DE3883189T2

DE3883189T2 - Trocken-flüssiges analytisches Element.

Info

Publication number: DE3883189T2
Application number: DE88121002T
Authority: DE
Inventors: Noriyuki Hosoi; Teppei Ikeda; Shigeru Nagatomo; Mitsutoshi Tanaka
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1987-12-18
Filing date: 1988-12-15
Publication date: 1994-01-05
Anticipated expiration: 2008-12-16
Also published as: DE3883189D1; EP0322669B1; EP0322669A1; US5122451A

Description

Die Erfindung betrifft ein trockenes chemisches Analysenelement zur Verwendung bei der Bestimmung einer spezifischen Substanz in Körperflüssigkeiten, wie Blut.
Die quantitative Analyse verschiedener in Körperflüssigkeiten vorhandener Metaboliten, z.B. Glukose, Bilirubin, Harnstickstoff, Harnsäure, Cholesterin, Lactatdehydrogenase, Creatinkinase, Glutamatoxalacetattransaminase (GOT) und Glutamatpyruvattransaminase (GPT) ist von klinischer Bedeutung und ist unverzichtbar bei der Diagnose von Krankheiten, der Überprüfung medizinischer Behandlung und der Überwachung der Prognose. In der klinisch chemischen Untersuchung von Blut oder dgl. als Probe ist es zweckmäßig, daß eine Untersuchung mit hoher Genauigkeit durchgeführt wird, bei der nur eine kleine Menge einer flüssigen Probe verwendet wird. Ein nasses Analysenverfahren, bei dem eine Reagenslösung verwendet wurde, wurde bisher verwendet. Jedoch ist ein solches nasses Analysenverfahren nicht schnell.
Eine trockene chemische Analyse, d.h. ein klinisches Analysenverfahren, bei dem ein Analysenreagenssystem, das in einem wasserpermeablen Träger in einem im wesentlichen trockenen Analysenelement inkorporiert ist, verwendet wird, wie ein Teststück oder ein mehrschichtiges Analysenelement, war bekannt. Das trockene chemische Analysenverfahren ist hinsichtlich der Leichtigkeit der Verwendung, der Minimierung der benötigten Menge an zu untersuchender Probe und der Geschwindigkeit der Analyse beser als das nasse Analysenverfahren. Mit anderen Worten, die Verwendung eines trockenen, mehrschichtigen Analysenelements erlaubt eine sehr präzise, einfache und rasche Analyse einer kleinen Menge einer flüssigen Probe. Ein solches trockenes, mehrschichtiges Analysenelement ist in JP- B-53-21677 (der hier verwendete Ausdruck "JP-B" bedeutet eine geprüfte japanische Patentpublikation) und JP-A-55-164356 und 60-222769 (Der hier verwendete Ausdruck "JP-A" bedeutet eine ungeprüfte, veröffentliche, japanische Patentanmeldung. In Englisch geschriebene Patente, die den in dieser Anmeldung zitierten japanischen Patentpublikationen entsprechen, sind nachstehend angegeben.) beschrieben.
Ein typisches, trockenes, mehrschichtiges Analysenelement besteht aus einem transparenten Träger, einer Reagensschicht, einer reflektierenden Schicht und einer Ausbreitungsschicht. Die auf einen wasserundurchlässigen, transparenten Träger (Unterzugsfilm aus Plastik) beschichtete Reagensschicht umfaßt ein Reagens, das mit der in der flüssigen Probe enthaltenen und zu bestimmenden Komponente reagiert und das eine Farbe bei einer optischen Dichte entsprechend der Menge der Komponente entwickelt. Die reflektive Schicht ist so angepaßt, daß sie verhindert, daß auf die Reagensschicht einfallendes Licht die Ausbreitungsschicht erreicht, so daß die optische Messung der Reagensschicht nicht von der punktförmig auf der Ausbreitungsschicht aufgebrachten, flüssigen Probe beeinträchtigt wird. Die Ausbreitungsschicht ist so angepaßt, daß sie die punktförmig aufgebrachte, flüssige Probe über eine fläche, die im wesentlichen der Menge der flüssigen Probe proportional ist, ausbreitet. Wenn ein solches trockenes Analysenelement zur quantitativen Bestimmung verwendet wird, wird eine flüssige Probe, wie Vollblut, auf die Oberfläche der Ausbreitungsschicht in einer festgelegten Menge aufgebracht. Das so über die Ausbreitungsschicht ausgebreitete Blut wandert durch die reflektierende Schicht und erreicht die Reagensschicht, wo es mit einem Reagens unter Farbentwicklung reagiert. Nach Auftropfen der flüssigen Probe auf die Ausbreitungsschicht wird das Analysenelement bei einer vorbestimmten Temperatur für eine geeignete Zeitspanne gehalten, um die Reaktion zur Farbentwicklung ablaufen zu lassen. Die optische Reflektionsdichte der Reagensschicht wird von der Trägerseite bei einem festgelegten Wellenlängenbereich bestimmt. Die quantitative Bestimmung wird von der optischen Reflektionsdichte auf der Basis einer vorbestimmten Kalibrationskurve durchgeführt.
Wie in der JP-A-58-70163 beschrieben, kann, wenn eine Reagensschicht aus einer hydrophilen Verbindung mit hohem Molekulargewicht, wie Gelatine, verwendet wird, eine Komponente mit hohem Molekulargewicht, wie ein Protein (z.B. Albumin), verschiedene Enzyme, die auch Proteine sind, Polysaccharide oder eine hydrophobe Komponente, wie Cholesterin, Triglyceride und Bilirubin, nicht in die Reagensschicht diffundieren, wodurch ihre Reaktion mit dem Reagens unmöglich wird. So kann eine solche Komponente nicht nachgewiesen werden.
Als Mittel zur Lösung eines solchen Problems wurde ein Versuch unternommen, bei dem man eine Komponente mit hohem Molekulargewicht oder eine hydrophobe Komponente in der Ausbreitungsschicht reagieren ließ. Gemäß diesem Versuch läßt man die Komponenten in der Ausbreitungsschicht ohne Diffusion in die Reagensschicht reagieren. Bei einer form dieses Verfahrens diffundiert ein Farbstoff, der in der Reagensschicht und/oder Ausbreitungsschicht gebildet wurde, durch die lichtreflektierende Schicht in eine unter der lichtreflektierenden Schicht (in der Nähe des Trägers) angebrachte Detektionsschicht und wird dann in der Detektionsschicht nachgewiesen. Bei einer anderen Form diffundiert ein Zwischenprodukt mit niedrigem Molekulargewicht, das durch die Reaktion in der Ausbreitungsschicht gebildet wurde, in die Farbreagensschicht, die unter der Ausbreitungsschicht (in der Nähe des Trägers) angebracht ist, wo es nachgewiesen wird. Jedoch ist das frühere Verfahren dahingehend nachteilig, daß, da der Teil eines Farbstoffs, der in die Detektionsschicht diffundierte, niedrig ist, die Analysenempfindlichkeit unzureichend ist. Das zuletzt genannte ist dahingehend nachteilig, daß es gegen Störungen von störenden Komponenten in der Probenflüssigkeit anfällig ist. Beispiele für das frühere Verfahren umfassen ein Verfahren, bei dem ein in der Ausbreitungsschicht gebildeter Farbstoff ohne Diffusion in andere Schichten nachgewiesen wird. Bei diesem Verfahren werden Schichten außer der Ausbreitungsschicht weggelassen. Jedoch ist dieses Verfahren dahingehend nachteilig, daß es schwierig ist, Vollblut zu analysieren, weil der Hintergrund variiert.
Um den Nachweis einer Komponente mit hohem Molekulargewicht oder einer hydrophoben Komponente zu ermöglichen, wurde ein trockenes, mehrschichtiges Analysenelement, umfassend eine Reagensschicht aus einer körnigen Struktur aus gebundenen Polymerkörnchen, in der JP-A-55-90859 und 58-70163 vorgeschlagen. Jedoch zeigt eine solche verbesserte Reagensschicht bestimmte Nachteile. Wenn eine lichtreflektierende Schicht oder dgl. zwischen der Ausbreitungsschicht und der Reagensschicht angebracht ist und die Diffusion einer Komponente mit hohem Molekulargewicht oder einer hydrophoben Komponente inhibiert, wird die Analyse dieser Komponenten erschwert.
Als lichtreflektierende Schicht eines trockenen, mehrschichtigen Analysenelements wurde eine Schicht aus Körnern aus anorganischem Material, wie Titandioxid oder Bariumsulfat, in Dispersion mit einer hydrophilen Verbindung mit hohem Molekulargewicht als Bindemittel in der US-A- 3 992 158 und 4 042 335 (JP-B-58-18628) beschrieben. In einer solchen Schicht ist, wenn das Verhältnis (Volumen oder Gewicht) des Bindemittels zu hoch ist, die Permeation einer Komponente mit hohem Molekulargewicht oder einer hydrophoben Komponente schwierig zu erzielen. Wenn im Gegensatz das Verhältnis des Bindemittels zu niedrig ist, sind die mechanischen Eigenschaften der Schicht schlecht, obwohl die Permeation einer Komponente mit hohem Molekulargewicht oder einer hydrophoben Komponente durch die Schicht möglich ist. Die Schicht wird extrem spröde und neigt zum Brechen, was eine Trennung der Körnchen verursachen kann.
