SE453637B

SE453637B - Anvendning av derivat av aminobensoesyra for framstellning av en farmaceutisk komposition med forhindrande eller aterstellande effekt pa stenokardi, arrytmi, cerebral infarkt, myokardial infarkt, cerebral apoplexi eller

Info

Publication number: SE453637B
Application number: SE8005575A
Authority: SE
Inventors: C Yoshikumi; F Hirose; Y Ohmura; T Fujii; M Ikuzawa; K Matsunaga; M Ohhara; T Ando
Original assignee: Kureha Chemical Ind Co Ltd
Priority date: 1980-07-03
Filing date: 1980-08-06
Publication date: 1988-02-22
Also published as: CA1158163A; CH644018A5; JPS5716898A; ZA804723B; AU6100880A; PH15186A; FR2485926B1; IT8024185A0; IT1132413B; FR2485926A1; DE3051068C2; GB2056856B; GB2056856A; SE8005575L; JPH0222047B2; BE887260A; DE3030892A1; AU538455B2

Description

453 -637 aspirin skulle kunna betecknas såsom ett reglerande medel för produk- tionen av alla PGs, men det har ingen förmåga att öka produktionen av ett visst PG eller vissa PGs, och följaktligen begränsas naturligtvis aspirinets användbarhet såsom ett PGs-reglerande medel. Vidare har aspirin bieffekter genom att det orsakar mag- och tarmkatarrer hos människor och däggdjur, varför det uppstår problem vid längre tids administrering av aspirin.

Efter undersökningar för att finna en förening med förmåga att reglera PGs, i största möjliga grad utan bieffekter, har det nu visat sig att en serie derivat av aminobensoesyra med den ovanstående gene- rella formeln (1) effektivt reglerar PGs, vilket lett till förelig- gande uppfinning.

Derivatet av aminobensoesyra enligt ovan, vilket användes såsom aktiv ingrediens enligt föreliggande uppfinning, är en kemiskt och fysikaliskt känd förening. Inoue et al. har beskrivit den kemiska syntesen av föreningen (se J. Aqr. Chem. Soc. Japan, vol 25, sid 59-63 och 291-293 (1951) och Chemical Abstracts, vol 48, kolumnerna 2001d och 2001i (1954)) samt vissa fysikaliska egenskaper hos föreningen (se J. Agr. Chem. Soc. Japan, vol 26, sid 329-331 (1952) och Chemical Abstracts, vol 48, kolumn 2003a (19§4)).

I de ovannämnda litteraturrefèrenserna finns emellertid ej någon beskrivning av de fysiologiska eller farmaceutiska egenskaperna hos den nämnda föreningen. Vidare har hittills ej någon redogörelse på- träffats avseende de fysiologiska och/eller farmakologiska egenska- perna hos föreningen med den generella formeln (1)¿ Enligt uppfinningen erhålles sålunda en fannaceutisk komposition med förmåga att reglera prostaglandiner (PGS) i människor och däggdjur, vilken är baserad på upptäckten av den nya medicinska användbarheten av de kemiska föreningar som representeras av ovanstående generella formel (1).

Pâ de bifogade ritningarna visar fig 1 den ifrågavarande substansens inverkan på aggregerandet av blodplättarna orsakat av arachidonsyra, fig 2 visar den ifrågavarande substansens inverkan på aggregerandet av blodplättarna orsakat av adenosindifosfat (ADP), fig 3 visar den ifrågavarande substansens inverkan pà aggregerandet av blodplättarna orsakat av kollagen, 'n _ 453 637 fig 4 visar den ifrågavarande substansens inverkan på aggregerandet av blod- plättarna orsakat av epinefrin, fig 5 visar den ifrågavarande substansens inverkan på aggregerandet av blod- plättarna orsakat av ristocetin, fig 6 visar den ifrågavarande subsi-ansens inverkan pâ aggregerandet av blod- plättarna orsakat av trombin, fig 7 visar den ifrågavarande sxzbstansens inverkan på halten av cykliskt adeno- sirmonofosfat (cykliskt AMP) i blodplättarna, fig 8 visar den ifrågavarande substansens inverkan på produktionen av malondial- dehyd (MDA) i blodplättarna, fig 9 visar effekten av indonxetacin på den ifrågavarande substansens hypotensiva verkan, fig 10 visar den ifrågavarande substansens inverkan på halten av cykliskt AMP i kancerceller, fig ll visar den ifrågavarande substansens inverkan på produktionen av prosta- glandin Iz (PGIZ) i BTB-fibroblaster, fig l2 visar den ifrågavarande substansens inverkan på halten av prostaglandin Fz- a (pGFz- a ) ' fig l3 visar den ifrågavarande substansens inverkan på halten av prostaglandin E (PGE) f fig 14 visar den ifrågavarande substansens inverkan på halten av PGs i plasma hos råttor vilka administrerats den ifrågavarande substansen, fig lS visar den ifrågavarande substansens effekt då det gäller att förhindra ett aggregerande av blodplättarna orsakat av ADP, och fig 16 visar den ifrågavarande föreningens effekt då det gäller att sänka den halt av PGE i cerebrospinalvätska som tidigare ökats medelst pyrogena mztkrober.

Den aktiva ingrediensen i den farmaceutiska kompositionen enligt föreliggande uppfinning (i det följande benämnd den ifrågavarande substansen) är en förening med följande famei <1) = coonz mI-Rl i vilken Rl betecknar en del vald från gruppen bestående av de restgmpper som bil- das genom att OH i l(alfa)- eller Hbeta) -ställning avlägsnas från arabinos, xylos, rhamnos, glukos, galaktos, rnanrxos och fruktos, och Rz betecknar en väteatom, en al- kylgrupp med l-4 kolatomer eller en farmaceutiskt accepterbar metall.

Eftersom den ifrågavarande substansen, såsom kommer att framgå senare har ex- tremt låg akut oral toxicitet, ej är mutationsframkallarxde, ej påverkar den cellulära och hurnorala inrrruniteten hos människor eller däggdjur och ej stör den gastrointe- stinala bakteriefloran på grund av frånvaro av antibakteriell verkan, kan den under 453 637 lång tid administreras oralt utan möjlighet eller risk för att den framkallar mutation och allergi hos människor.

Substansen enligt föreliggande uppfinning är följaktligen en i hög grad säker farmaceutisk förening.

I den generella formeln (1) enligt ovan,motsvarande den ifråga- varande substansen,betecknar R1 i korthet en återstod av en mono- sackarid, och monosackariden kan antingen ha D-form eller L-form, antingen vara alfa-anomer eller beta-anomer eller en blandning av anomererna. Själva den ifrågavarande substansen kan följaktligen även vara antingen alfa-anomer eller beta-anomer, eller en blandning av anomererna.

I den ovanstående generella formeln (1) betecknar R2 en väte- atom, en farmaceutiskt accepterbar metall såsom Na, K, 1/2Ca, 1/2 Mg, 1/3Al eller en alkylgrupp såsom metyl, etyl, propyl och butyl.

Sättet att framställa den ifrågavarande substansen framgår av följande exempel: En blandning av 5 g p-aminobensoesyra, 5-6 g av en monosacka- rid såsom L-arabinos, D-xylos, L-rhamnos, D-glukos, D-galaktos, D-mannos eller D-fruktos, samt 0,1-0,5 g ammoniumklorid, magnesium- klorid, myrsyra, ättiksyra eller klorvätesyra värmdes i 40-90 ml 95-100%-ig etanol eller ren metanol under âterflödeskylare för att åstadkomma kondensation. Sedan reaktionen avslutats fick reaktanterna stå i rumstemperatur eller på en sval plats, och de separerade kris- tallerna uppsamlades genom filtrering av reaktionslösningen. Kristal- lerna tvättades med vatten, etanol eller etyleter varefter de om- kristalliserades ur metanol, etanol eller en vattenhaltig lösning av metanol eller etanol.

För att ersätta väteatomen i karboxylgruppen hos den så fram- ställda föreningen med en bas kan man med fördel tillämpa den kända metoden. Föreningen, p-aminobensoesyra-N-pyranosid, löses i en vat- tenhaltig etanollösning och ett oorganiskt salt sättes till lös- ningen för att åstadkomma substitutionen.

De fysikaliska egenskaperna hos några av de ifrågavarande sub- stanserna (den aktiva ingrediensen i den farmaceutiska kompositionen enligt föreliggande uppfinning), vilka framställts på ovan beskrivet sätt, framgår av tabell 1. De i tabell 1 angivna substanserna be- tecknas i fortsättningen föreningarna 1-11.

(I '453 637 ﬁå z :OO m Ö mmm mcwwnm> mxmwumuowu mv uwwcm wmucmnmm Eøcﬂ mcnoumwﬂmk :ac/w SN 5.2.. :mmmwmmwmmw Såå ﬂ å- wSAZ Ewgäëófzbmowâßocëænnråﬁﬁå 5 . . . . . .mﬁšwwäwäwv EN 3 "Å ïw ms âﬁmß H ä? Éwmﬁ .HwëﬂåälqfwípmowcwnâëæhLadnmz 2 ~..ï~.«ë.om _ _ . . . 9% .wmﬂwwmwwmmmw âﬁm> H T mowèwﬁ uﬂouäuwóèﬂbmømânåëæhëbﬁﬁå m A é. :Wﬂï . äääwuäïmmv MR wwßmﬂwuomwm 55% ﬂ o? ïfmﬁ 3mââﬁlqßvTpmowcßocëalmèsﬂﬁmz w im awéä. "mæs âﬁš, H Q wmïﬂä wâoäxà|z|pmowcmnoqaæà|šdﬁwz ß w¿ä.ïm.m« _ _ _ . mä Sﬁwmwmmwmmzmw 83% ﬂ 3+ 341.2 Ewopäﬂmgåﬂpmomänaëæhèﬁﬂﬁmz w EN Smwwmwmmwmwmw 53.9, ﬂ mm.. Qwfmñ uﬂmoäﬂmà|zbmowﬁwnëä«åﬂﬁmz m S. ï m . m” o . m3 Amﬁšwøuwwmmw. vä o4.nm.mä.mq äﬁw» ﬂ T 37mm: oﬂwšå|z|pmßänonäæä|åﬂﬁmz w EN .wmﬂmmmmwwmww SNE m+ 3702 wﬂmæëëèå|umowcßåëæë|åﬂﬁmz m mﬁïﬂmäámv Amaﬁšwwäuamw.

Sw. .må .än Éšxmnoäm âﬁms ﬂ E+ STNBH uﬁaeë¥qfz|pmom=ﬁgweæöušﬂbmz ~ :\.ïo.m6¿s .mﬁšﬂwwhwmawmv mä .mä .Dm a ïïw.mxh..wq ääﬂ, ﬂ m- S754 EwBåﬂmàlz|pmowcßocëælnråﬁbmz H Eonöﬁñﬂﬁs, z n m u u o~n__v_ .ä :ﬁﬁë coﬁumuownm SL mæﬂmcm :Oﬂmnou Ûov uuwﬁoïmﬁﬁa ußcwåﬂm vnäuwmw Hšcåﬂåmcà :wmaﬁwnsw wwcüaßmmwnﬁ än mm šæz mﬁänﬁä, mcnwmcwﬂøohmcﬂ .Qâuxm wø mo: uwmmšmcmmm mxwﬁﬂmxﬁmæh Ä Üwﬁmm. 45-3 637 (1) ningsapparat tillverkad av Yanagimoto Works, Japan.

Smältpunkt: bestämdes med hjälp av en mikro-smältpunktsbestäm- (2) Sgecifik rotation: bestämdes med användning av en direkt av- läsbar polarimeter Model OR-50, tillverkad av Yanagimoto Works, Japan, på prover med en längd av 50 mm och bestående av en vatten- haltig etanollösning av den sura aktiva föreningen och av en vatten- lösning av natriumsaltet av den sura aktiva föreningen. (3) en CHN-Coder Model MT-2 tillverkad av Yanagimoto Works, Japan.

Molekylsammansättninoz elementaránalys utfördes med hjälp av (4) Ultraviolett absorptionsspektrum: bestämdes med hjälp av en självregistrerande spektrofotometer Model PS-3T tillverkad av Hitachi Works, Japan, på en vattenhaltig etanollösning av den sura aktiva föreningen och på en vattenlösning av natriumsaltet av den sura aktiva beståndsdelen i medicinen.

