SE423933B - Testremsa med mikrokapslar inneslutet reagens jemte forfarande for dess framstellning - Google Patents

Description

l0 l5 40 soooscss-e 2 reagensen ofta innehåller föroreningar, vilka kan interferera med färgutvecklingen och vidare är dess provtagningskapacitet för den lösning som skall analyseras inte riktigt konstant från försök till försök på grund av oundvikliga olikheter i de fiberaktiga material,som användes för framställningen av remsorna; metoden är således enbart kvalitativ. En annan nackdel är att inkapslingen utföres med hjälp av ett kolloidalt ämne som t.ex. gelatin, gummi arabicum eller karboxi-vinylpoly- merer, som producerar mycket sköra, tunnväggiga kapslar med tvivelaktig mekanisk och lagringsstabilitet. Ytterligare en nackdel är att färgen utvecklas inuti själva det vattenabsorberande materialet, vilket ofta är opakt och inte homogent, varvid tillkommer ytterligare felkällor vid utvärderingen av färgen.

US patentskriften 3.926.732 anger användningen av testremsor för färgbestäm- ning av katalas i mjölk. Metoden är baserad på den katalasberoende inhiberingen av den färgreaktion som uppstår vid oxidationen av ett leuko-färgämne (o-tolidin) av väteperoxid i närvaro av peroxidas. I ett utförande av nämnda referens, innefattar remsorna ett inert, fast, absorptions- och diffusionsmedel, i vilket är inbäddat fysikaliskt separerade, fristående mikrokapslar. Mikrokapslarna är av den "semi- permeabla vattenhaltiga" typen (se Can. J. Physiol. Pharmacol. 44 (1966), ll5) och medlet utgöres av cellulosafibrer. När remsan doppas i den lösning som skall analyseras, kommer den väteperoxid som alstras av reagensen i en första typ av mikrokapslar att vandra genom medlet, varvid den delvis kommer att inhiberas i proportion till den mängd katalas som skall analyseras och slutligen reagera med den färg som diffunderat ut frân mikrokapslar av en andra typ. Färgen kommer då att ut- vecklas inom diffusionsmedlet med påföljande nackdelar såsom nämnts ovan. Även vid denna metod är det mycket svårt att hålla remsans provtagningskapacitet per ytenhet konstant och metoden är inte exakt. En ytterligare nackdel med att använda remsor innefattandelager av fiberhaltiga, absorberande medel är det faktum att sådana medel har en kraftigt öppnad struktur, vilken inte tillräckligt filtrerar bort oönskade färgade ämnen, vilka kan vara närvarande i vätskan som skall analyseras och vilka kan interferera med den önskade färgreaktionen. Detta har delvis avhjälpts genom användningen av remsor omfattande ett lager av medel med en låg porositet, i vilket reagenset är dispergerade eller upplösta. Sådana typer av remsor anges t.ex. i den amerikanska patentskriften US 3.630.957, men de har den nackdelen att de inte äger någon oedelbar provtagningskapacitet för den vätska som skall analyseras. Utan då sådana remsor doppas ned i nämnda vätska, kommer denna vätska sakta att penetrera in i porerna av medlet (inom området av 0,1 - lvLm) och de föreningar som skall analyseras diffunderar mot reagensen, utelämnande de tänkbara, interfererande ämnena.

Men denna process tar många minuter eller mera och det är inte möjligt att exakt säga vid vilken tid processen är verkligen effektiv och när färgen är tillräckligt utvecklad. Därför är testet långsamt och enbart kvalitativt. Vissa av ovan nända olägenheter kan undanröjas genom att en droppe av den vätska som skall analyseras placeras på remsan. Men även detta är en långsam process och det finns inga garanti- 40 8000353-6 er för att droppen alltid absorberas av en viss given yta av remsan; således är även detta test enbart kvalitativt.

Ovan nämnda nackdelar har delvis undanröjts genom användningen av de remsor som anges i det franska patentet nr 2.303.290. Dessa remsor omfattar som diffusions- medel en syntetisk polymer, vilken erhållits enligt fällningstekniken med fasinver- sion. Enligt denna teknik, tillredes en lösning av polymer i en blandning av två lösningsmedel, där det ena lösningsmedlet är ett svagare lösningsmedel för denna polymer och mindre flyktig än det andra. Då den erhållna lösningen låtes torka, uppnås en punkt då det starka lösningsmedlet har avdunstat tillräckligt för att polymeren sakta skall kunna falla ut, vilket efter avslutad torkning resulterar i en öppen, porös, gelformig, vattenabsorberande struktur som påminner om cellulosa- fibrer och har gynnsamma provtagningsegenskaper för den vätska som skall analyseras.

De reagens som är nödvändiga för att utveckla den analytiska färgreaktionen hos remsorna kan införlivas i den ursprungliga polymerlösningen antingen genom impreg- nering eller genom upplösning. Detta är fördelaktigt då, i det fall då man har tvâ inbördes oförenliga reagens, kan den ena placeras inuti själva polymerstommen medan den andra sugas in i den öppna, porösa strukturen, varvid kontakt mellan dessa nämnda reagens i torkat tillstånd under lagring minimeras. Dessa remsor har många fördelar men den inre strukturen och porositeten av matrisen är starkt beroende av berednings- förhållandena och reproducerbarheten av detaljerna är svår att bibehålla från sats till sats. Dessutom kan detta materialet, på grund av dess ganska fiberaktiga natur, införa differentiella diffusionseffekter i lösningen vilken skall analyseras; en käl- la av effekter, vilka kan vara oförenliga med färgframkallningen. Vidare utveck- las färgen inuti hela kroppen av absorberande medel, vilket kan, på grund av ljus- difiraktionsproblem relaterade till dess struktur, i vissa fall begränsa känsligheten.

