtenú alkylovú skupinu obsahujúcu 2 až 18 uhlíkových atómov, pričom v prípade, že Sp značí trojmocnú skupinu, potom môže byť táto skupina naviac substituovaná aminovou skupinou, alkylaminovou skupinou, arylaminovou skupinou, heteroarylaminovou skupinou, karboxylovou skupinou, nižšou alkoxylovou skupinou, hydroxyskupinou, tiolovou skupinou alebo nižšou alkyltio-skupinou, s výhradou pozostávajúcou v tom, že keď CH₃-SSS-W je tvorené materským protinádorovým antibiotikom

LL-E33288alfa -Br,

LL-E33288alfa -I,

T.T.-P! T OBSa 1 F=> -Πν

LL-E33288alfa -I,

LL-E33288alfa -Br,

LL-E33288alfa -I,

LL-E33288alfa -Br, '

LL-E33288beta -Br, LL-E33288beta -I, t t _τ?-5 q o a _o~AUXJ J-l -J AJ AJ J- ,

LL-E33288beta -I,

LL-E33288gama_i-Br, LL-E33288gama._L-I,

LL-E33288delta -I, ľL '

BBM-1675,	CL-1577Ä,
FR-900405,	CL-1577B,
FR-900406,	CL-1577D,
PD114759,	CL-1577E, alebo
PR115028,	CL-1724,

potom Sp nemôže byť dvojmocnou skupniou, a ./litóccc

Q znapí alebo môže aminovú skupinu, karboxyaldehydovú byť nasledovne prevedený na atóm halogénu, alkylaminovú skupinu, karboxylovú skupinu, skupinu, hydroxy-skupinu, tiolovú skupinu, alfa-halogénacetyloxy-skupinu, nižšiu skupinu, skupinu -CONHNH^, skupinu -NHCSNHNH-,, skupinu -ONH^ , skupinu -CON^ , alkyl-dikarboxylovú NHCONHNH^, skupinu alebo skupiny

>

/

s výhradou pozostávajúci v tom, že keď Sp značí a W má význam uvedený v tabuľkách 1 a 2.

Pokiaľ produkt z reakčnej schémy I obsahuje aspoň jednu funkčnú skupinu, ktorá môže byť prevedená na cielenú jednotku (Tu, targeting uniť) alebo ktorá priamo reaguje s cielenou jednotkou, potom môže byť cielená forma protinádorových antibiotík z vyššie uvedených patentov a patentových prihlášok získaná spôsobom, ktorý je ilustrovaný nasledujúcou reakčnou schémou II :

TU-(Y) n

Q-Sp-SS-W--------------------TU- ( Z-Sp-SS-W) v ktorom

Q, Sp a W majú vyššie uvedené významy,

Tu značia ^zmono- alebo polyklonálnu protilátku, jej fragmenty, jej chemicky alebo geneticky manipulované analógy alebo rastové faktory alebo steroídy, /UctijC-iC

Y znapí bočnú aminovú skupinu, karboxylovú skupinu alebo tiolovú skupinu proteínov, aldehyd odvodený od uhlohydrátových zvyškov alebo amidoalkyltio-skupinu, 'VnCv-tĽ n značí· celé číslo od 1 do 100 ,

Z je vytvorený kovalentnou reakciou skupín Q a Y priamo alebo po nasledujúcej redukcii a

Z skupinu -CONH-, skupinu -CONHN=CH-, skupinu -CONHNHCH^-, -NHCONHN=CH-, -NHCONHNHCH^-, skupinu NHCSNHN=CH-, skupinu -NHCSNHNHCH__, skupinu -ON=CH-, skupinu -NH-, skuninu —NHCH — - skupinu —N=cw— skupinu —CO —, skuoinu NHCH^CO^-, —SS—, skupinu

a /eís

-NHCOCH -CH j

(CH ) ' 2 ' O

CO H znapí 0,1 až

Ako príklad vzťahujúci sa k vyššie uvedenej reakčnej schéme II sa dá uviesť, že deriváty kyseliny 3-merkaptopropionovej N-acetyl-E-33288gama_i-J (Q=CO₂H, Sp=-CH₂CH₂-) v prípade, že sú prevedené na ich aktivovanú hydroxysukcinimidovú formu (Q=CO₂Su, Sp=-CH₂~CH₂-), môžu byť použité k reakcii s niektorou z €-aminových skupín lyzínových zvyškov (napr. Tu= monoklonálna protilátka, Y=-NH₂, kde n=50-100, z dostupných lyzínových zvyškov) pri pH 7,0 až 9,5 vo vodných pufrovaných roztokoch za teploty 4° až 40° C, pričom sa získajú cielené formy antibiotík pripojené k nahodilým miestam pozdĺž základného proteínového reťazca (Tu=monoklonálna protilátka*, Z=-NHCO-, Sp=-CH₂CH₂~, m=l až 10). Týmto spôsobom je substituovaný iba zlomok dostupných dostupných lyzínových zvyškov, pretože vysoký stupeň substitúcie nie je všeobecne považovaný za kompatibilný so zachovaním protilátkovej imunoreaktivity.

Ten istý nahodile substituovaný imunokonjugát môže byť rovnako pripravený z derivátov kyseliny 3-merkaptopropionovej za použitia ďalších činidiel aktivujúcich karboxylovú skupinu, akými sú rôzne karbodiimidy alebo zodpovedajúce acylazidy.

Alternatívne 3-merkaptopripionylhydrazidový derivát N-acetyl-LL-ESSSŽSSdelta^-JÍÚ^H^NNHCO-, Sp=-CH₂CH₂~) v prípade, že je uvedený v reakciu s jodistanom oxidovanou protilátkou (Tu=monoklonálna protilátka, Y=-CHO, n=l až 15), ako je to popísané v patente US 4,671,958, pri pH 4 až 7 v pufrovanom vodnom roztoku za teploty 4° až 40° C, reaguje iba na úrovni aldehydovej funkcie (odvodenej zo štiepenia vic-diolov uhlohydrátových zvyškov situovaných na Fc časti protilátok) za vzniku monoklonálnych protilátkových konjugátov, obsahujúcich účinnú látku substituovanú v špecifických miestach pozdĺž hlavného reťazca proteínu (Tu=monoklonálna protilátka, Z=-CH=NNHCO-, Sp=-CH CH m=0,5 až 10).

Za účelom blokovania nezreagovaných aldehydových skupín na protilátke a teda aj za účelom zabránenia zosieťovania a stabilizácie hydrolyticky labilných väzieb Schiffovej báze je výhodné (aj keď však nie nevyhnutné) uviesť posledný uvedený konjugát v reakciu najskôr so zlúčeninou, ako je acetylhydrazid alebo tyrozínhydrazid, a potom podrobiť redukcii kyanoborohydridom sodným alebo borohydridom sodným za vzniku stabilizovaných konštruktov podľa vynálezu (Tu=monoklonálna protilátka, Z=-CH₂NHNHCO-, Sp=-CH₂CH₂~, m=0,5 až 10). Za účelom získania produktov spôsobom podľa reakčnej schémy II sa podľa vynálezu používajú aj ďal’šie skupiny reagujúce s aldehydom, tvoriace súčasť konštruktu účinnej látky. Takýmito funkčnými skupinami sú výhodne, aj keď nie výlučne, skupiny, ktoré reagujú s aldehydom za kyselých vodných podmienok. Reaktivita proteínových lyzínov je za bázických podmienok natoľko vysoká, že ich aminy súperia s produktami reakčnej schémy II o dostupnej aldehydovej funkcii monoklonálnej protilátky. Alternatívnymi skupinami reagujúcimi s aldehydom sú napríklad semikarbazidové skupiny, tiosemikarbazidové funkcie a O-substituované hydroxylaminové funkcie.

f

Vytvorenie cielených foriem zlúčenín uvedených v tabuľkách a 2 nie je obmedzené na sekvenciu uvedenú v reakčnej schéme II. Cielená jednotka (Tu) môže byť najskôr modifikovaná tak, aby obsahovala tiolovú skupinu, nato sa uvedie v reakciu so zlúčeninami uvedenými v tabuľkách 1 a 2 soôsobom uvedeným v nasledujúcej reakčnej schéme III :

TU(Y) + Q-Sp-S-P ---*· Tu-(Z-Sp-SH) m m (Y) n —m

CH -SSS-W

Tu-(Z-Sp-SS-W) i

(Y) n — m v ktorom Tu, Y, Q, Sp, W, n am majú vyššie uvedený význam a P značí atóm vodíku alebo 2-(pyridyltio)-skupinu s výhradou pozostávajúcou v tom, že keď Y značí tiol odvodený od .aminokyselinového zvyšku hlavného reťazca Tu, potom Z-Sp spolu značí kovaletnú väzbu.

Ako príklad vzťahujúci sa k reakčnej schéme III sa dá uviesť, že monoklonálna protilátka môže byť uvedená v reakciu s esterom kyseliny 3-(2-ditiopyridyl)propionovej a hydroxysukcinimidu za účelom modifikácie proteínu lyzínovými zvyškami (Tu=monoklonálna protilátka, Y-NH^, n=50 až 100,

Q=-CO₂Su, Sp=-CH₂~CH₂-, P=2-pyridyltio). Nasledujúcou redukciou, uskutočnenou napríklad ditiotreitolom, sa získa medziprodukt (Tu=monoklonálna protilátka, Z=-NHCO-,

Sp=-CH₂CH₂-, m= 1 až 15), ktorý môže byť uvedený v reakciu so zlúčeninami z tabuliek la 2 za vzniku požadovaných imunokonjugátov.

Obdobne môže byť 2-iminotiolan uvedený v reakciu s monoklonálnou protilátkou za účelom priameho zavedenia tiolových skupín na povrch proteínu, beztoho, že by pritom bolo nevyhnutné uskutočniť redukčný stupeň (Tu=monoklonálna protilátka, Z=-NHCO-, Sp=(CH₂)₃-, medziprodukt môže byť uvedený v m=l až 15) a tento reakciu so zlúčeninami

Alternatívne sa môžu priamo zúčastniť reakcie podľa reakčnej schémy III sulhydrylové skupiny inherentne v štruktúre monoklonálnych protilátok v dimérnej forme ako cystinové zvyšky. Takéto sulhydryly sa tradične podrobujú kombinácii enzýmatickej digescii a redukcii natívnych monoklonálnych protilátok (Tu=Fab-fragment, Z-Sp=väzba, Y=SH), aj keď je treba rátať s použitím geneticky modifikovaných konštruktov monoklonálnych protilátok obsahujúcich nepárové cystinové zvyšky.

Výhodným uskutočnením cielených derivátov podľa vynálezu je konjugát proteín-účinná látka všeobecného vzorca :

Tu-(Z-Sp-SS-W) (Y) ktorý sa pripraví zo skupiny protinádorových antibiotík označených ako LL-E33288 (CH₃SSS-W) postupom, ktorý zahrnuje :

vytesnenie ditiometylového zvyšku zlúčeninou všeobecného vzorca Q-Sp-SH, v ktorom Sp znapr priamu alebo rozvetvenú dvojmocnú alebo trojmocnú skupinu obsahujúcu dvojmocnú alebo až 10 uhlíkových atómov alebo trojmocnú arylalkylovú alebo heteroarylalkylovú skupinu obsahujúcu 2 až 5 uhlíkových atómov, pričom v prípade, že Sp značí trojmocnú skupinu, môže byť táto skupina naviac substituovaná aminovou skupinou, heteroarylaminovou skupinou, hydroxy-skupinou alebo tiolovou skupinou a . -Ί- P'U'tUí.

Q značí karboxylovú skupinu, nižšiu alkyldikarboxylanhydridovú skupinu, C0₂Su, -CONHNH₂ alebo skupinu

za vzniku medziproduktu všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Q, Sp a W majú vyššie uvedený význam, a reakciu uvedeného medziproduktu všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W so zlúčeninou všeobecného vzorca Tu-(Y) , v ktorom Tu značí monoklonálnu protilátku, ktorá vykazuje preferenčnú reaktivitu s ľudským antigénom združeným s nádorom,· Y značí bočnú aminoskupinu protilátky alebo aldehyd získaný oxidáciou uhlohydrátovej skupiny protilátky a n znacjiŕ celé číslo od 1 do 100, za vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W) i

v ktorom Tu, Y, Sp, W a n majú vyššie uvedený význam a Z je vytvorené kovalentnou reakciou skupín^Q a Y, a to priamo alebo ,4-nč-iu po nasledovnej redukcii a Z značí skupinu -CONH-, -CONHN=CH-, skupinu -CONHNHCH^- alebo skupinu

I

-NHCOCH -CH ² I

CO H m zna^í 0,1 až 15.