Die DE-A-31 50 102 beschreibt ein analytisches Element, umfassend eine Reagens- und eine Ausbreitungsschicht und eine oder mehrere dreidimensionale Gitterschichten mit einem Porenvolumen von 25 bis 85 %. Das Gitter ist aus 1 bis 350 um großen Polymerkörnern, die durch reaktive Endgruppen an den Polymerkörnern miteinander verbunden sind, aufgebaut. Die Gitterschichten sind für Verbindungen mit hohem Molekulargewicht permeabel.
Die EP-A 0 013 156 beschreibt eine analytische Elementschicht, umfassend organische Polymerteilchen, die an ein Gitter durch einen Klebstoff (Bindemittel), das auf der Oberfläche der Teilchen konzentriert ist, gebunden sind.
Aus der US-A-2 800 458 ist bekannt, daß ausgewählte Materialien, z.B. lichtreflektierende Substanzen, in ölhaltige Mikrokapseln verkapselt werden können.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein trockenes, mehrschichtiges Analysenelement bereitzustellen, das eine lichtreflektierende/filternde Schicht umfaßt, die eine leichte Permeation einer Komponente mit hohem Molekulargewicht oder einer hydrophoben Komponente erlaubt und kein Brechen oder Trennen der Körner erleidet.
(In der vorliegenden Erfindung bedeutet "eine lichtreflektierende/filternde Schicht" eine Funktion, Licht zu brechen und/oder eine Funktion, Licht zu filtern.)
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein trockenes, mehrschichtiges Analysenelement bereitzustellen, das eine lichtreflektierende/filternde Schicht umfaßt, die feste Körnchen eines lichtreflektierenden Materials, wie Titandioxid, oder ein lichtabsorbierendes Material, wie Kohlenstoff, enthält, aber eine leichte Permeation einer Komponente mit hohem Molekulargewicht oder hydrophoben Komponente erlaubt und kein Brechen oder Trennen der Körner erleidet.
Diese Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden durch ein trockenes, mehrschichtiges Analysenelement gelöst, das in dieser Reihenfolge mindestens eine wasserpermeable, poröse Reagensschicht, eine wasserpermeable, lichtreflektierende/filternde Schicht und eine wasserpermeable, poröse Ausbreitungschicht auf einem wasserundurchlässigen, transparenten Träger enthält, wobei eine Reagenszusammensetzung mit der Fähigkeit zur Erzeugung einer optisch nachweisbaren Substanz in Gegenwart einer nachzuweisenden Komponente vollständig in der Reagensschicht eingearbeitet ist oder ein Teil davon in die Reagensschicht eingearbeitet ist und ein anderer Teil in eine andere der wasserpermeablen Schichten eingearbeitet ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die lichtreflektierende/filternde Schicht porös ist und aus Mikrokapseln mit einem Kern, der lichtreflektierende/filternde Körnchen, die in einem Öl dispergiert sind, enthält und einer Schale aus einer Verbindung mit hohem Molekulargewicht, die sich in dem Öl und Wasser nicht auflöst, wobei jede der Schichten Reagensschicht, Ausbreitungsschicht, reflektierende/filternde Schicht die Permeation einer hydrophoben Komponente mit hohem Molekulargewicht hindurch erlaubt.
Fig. 1 zeigt einen Schnitt durch ein mehrschichtiges, analytisches Element nach Beispiel 1 und
Fig. 2 zeigt einen Schnitt durch ein mehrschichtiges, analytisches Element nach Beispiel 2.
Das erfindungsgemäße analytische Element umfaßt mindestens eine Reagensschicht, eine lichtreflektierende/filternde Schicht und eine Ausbreitungsschicht, die in dieser Reihenfolge auf einem wasserundurchlässigen, transparenten Träger angebracht sind. Diese vier Schichten einschließlich des Trägers können einander benachbart sein oder es können andere wasserpermeable Schichten dazwischen angebracht sein.
Beispielsweise können eine zweite Reagensschicht, eine Detektionsschicht zum Aufnehmen eines Farbstoffs oder dgl. und/oder eine wasserabsorbierende Schicht zur Beschleunigung der Permeation einer wäßrigen, flüssigen Probe oder dgl. zwischen dem Träger und der Reagensschicht vorgesehen sein. In die Detektionsschicht wird ein Farbstoff oder eine andere nachweisbare Substanz, die in Gegenwart einer nachzuweisenden Komponente erzeugt wurde, diffundiert und optisch durch den lichtdurchlässigen Träger nachgewiesen. Die Detektionsschicht kann aus einem hydrophilen Polymeren bestehen. Die Detektionsschicht kann ein Beizmittel, wie ein kationisches Polymeres hinsichtlich eines anionischen Farbstoffs enthalten. Die wasserabsorbierende Schicht ist normalerweise eine Schicht zur Verhinderung der Diffusion in wesentlichem Ausmaß des in Gegenwart einer nachzuweisenden Komponente gebildeten Farbstoffs. Die wasserabsorbierende Schicht kann aus einem quellbaren, hydrophilen Polymeren, wie Gelatine, gebildet sein. Die Dicke der wasserabsorbierenden Schicht beträgt im allgemeinen 3 bis 20 um.
Auch eine blutzellenfiltrierende Schicht (wie in dem US-Patent 3 992 158 (JP-B-53-21677) und den JP-A-62-138756, 62-138757 und 62- 138758) beschrieben), eine störsubstanzenentfernende Schicht (wie in der US-A-4 303 408 (JP-A-56-122956) beschrieben), oder dgl. können zwischen der Ausbreitungsschicht und der lichtreflektierenden/filternden Schicht angebracht sein. Alternativ kann eine störsubstanzenentfernende Schicht zwischen der lichtreflektierenden/filternden Schicht und der Reagensschicht angebracht sein. Oder eine störsubstanzenentfernende Schicht, eine lichtreflektierende Schicht (wie in der US-A-4 042 335 beschrieben) oder dgl. können zwischen der Detektionsschicht und der Reagensschicht angebracht sein.
Ein geeignetes Material für den wasserundurchlässigen, transparenten Träger ist Polyethylenterephthalat. Andere Beispiele für Materialien für den wasserundurchlässigen, transparenten Träger umfassen Celluloseester, wie Cellulosetriacetat. Dieser Träger ist normalerweise mit einer Unterschicht versehen oder wird so behandelt, daß die Oberfläche des Trägers hydrophil wird, so daß die hydrophile Schicht fest daran gebunden werden kann.
Die Reagenszusammensetzung ist eine Zusammensetzung mit der Fähigkeit zur Erzeugung einer optisch nachweisbaren Substanz, wie beispielsweise eines Farbstoffs, in Gegenwart einer nachzuweisenden Komponente.
Beispiele für solche Zusammensetzungen umfassen eine Zusammensetzung (Indikator), die mit einer nachzuweisenden Komponente reagiert oder mit einem durch die Reaktion einer nachzuweisenden Komponente und einem Reagens erzeugten Zwischenprodukt reagiert, wodurch eine optisch nachweisbare Substanz, wie ein Farbstoff, gebildet wird. Beispiele für solche Indikatoren umfassen Zusammensetzungen, enthaltend einen Leucofarbstoff, der oxidiert wird, wodurch ein Farbstoff gebildet wird (z.B. ein Arylimidazolleucofarbstoff, wie in US-A-4 089 747 und JP-A-59-193352 beschrieben), Diazoniumsalze, Zusammensetzungen, die eine Verbindung enthalten, die oxidiert wird und unter Kupplung mit anderen Verbindungen einen Farbstoff erzeugt (z.B. 4-Aminoantipyrine, Phenole, Naphthole) und Zusammensetzungen mit der Fähigkeit zur Erzeugung eines Farbstoffs in Gegenwart eines reduzierenden Coenzyms und eines Elektronentransfermittels. Im Falle eines Analysenelements zur Messung der enzymatischen Aktivität kann selbstentwickelndes Substrat mit der Fähigkeit zur Freisetzung einer gefärbten Substanz, wie p-Nitrophenol, in die Reagensschicht oder Ausbreitungsschicht eingearbeitet sein.