De fysiologiska egenskaperna hos de ifrågavarande substanserna är följande och beskrives nedan såsom (1) akut toxicitet, (2) anti- mikrobeffekt, (3) mutagenicitet, (4) fördröjd intrakutanreaktion, (5) antikroppbildande effekt och (6) inverkan på magsäcken. (1) Akut oral toxicitet Den akuta orala toxiciteten hos de ifrågavarande föreningarna undersöktes under användning av grupper av ICR-JCL-möss vilka oralt tvångsmatades med var och en av de ifrågavarande substanserna i form av en vattenlösning i destillerat vatten eller i form av en suspen- sion likaså i destillerat vatten och med en i förväg bestämd dose- ring. Sedan toxikologiska symptom, om nâgra, noterats under 6 dagar och dödligheten registrerats fram till den 7:de dagen efter administre~ ringen beräknades LD5O(akut oralt) i enlighet med metoden enligt Litchfield-wilcoxon, och både döda och levande möss obducerades för erhållande av informationer.

Resultaten visas i tabell 2. Som framgår av tabell 2 är LD5O(akut oralt) för var och en av de ifrågavarande föreningarna mycket högt, vilket bevisar att de har extremt låg toxicitet. - 453 637 Tabell 2: Akut oral toxicitet hos de ifrågavarande substanserna Förening f Namn på den ifrågavarande substansen i LDSO p.o. nr ' ' g/kg 1. : Natrium-o-aminobensoat-N-D-galaktosid = 6.10 2. : Natrium-o~aminobensoat-N-L-rhamnosid 2 12.50 3. : Natrium-m-aminobensoat-N-D-mannosid : >l0 4. : Natrium-p-aminobensoat-N-D-mannosid : >l0 . : Natrium-p-aminobensoat-N-D~glukosid : >l5 6. : Natrium-p-aminobensoat-N-D-galaktosid : 14.55 7. : Natrium-p-aminobensoat-N-D-xyloside : 11.75 s. * Na:rium-p-aminobensoat-N-L-rhamnosia * 12 . ao 9. : Natrium-p-aminobensoat-N-D-fruktosid : >l0 . : Natrium-p-aminobensoat-N-L-arabinosid : 10.80 ll. : Methyl-o-aminobensoat-N-D-mannosid : > 7.5 För övrigt gjordes inga onormala fynd vid obduktionen av döda och levande djur. ' (2) Antimikrobeffekt Den ifrågavarande substansen löstes i destillerat vatten i en serie byggd på ett tvåfaldigt utspädningssystem. De utspädda lös? ningarna blandades med agarmedium i 9-faldig volym, och blandningen hälldes i en petriskâl. Hjärtinfusíon-agarmedium användes för bak- terier, och Sabourauds agarmedium användes för fungi. Efter bestryk- ning med förkulturen inkuberades de inokulerade plattorna vid 37°C under 20-24 timmar för bakterier, och vid 2500 under 3-7 dagar för fungi, och därefter undersöktes tillväxten. Följande mikro- organismer användes vid bestämningen av den ifrågavarande substansens antimikrobeffekt.

Pseudomonas aeruginosa IAM 1514 Escherichia coli IFO 12734 Staghylococcus aureus 209 P Bacillus subtilis IAM 1069 Saccharomyces cerevisiae IAM 4207 Candida albicans ATCC 752 Trichophyton mentagrophytes IFO 6124 Asgergillus giggš IAM 3001 453 6-37 Som resultat av ovanstående försök visade det sig att ingen av de testade aktiva ingredienserna visade någon inhibering av till- växten av de olika organismerna vid en koncentration av l mg/ml. (3) Mutagenicitet Som första steg testades de ifrågavarande substanserna genom rekombinationsförsök (i) och som andra steg testades de genom äter- föringsförsök (ii). (i) En stam av Bacillus subtilis M 45 med bristfällig rekombi- nerande reperationsprocess och en vild stam av Bacillus subtilis H 17 med rekombinerande reparationsprocess inokulerades för att bilda egna ej korsande band på en B-2 agar kulturplatta (framställd genom att lösa 10 g köttextrakt, 10 g polypepton, 5 g natriumklorid och g agar i 1000 ml destillerat vatten vid ett pH av 7,0). En rund bit filterpapper, 8 mm i diameter, som absorberade 0,04 ml av en vattenlösning av den ifrågavarande substansen i sterilt vatten, lades på ytan av agarplattan så att den täckte utgångspunkten för ovan- nämnda band av bakteriekulturer. Den inokulerade B-2 agarkulturen hölls vid 37oC under en natt och längden på det tillväxthämmade om- erådet mättes. Kærmycnm användes som den negativa kontrollen och Mitomycin C som den positiva kontrollen. Resultaten från rekombina- tionsförsäaax visas i tabell 3. (ii) Stammarna TA 98 och TA 100 (båda är histidin-krävande) av Salmonella typhimurium användes vid återföringsförsöket. 2 ml av ett mjukt agarkultumedium (vilket medium i sig be- stod av 6 g natriumklorid och 6 g agar i 1000 ml destillerat vatten), till vilket man satt 0,1 volymdel av en vattenlösning av 0,5 mM biotin och 0,5 mM histidin, blandades med 0,1 ml av bakteriesuspen- sionen och 0,1 ml av en vattenlösning av den ifrågavarande substansen, och blandningen skﬂdzﬂes på minsta möjliga agarkulturmedium. Efter 2 dagars inkubation vid 37OC räknades antalet âterförda kolonier.

Furylfuramid (AF-2) användes som den positiva kontrollen. Resultaten från återföringsförsöket visas i tabell 4.

Som framgår av tabell 3 visade de ifrågavarande substanserna en svag mutagenicitet endast vid den höga koncentrationen av 5000 pg/ platta. Som framgår av tabell 4 förelåg ingen skillnad mellan den mutationshastighet som orsakades av den ifrågavarande substansen och den för kontrollprovet, till vilket ingen substans sattes, ej ens vid en koncentration så hög som 5000/ug/platta. Dessa resultat visar att den ifrågavarande substansen är säker med avseende på mutagenicitet. 453 657 »H = www =m=0~ w@@eaw;»xm>HHH» mm =wøw=mH mønﬁa mv z uæw =@=ø~ w@«Eem;~xw>HHH» mm =@øm=wH n @m=HHHgmm nec< PH N NH 3.0 u cHuæeopHz H Q m oH cﬁuæšmcmx % M m ﬂx%.m uwmoccmñvnuzuuøom:wA0cHEm|0|Hæumz .HH X ﬂ x x¶%.m øﬂwocﬁnmnmvﬂIzlumomcwnosHEm|m|EsHuumz .OH x X x xmm.m . wﬁmouxßum|n|z|#momcwQocHEm|m|E:Huumz .m _ . x m K .xxm m wﬂmocämzuuﬂlzlumom:wnocHEm|m|E:Huumz .w x x X xmM.m wHm0Hæx|o|z|umowcwnocHEm|m|E:Huumz .ß x x m xxM.m UHmOuxmHmm|Q|znumomcwnocHEm|m|EsHuumz .Q ~ X X R ﬁﬂm m WHw0xsHm|a|z|umom:mnocHEm|m|EøHHumz .m X x x xm%.m ®HmocømëfnIz:umowcmQo:HEm|m|E:Huumz .v Q H H ooO.w o o o oom UHm0:cmE|nnzsumom:mnocHEm|E|E:Huumz .m ß M N ﬂﬂM.m UHwocëmcu|A|z|umomcmnocHEm|o|EøHHumz .N W W m mK%.m UHm0uxmHmm|Q|z1vmomcwQocHEw|0xEsHHumz .H EE EE EE »H m me 2 . #wmnHHHxm ©m:mH mwmë ^muumHD\mQv Hc mcwcom |Emnuxm>HHHH coH»muucm0:ox cwwcmuwnﬂm wwcmHm>mmwuwH :mv wa :Emz m:H:wHmm MÛWHÛWWCOﬂUNSHQEOMÜH >m UMUHÜWWNH "M HHÜQNH. ma mvﬂ 1 Amummﬂﬁﬁu cømcﬂv Hﬂouucom ßwﬂ ﬁﬁm H.o wﬁšmuøwﬂæusm w mm ooo_m UHmocømE|Q|Z|umom:mQo:ﬁEmloxﬁæuwz HH m Hm ooo.m ﬂﬂmocﬂßmhmlﬂxzlumowcmnøcﬂëm|m|E5ﬁuumz oﬁ m mm 95 _ m wﬂmoﬁwfﬂ-nlzbmowcwpocﬁewkwïåïumz m v mn ooo.m wﬂmO:EmnHlﬂ|Z|um0w:wn0GﬂEmlmIëﬂﬂuumz m v mm ooo.m øﬂmoﬁæxnouzuumomcwnocﬂëmnmlšsﬂuumz ß ß Hm ooo.m wamouxmﬂmm|Quznumomcmnocﬁëmrmušﬂﬂuumz w HH voﬁ ooo_m øﬁmoxøﬁmunnzzumomcwnocﬂëmlmxëﬂﬂuumz m N m æmﬁ ooo.m wwwo::mE|Qxznumowcwnocﬁëmlmnësﬂnumz v m om ooo.m wﬁmo::mEJn|Z|umomﬂwno:«Em|E|EdHuumz m m Hw .ooo.m øﬂwo:Em:u1Auz|»m0mswno:ﬂEmnonšsﬂnumz ~ o Hmﬁ ooo~m wﬂwowxmﬁmm1o|Z|»mow:mno:ﬁEmnouﬁsﬁnumz H mm <9 QOH dB mﬁmﬁmšhmpcø Üuﬁmša .ä uwﬂmoﬁox muumwuwuw Hmusm coﬁnmuvcoucøx cwmcmumnøm w@:mum>æmmuwH :mv mm :Emz mcﬂcvuﬂm 455 637 xßwnßwmmnﬂuwwnwum >m umuﬂﬂmmm nv Hﬁmßmü 453 637 ' 11 (4) Fördröjd intrakutanreaktion För att få kännedom om de ifrågavarande substansernas effekter på cellimmunitet utfördes reaktionsförsök på trampdynor med ICR-JCL- möss som försöksdjur och erytrocyter från får som antigen.

En mus primärsensibiliserades först genom injektion av 0,2 ml av en 10%-ig vattenhaltig suspension av fårerytrocyter i fysiologisk saltlösning i kaudalvenen och 7 dagar efter den första sensibilise- ringen injicerades 0,05 ml av en vattenhaltig 40%-ig suspension av fårerytrocyter i fysiologisk saltlösning i trampdynan såsom en andra sensibilisering. Trampdynans tjocklek mättes följande dag. Administre- ringen av den ifrågavarande substansen skedde i en dos av 250 mg/kg/ dag, en gång per dag under de följande 5 dagarna, räknat från den dag då den första sensibiliseringen utfördes.

Resultaten visade att det ej förelåg någon markant skillnad mellan ökningen av tjockleken på trampdynan hos den mus som ad- ministrerats den ifrågavarande substansen och ökningen hos den grupp av möss som ej administrerats den aktiva föreningen. (5) Antikroppbildande effekt För att fâ kännedom om de ifrågavarande substansernas effekter .pà humoralimmunitet utfördes hemagglutinationsförsök med ICR-JCL- möss som sensibiliserats med fårerytrocyter.

En mus sensibiliserades genom injektion av 0,2 ml av en vat- tenhaltig 10%-ig suspension av fårerytrocyter i fysiologisk salt- lösning i kaudalvenen, och efter 7 dagars sensibilisering användes musens blod vid ett hemagglutinationsförsök för bestämning av den antikroppbildande effekten. Den ifrågavarande substansen administre- rades under 5 på varandra följande dagar efter sensibiliseringsdagen, intraperitonealt med doseringen 250 mg/kg/dag.

Resultaten visade att det ej förelåg någon markant skillnad i agglutinationstiter mellan gruppen som administrerats den ifråga- varande substansen och kontrollgruppen. (6) Den ifrågavarande substansens inverkan på magsäcken g av den ifrågavarande substansen (var och en av föreningarna 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 och 11) och av aspirin administrerades var för sig till hundar av beagle-ras med kroppsvikten 9- 12 kg i form av en vattenhaltig suspension i destillerat vatten med pH-värdet justerat till 3, och 90 minuter efter administreringen undersöktes hundens magsäck med avseende på blödningar. Resultaten visar att blödningar i magsäcken endast observerades hos de hundar som ad- ministrerats aspirin, medan däremot inga magblödningar kunde iaktta- 4_53 637 12 gas hos de hundar till vilka man administrerat någon av förening- arna l - 11.