Za účelom príkladnej protirakovinných zlúčenín monoklonálnych protilátok Monoklonálne protilátky Lym ilustrácie cielenia metyltritioje použitá množina odlišných (MoAb, monclonal antibodies).

a Lym 2 indikujú rôzne antigény na zrelých B-lymfocytoch a ich produkčných lymfómoch. Produkcia a charakteristiky týchto monoklonálnych protilátok sú popísané A.L. Epsteinom a kol., v Cancer Research, 47, 830 (1987. Monoklonálne protilátky B72.3 sú cielené prevažne na karcinómy prsníka a trakčníka, aj keď bola rovnako popísaná ich reakcitivita voči karcinómom pankreasu, vaječníkov a pľúc. Táto monoklonálna protilátka bola popísaná T.L.Klug-om a kol. v Int.J.Cancer, 38, 661 (1986). Monoklonálna protilátka CT-M-01, ktorá je cielená prevažne na nádory prsníka, je popísaná v európskej patentovej prihláške 86 401482.4 (podaná 3.7.1986), zatiaľ kým monoklonálna protilátka MÁC-68 je produkovaná sub-klonovaním hybridomu, ktorý produkuje monoklonálnu protilátku CT-M-01, a indikuje ako karcinómy prsníka, tak aj karcinómy trakčníka.

Medziprodukty uvažovaných zlúčenín a konjugáty s týmito protilátkami sú popísané v ďalej uvedenej príkladovej časti. Je však treba uviesť, že tento patent sa neobmedzuje iba na vyššie uvedené protilátky. Popísaná metodika je dostatočne všeobecná k tomu, aby mohla byť použitá pre všetky protilátky, a to bez ohľadu na ich triedu alebo izotop, na ich enzýmaticky odvodené fragmenty, ich chemicky manipulované a stabilizované fragmenty, ako aj na ich rešpektívné chimérické alebo humanizované analógy.

Ani cielené jednotky (Tu) nie sú obmezdené iba na monoklonálne protilátky. Ako cielené jednotky patria do rozsahu vynálezu aj ostatné proteíny, ako aj malé molekuly, pre ktoré na cieľovom vstupe existujú zodpovedajúce receptory.

Zlúčeniny podľa vynálezu všeobecného vzorca Q-Sp-SS-Ví sú účinné ako antibakteriálne činidlá. Ich antibakteriálna účinnosť voči gram-pozitívnym a gram-negatívnym baktériám môže byť stanovená štandardnou agarovou zrieďovacou metódou.

Muller-Hintonov agar obsahujúci vždy dvakrát menšie koncentrácie antibiotík sa rozleje do Petriho misiek. Povrch agaru sa zaočkuje za pomoci Steerova replikačného zariadenia 1 až 5 x 10⁴

minimálna inhibíčna koncentrácia (MIC) pre daný bakteriálny kmeň sa zaznačí najnižšia koncentrácia testovanej zlúčeniny, ktorá inhibuje rast bakteriálneho kmeňa po asi 18 hodinách inkubácie pri teplote približne 36° C.

Vyššie popísané disulfidové zlúčeniny sú účinné protinádorové činidlá.

Pre testovanie zlúčenín za účelom stanovenia ich spôsobilosti vo funkcii antineoplastických činidiel boli ústavom National Cancer Inštitúte vyvinuté niektoré testovacie systémy in vivo. Tieto testovacie systémy boli popísané v Cancer Chemotherapy Reports, časť III., sv. 3, č. 2 (1972), Geran a kol.. Tieto testovacie systémy boli kodifikované ako štandardné screenové testy, ktoré majú byť všeobecne používané v oblasti testovania protinádorových činidiel. Pre zlúčeniny podľa vynálezu sú z týchto testov významné nasledujúce testy : lymfocytová leukémia P388, melanotický melanóm B16, leukémia L1210 a adenokarcinóm 26 trakčníku. Tieto neoplazmy sú použité pre testovanie vo forme transplantovateľných nádorov u myší. Výrazná protinádorová účinnosť, preukázaná pri týchto testoch percentickým zvýšením strednej doby prežitie ošetrených pokusných zvierat (T) oproti kontrolným pokusným zvieratám, je ukazovateľom obdobných výsledkov dosažiteľných v prípade ľudskej leukémie a ľudských tuhých nádorov.

Test na lymfocytnú leukémiu P 388

Použité pokusné zvieratá sú myšacie samičky BDF^. V každej testovacej skupine je päť alebo šesť myší. Nádorový transplantát bol aplikovaný intraperitoneálnou injekciou 0,5 ml zriedenej ascitnej tekutiny obsahujúcej lymfocytnej leukémie P388. Táto aplikácia x 10® buniek bola uskutočnená v deň nula.

Testované zlúčeniny sa podávajú intraperitoneálne v

0,5 ml sterilného, a 9 (vzhľadom k inokulácii nádoru) v uvedených dávkach. Myši boli zvážené a počet myší, ktoré prežili, bol zaznačený ku 30 dňom. Z výsledkov sa vyráta stredná doba prežitia a pomer doby prežitia ošetrených myší (T) a kontrolných myší (C). Hodnoty T/C vyššie alebo rovné 125 sú považované za hodnoty, ktoré svedčia o významnej protinádorovej účinnosti. Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 3.

Tabuľka 3

Test na lymfocytnú leukémiu P388

Zlúčenina	Dávka (mg/kg)	Stredná doba prežitia (dni)	T/CX100 (%)
Kyselina 3-
merkapto-propionová-	0,005		145
disulfid-LL-E33288-	0,0025		125
gama -I(z príkladu 1)
4-Nitrofenylester kyse-	0,010		135
liny 3-merkapto-propio-	0,005		185
novej,disulfid-LL-E33288-	0,0025		150
gama -I(zpríkladu 2)	n ηηι		Ί o n x J u
3-Merkaptopropionyl-	0,005	18,0	164
hydraziddisulfid-	0,0025	25,0	186
LL-E3 3 288gamai-I	0,00125	19,0	173
(z príkladu 4)	0,0006	15,5	141
Kontrolný pokus	-	11,0	-
3-Merkaptopropionyl-	0,040	15,0	136
hydraziddisulfid-	0,020		123
LL-E33288alfa -I 3
(z príkladu 6)
Kontrolný pokus	-	11,0	-

Tabuľka 3 (pokračovanie)

Test na lymfocytnú leukémiu P388

Zlúčenina	Dávka (mg/kg)	Stredná doba prežitia (dni)	T/CX100 (%)
3-Merkaptopropionyl-	0,080	21,0	175
hydraziddisulfid-N-acetyl	0,040	18,0	150
LL-E3 3 288gama;;L-I	0,020	15,0	125
(z príkladu 7)
Kontrolný pokus	—	12,0	—
3-Merkaptopropionyl-	0,010	26,5	230
hydraziddisulfid-	0,005	21,0	183
LL-E33288alfa -I 2	0,0025	18,5	161
(z príkladu 8)	0,00125	18,5	161
Kontrolný pokus	-	11,5	—
3-Merkaptobutyry1	0,005	28,5	190
hydraziddisulfid-	0,0025	23,0	153
LL-E3 3 288gama.L-I	0,00125	21,0	140
(z príkladu 10)	0,0006	19,5	130
Kontrolný pokus	-	15,0	-
3-Merkaptoizovaleryl-	0,010	26,5	252
hydraziddisulfid-	0,005	18,0	171
LL-E3 3 288gama:L-I	0,0025	17,0	162
(z príkladu 11)	0,00125	16,0	152
	0,0006	13,0	124
	0,0003	14,0	133
Kontrolný pokus	-	10,5	-

Tabuľka 3 (pokračovanie)

Test na lymfocytnú leukémiu P388

Zlúčenina	Dávka (mg/kg)	Stredná doba prežitia (dni)	T/CxlOO (%)
4-Merkaptodihydrocin-	0,005	24,0	200
namylhydraziddisulfid-	0,0025	28,0	233
LL-E3 3 288gama.L-I	0,00125	25,5	213
(z príkladu 12)	0,0006	18,5	154
	0,0003	17,5	146
Kontrolný pokus	-	12,0	—
N-Acetyl-3-merkaptovale-	0,32		118
rylhydraziddisulfid-	0,16		205
LL-ESSlSSgama^-I	0,08		166
(z príkladu 13)	0,04		133
	0,02		117
N-Acetyl-3-merkaptobutyry1	0,32		142
hydraziddisulfid-	0,16		135
LL-E3 3 28 8gama;L-I	0,08		115
(z príkladu 14)	0,04		102
	0,02		109
N-Acetyl-p-merkapto-	0,32		75
dihydrocinnamoyl-	0,16		150
hydraziddisulfid-	0,08		209
LL-E3 3ISSgama^-I	0,04		150
(z príkladu 15)	0,02		146

Test na melanotický melanóm B16

Ako pokusné zvieratá sa pri tomto teste používajú myšacie samičkv BDF1.

V každej testovacej

pokusných zvierat. Jednogramové množstvo národu (melanotický melanóm B16) sa homogenizuje v 10 ml chladného vyváženého roztoku a 0,5 ml alikvot takto získaného homogenizátu sa intraperitoneálne implantuje každej z pokusných myší. Testované zlúčeniny sa podávajú intraperitoneálne v dňoch 1 až 9 ( vzhľadom ku dňu 0, kedy bol implantovaný nádor) v uvedených dávkach. Myši sa zvážia a zaznačí sa počet myší, ktoré prežili k 60 dňom. Z týchto údajov sa vyráta pomer doby prežitia ošetrených myší (T) k dobe prežitia kontrolných myší (C). Ak sa stanoví hodnota T/C vyššia alebo rovná 125 pre niektorú zlúčeninu, potom je táto testovaná zlúčenina považovaná za účinnú látku s významnou protinádorovou účinnosťou.

Spôsob podľa vynálezu, použitý pre prípravu konjugátov na bázi monoklonálnej protilátky zo zlúčenín uvedených v tabuľkách 1 a 2 všeobecného vzorca

Tu-(Z-Sp-SS-W) ^r 'm (Y) ^v * n—m poskytuje konštrukty, ktoré si zachovávajú dobrú imunoreaktivitu s cieľovými bunečnými radmi, čo je preukázané nasledujúcimi testami in vitro.

Cieľové bunky

Všetky cieľové bunky boli prechovávané v prostredí RPMI 1640 obohatenom fetálnym teľacím sérom (FCS), ITS (Collaborative Research, Cat 40351), streptomycínom (50 ,ug/ml), penicilínom (50 jedn./ml), gentamycínsulfátom (50 iig/ml) a glutaminom (0,03 %). Bunky sa prechovávajú vo zvlhčovanom inkubátore (5 % C0₂) pri teplote 37° C.

I. Imunoreakčné testy

Metóda I - Elisa

prostredia, zrátajú a pufrovanom fyziologickom suspendujú v Dulbecco-vo fosfátom roztoku (DPBS) v koncentrácii, ktorá je optimálna pre testovanú monoklonálnu protilátku (MoAb). Do každej jamky 96 jamkovej polystyrénovej sterilnej kultivačnej platne sa zavedie 0,1 ml alikvot buniek. Platne sa potom odstreďujú po dobu 5 minút pri 1000 otáčkach za minútu, nato sa supernatanty jednotlivých jamôk odstránia vytrepaním. Platne sa potom sušia cez noc na vzduchu a môžu byť potom skladované pri teplote 4° C po dobu 3 mesiacov.

Nešpecifické väzobné miesta sa blokujú pridaním 200 juI 1 % želatíny v DPBS do každej jamky a platňa sa inkubuje po dobu 1 hodiny pri teplote 37 θ C vo zvlhčovanom inkubátore (všetky nasledujúce inkubácie sa uskutočnia za rovnakých podmienok). Platne sa potom raz premyjú 250 jul 0,05 % Tweenu-20 v DPBS (premývací roztok) za použitia automatického premývacieho systému Elisa od Dynatech (Ultrawash II).