Die Reagenszusammensetzung kann vollständig in die poröse Reagensschicht eingearbeitet sein oder kann teilweise in eine andere poröse oder nicht-poröse Schicht eingearbeitet sein. Beispielsweise kann eine Zusammensetzung, die die Reaktion einer nachzuweisenden Komponente mit einem Reagens unter Erzeugung eines Zwischenprodukts verursacht, in die Reagensschicht eingearbeitet sein und eine andere Zusammensetzung (Indikator), die mit dem so erzeugten Zwischenprodukt unter Bildung eines Farbstoffs reagiert, kann in die zweite Reagensschicht, die zwischen der Reagensschicht und dem Träger angebracht ist, eingearbeitet sein. In diesem Fall kann die zweite Reagensschicht eine im wesentlichen gleichförmige Schicht, die ein hydrophiles Polymeres als Bindemittel enthält, sein. Geeignete hydrophile Polymere für diesen Zweck umfassen Gelatine, Gelatinederivate (z.B. phthalierte Gelatine), Cellulosederivate (z.B. Hydroxypropylcellulose), Agarose, ein Acrylamidpolymeres, ein Methacrylamidpolymeres oder ein Copolymeres aus Acrylamid oder Methacrylamid und verschiedene Vinylmonomere. Eine gasdurchlässige Schicht oder eine störsubstanzenbeseitigende Schicht (wie in der US-A-4 066 403 beschrieben) kann zwischen der ersten Reagensschicht und der zweiten Reagensschicht angebracht sein. Diese Schichten können, sofern notwendig, wasserdurchlässig sein.
Eine geeignete Reagensschicht ist eine faserige, poröse Schicht, wie Filterpapier, gewebtes oder nicht-gewebtes Textilgewebe, eine nicht- faserige, poröse Schicht einschließlich einer Weißpolymerschicht aus einem Celluloseester, wie in JP-B-53-21677 und US-A-1 421 341 beschrieben, wie Celluloseacetat, Celluloseacetat/Butyrat oder Cellulosenitrat, ein mikroporöser Film aus Polyamid, wie 6-Nylon oder 6,6-Nylon, ein Polyethylen oder ein Polypropylen und mikroporöse Filme aus Polysulfon, wie in der JP-A-62-27006 beschrieben. Bevorzugt sind das Weißpolymer und der mikroporöse Polysulfonfilm. Alternativ können eine poröse Schicht mit kontinuierlichen Poren, umfassend Polymerkörnchen, Glaskörnchen oder Diatomeenerde, die mit einem hydrophilen oder nicht-wasserabsorbierenden Polymeren verbunden ist, wie in der JP-B-53-21677 und der JP-A-55-90859 beschrieben, oder eine körnige Polymerstruktur, wie in der JP-A-57-101760 und 57-101761 beschrieben, verwendet werden.
In einem Membranfilter aus einem sog. Weißpolymeren, hergestellt nach dem Phasentrennverfahren, ist der vertikale Flüssigkeitsweg der engste auf der freien Oberfläche (d.h. der Glanzoberfläche), welche bei der Herstellung des Films gebildet wurde. Wenn die Reagensschicht bei dem erfindungsgemäßen, analytischen Element diese Art eines Films enthält, kann die Glanzoberfläche des Membranfilters bevorzugt zu dem Träger gewendet sein.
Die Reagenszusammensetzung kann im wesentlichen in die erste nicht- faserige, poröse Schicht durch Beschichten einer gleichförmigen Schicht, die eine Reagenszusammensetzung mit einem hydrophilen Polymeren als Bindemittel, enthält, auf einen Träger und anschließende Adhäsion einer nicht-faserigen, porösen Schicht ohne eine Reagenszusammensetzung nach einem in der JP-A-55-164 356 beschriebenen Verfahren eingearbeitet werden.
Die Reagenszusammensetzung kann ggf. einen Aktivator, einen Puffer, einen Filmhärter, ein grenzflächenaktives Mittel oder dgl. enthalten. Beispiele für Puffer, die in das erfindungsgemäße Analysenelement eingearbeitet werden können, umfassen Carbonat, Borat, Phosphat und Puffer, wie in Biochemistry, Band 5, Nr. 2, S. 467-477, 1988, beschrieben sind. Diese Puffer können gemäß der Beschreibung in Takekazu Horio et al., Basic Experimental Process on Protein and Enzyme, Nankodo, 1981 und Biochemistry, Band 5, ausgewählt werden.
Die Reagenszusammensetzung kann ein Enzym enthalten. Reagenszusammensetzungen, wie in JP-A-62-138 756 Nagatomo et al. (S. 18-20) beschrieben, können verwendet werden.
Eine Adhäsionsschicht (Unterschicht), an die die poröse Reagensschicht haften und laminiert sein kann, kann auf dem Träger, der wasserabsorbierenden Schicht, der Detektionsschicht oder dgl. vorgesehen sein. Bevorzugt kann die Adhäsionsschicht aus einem hydrophilen Polymeren, das mit Wasser unter Adhäsion an einer porösen Schicht quillt, wie Gelatine, ein Gelatinederivat, ein Polyacrylamid oder Stärke, hergestellt sein.
Die lichtreflektierende/filternde Schicht ist so angepaßt, daß sie die rote Farbe des Hämoglobins in Vollbut herausfiltert und als lichtreflektierende oder Hintergrundschicht dient, wenn Reflektionsfotometrie von dem lichtdurchlässigen Träger durchgeführt wird, um eine nachweisbare Veränderung, die in der Detektionsschicht der Reagensschicht oder dgl. entwickelt wurde (z.B. Farbveränderung, Farbentwicklung) zu bestimmen. Das erfindungsgemäße Analysenelement ist dadurch gekennzeichnet, daß die lichtreflektierende/filternde Schicht Mikrokapseln, umfassend eine Schale aus einer hydrophilen oder hydrophoben Verbindung mit hohem Molekulargewicht und einem Kern aus lichtreflektierenden/absorbierenden Körnchen, die in der Schale enthalten sind, umfaßt.
Der Kern umfaßt lichtreflektierende oder lichtabsorbierende Körnchen, die in einer organischen Flüssigkeit dispergiert sind. Beispiele für eine solche organische Flüssigkeit umfassen Mineralöle, tierische Öle, pflanzliche Öle und synthetische Öle. Spezifische Beispiele für Mineralöle umfassen Petroleum, Kerosin, Naphtha und Paraffin. Spezifische Beispiele für tierische Öle umfassen Fischöl und Schweineschmalz. Spezifische Beispiele für pflanzliche Öle umfassen Erdnußöl, Leinsamenöl, Sojabohnenöl, Rizinusöl und Maisöl. Spezifische Beispiele für synthetische Öle umfassen Biphenylverbindungen (z.B. Isopropylbiphenyl, Isoamylbiphenyl), Terphenylverbindungen, Alkylnaphthalin (z.B. Diisopropylnaphthalin), alkylierte Diphenylalkane (z.B. 2,4-Dimethyldiphenylalkan), chloriertes Paraffin und phthalierte Ester (z.B. Dibutylphthalat, Dioctylphthalat).
Weiße oder helle Pigmente können als lichtreflektierende Körnchen, die in einer solchen organischen Flüssigkeit dispergiert werden sollen, verwendet werden. Bevorzugte Beispiele für ein solches Pigment umfassen Titandioxid, Zinkoxid, Lithopon, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Bariumsulfat, Calciumsulfat, Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat, Kaolinit, Halloysit, Muscovit und Talk. Unter diesen Pigmenten ist Titandioxid am meisten bevorzugt.
Der Kern der Mikrokugeln kann lichtabsorbierende Körnchen, die in einer organischen Flüssigkeit dispergiert sind, enthalten. Beispiele für solche lichtabsorbierenden Körnchen umfassen schwarze Pigmente, wie Ruß und schwarzes Eisenoxid. (In diesem Fall ist die erfindungsgemäße, lichtreflektierende/filternde Schicht eine lichtfilternde Schicht).
Diese festen Körnchen besitzen normalerweise einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 2 um oder weniger, insbesondere 0,02 bis 1 um. Das Volumenverhältnis der festen Körnchen zu der Flüssigkeit liegt normalerweise im Bereich von etwa 1:1 (entsprechend im wesentlichen der dichtesten Packung) bis 1:20. Die organische Flüssigkeit soll feste Körnchen in einer Menge enthalten, so daß sie einen ausreichenden lichtreflektierenden und/oder lichtfilternden Effekt ergibt. Jedoch ist die Menge der festen Körnchen, die in die organische Flüssigkeit eingearbeitet werden soll, bevorzugt auf einen solchen Wert beschränkt, daß die Oberfläche der festen Körnchen nicht auf dem Außeren der Kapselkörnchen exponiert wird. Die organische Flüssigkeit kann ein Hilfsmittel, wie ein grenzflächenaktives Mittel enthalten, um eine Dispersion der festen Körnchen, wie der Pigmentkörnchen darin, aufrechtzuerhalten.
Als Material zur Erzeugung der Schale der Mikrokapseln wird eine Verbindung mit hohem Molekulargewicht, die sich in dem Öl, das in der Schale enthalten ist und in dem Wasser nicht auflöst, verwendet.
Das bevorzugte Material der Schale (oder Wand) der Mikrokapseln kann aus der Gruppe, bestehend aus Proteinen (z.B. Collagen, Gelatine und Casein), Polypeptiden, Polyurethanen, Polyharnstoffen, Polyamiden, Polyestern, Harnstoffformalinkondensaten, Polystyrolen, Polyethylenen, Wachsen, Polyacrylamiden, Polyacrylsäuren, Polyvinylalkoholen, Alginsäuren, Cellulosederivaten (z.B. Methylcellulose, Ethylcellulose und Carboxymethylcellulose), Gummi arabicum und Stärke, ausgewählt werden. Die Dicke der Schale der Mikrokapseln liegt normalerweise im Bereich von 0,01 bis 6 um. Die statische Ladung in der Schale ist nicht spezifisch beschränkt. Mit anderen Worten, die Schale kann positiv oder negativ geladen sein oder keine elektrische Ladung besitzen.
