SE468501B - Anvaendning av derivat av peroxidifosforsyra foer inhibering av tumoerutveckling - Google Patents

Description

468 501 understödja NK-cellernas funktion eller där tumörbildning inte uppträder i tillräckligt hög grad för att överta NK- -cellernas funktion och inhibera tumörutveckling. Förening- ar som frigör aktivt syreinnehàllande grupper gör i allmän- het detta mycket snabbt, under det att effektiviteten gent- emot tumörutveckling i varmblodiga däggdjur såsom människa tycks kräva åtminsone en långsammare och mer kvardröjande frigöringshastighet. Fram till dagen för föreliggande upp- finning har detta icke kunnat åstadkommas. När syrefrigö- ringen sker alltför snabbt kan såväl tumör- som normala celler attackeras.

I US patent nr 4 041 149, från 9 augusti 1977 beskrevs en komposition i olika former innefattande en dental tablett, som inhiberade bildningen av munodör i vilken denaktiva ingrediensen var ett peroxidfosfat. Peroxidfosfatföreningar skiljer sig från de flesta andra syretillhandahållande fö- reningar i det att den icke ger ett initial frisläppande av väteperoxid. I stället frisiäpper den väteperoxid långsamt så att när ekvivalenta koncentrationer jämföres med väte- peroxid, mängden syre som frigöres av peroxidifosfatet är en tiondel av mängden tillgängligt syre som frigöres av väteperoxid. Vidare frigöres endast ca 50% av det aktiva syreinnehållet under 20 timmar vid 25°C i närvaro av alka- liskt fosfatas eller surt fosfatas, vilka båda finns när- varande i kropparna i varmblodiga djur, såsom möss, råttor, människor, etc.

En fördel med föreliggande uppfinning är att tumörutveck- ling inhiberas på tumörceller in vitro och verklig malign tumörutveckling in vivo i varmblodiga djur, såsom gnagare och ända upp till människa.

En ytterligare fördel med föreliggande uppfinning är att tumörbildning kan inhiberas genom införandet av ett mate- 468 501 rial med långsamt syrefrigörande i en levande värd.

Enligt vissa aspekter hos föreliggande uppfinning avser uppfinningen en komposition omfattande en dosmängd av ca 0,1 - 10% av en nontoxisk vattenlöslig farmaceutiskt för- dragbar förening härledd från peroxidifosforsyra upplöst eller dispergerad i en farmaceutisk bärare.

Inhibering av bildning av tumör med maligna tumörceller sker genom administrering av en komposition omfattande en nontoxisk dosmängd av ca 0,1 - 6 g/kg kroppsvikt av ett varmblodigt djur av en nontoxisk vattenlöslig farma- ceutiskt fördragbar förening härledd ur peroxidifosfor- syra upplöst eller dispergerad i en farmaceutisk bärare till en varmblodig djurvärd genom oralt intagande av en kur, som ger ca 0,1 - 6 g/kg kroppsvikt av nämnda varm- blodiga djur per dag.

Ett sätt att inhibera tumörbildning är att systemiskt ad- ministrera en komposition omfattande en nontoxisk dosmängd av ca 0,1 - 2 g/kg kroppsvikt av ett varmblodigt djur som har maligna tumörceller, av en nontoxisk vattenlöslig far- maceutiskt fördragbar förening härledd ur peroxidifosfor- syra upplöst eller dispergerad i en farmaceutisk bärare, till en varmblodig djurvärdi en dos somger ca 0,1 - 2 g/kg kroppsvikt av nämnda varmblodiga djur.

Peroxidifosfatföreningen (PDP) föreligger i form av en nontoxisk farmaceutiskt fördragbar förening, vilket går utöver saltet som anges i tidigare nämnda US nr 4 041 149.

Föreningarna innefattar alkalimetallsalter (t ex litium, natrium och kalium), alkaliska jordartsmetallsalter (t ex magnesium, kalcium och strontium), zink- och tennsalter liksom organiska peroxidifosfat-Cl_12 alkyl-, adenylyl-, -guanylyl-, -cytosylyl- och -thymylylestrar liksom kvater- CT*- CC! (fl CT! ...s nära ammonium- och liknande salter. Alkalimetall, särskilt kaliumsalt, fördrages framför övriga oorganiska katjoner.