Vzorky určené k testovaniu sa zriedia na finálnu koncentráciu 3 ng/ml monoklonálnej protilátky v 0,1 % roztoku želatíny v DPBS. Z každých 3 jug/ml vzorky sa pripraví ďalších šesť prahových sériových zriedení a každé zriedenie (každé zriedenie sa použije trikrát) sa zavedie do príslušných jamôk kultivačnej platne. Do spodného radu jamôk sa zavedie ako slepý pokus iba 100 xil 0,1 % roztoku želatíny. Platne sa potom inkubujú po dobu 45 minút, nato sa trikrát premyjú. Purifikované kozie antimurinné imunoglobulíny s konjugovanou afinitou k alkalickej fosfatáze (Cappel Cat 8611-0231) sa zriedia v pomere 1:125 v 0,1 % roztoku želatíny a do každej jamky platne sa pridá 100 Ail tohoto zriedenia. Platne sa inkubujú po dobu 45 minút, nato sa trikrát premyjú. Potom sa do každej jamky pridá 200 jdl p-nitrofenylfosfátového substrátového roztoku (viď nižšie). Po 45 minútach pri teplote okolia sa reakcia zastaví pridaním 50 μΐ 3M roztoku hydroxidu sodného. V automatickom spektrometre od firmy Dynatech (EIA Autoreader EL-310) sa potom odráta absorbancia obsahu každej jamky pri vlnovej dĺžke 405 nm.

Substrátový dietanolaminový pufor (10 %) ml dietanolaminu,

800 ml vody,

0,2 g NaN^ a

100 mg hexahydrátu chloridu horečnatého.

Jednotlivé zložky sa rozpustia za nepretržitého miešania, nato sa k získanému roztoku pridá IM kyselina chlorovodíková až k dosiahnutiu hodnoty pH 9,8. Celkový objem sa potom doplní vodou na 1 liter a roztok sa sterilizuje filtráciou cez filter 0,2 pm filter. Tento pufor sa skladuje v tme pri teplote 4° C. Bezprostredne pred použitím sa v 10 % dietanolaminovom pufri (pri teplote okolia) rozpustí p-nitrofenylfosfát (Sigma, Cat 104-40) k dosiahnutiu finálnej koncentrácie 1 mg/ml.

Výpočet hodnôt zachovanej imunoreaktivity z hodnôt optickej hustoty (OD)

Percentická väzba každej vzorky sa vyráta podľa nasledujúcej rovnice :

A-B

----- x 100= percentická väzba,

C-B v ktorej

A značí priemernú optickú hustotu vzorky,

B značí priemernú optickú hustotu slepého pokusu a

C značí priemernú optickú hustotu 3 jug/ml nemanipulovanej kontrolnej monklonálnej protilátky.

Percentická väzba sa potom vynesie na nelogaritmickej stupnici semilogaritmického grafu a na logaritmickej stupnici sa vynesie koncentrácia monoklonovanej protilátky. Z tohoto rrY'sfu ss odvod.i hodnotní BD f ti. oožsdov^ná d^vkn r>notilátkv k dosiahnutiu 50 % väzby) pre každú testovanú vzorku a miera zachovania imunoreaktivity sa vyráta podľa nasledujúcej rovnice BD_so kontrolnej monoklonálnej protilátky percentická miera -²--x 100- za chova nej i mun o BD_so testovenej vzorky reaktivity

Metóda 2 - Nepriame stanovenie RIA

Príslušné množstvo cieľových buniek v 0,2 ml 10 % FCS-prostredí sa zavedú do 4 ml polystyrénových skúmaviek. Vzorky určené k testovaniu sa zriedia na koncentráciu 2 jig/ml ekvivalentov monoklonálnej protilátky v 10 % prostredí FCS. Z každého 2 ng/ml vzorky sa. pripraví päť trojnásobných sériových zriedení a 0,2 ml každého zriedenia (každé zriedenie vždy dvakrát) sa zavedie do zodpovedajúcej skúmavky. Za účelom slepého pokusu sa do niektorých skúmaviek zavedú iba bunky a uvedené prostredie. Bunky sa inkubujú pri teplote 4 ° C po dobu jednej hodiny, nato sa dvakrát premyjú 2 % prostredím. FCS (všetky premytia RIA sa uskutočnia 3 ml objemu). Do každej skúmavky sa potom pridá 0,05 ml ovčieho F(ab')₂~animurinného imunoglobulínu IgG značeného ^12SJ (DuPont, Cat NEX 162-0142) vykazujúceho približne 500 000 rozpadu za minútu. Bunky sa potom inkubujú ešte hodinu pri teplote 4° C, raz premyjú 2 % FCS a dvakrát PBS. Do každej skúmavky sa pridá 0,5 ml PBS, bunky sa rozvíria, prevedú do čistých skúmaviek a merajú po dobu 1 minúty počítačom Packard Gamma 500.

Percentická väzba sa stanoví a vynesie do grafu rovnako ako v predchádzajúcej metóde Elisa s výnimkou pozostávajúcou v tom, že optická hustota je nahradená počtom rozpadov za minútu a že C značí priemerný počet rozpadov 1 Aig/ml nemanipulovanej kontrolnej monoklonálnej protilátky. Percentická miera zachovanej imunoreaktivity každej vzorky sa vyráta rovnako ako v predchádzajúcom prípade.

Metóda 3 - Nepriame stanovenie RIA

Príslušné množstvo cieľových buniek v 1 ml 10 % prostredí FCS sa alikvótne rozdelí do 4 ml polystyrénových testovacích skúmaviek, skúmavky sa odstredia a supernatant sa odleje. Vzorky určené k testovaniu sa zriedia na koncentráciu 200 jug/ml monoklonálnej protilátky v 10 % prostredí FCS. Ž každého

200 jig/ml vzorky sa pripraví päť trojnásobných sériových zriedení a 0,05 ml tohoto zriedenia sa vždy zavedie (každé zriedenie dvakrát) do príslušnej skúmavky. Do každej skúmavky sa potom pridá 0,05 ml monoklonálnej protilátky značenej rádioizotopom ¹²⁵J (^12SJ-MoAb). Optimálne množstvo sa individuálne stanoví pre. každú MoAb a šaržu. Pozitívne kontrolné vzorky obsahujú bunky, prostredie a ^12SJ-MoAb. Vzorky slepého pokusu obsahujú nešpecifické bunky, prostredie a ^12SJ-MoAb. Bunky sa potom inkubujú po dobu 1 hodiny pri teplote 4° C, raz premyjú 2 % prostredím FCS, dvakrát premyjú PBS, prevedú do čistých skúmaviek a zmerajú rovnako ako v predchádzajúcom prípade.

Percentická inhibícia väzby ^12SJ-MoAb, každej vzorky sa vyráta podľa nasledujúceho vzorca

A-B

--x 100 = percentická inhibícia väzby ^12SJ-MoAb,

C-B v ktorom

A značí priemerný počet rozpadov za minútu vzorky,

B značí priemerný počet rozpadov za minútu slepého pokusu a C značí ho priemerný počet rozpadov za minútu pozitívneho kontrolnej vzorky.

Vynesenie výsledkov do grafu a výpočet zachovanej percentickej imunoreaktivity sa uskutoční rovnako ako v predošlom prípade terez BTD f tή.

0 ‘ ^J k dosiahnutiu 50 % s výnimkou pozostávajúcou v tom, že BD_so je á t r Ír s

-J inhibície väzby ¹²⁵J-MoAb).

Poznámky :

1) Bezprostredne po pridaní každého činidla pri stanoveniach RIA boli skúmavky vždy intenzívne pretrepané.

2) Do každého súboru stanovenia bola začlenená 'vnútorná kontrolná vzorka zahrnujúca 50 % nemanipulovanej kontrolnej monoklonálnej protilátky za účelom zistenia, či každá metóda je kvantitatívna v rámci predbežného určenia zachovania imunoreaktivity konjugátu.

Výsledky uvedených stanovení sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 4.

Tabuľka 4

Imunoreaktivita konjugátu monoklonálnej látky

Preparát Imunoreaktivita v percentách vztiahnutá na imunoreaktivitu nemodifikovanej kontrolnej monoklonálne j protilátky (=100 %) %
Nešpecifické konjuqáty na bázi:		-
3-merkaptopropionylhydra z iddisulfidu zlúčeniny LL-E33288alfa3~I (príklad 6) konjugovaného s : Ľym 1	78
CT-M-01	81
3-merkaptopropi onyIhydra z iddisulfidu zlúčeniny N-acetyl-LL-E3 3 288delta:L-I (príklad 7) konjugovaného s : Lym 1	82
CT-M-01	100
B72.3	100
3-merkaptopropionylhydraziddisulfidu zlúčeniny LL-E33288alfa -I 2 (príklad 8) konjugovaného s : CT-M-01	56

Tabuľka 4 (pokračovanie)

Imunoreaktivita konjugátu monoklonálnej látky

Preparát	Imunoreaktivita v percentách vztiahnutá na imunoreaktivitu nemodifikovanej kontrolnej monoklonálnej protilátky (=100 %) %
3-merkaptopropionylhydra z iddisulfidu zlúčeniny N-acetyl-LL-E33288-pseudoaglykónu
(príklad 9) konjugovaného s : CT-M-01	50
3-merkaptobutyrylhydra z iddisulfidu zlúčeniny LL-E33288delta -I JL (príklad 10) konjugovaného s : Lym-1	73
3-merkaptoizovalerylhydrazid- disulfidu zlúčeniny LL-E33288delta -I (príklad 11) konjugovaného s : Lym 1	64

Tabuľka 4 (pokračovanie)

Imunoreaktivita konjugátu monoklonálnej látky

Preparát	Imunoreaktivita v percentách vztiahnutá na imunoreaktivitu nemodifikovanej kontrolnej monoklonálnej protilátky (=100 %) %
p-merkaptodihydrocinnaiuylhydraziddisulfidu zlúčeniny LL-E33288delta -I (príklad 12) konjugovaného s : Lym-1	61

Konjugáty na bázi monoklonálnej protilátky podľa vynálezu sú účinné ako protirakovinné činidlá. Nižšie popísané testy pre stanovenie cytotoxicity in vitro preukazujú výraznú preferenciu popísaných konštruktov pre cieľové bunečné rady v porovnaní s necieľovými bunečnými radmi a demonštrujú mieru využiteľnosti cielených foriem týchto zlúčenín v porovnaní s ich necielenými analógami.

Test stanovujúci cytotoxicitu in vitro

Vzorky určené k testovaniu sa zriedia na koncentráciu 0,2 alebo 0,02 jjg/ml materskej účinnej látky (východzia koncentrácia je závislá na bunečnom rade a účinnosti materskej účinnej látky). Z každého pôvodného zriedenia vzorky sa pripravia tri alebo štyri ďalšie päťnásobné zriedenia a 0,2 ml tohoto zriedenia sa vždy zavedie do 15 ml sterilnej polystyrénovej skúmavky. Za účelom stanovenia špecifičnosti príslušného konjugátu sa do každého stanovenia zahrnie aspoň jeden obdobný konjugát tvorený materskou účinnou látkou a nepríslušnou (pre dané bunky necielenou) monoklonálnou protilátkou.

10⁵ príslušných cieľových buniek v 0,2 ml 10 % prostredia FCS sa alikvotné rozdelí do skúmaviek a pretrepe sa. Okrem toho sa uskutoční rovnaký test za použitia nepríslušných cieľových buniek za účelom ďaľšieho potvrdenia špecifičnosti príslušného konjugátu. Kontrolné vzorky monoklonálnej protilátky obsahujú iba ekvivalentné množstvo monoklonálnej protilátky a pozitívne kontrolné vzorky obsahujú iba 10 % prostredia FCS.

Bunky sa inkubujú pri teplote 37° C po dobu 7 minút, nato sa štyrikrát premyjú 8 ml 2 % prostredia FCS. Do každej skúmavky sa pridá 0,1 ml 10 % prostredia FCS, skúmavky sa pretrepú a vždy 0,2 ml obsahu skúmavky sa zavedie do jamky 96-jamkovéj sterilnej kultivačnej platne.

Platne sa potom inkubujú po dobu 2 dní vo zvlhčovanom inkubátore (5 % CO^) pri teplote 37° C. Polovica prostredia sa odstráni a nahradí čerstvým prostredím obsahujúcim 2 juCi/ml³

-H-tymidínu (DuPont, NEN, pokračuje po dobu 24 hodín,

Cat.NET-027). V inkubácii sa nato sa bunky zmrazia, ponechajú opäť rozmraziť a izolujú z inkubačného prostredia za použitia zariadenia pre izoláciu buniek PHD (Camridge Technology, Inc.).

Každá vzorka sa potom premeria v priebehu 1 minúty na kanále 1 Beckmanova scintilačného počítača LS 5800.