Das Mikroverkapselungsverfahren kann geeigneterweise aus verschiedenen bekannten Verfahren ausgewählt werden, wie einem Grenzflächenpolymerisationsverfahren, einem in situ-Verfahren, einem Submershärtungsverfahren, einem Koazervationsverfahren, einem Phasentrennverfahren, einem Submerstrocknungsverfahren, einem Fusions-Dispersions-Kühlungsverfahren, einem Gassuspensionsverfahren, einem Sprühtrocknungsverfahren und einem statischem Koaleszenzverfahren. Es ist bevorzugt, daß die erfindungsgemäß verwendeten Mikrokapseln unter Verwendung eines Kondensationspolymerisationsverfahrens hergestellt werden. Beispiele für ein nach einem solchen Verfahren hergestellten Material umfassen ein Polyurethan-, Polyharnstoff-, Polyamid- und Harnstoff-Formalinkondensat.
Als Verfahren zur Verkapselung sind die in der US-A-2 800 457 und 2 800 458 beschriebenen Verfahren bekannt, bei denen die Koazervation eines hydrophilen Colloidsols verwendet wird. Ein Grenzflächenpolymerisationsverfahren, wie in der GB-A-867 797, 950 443, 989 264 und 1 091 076 beschrieben; wie die in der US-A-3 103 404 beschriebene Technik.
Um die Viskosität der organischen Flüssigkeit in dem Kern zu erhöhen, um die Körnchen stabil zu dispergieren, kann der Kern der MikrokapseIn die vorstehend beschriebene Verbindung mit hohem Molekulargewicht, wie sie in der Schale der Mikrokapseln verwendet wird, umfassen. Die Verbindung ist eine hydrophobe Verbindung, die in der organischen Flüssigkeit aufgelöst werden kann.
Die Schale der Mikrokapseln ist bevorzugt im wesentlichen von lichtreflektierenden/filternden, festen Körnern frei, weil sie zum zusammenwachsen neigen, wenn die Schale die festen Körnchen enthält. Jedoch kann die Schale der Mikrokapseln einige feste Körnchen enthalten, wenn die Stabilität der Mikrokapseln nicht verschlechtert wird.
Der durchschnittliche Teilchendurchmesser der Mikrokapseln liegt bevorzugt im Bereich von 1 bis 50 um, bevorzugter 2 bis 30 um. Wenn der Durchmesser 100 um überschreitet, werden die Öffnungen bei den Mikrokapslen in der lichtreflektierenden/filternden Schicht zu groß, um das Wandern der Blutpartikel durch die Löcher zu verhindern. Wenn andererseits der Durchmesser weniger als 1 um beträgt, wird das Durchdringen der Verbindungen mit hohem Molekulargewicht schwierig.
Die erfindungsgemäße lichtreflektierende/filternde Schicht sollte im wesentlichen aus den Mikrokapseln bestehen, um eine poröse Schicht zu bilden, durch die eine Komponente mit hohem Molekulargewicht oder eine hydrophobe Komponente leicht wandern kann.
Die erfindungsgemäße lichtreflektierende/filternde Schicht kann durch Beschichten einer Zusammensetzung, worin Mikrokapseln gebildet werden, direkt auf eine Schicht in dem Analysenelement gebildet werden, wenn die Mikrokapseln aneinander unter Bildung einer porösen Schicht geheftet werden können. Alternativ werden die Mikrokapseln in einem flüssigen Dispersionsmedium dispergiert, und dann wird die so erhaltene Dispersion auf eine Schicht beschichtet. Im allgemeinen wird Wasser als Dispersionsmedium verwendet. Um die Dispergierbarkeit der Mikrokapseln in dem Medium zu stabilsieren oder um die Viskosität der Beschichtungszusammensetzung zu erhöhen, wird eine wasserlösliche Verbindung mit hohem Molekulargewicht als Bindemittel in einer solchen Menge verwendet, daß die Permeation eines hochmolekularen oder hydrophoben Analyten (nachzuweisende Substanz) nicht von den Transmissionsöffnungen unter den Mikrokapseln, die die lichtreflektierende/filternde Schicht bilden, abgehalten werden. Es ist bevorzugt, daß die Schicht eine Porosität im Bereich von 6 bis 30 % besitzt. Die Menge der wasserlöslichen Verbindung mit hohem Molekulargewicht in der Schicht beträgt bevorzugt von 0,5 bis 15 Vol.-%, bezogen auf das offensichtliche Volumen der Schicht.
Die Dicke der lichtreflektierenden/filternden Schicht beträgt im allgemeinen 20 bis 200 um, und die Menge der lichtreflektierenden/filternden Körnchen beträgt bevorzugt 25 bis 75 Vol.-%, bezogen auf das offensichtliche Volumen der Schicht. Die Anzahl der Mikrokapseln in der Richtung der Schichtdicke beträgt bevorzugt 5 bis 100.
Beispiele für eine solche wasserlösliche Verbindung mit hohem Molekulargewicht umfassen Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Gelatine, acylierte Gelatine, wie phthalierte Gelatine, Poly(vinylpyrolidon), Poly(vinylalkohol), Poly(acrylamid) und dergleichen.
Die erfindungsgemäß verwendeten Mikrokapseln können bevorzugt einem Druck von mindestens 30 kg/cm², der senkrecht zur Oberfläche des Analysenelements ausgeübt wird, ohne Zerstörung der Wand der Mikrokapseln widerstehen.
Die Ausbreitungsschicht ist bevorzugt eine Schicht mit einem Dosiereffekt auf die Probenflüssigkeit. Diese Flüssigkeitsdosierwirkung soll die auf die Ausbreitungsschicht aufgetropfte Probenflüssigkeit in der Oberflächenrichtung mit im wesentlichen konstanter Geschwindigkeit pro Flächeneinheit davon, ohne die Komponenten der Flüssigkeit ungleichförmig zu verteilen, ausbreiten. Geeignet für die Verwendung als faseriges, poröses Material für die Ausbreitungsschicht sind Filterpapier, nicht-gewebtes Textilgewebe, Textilgewebe (z.B. glatt gewebtes Textilgewebe), gewirktes Textilgewebe (z.B. Trikot) oder Glasfaserfilterpapier. Unter diesen Materialien sind Textilgewebe und gewirktes Textilgewebe bevorzugt. Das Textilgewebe kann einer Koronaentladung, wie in der JP-A- 57-66359 beschrieben unterworfen werden. Die Ausbreitungsschicht kann eine hydrophile Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder ein grenzflächenaktives Mittel, wie in der JP-A-60-222770, 63-219397, 63-112999 und 62-182652 beschrieben, enthalten, um die Entwicklungsfläche, die Entwicklungsgeschwindigkeit oder dgl. einzustellen. Die Ausbreitungsschicht kann eine nicht-faserige Ausbreitungsschicht, wie in der US-A-3 992 158 beschrieben, sein.
Das erfindungsgemäße, trockene Analysenelement ermöglicht eine rasche Bestimmung von Komponenten mit hohem Molekulargewicht, wie Gesamtprotein, Albumin und verschiedenen Enzymen, von an Protein gebundenen Komponenten, wie Bilirubin und hydrophoben Komponenten, wie Cholesterin und Glyceriden, ebenso wie Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht, wie Glukose, Harnstoff und Harnsäure in Vollblut mit hoher Empfindlichkeit.
Die Schichten des erfindungsgemäßen Analysenelements unterliegen keiner Versprödung, was zum Brechen der lichtreflektierenden/filternden Schicht, Zerstreuen oder Herabfallen der vorstehend erwähnten Körnchen führt, was in den Schichten, die in der US-A-3 992 158 und 4 042 335 (JP- B-58-18628) beschrieben sind, die aus Körnchen aus einer anorganischen Substanz, wie Titandioxid und Bariumsulfat, bestehen, die darin mit einer hydrophilen Verbindung mit hohem Molekulargewicht als Bindemittel dispergiert sind, worin ein Teil des Bindemittels niedrig genug ist, um die Permeation einer hochmolekularen Verbindung oder hydrophoben Komponente zu erlauben, eintritt.
Das erfindungsgemäße, trockene Analysenelement kann zur immunologischen Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers verwendet werden, wenn die poröse Schicht mindestens ein Antigen oder einen Antikörper enthält.
Zwei Ausführungsformen der Erfindung sind in den Fig. 1 bzw. 2 dargestellt, worin 10 die Trägerschicht bedeutet, 20 die Reagensschicht bedeutet, 30 die Filterschicht bedeutet, 40 die lichtreflektierende/filternde Schicht bedeutet, 50 die Ausbreitungsschicht bedeutet und 60 die wasserabsorbierende Schicht bedeutet.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