US-patentskriften 3.993.451 anger testremsor varav ett utförande omfattar en remsa av hydrofilt papper, vilket på ena sidan är klätt med ett enhetligt lager av en homogen blandning av tvâ typer av partiklar. Dessa partiklar utgöres av agglomerat av hydrofila adsorberande material, som t.ex. pulverformig cellulosa, aluminiumoxid, kiselgel, m.m. och är impregnerade med reagenslösningarna och därefter torkade.

Den ena typen av partiklar innehåller ett första reagens och den andra typen av par- tiklar innehåller ett andra reagens, där de två reagensen icke är förenliga med var- andra och därför lagras skilda från varandra. När dessa remsor doppas i den lösning smiskall analyseras, uppsamlas en del av nämnda lösning av de absorberande materialen och reagensen komnær i kontakt ned det ämne som skall fästas. varvid färgreaktionen erhålles. Detta färgtest är således mycket snabbt men själva uppsamlingen är ganska oregelbunden på grund av den pulveraktiga naturen av det absorberande materialet och den okontrollerade storleken av agglomeraten, innehållande reagensen.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att så långt som möjligt undanröja ovan diskuterade nackdelar. Kortfattat skulle en ideal testremsa uppfylla följande 40 3ÛÜ0353-6 krav och inneha följande egenskaper: a) Exakt uppsamla en given mängd av den lösning som skall analyseras per yt- enhet av remsan. b) Uppnå en sådan uppsamling omedelbart under loppet av en enda åtgärd: ned- doppning och borttagning. c) Tillåta nära kontakt mellan ämnena som skall analyseras och reagensen, samt filtrera bort oönskade beståndsdelari lösningen, vilka kan interferera med den önskade analytiska reaktionen. d) Medföra en snabb och reproducerbar färgutveckling med god känslighet och god mätbarhet (visuell) eller spektrofotometrisk). e) Medföra god separation under lagring av reagensen, då de är inbördes oför- enliga. f) Vara lämplig för reagens av olika förenlighet, t.ex vattenlösliga reagens och fettlösliga reagens. g) Så mycket som möjligt undvika s,k "inerta" medel, vilka kan maskera eller _ interferera med färgreaktionen. h) Erbjuda enkla och ekonomiska tillverkningsvägar. i) Vara tillräckligt mekaniskt stark för att emotstä tillfälligt missbruk (brott genom avskalning). j) Ha lång hållbarhet, dvs reagensen skall vara väl skyddade och bevarade från avdunstning och nedbrytning.

Enligt föreliggande uppfinning tillhandahâlles en testremsa för halvkvanti- tativt eller kvalitativt påvisande av vattenlösliga föreningar bl.a biologiska vätskor genom färgreaktion med reagens inneslutna i sfäriska polymera mikrokapslar (beads) eller droppar, varvid de företrädesvis genomskinliga och sermipermeabla mikrokapslar- na, som innesluter reagensen tillsammans eller i skilda mikrokapslar beroende på om de är kompatibla eller ej och som är tillverkade av hydrofilt material, vilket till- låter diffusionen av reaktanterna för bildning av en färgreaktion inom mikrokapslar- na, är anbringade som en kontinuerlig vidhäftande beläggning på en inert, icke-absor- berande bärande basremsa, varigenom utrymmet mellan de hydrofila mikrokapslarna kom- mer att utfyllas med avsedd mängd provlösning. Basmaterialet eller basremsan kan ut- göras av t.ex ett ark eller en remsa av plast eller ett metallark, t.ex ett ark av aluminium eller glas. Dropparna är enkelt anbringade med hjälp av adhesion till den bärande remsan åtminstone på ena sidan utan någon form av dispersiv eller absorberan- de matris för inbäddning av dropparna, som i remsor enligt tidigare känd teknik, där nämnda matris vanligtvis tjänar som uppsamlingsmedel för de lösningar som skall tes- tas och även som framkallningsmedel för den önskade, färgade, analytiska reaktionen.