Percentická inhibícia rastu spôsobom :

sa vyráta nasledujúcim

Priemerný počet rozpadov za minútu testovanej vzorky

--- x 100 = percentický

Priemerný počet rozpadov za minútu nárast kontrolnej vzorky

100 - percentický nárast = percentická inhibícia

Uvedená percentická inhibícia sa vynesie na nelogaritmickej stupnici semilogaritmického grafu, zatiaľ kým na logaritmickej stupnici sa vynesie koncentrácia materskej účinnej látky. Hodnota IC_so (koncentrácia materskej účinnej látky nevyhnutná k dosiahnutiu 50 % inhibície) pre každú testovanú vzorku sa odvodí z uvedeného grafu a miera zachovanej cytotoxicity sa vyráta z nasledujúcej rovnice :

IC_so materskej účinnej látky ---------------------------- x 100 = zachovaná cytotoxicita (%) IC_so testovanej vzorky

Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 5.

Tabuľka 5

Cytotoxicita in vitro konjugátov MoAb
	MoAb	Cytotoxicita
Hydrazidový konjugát pripravený za použitia produktu z príkladu 6 s :	Lym 1 CT-M-01	% LL-E33288alfa -I 3 500 300
Hydrazidový konjugát pripravený za použitia produktu z príkladu 7 s :	Lym 1 CT-M-01	% N-acetyl- LL-E33288delta -I 3_ 400 700
Hydrazidový konjugát pripravený za použitia produktu z príkladu 8 s :	CT-M-01	% produkt z prí- kladu 8 -18
Hydrazidový konjugát pripravený za použitia produktu z príkladu 9 s :	CT-M-01	% produkt z prík- ladu 9 100

Tabuľka 5 (pokračovanie)

MoAb Cytotoxicita

Hydrazidový konjugát pripravený za použitia produktu z príkladu 10 s :	Lym 1	% produkt kladu 10 400	z. pri-
Hydrazidový konjugát pripravený za použitia produktu z príkladu 11 s :	Lym 1	% produkt kladu 11 320	z pri-
Hydrazidový konjugát pripravený za použitia produktu z príkladu 12 s :	Lym 1	% produkt kladu 12 560	z pri-

Za účelom stanovenia účinnosti konjugátov podľa vynálezu in vivo bol použitý nasledujúci testový model.

’l'GS'Cy konjugátov in vivo snanovujucs piOLinadoruvu ucimiost účinná látka-monoklonálna protilátka boli uskutočnené za použitia athymických (holých) myší.

ľudských nádorových štepov u Bunky Burkittova lymfomu(Raji) a myelomu(HS Sultán) sa izolujú z kultivačných buniek, nato sa subkutánne zaočkujú (80xl0⁶ Raji-buniek alebo 40xl0⁶ HS

Sultan-buniek) pokusným myšiam. U athymických myší sa propagujú pevné nádory, karcinómy vaječníkov (CÄ73, Ovcar-3), karcinóm prsníka (MX-1) a karcinóm trakčníka (LS174T. Tieto sa potom odpreparujú, narežú na fragmenty o veľkosti 2 mm³ a subkutánne implantujú pokusným myšiam (5 až 8 fragmentov na každú mys).

Účinné látky, monoklonálne protilátky a konjugáty účinná látka-monoklonálna protilátka sa podávajú intraperitoneálne vždy raz za tri dni celkom v troch alebo piatich injekciách počínajúc 2., 3., 4., 6., 7. alebo 8. deň po implantácii nádoru. Meranie nádorov (dĺžka a šírka nádoru) sa uskutoční za pomoci Fowlerova elektronického posúvneho merítka Ultra CAL II každý siedmy deň po dobu 4 až 6 týždňov po implantácii nádoru. Hmota nádoru v miligramoch sa vyráta z nasledujúceho vzorca :

Hmota nádoru (mg)

Pre nádoru v každú testovanú skupinu percentách vzhľadom ku u ošetrených pokusných zvierat zvierat (C) je s aspoň 65 počet mg počtom mg u kontrolných nevyhnutnú k demonštrovaniu menšia alebo rovná 42 % v pokusných zvierat.

účinnosti skupinách sa vyráta inhibícia rastu kontrolnej skupine /priemerný (T) delený priemerným x 100/.

považovaná %

Za hodnotu hodnota T/C prežijúcich

Výsledky tohoto testu sú zahrnuté v nasledujúcej tabuľke 6.

Tabuľka 6

Test na protinádorovú účinnosť in vivo

Dávka (vig) Veľkosť nádoru s /T (T/C) v % na

MoAb Účinná kontrolnú látka skupinu

Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfidu LL-E333288 alfa₃~I konjugovaný s

Lym 1	28	0,75	1,3	6/6
samotná LL-E33288alfa -I 3	-	0,75	365	6/6
samotný hydrazid	-	0,75	330	6/6
samotná MoAb	28		68	6/6

intraperitoneálna aplikácia proti ľudskému Burkittovu lymfomu bunečného radu Raji TC; tri injekcie počínajúc siedmy deň po implantácii nádoru; uvedené meriania sa uskutočnia 28. deň po implantácii

Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfidu LL-E333288 alfa^-I konjugovaný s

CT-M-01 83 2,0 0,02

0/6

Tabuľka 6 (pokračovanie)

Dávka (;ug) Veľkosť nádoru S/T (T/C) v % na

MoAb Účinná kontrolnú látka skupinu

samotná LL-E33288alfa -I 3	2,0	-	0/6
samotná CT-M-Old	83	75	5/6
vincristine (pozitívna kontrola)	20	1,2	5/5
intraperitoneálna aplikácia bunečného radu MX01; tri implantácii nádoru; uvedené implantácii	proti injekcie meriania	ľudskému nádoru počínajúc druhý sa uskutočnia 35	prsníka deň po . deň po

Hydrazid N-//(4-metylkumarín-7-yl)amino/acetyl/cysteindisulfidu LL-E33288delta_i-I konju-

govaný s Lym 1	50	0,22	23	7/7
samotný hydrazid	-	0,22	228	4/7
samotná MoAb Lym 1	50	-	61	7/7

Tabuľka 6 (pokračovanie)

Dávka Qug) Veľkosť nádoru S/T (T/C) v % na

MoAb Účinná kontrolnú látka skupinu zmes hydrazidu plus

MoAb Lym 1

0,22

7/7 intraperitoneálna aplikácia proti ľudskému Burkittovu lymfomu bunečného radu Raji TC; tri injekcie počínajúc siedmy deň po implantácii nádoru; uvedené meriania sa uskutočnia 35. deň po implantácii

Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfidu N-acetylLL-E33288delta --I 1 konjugovaný s CT-M-01	125	1,0	0	6/6
samotný hydrazid	-	2,0	71	3/6
Zmes N-acetyl-LL-E33288 delta^-I plus MoAb CT-M-01	125	1,0	5	1/6
N-acetyl-LL-E33288
delta -I ľL	—	1,0	46	2/6

Tabuľka 6 (pokračovanie)

Dávka (,ug) Veľkosť nádoru S/T f T/C) v % na

MoAb Účinná kontrolnú látka skupinu intravenózna aplikácia proti ľudskej rakovine prsníka bunečného radu MX-1; tri injekcie počínajúc druhý deň po implantácii nádoru; uvedené meriania sa uskutočnia 42. deň po implantácii

Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfidu N-acetyl LL-E33288delta__L-I konju-

govaný s Lym 1	37	1,0	11	6/6
samotný hydrazid	-	1,0	517	6/6
samotná N-acetyl-
LL-E33288delta -I	-	0,5	226	6/6
samotná MoAb Lym 1	37	-	178	6/6
intravenózna aplikácia	proti	Burkittovu	lýmfomu
bunečného radu Raji TC; tri	injekcie	počínajúc siedmy	deň po

implantácii nádoru; uvedené meriania sa uskutočnia 35. deň po implantácii

Tabuľka 6 (pokračovanie)

Dávka (jjg) Veľkosť nádoru S/T f m /r* x xr 9- *> -=»

J. / V j v Ό 1X CA

MoAb Účinná kontrolnú látka skupinu

Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfidu N-acetylLL-E33288delta -I

konjugovaný s B72,3	127	2,7	61		6/6
samotná N-acetyl-
LL-E33288delta -I	-	2,0	32		1/6
samotná B7 2,3	127	-	125		6/6
vincristin (pozitívna kontrola)	-	20	23		6/6
intravenózna aplikácia	proti	ľudskej	rakovine	trakčníka
bunečného radu LS174T;	tri	injekcie	počínajúc	ôsmy	deň	po
implantácii nádoru; uvedené merania sa	uskutočnia	21.	deň	Po

implantácii

Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfidu N-acetyl

LĽ-E33288delta_i-I konjugovaný s CT-M-01 112 2,7 40

5/6

Tabuľka 6 (pokračovanie)

Dávka (>ig) Veľkosť nádoru S/T (T/C) v % na

MoAb Účinná kontrolnú látka skupinu

samotná N-acetyl- LL-E33288delta -I 3_	2,0	32	1/6
vincristin (pozitívna kontrola)	-	20	23	6/6
intravenózna aplikácia	proti	ľudskému	karcinómu	trakčníka
bunečného radu LS174T;	tri	injekcie	počínajúc	ôsmy deň po

implantácii nádoru; uvedené merania sa uskutočnia 21. deň po implantácii

Hydrazid 3-merkaptopropionyldisulfidu

LL-E33288alfa₂-I konjugovaný s CT-M-01 242 1,0 0,33 2/6 samotný hydrazid - 1,0 - 0/6 intravenózna aplikácia proti ľudskej rakovine prsníka bunečného radu MX-1; tri injekcie počínajúc druhý deň po implantácii nádoru; uvedené meriania sa uskutočnia 35. deň po implantácii

Stručný popis obrázkov

Vynález je bližšie ilustrovaný na pripojených výkresoch, r·» cj b-4-r^ v'wnl'?

- obr. 1 znázorňuje ultrafialové spektrum protinádorového antibiotika označeného ako N-acetyl-LL-E33288-gama_i-I,

- obr. 2 znázorňuje infračervené špektrum protinádorového antibiotika označeného ako N-acetyl-LL-E33288-gama_i-I,

- obr. 3 znázorňuje protónové nukleárne magnetickorezonančné špektrum protinádorového antibiotika označeného ako N-acetyl-LL-E3 3 288-gama__L-I,

- obr. 4 znázorňuje ¹³C-nukleárne magnetickorezonančné špektrum protinádorového antibiotika označeného ako

N-acetyl-LL-E33288-gama_3L“I,

- obr. 5 znázorňuje ultrafialové špektrum protinádorového antibiotika označeného ako jód-LL-E33288-pseudoaglykón,

- obr. 6 znázorňuje infračervené špektrum protinádorového antibiotika označeného ako N-acetyl-LL-E33288-pseudoaglykón,

- obr. 7 znázorňuje protónové nukleárne magnetickorezonančné špektrum protinádorového antibiotika označeného ako jód-LL-E33288-pseudoaglykón a

- obr. 8 znázorňuje ¹³C-nukleárne magnetickorezonančné špektrum protinádorového antibiotika jód-LL-E3 3 2 8 8-pseudoaglykón.

ako označeného

V nasledujúcej časti popisu bude vynález bližšie objasnený za pomoci konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia.

Príklad 1

3-Merkaptopropionyldisulfid zložky LL-E33ŽSSgama^-I

K roztoku 90 mg LL-E33288gama-I v 90 ml acetonitrilu sa pridá 10,6 mg kyseliny 3-merkaptopropionovej v 1 ml acetonitrilu. Získaný roztok sa dôkladne premieša a potom skladuje pri teplote -20° C po dobu 6 hodín. Rozpúšťadlo sa odoženie za vákua a zvyšok sa chromatografuje na stĺpci silikagélu za použitia elučného činidla tvoreného najskôr 50 ml metylénchloridu, potom 50 ml 4 % metanolu v metylénchloridu a nakoniec 100 ml 8 % metanolu v metylénchloridu. Po odparení tejto poslednej frakcie sa získa zvyšok, ktorý sa vyberie etylacetátom s malým množstvom acetónu a získaný podiel sa po kvapkách pridá k prebytku hexánu. Vylúčená zrazenina sa izoluje a vysuší, pričom sa získa 39 mg požadovaného produktu (hmotové špektrum/ionizácia rýchlymi atómami/ : M+H 1394).

Príklad 2 p-Nitrofenyl-3-merkaptopropionyldisulfid zložky LL-E33288gama_;L-I

Stupeň A

Príprava p-nitrofenylesteru kyseliny 3-merkaptopropionovej

Komerčne dostupná kyselina 3-merkaptopropionová v metylénchloridu obsahujúcom katalytické množstvo koncentrovanej kyseliny sírovej sa uvedie v reakciu s izobutylénom po dobu 20 minút. Roztok sa potom extrahuje IN roztokom hydrogénuhličitanu sodného po predchádzajúcom vysušení metylénchloridového roztoku nad bezvodým síranom horečnatým. Roztok sa potom odparí, aby sa získala bezfarebná mobilná kvapalina, ktorej nukleárne magnetickorezonančné spektrum a hmotové spektrum dokazujú, že sa jedná o terc, butylester kyseliny S-terc.butylmerkaptopropionovej.