1) Herstellung der Mikrokapseln

8 g eines Methacrylsäureester/Acrylsäure-Copolymeren (Molekulargewicht 100 000) wurden in 12 g Monoisobutyldiphenylethan bei einer Temperatur von 80ºC aufgelöst. 15 g gepulvertes Titandioxid (PF656; hergestellt von Ishihara Sangyo K.K. (durchschnittliche Teilchendurchmesser: 0,2 um)) wurde der Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde dann einer Dispersionsbehandlung in einem elektrischen Mörser für 8 h unterworfen. Das folgende Gemisch wurde mit der Dispersion unter Rühren mit einem Glasstab gemischt.
Methacrylsäureester/Acrylsäure-Copolymeres* (Molekulargewicht: etwa 100 000) 12 g
Ethylacetat 18,5 g
Paraffinöl (durchschnittliche Anzahl der Kohlenstoffatome: 12) 12 g
*Acrylbase MM2002-2 (hergestellt von Fujikura Kasei)
Das folgende Gemisch wurde dann dem System zugesetzt. Das System wurde mit einem Glasstab unter Erhalt der Flüssigkeit I gründlich gerührt.
Ethylacetat 14 g
Siliconöl (KF96 1000: Produkt, hergestellt von Shinetsu Chemical Industry Co., Ltd.) (verwendet als Schmiermittel) 4 g
1,1,1-Tri(p-isocyanatomethylbenzylaminocarbonyloxymethyl)propan (schalenbildende Substanz) 28 g
10 g einer 2,5%igen wäßrigen Lösung aus Diethylentriamin wurden zu 180 g einer 4%igen wäßrigen Lösung aus Methylcellulose (Schutzkolloid) gegeben. Die Flüssigkeit I wurde dann dem Gemisch unter Rühren zugesetzt, so daß es dispergiert wurde. Die Dispersion wurde mittels eines Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.-Kochmixers MX915C' durchgeführt. Ein Gerät zur Einstellung der Spannung wurde verwendet, um die Spannung auf 40 V einzustellen. Bei Betrieb wurde das System wie eine Mayonnaise (niedrige Geschwindigkeit) 20 s lang gerührt. Das System wurde dann mit der Einstellung zum Vermahlen (hohe Geschwindigkeit) bei 100 V 3 min 30 s lang dispergiert.
64 g einer 5%igen wäßrigen Lösung aus Diethylentriamin wurden dann der Dispersion zugesetzt, und das Diethylentriamin wurde mit der vorstehend beschriebenen Isocyanatverbindung bei einer Temperatur von 60ºC 3 h lang umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt mit Wasser gewaschen und dann unter Erhalt von Mikrokapseln (II) getrocknet.

2) Herstellung des Analysenelements

Die folgende Zusammensetzung (a) wurde auf einen 180 um dicken mit Gelatine beschichteten, farblosen, durchscheinenden, glatten Polyethylenterephthalatfilm als eine wäßrige Lösung beschichtet und unter Bildung einer Reagensschicht getrocknet.

(a)

Gelatine 1,2 g/m²
Teilchenförmiges Polyolefin (Chemipearl M200; Produkt, hergestellt von Mitsui Petrochemical Industries, Ltd., Teilchendurchmesser: 5 um; Dichte: 0,92) 41 g/m²
Grenzflächenaktives Mittel (Polyoxyethylennonylphenylether) 0,22 g/m²
Trishydroxymethylaminomethan 0,32 g/m²
Monokaliumphosphat 0,32 g/m²
α-Ketoglutarsäure 0,1 g/m²
Natrium-L-asparaginat 0,5 g/m²
Oxalacetat-Decarboxylase 2 520 IE/m²
Flavinadenindinucleotid (FAD) 6 mg/m²
Thiaminpyrophosphat (TPP) 24 mg/m²
Pyruvat-Oxidase 7 000 IE/m²
Peroxidase 1 280 IE/m²
Farbstoff: 2-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4-phenethyl-5-(4- dimethylaminophenyl)imidazol (zugesetzt als 5%ige methanolische Lösung) 0,36 g/m²
H&sub2;O 100 ml/m²
(Der pH-Wert der Zusammensetzung wurde auf 7,5 mit einer verdünnten NaOH-Lösung eingestellt.)
Die folgende Zusammensetzung (b) wurde auf die so gebildete Reagensschicht als Lösung beschichtet und unter Bildung einer lichtreflektierenden/filternden Schicht getrocknet.

(b)

Mikrokapseln (II) 39 g/m²
Methylcellulose 2 g/m²
(65SH50: ein Produkt, hergestellt von Shinetsu Chemical Industry Co., Ltd., enthaltend 10 Mol% Hydroxypropylcellulose)
H&sub2;O (Lösungsmittel) 50 ml/m²
Eine Stärkepaste wurde auf die Oberfläche eines Polyestertrikots (Dicke: 0,25 mm; Porenvolumen: etwa 18 ul/cm²) mittels eines Siebdruckverfahrens durch ein 100 Mesh-Sieb aufgebracht. Das Trikot wurde dann auf die Mikrokapselnschicht unter Herstellung eines die AST-Aktivität (Aspartataminotransferaseaktivität) messenden integrierten, mehrschichtigen Analysenelements (Fig. 1) laminiert.