Föreliggande remsa uppvisar, trots avsaknaden av absorptionsmedel, en mycket exakt uppsamlingskapacitet. I detta sammanhang bör nämnas att absorptionskraften hos själva dropparna (eller hellre hos de hydrofila polymerer som utgör dropparna) inte har någon speciell inverkan, då det är avståndet mellan dropparna som är inrättat för att uppnå en prov- l0 l5 40 8000353-6 tagningsreaktion i lösningen som skall analyseras. Detta är möjligt då dropparna består av en hydrofil polymer, vilken vätes av nämnda lösning då remsan doppas ned däri och vilken därför omedelbart undandrar en konstant del av vätska per ytenhet tack vare kapilläreffekter. Således kan beroende på vätningsegenskaperna hos poly- meren som användes och beroende pá dropparnas medeldiameter, mängden uppsamlad vätska per ytenhet bestämmas och hållas under kontroll. Av denna anledning har dropparna företrädesvis en enhetlig medeldiameter och anbringas på remsan på ett enhetligt sätt, t.ex. som ett monoskikt. I ett sådant fall är avståndet mellan dropparna ett resultat av att dropparna placeras pà remsan huvudsakligen nära i förhållande till varandra för att mellan dropparna på remsan erhålla regelbundet fördelade tomrum. Summan av dessa tomrum utgör en konstant volym per ytenhet, vilken fylles av lösningen som skall analyseras då remsan doppas däri. Dropparna fästes pa remsan företrädesvis med hjälp av ett lim,men andra sätt som t.ex. att värmeuppmjuka ytan av bärarplasten just så mycket att dropparna direkt fäster på plasten är också tänkbara. Det bör här noteras att principen att placera droppar, sida vid sida på en remsa, för att uppnå en provsamlingsverkan i en vätska inte är ny i sig. Den har bl.a. angetts i det franska patentet med nr 2.l9l.734, vilket hänför sig till en remsa för detektering och uppskattning av föreningar genom att placera en droppe av en lösning med den aktuella föreningen på remsan och spektrofotometriskt bestämma färgutvecklingen vilken erhållits genom någon reaktion mellan reagens på remsan och föreningarna som skall analyseras. Remsan enligt detta franska patent består av åtminstone tre lager, vilka har oberoende funktioner: ett av lagren tjänar som stödjande medium för reagenset, det andra lagret tjänar som filter och det tredje yttre lagret tjänar som ett fördelningsmedium, för att jämnt sprida vätskan som skall analyseras över ytan av remsan. Denna effekt erhålles genom användningen av sfäriska droppar av glas eller polymerharts placerade sida vid sida som ett spri- dande lager och klädda på ytan med hjälp av ett lim. Men inte på något ställe i referensen nämnes att dylika droppar även kan innehålla de analytiska reagensen av remsan, såsom enligt föreliggande uppfinning.

Företrädesvis, enligt föreliggande uppfinning väljes storleken av dropparna och den kemiska naturen av polymererna så att den uppsamlade vätskan tränger genom dropparna med en hastighet som är tillräcklig för att en observerbar färg skall utvecklas inom en eller nägra minuter. Polymerenimâste således ha en lämplig struktur (semipermeabilitet) och under dessa förhållanden kommer de oönskade ämnen som möjligtvis finns närvarande i lösningen att filtreras bort, då polymeren är anpassad att tillåta de ämnena som skall analyseras att diffundera in i dropparna, samt att blockera andra ämnen med större molekylvikt (proteiner eller röda celler, vilka är beståndsdelar i blod). Nedan anges vissa data avseende placeringen av rea- gensen inuti dropparna.

Dropparna kan alla vara av samma slag och innehålla reagensen, samtliga 40 sooossa-6 . 6 blandade tillsammans om de är inbördes förenliga, eller separerade från varandra om nödvändigt; förfarandet för att uppnå denna separation kommer att beskrivas ' senare. Alternativt kan dropparna vara av olika slag, dvs. ett slag innehåller en av reagensen och ett annat slag innehåller ett annat reagens, där reagensen even- tuellt inte är förenliga med varandra. I detta fall kommer färgen att utvecklas endast i en sort av dropparna, vilket dock inte har någon betydelse eftersom dropparna kan göras tillräckligt små (ca 20-- 200 m) för att den färgade ytan skall framstå såsom enhetlig.

Normalt är, för erhâllandet av en god färgobservation, den polymer som an- vändes för dropparna företrädesvis genomskinliga och i ett Sådant fal] kan det för dropparna stödjande plastarket göras opakt, för att erhålla bättre reflektionsför- måga, t.ex. med titandioxid eller något annat opakt fyllmedel (BaC03, CaSO4, belägg- ningspigment för papper etc.). överraskande nog har man funnit att Ti02 även kan införlivas inuti kropparna, om så önskas, vilket är möjligt då reaktiongiäget 1 dropparna, vilket är det allra viktigaste för utvecklingen av färg, befinner sig nära periferin av dropparna, dvs. närvaron av det vita pigmentet i dropparna har ingen förstörande effekt på detektionen av färgen utan snarare ökar kontrasterna.

Polymeren i dropparna i föreliggande remsor kan väljas av flertalet vattenolös- liga hydrofila polymerer, förutsatt att de kan lösas upp i icke-blandbara organiska lösningsmedel av orsaker för vilka kommer att redogöras närmare nedan. Som sådana, kan produkter från cellulosa, hydroxiakrylpolymerer, polyalkylen-oxipolymerer och polyamider användas. Inom cellulosagruppen, kan cellulošaestrar och-etrar såsom metylcellulosa, etylcellulosa, butylcellulosa, cellulosaacetat, -propionat och -butyrat användas. Mängden reagens som kan införlivas i dropparna är oerhört varie- rande och beror naturligtvis på det speciella reagensets löslighet, den känslighet varmed testet önskas utföras och andra krav, som kommer att framgå för fackmannen från fall till fall. I exemplifierande syfte beskrives nedan föredragna utförings- former av uppfinningen.

Förfarandet för framställning av dropparna är framtagen ur kända förfaranden och mera speciellt från följande referens: T.M.S. Chang: "Microencapsulation of Enzymes and Biologicals", ur "METHDDS IN ENZYMÛLOGY", Vol. 44 (l976), sid. 2l0.