Alikvotný podiel tohoto esteru sa zohrieva na teplotu varu 6N kyselinou chlorovodíkovou v dioxánu Rozpúšťadlo sa potom odparí, pridá sa sa extrahuje uhličitanom sodným, extrakt sa potom zlučuje s 6N kyselinou k dosiahnutiu pH suspenzie 2,0. Táto extrahuje etylacetátom, extrakt sa vysuší zbaví rozpúšťadla a týmto ^H-nukleárne spoločne s hmotovým butylmerkaptopropionopod spätným chladičom s po dobu 2,5 hodiny, etylacetát a získaný roztok Natrium-karbonátový chlorovodíkovou suspenzia sa nad bezvodým spôsobom sa magnetickorezonančné spektrom, vú.

až potom síranom horečnatým, získa bezfarebná kvapalina, ktorej špektrum dokazuje že sa jedná o kyselinu S-terc.

Táto kyselina sa potom prevedie na p-nitrofenylester reakciou s ekvimolárnymi množstvami p-nitrofenolu a dicyklohexylkardodimidu v tetrahydrofuránu po dobu 4 hodín.

Dicyklohexylmočovinový vedľajší produkt sa odstráni filtráciou a filtrát sa odparí na olejovom kúpeli. Získaný olejovitý produkt sa chromatografuje za účelom prečistenia na neutrálnom silikagéli za použitia elučnej sústavy tvorenej zmesou hexánu a metylénchloridu v objemovom pomere 50:50. Čistý p-nitrofenylesterový derivát je nažltlý pohyblivý olej.

Voľný merkaptán sa odmaskuje nasledujúcim postupom. Kyselina S-t-butylmerkaptopropionová vo forme p-nitrofenylesteru sa rozpustí v kyseline trifluóroctovej a k získanému roztoku sa potom pridá mierny molárny prebytok (10 %) octanu ortuťnatého. Získaná zmes sa potom mieša po dobu 30 minút, kyselina trifluóroctová sa odparí a zvyšok sa vyberie dimetylformamidom. Tento roztok sa uvedie do styku so sírovodíkom po dobu 15 minút, nato sa čierny sirník ortuťnatý odfiltruje a filtrát sa odparí za zníženého tlaku za účelom

mobilná kvapalina sa

prečistí chromatografiou na neutrálnom silikagéli za použitia elučnej sústavy tvorenej zmesou hexánu a metylénchloridu v objemovom pomere 50:50. ^-H-nukleárne magnetickorezonančné spektrum ukazuje, že hlavná zložka obsahuje malé množstvo terc, butylmerkapto-derivátu. Analytická vysokotlaká kvapalinová chromatografia na dvoch tandemovo usporiadaných stĺpcoch Perkin-Elmer Pecosphere C (4,6x33 mm a 4,6x83 mm) za použitia elučnej sústavy tvorenej gradientovým systémom acetonitrilu a O,1M amoniumacetátového pufra pH 6,5 (kyselina octová) v objemovom pomere 37,5/62,5 až 47,5/52,5 v rozpätí 12 minút ukazuje, že produkt obsahuje 88 % p-nitrofenylesteru kyseliny 3-merkaptopropionovej a 10 % menej polárnejšieho p-nitrofenylesteru kyseliny S-t-butylmerkaptopropionovej. Je tu rovnako prítomné malé množstvo voľného p-nitrofenolu.

Stupeň B

Reakcia p-nitrofenylesteru kyseliny 3-merkaptopropionovej so zložkou LL-E33288gama__L-I

100 mg podiel zložky LL-ESSZSSgama^-I sa rozpustí v 50 ml acetonitrilu. K takto získanému roztoku sa pridá roztok 25,7 mg p-nitrofenylesteru kyseliny 3-merkaptopropionovej v 1 ml acetonitrilu. Reakcia sa uskutoční pri teplote -20° C po dobu 48 hodín. Dokončenie reakcie sa preukáže vysokotlakou kvapalinovou chromatografiou. Roztok sa odparí do sucha, zvyšok sa vyberie 4 až 5 ml etylacetátu, pričom sa k získaniu roztoku použije ultrazvuk. Zmes sa potom sfiltruje a filtrát sa potom nakvapká do 45 ml miešaného hexánu. Rezultujúci nažltlý pevný podiel sa izoluje a vysuší za zníženého tlaku, pričom sa získa 93 mg p-nitrofenylesteru kyseliny propionovej vo forme derivátu so zložkou LL-E33288gama_i-J, čo bolo preukázané ^-H-nukleárnym magnetickorezonančným spektrom. Pri hmotovej špektroskopii (ionizácia rýchlymi atómami) je /M+H/ iont indikovaný pri m/z=1515.

Retenčná doba na reverznej fázi C pri HPLC za použitia 50 % acetonitrilu v O,1M vodnom roztoku octanu amonného : 18 minút (LL-E33288delta_x-I: 8,0 min, esterový hydrolyzný produkt : 1,5 min).

Príklad 3

N-Hydrosukcinimidyl-3-merkaptopropionátdisulfid zložky LL-E3 3 288gama._L-I

K roztoku 5 mg 3-merkaptopropionyldisulfidového analógu zložky LL-ESSžSSgama^-I z európskej patentovej prihlášky v 0,5 ml tetrahydrofuránu sa pridá 0,45 mg N-hydroxysukcinimidu v 0,1 ml tetrahydrufuránu a potom 1,8 mg dicyklohexylkarbodiimidu v 0,2 ml tetrahydrofuránu. Reakčná zmes sa potom mieša pri teplote okolia po dobu 4 hodín, nato sa reakcia ukončí pridaním prebytku hexánu. Pevný podiel sa izoluje filtráciou a rozpustí v etylacetátu. Rezultujúci roztok sa premyje trikrát solankou, vysuší nad síranom horečnatým a odparí, pričom sa získa 5 mg požadovaného produktu vo forme žltohnedého prášku, ktorý sa použije bez ďalšieho čistenia. Retenčná doba na reverznej fázi pri HPLC za použitia elučnej sústavy tvorenej 40 % acetonitrilom v 0,lM vodnom roztoku octanu amonného : 15 minút (východzia látka : 6,0 minút).

Príklad 4

3-Merkaptopropionylhydraziddisulf id zložky LL-E33288gama_i-I

K 5,4 ml (3 ekv.) bezvodého hydrazínu v 100 ml tetrahydrofuránu zohrievaného na teplotu varu pod spätným chladičom sa pod atmosférou argónu po kvapkách pridá 9,2 ml (83 mmolu) metyl-3~merkaptopropionátu v 50 ml tetrahydrofuránu v priebehu dvoch hodín. Roztok sa potom zohrieva na teplotu varu ešte po dobu dvoch hodín, odparí a potom zriedi a dvakrát odparí z 300 ml toulénu. Získaný produkt sa potom nanesie v 5 % etylacetátu v chloroformu na stĺpec silikagélu a eluuje 20 % metanolom v chloroforme. Rezultujúci 3-merkaptopropionylhydrazid je ružovkastý olej, ktorý pri ochladení tuhne a pri teplote okolia opäť sa topí.

K 50 mg zložky LL-ESSžSSgama^-I v 50 ml acetonitrilu sa pri -15° C pridá 6,6 mg 3-merkaptopropionylhydrazidu v 1 ml tetrahydrofuránu. Pridá sa jeden ekvivalent trietylaminu alebo jeden ekvivalent trietylaminu a jeden ekvivalent kyseliny octovej. Reakčná zmes sa mieša pri teplote 0° C po dobu jednej hodiny, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli za použitia eluznej sústavy tvorenej 10 až 15 % (gradient) metanolu v chloroforme, pričom sa získa 26 mg požadovaného produktu. Hmotové spektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/z=1408 (M+H); retenčná doba na referznej fázi C pri HPLC: 5 minút (41 % acetonitril v 0,IM vodnom roztoku octanu amonného.

Príklad 5

N-//(4-Metylkumarín-7-yl)amino/acetyl/cysteinhydraziddisulfid zložky LL-E33288gama_i-I

Zmes 1,0 g (5,7 mmolu) 4-metyl-7-aminokumarínu, 3,0 ml etylbrómacetátu (5 ekv.), 90 mg (0,1 ekv.) jodidu sodného a 30 ml dimetylformamidu sa zohrieva pod atmosférou argónu na teplotu 80° C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa potom ochladí, zriedi dietyléterom, trikrát premyje 50 % solankou, vysuší nad síranom horečnatým a odparí do sucha. Surový produkt sa rozpustí v chloroforme obsahujúcom 1 % etylacetátu a sfiltruje cez stĺpec silikagélu. Rekryštalizáciou z dietyléteru obsahujúceho stopy chloroformu sa získa čistý etyl-N-/(4-metylkumarín-7-yl)amino/acetát.

K 1,96 g (7,5 itunolu) vyššie uvedeného esteru v 15 ml metanolu a 15 ml tetrahydrofuránu sa pridá 10 ml IN vodného roztoku hydroxidu sodného. Po 30 minútach sa pridá 4 ml 10 % vodného roztoku kvselinv chlorovodíkové*!. Qrcranické roznúšťadlá sa odparia a získaný kryštalický produkt sa odfiltruje a premyje chladným etanolom a potom rozpustí v 20 ml tetrahydrofuránu éterom. Tento produkt sa a 4 ml dimetylformamidu.

Pridá sa dicyklohexylkarbonyldiimidazol (1,3 g, 2,2 ekv.) a reakčná zmes sa mieša po cisteinetylesterhydrochlorid (1,2 ml). Po ďalších troch dobu 15 minút. Potom sa pridajú (1,6 g, 2,5 ekv.) a trietylamin hodinách sa reakčná zmes zriedi dietyléterom obsahujúcim 5 % metylénchloridu a raz premyje 10 % vodným roztokom kyseliny chlorovodíkovej a potom dvakrát solankou. Po vysušení nad síranom horečnatým a odparení rozpúšťadiel sa surový produkt rekryštalizuje rozpustením v chloroforme obsahujúcom minimálne množstvo etanolu a pridaním prebytku éteru. Vylúčené kryštále sa odfiltrujú a vysušia, pričom sa získa čistý N-//(4-metylkumarín-7-yl)amino/acetyl/ cysteinetylester.

Zmes 5 ml chloroformu, 20 ml metanolu a 0,4 ml hydrazínhydrátu sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom a pod atmosférou argónu. Pridá sa 550 mg N-//(4-metyl kumarín-7-yl)amino/acetyl/cysteinetylesteru. Po 9 hodinovom zohrievaní na teplotu varu pod spätným chladičom sa reakčná zmes ochladí a pevný produkt sa odfiltruje a premyje chloroformom a potom etyléterom. Surový produkt (ktorý obsahuje tiol a disulfid) sa rozpustí v dimetylformamidu obsahujúcom ditiotreitol a trietylamin. Po 30 minútach sa produkt vyzráža prebytkom dietyléteru a izoluje filtráciou. Tento materiál sa ďalej prečistí rekraštalizáciou z odplynovaného acetonitrilu obsahujúceho ditiotreitol a stopy trietylaminu, pričom sa získa čistý N—//(4—metylkumarín—7—yl)amino/acetyl/cysteinhydrazid.

K 12 mg LL-E33288gama_;L-I v 12 ml acetonitrilu sa pri teplote 0° C pridá 4 mg N-//(4-metylkumarín-7-yl)amino/acetyl/ cysteinhydrazidu v 1,2 ml dimetylformamidu. Po celonočnom miešaní sa pridá ďalších 2 mg N-//(4-metylkumarín-7-yl)amino/ acetyl/cysteinhydrazidu v 0,6 ml dimetylformamidu. Reakčná zmes sa mieša po dobu 3 dní pri teniete 0° C a sfiltruje. Acetonitril sa odparí a získaný dimetylformamidový roztok sa zriedi prebytkom zmesi hexánu a éteru v objemovom pomere 1:1. Produkt sa izoluje filtráciou a ďalej sa prečistí chromatografiou na silikagéli za použitia elučnej sústavy s 15 až 20 % gradientom metanolu v chloroforme, pričom sa získajú 3 mg požadovaného produktu. Retenčná doba na reverznej fázi C pri HPLC: 3,5 min za použitia 45 % acetonitrilu v 0,IM vodnom roztoku octanu amonného (LL-E33288delta -J: 15,5 min v rovnakom elučnom systéme).

