SE522972C2 - Sätt att anrika fiskfoder och levande larvfiskrov med näringsämnen som är väsentliga för fisklarver - Google Patents

Description

lO 522 972 _2_ tigt omättade fettsyror kräver marin larvfisk mer dokosahexa- ensyra (DHA) än eikosapentaensyra (EPA) som en essentiell fettsyra. En del fiskarter kan även kräva arakidonsyra (ARA) som en essentiell fettsyra. Anrikningen av Artemia med HUFA har rapporterats med användning av anrikningstekniker med mikropartikeldiet och emulsioner rika på n-3-HUFA-estrar el- ler med användning av algarter rika på n-3-HUFA. Ett problem med dessa mikropartikeldieter och emulsioner är den höga kostnaden för den fiskolja som används för att anrika mikro- partiklarna med HUFA. Ett annat problem är att de små olje- dropparna har en begränsad förmåga att ladda olika näringsäm- nen in i den lilla droppen och är helt olämpliga för att bära vattenlösliga näringsämnen såsom essentiella aminosyror.

Anrikningen av Artemia-naupliuslarver med användning av alger har många problem. Ett problem år att algerna kan bidraga till nedsmutsning av odlingstankarna för larverna. Se C.M.

Hernandez-Cruz et al. Larvi '95 Fish and Shellfish Larvicul- ture Symposium, sid 511-514, inkorporerad häri genom hänvis- ning, som rapporterar att anrikning av rotiferer med lipid- emulsioner leder till en ökning i det antal bakterier som är associerade med rotifererna vilket kan påverka bakteriefloran i larvernas odlingstank.

J.O. Eujemo et al. i Larvi '95 Fish and Shellfish Larvicultu- re Symposium, sid 109-110, rapporterar att "dokosahexaensyra (DHA) är viktigare än eikospentaensyra (EPA) för den fysiolo- giska funktionen av marina fenfisklarver inkluderande över- levnads-, tillväxt- och pigmenteringsframgångf I motsats till annan levande föda är emellertid anrikningen av Artemia med DHA svår på grund av den inneboende katabolismen för den se- nare fettsyran vid anrikning. Dessa problem, liksom även ' andra, har förhindrat anrikningen av levande föda med DHA." Andamål med och sammanfattning av uppfinningen Ett ändamål med uppfinningen är att tillhandahålla ett sätt att anrika Artemia och annat levande rov med HUFA, öka för- 522 972 _3_ hållandet mellan DHA och EPA och producera ett anrikat Arte- mia- eller annat levande rov.

Ett annat ändamål med uppfinningen är att använda HUFA- tvålpulver för att anrika rotiferer, Artemia och annat levan- de rov. Ännu ett ändamål med uppfinningen är att använda HUFA- tvàlpulver för att inkapsla essentiella aminosyror, läkeme- del, vitaminer och andra näringsämnen. Ännu ett ändamål med uppfinningen är användningen av HUFA- tvålpulver som en fodertillsats till en mikropartikeldiet för larvfisk. Ännu ett ändamål med uppfinningen är att utnyttja HUFA utvun- na fràn en avfallsström.

Ytterligare ett ändamål för uppfinningen är att använda HUFA- haltiga tvàlpulver som bärare för bioinkapslingen av läkeme- del, vitaminer, karotenoider, pigment och essentiella amino- syror i rov för administration till larvfisk.

Dessa och andra ändamål för uppfinningen som har åstadkommits genom uppfinningen beskrivs nedan.

Sammanfattningsvis har vi upptäckt att Artemia och annat le- vande rov anrikas med HUFA och att förhållandet mellan DHA och EPA ökas genom att mata det levande rovet med torkade tvàlpulver innehållande HUFA. På detta sätt har vi undvikit problem enligt tidigare teknik associerade med anrikning av levande rov med HUFA. Sedan det levande rovet har intagit 0 eller absorberat en tillräcklig mängd av de önskade fettsy- rorna matas rovet till larvfisken.

Det levande rov som kan anrikas med HUFA-tvàlpulver innefat- tar Artemia-naupliuslarver, rotiferer och copepoder. Efter anrikning har det levande rovet i allmänhet ett förhållande lO 522 972 _4- mellan dokosahexaensyra (DHA) och eikosapentaensyra (EPA) större än omkring 1:1. Företrädesvis är förhållandet mellan DHA och EPA större än omkring 1,5 till 1,0 och ännu mer före- trädesvis är förhållandet mellan DHA och EPA större än om- kring 2,0 till l,O efter anrikning av rovet.

Anrikning av levande rov med HUFA kan lätt åstadkommas genom att mata det levande rovet med kraftigt omättade fettsyra- tvålpulver som kan göras från de lipider som extraheras under den alkaliska tvätten av fisk- och algoljor. Den alkaliska tvätten avlägsnar de fria fettsyrorna och fosfolipiderna från de erhållna oljorna och kastas vanligtvis bort som ett av- fallsmaterial. De kraftigt omättade fettsyratvålarna, som en vattenhaltig alkalisk lösning, kan även erhållas från Martek Bioscience of Columbia, Maryland, som en biprodukt av Marteks polyomättade fettsyraextraktionsprocess från marina alger.

Dessa fettsyror extraheras under köldtålighetsbehandlingen och alkaliska bearbetningen av algoljor av Martek eller köld- tålighetsbehandlingen och alkaliska tvätten av råa fiskoljor.

Den normala motjonen i tvàlen är vanligtvis natrium men andra motjoner såsom kalium och kalcium kan även användas liksom även blandningar av dessa motjoner. Kalcium är en föredragen motjon eftersom kalciumtvålar är mycket olösliga i vatten och larvfisk kräver kalcium för benutveckling. Valet av motjoner kan även bestämmas av larvfiskens behov liksom även av förmå- gan hos det levande rovet att absorbera fettsyran i närvaron av motjonerna.

Det kraftigt omättade fettsyratvålpulvret har ett förhållande av omkring 1 till 1 mellan dokosahexaensyra (DHA) och eikosa- pentaensyra (EPA), företrädesvis större än omkring 1,5 till 1,0 och ett förhållande av större än omkring 2,0 till 1,0 är mest föredraget.

Tvålarnas fettsyrasammansättning kan varieras men omfattar företrädesvis: från omkring 8% till omkring 16% C14:O, från omkring 0,75% till omkring 2,50% Cl6:lw7, från omkring 9% 522 972 _5_ till 13% C16:O, från omkring 7,5 till 10,5% Cl8:2m6, från omkring 30 till 55% Cl8:1w9, från omkring 0,01% till omkring 2,5% C18:lw7, från omkring 2% till omkring 4,5% C20:4 och från omkring 8,5 till omkring 28% C22:6w3. emellertid skall betonas att sammansättningen hos tvälen kan varieras beroende pà larvfiskarternas näringsbehov.