Den metod som användes är beroende av den speciella produkt som önskas. I ett spe- ciellt utförande av uppfinningen, framställdes en testremsa för bestämning av glukos i urin. De kemiska reaktioner som var inblandade var den klassiska oxidationen av glukos i närvaro av ett glukosoxidas och detektionen av väteperoxid, vilken fri- gjorts med hjälp av o-tolidin i närvaro av peroxidas. För framställning av dropparna, valdes en ester av cellulosa och den upplöstes i ät vattenolösligt organiskt lös- ningsmedel innehållande o-tolidin. Därefter emulgerades en buffrad vattenfas, inne- hållande enzymet, i denna organiska lösning, varvid små droppar av vattenfasen bildades inuti den organiska lösningen. Därefter dispergerades denna emulsion ånyo l0 l5 40 8000353-6 i en andra vattenfas, vilket resulterade i bildningen av droppar av polymer lösning i denna andra vattenfas, där varje droppe fortfarande innehöll, suspenderat däri, de små dropparna av den första vattenfasen. Därefter utsattes suspensionen för en avdunstning, varvid det organiska lösningsmedlet avlägsnades och g hårda cellulosa- esterdroppar, innehållande små vakuoler fyllda med vattenlösningen med enzymen er- hölls. 0-tolidin stannade kvar upplöst i själva polymerhartset och hölls således borta från att blandas med enzymet. Dropparna filtrerades, torkades och kalibrerades med lämplig masktäthetsstorlek, varvid dropparna inom området kring l00_mm valdes ut.

Därefter anbringades dropparna, såsom ett kontinuerligt monolager, på en bärarremsa av plast, med användning av ett bindemedel. Samtliga vanliga bindemedel i flytande form kan användas, t.ex. lösningar av karboximetylcellulosa (KMC), polyvinylalkohol (PVA), gummi arabicum, butadien-styrengummi (3M), m.fl. I syfte att binda dropparna till plastremsan, kan ett mycket tunt lager av bindemedelslösningen sprayas, eller på annat sätt anbringas, på remsan och dropparna fästes regelbundet därpå med an- vändning av måttligt tryck och en utjämnande slät yta. I detta fallet anbringades dropparna såsom ett monolager, där dropparna huvudsakligen rörde vid varandra på ett kontinuerligt sätt. Alternativt kan dropparna vätas med en utspädd lösning av binde- medlet och anbringas på plastremsan med en avskrapare eller något liknande verktyg.

I detta fallet är tjockare lager av droppar (dubbel- eller trippellager) tänkbara.

Vid användningen doppas remsorna ner i lösningen innehållande glukos och tages omedelbart ut ur lösningen igen. Därefter får remsan vila en viss given tid, tillräckligt lång för att tillåta den lösning som är instängd i omrâdet mellan dropparna, att tränga in i själva dropparna och nä vakuolerna, vilka innehåller enzymerna. Där sker så reaktionen och det syre, som frigöres då peroxidas verkar pä H202, vilken erhållits genom oxidationen av glykos, kommer att omvandla den o-tolidin, som finns i närheten av vakuolerna, till den önskade blåa färgen. För att färgen skall kunna utvecklas inom en, praktiskt sett, skälig tid, säg l min., bör det djup, till vilket föreningen som skall analyseras måste tränga in i polymeren för att huvudsakligen nä reagensen i dropparna, vara en bråkdel av ljum till l_um. Således bör tjockleken av det halvgenomträngliga membranet som skyddar vakuolerna, vilka är placerade inom räckhåll utifrân, företrädesvis hälla sig inom omrâdet kring 0,l/um till l /um.

I ett annat utförande framställdes en remsa under användandet av tvâ sinsemellan oförenliga, fettlösliga reagens. I detta fallet framställdes ett första slag av droppar genom att en polymer och ett första reagens upplöstes i ett lämpligt icke- vattenlösligt lösningsmedel. Denna lösning dispergerades i en vattenfas och utsattes därefter för indunstning, vilket gav en vattendispersion av polymerdroppar av huvud- sakligen enhetlig storlek (ca 60/um), vilka droppar innehöll det första reagenset i ett upplöst tillstånd. Detta första slags droppar filtrerades därefter, torkades och kalibrerades. Det andra slaget av droppar framställdes på identiskt vis, men i dessa l0 l5 40 isooosss-6 D8 införlivades det andra reagenset. Efter torkning, blandades båda sorterna av droppar i sådana proportioner att lämpliga mängder av reagens var närvarande i blandningen, varefter denna användes för att bereda testremsorna såsom beskrivits ovan enligt det första utförandet. Användningsområdet för remsorna enligt dessa bägge utföranden kommer nedan att beskrivas mera detaljerat.

Vid framställningen av dropparna enligt ovan, kan många lösningsmedel, vilka är olösliga i vatten men har god upplösningsförmâga för de valda hydrofila polymer- erna användas; exempelvis kan klorinerade lösningsmedel som metylenklorid, kloroform och trikloreten användas, såväl som estrar och etrar såsom etylacetat, butylacetat, dietyleter m.fl. I allmänhet måste dylika lösningsmedel vara tillräckligt flyktiga för att kunna avlägsnas genom indunstning under mild uppvärmning och luftgenom- blåsning eller genom sänkning av trycket. _ För utförande av emulsions- och dispersionsstegen enligt ovan rekommenderas starkt användningen av ett emulgeringsmedel. Lämpliga är de mest vanliga, kommer- siellt tillgängliga, emulgeringsmedlen med neutrala egenskaper, t.ex. natriumlauryl- sulfat, "Tween 20" (tillverkad av ICI), m.fl.