Vergleichsbeispiel 1

Ein integriertes, mehrschichtiges Analysenelement zur Messung der AST-Aktivität wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Zusammensetzung (b) durch die folgende Zusammensetzung (c) ersetzt wurde:

(c)

Entionisierte Gelatine 11 g/m²
Grenzflächenaktives Mittel (Polyoxyethylennonylphenylether) n = 40 (Polymerisationsgrad von Ethylenoxid) 0,4 g/m²
Rutil-Titandioxid (R780: Produkt, hergestellt von Ishihara Sangyo K.K.) 18 g/m²
H&sub2;O (Lösungsmittel für die Beschichtung) 40 ml/m²
(Der pH-Wert der Zusammensetzung wurde mit verdünnter NaOH-Lösung auf 7,5 eingestellt.)

Meßbeispiel 1

10 ul von Kontrollseren mit unterschiedlichen AST-Aktivitätswerten (erhalten durch Zugabe der notwendigen Mengen einer Schweine-AST von SIGMA zu Moni-Trol I von Dade), wie in Beispiel 1 gezeigt, wurden auf die in Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 hergestellten Analysenelemente getropft. Diese Analysenelemente wurden dann bei einer Temperatur von 37ºC in einem versiegelten Gefäß gelagert. Diese Analysenelemente wurden dann bezüglich der Reflektionsdichte bei einer Wellenlänge von 640 nm nach 4- minütigem und 6-minütigem Lagern gemessen. Die Veränderung der Reflektionsdichte pro 1 min wurde dann aus diesen Messungen bestimmt. Die AST- Aktivität wurde dann aus dieser Veränderung der Reflektionsdichte berechnet und eine Kalibrationskurve, die zuvor hergestellt worden war (die Aktivität der Standardlösung wurde nach dem Naßverfahren unter Verwendung eines Hitachi 7050-chemischen Analysators kalibriert) berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Tatsächliche Konzentration Beispiel Vergleichsbeispiel Einheiten/l nicht meßbar
In Vergleichsbeispiel 1 war die Farbdichte niedrig, und die AST-Aktivität konnte nicht gemessen werden. Im Gegensatz dazu wurde in Beispiel 1 die AST-Aktivität mit ausgezeichneter Genauigkeit, wie in Tabelle 1 gezeigt, gemessen.

Beispiel 2

Eine wäßrige Gelatinelösung wurde auf einen 180 um dicken, mit Gelatine beschichteten, farblosen, transparenten Polyethylenterephthalatfilm mit einer glatten Oberfläche in einer Filmdicke von 7 um beschichtet und anschließend unter Herstellung einer wasserabsorbierenden Schicht getrocknet.
Die Oberfläche der so hergestellten, wasserabsorbierenden Schicht wurde im wesentlichen gleichförmig mit Wasser von etwa 25ºC vernetzt. Ein Celluloseacetatmembranfilter mit einem maximalen Porendurchmesser von 3 um, einer Dicke von 140 um und einem Porenvolumen von etwa 80 % (Mikrofilter FM300: ein Produkt, hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.) wurde dann auf die wasserabsorbierende Schicht laminiert. Die Laminierung wurde getrocknet, so daß das Membranfilter an die wasserabsorbierende Schicht geheftet wurde.
Die folgenden Zusammensetzungen 1 und 2 wurden dann auf das Membranfilter nacheinander in den nachstehend gezeigten Mengen beschichtet. Die Laminierung wurde getrocknet, wodurch eine poröse Reagensschicht erhalten wurde.

Zusammensetzung 1:

Gelatine 0,64 g/m²
Grenzflächenaktive Mittel (Polyoxyethylennonylphenylether) 2,5 g/m²
Trishydroxymethylaminomethan 0,46 g/m²
Monokaliumphosphat 0,46 g/m²
α-Ketoglutarsäure 0,5 g/m²
Natrium-L-asparaginat 2,5 g/m²
Oxalacetat-Decarboxylase 12 600 IE/m²
Magnesiumchlorid (wasserfrei) 0,3 g/m²
FAD 28 mg/m²
Thiaminpyrophosphorsäure 118 mg/m²
Pyruvat-Oxidase 35 000 IE/m²
Peroxidase 6 400 IE/m²
Lösungsmittel: Wasser 100 ml/m²
(Der pH-Wert der Zusammensetzung wurde mit verdünnter NaOH-Lösung auf 7,5 eingestellt.)

Zusammensetzung 2:

Leuco-Farbstoff: 2-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4-phenethyl-5-(4-dimethylaminophenyl)imidazol 1,8 g/m²
Grenzflächenaktives Mittel (Polyoxyethylen (n = 40) Nonylphenylether) 0,6 g/m²
Lösungsmittel: Ethanol 120 ml/m²
Ein Gemisch der in Beispiel 1 hergestellten Mikrokapseln (II) und Methylcellulose wurde auf die vorstehende poröse Reagensschicht in der folgenden Beschichtungsmenge beschichtet. So wurde eine lichtreflektierende/filternde Schicht auf das Membranfilter erzeugt.
Mikrokapsel (II) 20 g/m²
Methylcellulose (65SH50: hergestellt von The Shinetsu Chemical Industry Co., Ltd.) 4 g/m²
H&sub2;O 100 ml/m²
Eine Stärkepaste wurde auf die Oberfläche des Mikrofilters FM300 (Produkt, hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.), ein Celluloseacetatmembranfilter mit einem minimalen Porendurchmesser von 3,0 um, einer Dicke von 140 um und einem Porenvolumen von etwa 80 % in einer Menge von 3 g/m², ausgedrückt als Feststoffgehalt, nach einem Siebdruckverfahren durch ein 100 Mesh-Netz (Flächendichte etwa 20 %) aufgebracht. Dieses Mikrofilter wurde dann auf den Membranfilter laminiert und unter Bildung einer Blutzellenfilterschicht getrocknet.
Ein Trikot mit einer Dicke von etwa 250 um, hergestellt aus PET- Baumwollgarn mit 100S, wurde aufgebracht und mit der zweiten nicht-faserigen, porösen Schicht nach dem gleichen Siebadhäsionsverfahren, wie vorstehend zur Herstellung eines Analysenelements zur Messung der AST-Aktivität beschrieben (Fig. 2), integriert.

Vergleichsbeispiel 2

Ein Analysenelement wurde wie in Beispiel 2 hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß die lichtreflektierende/filternde Schicht, die die Mikrokapseln enthielt, weggelassen wurde und daß eine Blutzellenfilterschicht direkt auf die poröse Reagensschicht laminiert wurde.

Referenzbeispiel

Um die Lichtfilterwirkung der lichtreflektierenden/filternden Schichten, die in Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2 hergestellt wurden, zu untersuchen, wurden die folgenden Messungen durchgeführt.
i. Die blutzellenfilternde Schicht und die vorstehenden Schichten wurden von dem Analysenelement abgeschält, so daß die lichtreflektierenden/filternde Schicht und die darunterliegenden Schichten übrig blieben.
ii. Das verbleibende Analysenelement wurde mit Wasser getränkt.
iii. Die Reflektion durch das Analysenelement wurde von der Trägerseite her gemessen. Bei dieser Messung wurde die optische Dichte gegen einen schwarzen bzw. einen weißen Untergrund als Hintergrund bestimmt. Tabelle 2 Wellenlänge Hintergrund Beispiel Vergleichsbeispiel weiß schwarz
Tabelle 2 zeigt, daß Beispiel 2 einen optischen Dichteunterschied von 0,01 bis 0,03 zeigt, während Vergleichsbeispiel 2 einen optischen Dichteunterschied von 0,25 bis 0,3 zwischen dem weißen Hintergrund und dem schwarzen Hintergrund zeigt. So wurde der Unterschied in der optischen Dichte auf 1/10 oder weniger verringert.
Es wurde dann bestätigt, ob die lichtreflektierende/filternde Schicht die Passage einer Verbindung mit hohem Molekulargewicht erlaubt. Das folgende Verfahren wurde verwendet.
10 mg BLUE DEXTRAN (Katalog Nr. D-5751; Molekulargewicht: etwa 2 000 000), erhältlich von SIGMA Corp., wurden in 1 ml Wasser aufgelöst. 10 ul der Lösung wurden auf das in Beispiel 2 hergestellte Analysenelement getropft. Nach 10 s wurde ein blaues Licht von der Trägerseite beobachtet.