Príklad 6

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfid zložky LL-E33288alfa₃-I

K 10 mg LL-E3328Salfa -I v 9 ml acetonitrilu sa pri teplote -15° C pridá 6,6 mg 3-merkaptopropionhydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Potom sa pridá jeden ekvivalent trietylaminu alebo jeden ekvivalent trietylaminu a jeden ekvivalent kyseliny octovej. Reakčná zmes sa mieša pri teplote 0° C po dobu jednej hodiny, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, pričom sa ako elučná sústava použije 10 až 15 % (gradient) metanol v chloroforme. Z patričnej frakcie eluátu sa získa požadovaný produkt. Hmotové spektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/g=1251 (M+H), retenčná doba na reverznej fázi C pri HPLC: 2,1 min za použitia elučnej sústavy tvorenej 45 % acetonitrilom v 0,IM vodnom roztoku octanu amonného (LL-E33288alfa₅~I: 5,7 min v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 7

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfid zložky N-acetylLL-E33288gama_i-I

K 10 mg LL-E33288gama_i-I v 10 ml acetonitrilu sa pri teplote -15° C pridá 1,5 mg 3-merkaptopropionhydrazidu v 85 jul acetonitrilu. Potom sa pridá jeden ekvivalent trietylaminu. Reakčná zmes sa mieša pri teniete 0° C no dobu dvoch hodín, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, za použitia elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % (gradient) metanolu v chloroforme. Hmotové špektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/z=1450 (M+H), retenčná doba na reverznej fázi Cý_a pri HPLC: 2,5 min za použitia 50 % acetonitrilu v 0,05M vodnom roztoku dihydrogénfosforečnanu amonnom (N-acetyl-LL-E3 3 288gama_i-1: 6,6 min v rovnakej elučnej’sústave.

Príklad 8

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfid zložky LL-E33288alfa₂-I

K 10 mg LL-E33288alfa -I v 10 ml acetonitrilu sa pri teplote -15° C pridá 1,5 ekvivalentu 3-merkaptopropionhydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Potom sa pridá jeden ekvivalent trietylaminu. Reakčná zmes sa mieša pri teplote 0° C po dobu jednej hodiny, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, za použitia elučnej sústavy tvorenej 5 až 15 % metanolom v chloroforme (gradient). Z patričnej frakcie eluátu sa získa požadovaný produkt. Hmotové špektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/z=1248 (M+H), retenčná doba na reverznej fázi pri HPLC: 2,6 min za použitia 58 % acetonitrilu v 0,05M vodnom roztoku dihydrogénfosforečnanu amonnom (N-acetyl-LL-E33288alfa₂-I: 7,5 min v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 9

3-Merkaptopropionylhydraziddisulfid zložky jód -LL-E33288pseudoaglykón

K 10 mg jód- LL-E33288-pseudoaglykónu v 9 ml acetonitrilu sa pri teplote -15° C pridá 1,5 ekvivalentu 3-merkaptopropionhydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Ako katalyzátor sa pridá jeden ekvivalent trietylaminu. C po dobu jednej chromatografuje tvoG ”í 10 3. Ž 15 %

0° sa

Reakčná zmes sa potom mieša pri hodiny, nato sa rozpúšťadlo odparí, na silikagéli, za použitia elučnej rrrôH ΐ ont· xr rhl nrnfnrmo .

sa získa požadovaný produkt. Hmotové špektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/z=1091 (M+H), retenčná doba na reverznej fázi C pri HPLC: 2,8 min za použitia 50 % acetonitrilu v 0,05M dihydrogénfosforečnanu amonnom (jód-LLE33288-pseudoalykón: 7,9 min vrovnakej elučnej sústave).

Príklad 10

3-Merkaptobutyrylhydraziddisulfid zložky LL-E33288gama._L-I

K 17,2 g (0,2 molu) kyseliny krotónovej sa pridá 18 ml (0,26 molu) kyseliny tiooctovej. Táto zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom a pod atmosférou argónu po dobu 6 hodín. Prebytok kyseliny tiooctovej sa odstráni za zníženého tlaku (vodná výveva) a rezultujúci olej sa rozpustí v 100 ml absolútneho etanolu obsahujúceho 200 jjI koncentrovanej kyseliny sírovej. Reakčná zmes sa potom zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom po dobu 10 hodín, nato sa jej objem redukuje za podtlaku vodnej vývevy. Pridá sa hexán a získaný roztok sa postupne premyje dvomi dávkami nasýteného vodného roztoku hydrogénuhličitanu sodného a· jednou dávkou vody. Tento roztok sa potom vysuší nad síranom horečnatým, sfiltruje a zbaví rozpúšťadla, pričom sa získa olejovítý produkt. Tento surový produkt sa rozpustí v 250 ml metanolu obsahujúceho 12 ml hydrazínu a získaná zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom pod atmosférou argónu po dobu 10 hodín. Objem reakčnej zmesi sa potom zníži, nato sa rýchlo destiluje v guličkovom destilačnom prístroji a ponechá vykryštalizovať v zmesi chloroformu a hexánu k získaniu 3-merkaptobutyrylhydrozidu.

K 5 mg LL-E3 3 288gama__L-I v 10 ml acetonitrilu sa pri teplote -15° C pridá 1,5 ekvivalentu 3-merkaptopropionylhydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Pridá jeden ekvivalent trietylaminu.

Reakčná zmes sa mieša pri teplote 0° C po dobu jednej hodiny a rozpúšťadlo sa odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, za použitia elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % metanolom v chloroforme (gradient). Z patričnej frakcie eluátu sa získa požadovaný produkt. Hmotové Spektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/e=1422 (M+H), retenčná doba na reverznej fázi C pri HPLC: 3,5 min za použitia 43 % acetonitrilu v 0,05M vodnom roztoku dihydrogénfosforečnanu amonnom (LL-ESSŽSSgama^-I: 13,4 min v rovnakej elučnej sústave).

Príklad 11 3-Merkaptoizovalerylhydraziddisulfid zložky LL-E33288gama_i~I

K 10 g (0,1 molu) kyseliny 3,3-dimetylakrylovej sa pridá 9 ml (0,13 molu) kyseliny tiooctovej. Táto zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom a pod atmosférou argónu po dobu 6 hodín. Prebytok kyseliny tiooctovej sa odstráni za zníženého tlaku (vodná výveva) a rezultujúci olej sa rozpustí v absolútnom etanolu obsahujúcom 200 zUl koncentrovanej kyseliny sírovej. Táto reakčná zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom po dobu 34 hodín, nato sa pridá 16 ml hydrazínu. Rezultujúca zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom a pod atmosférou argónu po dobu 24 hodín. Objem reakčnej zmesi sa redukuje a zvyšok sa rozpustí v zmesi solanky a nasýteného vodného roztoku hydrogénuhličitanu sodného. Produkt sa extrahuje niekoľkými objemami chloroformu. Zlúčené chloroformové frakcie sa vysušia nad síranom horečnatým, sfiltrujú a zbavia rozpúšťadla, pričom sa získa olejovítý produkt. Tento olej sa prečistí okamihovou chromatografiou za použitia gradientu metanolu v chloroforme ako elučnej sústavy a potom rekryštalizáciou zo zmesi chloroformu a hexánu, pričom sa získa 3-merkaptoizovalerylhydrazid.

K 15 mg LL-ESSžSSgama^-I v 5 ml acetonitrilu sa pri teplote -15° C pridá 1,5 ekvivalentu 3-merkaptoizovalerylhydra zidu v 100 ul acetonitrilu. Ako ekvivalent trietylaminu. Reakčná teplote okolia po dobu troch hodín, katalyzátor sa pridá jeden zmes sa potom mieša pri nato sa rozpúšťadlo odparí.

7^ π τς'/λΐζ c* ο /-»Τ~» ·3 í“ ν’ -a -Pn π ζλ >-»-?> ,~<-»ΊτΤ>--5>ζ*γΑΊ-γ rv —. vazm i í <-l V _v O X-/J X, C-HÁ. VXUU U'J'JX O. J. M. JC· ± i ZA. O _L JC Cl ’CZ _L _f £_i CL £_*S_t U» £j sústavy tvorenej 10 až 15 % metanolom v chloroforme tu_cí elučnej (gradient), pričom sa z príslušnej frakcie eluátu získa požadovaný produkt.

Hmotové spektrum (ionizácia rýchlymi atómami): m/z=1436 (M+H), retenčná doba použitia 43 na reverznej fázi acetonitrilu v

C pri

S -¹·

0,05M

HPLC: 3,9 min za vodnom roztoku dihydrogénfosforečnanu amonnom (LL-E33288gama_i-I: 13,4 min v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 12 p-Merkaptodihydrocinnamoylhydraziddisulfid zložky LL-E3 3 288gama_;L-I

K 500 mg (2,75 mmolu) kyseliny p-merkaptodihydroškoricovej sa pridá 15 ml metanolu obsahujúceho jednu kvapku koncentrovanej kyseliny sírovéj.Reakčná zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom po dobu 5 hodín, nato sa ochladí na teplotu okolia. Pridá sa hydrazín (1,5 ml) a získaná zmes sa zohrieva na teplotu varu pod spätným chladičom a pod atmosférou argónu po dobu 2 hodín, nato sa potom mieša pri teplote okolia po dobu 10 hodín. Za účelom redukcie všetkých disulfidov prítomných v reakčnej zmesi sa pridá 200 mg ditiothreitolu a reakčná zmes sa ochladí na teplotu -15° C. Získané kryštále sa odfiltrujú, premyjú zmesou éteru a metanolu, nato sa vysušia vo vákuovej sušiarni 50° C, 10 hodín), pričom sa získa p-merkaptodihydrocinnamoylhydrazid.

K 25 mg LL-E3 3 2 88gama._L-I v 25 ml acetonitrilu sa pri teplote -15° C pridá 1,5 ekvivalentu p-merkaptodihydrocinnamoyl hydrazidu v 1 ml acetonitrilu. Reakčná zmes sa mieša pri teplote 0° C po dobu desať hodín, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, za použitia elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % metanolom v chloroforme (gradient), nato sa z patričnej frakcie eluátu získa požadovaný produkt. Hmotové spektrum (ionizácie! rýchlymi atómami): m/z=1484 (M+H), retenčná doba na reverznej fázi C pri HPLC: 5,4 min za

Ό o u. ž ΐ-1 i s 43 % sestonitrilu v 0 _f 0 5M vodnom jĽOZtoR.vi dihydrogénfosforečnanu amonnom (LL-EOSZSSgama^-I: 13,4 min v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 13

3-Merkaptoizovalerylhydraziddisulfid zložky N-acetylLL-E33288gama._L-I

K 20 mg N-acetyl- LL-E33288gama_i-I v 15 ml acetonitrilu sa pri teplote -15° C pridajú 3 ekvivalenty 3-merkaptoizovalerylhydrazidu v 6,2 ml acetonitrilu. Pridá sa jeden ekvivalent trietylaminu. Reakčná zmes sa mieša pri teplote okolia po dobu dvoch hodín, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, za použitia elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % metanolom v chloroforme (gradient), nato sa z patričnej frakcie eluátu získa požadovaný produkt. Retenčná doba na reverznej fázi C pri HPLC: 2,5 min za použitia 50 % acetonitrilu v 0,05M vodnom roztoku dihydrogénfosforečnanu amonnom (N-acetyl-LL-E33288gama_i-I: 6,6 min v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 14

3-Merkaptobutyrylhydraziddisulfid zložky N-acetylLL-EOSZSSgama^-I

K 10 mg N-acetyl- LL-ESSZSSgama^-I v 7,5 ml acetonitrilu sa pri teplote -15° C pridajú 3 ekvivalenty 3-merkaptobutyrylhydrazidu v 5 ml acetonitrilu. Pridá sa jeden ekvivalent trietylaminu. Reakčná zmes sa mieša pri teplote okolia po dobu desať hodín, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, za použitia elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % metanolom v chloroforme (gradient), pričom sa získa požadovaný produkt. Retenčná doba na reverznej fázi C_ie pri HPLC: 7,3 min za použitia 43 % acetonitrilu v 0,05M vodnom roztoku dihydrogénfosforečnanu amonnom (N-acetyl-LLE33288gama__L-1: 5,6 min v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 15 p-Merkaptodihydrocinnamoylhydraziddisulfid zložky N-acetylLL-E3 3 288gama_i-I

K 10 mg N-acetyl- LL-E33288gama__L-I v 7,5 ml acetonitrilu sa pri teplote -15° C pridajú 3 ekvivalenty 3-merkaptodihydrocinnamoylhydrazidu v 2 ml acetonitrilu. Pridá sa jeden ekvivalent trietylaminu. Reakčná zmes sa mieša pri teplote okolia po dobu dvoch hodín, nato sa rozpúšťadlo odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagéli, za použitia elučnej sústavy tvorenej 10 až 15 % metanolom v chloroforme (gradient), nato sa z patričnej frakcie eluátu získa požadovaný produkt. Retenčná doba na reverznej fázi C pri HPLC: 7,3 min za použitia 43 % acetonitrilu v 0,05M vodnom roztoku dihydrogénfosforečnanu amonnom (N-acetyl-LL-E33288gama_i-I: 5,6 min v rovnakej elučnej sústave.