Av ovan gjorda-beskrivning framgår att syftena med föreliggande uppfinning huvudsakligen uppfylles med hjälp av komponenterna i föreliggande remsa. Således, tack vare närvaron av hydrofila droppar, vilka arrangeras regelbundet på en icke porös, vattenogenomtränglig, bärande plastfilm, erhålles en korrekt och snabb upp- samling av den vätska som skall analyseras. Dessutom komner reagensen, tack vare den intima polymerstrukturen vilken är ett resultat av framställningsförfarandet, att under lagringen vara effektivt avskilda och skyddade (detta är Spefilßllt Vlkïlgt då en hydroperoxidoch en oxiderbar indikator lagras tillsammans) trots att dropparna tillåter nära kontakt mellan föreningarna som skall analyseras och reagensen i dropparna och samtidigt utesluter oönskade ämnen. Vidare är koncentrationen av reagen- sen nära ytan av dropparna tillräcklig för erhàllandet av en användbar färgutveck- ling, med ett inträngningsdjup av den lösning som skall analyseras som endast är en liten bråkdel av den totala tjockleken av dropparna. Det bör noteras att även med avseende på ytkontaktförhâllanden, föreligger en väsentlig skillnad mellan tidigare känd teknik och föreliggande uppfinning. I tidigare känd teknik är den observerbara, reagensinnehållande ytan en slät yta, vars absorptionskraft och reflektivitet har samband med dess plana dimensioner. I föreliggande uppfinning, är ytan inte slät utan består av på varandra följande sfäriska droppar, vars totala yta är lika med 4 nr? (där r är dropparnas radie). Det kan enkelt räknas ut att förhållandet mellan ytan av dropparna och den yta som stödjer dropparna är n, dvs. den tillgängliga ytan är mer än 3 ggr så stor som den yta som är tillgänglig i remsorna enligt tidigare känd teknik. Ur färgobservationssynpunkt erhålles också att den observerbara ytan från en grupp av droppar på en slät yta, vilken är synlig utifrån, är ca l,4 ggr större än själva den släta ytan; således ökas den observer- l0 l5 40 aoonssz-6 bara färgdensiteten och känsligheten i jämförelse med remsorna enligt tidigare känd teknik.

Det bör också noteras att i de flesta testremsutföranden enligt tidigare känd teknik, måste det fuktighetsabsorberande materialet som användes för uppsamling av den lösning som skall analyseras, samtidigt hysa föreningen som skall detekteras, färgämnet och de andra reagensen. Vidare har sådana material en stor inre kontakt- yta och saknar i allmänhet homogenitet då de inte kan förena två motstäende egen- skaper särskilt väl: en hög absorptionskapacitet för vätskan som skall analyseras och en utjämnande verkan pä de olika inblandade kemikaliernas migrationshastigheter (inga kromatografiska effekter). Alla sådana nackdelar har eliminerats med föreliggan- de uppfinning. Dessutom, enligt uppfinningen, är reproducerbarheten i färgutveck- lingen god på grund av de relativt koncentrerade, med litet mellanrum, färgade ställena och undvikande av diffusion av färgen på utsidan av dropparna. Ett ytter- ligare gynnsamt drag är_att den fiberhaltiga, inbäddade matrisen i remsor enligt tidigare känd teknik fullständigt undertryckes, varvid undvikes de differentiella diffusionseffekterna vilka hänför sig till dylika fiberhaltiga materials kromato- grafiska egenskaper. Slutligen kan remsorna enligt föreliggande uppfinning till- verkas mycket enkelt och ekonomiskt eftersom de endast omfattar två uppbyggande delar, dvs. dropparna och de bärande remsorna, där dropparha är utförda i en stark och motstândskraftig struktur jämfört med de bräckliga mikrokapslarna enligt tidi- gare känd teknik. I dropparna enligt föreliggande uppfinning, är reagensen väl skyddade utifrån och föreliggande remsor har mycket lång livslängd utan att därvid deras analytiska egenskaper förändras.

Följande exempel illustrerar uppfinningen.

Exempel l 2 g cellulosatriacetat och 0,25 g o-tolidin upplöstes i 50 ml CH2Cl2 med 0,l g av ett ytaktivt medel ("Tween 20" från ICI = polyoxieten~sorbitanmonolaurat) för att bilda en polymer lösning (lösning A).

En vattenlösning framställdes genom att blanda samman 3,5 ml av en glukosoxi- daslösning med l000 I.U./ml, 60 mg peroxidas (60 I.U./mg) och l85 mg av en citrat- buffert (pH 4,7). Detta gav lösningen B.

Lösning B emulgerades därefter i lösning A under följande förhållanden: temperatur: rumstemperatur, omrörning: 2000 varv/min, tid: 20 min. Emulsionen bestod av små droppar av lösning B (l-5,um) suspenderad i den polymera, organiska lösningen.

Därefter dispergerades denna emulsion i en andra vattenfas, vilken bestod av 460 mg av natrium-laurylsulfat i 800 ml av en 0,l M vattenhaltig acetatbuffert, varvid omrördes på så sätt att erhâllandet av alltför små partiklar undveks. Denna disper- sion bestod sáledes av droppar av den organiska lösningen A suspenderade i den andra fasen, varvid varje droppe innehöll, jämnt fördelade, små droppar av lösningen B.

Dispersionen upphettades under omrörning till 35°C under 30 min., medan luft 40 Éaooozsá-en blåstes mot ytan. CH2Cl2 drevs fortlöpande av, vilket resulterade i bildningen av fasta polymerdroppar innehållande o-tolidin och lösning B med enzymerna, såsom små vakuoler instängda i den mikroporösa stomen av dropparna. Därefter avlägsnades CH¿Cl2 fullständigt (vilket kan säkerställas genom lukten av lösningsmedlet), droppar- na iöltrerades och torkades. De undersöktes under mikroskop och visade sig ha diamet- rar i omrâdet kring ca 40 till l00/mn, med vakuolerna placerade nära omkretsen fullt jsynliga, varvid det membran som separerade dessa yttre vakuolerna från utsidan endast hade en tjocklek av en bråkdel av en mm. Detta illustreras av bifogade foto- egrafier som tagits med ett svepelektronmikroskop och där: Fig. l visar dropparna vid 200 ggr förstoring och ger dess storleksfördelning.