Meßbeispiel 2

Ein Schweine-AST (SIGMA Corp.) wurde zu Blutplasma (Hämatocritwert: 0 %) und einer frischen Blutprobe mit einem Hämatocritwert von 30 % (entnommen mit Heparin) in solchen Mengen, daß die AST-Aktivität davon 320 Einheiten/l und 790 Einheiten/l erreichte, gegeben. Dann wurden vier Bluttypen hergestellt. Das in Beispiel 2 hergestellte Analysenelement wurde in Stücke von 1,5 cm x 1,5 cm geschnitten. Diese Stücke wurden dann in eine mit Löchern zum Auftropfen einer Probe auf das Element bzw. zur optischen Messung versehenen Plastikvorrichtung gegeben. Die vier Bluttypen wurden in Tröpfchen auf diese Stücke aufgebracht. Nach Aufbringen ließ man das Reagenssystem bei einer Temperatur von 37ºC reagieren. Die Reflektometrie wurde dann auf der Trägerseite durchgeführt, um die Absorption von 640 nm nach 2,5 min und nach 4 min zu bestimmen. Diese Absorptionswerte wurden in ODt (transmissionsoptische Dichte) gemäß den in Clinical Chemistry, Band 24, 1335 (1978), beschriebenen Verfahren umgewandelt, Diese ODt-Werte wurden dann zur Berechnung der AST-Aktivitätswerte verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Hämatocritwert 0 % (Blutplasma) 320 Einheiten/l
Die Tabelle 3 zeigt, daß das erfindungsgemäße Analysenelement einen geringen Unterschied bezüglich des AST-Aktivitätswertes zwischen frischem Blut und Blutplasma zeigt.

Beispiel 3

Eine wäßrige Gelatinelösung wurde auf einen 180 um dicken gelatinebeschichteten, farblosen, transparenten Polyethylenterephthalatfilm mit einer glatten Oberfläche in einer Menge, so daß die getrocknete Filmdicke 7 um erreichte, beschichtet und unter Bildung einer wasserabsorbierenden Schicht getrocknet.
Die Oberfläche der so hergestellten wasserabsorbierenden Schicht wurde im wesentlichen gleichförmig mit Wasser von etwa 25ºC benetzt. Ein Celluloseacetatmembranfilter mit einem minimalen Porendurchmesser von 1,2 um, einer Dicke von 140 um und einem Porenvolumen von etwa 80 % (Fuji Photo Film Co., Ltd.-Mikrofilter FM120) wurde dann auf die wasserabsorbierende Schicht laminiert. Die Laminierung wurde getrocknet, so daß das Membranfilter an die wasserabsorbierende Schicht integriert wurde.
Die folgenden Zusammensetzungen 1 und 2 wurden dann auf das Membranfilter in der Reihenfolge in solchen Mengen, daß die beschichtete Menge jeder Komponente die nachstehend gezeigten Werte erreichte, beschichtet. Die Laminierung wurde unter Erhalt einer porösen Reagensschicht getrocknet.

Zusammensetzung 1:

Leuco-Farbstoff: 2-(3,5-Dimethoxy-4-hyxdroxyphenyl)-4-phenethyl-5-(4-dimethylaminophenyl) imidazol 1,36 g/m²
Grenzflächenaktives Mittel (Polyoxyethylen(n = 40) Nonylphenylether) 0,43 g/m²
Lösungsmittel: Ethanol 120 ml/m²

Zusammensetzung 2:

Gelatine 2,13 g/m²
Polyoxyethylennonlyphenylether:
Oxyethyleneinheit 10 2,13 g/m²
Oxyethyleneinheit 40 0,13 g/m²
Cholesterinesterase 8 070 Einheit/m²
Cholesterinoxidase 88 500 Einheit/m²
Peroxidase 28 200 Einheit/m²
H&sub2;O (Lösungsmittel) 100 ml/m²
Ein Gemisch der Mikrokapseln (II), hergestellt in Beispiel 1, und Methylcellulose wurde auf die poröse Reagensschicht in einer solchen Menge beschichtet, daß der Anteil der Zusammensetzung die folgenden Werte erreichte. So wurde eine lichtreflektierende/filternde Schicht auf das Membranfilter erzeugt.
Mikrokapsel (II) 48 g/m²
Methylcellulose (65SH50: Produkt hergestellt von The Shinetsu Chemical Industry Co., Ltd.) 4,1 g/m²
Polyoxyethylennonylphenylether (Oxyethyleneinheit 40) 0,11 g/m²
H&sub2;O (Lösungsmittel) 100 ml/m²
Eine Stärkepaste wurde auf die Oberfläche des Mikrofilters FM300 (ein Produkt, hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.) (Celluloseacetatmembranfilter mit einem minimalen Porendurchmesser von 3,0 um, einer Dicke von 140 um und einem Porenvolumen von etwa 80 %) in einer Menge von 3 g/m², ausgedrückt als Feststoffgehalt, nach dem Siebdruckverfahren durch ein 100 Mesh-Netz (Flächendichte: etwa 20 %) aufgebracht. Dieses Mikrofilter wurde dann auf das Membranfilter laminiert und unter Bildung einer Blutzellenfilterschicht getrocknet.
Ein Trikot mit einer Dicke von etwa 250 um, hergestellt aus Polyethylenterephthalat-Baumwollgarn mit 100S wurde mit der zweiten nicht- faserigen, porösen Schicht nach dem gleichen Siebadhäsionsverfahren, wie vorstehend beschrieben, unter Herstellung eines trockenen Analysenelements für Gesamtcholesterin verbunden und integriert.

Meßbeispiel 3

Blutzellen, die aus menschlichem Vollbut (entnommen durch ein Heparinröhrchen) abgetrennt wurden, wurden zu Kontrollserum Moni-Trol I von Dade unter Herstellung eines künstlichen Bluts (I) mit einem Hämatocritwert von 40 % und einem Gesamtcholesterinwert von 115 mg/m² gegeben. Die gleichen Blutzellen, wie vorstehend beschrieben, wurden zu dem Lipidserum II, hergestellt von K.K. Eiken Kagaku, unter Herstellung eines künstlichen Bluts (II) mit einem Hämatocritwert von 40 % und einem Gesamtcholesterinwert von 351 mg/l gegeben.
Die künstlichen Seren (I) und (II) wurden jeweils auf ein in Beispiel 3 hergestelltes, trockenes Analysenelement in Mengen von 10 ul gegeben. Die Analysenelemente wurden dann bei einer Temperatur von 37ºC in einem verschlossenen Container 4 min lang gelagert. Jedes Analysenelement wurde dann auf die Reflektionsdichte bei einer Wellenlänge von 640 nm gemessen. Tabelle 4 Probe Berechneter Wert Gemessener Wert
Tabelle 4 zeigt, daß das trockene Analysenelement auf Gesamtcholesterin mit ausgezeichneter Genauigkeit gemessen werden kann.