Den vattenhaltiga alkaliska lösningen av fettsyratvàlar kan torkas och omvandlas till ett tválpulver genom en konventio- nell spruttorkningsprocess. Den hydratiserade partikelstorle- ken kan variera men bör inte vara större än omkring 10 pm, företrädesvis mindre än omkring 7,5 pm och mest företrädesvis är partikelstorleken i området omkring 1 pm till omkring 5 pm. Varje konventionell motjon kan användas men natrium och kalium är föredragna och mest föredragen är kalcium. Kalcium föredras eftersom kalciumsalter av tvàlar är mycket mer olös- liga i vatten och eftersom kalcium behövs för bildning av ben. Läkemedel, vitaminer, karotenoider och/eller pigment tillsätts vanligtvis till den vattenhaltiga tvàllösningen före spruttorkningsprocessen men läkemedel, vitaminer, amino- syror, karotenoider och/eller pigment skulle även kunna till- sättas till tvàlpulvret efter torkning. De läkemedel som kan inkorporeras innefattar antibiotika, medel mot svamp och andra godkända läkemedel. Vitaminerna innefattar vitamin A, Bm, E, D och fettsyraderivaten av askorbinsyra.

Aminosyror sàsom metionin, cystein och andra essentiella ami- nosyror kan sättas till fettsyratvàlarna före spruttorknings- processen. Karotenoiderna och pigmenten innefattar a-karo- ten, ß-karoten, kantaxantin, astaxantin, astaxantin-mono- eller -diester, dosadexantin, idoxantin, zeaxantin och xanto- fyller. Företrädesvis är karotenoiderna i den fria formen och âr inte förestrade med fettsyror.

Tillsatsen av läkemedel, vitaminer, karotenoider och pigment till tvàlpulvren gör att det levande rovet kan verka som bio- kapslar vid administrering av dessa medel till larvfisk. Spe- ciellt är levande föda sàsom rotiferer, Artemia-nauplius- lO 522 972 _6_ larver och copepoder föredragna för denna roll pà grund av den ökande smakligheten hos dessa födor för larvfisk. Det torkade tvàlpulvret kan även blandas med artificiellt fiskfo- der eller matas direkt till larvfisk som en del av en artifi- ciell mikropartikulär diet. Tillsatsen av det torkade tvàl- pulvret som innefattar aminosyror till torkat eller halvfuk- tigt fiskfoder är en av de få metoderna för anrikning av fiskfoder med aminosyror pà grund av att aminosyrorna är vat- tenlösliga. På detta sätt kan både kraftigt omättade fettsy- ror och essentiella aminosyror liksom även andra vattenlösli- ga föreningar administreras till fisk via ett anrikat fiskfo- der.

Kort beskrivninfl av ritninqarna Figur 1 är ett diagram som visar effekterna med tiden av att behandla Artemia-naupliuslarver med tvàlpulvret enligt upp- finningen jämfört med etylesteremulsioner av tvàlpulvren och en obehandlad kontroll. Diagrammet visar anrikningen av DHA som procent av totala fettsyror vid noll, sex, tolv och 24 h.

Felstrecken visar standardfelet för mätningen.

Figur 2 är ett diagram som visar effekten med tiden av be- handling av Artemia-naupliuslarver med tvàlpulvret enligt uppfinningen jämfört med etylesteremulsioner av tvàlpulvren och en obehandlad kontroll. Figuren visar procent EPA som procent av totala fettsyror vid noll, sex, tolv och 24 h.

Felstrecken visar standardfelet för mätningen.

Figur 3 är ett diagram som visar effekten med tiden av att behandla Artemia-naupliuslarver med tvàlpulvret enligt upp- finningen jämfört med etylesteremulsioner av tvàlpulvren och en obehandlad kontroll. Figuren visar procent arakidonsyra (ARA) som procent av totala fettsyror vid noll, sex, tolv och 24 h. Felstrecken visar standardfelet för mätningen. 522 972 _7_ Figur 4 är ett diagram som visar DHA-anrikningen av Artemia- naupliuslarver i andra stadiet som procent av DHA-natrium- salt.

Figur 5 är ett diagram som visar effekten av dietfosfolipider vid 30% etylester-DHA (EE-DHA) eller 30% DHA-natriumsalt (DHA-Na)-nivåer pà förhållandet DHA:EPA i 16 h anrikade Arte- mia-naupliuslarver i andra stadiet.

Figur 6 är ett diagram som visar absorption av DHA fràn neu- trala polära dietlipider.

Beskrivning av de föredragna utföringsformerna A sänt att tillverka HUFA-cvålpulver.

Avfallet från den alkaliska tvätten (tvàlar) och fasta avfal- let från köldtàlighetsbehandlingen fràn Martek DHAsco- och ARAsco-oljor befanns vara omkring 75% vatten och hade följan- de allmänna lipidsammansättning såsom visas i tabell 1.

TABELL 1 SAMMANSÃTTNING TVÅLAR FAST SUBSTANS Viktprocent av li- Viktprocent av li- pider pider Sterol/vaxestrar 1,88 3,10 Triglycerider 45,27 85,60 Fettsyror 27,70 0,98 Steroler 4,18 1,42 Fosfolipider 20,97 8,89 När tválarna tvättades med kall aceton vid pH 4,0 inkapslades fosfolipiderna och fettsyrorna och kunde utvinnas. Fettsyra- halten i det ursprungliga materialet och det material som erhölls efter acetontvätten visas i tabell 2. Emellertid var 522 972 _g_ utvinningen inte kvantitativ och endast tválarna användes för anrikning.

TABELL 2 Fettsyrasammansâttning Före acetontvätt Viktprocent av totala fettsyror Efter acetontvätt Viktprocent av totala fettsyror C14:O 14,87 9,02 C16:1w7 2,09 1,06 Cl6:0 11,93 11,86 C18:2w6 9,1 8,43 C18:1w9 35,62 49,17 C18:1m7 0,5 1,86 C20:4 2,46 3,51 C22:6w3 23,44 13,5 För att undersöka anrikningen av Artemia-naupliuslarver jäm- fördes en emulsion av den acetontvättade tvàlen (l,6g tvål med 8,4g DHAsco-olja) av menhadenolja (Zapata) ja). blandad med DHAsco-olja med en emulsion (0,75g tválar och 2,259 menhadenol- Fettsyrahalten hos dessa emulsioner visas i tabell 3.