I det följande beskrives kortfattat de ifrågavarande substan- sernas farmaceutiska egenskaper, och en mer detaljerad beskrivning ges i exemplen. (1) Reglering av prostaglandin Den ifrågavarande substansen deltager i regleringen av PGs, såsom PGA, PGs, Pec, Pen, 9GB, PGP, PGs, PGH,PGI,TxA,'rxB, samt de metaboliska produkterna därav. Dessutom reglerar den ifrågavarande substansen ej endast något av ovannämnda PGs utan flera olika slag av PGs.

Den ifrågavarande substansens reglerande inverkan på produk- tionen av PGs och metaboliter därav framgår av följande fakta: (a) Hämmande inverkan pâ blodplättarnas aggregerande Det är känt att blodplättarnas aggregerande huvudsakligen in- duceras av PGG2, PGH och TXA2, och det har fastställts att den 2 ifrågavarande substansen har en hämmande inverkan på blodplättar- nas aggregerande (se exemplen 2 och 5). (b) Ökning av halten av cykliskt adenosinmonofosfat Det är känt att cykliskt adenosinmonofosfat (cyklískt AMP) är närbesläktat med PGs, i synnerhet PGD, PGE och PGI, och den ifråga- varande substansen visade en förmåga att höja nivån av cykliskt AMF i blodplättar och celler hos en kultur (se exemplen 3, 6 och 8). (c) Hämmande inverkan på produktionen av malondialdehyd Det har bekräftats att den ifrågavarande substansen har en inhiberande verkan på produktionen av malondialdehyd (MDA) i blod- plättarna, och MDA är känd såsom en metabolisk produkt av PGs (se exempel 4). (d) Acceleration av produktionen av PGI2 Det har bekräftats att den ifrågavarande substansen har acce- lererande inverkan på produktionen av PGI2 i celler odlade in vitro (se exempel 7). (e) Angående produktionen av några PGs Enligt experimentella resultat avseende metabolismen av PGs in vitro under användning av arachidonsyra som utgångsmaterial, har det visat sig att den ifrågavarande substansen påverkar produktionen av PGD PGE2, 6-keto-PGF och PGF (se exempel 1). 2' 1-u 2-a . 453 6.37 13 (f) Effekt på biosyntesen av PGE och PGF2_a Det har visat sig i ett in vitro kulturexperiment med celler att substansen enligt föreliggande uppfinning inverkar på biosyn- tesen av PGE och PGF a (se exemplen 9 och 10). 2- (o) Inhibering av proliferationen av tumörceller Undersökningen av proliferationen av tumörceller och nivån av intratumörcell-PGE hos tumörbärande experimentdjur vilka administre- rats med substansen enligt föreliggande uppfinning, bekräftade inhi- beringen av tumörcellernas proliferation samt även ökningen av PGE- nivån i tumörceller hos djur vilka administrerats med den ifråga- varande substansen (se exemplen 11, 12, 13 och 14). (h) Förstärkt effekt på transporten av pigment I ett experiment vid vilket den ifrågavarande substansen ad- ministrerades till tumörbärande experímentdjur och graden av över- föring av ett färgämne till tumörvävnaden hos djuret undersöktes, fastställdes en förstärkt effekt på överföringen av det exogena färgämnet, vilket tyder på blodkärlsvidgande verkan av den ifråga- varande substansen (se exempel 15). (i) Inhiberinq av tumörmetastas I ett experiment vid vilket den ifrågavarande substansen ad- ministrerades till experimentdjur före och efter transplantation av tumörceller i djuren konstaterades en inhiberande inverkan på meta- stasen av de transplanterade tumörcellerna (se exempel 16). (j) Sänkning av nivån av 6-keto-PGF1_a Man har observerat att hos tumörbärande djur är nivån av 6-keto- PGF1_a i deras plasma anmärkningsvärt hög jämfört med icke tumör- bärande djur, men det har bekräftats att den en gång förhöjda nivån nedbringas till normal nivå genom administrering av den ifrågava- rande substansen (se exempel 17).

Generellt har PGs påträffats i flera organ i hela kroppen, och de har ett mycket nära samband med organens funktioner. Vidare är det känt att de fysiologiska och farmakologiska funktionerna av Pés täcker ett ytterst brett område. Det vill säga, PGs påverkar huvud- sakligen utvidgningen och sammandragningen av blodkärl vadgällerieras farmakologiskaeffekt på cirkulationssystemet, och PGE och PGI :ar kraftigare utvidgande verkan,medan TXA däremot har sammandragande verkan på artärerna. Dessa funktioner orsakar ökningen eller minsk- gaccelerera andningen och motverka hosta och expektoration. .--__ .1.. 453 es? 1,, ningen av blodtrycket och påverkar den läkande funktionen vid steno- kardi och arytmi. Även då överdrivet fortskridande av blodplättarnas aggregerande leder till arterioskleros, cerebral infarkt, myokardial infarkt eller cerebral apoplexi har PGs markant inverkan på blodplättarna. D'vs PGD, PGE och PGI har en antagonistisk verkan på blodplättarnas aggregerande, och TXA2, PGG2, PGH2 och PGE2 framkallar eller accele- rerar aggregerandet. Följaktligen är det lätt att föreställa sig att en behandling och ett förebyggande av ovannämnda sjukdomar skulle : kunna möjliggöras genom lämplig justering av PGs.

Då det gäller diabetes har det vidare rapporterats att produk- tionen av PGI2 i det vaskulära systemet hos en patient som lider av diabetes är begränsad, eller halten av PGE och PGF2 är hög, och för- hållandet mellan denna sjukdom och PGs har sålunda alltmer kunnat förklaras. E Funktionerna av PGs i andningssystemet har även studerats och det är känt att PGE nedbringar luftvägarnas motståndskraft. Funktio- nen är att undertrycka effekten av PGE för att motverka astma, Som en funktion med avseende på immunitet har å andra sidan en dämpande effekt på frigörandet av den lângsamtreagerande substan- sen vid anafylaxi konstaterats hos PGI2 och dess metaboliter, och PGs har även antiallergisk verkan, antianafylaktisk verkan, och det är mycket troligt att PGs kan vara effektiva vid behandling av olika sjukdomar som förorsakas av autoimmunisation, i synnerhet så svår- behandlade sjukdomar som t ex reumatism.

Det är välkänt att det nu kommersiellt tillgängliga anti- inflammatoriska läkemedlet indometacin är besläktat med cyklooxi- genas i den metaboliska processen för PGs, och att flera slag av PGs har att göra med inflammatoriska reaktioner. Kort sagt kan det visa sig att en antiinflammatorisk verkan är tänkbar genom regle- ring av metabolismen av PGs. Ä andra sidan har PGs visat sig ha en avsevärd inverkan på matsmältningssystemet. D'vs PGE och PGI hämmar utsöndringen av mag- saft, och det har hävdats att de som ett resultat därav motverkar ulceration. Det har rapporterats att denna verkan är speciellt mar- kant hos PGI.

Beträffande njurarna har det rapporterats att PGI2 huvudsak- ligen har diuretisk verkan. Bland de kommersiellt tillgängliga anti- hypertensiva medlen är den ställning som intages av diuretika fort- farande av betydelse, varför ökad produktion av PGI2 har betydelse - 453 637 för dess värde som diuretiskt och antihypertensivt medel.

PGs farmakologiska verkan på det genitala systemet är likaså välkänd, och PGs medverkar till att underlätta uterusrörelser och uterusspänningar, eller omvänt motverkar uterusspänningar. Dessa funktioner är grundläggande vid värderingen av PGs såsom ett accele- rerande medel vid förlossning, preventivmedel och medel för avbry- tande av havandeskap. å Vidare överväger man användningen av PGs såsom ett psykoneuro- tiskt medel. I hjärnans celler är en stor mängd PGD fördelad, och man undersöker nu med stort intresse förhållandet mellan epilepsi och PGD.

Det är känt att peroxidationen av lipider accelereras genom åldrande och arterioskleros och att, som ett resultat därav, aktivi- teten av PGI-syntetiskt enzym undertryckes. Dessutom har det även rapporterats att detta PGI har en stabiliserande verkan på lysosom- membranet. Dessa fakta visar PGI's värde såsom medel som motverkar lipidperoxidation och kan leda till en möjlighet att förebygga strål- ningsskador och åldrande.

Nyligen har PGs rönt uppmärksamhet 1 samband med kancer. I syn- ^nerhet har många undersökningar utförts med PGD, PGE och PGI inom det nämnda området, och det har framkommit att dessa PGs har att göra med den hämmande effekten på proliferationen av kancerceller, normalise- ringen av kancercellerna, metastasen av kancer etc. Dessa fakta anty- der en möjlighet att hämma proliferationen av kancer och förhindra metastasen av kancer.

Såsom beskrivits är de farmakologiska funktionerna av PGs på varierande sätt förknippade med olika områden, och det är därför ingen överdrift att säga att PGs på något sätt har samband med alla sjukdomarna. Följaktligen ger oss det förhållandet att den ifrågava- rande substansen reglerar PGs en förhoppning om att PGs kan utnyttjas för att förebygga och behandla ovannämnda sjukdomar.

Exempelvis har, då det gäller den tidigare beskrivna tumörhëm- mande funktionen, PGE konstaterats ha en antitumöreffekt mot L-celler ¿D. R. Thomas et al., Experimental Cell Research 84, 40-46 (194Zl7, och det har konstaterats att ökningen och minskningen av PGD-halten kan hänföras till metastasen och proliferationen av tumörer LP. A.

Fitzpatrik et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76 (4) 1765-1769 197917, och att PGI har hämmande inverkan på proliferationen av tumörer. Dessa informationer visar emellertid endast att varje prosta- glandin som en av de fysiologiska effekterna har tumörhämmande verkan. Ä andra sidan, såsom kommer att framgå av exempel 1, har det nu av uppfinnaren klarlagts att den ifrågavarande substansen kan ändra 453 637 16 halten av både PGD och PGE i celler, d'vs att den har förmåga att reglera olika slag av PGs i samma cell. Vidare, såsom framgår av ett annat exempel, är det klarlagt att den ifrågavarande substansen häm- mande eller accelererande påverkar TXA och PGI, och detta förhållande visar tydligt att den ifrågavarande substansen ej endast påverkar en enstaka prostaglandin utan dessutom samtidigt påverkar olika slag av PGs.

En sådan substans som samtidigt påverkar många slag av prosta- glandiner har aldrig tidigare konstaterats, och en sådan egenskap kan sägas vara specifik för den ifrågavarande substansen.

Den blandning innehållande den aktiva ingrediensen som utgör den farmaceutiska kompositionen enligt föreliggande uppfinning skall nu beskrivas nedan.

I det fall då den farmaceutiska kompositionen skall användas som ett PGs-reglerande medel är det möjligt att använda den farma- ceutiska kompositionen i den form som är lämplig för att uppnå en effekt motsvarande sjukdomens art och symptom, och dessutom kan den aktiva beståndsdelen användas som sådan eller som en blandning i -kombination med något utspädningsmedel, som är tillåtet inom farma- ceutiska processer, och med andra mediciner.

Den farmaceutiska kompositionen enligt föreliggande uppfinning administreras oralt eller parenteralt, och följaktligen kan den far- maceutiska kompositionen enligt uppfinningen ha varje form som är lämplig för oral eller parenteral administrering.

Den farmaceutiska kompositionen enligt föreliggande uppfinning kan föreligga i form av en enhetsdos. Den farmaceutiska kompositionen enligt uppfinningen kan ha formen av pulver, granulat, tabletter, sockeröverdragna tabletter, kapslar, suppositorier, suspensioner, lösningar, emulgerbara koncentrat, ampuller, injektioner etc. Som utspädningsmedel kan något fast, flytande eller halvflytande medel användas, t ex excipienter, bindemedel, vätmedel, desintegrerings- medel, ytaktivt medel, demulgeringsmedel, dispergermedel, buffert- medel, parfymer, konserveringsmedel, upplösningshjälpmedel och lös- ningsmedel. Vidare kan en eller flera av dessa adjuvanter användas i kombinationer eller blandningar.

Den farmaceutiska kompositionen enligt föreliggande uppfinning kan inblandas på något känt sätt, och mängden aktiv ingrediens (den ifrågavarande substansen) i kompositionen (preparatet) är generellt från 0,01 till 100 vikt%. 453 637 17 Den farmaceutiska kompositionen enligt föreliggande uppfinning kan administreras oralt eller parenteralt till människor och djur, företrädesvis administreras de dock oralt. Sublingual administrering inkluderas i oral administrering. Parenteral administrering inklude- rar subkutan, intramuskulär och intravenös injektion samt injektion genom dropp.