Fig. 2 är en förstoring av en av dropparna i fig, l.

Fig. 3 är en förstoring av en del av en av dropparna i fig. l och visar när- varon av vakuolerna vilka normalt är fyllda med lösningen B. Naturligtvis har de fles- * ta vakuolerna, vilka visas i figurerna, kollapsat på grund av det tryck som ut- vecklas på dess insida när de utsättes för vakuumet i elektronmikroskopet.

Dropparna kalibrerades med en masktäthet för att utvälja dropparna med en diameter i området av 100/tm. Därefter anbringades de utvalda dropparna enhetligt a som ett kontinuerligt monolager (där varje droppe huvudsakligen rörde vid sina grannar) på en självhäftande plastremsa (av typ "EGAFIX" tillverkad av R. Burkhart, Luzern, Schweiz) för att erhålla en remsa enligt uppfinningen.

De så erhållna remsorna doppades under l sek i lösningar av glukos av olika koncentrationer (visas nedan) och färgen tilläts utvecklas under l min, varefter en färgavläsning gjordes. Färgen erhölls på grund av oxidationen av o-tolidin genom den peroxidaskatalyserade verkan av HZOZ, vilken frigjorts genom den glukosoxidaskata- lyserade oxidationen av glukos, varvid frambringades en blå indikatorfärg. Resultaten visas nedan: Glukoslösningar Remsornas färg (koncentration g/l) l mycket svagt blå 2,5 ljusblå medelblått kraftigt blå Det är viktigt att notera att för att erhålla reproducerbara resultat, måste färgavläsningarna göras vid vissa givna intervall, efter det att remsorna ahdoppats ned, eftersom vid tiden för avläsningen är reaktionen ännu inte avslutad och en del av glukosen har fortfarande inte förbrukats.

Ovan beskrivna remsor var mycket stabila när de lagrades under normala torra förhållanden. Den membranaktiga väggen av vakuolerna som var halvgenomtränglig, gjorde att enzymerna effektivt instängdes däri på grund av asin molekylvikt, vilken 40 Hemoglobin konc. (mg/l) 8000353-6 ll var alltför hög för att enzymerna skulle kunna filtreras ut genom nämnda halv- genomträngliga membran.

Exempel 2 Droppar framställdes såsom beskrivits i exempel l men o-tolidin uteslöts i polymerlösningen. Denna indikator tillsattes efteråt till de torkade dropparna genom impregnering av dropparna med en lösning av o-tolidin i toluen och påföljande torkning. Därefter behandlades testremsorna med dropparna såsom beskrivits i exempel l och de uppförde sig på identiskt vis under användningen i fält.

Exempel 3 Förfarandet enligt exempel l upprepas med följande variationer: lösning A av polymeren gjordes av 4 g cellulosatriacetat, 0,5 g "Tween 20", l g Ti02 och 50 ml CH2Cl2. Dropparna framställdes och användes för att tillverka testremsorna exakt såsom i exempel l. När remsorna testades med glukoslösningar gav de lika goda resul- tat men med en ökad färgkontrast.

Exempel 4 En första organisk lösning framställdes genom att blanda samman: CH2Cl2 25 ml; natriumlaurylsulfat 0,5 g; cellulosatriacetat 2 g; kumen-hydroperoxid 0,5 g; 6-metoxikinolin 0,l6 g; etylenglykol (stabilisator) 0,5 g.

Denna lösning emulgerades i 400 ml 0,l M acetatbuffert (pH 5,8) innehållande 0,5 g natrium-laurylsulfat; därefter indunstades lösningen såsom beskrivits i exempel l för att ge droppar av en första typ (C), vilka filtrerades och torkades.

En andra typ av droppar (D) framställdes på samma sätt, förutom att som den organiska lösningen användes följande blandning: CHZCIZ 25 ml; cellulosatriacetat l g; natriumlaurylsulfat 0,5 g; o-tolidin 0,25 g. Den vattenhaltiga dispersionsfasen var samma som ovan.

Därefter framställdes remsor såsom beskrivits i exempel l med användandet av en l/l-blandning (viktsförhàllanden) av dropparna C och D. De så framställda test- remsorna testades för att bestämma spår av blod i vattenlösningar. Testmekanismen är samma som den som beskrivits i samband med US patentskriften 3.092.463 och baseras på förmågan hos vissa av blodets komponenter (hemoglobinbeståndsdelar) att katalysera överförandet av syre från peroxiden till o-tolidin med följande bildning av den blåa färgen. Följande resultat erhölls: Remsans färg (Efter l min.) 0,923 svagt blå 6,l6 blå Exempden ovan är inte begränsande eftersom många andra typer av remsor kan framställas för mätning av andra biologiskt producerande ämnen såsom galaktos, kolestorol, ketonföreningar och bilirubin. Vidare kan remsorna användas inom många andra områden där en snabb test av vattenlösningar är viktig, t.ex. kemiska synteser, 40 .aooosss-6 0 a plätering, ytbearbetning m.m. g Remsor med en typ av droppar på ena sidan och en annan typ på den andra sidan för selektiv mätning av tvâ olika föreningar i en lösning kan också enkelt fram- ställas.