TABELL 3 Fettsyra Tvål och Tvàl och Menhadenolja DHAsco-olja Menhadenolja C14:O 12,46% 8,19% 7,04% Cl6:2 0% 1,53% 1,86% C16:1 0% 9,31% 10,55% C16:1w7 1,66% 1,35% 1,56% c16=2 0% --- --- C16:O 17,13% 18,68% 19,42% C18:3 0,36% 3,15% 3,72% C18:2w6 1,77% 2,36& 2,06% av uno; en nu 522 972 _9_ c18= 1w9 18,32% 13,49% 9,91% C18: 1w7 0% 2,84% 3,27% C18 0 1,95% 3,27% 3,61% C20 6 0% 0% 0% C20 5w3 5,68% 10,09% 12,16% C20 4 0,3% 1,49% 1,82% C20 3 0% 0,26% 0,32% C20 2 0% 0% 0% C20 1 0% 1,18% 1,41% C22 6m3 37,33% 16,941% 11,41% c22=s 0,62% 2% 2,28% DHA/EPA 6,572 1,678 0,938 * De värden som ges är i viktprocent av totala fettsyror.

B Sätt att anrika levande rov med användning av HUFA-anrikat tvålpulver Artemia anrikades genom följande förfarande: 1. Kläck Artemia i behållare om 1 1 med 26 ppt vattenhaltig saltkoncentration vid 26°C under 24 h. 2. Separera nykläckta naupliuslarver fràn okläckta ägg och placera naupliuslarverna i en tank. 3. Làt naupliuslarverna avancera till det tredje nauplius- larvstadiet under nästa 18 till 24 h. 4. Placera 10 g av den önskade lipiden i en blandare, till- sätt 200 till 300 ml odlingsvatten och emulgera blandningen under en min. \ . Låt naupliuslarverna adsorbera/intaga emulsionen i en kon- centration av 0,1 g emulsion per 1 lösning under nästa 12-24 h. 522 972 _10- 6. Uppsamla anrikade naupliuslarver och skölj hastigt under rinnande vatten. 7. Sätt anrikad Artemia till larvfisktankarna.

Naupliuslarverna undersöktes efter 3 h och 6 h för att se om nàgon anrikning hade skett. Tabell 4 sammanfattar fettsyra- sammansättningen (i viktprocent av lipid) för naupliuslarver- na efter behandling med de emulgerade tvàlarna. Såsom obser- no!! verades sker en väsentlig anrikning av naupliuslarverna med DHA.

TABELL 4 Fettsyrasamansättning * hos naupliuslarver som funktion av tiden.

Fettsyrasam- Tid O Efter 3 h Efter 3 h Efter 6 h Efter 6 h mansàttning kontroll Tvål + Tvál + DHAsco DHAsco C14:0 0,45% 0,43% 4,55% 0,00% 4,93% Cl6:2 0,64% 0,64% 0,6% 0,55% 0,59% C16:1 2,67% 2,71% 2,25% 1,31% 2,04% Cl6:1m7 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% Cl6:0 9,88% 10,32% l0,97% 5,48% 9,94% Cl8:3 4,84% 5,26% 2,89% 2,32% 3,20% C18:2m6 5,79% 5,93% 4,47% 2,98% 4,07% Cl8:1w9 30,l6% 45,24% 36,44% 22L56% 33,25% Cl8:1m7 l4,4% 8,82% 5,43% 4,89% 4,87% Cl8:0 8,79% 8,85% 5,77% 5,14% 5,07% C20:6 1,31% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% C20:5m3 0,30% 1,51% 0,96% 0,97% 1,16% C20:4 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,9% C20:3 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% C20:2 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% C20:1 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% C22:6w3 0,00% 0,00% 9,92% 0,00% 9,33% 522 972 _11- C22:5 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,9% DHA/EPA 0 0,00 10,33 0,00 10,36 * Viktprocent av lipid.

Olyckligtvis upptäcktes även att de emulsioner som rapporte- rats i tabell 4 var toxiska för Artemia efter omkring 6 h exponering. Överraskande var de torra tvàlarna inte toxiska för nauplius- larverna när de matades till naupliuslarverna eller placera- des i samma tank som naupliuslarverna. För att undvika den toxiska effekten av emulsionerna användes därför den pulveri- serade torra tvàlen för anrikningen av naupliuslarverna. För att jämföra anrikningseffekten framställdes etylestrar av HUFA-tvàlarna och emulgerades genom att tillsätta 3% Tween-80 följt av kraftig omrörning. De torra HUFA-tvàlarna och etyl- estrarna av HUFA-tvàlarna suspenderades separat med 1 g/l- koncentration med Artemia-naupliuslarver och jämfördes över en period om 24 h. Resultaten visas i tabell 5. Det är an- märkningsvärt att Artemia i både etylesteremulsionerna och HUFA-tvàlarna inte visade någon väsentlig dödlighet över 24 timmarsperioden av anrikningen. como TABELL 5 Tid EPA Torra EE DHA Torra EE DHA/ EPA Torra EE kontroll :vålar s omul- kontroll rvålar omul- konrroll rvålar emul- % tOtal total SiOn % % total *lf total Bion % % .tøtal % 51011 % lipia lipia :oral lipia lipia :oral lipia coral :oral lipia lipia lipid lipia 0 3,71 0,00 O 6 4,06 4,11 4,04 0,00 0,79 1,12 0 0,19 0,28 12 4,01 3,86 3,69 0,00 5,61 3,13 0 1,45 0,85 24 3,40 3,70 3,67 0,00 8,94 5,09 0 2,42 1,39 Såsom ses i tabell 5 ledde de naupliuslarver som erhöll ett 24 h anrikningsprogram med de torra tvàlarna till en väsent- lO 522 972 _12- ligt anrikad DHA-nivå jämfört med etylesteremulsionen. Dess- utom visade tvàlarna väsentligt förbättrad anrikning i för- hållandet DHA/EPA jämfört med etylesteremulsionen över anrik- ningsperioden om 24 h.