Dosen farmaceutisk komposition enligt föreliggande uppfinning beror på ålder, personella olikheter och sjukdomsstadiet, och om patienten är en människa eller ett djur, och följaktligen kan helt andra kvantiteter administreras än följande doser: generellt är för människor den orala dosen 0,1- 1000 mg/kg kroppsvikt/dag, företrädes- vis 1-500 mg/kg/dag, och den parenterala dosen är 0,01- 200 mg/kg/dag, företrädesvis 0,1- 100 mg/kg/dag uppdelat i 1-4 delar, varvid en del administreras per gång.

Nedan ges en mer detaljerad beskrivning av kompositionernas sammansättning, framställningen och de fysiologiska effekterna av den farmaceutiska kompositionen enligt föreliggande uppfinning i form av exempel.

.Berednínosexempel 1 (delar avser i det följande viktdelar) Följande komponenter blandades intimt och blandningen pulveri- serades eller granulerades fint till en pulverformig komposition med en kornstorlek mindre än 350/u: (1) natrium-p-aminobensoat-N-D-galaktosid 10 delar (2) tung magnesiumoxid 15 delar (3) galaktos 75 delar Den så framställda beredningen användes som sådan eller i form av kapslar.

Beredningsexempel 2 Följande komponenter blandades intimt, pulveriserades och upp- arhetades till ett vått granulat. Detta torkades och síktades till ett granulat med kornstorleken 177-1410/u: (1) natrium-p-aminobensoat-N-D-xylosid 45 delar (2) stärkelse 15 delar (3) galaktos 16 delar (4) kristallin cellulosa 21 delar (5) polyvinylalkohol 3 delar och (6) vatten för upparbetning till det våta granulatet 30 delar 455 637 18 Beredningsexemgel 3 I stället för att använda natrium-p-aminobensoat-N-D-xylosid i beredningsexempel 2 användes natrium-o-aminobensoat-N-L-rhamnosid, och granulatet framställdes såsom i beredningsexempel 2. Till 96 de- lar av den så framställda beredningen i form av granulat sattes 4 delar kalciumstearat och blandningen formpressades till tabletter med en diameter av 10 mm.

Beredningsexemgel 4 Till 90 delar av det i beredningsexempel 2 framställda granu- latet sattes 10 delar kristallin cellulosa och 3 delar kalciumstea- rat, och den så erhållna blandningen formpressades till tabletter med en diameter av 3 mm. De så framställda tabletterna överdrogs med en blandad suspension,innehållande sirap-gelatin och utfällt kalciumkarbonat, till sockeröverdragna tabletter.

Beredninosexemgel 5 Följande komponenter blandades noga under värmning, och bland- ningen infördes i ampuller och steriliserades för att utgöra injek- tionsmedel: (1) natrium-m-aminobensoat-N-L-rhamnosid 0,6 delar (2) ett icke jonaktivt, ytaktivt medel 2,4 delar och (3) en vattenhaltig fysiologisk saltlösning 97 delar Exemgel 1 Den ifrågavarande substansens inverkan på PGs meta- bolísm av arachidonsyra härrörande från lymfocyter Efter inställning av lymfocyter tagna från mjälten hos en BALB/C-mus till en koncentration av 124107 celler/ml tillsattes 2/uCi 3H-arachidonsyra och blandningen inkuberades vid en temperatur av 37°C under 90 minuter. De inkuberade lymfocyterna tvättades tre gånger med kulturmediet. Sedan cellerna åter inställts till en koncentration av 1:<1O7 celler per ml hälldes kulturen i fyra kisel- belagda provrör i en mängd av 2 ml/rör. Två provrör användes som kontroller, och i vart och ett av de återstående två provrören in- fördes 500/ug av den ifrågavarande substansen, i detta exempel förening 7, varefter de fyra provrören inkuberades vid 37°C under 60 minuter. Efter inkubationen centrifugerades provrören vid O°C under 5 min vid 1200 varv/min.

De så erhållna cellkulorna upptogs i en medicinflaska innehål- lande 2 ml av kulturmediet och efter tillsats av 5 ml petroleumeter skakades flaskan och eterskiktet avlägsnades, varefter det kvarva- rande vattenskiktet inställdes på pH 3,5 medelst O,5N saltsyralösning. 453 637 19 Den vattenhaltiga sura lösningen extraherades 3 gånger med vardera 5 m1 eter, och eterextraktet torkades till torrhet. Det fasta materialet uæattes för föresuing med hjälp av en diazoirxetanlösning. Den förestrade reaktionsblandniiigen tunnskilctskrmiatograferades och frarnkallades med ett volyxrrnässigt 90:50:20:l00 blandat lösningsmedel av etylacetat:isooktanzättiksyrazvatten. Identifieringen av de därvid på kromatogramnet uppträdande fläckarna skedde under användning av följande autentiska prover av PGDZ, PGEZ, PGF2_ och ö-keto-PGFk .. Det separerade krornatogranmets silikagelskilct skrapades bort och löstes i en vätska för en vät- skescintillationsräknare för att räknas. Från förändringarna vid räkningarna be- stämdes förändringen av PGs. Resultaten visas i tabell 5 Tabell 5: Prostaglaxidinföräxidringar i cellkultur in vitro PGs s-k w-PGF PGP Pas Pen bﬁngdl) e l-a z-u z 2 o 3) - - - 500 13) i +4) + Anm: l) tillsatt mängd av den ifrågavarande substansen, förening 7 (g/ml) 2) ingen förändring observerades 3) svag förändring observerades 4) tydligt observerad förändring Liknande resultat erhölls i de fall då var och en av föreningarna 1-6 och 8-l0 insattes i en mängd av 500 pgﬁnl. Resultaten visar att de respektive sub- stanserna enligt föreliggande uppfinning reglerar :netabolismen av PGs även i ett test in vitro.

Exempel 2 Den ifrågavarande substansens inverkan blodplättarnris aggregerande Eftersom det har klarlagts att blodplättarnas aggregerande huvudsakligen frarnkallas av PGGZ, Ptšíz och TXAZ, vilka alla ingår i raden av PGs, undersöktes den ifrågavarande substansens inverkan på blodplättarnas aggregerarxde på följande sätt: Som antikoaguleringsnnedel användes en vattenlösning av citrat för bestäm- ning av erytrocytsediinentationen, och 1 del av citratlösningen och 9 delar ny- uppsamlat humant blod tillsattes. Blandningen centrifugerades under 6 minuter vid 400 G, och det övre skiktet användes för beredning av på humana blodplättar rikt plasma (PRP) . Återstående vätska centrifugerades ytterligare under 20 minuter vid 700 G, och det övre skikt sparades såsompåblodplättar fattigt plasma (PPP) . Ändringen av överföringen av PRP mättes i en agrigometer (typ PAF-B, tillverkad av Biodata Oo) för bestämning av blodplättar-nas aggregeringsgrad, varvid aggregeringen åstadkoms 45.3 637 genom.tillsats av ett aglutinationsmedel.

De härvid använda agglutinationsmedlen var arachidonsyra (1,64 mmol), adenosindifosfat (50/umol), kollagen (0,26 mg/ml), epinefrin (0,11 mmol), ristocetin (2,0 mg/ml) och trombin (0,5 U per ml). Vart och ett av medlen sattes till PRP 2 minuter efter tillsatsen av någon av de ifrågavarande substanserna (föreningar- nal-8L _ I Resultaten visas av fig 1-6. Som framgår av figurerna upp- visade var och en av de här testade substanserna enligt föreliggande uppfinning en inhiberande verkan på blodplättarnas aggregerande, som åstadkommits med de olika agglutinationsmedlen. Fenomenet enligt ovan visar att var och en av de ifrågavarande substanserna reglerar pro- duktionen av PGs, i synnerhet av PGG2, PGH2 och TXA2.

Exempel 3 Den ifrågavarande substansens inverkan på nivån av cykliskt adenosinmonofosfat (cykliskt AMF) Cykliskt AMF är mer känt för att ha nära samband med PGS än för att vara en intracellulär budbärare, och sambandet är närmare till PGD, PGE och PGI. I detta exempel undersöktes därför den ifråga- varande substansens inverkan på cykliskt AMP i blodplättarnas celler 'på följande sätt: PRP (på blodplättar rikt plasma) framställdes enligt ovanståen- de metod och centrifugerades under 20 minuter vid 700 G för erhållan- de av en överflytande vätska betecknad PPP (på blodplättar fattigt plasma). Fällningen upptogs i 1/3 av PPP-volymen för att åstadkomma ett 3 gånger mer koncentrerat PRP. å Till så framställt koncentrerat PRP sattes var och en av vat- tenlösningarna av de ifrågavarande substanserna (i detta fall för- eningarna 4, 7 och 8) i vattenhaltig fysiologisk saltlösning i en förutbestämd koncentration, och blandningen inkuberades vid rumstem- peratur under 5 minuter. Sedan utfördes i tur och ordning kokning, homogenisering och centrifugering, och 50/ul av supernatanten använ- des för bestämning av cykliskt AMP. Denna bestämning utfördes enligt Gilam's metod. Som positiv kontroll användes PGE Resultaten visas 1. av fig 7. Som framgår av fig 7 har den ifrågavarande substansen förmåga att höja nivån av cykliskt AMP i blodplättarnas celler, och på grund därav kan man antaga att den ifrågavarande substansen på- verkar metabolismen av PGs.

Exempel 4 Den ifrågavarande substansens inverkan på nivån av malondialdehyd (MDA) i blodplättarna PRP från humant blod centrifugerades och tvättades för att ge u 45: 535 21 "tvättade blodplättar“. Efter tillsats av en av de ifrågavarande substanserna (föreningarna 4, 7 och 8) till de tvättade blodplättarna sattes vidare Caionophore A-23187 därtill och blandningen inkuberades under 5 minuter vid 37°C. Därefter sattes tiobarbitursyra till den inkuberade blandningen, som färgframkallare, och blandningen extra- herades med en lösningsmedelsblandning av metanol och butanol. Ab- sorptionen vid 535 nm avlästes kolorimetriskt för bestämning av mängden malondialdehyd (MDA). Resultaten visas av fig 8. Den ifråga- varande substansen hämmade produktionen av MDA. Även på grund av detta faktum är det troligt att den ifrågavarande substansen delta- ger i metabolismen av PGs.

Exempel 5 Effekt av indometacin på den ifrågavarande substan- sens hypotensiva verkan Det är känt att PGs bildas av arachidonsyra och att cyklooxi- genas deltager vid omvandlingen av arachidonsyra till PGG2, att indometacin inaktiverar nämnda cyklooxigenas och vidare att meta- bolismen av PGs fullständigt stoppas genom administrering av indo- metacin.

Följaktligen jämfördes blodtrycket hos spontant hypertensiva (SHR) hanråttor 30-40 veckor efter födelsen med de båda fall (1) då endast den ifrågavarande substansen administrerades í en mängd av 100 mg/kg, och (2) då indometacin administrerades 2 gånger i en mängd av 2,5 mg/kg/gång, före och efter administreringen av den ifrågavarande substansen. Den ifrågavarande substansen, förening 7, löstes i destillerat vatten eller dispergerades i en 2%-ig vatten- lösning av karboximetylcellulosa och tvångsadministrerades oralt.

Indometacinet dispergerades i en 2%-ig vattenlösning av karboximetyl- cellulosa och även denna dispersion tvångsadministrerades oralt, 1 timme före och efter administreringen av den ifrågavarande sub- stansen.

Resultaten visas av fig 9. Den ifrågavarande substansens hypo- tensiva verkan försvann i det fall då indometacin administrerades före och efter administreringen av den ifrågavarande substansen.

Med tanke på att indometacin är en inhibitor för prostaglandin- metabolismen kan den ifrågavarande substansens förmåga att sänka blodtrycket tillskrivas dess nära släktskap med prostaglandin. 453, 637 22 Exempel 6 Den ifrågavarande substansens inverkan på nivån av cykliskt AMP i tumörceller av sarkom 180 Den ifrågavarande substansen, i detta fall förening 7, sattes till 100/ul ascitestumör tagen från bukhålan på en mus med sarkom 180, så att en förutbestämd koncentration erhölls, och blandningen inku- berades vid rumstemperatur under 5 minuter. Efter inkuberingen koka- des kulturen, homogeniserades och centrifugerades för att ge en supernatant. I den så erhållna supernatanten bestämdes cykliskt AMP enligt Gilam's metod. Resultaten framgår av fig 10. Det konstaterades att den ifrågavarande substansen hade förmåga att höja nivån av cyk- liskt AMP i tumörcellerna av sarkom 180. Den ifrågavarande substan- sens delaktighet i metabolismen av PGs verkar sannolik även på grund av detta faktum.