Tetrakaliumperoxidifosfatet är ett stabilt, luktlöst, fin- fördelat, friflytande, vitt icke hygroskopiskt kristallint fast material med en molekylvikt av 346,5 och ett innehåll av aktivt syre av 4,6%. Tetrakaliumperoxidifosfat är vat- tenlösligt :in 47 - 51% vid o - 61°c, men olagligt i van- liga lösningsmedel såsom acetonitrid, alkoholer, etrar, kretoner, dimetylformamid, dimetylsulfoxid och liknande.

En 2% vattenlösning har ett pH av ca 9,6 och en mättad lösning därav ett pH av ca 10,9. En 10% lösning i vatten vid 25°C uppvisade ingen förlust av aktivt syre under 4 månader; och vid 50°C visade en 10% lösning en förlust av aktivt syre av 3% under 6 månader.

De organiska salterna kan vara särskilt lämpade för admi- nistrering gentemot maligna tumörer. Av de organiska est- rarna föredrages de som ger hydrofoba egenskaper, såsom Cl_l2-alkylradikal och de san underlättar snabb upptagning av peroxidifosfatenheten av cellerna, såsom adenylyl-, gua- nylyl-, cytocylyl- och thymylylestrar.

Farmaceutiska bärare lämpade för oralt intagande är belagda tabletter sammansatta av material somnwtstårnedbrytning av magsyror vid det pH som föreligger i magsäcken (ca 1 - 3), eftersom peroxidifosfatet skulle inaktiveras av sådana mag- syror. Istället upplöses bärarna med i tablettform överför- da granuler av det fasta peroxidifosforsyrasaltmaterialet däri genom intestinala vätskor som har ett högre pH (ca ,5 - 10) och som inte inaktiverar peroxidifosfatet utan kvarlämnar detta för enzymatisk påverkan av fosfatas som är närvarande i människan och andra varmblodiga djur. En önskvärd tablettbeläggningslösning är sammansatt av en fettsyraester såsom N-butylstearat (typiskt ca 40 - 50, företrädesvis ca 45 viktdelar), vax såsom karnubavax (ty- GI 468 501 piskt ca 15 - 25 och företrädesvis ca 20 viktdelar), fett- syra såsom stearinsyra (typiskt ca 20 - 30, förträdesvis viktdelar) och cellulosaester såsom cellulosaacetatfta- lat (typiskt ca 5 - 15 och företrädesvis ca 10 viktdelar) och organiskt lösningsmedel (typiskt ca 400 - 900 delar).

Andra önskvärda beläggningsmaterial innefattar shellac och sampolymerer av maleinsyraanhydrid och etyleniska förening- ar såsom polyvinylmetyleter. Dylika beläggningar skiljer sig från tabletter som bryts ner i munhålan i vilken tab- lettmaterialet typiskt innehåller ca 80 - 90 viktdelar ma- nitol och ca 30 - 40 viktdelar magnesiumstearat.

Tabletterade granuler av peroxidifosfatsaltet framställes genom blandning av ca 30 - 50 viktdelar av peroxidifosfat- saltet med ca 45 - 65 viktdelar av ett fast polyhydroxi- socker såsom manitol och vätning med ca 20 - 35 viktdelar av en lösning av en polyhydroxisockerförening såsom sor- bitol, siktning till storlek, blandning med ca 20 - 35 viktdelar av ett bindemedel såsom magnesiumstearat och kompaktering av granulerna till tabletter med en tablett- pressmaskin. De tabletterade granulerna belägges genom sprayning av ett skum av en lösning av beläggningsmate- rialet därpå och torkning för avlägsnande av lösningsme- del. Sådana tabletter skiljer sig från dentaltabletter, som är typiska pressade granuler utan någon speciell skyd- dande beläggning.

En effektiv band med en föreskriven kur, när administreringen sker genom oralt intagande, är ca 0,1 - 6 g/kg kroppsvikt dag- ligen; när administrationen är systemisk såsom genom intra- administreringsdos av peroxidifosfat i sam- muskulär, intraperitonial eller intravenös injicering, är doseringen ca 0,1 - 2 g/kg kroppsvikt dagligen. 468 501 Fysiologiskt fördragbara pyrogenfria lösningsmedel är lämp- liga bärare för användning för systemisk administrering.

Salinlösning buffrad med fosfat till ett fysiologiskt pH av ca 7 - 7,4 är den föredragna bäraren för systemisk ad- ministrering. Dylika lösningsmedel skiljer sig från vatten- -humektantvehiklar som typiskt användes i tandborstmedel.