Experimentet upprepades i trippeluppsättning. Följande resul- tat, visade i figurerna 1-3, erhölls för total lipidanrikning med användning av den torkade fettsyratválen. Figur 1 visar DHA som procent av total fettsyra över tiden för naupliuslar- ver att administrerade HUFA-tvàlpulvret enligt uppfinningen jämfört med naupliuslarver administrerade en etylesteremul- sion enligt uppfinningen och en kontrollgrupp. Såsom framgår av figur 1 ökade de Artemia-naupliuslarver som administrerats HUFA-tvàlarna sina DHA-nivåer som procent av totala fettsyror snabbare och förvärvade en högre total nivà av DHA jämfört med de naupliuslarver som administrerats etylestrarna av HUFA-tvàlarna. Figur 2 visar EPA som procent av totala fett- syror över tiden för tre grupper av naupliuslarver och figur 3 visar arakidonsyra (ARA) som procent av totala fettsyror över tiden för tre grupper av naupliuslarver. Det observera- des att EPA och arachidonsyrasammansättningen för nauplius- larverna inte förändrades när DHA-nivån ökade.

Den normala matningsproceduren för torr tvål för Artemia- naupliuslarver är som följer: 1. Kläck Artemia i behållare om 1 l med 26 ppt vattensaltkon- centration vid 26°C under 24 h. 2. Separera nykläckta naupliuslarver från okläckta ägg och placera naupliuslarverna i en tank. 3. Làt naupliuslarven avancera till det tredje naupliuslarv- stadiet under nästa 6 till 8 h. 4. Tillsätt det torra tvàlpulvret till tankens yta. 522 972 _13- . Lät naupliuslarverna adsorbera/intaga emulsionen vid den önskade koncentrationen under nästa 12-24 h. 6. Samla upp anrikade naupliuslarver och skölj kort under rinnande vatten. 7. Sätt anrikad Artemia till larvfisktankarna.

Effekterna av att anrika Artemia-naupliuslarver av andra sta- diet (andra naupliuslarvstadiet) och av att använda DHA- fosfolipid (PL) och DHA-natriumsalt (DHA-Na) pà anrikningsef- fektiviteten undersöktes i en serie experiment.

Anrikningsdieten applicerades i ett fullständigt slumpmässigt utförande och tre replikat i tre uppsättningar för experimen- tella körningar. Den förenade effekten av dietisk DHA-rik PL och DHA-Na-salt pä anrikningseffektiviteten utvärderades i tvâ uppsättningar experiment. I den första uppsättningen an- vändes olika anrikningsdieter som har varierande proportioner av DHA-Na-salt (l0,2O eller 30%) och DHA-rika fosfolipider (DHA-rika triacylglyceroler (TAG) och olivolja användes för att justera dietnivàn av DHA till 32 i 2% av totala fettsy- ror, tabell 6). I en andra uppsättning av experiment förena- des lika stora mängder etylester-DHA eller DHA-Na (30% av totala lipider) med olika proportioner (l0,2O eller 40% av totala lipider) av sojalecitin vid konstant DHA-nivå av 21 i 1% av de totala fettsyrorna (30% DHA-TAG och kompletterande mängder olivolja användes som en källa för triacylglyceroler, tabell e) . " Absorptionseffektiviteten för DHA som funktion av avgivnings- formen för lipidfraktionen utvärderades i en tredje uppsätt- ning experiment. Dieter som har ökande nivàer av DHA (0- l3,21% av totala fettsyror) endast i triacylglycerol-, fosfo- lipid- eller natriumsaltfraktionen av anrikningslipiderna formulerades. Dieter justerades med liknande icke-DHA-haltiga fraktioner (t ex olivolja, sojalecitin och oljesyranatrium- 522 972 _14- salt) till att innehålla lika stora mängder av dessa tre li- pidfraktioner.

Alla dieter försattes med 2% polyoxietylensorbitanmonooleat Sigma, Mo, USA) Artemia-naupliuslarvstadiet II. Anrikningsbetingelserna fast- ställdes vid 28-30°C i 20 ppt artificiellt havsvatten (200 000) naupliuslarver/l) försett med luftning och konstant be- (Tween 80, och matades i tre replikat till lysning genom fluorescerande ljus. Två lika stora portioner om 0,3 g anrikningslipider blandades med färskt vatten, homo- geniserades under 15 s och matades till Artemia-nauplius1ar- verna vid tidpunkten O och 8 h efter larvstadiet II.

Artemia-längd, -vikt och -överlevnad registrerades före mat- ning och vid 8 och 16 h efter matning. Ett prov av Artemia- naupliuslarver avlägsnades fràn varje behållare vid tidpunk- terna 0, 8 och 16 h, tvättades med destillerat vatten, torka- des med pappershanddukar, placerades i provrör och frystes omedelbart pà torris. Proven frystorkades under 48 h och hölls vid -80°C för senare analys. Trippelgrupper om 100 in- divider vardera av de frystorkade Artemia vägdes till närmas- te 0,1 pg för bestämning av torrvikten.

Totala lipider extraherades från triplikatprov enligt metoden av (Folch et al. Biological Chemistry 226, 497-509 (1957) inkorporerad häri genom hänvisning). Lipidvikten bestämdes gravimetriskt och uttrycktes som procent torr vikt av Arte- mia. Lipidklasser i de anrikade Artemia-naupliuslarverna se- parerades på Chromarods-S III och kvantifierades med Iatros- can TH-10 TLC/FID-analysanordning (Iatron Laboratories, Inc, Tokyo, Japan) utrustad med HP 3390A-integrator. Chromarods fokuserades inledningsvis två gånger i 1:1 kloroformzmetanol för att frambringa ett snävt band av provlipider och framkal- lades i lösningsmedelssystem innehållande hexan:dietyl- eterzmyrsyra (85:15:0,1) under 45 min. Standardkurvor (första ordningen) av kända mängder av L-a-fosfatidylkolin, tripal- mitin, oljesyra, kolesteryloleat och kolesterol (alla erhåll- 522 972 _15- na frán Sigma, Mo, USA) alstrades för varje lipidklass och användes för kvantifiering.

Fettsyrametylestrar (FAME) framställdes fràn totala lipidex- trakt i enlighet med Morrison och Amith, J2 Lipid Res. 5, 600-608 (1964) inkorporerad häri genom hänvisning. Lipidex- trakten förtvàlades med mättad KOH i metanol och metylerades med 12% BF3/metanol. Fettsyrametylestrarna analyserades med användning av en Hewlett-Packard 589OA gaskromatograf utrus- tad med en flamjoniseringsdetektor och en 30 m X 0,25 mm ID kapillärkolonn med 0,25 pm filmtjocklek (DB5, J&W Scientific, Folson, CA, USA). Bärargasen var helium vid ett kolonntryck av 19 psi. Injektor- och detektortemperatur var 300°C och ugnstemperaturen programmerades från initial temperatur av °C till l80°C inom 20 min, fràn l80°C till 235°C inom 2 min och 235°C till 275°C inom 20 min. Två inre standarder, Cl9:0 och C21:0, sattes till varje prov för kvantifiering och de integrerade toppytorna för fettsyrametylestrarna identifiera- des genom sammansättning med kända standarder.