Exempel 7 Den ifrågavarande substansens inverkan på PGI2- produktiviteten av 3T3-fibroblaster Den ifrågavarande substansens inverkan på PGI2-produktiviteten av 3T3-fibroblaster från en mus undersöktes. Som kontroll användes en _kultur erhâllen genom att arachidonsyra, föregångaren till PGs, sat- tes till ett kulturmedium av mus-3T3-fibroblaster, och blandningen inkuberades under S minuter vid 37°C för produktion av PGI2. Ä andra sidan sattes 30 mmol av var och en av de ifrågavarande substanserna (föreningarna 1, 3, 4 och 7-11) till 4 ml av ett kultur- medium av 3T3-celler, och blandningen inkuberades under 2 minuter vid 37°C. Efter tillsats av arachidonsyra till den inkuberade kultu- ren inkuberades denna åter på samma sätt som kontrollen för produk- tion av PGI2. Den sistnämnda kulturen betecknades den behandlade gruppen.

Sedan de respektive supernatanterna erhållits från kulturerna, kontrollen och den behandlade gruppen, jämfördes deras produktivite- ter av PGI2, varvid såsom en indikator användes den hämmande verkan på blodplättarnas aggregerande som förorsakats genom tillsatsen av 2,43 mmol arachidonsyra.

Resultaten visas av fig 11, och det framgår av fig ll att även om en hämning av blodplättarnas aggregerande konstaterades i viss utsträckning hos kontrollen 5 minuter efter tillsatsen av arachidon- syra såsom en föregångare till PGs, så konstaterades en markant häm- ning hos den behandlade gruppen, vilket indikerade den ökade produk- tiviteten av PGI2 genom tillsatsen av den ifrågavarande substansen. 453 es? 23 Exempel 8 Den ifrågavarande substansens inverkan på metabolismen av cykliskt AMP och cykliskt guanosinmonofosfat i möss med kancer Ehrlich's kancerceller transplanterades in i bukhålan på ICR/JCL-honmöss 5 veckor efter födelsen i en mängd av 1:<106 celler/ djur, och under uppfödningen av mössen administrerades intraperito- nealt den ifrågavarande substansen, förening 7, till mössen varje dag från dagen efter transplantationen och under 5 dagar i en mängd av 200 mg/kg/dag. Pâ 6:te dagen avlivades mössen med eter för uppsamling av 5 ml ascites per djur. Efter tillsats av tetranatriumetylendiamin- tetraacetat till på så sätt uppsamlad ascites centrifugerades bland- ningen under 10 minuter vid en temperatur av 4°C och vid 1500 varv/min för separation av supernatanten från kancercellerna. Supernatanten centrifugerades åter vid 4°C och vid 3000 varv/min under 15 minuter.

De separerade kancercellerna tvättades med Hank's lösning och utsat- tes därefter för upprepad centrifugering 5 gånger vid 800 varv/min och varje gång 5 minuter för avlägsnande av föroreningar, såsom erytrocyter etc. Efter homogenisering av 1Jc1O8 kancerceller i 3 ml .av en 6”-ig vattenhaltig lösning av triklorättíksyra vid en tempera- tur av OOC, centrifugerades den homogena blandningen under 20 minuter vid 3000 G för att ge ett vätskeextraktf Efter tillsats av 10 vikt% av en 1N vattenhaltíg saltsyralösning till vätskeextraktet, extra- herades detta 5 gånger, varje gång med dubbla volymen eter, för av- lägsnande av triklorättiksyran. Sedan etern fullständigt avlägsnats genom värmning av den återstående vätskan på ett vattenbad vid 80°C, frystorkades återstoden.

Till ascites-supernatanten sattes samma mängd av en 10%-ig i vattenlösning av triklorättiksyra och sedan den fått stå under 15 mi- nuter vid en temperatur av OOC centrifugerades blandningen under min vid 3000 G för att ge supernatanten. Till den så erhållna su- pernatanten sattes 0,1 ml av en 1N vattenhaltig saltsyralösning, och sedan triklorättiksyran avlägsnats medelst 2 gånger volymen eter, bortskaffades etern fullständigt på ett vattenbad vid 80°C och åter- stoden frystorkades. ' Båda de frystorkade preparaten, härrörande från kancercellerna respektive ascites-supernatanten, löstes var för sig i 1 ml av en vattenhaltig buffertlösning med pH 4,0 innehållande 50 mmol ättiksyra och utsattes för radioimmuntest under användning av anti-cykliskt AMF- -antikroppar och anti-cykliskt guanosinmonofosfat(GMP)-antikroppar för bestämning av cykliskt AMP respektive cykliskt GMP i kancercel- lerna och i ascites-supernatanten. Resultaten visas i tabell SA. En 453 637 24 ökning av halterna av cykliskt AMP och cykliskt GMP konstaterades i de kancerceller som härrörde från den råtta till vilken den ifråga- varande substansen administrerats. Detta faktum bekräftade den ifrågavarande substansens inverkan på metabolismen in vivo av cyk- liskt AMP och cykliskt GMP i kancerceller härrörande från de i mus- kroppen transplanterade kancercellerna.

Tabell SA: Nivå av cykliskt AMP och cykliskt GMP Cykliskt AMP per Cykliskt GMP per Grupp 108 kancerceller 108 kancerceller Kontroll 19.5 0.59 Den ifrågavarande 21 2 ' O 72 substansen ' ° enhet: pM Exemgel 9 Den ifrågavarande substansens inverkan på mängden PGs i ett kulturmedium i vilket humana leukemicel- ler odlats I vardera 10 ml av ett kulturmedium, framställt genom till- sats av 10% fetalt bovinserum och en av de ifrågavarande substan- serna, förening 7, i en koncentration av 50, 500 eller 5000/ug/ml, till Eagle's kulturmedium i en polystyrenflaska med bottenytan 75 cmz, inokulerades 5><105 kulturceller av stammen humant dinukle- ärt leukemi J-111 och odlades vid 37°C under en blandad atmosfär av volym% gasformig kolmonoxid och 95 volym% luft under 7 dagar. Un- der odlingen utbyttes kulturmediet på den andra och den fjärde da- gen mot färskt medium, och varje utnyttjat medium utsattes för centrifugering så snart som möjligt vid en temperatur av 4°C vid 1500 varv/min, så att en supernatant av varje kulturmedium erhölls.

Halten av PGB och PGF2_a 3H-prostaglandin E Radioimmuntest Kit och en 3H-prostaglandin E ka- i varje supernatant bestämdes medelst en dioimmuntest Kit (tillverkade av Clinical Assay Co, USA).

Resultaten visas av fig 12 och 13. Som framgår av fig 12 ökade den samlade mängden PGE2_a med tiden, och det framgår av fig 13 att den samlade mängden PGE minskade med tiden, generellt. Okningsgraden för verka rande substansen ökades, och minskningsgraden för PGE steg när kon- minskade emellertid när koncentrationen av den ifrågava- centrationen av den ifrågavarande.substansen ökades. Under alla för- hållanden framgår det av fig 12 och 13 att den ifrågavarande substan- sen deltager i metabolismen av PGs. 453 637 Exgæl l0 Den ifrågavarande substansens inverkan på mängden av PGs i ett kulturmedimn i vilket humana uterina kancerceller odlats I vardera 10 ml av ett kulturmediuxn, framställt genom tillsats av 10% fe- talt bovirxsermn och en av de ifrågavarande substanserna, förening 7, i en kon- centration av 0 (kontroll), 10, 100, 500, l000 eller 5000 /lig/nﬂ. till Eagle's kulturmedimn i en polystyrenflaska med en bottenyta av 75 cmz, inokulerades Hela S3 odlade humana uterina kancerceller i en :mängd av 5 x 105 celler/flaska och od- lades vid 37°C under 2 dagar i en blandad aunosfär av 5 volym% gasfonnig koldioxid och 95 volym% luft. Efter avslutad inkubation centrifugerades hela kulturmediet vid en temperatur av 4°C med 1500 varv/min så att en supernatant av lmlturnxediet erhölls. Halten PGE i supernatanten bestämdes medelst en 3H-prostaglandin E Radio- inmuntest Kit. Resultaten visas av tabell 6.

Som framgår av tabell 6 minskade mängden PGE i kulturmediet (utan kancercel- ler) genom tillsats av den ifrågavarande substansen. Detta falﬁturn bevisar den ifrågavarande substansens inverkan på rnetabolismen av PGs.

Tabell 6: Halt av PGE i kulturmediet (utan celler) Koncentration av den Koncentration av PGE Ändring av koncentra- ifrågavararmde substansen efter odling tion av PGE under od- lingen /uq/ml Ps/ml pg/ml 0 (kontroll) 312 +l20 40 -152 100 80 -ll2 500 48 -144 1000 25 -l67 5000 25 -167 Exgrgêl ll Den ifrågavarande substansens inverkan på PGE i kancerceller och i ascites från möss transplanterade med Ehrliclfs kancerceller Till grupper av ICR-JCIJ-homröss, 5 veckor efter födseln, transplanterades intraperitonealt Ehrlich's kancerceller i en mängd av l x 106 celler/djur, och en av de ifrågavarande substanserna, förening 7, administrerades intraperitonealt till mössen varje dag från dagen efter transplantationen och under 5 dagar i en mängd av 200 rng/kg/dag. Mössen avlivades med eter på den sjätte dagen efter tran- splantationen och ascites uppsamlades. Efter tillsats av tetnranatrimrxetylerﬁia- mintetraacetat tillsammans med l viktfà aspirin till ascites centri- fugerades under 10 minuter vid 1500 varv/min och vid en temperatur 453 657 26 av 4°C för att separera kancercellerna från supernatanten. Superna- tanden centrifugerades ytterligare vid 4°C och 3000 varv/min under minuter. De separerade kancercellerna tvättades med Hank's lösning och centrifugerades därefter 5 gånger vid 800 varv/min och varje gång under 5 minuter för att avlägsna föroreningar, såsom erytrocyter etc.

De på så sätt renade kancercellerna i ett antal av 11<1O8 homogenise- rades vid O°C efter tillsats av 7 ml metanol, och homogenatet filtre- rades med hjälp av filtrerpapper. Efter tillsats av 14 ml kloroform till filtratet och blandning, fick blandningen stå under 30 minuter vid en temperatur av 4°C. Det utfällda proteinet avlägsnades sedan genom sugfiltrering, och det så erhållna filtratet torkades till fasthet i en roterande evaporator. Det torkade fasta materialet in~ fördes i en separertratt tillsammans med kloroform, metanol och en med vatten utspädd lösning av klorvätesyra med pH 2, och efter nog- grann blandning löstes det i det undre vattenskiktet och utgjorde en lösning av 2 ml. Halten PGE i lösningen och i supernatanten av ascitesvätska bestämdes medem13H-prostaglandin E Radioimmuntest Kit.

Resultaten visas i tabell 7. I de med kancerceller transplanterade -djuren, vilka administrerats den ifrågavarande substansen förekom PGE i större mängd i kancercellerna och 1 mindre mängd i ascites- supernatanten jämfört med de djur som transplanterats med samma kancerceller men ej administrerats den ifrågavarande substansen.

Detta faktum visar tydligt förhållandet mellan administreringen av den ifrågavarande substansen och metabolismen av PGs.

Tabell 7: Halt av PGE i kancerceller och ascites (supernatant) Halt av PGE i Halt av PGB i ascites- Grupp 108 celler supernatanten H9 H9 Kontroll 2.36 0.26 Den ifrågavarande 3_05 0_l2 substansen Exemgel 12 Den ifrågavarande substansens inverkan på mängden PGE i Ehrlich's kancerceller och effekt på tumörprolife- rationen Ehrlich's kancerceller transplanterades subkutant på grupper av C57BL/6 honmöss, 9 veckor efter födelsen, i en mängd av 1.x1O och under uppfödningen av mössen administrerades intraperitonealt den ifrågavarande substansen, förening 7, till mössen varannan dag från 453 657 27 dagen efter transplantationen i en mängd av 100 mg/kg. På den 14:de dagen efter transplantationen avlivades mössen med eter och tumör- vävnaden exstirperades. Efter homogenisering av den med en sax fin- fördelade tumörvävnaden under tillsats av 7 ml metanol per gram tumörvävnad vid en temperatur av 0°C, filtrerades homogenatet med hjälp av filterpapper så att ett filtrat erhölls. Efter tillsats av 2 gånger volymen av kloroform till filtratet blandades noga och blandningen fick stå 30 minuter vid 4°C. Den kylda blandningen ut- sattes sedan för samma procedurer som i exempel 11 för bestämning av PGE-halten i tumörvävnaden. Resultaten framgår av tabell 8.