Príklad 16

Nešpecifická konjugácia s proteínami

Hydroxysukcinimidester popísaný v príklade 3 sa kovalentne pripojí k protilátkam za mierne alkalických podmienok. V nasledujúcej časti popisu bude uvedený všeobecný postup, ktorý bol použitý na prípravu konjugátov s protilátkami uvedenými v tabuľke 7. Protilátka s koncentráciou 3 až 5 mg/ml fosfátového pufru obsahujúceho O,1M chloridu sodného, pH 7,5, sa uvedie v reakciu s 5 až 20-násobným molárnym prebytkom produktu z príkladu 3. Táto reakcia sa uskutoční za miešania, pri teplote okolia a po dobu 1 až 4 hodín. Konjugovaný proteín sa potom chromátograficky odsolí a agregovaný proteín sa oddelí od monomérneho materiálu gélovou filtráciou HPLC. Monomérna frakcia sa zlúči a zahustí.

Tabuľka 7

Nešpecifické konjugáty pripravené za použitia produktu z príkladu 3

MoAb	Obsah účinnej látky (M/M)
Lym 1	5,2
B72,3	6,0
B72,3	2,9

Príklad 17

Príprava lokálne špecifického konjugátu

Obecný postup na pripojenie hydrazidových derivátov účinných látok k oxidovaným protilátkam je popísaný T.J.McKearn-om a kol. v patente US 4,671,958. Tento postup bol použitý na prípravu konjugátov protilátok odvodených od produktov z príkladov 4 až 15, pričom boli zavedené nižšie popísané špecifické modifikácie. Produkty týchto reakcií a ich vlastností sú zahrnuté v ďalej zaradenej tabuľke 7.

A) Oxidácia protilátky

Protilátka s koncentráciou 5 až 10 mg/ml sa cez noc dialyzuje proti 200-násobnému objemu 50mM natriumacetátového pufru, pH 5,5 obsahujúceho O,1M chlorudu sodného (pufor A). Po dialýze sa MoAb oxiduje 15mM až 200mM kyselinou jodistou v 0,2M octanu sodnom. Oxidačná reakcia sa uskutočňuje bez svetla, za miešania pri teplote 4° C po dobu 45 minút, nato sa oxidovaná protilátka MoAb odsolí na aspoň päťnásobnom objeme Sephadexu G-25. Stupeň oxidácie protilátky sa stanoví reakciou s p-nitrofenylhydrazínom a porovnaním absorbancie proteínu pri 280 mm a p-nitrofenylhydrazínu pri 395 mm.

B) Konjugácia s hydrazidom účinnej látky

Oxidovaná protilátka MoAb sa uvedie v reakciu s 10 až

ΤΠ. o 1 á ľľnvm

Ό ir θ i? v t k. o Ti

Ír. s z i čiu

Hydrazidy boli rozpustené v dimetylformamidu a získané roztoky boli pridané k vodnému roztoku protilátky MoAb. Za účelom zabránenia precipitácie MoAb, nepresahuje finálny objem pridaného dimetylformamidu 10 % z celkového reakčného objemu.

Reakcia sa uskutočňuje za miešania po dobu 3 hodín pri teplote okolia. Za účelom zabránenia zosieťovania nezreagovaných aldehydov a nasledovnej agregácii sa ako blokačné činidlo pridá hodiny po prídavku hydrazidu účinnej látky 100-násobný molárny prebytok acetylhydrazidu. Za účelom stabilizácie väzby typu Schiffova báza medzi aldehydom a hydrazidom účinnej látky (hydrazón) sa produkt zvyčajne redukuje na alkylhydrazín pridaním lOmM kyanborohydridu sodného. Reakcia prebieha po dobu jednej hodiny (celková doba konjugácie : 4 hodiny). Získaný konjugát sa chromatograficky odsolí a potom dôkladne dialyzuje (minimálne 48 hodín) do fosfátového pufru za účelom skladovania a testovania.

Tieto konjugáty sa potom analyzujú na prítomnosť agregátov gólovou filtráciou HPLC a na prítomnosť voľnej účinnej látky HPLC s reverznou fázou. Obsah účinnej látky v konjugáte sa stanoví špektroskopicky za použitia extinkčných koeficientov protilátky a účinnej látky, čím sa stanoví molárna koncentrácia protilátky v konjugáte.

Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 7.

Tabuľka 7

MoAb

Príprava Obsah účinnej látky (M/M)

Hydrazidové konjuqáty pripravené z produktu z príkladu 4

CTM-01

MAC-68

r

r

Hydrazidové konjugátv pripravené z produktu z príkladu 5

Lym

0,15

0,76

3,2

Hydrazidové konjugátv pripravené z produktu z príkladu 6

Lym 1

CT-M-01

3,0

2,4

2,9

Hydrazidové konjugáty pripravené z produktu z príkladu 7

Lym 1	3,0
Lym 2		2,4
B72.3	1	2,1
	2	2,4
CT-M-01	1	1,6
	2	3,6
	3	2,5
	4	2,4

, 74

Tabuľka 7 (pokračovanie)

MoAb Príprava Obsah účinnej látky (M/M)

Hydrazidové konjugáty pripravené z produktu z príkladu 8

CT-M-014,8

Hydrazidové konjugáty pripravené z produktu z príkladu 9

CT-M-013,0

Hydrazidové konjugáty pripravené z produktu z príkladu 10

Lym 13,7

Hydrazidové konjugáty pripravené z produktu z príkladu 11

Lym 16,2

Hydrazidové konjugáty pripravené z produktu z príkladu 12

Lym 1

3,5

7? c/_c rppc

Claims (12)

1. PA TENTOVÉ

   ROK Y

   1. Substituovaný disulfid všeobecného vzorca Q-So-SS-W, odvodený od zlúčenín CH₃SSS-W, označovaných ako LLE33288alfai-Br, LL-E33288alfa!-I, LL-E33288alfa₂-Br, LL-

   33288alfa₂-I, LL-E33288alfa₃-Br, LL-E33288alfa₃-I, LLE33288alfa₄-Br, LL-E33288beta₁-Br, LL-E33288beta--I, LLE33288beta₂-Br, LL-E33288beta₂-I, LL-E33288gama₁-Br, LLE33288gamai-I a LL-E33288deltai-I, od ich jód- alebo bróm pseudoglykónov a ich dihydro- alebo N-acyl-homológov, od látok BBM-1675, FR-900405, FR-900406 a od ich antibiotík

   PD114759, PD115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL1577E a CL-1724 alebo ich N-acetylhomológov pričom v uvedenom všeobecnom vzorci

   W znamená kde

   Ri znamená alebo· CH₃ κ- znamená alebo

   Rj znamená

   R₄ znamená alebo H, alebo H alebo R_? znamená

   H alebo

   CH,

   Ra znamená s kupinu metylovú (CH₃)₂CH, skupinu, etylovú s kupinu alebo R s znamená hydroxylovú s kupinu, R_s znamená atóm vodíka alebo R: a R9 spo lu znamenajú karboxylovú skúp mu,

   X znamená atóm jódu alebo atóm brómu,

   R₅' znamená atóm vodíka alebo skupinu RCO, v ktorej

   R znamená atóm vodíka alebo rozvetvenú alkylovú skupinu, ktorá obsahuje 1 až 10 uhlíkových atómov alebo alkylénovú skupinu, obsahujúcu 1 až 10 uhlikových atómov, arylovú skupinu obsahujúcu 6 až 11 uhlíkových atómov alebo heteroarylovú skupinu zvolenú z množiny zahŕňajúcej furylovú skupinu, tienylovú skupinu, Nmetylpyrolylovú skupinu, pyridylovú skupinu, Nmetylimidazolylovú skupinu, oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú skupinu, izochinolylovú skupinu, N-metylkarbazolylovú skupinu, aminokumarinylovú skupinu a fenazinylovú skupinu alebo arylalkylovú skupinu, v ktorej arylový zvyšok obsahuj e

   6 až 11 uhlíkových atómov a alkylový zvyšok obsahuj e

   1 až 5 uhlíkových atómov, alebo heteroarylalkýlovú skupinu, v ktorej je heteroarylový zvyšok zvolený zvyšok obsahuje uvedené skupiny vyššie uvedenej množiny a alkylový až 5 uhlíkových atómov, môžu pričom byť poprípade substituované aspoň jedným substituentom, zvoleným z množiny, ktorá zahŕňa hydroxylovú skupinu, aminovú skupinu, karboxylovú skupinu, halogén, nitro-skupinu, alkoxy-skupinu, obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy a alkyltio-skupinu, obsahuj úcu

   1 až 5 uhlíkových atómov,

   Sp znamená priamu alebo rozvetvenú dvojvalenčnú alkylovú skupinu, obsahujúcu 1 až 18 atómov uhlíka, dvojvalenčnú arylovú skupinu, ktorá obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka alebo dvojvalenčnú heteroarylovú skupinu, zvolenú z množiny zahŕňajúcej furylovú skupinu, tienylovú skupinu, N-metylpyrolylovú skupinu, piridylovú skupinu, N-metylimidazolylovú skupinu, oxazolylovú s kupinu, pyrimidinylovú s kupinu, chinclylovú skupinu, izochinclylovú s šupinu,

   Nmetylkarba zolylovú skupinu, aminokuma rinylovú skupinu a fenazinylovú skupinu alebo dvojvalenčnú cyklcalkýlovú skupinu obsahujúcu 3 až 18 atór uhlíka, dvojvalenčnú arylalkylovú skupinu, ktorej arylový zvyšok obsahuje 6 až 11 atómov uhlí sa a alkylovú zvyšok obsahuje 1 až atómov uhlíka, alebo heteroarvial kýlovú skupinu, zvyšok obsahuje 1 až 18 atómov uhlíka store~ alkýlový zahŕňajúcej zvyšok znamená zvyšok zvolený z množiny furylovú skupinu, tienylovú skupinu, N-rr.etylpyrolylovú skupinu, pyridylovú skupinu, N-metylimidazolylovú skupinu, oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú skupinu, izochinclylovú skupinu, Nmetylkarbazolylovú skupinu, aminokumarmylovú skupinu a fenazinylovú skupinu, alebo dvojvalenčnú alkenylovú alebo alkinylovú skupinu obsahujúcu 2 až 18 atómov uhlíka, pričom Sp môže byť dodatočne substituovaný amino-skupinou, alkylaminoskupinou , obsahujúcou 1 až 10 atómov uhlíka, arylamino-skupinou, obsahujúcou 6 až 11 atómov uhlíka, heteroarylamino-skupinou, v ktorej heteroarylový zvyšok znamená zvyšok zvolený z množiny zahŕňajúcej furylovú skupinu, tienylovú skupinu, N-metylpyrolylovú skupinu, pyridylovú skupinu, N-metylimidazolylovú skupinu, oxazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, chinolylovú skupinu, izochinolylovú skupinu, N-metylkarbazolylovú skupinu, aminokumarinylovú skupinu a fenazinylovú skupinu, karboxylovú skupinu, alkoxyskuptnu, obsahujúcu 1 až 3 atómy uhlíka, hydroxyskupinu , tiolovú skupinu alebo alkvltio-skupinu obsahujúcu 1 až 5 atómov uhlíka,