Variansanalys användes (ANOVA, Statview 4.5, 1995) för att bestämma skillnader mellan och inuti blandningsmedel av över- levnadslängd, vikt, lipid, lipidklass och fettsyraprocent.

Procentdata normaliserades genom arcsin-transformation för analys. När signifikanta skillnader mellan medlen detektera- des tillämpades ett Duncan's multipelomràdestest. En signifi- kansnivà om 95% (P<0,05) användes genomgående.

TABELL 6 Sammansättning av anrikningsdieter (% av totala lipider) Oljetyp %iet#l Diet#2 Diet#3 Diet#4 Diet#5 Diet#6 1:a uppsättning experiment DHA-TAG 65 55 45 60 50 40 DHA-PL 5 5 5 10 10 10 DHA-Na 10 20 30 10 20 30 oo 522 972 _16- olivolja 20 20 20 20 20 20 DHA* 32,4 32,3 31,0 34,9 34,3 33,6 2:a uppsättning experiment DHA-TAG 30 30 30 30 30 30 DHA-Na 30 -- 30 -- 30 -- EE-DHA -- 30 -- 30 -- 30 Sojalecitin 10 10 20 20 40 40 Olivolja 30 30 20 20 -- -- DHA1 20,2 21,2 21,1 21,7 22 20,8 1 Procent av totala fettsyror.

Artemia-naupliuslarverna ökade i längd från 624,3 i 10,0 pm vid larvstadie II till 911,1 i 12,6 pm efter 16 h anrikning oberoende av dietbehandling (P>0,05). Medelvikten för Arte- mia-naupliuslarver av stadie II var 2,10 i 0,08 pg torrvikt och förändrades inte väsentligt efter 16 h anrikning på någon dietbehandling (2,05 i 0,13 pg torrvikt, P>0,05). Överlevnad efter 16 h anrikning var 74,0 i 7,8% och påverkades ej signi- fikant (P>0,05) av PL eller fettsyranatriumsaltnivàer i an- rikningsdieten (inte ens vid höga nivåer av 30% respektive 40%). nehöll Artemia-naupliuslarverna 16,28 i 0,15% (torr vikt) lipid, som minskade till 13,81 i 0,41% efter 16 h svältning.

Vid början av matningsexperimenten (larvstadie II) in- Alla dietlipider absorberades effektivt av Artemia- naupliuslarverna oberoende av PL- eller fettsyranatriumsalt- halten (P>0,05) som àtföljdes pidhalt till 24,3 i 0,6% torr av en signifikant ökning i li- vikt efter 16 hpanrikning.

Anrikningslipider ackumulerades till största delen som TAG i Artemia-lipider medan Artemia-PL-halten inte svarade pà för- ändringar i diet-PL och förblev konstant vid 47,69 i 7,74 mg/g torr vikt (P>0,05). Vidare påverkades förhållandena PL:TAG i Artemia-lipider vid lika stor lipidhalt och också av dietförändringar i PL-fraktionen (P>0,05, tabell 2). Emeller- tid àtföljdes dietinkludering av 30% DHA-Na, vid vilken PL- dietnivà som helst, av ett väsentligt högre förhållande 522 972 _17- (P<0,05)PL:TAG i Artemia-lipider jämfört med dietinkludering av 30% EE-DHA (O,33 i 0,02 respektive 0,24 i 0,01, tabell 7).

Absorption av diet-DHA vid 16 h av anrikade Artemia-nauplius- larver var signifikant högre (P<0,05) när lipiden gavs i sin natriumsaltform jämfört med etylesterformen (30,97 i 4,82 mg/g torrvikt respektive 23,76 i 3,06 mg/g torrvikt). Dessut- om var DHA-absorptionen genom Artemia högst vid 20% diet-PL och minskades väsentligt vid högre eller lägre dietnivàer (tabell 7). Alternativt ledde en blandning av 10% PL och 10% SS-DHA också till maximal (P<0,05) absorption av DHA i de anrikade Artemia-naupliuslarverna ( figur 4).

Figur 4 beskriver effekterna av diet-PL- och -DHA-natriumsalt (DHA-Na)-nivåerna på DHA-absorption vid 16 h anrikade Arte- mia-naupliuslarver vid andra larvstadiet. Procenttalet för dietfraktionerna är av totala dietlipider. Staplar som delar (P>0,05). för tre replikat. Emellertid frambring- samma överskrift är inte signifikant skilda Vârdena är medelvärde i s. e. ade en kombination av 20% diet-PL och 30% DHA-Na det högsta förhållandet (P<0,05) DHA:EPA i de anrikade Artemia- naupliuslarverna jämfört med alla andra kombinationer av PL och DHA~Na eller EE-DHA (fig 5). Figur 5 beskriver effekterna av diet-PL vid 30% etylester-DHA (EE-DHA) eller 30% DHA- natriumsalt (DHA-Na)-nivåer pà förhållandet DHA:EPA i 16 h anrikade Artemia-naupliuslarver vid andra larvstadiet. Pro- centtalen för dietfraktionerna är av totala dietlipider.

Staplar som delar samma överskrift är inte signifikant skilda (P>0,05). Vârdena är medelvärde i s. e. för tre replikat. n o» u 522 972 _ _ TABELL 7 Effekt av variering av proportionerna av diet-PL vid 30% etylester-DHA (EE-DHA) eller 30% natriumsalt-DHA (DHA-Na) på PL-TAG-förhållandet och DHA-absorption i Artemia. % diet- PL:TAG PL:TAG DHA-absorption sojalecitin vid 30% EE-DHA 'vid 30% DHA-Na (mg/g torr vikt) 0,26 i 0,01” 0,33 i 0,01^ 25,89 i 3,60” 0,24 i 0,018 0,32 i 0,05^ 35,74 i 7,s7^ 40 0,25 i 0,025 0,34 i 0,02'* 20,96 i 2,981* - Procent för dietfraktioner är av totala dietlipider.

- Värden i varje spalt som delar samma överskrift är inte (P>0,05) . för signifikant olika Värdena är medelvärde i s. e. tre replikat.