Halten av PGE i tumörvävnaden var större hos de djur som transplan- terats med kancerceller och administrerats den ifrågavarande substan- sen ääos/kontrolldjuren som transplanterats med samma kancerceller men ej administrerats den ifrågavarande substansen. Detta faktum ger en information om den ifrågavarande substansens delaktighet i metabolismen av PGs.

Tabell 8: Halt av PGE i tumörvävnad Grupp ” _ Tumörvävnadens vikt Halt av PGE i tumör- vävnaden 9 H9/9 Kontroll 1.30 1.77 Tillförd den ifraga- 0_75 3_98 varande substansen Exempel 13 Upprepning av experimentet i exempel 12 under något olika betingelser Ehrlich's kancerceller transplanterades subkutant till grupper av C57BL/6 honmöss 8 veckor efter födelsen, och under uppfödningen av mössen administrerades den ifrågavarande substansen, förening 7, oralt till varje mus varje dag i en mängd av 1 9/kg/dag. På den 7:de eller l4:de dagen efter transplantationen avlivades mössen med eter och tumörerna exstirperades. Tumörerna behandlades på samma sätt som i exempel 11 för bestämning av halten av PGE däri. Resultaten framgår av tabell 9. Koncentrationen av PGE i tumörerna var högre hos de djur som transplanterats med celler och administrerats den ifrågavarande substansen än hos kontrolldjuren, vilka transplanterats med samma celler men ej administrerats den ifrågavarande substansen. Vidare konstaterades att halten av PGE minskade i båda grupperna med tiden, och minskningsgraden var mindre hos den grupp som transplanterats och administrerats än hos kontrollgruppen som transplanterats men 453 637 28 ej administrerats. Dessa fakta ger den informationen att den ifråga- varande substansen deltager i metabolismen av PGE.

Tabell 9: Halt av PGE i tumörerna Grupp Exstirpationsdag efter Tumörens Halt av PGB transplantationen vikt i tumören 9 ng/9 Kontroll 7:de dagen 0.09 2.59 l4:de dagen 0.84 l.l6 Tillförd den _ ifrågavaranåe 7.de dagen 0.08 2.80 substansen 14:de dagen 0.67 1.65 Exempel 14 Den ifrågavarande substansens effekt på halten av PGE i tumör av adenokarcinom 755 och mot dess prolifera- tion Tumörceller av adenokarcinom 755 transplanterades subkutant på grupper av C57BL/6 honmöss 8 veckor efter födelsen, och under upp- födningen av mössen administrerades den ifrågavarande substansen, förening 7, oralt varje dag från dagen efter transplantationen i en mängd av 1 g/kg/dag. Mössen avlivades med eter på den 7:de eller den 14:de dagen efter transplantationen för exstirpation av tumörerna.

De exstirperade tumörerna behandlades på samma sätt som i exempel 11 för bestämning av halten av PGE i tumörerna. Resultaten framgår av tabell 10. Som synes av tabell 10 visade halten av PGE i tumörerna en minskning allteftersom tiden gick hos båda grupperna, av vilka den ena transplanterats och administrerats medan den andra trans- planterats men ej administrerats, och halten av PGE var följdriktigt högre hos den grupp som administrerats den ifrågavarande föreningen än hos kontrolldjuren. Dessa fakta visar att den ifrågavarande sub- stansen deltager i metabolismen av prostaglandiner.

Tabell 10: Halt av PGE i tumörerna Grupp Exstirpationsdag efter Tumörens Halt av PGE transplantationen vikt i tumören g ng/Q Kontroll 7:de dagen 1.34 0.67 14=d@ dagen 4.01 0.34 T'llf“ Ö d ifràgâíaraâge 7:de dagen l'04 2'83 substansen 14:de dagen 3_10 1,15 - 453 6307 29 Exempel 15 Den ifrågavarande substansens inverkan på förflytt- ningen av ett färgämne från injektionsomrâdet till den transplanterade tumören På ryggen av en donryu-råtta transplanterades subkutant en bit av Sato's lungkancer med en storlek av 5 mm.

I axelhålan på en ICR-mus transplanterades 106 celler av sarkom 180 subkutant. Under uppfödningen av båda djuren tvângsmatades de oralt med den ifrågavarande substansen, förening 7, en gång med en mängd av 1000 mg/kg på den 16:de dagen efter transplantationen, och en 2%-ig vattenlösning av Lissamine Green (ett färgämne till- verkat av Imperial Chem. Ind. Co) injicerades i djurens kaudalven i en mängd av 1 ml per råtta och 0,5 ml per mus.

En timme efter injektionen avlivades djuret för exstirpering av den prolifererade tumören. Tumören från råttan finfördelades och homogeniserades i en 50%-ig vattenlösning av etanol. Efter utspäd- ning av homogenatet genom tillsats av lösning till en total volym av 50 ml centrifugerades vätskan under 15 minuter vid 1000 varv/min för separation av supernatanten. Halten av färgämne bestämdes både i själva supernatanten och efter utspädningen genom spektrofotometri med dess absorptionsmaximun vid 630 nm. Beträffande tumören hos musen skars denna upp och närvaron av färgämnet observerades med bara ögat på tvärsnittet av tumören.

Mängden färgämne som sedimenterat i Sato's lungkancer per gram kancertumör visas i tabell 11.

Tabell 11: Grupp _ Mängd färgämne (/ug/g tumör) Kontroll 30.0 Tillförd den ifråga- 51 0 varande substansen Genom visuell undersökning konstaterades den anmärkningsvärda sedimentationen av färgämne i tumörens centrala del ifråga om sar- kom 180 hos den mus som administrerats den ifrågavarande substansen.

Resultaten visar att den ifrågavarande substansen kan underlätta möjligheten för ett antikancerläkemedel att nå en tumör och ådaga- lägger att den ifrågavarande substansen deltager i metabolismen av PGB. 453 637 Exempel 16 Den ifrågavarande substansens effekt då det gäller att förhindra metastaser av en transplanterad tumör MH-134 tumörceller transplanterades till C3H/He-NÖSS i kaudalvenen i en mängd av 2:x1O6 celler/djur. Den ifrågavarande substansen, förening 7, administrerades till mössen 6, 3 och 1 timme före och 1, 3 och 6 timmar efter transplantationen en gång i en mängd av 1000 mg/kg genom tvångsmatning.

Mössen avlivades på den 14:de dagen efter transplantationen och lungorna exstirperades för undersökning av antalet metastatiska organskador. Graden av positiv metastas och antalet metastatiska organskador visas i tabell 12.

Tabell 12: Grupp Grad av positiv metastas Antal metastatiska % organskador Administrerad 6 timmar före 10/10 (l00%) 2.3 3 " " 8/9 (88.9%) 1.9 1 " " 7/9 (77.8%) 1 timme efter 7/10 (70%$ 3 H H 9/10 (90%) 6 " " 10/10 (l00%) 3.5 Ej administrerad 6/6 (l00%) 4.5 Eftersom det föreligger ett flertal informationer angående deltagandet av PGs, i synnerhet PGD2, vid metastaser av en trans- planterad tumör, kan det av ovanstående data bestyrkas att den ifråga- varande substansen har en inhiberande effekt på metastaser av en in- planterad tumör via PGs.

Exempel 17 Variation av PGs-nivån i blodet hos djur administre- rade med den ifrågavarande substansen Sarkomceller framkallade av metylkolantren transplanterades på ryggen av en grupp spontant hypertensiva råttor (SHR) subkutant i en mängd av 1><106 celler/djur, och under uppfödningen av råttorna administrerades den ifrågavarande substansen, förening 7, intraperi- tonealt dagligen under 6 på varandra följande dagar från och med 24 timmar efter transplantationen i en mängd av S00 mg/kg/dag. Två veckor efter avslutad administrering uppsamlades hela blodmängden för erhållande av en plasmafraktion. Eterextraktet av plasmat sepa- rerades genom tunnskiktskromatografi och sedan extraktet omvandlats 453 637 3l till ett lnetyloxjnxesilylderivat undersöktes nivåvariation av 6-keto-PGFl_ d i extraktet genom gaskroxnatografi och Inass-spektroskopi. Resultaten visas av fig. 14.

Det framgår av fig 14 att även om generellt nivån av 6-keto-PGE'l i blodet hos en råtta med kancer är högre än i blodet hos en råtta i normalt tillstånd, så var nivån hos kancerbärande råttor administrerade med den ifrågavarande substansen så gott som densamma som hos normala råttor. Det år troligt att den ifrågavarande substansen nedbringat den förhöjda nivån till den nonnala.

Exempel 18 Den ifrågavarande substansens effekt på kancerproliferation och mängden PGE i kancerceller Medelst samma metod som i exempel 12 undersöktes antikancereffekten mot transplanterad Bhrlich-kancer hos C57BL/6-1röss samt :längden PGE i kancerceller under proliferation i den levande rnuskroppen i de fall då var och en av substanserna enligt uppfinningen, förening l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 .och ll, administrerats intraperitonealt varannan dag från och med dagen efter transplantationen och totalt 6 gånger i en dos av 100 mg/kg.

Resultaten från bestämningen av vikten på kancertmrörerna exstiiperade från de avlivade mössen på l4:de dagen efter transplantationen av kancercellerna, l x 106 i antal per djur, samt halten av PGE i de exstirperade kanceturrörerna framgår av följande tabell 13.

Tabell 13: Kancertwnöremas vikt (g) och halten av PGE i kancercellerna (ng/g) Förening Kancertwrörernas vikt Halt av PGE i kancercellerna 9' 119/9 xontronl) 1.30 1.77 Förening l 0.63 4.10 å 0.81 3:88 3 0.74 4.23 4 0.56 4219 š 0.70 3.20 6 0.65 3.66 72) 0.75 3.98 8 0.72 4.03 9 0.80 4.32 0.70 4.14 ll 0.69 4.20 Anm: 1) transplanterade men ej administrerade djur 2) resultat från exempel 12 Det frarngår av tabellen att även om det föreligger en viss skillnad mellan föreningarna, är de alla effektiva då det gäller inhibering av tillväxten av kan- x cer och höjning av PGE-nivån i kancercellerna. 453 637 32 Exempel 19 Effekt av aspirin på den ifrågavarande substansens hypotensiva verkan Det är känt att PGs produceras av arachidonsyra och att om- vandlingen av arachidonsyra till PGG2 förmedlas av cyklooxigenas.

Det är likaså känt att aspirin inaktiverar cyklooxigenas och att metabolismen av PGs fullständigt stoppas genom administrering av aspirin till ett däggdjur.

Följaktligen gjordes följande försök: Till grupper av SHR han- råttor 30-40 veckor efter deras födelse, (a) administrerades oralt genom tvångsmatning en av de ifrågavarande substanserna i en mängd av 100 mg/kg i form av en lösning i destillerat vatten eller i form av en vattensuspension i 2%-ig karboximetylcellulosa, eller (b) ad- ministrerades oralt genom tvångsmatning aspirin,1 timme före och efter administreríngen av den ifrågavarande substansen, i en mängd av 200 mg/kg. Blodtrycket hos de sålunda behandlade råttorna mättes under tidens gång.

Resultaten visas i tabell 14. Det framgår av tabell 14 att genom administreríngen av inhibitorn för metabolismen av PGs, aspi- -rin, så uppträdde den hypotensiva effekt av den ifrågavarande sub- stansen (föreningarna 4, 7 och 8),som visade sig hos gruppen (a), ej hos gruppen (b). Dessa resultat visar att den hypotensiva effek- ten av den ifrågavarande substansen har sin grund i PGs.