En sådan lösning framställes genom sterilisering av avjo- niserat destillerat vatten, kontroll för att säkerställa non-pyrogenisitet med användning av testet med limulus- -amebocyt-lysat (LAL) beskrivet av Tsuji et al i "Pharma- ceutical Manufacturing", oktober 1984, sid. 35 - 41, med efterföljande tillsats av fosfatbuffert (pH t ex ca 8,5 - - 10) framställd av pyrogenfritt sterilt vatten och ca 1-100Im;peroxidifosfatderivatförening och natriumklorid till en koncentration av ca 0,5 - 1,5 viktprocent. Lös- ningen kan packeteras i flaskor för användning sedan de resteriliserats genom passage genom ett mikroporfilter.

Alternativt kan andra lösningar såsom Ringers lösning in hållande 0,86 'viktprocent natriumklorid 0i,03viktprocent kalium- klorid och 0,033 viktprocent kalciumklorid.

Peroxidifosfatföreningen (PDP) frigör väteperoxid långsamt i närvaro av fosfatasenzymer enligt följande ekvation: O 0 O ll ll ll 3 fosfater H20 H2O2+P04 ' X4-O-P-O-O-P-O -_-*--Q -O-O-P-O- ----9 | I r O O O- Där X är en nontoxisk farmaceutiskt fördragbar katjon eller avslutar en organisk estergrupp. Fosfatas som bryter ner peroxidifosfatet är närvarande i saliv liksom i plasma, intestinala vätskor och vita blodkroppar. Den långsamma syrefrigöringen är särskilt effektiv vid förstärkning av I: 468 501 NK-cellers effektivitet gentemot maligna tumörceller, vil- ka svarar på peroxidifosfatterapin. När varmblodiga djur behandlas med PDP enligt föreliggande uppfinning är det önskvärt att tillhandahålla en kur, varigenom behandling- en fortsätter åtminstone tills dess tumörerna tillbakabil- dats.

Följande jämförande exempel illustrerar uppfinningen. Alla mängder avser vikt såvida icke annat anges.

EXEMPEL Exempel 1: In vitro studium av PDP-tumörcytotoxisitet.

I denna studie undersökes effekterna av PDP vid olika kon- centrationer på tillväxten av murin myeloma (SP2-linje)- -celler (tabell 1). Humana gingivala fibroblaster användes som kontroll för normala celler (tabell 2). Cellerna odlas i Dulbeccos modifierade Eagles-medium kompletterat med 10% fettalt bovinserum, lX MEM-vitaminer, lXL-glutamin, lX NEAA3, 1X gentamucin. De inkuberas vid 37°C i en humidi- fierad C02-atmosfär. Approximativt 1 - 3 x 105 celler pla- ceras i varje våg av en 24 vågors mikrotiterplatta inne- hållande 2 ml av mediet. PDP (kaliumsalt) i varierande koncentrationer tillsättes.

Efter inkubering bestämmes cellernas livskraft genom av- lägsnande av prov från vågorna över den i tabell 1 angivna tiden. Livskraften bestämmes genom "trypan blue exclusion test". Nytt medium tillsättes varje våg, varje dag för att bibehålla de nödvändiga tillväxtbetingelserna. Inhiber- ingen beräknades genom jämförelse av procent celler som lever i fosfatbuffrad salin (PBS) jämfört med PDP. Data sammanfattas i tabell 1. 468 501 TABELL 1 Effekter av PDP pà murin myeloma (SP2-lüfie)-celler.

Behandling Kontroll (PBS) PDP pH 7,0 100 mcg/ml 500 mcg/ml 1000 mcg/ml 2500 mcg/ml E nhnhnßuh Antal celler x 10 (efter 72 timmar)- 8,98 1,86 1,33 1,07 0,48 l+ I+ I+ l+ l+ 0,14 0,14 0,03 0,17 0,15 % livsdugliga celler 100% 47 33 29 12 Dessa resultat visar att jämfört med buffertkontrollen kaliumsalt av PDP är högcytotoxiskt och inhiberande gent- emot murin myeloma, celler (cancer).

Tabell 2 beskriver effekterna på normala celler (human gingival fibroblast).

TABELL 2 Effekter av PDP på human gingival fibroblast.

Behanälin N Antal celler x 105 % liVSdu¶li¶ä _________JE _ (efter 72 tlmmar) Eååiåå Kontroll (Pas) 4 2,67 i 0,17 1oo PDP pH 7,0 100 mcg/ml 4 2.61 f 0,16 98 son mcg/ml 4 2.58 f 0,13 97 1ooo mcg/ml 4 2,12 3 0.15 79 2500 mcg/ml 4 1,97 i 0,11 74 V! 468 501 Data i tabell 2 antyder ingen signifikant effekt på cell- tillväxt vid 10Û'500IM@hM.PDPmen även på normala celler reduceras lívskraften vid 100 och 2500 mcg/ml. Det är an- märkningsvärt att effekten på myeloma tumörceller (tabell 1) även vid höga koncentrationer är mer uttalad än effek- ten med normala celler (tabell 2).