EPA-halten i Artemia-naupliuslarver i larvstadie II var 8,14 i 0,42 mg/g torr vikt och minskades lätt till 7,20 i 0,61 mg/g torr vikt efter 16 h svält. Å andra sidan nästan för- dubblades EPA-halten till 13,82 i 0,23 mg/g torr vikt efter 16 h av DHA/anrikning utan någon signifikant effekt av PL- (P>0,05) . saknade EPA (mindre än 0,5% av totala fettsyror) resulterade ökningen i EPA-halt från DHA-metabolism och tillbakaomvand- eller DHA-Na-dietnivàerna Eftersom dietlipiderna ling i den anrikade Artemia. Fastän ytterligare EPA till största delen härstammade fràn àteromvandlad DHA observerades ingen korrelation mellan nivåerna av de bàda (R2=0,32). Fig 5 visar förhållandet DHA:EPA i anrikad Artemia som en funktion av diet-PL- och -natriumsalt-DHA-halterna. Höga dietnivàer av PL (40% av totala lipider) påverkar DHA-absorptionen väsent- ligt med konsekvens av lägre förhållanden DHA:EPA i den anri- kade Artemian. Ãndà var förhållandet DHA:EPA i Artemia signi- fikant högre (P<0,05) vid matning pà 10-20% PL tillsammans med 30% natriumsalt-DHA än med över 30% etylester-DHA.

Figur 6 beskriver DHA-absorption i neutrala (ofyllda symbo- ler) och polära lipider (fyllda symboler) av 8 h anrikade 522 972 _19- Artemia-naupliuslarver som funktion av dess avgivningsform för dietfraktion. DHA avgavs i ökande nivà (O-l3,2l% av tota- la fettsyror) endast i en dietfraktion àt gängen (triacylgly- ceroler (TAG), etylestrar (EE) eller fosfolipid (PL)- fraktion). Värdena är medelvärden i s. e. för tre replikat.

Avgivning av DHA i PL- eller TAG-lipidformer förbättrade dess absorption genom den anrikade Artemia jämfört med ej förest- rad form (fig 6). Efter 8 h av anrikning ackumulerades DHA huvudsakligen i den neutrala fraktionen av Artemia-lipider.

Dessutom ledde DHA inkorporerad i Artemia polära lipider först vid avgivning som diet-fosfolipider avgivande DHA i andra dietfraktioner till inkorporering i Artemia neutral lipid. Dessutom var anrikningseffektiviteten för Artemia neu- trala lipider med DHA högst när den avgavs i diet-PL- eller - TAG-former (43% diet-DHA, R2=O,99) och minskade väsentligt till 28% av diet-DHA (R2=O,89) när den avgavs som oförestrad- DHA. Vidare ackumulerades 7% av diet-DHA (R2=O,9l) i Artemia polär fraktion när den avgavs i PL-fraktion jämfört med en- dast 7,5% av diet-DHA (R2=O,95)när den avgavs i andra diet- fraktioner.

Vuxna rotiferer behandlades med de tidigare beskrivna HUFA- tvàlpulvren enligt uppfinningen. Rotifererna behandlades ge- nom att sätta tvàlpulvren till respektive tankar vid de kon- centrationer som visas i tabell 8 och 9. Fettsyraanrikningen av denna behandling med tválpulvret visas även i tabellerna 8 och 9. Tabell 8 visar fettsyraanrikningen efter 4 h vid be- handling och tabell 9 visar anrikningen efter 8 h behandling, rotifererna uppsamlades därefter och analyserades. Goda för- hållanden mellan n-3 och n-6 polyomättade fettsyror erhölls.

Det är värt att observera att de vuxna rotifererna omvandlade 22:5n3 fettsyror till 20:5n3 fettsyror när anrikningsperioden förlängdes från 4 h till 8 h och därför kan det vara viktigt att omsorgsfullt övervaka anrikningsperioden. 522 972 _20- TABELL 8 Sammanfattning av 4 h anrikning (mg/g DBW rctifer) Behandlingar Lipidklass 0,025 S.D.* 0,050 S.D. 0,1 S.D. 0,2 S.D. 9/1 9/1 9/1 9/1 Fettsyror totalt 77,98 45,27 54,55 19,78 66,49 15,71 103,02 24,90 22:6n3 2,21 2,22 1,30 0,39 2,91 0,73 9,03 2,56 22:5n3 2,98 2,68 3,18 1,19 3,78 0,756 5,00 1,75 :5n3 11,84 5,36 8,70 3,36 9,48 1,72 12,58 4,31 Mättade totalt 22,92 15,32 14,53 5,21 17,70 4,30 25,88 5,67 Mono- omättade 26,51 12,17 19,83 6,93 24,33 6,10 37,93 8,18 totalt Fler- omättade 9,22 5,21 6,13 2,30 6,64 2,98 7,49 1,68 totalt n-3 fler- omättade 18,23 11,45 13,54 5,13 16,60 3,26 27,56 8,58 totalt n-6 fler- omättade 8,36 4,49 5,81 2,20 6,87 1,72 10,15 2,39 totalt n-3/n-6 2,12 0,26 2,33 0,07 2,44 0,17 2,68 0,25 * Standardavvikelse TABELL 9 Sammanfattning av 8 h anrikning (mg/g DBW-rotifer) Behandlingar _ Lipidklass 0,025 S.D.* 0,050 S.D. 0,1 S.D. 0,2 S.D. 9/1 9/1 9/1 9/1 Fettsyror totalt 64,38 13,13 62,23 3,29 79,18 9,48 98,58 42,29 22:6n3 0,73 0,24 1,26 0,068 2,76 0,45 6,93 3,40 w 522 972 _21- 22:5n3 4,02 0,85 3,61 0,18 4,50 0,94 4,88 2,44 :5n3 9,43 2,57 8,31 0,97 11,01 0,96 11,74 5,61 Mättade totalt 17,23 3,39 16,77 1,83 21,37 2,54 26,01 9,86 Mono- Omättade 25,00 5,23 24,29 2,10 29,32 3,39 36,18 16,71 totalt Fler- omättade 22,15 5,12 21,17 0,86 17,79 9,12 15,03 5,63 totalt n-3 fler- omättade 14,52 3,66 13,78 0,39 18,75 2,30 24,51 11,38 totalt n-6 fler- Omättade 6,92 1,34 6,54 0,27 8,74 1,30 10,35 4,11 totalt n-3/n-6 2,09 0,18 2,11 0,05 2,15 0,06 2,32 0,21 * Standardavvikelse Effekterna av att mata med alger anrikade med DHA undersöktes ocksà.