Tabell 14: Hypotensiv effekt inhiberad av aspirin Förändring av blodtrycket (mmHg)1) substans Grupp (a) Grupp (b) Kontrollz) 0 0 Förening 4 -20 -5 7 -20 0 8 -15 0 Anm: 1) 6 timmar efter administreríngen av den ifrågavarande substansen 2) enbart tillförd destillerat vatten samtidigt med administre- ríngen av aspirin och den ifrågavarande substansen Exempel 20 Den ifrågavarande substansens inverkan på PGs-nivån i blodet hos spontant hypertensiva råttor (SHR) Efter tvångsadministrering av den ifrågavarande substansen (föreningarna 4, 7 och 8) varje dag under 14 på varandra följande dagar i en mängd av 100 mg/kg/dag genom oral tillförsel till grupper - 453 637 33 av SHR hanråttor, uppsamlades deras hela blodmängd på den 15:de da- gen för erhållande av en plasmafraktion. Eterextraktet av plasma- fraktionen separerades och isolerades genom tunnskiktskromatografi, och efter omvandling av den isolerade fraktionen till metyloximesilyl- derivat undersöktes förändringen av 6-keto-PGF1_a genom gaskromatogra- fi och mass-spektroskopi. Resultaten visas i tabell 15. Hos den grupp till vilken den ifrågavarande substansen administrerats var halten av 6-keto-PGF1_a större samtidigt som blodtrycket var lägre än hos kontrolldjuren. Denna parallellism hos effekterna leder till det an- tagandet att effekten av den ifrågavarande substansen förmedlas av prostaglandin.

Tabell 15: Blodtryck och halt av PGs i blod uppsamlat 14 dagar efter administreringen av den ifråga- varande substansen (föreningarna 4, 7 och 8) Kontroll Förening 4 7 8 Blodtryck (mmhg) 195 155 160 150 'Halt av 6-keto-PGF1_a 3 7 6'5 7 i blodet (ng/ml) Exempel 21 Den ifrågavarande substansens inverkan på produktionen av PGI2 i råttor som lider av diabetes mellitus Grupper av Sprague-Dowley hanrâttor med en kroppsvikt av ca 200 g användes vid detta experiment. En del grupper av råttor ad- ministrerades intravenöst med streptozotocin i en mängd av 80 mg/kg 1-3 månader innan experimentet påbörjades för att vara i ett till- stånd av diabetes mellitus. Råttor av samma art, samma kön och samma ålder men ej administrerade med streptozotocin användes som kontroll- djur.

De ifrågavarande substanserna (föreningarna 4, 7 och 8) admi- nistrerades var för sig till grupperna av råttor vilka led av arti- ficiell diabetes mellitus genom tvångsmatning och i en mängd av 100 mg/kg i form av en vattenlösning i destillerat vatten. 6 timmar efter administreringen av den ifrågavarande substansen togs blodprover från râttorna under bedövning med eter och i en mängd av 0,5 ml/djur, och blodsockerhalten mättes genom den enzyma- tiska metoden.

Därefter mättes mängden av prostaglandin I2 som producerats i den arteriella vävnaden på följande sätt: 453 637 34 Råttans bröstaorta exstirperades snabbt, tvättades med Krebs' buffertlösning vid en temperatur av 4°C och skars i tunna ringar med en vikt av 1-2 mg. Därefter upptogs 60 mg av den så skurna aortan i 200/ul av Krebs' buffertlösning och blandningen inkuberades under 3 minuter vid 22°C.

Mängden prostaglandin I2(PGI2) som producerats i aorta bestäm- des i supernatanten (1-10/ul) av den enligt ovan inkuberade kulturen på samma sätt som i exempel 2 med den hämmande effekten på blodplät- tarnas aggregering som ett index, men med användning av adenosin- difosfat såsom agglutinationsmedel. Sedan en standardkurva erhållits genom användning av ett autentiskt prov av PGI2, erhölls halten av PGI hos den nämnda supernatanten från standardkurvan i ng/mg våtvikt 2 av artärvävnaden. Resultaten visas i tabell 16.

Tabell 16: Mängder av PGI2 och blodsocker Grupp av råttor PGI2 Blodsocker ng/mg våt vävnad mg/100 ml Normal råtta 0.26 É 0.06 76.7 i 5.0 Råtta med artificiell diabetes mellitus Ej administrerad med den ifrågavarande 0.07 i 0,01 412,1 i 15.1 substansen Administrerad med förening 4 0.19 i 0.04 r :133.e i 8.3 Administrerad med förening 7 0.22 i 0.02 165.0 if 11 0 Administrerad med _ 0.18 r 0.04 110.1 i* 5.5 förening 8 Även om produktionen av PGI2 i aortavävnaden hos den råtta som artificiellt bringats i ett tillstånd av diabetes mellitus var lägre än hos den normala råttan, så medförde administreringen av den ifråga- varande substansen till den råtta som artificiellt bringats i ett tillstånd av diabetes mellitus en ökad förmåga hos vävnaden att pro- ducera PGI samtidigt med en minskning av blodsockerhalten. 2 Exempel 22 Ett annat exempel som visar den ifrågavarande substan- sens inverkan på produktionen av PGI2 Efter exstirpation av cervikalaortan hos en SD-råtta under narkos tvättades denna med Krebs-Linger bikarbonat-buffertlösning och skars i tunna ringar, och bitarna upptogs i den nämnda buffert- - I 453 637 lösningen i en mängd av 1 mg våta bitar per 0,5 ml för produktion av PGI2.

Till 500/ul av den så framställda blandningen sattes SO/ul av en vattenhaltig fysiologisk saltlösning innehållande 2 vikt% av den ifrågavarande substansen (var och en av föreningarna 4, 7 och 8) löst däri, och sedan produktionen av PGI2 generellt nått sitt maximum efter ca 10 minuter, åstadkoms en supernatant (2,5/ul) av blandningen minuter efter tillsatsen, varefter mängden PGI2 i supernatanten bestämdes under användning av den hämmande effekten på blodplättarnas aggregering som ett index och med användning av ADP som agglutina- tionsmedel, varvid som kontroll användes endast en vattenhaltig fysiologisk lösning. Resultaten visasavzfig 15. Tillsatsen av den ifrågavarande substansen ökade produktionen av PGI2 i de skurna de- larna av cervikalaortan. Även om olika undersökningar utförts avseende orsaken till arterioskleros har agglutinationen av de aggregerade klumparna till kärlväggarna nämnts som en orsak av speciell betydelse. Med andra ord, den första behandlingen är att hindra agglutinationen av blod- plättarna på kärlväggarna. Det är känt att PGI2 har en starkt inhi- berande effekt på blodplättarnas agglutination, och av de erhållna resultaten framgår tydligt att den ifrågavarande substansen, vilken ökar produktionen av PGI i aortaväggarna, har en behandlíngseffekt 2 och förebyggande effekt då det gäller arterioskleros.

Den ifrågavarande substansens effekt med avseende på -nivån i den levande kroppen hos Exempel 23 ökningen av PGE1 däggdjur (1) Vid artificiellt framkallat fotödem Tre grupper av Sprague-Dowley hanråttor av totalt sex grupper administrerades de ifrågavarande substanserna, föreningarna 4, 7 respektive 8 oralt genom tvångsmatning i en mängd av 1000 mg/kg, varvid de andra tre grupperna av samma slag av råttor vid denna tid ej administrerades någonting. 60 minuter efter administreringen injicerades 0,1 ml av en vattenlösning av carrageenin (1 mg) och PGE (0,1/ug) i baktassen hos råttorna i fyra av grupperna, inklusiveíde tre grupper som ad- ministrerats den ifrågavarande substansen. I den ena av de två återstående grupper som ej administrerats den ifrågavarande substan- sen injicerades 0,1 ml av en vattenlösning innehållande endast 1% carrageenin, och i den andra gruppen som ej administrerats den 453. 637 36 Tabell 17: Den ifrågavarande substansens inverkan på upp- svullnad orsakad av carrageenin Procentuell volymökning av foten Grupp av râttor behandlade med 60 minuter efter administreringen av carrageenin Carrageenin 37.0 PGEl 9.3 Carrageenin + PGEI 66.2 Förening 4 + Carrageenin + PGEl 32-5 Förening 7 + Carrageenin + PGEl 28.2 Förening 8 + Carrageenin + PGEI 29.7 Tabell 18: Den ifrågavarande substansens inverkan på spridningen av färgämnet Grupp av råttor behandlad med Absorbans vid 620 nm 'Histamin 0.192 PGEl , 0.066 Histamin + PGEI 0.259 Förening 4 + histamin + PGEl 0.155 Förening 7 + histamin + PGEI 0.152 Förening 8 + histamin + PGEl 0.162 Av de i tabellen 17 visade resultaten framgår att inflammationen orsakad av carrageenin och potentierad av PGEl inhiberades genom in- verkan av den ifrågavarande substansen.

Av de i tabell 18 visade resultaten framgår att spridningen av färgämnet på grund av histamin och potentierad av PGEI inhiberades.

Exempel 24 Den ifrågavarande subsunßens diuretiska effekt i relation till halten av 6-keto-PGFl“ i blodet hos råttor Grupper av spontant hypertensiva honrâttor (SHR) som fått fasta under l2 timmar och avhållits från vatten under 2 timmar behandlades oralt genom tvångsadministrering av den ifrågavarande substansen (var och en av föreningarna 4, 7 och 8) i respektive mängder av l och 5 g/kg upplöst i 8 ml (per 200 g kroppsvikt) av en vattenhaltig fysiolo- gisk saltlösning, varvid kontrollgruppen endast administrerades den 453 637 37 vattenhaltiga fysiologiska saltlösningen i en mängd av 8 ml/200 g kroppsvikt.

Mängden av råttorna utsöndrad urin mättes varje timme från och med l timme efter administreringen 6 gånger, och den procentuella urinvolymen i förhållande till volymen vattenhaltig fysiologisk saltlösning innehållande den tidigare administrerade ifrågavarande substansen (8 ml per 200 g kroppsvikt) visas i tabell 19. 6 timmar efter administreringen avlivades sedan alla djuren för uppsamling av hela blodvolymen och erhållande av plasmafraktio- nen. Eterextraktet av plasmafraktionen separerades genom tunnskikts- kromatografi, och efter omvandling av de sålunda separerade substan- serna till metyloximesílylderivat undersöktes variationen av 6-keto- PGFl“ genom gaskromatografi-masspektrografi. Även dessa resultat visas i tabell 19.

Som framgår av tabell 19 var urinmängden, efter omräkning till standardvärdet för utvinningen, större från de råttor som administre- _ rats den ifrågavarande substansen än från kontrolldjuren, och ett för- -hållande mellan dos och effekt framgår av urinmängden från de råttor som administrerats den ifrågavarande substansen. Med andra ord, en diuretisk effekt konstaterades hos den ifrågavarande substansen.

Vidare är nivån av 6-keto-PGFLM något högre i blodet hos råttor till vilka den ifrågavarande substansen administrerats än hos kontroll- djuren, även om skillnaden är mycket liten. Även om det är naturligt att ökningen av 6-keto-PGF som är metaboliten av PGI la' 2' ökning av PGI2 eftersom den diuretsika effekten konstaterats vara en av de fysiologiska funktionerna av PGI2, är det troligt att den ifrå- innebär en gavarande substansens diuretiska effekt visar sin verkan genom regle- ring av PGI2. 453 637 38 Tabell 19: Urinmängd och halt av 6-keto-PGFl“ i blodet Urinvolyml) i % efter Halt av 6-keto-PGFyu Grupper ett antal timmar av i blodet l 2 3 4 5 6 ng/ml Kontroll 2 9 22 26 28 30 3.0 Ifrågavarande substans Förening 4 g/kg 7 40 50 52 78 9l 1 g/kg 6 40 46 50 60 63 3.3 Förening 7 g/kg 5 50 66 80 92 100 l g/kg 4 38 45 48 63 72 3.5 Förening 8 g/kg 5 43 60 70 77 93 l g/kg 5 39 47 50 65 68 3.2 Anm: l) Procent av den uppsamlade urinvolymen vid tiden för be- stämningen i förhållande till den administrerade volymen vattenhaltig fysiologisk saltlösning innehållande den ifrågavarande substansen.

Exempel 25 Den ifrågavarande substansens inverkan på smärttröskeln för smärta orsakad genom upprepad injektion av PGE2 _ Grupper av Wistar hanråttor med en kroppsvikt av 230-250 g in- jicerades dagligen under 2 veckor i två tassar med 2 jpg PGE2 löst i 0,l ml av en steriliserad O,9%-ig vattenlösning av natriumklorid.

På den l6:de dagen tvångsadministrerades oralt den ifrågavarande sub- stansen (någon av föreningarna 4, 7 och 8) i en mängd av 1000 mg/kg.

"Smärttröskeln" mättes 1 timme efter administreringen av den ifrågavarande substansen. Ordet "smärttröskel" betecknar det minsta möjliga tryck som råttans tass kan utsättas för innan råttan känner smärta. Resultaten visas av fig 16.