Beispiel 4

1) Herstellung von Mikrokapseln

18 g gepulvertes Titandioxid (PF656: Produkt, hergestellt von Ishihara Sangyo K.K.; durchschnittlicher Teilchendurchmesser: 0,2 um) wurden zu 27 g Diisopropylnaphthalin gegeben. Das Gemisch wurde dann einer Dispersionsbehandlung in einem elektrischen Mörser für 8 h unterworfen. Ein Lösungsmittelgemisch aus 2,5 g Aceton und 7,5 g Methylenchlorid wurde der Dispersion zugesetzt. Die Dispersion wurde dann gründlich unter Herstellung einer Primärlösung gerührt. Ein 3 Mol:1 Mol-Additionsprodukt aus Hexamethylendiisocyanat und Hexantriol wurde zu der Primärlösung unter Herstellung einer Sekundärlösung gegeben.
Das Vermischen-Auflösen dieser Materialien wurde bei einer Temperatur von 25ºC oder darunter durchgeführt. Die so hergestellte Sekundärlösung wurde dann schrittweise unter heftigem Rühren zu einer Lösung, die durch Auflösen von 3 g Gummi arabicum in 57 g Wasser bei einer Temperatur von 20ºC erhalten worden war, gegeben, um eine Öl-in-Wasser-Emulsion mit einem Öltropfendurchmesser von 5 bis 15 um zu erhalten. Bei der Herstellung der Emulsion wurde die Umgebung des Reaktionsgefäßes abgekühlt, so daß die Temperatur des Reaktionssystems 20ºC nicht überschritt.
100 g Wasser von 40ºC wurden weiter unter Rühren zu der Emulsion gegeben, während die Temperatur des Systems schrittweise erhöht wurde. Die Temperatur des Systems erreichte in 30 min 90ºC und wurde dann bei diesem Wert 20 min lang gehalten. Das System wurde dann einer Zentrifugentrennung unterworfen, so daß der Mikrokapselteil von der Gummi arabicum-Lösung getrennt wurde. 100 g Wasser wurden dann dem Mikrokapselteil zur Beendigung der gewünschten Mikrokapseln zugesetzt.

2) Herstellung des Analysenelements

Ein mehrschichtes Analysenelement zur Messung der AST-Aktivität wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, ausgenommen, daß die Mikrokapseln (II) durch die vorstehend beschriebenen Mikrokapseln ersetzt wurden.
Das so hergestellte Analysenelement konnte zur Messung der AST-Aktivität mit einer ausgezeichneten Genauigkeit, ähnlich wie die, die in Beispiel 1 erhalten wurde, verwendet werden.
Patente in englischer Sprache, die den vorstehend aufgeführten japanischen Patentpublikationen entsprechen, sind nachstehend aufgeführt.
JP-B-53-21677: US-A-3 992 158
JP-A-55-164356: US-A-4 292 272
JP-A-60-222769: EP-A-0 162 302
JP-A-58-70163: US-A-4 486 537
JP-A-55-90859: US-A-4 258 001 US-A-4 357 363 US-A-4 381 921
JP-A-57-101761: US-A-4 430 436
JP-A-60-222770: EP-A-0 162 301

Claims

1. Trockenes, mehrschichtiges Analysenelement, welches in dieser Reihenfolge mindestens eine wasserdurchlässige, poröse Reagensschicht, eine wasserdurchlässige, lichtreflektierende/-filternde Schicht und eine wasserpermeable, poröse Ausbreitungsschicht auf einem wasserundurchlässigen, transparenten Träger enthält, worin eine Reagenszusammensetzung mit der Fähigkeit zur Erzeugung einer optisch nachweisbaren Substanz in Gegenwart einer nachzuweisenden Kornponente vollständig in die Reagensschicht eingearbeitet ist, oder ein Teil davon in die Reagensschicht eingearbeitet ist und ein anderer Teil davon in eine andere der wasserpermeablen Schichten eingearbeitet ist, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtreflektierende/-filternde Schicht porös ist und Mikrokapseln mit einem Kern, der lichtreflektierende/-filternde Körnchen enthält, die in einem Öl dispergiert sind, und einer Schale aus einer Verbindung mit hohem Molekulargewicht, die sich in dem Öl und in Wasser nicht auf löst, enthält, worin jede der Reagensschicht, Ausbreitungsschicht und reflektierenden/-filternden Schicht die Permeation einer Komponente mit hohem Molekulargewicht oder einer hydrophoben Komponente hindurch erlaubt.

2. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapseln eine Schale aus einer hydrophilen Verbindung mit hohem Molekulargewicht umfassen.

3. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hikrokapseln eine Schale aus einer hydrophoben Verbindung mit hohem Molekulargewicht umfassen.

4. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung mit hohem Molekulargewicht eine Verbindung, ausgewahlt aus der Gruppe, bestehend aus Proteinen, Polypeptiden, Polyurethanen, Polyharnstoffen, Polyamiden, Polyestern, Harnstoff-Formalin-Kondensaten, Polystyrolen, Polyethylenen, Wachsen, Polyacrylamiden, Polyacrylsäuren, Polyvinylalkoholen, Alginsäuren, Zellulosederivaten, Gummi arabicun und Stärke, ist.

5. Analysenelement nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophile Verbindung mit hohem Molekulargewicht eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proteinen, Polypeptiden, Polyacrylamiden, Polyacrylsäuren, Polyvinylalkoholen, lginsäuren, hydrophilen Zellulosederivaten, Gummi arabicum und Stärke, ist.

6. Analysenelement nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophobe Verbindung mit hohem Molekulargewicht eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyurethanen, Polyharnstoffen, Polyamiden, Polyestern, Harnstoff-Formalin-Kondensaten, Polystyrolen, Polyethylenen, Wachsen und hydrophoben Zellulosederivaten, ist.

7. Ahalysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtreflektierenden/-filternden Körnchen ein Pigment umfassen.

8. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Körnchen einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von nicht mehr als 2 um besitzen.

9. Analysenelement nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der durchschnittliche Teilchendurchmesser mindestens 0,02 um beträgt.

10. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtreflektierenden/-filternden Körnchen mindestens ein Pigment, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Titandioxid, Zinkoxid, Lithopon, Siliziumdioxid, Aluminiumoxid, Bariumsulfat, Kalziumsulfat, Kalziumkarbonat, Magnesiumkarbonat, Kaolinit, Halloysit, Nuskovit, Talk, Ruß und Eisenmohr, umfassen.

11. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtreflektierenden/-filternden Körnchen Titandioxid umfassen.

12. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumenverhältnis der Körnchen zu dem Öl im Bereich von etwa 1:1 bis 1:20 liegt.

13. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der durchschnittliche Teilchendurchmesser der Mikrokapseln im Bereich von 1 bis 50 um liegt.

14. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schale im wesentlichen frei von den Körnchen ist.

15. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapseln unter Verwendung eines Bindemittels eine Schicht bilden.

16. Analysenelement nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemittel eine wasserlösliche Verbindung mit hohem Molekulargewicht ist.

17. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Element weiterhin eine wasserabsorbierende Schicht umfaßt, die zwischen dem Träger und der Reagensschicht angebracht ist.

18. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Element weiterhin eine Filterschicht, die zwischen der Ausbreitungsschicht und der lichtreflektierenden/-filternden Schicht angebracht ist, umfaßt.

19. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Element weiterhin eine absorbierende Schicht, die zwischen dem Träger und der Reagensschicht angebracht ist, und eine Filterschicht, die zwischen der Ausbreitungsschicht und der lichtreflektierenden/-filternden Schicht angebracht ist, umfaßt.

20. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtreflektierende/-filternde Schicht eine Porosität im Bereich von 6 bis 30% besitzt.

21. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtreflektierende/-filternde Schicht ein Bindemittel in einer Menge von 0,5 bis 15 Vol.-%, bezogen auf das offensichtliche Volumen der Schicht, enthält.

22. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtreflektierende/-filternde Schicht eine Dicke von 20 bis 200 um besitzt.

23. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtreflektierende/-filternde Schicht die lichtreflektierenden/-filternden Körnchen in einer Menge von 25 bis 75 Vol.-%, bezogen auf das offensichtliche Volumen der Schicht, enthält.

24. Analysenelement nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der Mikrokapseln in der Richtung der Schichtdicke 5 bis 100 beträgt.

25. Verfahren zur quantitativen Analyse einer flüssigen Probe, worin eine Probe auf ein trockenes Analysenelement aus Schichten, die der kolorimetrischen Analyse der Komponente in der Probe angepaßt sind, punktförmig aufgebracht wird, und die optische Dichte der gebildeten Färbung gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Analysenelement nach den Ansprüchen 1 bis 24 verwendet wird.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Probe eine Körperflüssigkeit ist.

27. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Probe Vollblut, Blutplasma oder Serum ist.

28. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Probe Vollblut ist.

29. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente aus der Gruppe, bestehend aus Gesamtprotein, Albumin, Enzym, Bilirubin, Cholesterin und Glyzeriden, ausgewählt ist.