   Q znamená atóm halogénu, ammovú skupinu, alkyl^mincvú skupinu obsahujúcu 1 až 10 uhlíkových atómov, dialkylaminovú skupinu, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 10 atómov uhlíka, arylaminovú skupinu, v ktorej arylový zvyšok obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka, heteroarylamincvú skupinu, v ktorej je heteroarylový zvyšok zvolený z vyššie uvedenej množiny, piperidinovú skupinu, pyrolidinovú skupinu, piperazinovú skupinu, karboxylovú skupinu, nitrofenyloxykarbonylovú skupinu, skupinu -CHO, alkoxy-skupinu, obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy, hydroxylovú skupinu, tiolovú skupinu, dikarboxyalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 5 atómov uhlíka, skupinu -CONHNH₂, skupinu -HCONHNH₂, skupinu -CSNHNH₂, skupinu -NHCSNHNH₂ oxykarbonylovú skupinu alebo skupinu -ONH₂, pričom v prípade, že je uvedený substituovaný disulfid odvodený od zlúčenín CH3-SSS-W, zahŕňajúcich LL-E33288alfai_Br,

   LL-E33288deltai~I, BBM-1675, FR-900405, FR-900406,

   PD114759, PR115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D,

   CL-1577E alebo CL-1724, potom Q neznamená atóm halogénu, aminovú skupinu, alkylaminovú skupinu, dialkylaminovú skupinu, arylaminovú skupinu, heteroarylaminovú skupinu, piperidinovú skupinu, pyrolidinovú skupinu, piperazinovú skupinu alebo karboxylovú skupinu.
2. 2. Substituovaný disulfid podľa nároku 1 všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom

   W znamená

   R₄ znamená alebo H,

   R₅ znamená metylovú skupinu, etylovú skupinu alebo skupinu (CH₃)2CH,

   X znamená atóm jódu alebo atóm brómu,

   R₅' znamená atóm vodíka alebo skupinu RCO, v ktorej

   R znamená atóm vodíka, metylovú skupinu alebo monosubstitucvar.ú arylovú skupinu, ktorá obsahuje 6 a atómov uhlíka a

   Sp a Q majú významy uvedené v nároku 1.
3. 3. Konjugát substituovaného disulfidu podľa nároku 1 s nosičom, ktorý má všeobecný vzorec

   Tu-(Z-Sp-SS-W) ^r m (Y) n-m v ktorom

   W má význam uvedený v nároku 1,

   Sp má význam uvedený v nároku 1,

   Tu znamená monokolonálnu protilátku alebo jej fragmenty, alebo jej chemicky alebo geneticky modifikované homológy,

   Y znamená aminovú kupinu, karboxylovú skupinu alebo tiolovú skupinu, tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu, aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteínových cukrových zvyškov protilátky Tu, amidoalkyltioskupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 2 až 18 uhlíkových atómov, skupinu -CH2NHNHCOCH3 alebo skupinu

   -ch₂nhnhcoch(nh₂)ch₂

   Z znamená skupiny -CONH-, -CONHN=CH-,-CONHNHCH₂-,

   -NHCONHN=CH-, -NHCONHNHCH₂-, -NHCSNHN=CH-,

   -NHCSNHNHCH2-, -ON=CH-, -NH-, -NHCH2-, ~N=CH-,

   -co₂-, -NHCH₂CO₂-, -SS-, alebo

   -NHCOCH₂-ČH (CH _ ) | / co, h:

   kde x = 0 alebo 1, znamená celé číslo od

   1 do 100 a znamená 0,1 až 15.
4. 4. Konjugát substituovaného disulfidu s nosičom pódia nároku 3 všeobecného vzorca ^! Tu-(Z-Sp-SS-W) m

   (Y) n-m v ktorom

   W má význam uvedený v nároku 3,

   Sp znamená priamu alebo rozvetvenú dvopvalenčnú alkylovú skupinu, obsahujúcu 2 až 10 uhlíkových acómov alebo dvojvalenčnú arylalkylovú skupinu, v ktorej arylový zvyšok obsahuje 6 až 11 atómov uhlíka a alkylový zvyšok obsahuje 2 až 5 uhlíkových atómov alebo heteroaryla1 kýlovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 2 až 5 uhlíkových atómov a heteroarylový zvyšok má významy uvedené v nároku 1, pričom Sp môže byť dodatočne substituovaný amino-skupinou, heteroarylamino-skupinou, v ktorej má heteroarylový zvyšok významy uvedené v nároku 1, hydroxy-skupinou alebo tiolovou skupinou,

   Tu znamená monoklonálnu protilátku, ktorá vykazuje preferenčnú reaktivitu s ľudským nádorovým antigénom,

   Y znamená aminovú skupinu tvoriacu bočný reťazec pro tilátky Tu alebo aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteínových cukrových zvyškov protilátky Tu, znamená skupinu -CONH-, skupinu CONHN=CH-, skupinu

   -CONHNHCH2kde znamená

   0 alebo 1,

   I

   -NHCOCH -CH

   CO₂H znamená znamená celé číslo od 1 do 100.
5. 5. Spôsob prípravy subtituovaného disulfidu podlá nároku

   1, vyznačuj všeobecného vzorca uvedený v nároku 1, úci sa tým, že

   CH3SSS-W podlá nároku uvedie do reakcie so sa zlúčenina

   1, kde W má význam substituovaným merkaptánom všeobecného vzorca Q-Sp-SH, v ktorom Q a Sp majú významy uvedené v nároku 1, v acetónitrili alebo v zmesi acetóntrilu a tetrahydrofuránu alebo acetonitrilu a dimetylformamidu pri teplote -20 až 40 °C počas 1 hodiny až 6. dní.
6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia uskutočňuje v prítomnosti jedného ekvivalentu terciárnej aminovej bázy a jedného ekvivalentu organickej karboxylovej kyseliny.
7. 7. Spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom podľa nároku 3 všeobecného vzorca

   Tu-(Z-Sp-SS-W) l m

   Y) n-m v ktorom Sp, W, Tu, n a m majú významy definované v nároku 3, znamená aminovú alebo karboxylovú skupinu tvoriaca bočný

   reťazec protilátky Tu a Z znamená skupinu -CONH-, skupinu -NH-, skupinu -N= =CH, skupinu -CCy- alebo s kupinu -nhcoch -ch (CH ) I Z .·. C°2_H, kde x = 0 alebo 1, v yznačuj úci sa tým, že sa

   uvedie do reakcie zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú vyššie uvedené významy a Q znamená.atóm halogénu, aminovú skupinu, alkylaminovú skupinu, karboxylovú skupinu, karboxaldehydovú skupiu, hydroxylovú skupinu alebo skupinu anhydridu alkyIdikarboxylovéj kyseliny, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 4 alebo 5 uhlíkových atómov, s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu, Y a n majú vyššie uvedený význam, vo vodnom puzri s hodnotou pH

   6,5 až 9 pri teplote 4 až 40 ^cC buď priamo alebo v prítomnost vo vode rozpustného karbodiimidu.
8. 8. Spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom podľa nároku 3 všeobecného vzorca

   Tu-(Z-Sp-SS-W)

   I m n-m v ktorom Sp, W, Tu, n a m majú významy uvedené v nároku 3, Y znamená aminovú skupinu tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu a Z znamená skupinu -CONH-, vyznačujúci sa tým, že sa zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú vyššie uvedené významy a Q znamená karboxylovú skupinu, uveaie do reakcie s N-hvdroxysukcinimidom, 2,3,5,6-tetrafluórfenclom, pentafluórfenolom alebo 4-nitrofenolom v prítomnosoi činidla aktivujúceho karboxylovú skupinu, akým je karboximid, pri vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom

   Sp a W majú vyššie uvedené významy a Q znamená alebo potom sa získaná zlúčenina uvedie do reakcie s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu, Y a n majú vyššie uvedené významy, vo vodnm pufrovanom roztoku s hodnotou pH 6,5 až 9 a pri teplote 4 až 40 °C.
9. 9. Spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom podľa nároku 3 všeobecného vzorca v ktorom Tu, Z, Sp, W, Y, m a n majú významy uvedené v nároku

   3, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že sa zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú vyššie uvedené významy a Q znamená skupinu -CONHNH2, uvedie do reakcie s kyselinou dusitou vo vodnom roztoku acetonitrilu za vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú vyššie uvedené významy a Q znamená skupinu -CON₃, a hneď sa táto zlúčenina uvedie do reakcie so zlúčeninou všeobecného vzorca Tu-(Y)_n, v ktorom Tu, Y a n majú vyššie uvedené významy.

   ±0. Spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom podľa nároku 3 všeobecného vzorca

   Tu-(Z-Sp-SS-W) (Y) n-m

   V ktorom Tu, Sp, W, n a m majú vyššie uvedené významy,

   Z znamená a Y znamená oiolcvú skupinu, tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu alebo amidoalkyltio-skupinu, v ktorej a1 kýlový zvyšok obsahuje 2 až 18 uhlíkových atómov, v y z n a č u j ú c i s a t ý m, že sa zlúčenina všeobecného vzorca QSp-SS-W, v ktorom Sp a W majú vyššie uvedený význam a Q znamená hydroxylovú skupinu, uvedie do reakcie s anhyaridom kyseliny alfa-halcgénoctovej za vzniku zodpovedajúcej zlúčeniny, v ktorej Q znamená alfa-haiogénacetyloxy-skupinu, a potom sa alfa-halogénacetyloxy-Sp-SS-W alebo zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú vyššie uvedené významy a Q znamená uvedie do reakcie s molekulou látky všeobecného vzorca Tu\Y)_n, v ktorom Tu má vyššie uvedený význam, Y znamená uiolcvú skupinu, tvoriacu bočný reťazec protilátky Tu alebo amidoalkyltio-skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 2 až 1S uhlíkových acórccv, zavedenú na aminovú funkciu protilátky

   Tu s použitím hydroxysukcinimidesteru kyseliny 3-(2ditiopyridyl)propiónovej a následnou redukciou ditiotreitolor. alebo amidoalkyltio-skupinu zavedenú na aminovú funkciu protilátky Tu s použitím 2-iminotiolanu, a r. znamená 1 až
10. 10, vc vodnom pufrovanom roztoku s hodnotou pH 4,4 až 7 a pri teplcze 4 až 40 ³C.
11. 11. Spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfidu, s nosičom, podľa nároku 3 všeobecného vzorca

    Tu-(Z-Sp-SS-W)

    I ^ľ m (Y) n-m v ktorom Sp, a Tu majú významy uvedené v nároku 3, Y znamená aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteinových cukrových zvyškov protilátky Tu, Z znamená skupinu -ON=CH-, skupinu -N=CH-, skupinu -CONHN=CH-, skupinu -NHCONHN=CH- alebo skupinu -NHCSNHN=CH-, n znamená 1 až 20 a m znamená 0, 1 až 15, vyznačujúci sa tým, že sa zlúčenina všeobecného vzorca Q-Sp-SS-W, v ktorom Sp a W majú vyššie uvedené významy a Q znamená skupinu -NH₂, skupinu -CONHKH₂, skupinu NHCONHNH₂, skupinu -NHCSNHNH₂ alebo skupinu -ONH₂, uvedie do reakcie s molekulou látky všeobecného vzorca Tu-(Y)_r, v ktorom má Tu vyššie uvedený význam a Y znamená aldehydovú skupinu odvodenú od glykoproteinových cukrových zvyškov protilátky Tu, v prítomnosti jodistanu kovu alkalických zemín vo vodnom pufri pri hodnote pH 4 až 6,6 pri teplote 4 až 40 °C.
12. 12. Spôsob prípravy konjugátu substituovaného disulfidu s nosičom podľa nároku 3 všeobecného vzorca v ktorom Tu, Sp, ú, mar. majú významy uvedené v nároku 11, Z znamená skupinu -NH-CH₂-, skupinu -CONHNHCH₂-, skupinu -NHCONHNHCH2- alebo skupinu -NHCSNHÚÚHCH₂-, a Y znamená skupinu -CH₂NHNHCOCH₃ alebo skupinu

    -CH^HNHCOCH(NH₂)ch₂ vyznačujúci sa t ý m, že sa zlúčenina všeobecného vzorca m

    v ktorom Tu, Z, Sp, W, Y, n a m majú významy uvedené pre túto zlúčeninu v nároku 11, uvedie do reakcie s acetylhydrazinom alebo tyrozinhydrazinom vo vodnom pufri pri pH 4 až c,5 za teploty 4 až 40 °C za vzniku zlúčeniny všeobecného· vzorca m

    v ktorom Tu, Z, Sp, W, n a m majú vyššie uvedené významy a Y znamená skupinu -CH=NHHCOCH3 alebo skupinu

    -CH = b)NHCO~CH (NH₂) -CH₂ a potom sa táto zlúčenina uvedie do reakcie s kyanobórohydridom sodným alebo bórohydridom sodným vo vodnom pufri pri pH 4 až 6,5 pri teplote 4 až 40 °C.