Liknande resultat erhålles med litium-, natrium-, magne- sium-, kalcium-, strontium-, zink- och tennsalter av PDP, organisk peroxidifosfat liksom C1_12-alkyl, adenylyl, gua- nylyl, cytosylyl, flnmyhflesüßr och tetrametylammoniumsalt av PDP.

Exempel 2: Effekter av PDP. kaliumnvrofosfat (KPP) och PBS (fosfatbuffrad salin) på tumörutveckling in vivg- Sjuttiofem genetiskt identiska Balb/C möss med en genom- snittlig vikt av 20 g 1 3 g i grupper om 25 djur vardera: (a) kontrollbehandlade med fosfatbuffrad salin (PBS); (b) behandlad med kaliumperoxidifosfat (PDP) och PBS, pH 7,0; och (c) kaliumpyrofosfat (KPP) och PBS som en fosfatkont- roll. Varje djur mottar 0,2 ml pristan intraperitonealt (I.P.) för att bereda djuren för implantering av maligna SP2-celler (murin myeloma carcinoma tumörceller). Efter tre veckor sättes djuren på en behandling innefattande oralt intagande av en kur enligt följande: Grupp (a) mot- tar via I.P. 0,2 ml PBS; grupp (b) mottar 2,0 mg PDP sus- penderat i 0,2 ml PBS, och grupp (c) mottar 2,0 mg KPP i 0,2 ml PBS under tre på varandra följande dagar. Fyrtioátta timmar efter den tredje injektionen inokuleras (I.P.) varje djur med 2 till 3 x 106 celler SP2 (mösstumörceller, murin myeloma). Därefter ges djuren sina respektive material en gäng dagligen under 5 dagar per vecka, d v s (a) PBS, (b) PDP eller (c) KPP. Djuren protokollföres med avseende pá tumörutveckling och död varje vecka. Data analyseras med 468 501 hjälp av Mantel-Haenszelproceduren (Statistical Aspects of the Analyses of Data from Retrospective Studies of Disease, J. National Cancer Institute, vol. 3, 719 - 748, 1959).

Data i tabellerna 3, 4 och 5 indikerar att PDP är signi- fikant effektivt vid kontroll av tumörutveckling i möss jämfört med PBS eller KPP och bevisar därigenom att effek- terna på inhibering av tumörutveckling beror pá tillhanda- hállandet av aktiva syregrupper och icke fosfat.

TABELL 3 PBS* VS. KPP** Tio veckors studium av tumörutveckling VBCKA BEHANDLING TUMÖR ocH Bön INGEN TUMÖR I RIsKzoNBN 1-4 PBs 11 14 25 KPP 10 15 25 PBs 4 10 14 KPP 4 11 15 6 PBs 5 5 10 KPP 2 9 11 7 PBS 2 3 5 KPP 4 5 9 8 PBs 0 3 3 KPP 1 4 5 9 PBS 2 1 3 KPP 3 1 4 PBS 1 0 1 KPP 0 1 1 Mantel-Haenszel chi-square = 0,36 med 1, d.f., P = 0,55 Oddsförhållande = 1,34 Dessa resultat är icke signifikanta och bevisar ingen signi- fikant skillnad mellan PBS och KPP i reduktion av tumörut- 468 501 ll veckling i djuren.

*PBS = fosfatbuffrad salin **KPP = kaliumpyrøfosfat.

TABELL 4 Tio veckors tumörstudie PBS* VS. PDP** VECKA BEHANDLING TUMÖR OCH DÖD INGEN TUMÖR I RISKZONEN 1-4 Bßs 11 14 25 PDP 2 23 25 Pßs 4 10 14 PDP 4. 19 23 6 Pas s S 10 PDP 5 14 19 7 Pßs 2 2 5 PDP 2 13 14 s Pas o _3 3 PDP 2 10 12 9 Pas 2 1 3 PDP 3 7 10 Pßs 1 0 PDP 1 6 Mantel-Haenszel chi-square = 10,40 med 1, d.f., P = 0,001.

Oddsförhâllande = 3,66 Dessa data indikerar att PBS-kontrollgruppen utvecklar tu- mörer märkbart snabbare än PDP-behandlade djur (P = 0,001).