En faktor är mycket viktig och bör alltid noggrant beaktas vid framställning av droppar, lämpliga för användning enligt föreliggande uppfinning, i det fall då dropparna innehåller en vattenlösning av en vattenlöslig förening. För att vara inom snabbt räckhåll för den lösning som skall analyseras, måste vakuolerna som innehåller nämnda vattenlösning vara mycket nära dropparnas yta, men inte alltför nära eftersom då kan inte vakuolerna stå mot en tillfällig bristning. Med andra ord måste den vägg somfseparerar vakuolerna från det yttre vara så stark att den lever upp till de uppställda krav för mekanisk styrka som krävs för dropparna enligt föreliggande uppfinning, men tillräckligt tunn för att tillåta diffusion av de för- eningar som skall analyseras inonien skälig tid. En sådan väggtjocklek kan faktiskt kontrolleras genom en korrekt justering av de osmotiska faktorerna hos a) lösningen som skall införlivas i dropparna och b) den vattenfas som tjänar som slutlig dis- persionsfas vid framställningen av dropparna. Dessa osmotiska faktorer ligger inom acceptabla gränser då förhållandet mellan molkoncentrationen av ingredienserna av den första vattenfasen och molkoncentrationen av ingredienserna av den andra vatten- fasen är mellan ca l/5:5/l.

Under den lägsta gränsen, kan inneslutningsutbytet bli för lågt och vakuolerna vara fördelade alldeles för långt från dropparnas omkrets, vilket kan resultera i att färgreaktionen utvecklas alldeles för långsamt för att vara praktisk. Då, å andra sidan, den övre gränsen överskrides, är det risk att den yttre väggen av vakuolerna blir alldeles för tunn (det yttre vattnet tenderar att tränga in i dropparna för att späda ut den instängda lösningen) och vakuolerna kan praktiskt taget brista under framställning eller under lagring med påföljande förlust av en del av de inkapslade produkterna.

Exempel 5 En organisk lösning (0) av cellulosatriacetat framställdes genom upplösning, under omrörning, av 2 g av den granulerade polymeren i 25 ml CH¿Cl¿ innehållande 0,2 g "Tween 20" och 0,25 g o-tolidin. Därefter bereddes en första vattenfas Wl genom uppmätning och successiv inblandning av 3,5 ml glukosoxidaslösning (1000 Internationella Enheter/ml), 60 mg peroxidas, l33,8 mg trinatriumcitrat och 5l,4.mg citronsyra, där de tvâ sistnämnda ingredienserna först blandades tillsammans i torrt tillstånd, innan de upplöstes. Därefter emulgerades den första vattenfasen Wl i den organiska lösningen vid rumstemperatur, meahög hastighet tills en jämn emulsion Wl/0 erhölls (droppar av vattenfasen, ca l - 5/nn, dispergerade i den organiska lösningen). Under detta steg kan kylning vara nödvändigt för att undvika upphettning och eventuell denaturering av enzymen. m 40 8000353-6 l3 Under tiden framställdes de tre följande andra vattenfaslösningarna (W2a, N+b och W2c) genom upplösning av följande ingredienser i 350 ml av destillerat vatten.

Ingredienser Egg Egg Egg Trinatriumcitrat 6,69 g l3,38 g (0,l3M) 26,76 g Citronsyra 2,8 g 5,4 g (0,07M) l0,8 g (NH4)2so4 2,31 g 4,62 g (oensn) 9,24 g Natriumlaurylsulfat 202 mg 202 mg 202 mg Vatten till 350 ml 350 ml 350 ml Därefter dispergerades emulsionen Wl/0 i W2b genom sakta tillsats av wl/0, och snabb omrörning, till w2b.

Efter avslutad tillsättning, fortsattes omrörningen och temperaturen höjdes gradvis till 40°C, alltmedan en ström av kväve läts passera över ytan av den omrörda dispersionen tills metylenkloriden avdunstats. Den erhållna suspensionen av polymer- droppar filtrerades och torkades och den avfiltrerade vattenfasen analyserades på kvarvarande icke-inneslutet enzym (glukosoxidas) på vanligt sätt. Man fann att endast 3 % av den ursprungliga glukosoxidasen inte inneslutits i dropparna, vilket betecknas som hög inneslutningseffektivtet.

Ovan nämnda dispersionssteg upprepades med nya mängder Wl/0-emulsioner och vattenfaserna W2a och W2c. I dessa fall var inkapslingsutbytena för enzymerna 72 % resp. 82 %. Detta tyder på att bäst resultat erhålles dä buffertkoncentrationerna i den första och den andra vattenfasen är ungefär lika.

Exempel 6 Framställning av en testremsa för bestämning av närvaron av katalas i komjölk Närvaron av katalas i mjölk från idisslare är ett tecken på sjukdom och en enkel metod för detektion av enzymet kan hjälpa till att upptäcka sådana sjukdomar i ett tidigt, lättbotat stadium. De reaktioner som är inblandade i föreliggande remsa är följande: splittring av mjölkens laktos till galaktos med galaktosidas.

Oxidation av galaktos vid katalytisk närvaro av galaktosoxidas, varvid erhålles väteperoxid. Nedbrytning av H202 till vatten och 02 av den katalas som eventuellt är närvarande. Bestämning av återstående H202 genom dess verkan på o-tolidin i när- varo av peroxidas (samma färgreaktion som i föregående exempel). 4 g cellulosatriacetat och 0,02 g o-tolidin upplöstes i 50 ml CH2Cl2 med 0,4 g “Tween 20". Lösningen uppdelades i tvâ lika delar om vardera 25 ml, kallade El och E2.