Heterotrofiskt odlade hela Chlorella sp- och Tetraselmiss- pastor, hela celler och krossade celler samt avlipiderat torrt biomjöl av Cryptecodinium sp-alger erhölls från Martek BioSci, Inc. Alla material frystorkades innan de blandades med DHA-PL-fraktionen fràn DHA-oljeproduktionsprocessen. An- rikningsdieterna innehöll endast DHA-PL ellerf3:1, 2:1 eller 1:1 blandning (pà basis av torr vikt) av DHA-PL med var och en av de frystorkade algerna (Chlorella sp, Tetraselmiss och avlipiderat Cryptecodinium sp-biomjöl). Alla anrikningsbland- ningar homogeniserades med vatten och frystorkades en gång till för att säkerställa högsta blandningen av alla förening- arna .

Artemia och rotifererna odlades och lipiderna analyserades genom de metoder som tidigare beskrivits. 522 972 _22- Över 75% av Artemia överlevde efter 16 h anrikning utan någon signifikant effekt (P>0,05) av bärartyp (biomjöl, Chlorella sp och Tetraselmiss). Emellertid ledde en blandningspropor- tion av 75% av någon typ av bärare med 25% DHA-PL till högsta överlevnadsgraden av 94,6 i l,l% med endast 75-79% i alla andra blandningsproportioner. Lägsta överlevnadsgraden av 63,7 i l,4% erhölls vid matning av Artemia med hel Crypteco- dinium sp-cell. Dessa överlevnadsresultat återspeglar troli- gen näringsvärdet hos dieterna eftersom den mycket digererba- ra och näringsmässigt balanserade 45% blandningsdieten ledde till maximal överlevnadsgrad medan Artemia som matades med de dåligt digererade hela intakta cellalgerna svalt.

Alla typer av bärarblandningar (biomjöl, Chlorella sp och Tetraselmiss) var lika effektiva (P>0,05) i att öka lipidhal- ten i de 16 h anrikade Artemia (23,9-27,6% torr vikt). Bland- ningsproportioner av 25-50% av vilken bärare som helst med DHA-PL var signifikant mer effektiva (P<0,05) i att öka li- pidhalten än 75% blandningsnivà eller DHA-PL (ingen bärare)- dieten. Detta antyder att dieten med endast DHA-PL inte är en effektiv diet för Artemia-anrikning medan rätt blandning av detta material med en bärare såsom biomjöl och mikroalger signifikant kunde förbättra bàde dess smaklighet och anrik- ningseffektivitet. Anrikning av Artemia med alger i form av hela celler eller krossade celler var signifikant mindre ef- fektiv (P>0,05) i att öka lipidhalten än dieten med enbart DHA-PL eller någon av de blandade dieterna. Emellertid uppför sig dieten med krossade celler något bättre än dieten med hela celler (l9,1% mot l7,0% torr vikt) vilket antyder att Artemia-naupliuslarverna inte kunde ta upp och effektivt di- gerera den stora partikelstorleken (>40pm) av de hela celler- na av Cryptecodinium sp-algerna.

Bärarna biomjöl, Chlorella sp och Tetraselmiss var lika ef- fektiva som DHA-PL (P>0,05) i att avge diet-DHA till Artemia (20-30 mg/g torr vikt). Däremot var helcelliga alger och al- ger med krossade celler de minst effektiva (7,8-10,5 mg/g none nu 522 972 _23.. torr vikt). Dietproportionerna av 25-50% av någon bärare med DHA-PL var signifikant bättre i att avge DHA till Artemia (26,2-28.0 mg/g torr vikt, P<0,05) än dieten med DHA-PL en- bart eller dieten med 75% blandning (13-16,1 mg/g torr vikt).

I tabell 10 är mängden lipid som procent av kroppsvikt under- sökt som funktion av matningsmaterialet.

TABELL 10 Lipid (% torr vikt) Räkning Medelvärde Std.-avv. Std.-fel Biomjöl 9 27,60 1,34 0,45 Chlorella 9 26,10 2,97 0,99 Krossade celler 3 19,05 3,35 1,93 Ingen bärare 3 27,11 1,60 0,92 Tetraselmiss 8 23,92 2,12 0,75 Hela celler 3 17,04 2,63 1,52 * Ett fall utelämnades pà grund av avsaknad av värden.

TABELL 11 DHA som % av totalt FA Räkning Medelvärde Std.-avv. Std.-fel Biomjöl 9 19,83 1,31 0,44 Chlorella 9 16,97 4,40 1,47 Krossade celler 3 13,74 4,56 2,63 Ingen bärare 3 20,58 1,32 0,76 Tetraselmiss 8 16,26 2,86 1,01 Hela celler 3 9,56 0,78 0,45 * Ett fall utelämnades beroende pà avsaknad av värden. \ Överlevnaden för rotiferer var mycket känslig för anriknings- dietens nivà. Vid anrikningsnivàn 0,1 g/l överlevde endast 49,7% rotiferer efter 8 h anrikning oberoende av bärartyp och procenttal (P>0,05). Reducerad anrikningsnivà till 0,05 g/l var associerad med en signifikant bättre överlevnadsgrad 522 972 _24_ (80,9%, P<0,05). fererna matades med alger i form av hela celler eller krossa- de celler (81,7-89,9%). Överlevnadsgraderna var höga också när roti- Reducerad anrikningsnivà (fràn 0,1 g/l till 0,05 g/l) var inte associerad med en signifikant reduktion i lipidhalt (om- kring 20% torr vikt, P>0,05). Alla bärartyper (biomjöl, Chlo- rella sp och Tetraselmiss) vid 25-75% blandningsproportioner med DHA-PL var lika effektiva i att öka lipidhalten i 8 h anrikade rotiferer (2l,l-22,5% torr vikt). Hela intakta cell- alger var den minst effektiva dieten i att öka lipidhalten (10,7 i 1,3% torr vikt) i rotiferer men matning av rotiferer med algdiet med krossade celler var associerad med en väsent- ligt förbättrad lipidabsorption (16,3 i O,9% torr vikt, P<0,05).