Som framgår av fig 16 återställdes den "smärttröskelï som åstad- kommits genom injektion av PGE2 nästan till noll på grund av admini- streringen av den ifrågavarande substansen. Med andra ord, en anal- getisk effekt erhölls med den ifrågavarande substansen.

Exempel 26 Den ifrågavarande substansens effekt då det gäller att förhindra uppkomsten av stress-ulcus i magen på råttor - 453 637 39 Till tre grupper av Donryu hanrâttor med kroppsvikten 220- 250 g, vilka fastat 23,5 timmar, administrerades oralt den ifråga- varande substansen (var och en av föreningarna 4, 7 och 8) i en mängd av l g/kg upplöst i 8 ml (per 200 g kroppsvikt) av en vatten- haltig fysiologisk saltlösning.

Dessa tre grupper av råttor samt en annan grupp, som likaså fastat under 23,5 timmar men sedan endast administrerats den vatten- haltiga fysiologiska saltlösningen, infördes i en stressbur och ned- sänktes i vatten med en temperatur av 23°C till brösthöjd för att stressa råttorna.

Efter 7 timmars neddoppning togs råttorna upp ur vattnet och avlivades omedelbart för uppsamling av hela blodmängden, och deras magar exstirperades. Den av blodet preparerade plasmafraktionen extraherades med eter och eterextraktet separerades genom tunnskikts- kromatografi. Efter omvandling till de respektive metyloximesilyl- derivaten utsattes det separerade extraktet för gaskromatografi-mass- spektrografi för bestämning av halten av 6-keto-PGFIK.

En 1%-ig vattenlösning av formaldehyd injicerades i den ex- -stirperade magen och 10 minuter efter injektionen skars magarna upp utmed den mer buktiga sidan för undersökning av magsäckens slemhinna.

De längre områdena av varje ytligt sår i slemhinnan (om något) mättes mikroskopiskt.och summan därav uttryckt i millimeter togs som en ulcus- koefficient för råttan.

Resultaten visas i tabell 20. Som framgår av tabell 20 är den ifrågavarande substansen verksan då det gäller att nedbringa före- komsten av stress-ulcus, och mängden av 6-keto-PGP i plasmat var större hos de råttor som administrerats den ifrågaïärande substansen än hos kontrolldjuren. Eftersom ökningen av nivån av 6-keto-PGFlu, som är en metabolisk produkt av PGI2, innebär en ökning av PGI2- nivån, och PGI2 konstaterats vara aktivt då det gäller att nedbringa utsöndringen av magsaft och nedbringa ulcerationen, är det troligt att den ifrågavarande substansen har en anti-ulcerationseffekt genom att den reglerar PGI -nivån. 2 Tabell 20: Stress-ulcus och nivån av 6-keto-PGF1u Grupp Ulcus-koefficientl) Mängd 6-keto-PGFlq % ng/ml Kontroll 100 3.3 Ifrågavarande substans ' Förening 4 62 3.8 Förening 7 58 3.9 Förening 8 55 3.6 453 637 40 Anm: 1) Total summa av de längre områdena av ytliga sår på magens slemmhinna hos den behandlade gruppen av råttor dividerad med densamma för kontrolldjuren, multiplicerat med 100 Exempel 27 Den ifrågavarande substansens inverkan på pyrexi förorsakad av en feberalstrande bakterie Experimenten utfördes på kattor med en vikt av 3-3,5 kg. Vid en aseptisk operation och efter intraperitoneal administrering av natriumpentomnbium1 i en mängd av 36 mg/kg implanterades en Collison kanyl i den rostrala delen av den tredje ventrikeln hos katten.

Några få dagar efter implantationen av kanylen, när katten hade hämtat sig från operationen, uppsamlades prover på cerebro- spinalvätska utan bedövning. Katten fick röra sig fritt i buren och dess rektaltemperatur noterades.

Proverna av cerebrospinalvätska (c.s.f.) undersöktes Omedelbart efter uppsamlingen, eller sedan de lagrats vid -200 under 24-48 tim- mar, och bestämningen av PGE i proverna utfördes på samma sätt som i exempel 9 under användning av en 3H-Prostaglandin E Radioimmuntest 'Kit (tillverkad av Clinical Assay Co, USA). Rektaltemperaturen note- rades vid rumstemperatur (12-23°C) med termometern införd ca 10 cm djupt i rektum.

Som feberalstrare användes en somatisk typ av o-antigen av Shigella dysentriae, och efter upplösningen av 75 ng av feberalstraren i 0,15 ml pyrogenfri artificiell c.s.f. injicerades lösningen i den tredje ventrikeln via den implanterade kanylen för att framkalla feber. 2 timmar efter administreringen mättes rektaltemperaturen för att fastställa förekomsten av pyrexi, och därefter tvångsadministre- rades oralt den ifrågavarande substansen (var och en av föreningarna 4, 7 och 8) i form av en vattenlösning i destillerat vatten och i en mängd av 100 mg/kg, varvid kontrolldjuren denna gång endast admini- strerades destillerat vatten.

Rektaltemperaturen hos alla djuren mättes l timme efter ad- ministreringen av den ifrågavarande substansen.

C.s.f. för bestämning av dess halt av PGE uppsamlades före respektive 2 timmar efter injektionen av feberalstraren samt l timme efter administreringen av den ifrågavarande substansen.

Resultaten visas i tabell 21. - 41 453 637 Tabell 21: Rektaltemperatur och mängd PGE i c.s.f.

Grupp âektal- Mängd PGE emperatur 1 c.s.f.

°C ng/ml Kontroll före admin av pyrogen 39-0 2-5 2 tim efter admin av pyrogen 41-0 12 1 tim efter admin av vatten* 40-7 10 Administrerade den ifrågavarande substansen Förening 4 före admin av pyrogen 39-Û 2-6 2 tim efter admin av pyrogen 41-3 ll 1 tim efter admin av föreningen 39;9 "* 5 Förening 7 före admin av pyrogen 38.8 2.4 2 tim efter admin av pyrogen 4l.l 16 1 tim efter admin av föreningen 39.5 Förening 8 före admin av pyrogen 39.1 2.5 2 tim efter admin av pyrogen 41.5 13 1 tim efter admin av föreningen 40.0 8 Anm: * destillerat vatten Som framgår av tabell 21 sjönk den tidigare genom injektionen av feberalstraren förhöjda temperaturen hos katten samtidigt med att samma tendens förelåg hos förändringarna i halten av PGE i c.s.f., på grund av administreringen av den ifrågavarande substansen.

Det är följaktligen troligt att den ifrågavarande substansen, när den administreras oralt till däggdjur med febersymptom orsakade av inympning av feberalstrande mikroorganismer, uppvisar en anti- pyretisk effekt troligen i förening med reduktionen av PGE i c.s.f.

L/å 453. 637 KOMPLETTERANDE EXEMPEL EXEMPEL I: Förbättring av deformerbarheten av erytrocyter: 3 timmar efter administration av var och en av de föreningar som anges i tabell A oralt i en dosmängd av 300 mg/kg till var och en av 5 wistar-råttor i en grupp, uppsamlades blodprov från råttorna och blodproven blandades med tio volymer av en vattenhaltig fysiologisk salinlösning. Efter det att den fram- ställda blandningen hemolyserats mekaniskt genom omröring i en blandare, centri- fugerades den hemolyserade blandningen och mängden hemoglobin (A1) i den överstående vätskan mättes genom kolorimetri. Separat blandades blodprovet med tio volymer destillerat vatten istället för med denvattenhaltiga fysiologiska salinlösningen och mängden hemoglobin (Bl) i den överstående vätska som erhölls vid centrifugering av den omrörda blandningen mättes kolorimetriskt.

Hemolysgraden (H1) beräknades enligt följande formel; Hi = -%%- X 100 (2) Samma förfarande utfördes som kontroll, varvid en vattenhaltig fysio- logisk salinlösning administrerades istället för natriumsaltet av föreliggande Sub-Stans, Och hemolysgraden (HC) ernöns av bina från kann-aim.

Den relativa hemolysgraden för var och en av de föreningar som anges i tabell A beräknades enligt följande formel och anges i samma tabell A. medelvärde av H- RelatiV hemOlySgfâd = X IÛÛ Som framgår av tabell A var den relativa hemolysgraden i den grupp av råttor vartill administrerats natriumsalterna av var och en av föreliggande substanser lägre än för kontrollen, med andra ord var deformerbarheten av erytrocyterna i den grupp av råttor vartill föreningarna som anges i tabell A administrerats större än för kontrollen.

Resultaten visar förbättringen av deformerbarheten av erytrocyter genom en adminsistration av var och en av de föreningar som anges i tabell A, vilken är speciellt framträdande för natrium-p-aminobensoat-N-D-mannosid.

Förbättringen av deformerbarheten av erytrocyterna ger en förbättring av blodcirkulationen i kroppen och följaktligen är en administration av natriumsalt av föreliggande substans effektiv vid behandling av patienter med ischemiska cerebrala sjukdomar, såsom cerebral infarkt och cerebral apoplexi, eftersom blodcirkulationen hos patienten med en ischemisk cerebral sjukdom reducerats till ett minimum vilket orsakar allvarliga skador. Ät '43 - .- 453 637 Tabelï A: Relativ hemolysgrad Föreliggande substans Relativ hemolysgrad Natríum-p-aminobensoat-N-L-arabínosid 88 Natrium-0-aminobensoat-N-L-arabínosíd 90 Natríum-p-amínobensoat-N-L-ramnosid 70 Natríum-o-amínobensoat-N-L-ramnosid 70 Natrium-p-aminobensoat-N-D-ga]aktosid 79 Natríum-o-amínobensoat-N-D-ga]aktosid 83 Natrium-p~amínobensoat-N-D-xylosid 71 Natríum-o-aminobensoat-N-D-xylosid 77 Natríum-p-aminobensoat-N-D-glukosid 80 Natrium-o-amínobensoat-N-D-glukosid 80 Natrium-p-amínobensoat-N-D-mannosid 56 Natrium-m~amínobensoat~N-D~mannosid 79 Kontroll 100 LH 452: 637 EXEMPEL II: Förbättring av blodflödesvolymen i koronarsinus, vilket ger en förbättring vid arrytmi, stenokardi eller myokardial infarkt: Efter införing av en Morawitfs kanyl i koronarsinus på var och en av tre beagle-hundar från det högra förmaket, registrerade koronarblodflödes- volymen_med en elektromagnetisk flödesmätare före och efter administration av var och en av de föreningar som visas i tabell B till varje hund i form av en lösning i en vattenhaltig fysiologisk salinlösning i en dosmängd av 100 Ing/kg. Det värde som erhölls genom att den blodflödesvolym som erhölls före administationen subtraherades från flödet efter administrationen och delades - med blodflödesvolymen före administrationen, dvs graden av ökning av blod- flödesvolymen anges i tabell B.

Som framgår av tabell B gav varje undersökt förening en ökning av koronarblodflödesvolymen, vilket var speciellt framträdande för natrium-p- - aminobensoat-N-D-mannosid, -D-ramnosid och -D-xylosid.

Tabell B: Förbättring av koronarblodflödesvolymen Föreliggande substans Grad av förbättring (2) Natrium-p-aminobensoat-N-L-arablnosid 22,7 Natrium-o-amínobensoat-N-L~arabïnosid 10,8 Natríum-p-amínobensoat-N-L-ramnosid Å9,h Natrium-o-amínobensoat-N-L-ramnosid 9,7 Natrlum-p-amlnobensoat-N-D-galaktosid 27,5 Natrlum-o-amínobensoat~N-D-galaktosid 26,0 Natrium-p-amïnobensoat-N-D-xylosíd 38,3 Natríum-o-amínobensoat-N-D-xylosíd l0,0 Natrium-p-aminobensoat-N-D-glukosid l#,9 Natríum-0-amínobensoat-N-D-glukosid 20,1 I Natrium~p~aminobensoat-N-D-mannosid 50,2 Natríum-m-amlnobensoat-N-D-mannosid 5,4 É I L- ;

Claims

1. ai - 45 453 637 Patentkrav Användning av en förening med den allmänna formeln coonz NH-R' vari R' betecknar en restgrupp som bildats genom avlägsnande av -OH från l(0L)- eller 1( ß)-ställningen i arabinos, xylos, ramnos, glukos, galaktos, mannos eller fruktos, och R2 betecknar väte, alkyl med 1-4 kolatomer eller en farmaceutiskt godtagbar metall, för framställning av en farmaceutisk komposition med förhindrande eller återställande effekt på stenokardi, arrytmi, cerebral infarkt, myokardial infarkt, cerebral apoplexi eller trombos.