Därefter bereddes en första vattenfas (Fl) genom upplösning av l0 I.U. kata- lasfri ß-galaktosidas och l50 I.U. galaktasfri ß-galaktosoxidas i 3,5 ml 0,l M fos- fatbuffert (pH 7,5) innehållande en liten mängd magnesiumklorid (0,003 M MgCl2).

En annan vattenfas (FZ) bereddes,identiskt,med l00 I.U. peroxidas i 3,5 ml av samma fosfat-MgCl2-buffert. Därefter emulgerades Fl med El under samma förhållanden l5 eoøfissß-6 14 som beskrivits i exempel l vid emulgering av B i A; och FZ emulgerades på identiskt vis med E2.

Därefter blandades Fl/El och F2/E2 milt tillsammans (för att undvika att mikrodroppar av El kollapsar med de av E2) och blandningen dispergerades i en tredje vattenfas G, vilken framställdes genom upplösning.av följande ingredienser: Natriumlaurylsulfat 0,2; ammoniumsulfat 4,6 g; 0,l M fosfatbuffert (pH 7,5) ~350 ml. Den erhållna dispersionen utsattes för indunstning med kvävgas såsom be- skrivits i exempel 4, varefter polymerdropparaerhölls (50 - l2O m), innehållande :små vakuoler (l - 5 nm) av två slag. Det första slaget innehöll den första vatten- fasen fl och det andra slaget innehöll den andra vattenfasen F2. Vakuolerna av de tvâ slagen var homogent och statistiskt fördelade i omkretsen av dropparna.

Därefter kalibrerades dropparna och anbringades på ytan av en vidhäftande remsa såsom i föregående exempel.

När remsorna användes för att testa mjölk av friska eller infekterade djur, tilläts den laktos som är upplöst i mjölken att reagera med«enzymerna i Fl, varvid H202 frigjordes. Därefter vandrade lösningen innehållande katalas och H202 från den första typen av vakuoler till den andra typen där den H202, som ännu inte förstörts av katalas, oxiderade tolidin, på grund av närvaron av katalas. Eärgutvecklingen efter l min. var således omvänt proportionell mot den ursprungliga koncentrationen av katalas i den infekterade mjölken. För de friska korna, var färgen mycket kraftigt blå. För kor med kraftig mastitis, förblev remsorna färglösa eller mycket svagt blå.

Claims (6)

l0 l5 20 25 30 35 15 8000353-6 PATENTKRAV
1. l. Testremsa för halvkvantitativt eller kvalitativt pâvisande av vattenlösliga föreningar bl.a. biologiska vätskor genom färgreaktion med reagens inneslutna i sfäriska polymera mikrokapslar (beads) k ä n n e t e c k n a d av att de företrädes- vis genomskinliga och sermipermeabla mikrokapslarna, som innesluter reagensen till- sammans eller i skilda mikrokapslar beroende på om de är kompatibla eller ej och som är tillverkade av hydrofilt material, vilket tillåter diffusionen av reaktan- terna för bildning av en färgreaktion inom mikrokapslarna, är anbringade som en kontinuerlig, vidhäftande beläggning på en inert, icke-absorberande bärande bas- remsa, varigenom utrymmet mellan de hydrofila mikrokapslarna kommer att utfyllas med avsedd mängd provlösning.
2. 2. Testremsa enligt krav l, omfattande reagens varav minst ett är vattenlös- ligt och varav ett är icke-vattenlösligt, k ä n n e t e c k n a d av att de vatten- förenliga reagensen inneslutes i mikrokapslarna med känd teknik så att det bildas mikrovakuoler fyllda med lösningen av vattenlösliga reagens, medan de icke-vatten- lösliga reagensen är närvarande i upplöst form i själva polymeren.
3. 3. Testremsa enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a d av att mikrovakuolerna är separerade från den yttre omgivningen med hjälp av ett yttre membran av 0,l - l}¿m tjocklek.
4. 4. Testremsa enligt krav l, k ä n n e t e c k n a d av att polynmren i mikro- kapslarna är genomskinlig.
5. 5. Förfarande för framställning av en testremsa enligt krav 2, där kapslarna bildas med hjälp av den dubbla emulsionstekniken, omfattande _ a) emulgering av en första vattenlösning av de vattenförenliga reagensen i en lösning innefattande en polymer, och ett icke-vattenlösligt, organiskt lösningsmedel, b) dispergering av den erhållna emulsionen i en andra vattenfas, varvid er- hâlles kapslar av den första emulsionen dispergerade i den andra vattenfasen, c) utsättande dispersionen för indunstningsförhållanden för att indunsta lös- ningsmedlet i den organiska lösningen, varvid erhålles en dispersion i den andra vattenfasen av polymerkapslar innehållande mikrovakuoler, vilka är fyllda med den första lösningen av vattenlösliga reagens, d) filtrering och torkning av kapslarna, k ä n n e t e c k n a d av att kapslarna anbringas som en kontinuerlig beläggning på en plastremsa med hjälp av ett bindemedel, där de icke-vattenlösliga reagensen upplöses i polymeren i kapslarna antingen genom tillsats av reagensen till polymer- lösningen i steg a) eller genom att låta kapslarna komma i kontakt med reagensen innan eller efter det att de anbringas på plastremsan.
6. 6. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att förhållandet mellan den totala molkoncentrationen av ingredienserna i den första vattenfasen lig- ger inom omrâdet mellan l:5 till 5:l.