*PBS = fosfatbuffrad salin **PDP = kaliumperoxidifosfat 468 5531 12 TABELL 5 Tio veckors tumörstudie KPP* VS. PDP*** VECKA BEHANDLING TUMÖR OCH DÖD INGEN TUMÖR I RISKZONEN 1-4 KPP 10 15 25 PDP 2 23 25 KPP 4 ll 15 PDP 4 19 23 KPP 2 9 11 PDP 5 14 19 7 KPP 4 5 9 PDP 2 14 14 3 KPP l 4 5 PDP 2 10 12 9 KPP 3 1 4 PDP 3 7 10 KPP 0 1 PDP 1 5 Mantel-Haenszel chi-square = 5,86 med 1, d.f., P = 0,02. oaasförhällande = 2,60.

Data indikerar att KPP-gruppen utvecklar tumörer avsevärt snabbare än PDP-behandlade djur (P = 0,001).

*KPP = kaliumpyrofosfat ***PDP = kaliumperoxidifosfat Liknande resultat kan iaktagas när vardera av PBS, KPP och PDP administreras intramuskulärt och intravenöst i samma koncentrationer i PBS eller oralt ge en koncentration av 1 mg/ml (0,l%) i en stabil bärare av 45 delar N-butylstea- rat, 20 delar karnaubavax, 25 delar stearinsyra och 10 delar cellulosaacetatftalat. 468 501 13 Liknande resultat erhålles med andra oorganiska salter av PDP, särskilt litium-, natrium-, magnesium-, kalcium-, strontium-, zink- och tennsalter. Organiska föreningar av PDP, särskilt C1_12-alkyl, adenylyl, guanylyl, cytocylyl, thymylylestrar och tetrametylammoniumsalter är också effek- tiva i motverkande av tillväxt av murin myeloma maligna tu- mörceller.

EXEMPEL 3 500 delar kaliumperoxidifosfat och 641 delar mannitol blan- das och vätes med 32,5 delar av en 10% lösning av sorbitol till bildning av ett vått granulat, vilket torkas vid 49°C och siktas genom en 12 mesh U S sieve (1,68 mm siktöppning- ar). 35 delar magnesiumstearat tillsättes sedan som binde- medel och tabletterade granuler bildas genom pressning av kompositionen på en tablettpressmaskin.

Tabletterna belägges med en enterisk beläggningslösning med följande sammansättning: Cellulosaacetatftalat 120 delar Carnaubavax 30 delar Stearinsyra 10 delar 95% etanol 450 delar Aceton Q.S. till 1000 delar Beläggningen genomföres genom en hällningsprocedur i ett konventionellt beläggningskärl.

När de sålunda framställda tabletterna inmundigas passe- rar de genom magen utan nedbrytning och beläggningen upp- löses sedan av intestinala vätskor. $> O\ CD CD ...x 14 EXEMPEL 4 Avjoniserat destillerat vatten stabiliseras vid atmosfärs- tryck under 20 minuter i en autoklav. Efter kylning tes- tas de för icke pyrogenisitet med användning av Limulus- -Amebocyt-Lysat (LAL) såsom beskrives av Tsuji et al i "Pharmaceutical Manufacturing", oktober 1984, sid. 35 - 41. 50 delar kaliumperoxidifosfat, natriumklorid i en mängd motsvarande 0,9% av lösningen och 0,1 M fosfatbuffert in- nehállande KHZPOQ och Na2HPO4, pH 9,4 tillsättes till det pyrogenfria sterilà vattnet. Lösningen steriliseras sedan genom passage genom ett 0,5 mikroporfilter och packeteras sedan i sterila förpackningar. Även om uppfinningen beskrivits i anslutning till specifika exempel är det uppenbart för fackmannen att olika modifier- ingar kan göras vilka faller inom ramen för uppfinningen.

Claims (3)

468 501 /5 P a t e n t k r a v

1. Användning av en farmaceutiskt fördragbar derivatför- ening av peroxidifosforsyra för framställning av ett medel mot cancer.

2. Användning enligt krav 1 varvid derivatföreningen av peroxidifosforsyra är ett salt valt från gruppen bestående av alkalimetall, alkalisk jordartsmetall, zink och tenn.

3. Användning enligt krav 1 varvid derivatföreningen av peroxidifosforsyra är valt från gruppen bestående av Cl_l2_ alkyl, adenylyl, guanylyl, cytosylyl, thymylylester och kvaternärt ammoniumsalt.