Fastän rotiferanrikning vid dietnivàer av 0,05-0,1 g/l ledde till liknande absorption av dietlipider var DHA-ackumulering- en mer än den dubbla vid den högre anrikningsnivàn (28,0 i 1,4 mg/g torr vikt vid 0,lg/l jämfört med 12,0 i 1,1 mg/g torr vikt vid 0,05 g/l). Alla typer av bärare vid vilken blandningsnivà som helst (0-75%) inkluderande dieten med en- bart DHA-PL var lika effektiva (P>0,05) i att avge diet-DHA till rotifererna. Alger med hela celler var den minst effek- tiva dieten i att avge DHA till rotifererna (endast 6,0 i 1,4 mg/g torr vikt). Emellertid var alger med krossade celler mycket effektiva för DHA-avgivning till rotifererna (23,6 i 2,1 mg/g torr vikt). Denna DHA-nivå i de anrikade rotifererna liknade de nivåer som erhölls genom andra effektiva DHA-PL baserade dieter (P>0,05). Den observerade låga korrelationen mellan lipid- och DHA-halter i rotifererna jämfört med den höga korrelationen i Artemia kan antyda att rotiferer är* mycket effektiva i att absorbera diet-DHA och även kataboli- sera den med mycket högre hastigheter än Artemia. 522 972 _25_ TABELL 12 Överlevnad av rotiferer (8 h) Räkning Medelvärde Std.-avv. Std.-fel Biomjöl 15 52,933 23,574 6,087 Chlorella 15 58,067 34,385 8,878 Krossade celler 6 81,667 5,989 2,445 Ingen bärare 6 64,333 3,697 1,509 Tetraselmis 9 55,444 14,621 4,874 Hela celler 6 89,917 6,636 2,709 TABELL 13 DHA (% av total FA) i 8 h och anrikade rotiferer Räkning Medelvärde Std.-avv. Std.-fel Biomjöl 15 25,59 10,67 2,75 Chlorella 15 18,55 10,25 2,65 Krossade celler 6 36,19 0,99 0,40 Ingen bärare 9 24,60 5,19 2,12 Tetraselmis 9 24,77 2,14 0,71 Hela celler 6 22,26 6,47 2,64 Fastän vissa för närvarande föredragna utföringsformer av föreliggande uppfinning har beskrivits specifikt häri kommer det att vara uppenbart för fackmannen på det område till vil- ket uppfinningen hör att variationer och modifieringar av de olika utföringsformer som visats och beskrivits häri kan gö- ras utan att avvika frán uppfinningens anda och omfattning.

Följaktligen är det avsett att uppfinningen skall begränsas endast i den utsträckning som krävs av bifogade patentkrav och tillämpliga lagregler.

Claims (4)

1. W U 20 25 30 35 522 972 26 PATENTKRAV 1 Sätt att öka förhållandet mellan dokosahexaensyra och eikosapentaensyra i det levande rovet av larvfisk omfattande administrering av ett kraftigt omättat fettsyratvàlpulver till det levande rovet där det kraftigt omättade fettsyra- tvàlpulvret har ett förhållande mellan dokosahexaensyra och eikosapentaensyra större än 1,0:1,0.

2. Sätt enligt krav 1, där det kraftigt omättade fettsyra- tvàlpulvret omfattar följande fettsyror: fràn omkring 8% till omkring 16% Cl4:0, från omkring 0,75% till omkring 2,50% C16:lw7, fràn omkring 9% till 13% C16:0, från omkring 7,5 till 10,5% C18:2m6, från omkring 30 till 55% C18:1m9, fràn omkring 0,01% till omkring 2,5% Cl8:1w7, fràn omkring 2% till omkring 4,5% C20:4 och från omkring 8,5 till omkring 28% C22:6w3.

3. Sätt enligt något av kraven 1 och 2, där motjonen till fettsyran är vald bland natrium, kalium, kalcium och bland- ningar därav.

4. Sätt enligt något av kraven 1, 2 och 3, där antibioti- ka, eller blandningar därav inkorporeras i det torra tvàlpulvret. vitaminer, essentiella aminosyror, karotenoider, pigment 5 Sätt enligt något av kraven 1 till 4, där det levande rovet är valt bland Artemia-naupliuslarver, copepoder och ro- tiferer. 6 Sätt enligt krav 5, där det levande rovet är Artemia- naupliuslarver. 7 Sätt enligt krav 6, där Artemia-naupliuslarverna är ät- minstone i det andra larvstadiet. 8 Sätt enligt krav 7, det tredje larvstadiet. där Artemia-naupliuslarverna är i W U 20 25 30 35 522 972 27 9 Sätt enligt krav 5, där det levande rovet är rotiferer. 10 Sätt enligt krav 9, där rotiferen får absorbera eller intaga tvålpulvret till dess att förhållandet mellan dokosa- hexaensyra och eikosapentaensyra är större än omkring 1,0:1,0 och rotiferen skördas innan väsentlig metabolism av dokosa- hexaensyran sker. 11 Sätt enligt krav 10, där förhållandet mellan dokosahex- aensyra och eikosapentaensyra är större än 2,0:l,0. 12 Sätt enligt något av kraven 1-11, där det levande rovet efter anrikning matas till larvfisk. 13 Sätt enligt något av kraven 1-4, där partikelstorleken för tvålpulvret är mindre än omkring 10 pm. 14 Sätt pulvret är enligt krav 13, där partikelstorleken för tvål- mindre än omkring 7,5 pm. 15 Sätt pulvret är enligt krav 14, där partikelstorleken för tvål- fràn omkring 1 pm till omkring 5 pm. 16 Sätt netecknat av att fisk i en fiskodling eller fiskfarm matas att mata fisk i en fiskodling eller fiskfarm, kän- genom stegen att: a larvfisk anordnas i nämnda fiskodling eller fisk- farm och b larvfisken matas med fiskfoder anrikat med en kraftigt omättad fettsyratvål, där den kraftigt omät- tade fettsyratvålen har ett förhållande mellan doko- sahexaensyra och eikosapentaensyra större än 1,0:1,0. 17 Sätt enligt krav 16, vilket dessutom innefattar steget att öka mängden av kraftigt omättade fettsyror i fisken genom 10 15 522 972 28 att tillsätta ett tvàlpulver omfattande kraftigt omättade fettsyror till fiskfodret. 18 Sätt enligt krav 17, där det kraftigt omättade fettsy- ratvàlpulvret omfattar följande fettsyror: till omkring 16% Cl4:0, fràn omkring 8% fràn omkring 0,75% till omkring 2,50% C16:1m7, fràn omkring 9% till 13% C16:0, fràn omkring 7,5 till 10,5% Cl8:2m6, fràn omkring 30 till 55% C18:1m9, fràn omkring 0,01% till omkring 2,5% C18:1m7, från omkring 2% till omkring 4,5% C20:4 och fràn omkring 8,5 till omkring 28% C22 : 6603 . 19 Sätt enligt något av kraven 17 eller 18, där antibioti- ka, vitaminer, essentiella aminosyror, karotenoider, pigment eller blandningar därav inkorporeras i det torra tvàlpulvret.