RU2663586C1 - Композиция среды и способ получения ботулинического токсина - Google Patents
Композиция среды и способ получения ботулинического токсина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2663586C1 RU2663586C1 RU2017120811A RU2017120811A RU2663586C1 RU 2663586 C1 RU2663586 C1 RU 2663586C1 RU 2017120811 A RU2017120811 A RU 2017120811A RU 2017120811 A RU2017120811 A RU 2017120811A RU 2663586 C1 RU2663586 C1 RU 2663586C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- medium
- apf
- candidate
- wednesday
- hydrolyzate
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 5
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 claims abstract description 73
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 66
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 66
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims abstract description 44
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims abstract description 44
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 claims abstract description 13
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 235000016816 Pisum sativum subsp sativum Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims abstract description 10
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 64
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 7
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 claims description 5
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 claims description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 101000963974 Hydrophis stokesii Alpha-elapitoxin-Ast2b Proteins 0.000 claims 1
- 101000964025 Naja naja Long neurotoxin 3 Proteins 0.000 claims 1
- 101000822778 Naja naja Long neurotoxin 4 Proteins 0.000 claims 1
- 101000822797 Naja naja Long neurotoxin 5 Proteins 0.000 claims 1
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 claims 1
- 108010010958 snake venom neurotoxin F Proteins 0.000 claims 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 46
- 208000010544 human prion disease Diseases 0.000 abstract description 22
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 abstract description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 abstract description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 abstract description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 152
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 73
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 42
- 239000000306 component Substances 0.000 description 38
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 37
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 36
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 34
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 32
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 32
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 28
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 27
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 24
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 23
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 23
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 23
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 23
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 23
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 19
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 17
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 17
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 16
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 15
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 15
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 11
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 11
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 10
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 9
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 9
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 6
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 6
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 5
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 5
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 4
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 4
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 4
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 4
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 229960004716 idoxuridine Drugs 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 3
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 3
- 229940094657 botulinum toxin type a Drugs 0.000 description 3
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007773 growth pattern Effects 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 3
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 229940046307 sodium thioglycolate Drugs 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 101710117542 Botulinum neurotoxin type A Proteins 0.000 description 2
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 2
- 241000193464 Clostridium sp. Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 2
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010005730 R-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000050389 Syntaxin Human genes 0.000 description 2
- 229940089093 botox Drugs 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108010074523 rimabotulinumtoxinB Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000000722 Akinetic Mutism Diseases 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 206010019468 Hemiplegia Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 201000000251 Locked-in syndrome Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000005917 R-SNARE Proteins Human genes 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000002215 Synaptobrevin Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 108010079650 abobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N alpha-mercaptoacetic acid Natural products OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 229940098753 dysport Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 208000037957 feline spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229940112646 myobloc Drugs 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010993 response surface methodology Methods 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 description 1
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M sodium thioglycolate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CS GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 201000007770 spastic cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 201000008417 spastic hemiplegia Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/76—Undefined extracts from plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Предложены композиция среды и способ для получения ботулинического токсина. Данная группа изобретений относится к биотехнологии. Композиция питательной среды содержит, по меньшей мере, один пептон растительного происхождения, выбранный из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы, источник углерода и минеральные вещества. Способ получения ботулинического токсина предусматривает культивирование Clostridium botulinum с использованием указанной композиции среды в анаэробных условиях с последующим выделением ботулинического токсина. Группа изобретений позволяет повысить скорость роста бактерий Clostridium botulinum и предотвратить риск инфекции трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE). 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 18 ил., 13 табл., 10 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композиции среды для производства ботулинического токсина, более конкретно, к составу среды для культивирования штаммов Clostridium, способных продуцировать ботулинический токсин. Композиция среды по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, один пептон растительного происхождения, выбранный из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы.
Предшествующий уровень техники
Множество штаммов Clostridium sp., которые выделяют нейротоксические токсины было обнаружено начиная с 1890-х годов, и описание характеристик токсинов, которые секретируются этими бактериями, была проведена в течение последних 70 лет (Schant, E. J. et al., Microbiol.Rev., 56:80, 1992).
Нейротоксические токсины, полученные из Clostridium sp., т.е., ботулинические токсины, подразделяются на семь серотипов (серотипы А-G) в зависимости от их серологических свойств. Каждый из токсинов имеет белок токсина размером около 150 кДа, и в природе содержит комплекс нескольких нетоксичных белков, связанных с ним. Средний комплекс (300 кДа) состоит из белка токсина и нетоксичного белка не гемагглютинина, а большой комплекс (450 кДа) и очень большой комплекс (900 кДа) состоит из средних размеров комплексов, связанных с гемагглютинином (Sugiyama H., Microbiol. Rev., 44:419, 1980). Такие нетоксичные гемагглютининовые белки, как известно, действуют, выполняя роль защиты токсина от низкого рН и различных протеаз в кишечнике.
Токсин синтезируется в клетках в виде одиночного полипептида, имеющего молекулярную массу около 150 кДа, а затем расщепляется в положении 1/3, начиная от N-конца под действием внутриклеточной протеазы или обработки искусственным ферментом, таким как трипсин, на две единицы: легкую цепь (L, молекулярная масса: 50 кДа) и тяжелую цепь (Н; молекулярная масса: 100 кДа). Расщепленный токсин имеет значимо увеличенную токсичность по сравнению с одиночным полипептидом. Два блока соединяются друг с другом дисульфидной связью и имеют различные функции. Тяжелая цепь связывается с рецептором клетки-мишени (Park. M.K. et al., FEMS Microbiol. Lett., 72:243, 1990) и выполняет функцию взаимодействия с биомембраной при низком рН (рН 4), образуя канал (Mantecucco, C. et al., TIBS., 18:324, 1993), а легкая цепь имеет фармакологическую активность нарушения секреции нейротрансмиттеров, когда проникает в клетки или вводится путем электропорации или т.п. (Poulain, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:4090, 1988).
Токсин ингибирует экзоцитоз ацетилхолина в холинергическом пресинапсе нервно-мышечного соединения, чтобы вызывает астению. Считается, что токсичность демонстрирует обработка очень небольшим количеством токсина, что позволяет предположить, что токсин имеет некую ферментативную активность (Simpson, L. L. et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 26:427, 1986).
Согласно недавнему отчету, токсин обладает активностью металлопептидазы и его субстраты включают синаптобревин, синтаксин, cинаптосомально-ассоциированный белок, 25 кДа (SNAP-25) и т.д., которые являются единичными белками комплекса машинерии экзоцитоза. Каждый тип токсина использует один из описанных выше трех белков в качестве своего субстрата, и известно, что токсины типа B, D, F и G, расщепляют синаптобревин в конкретном участке, токсины типа А и Е расщепляют SNAP - 25 в конкретном участке, а типа C расщепляет синтаксин в конкретном участке (Binz, T.et al., J. Biol. Chem., 265:9153, 1994).
В частности, ботулинический токсин типа А, как известно, растворим в разбавленном водном растворе при рН 4,0-6,8. Известно, что стабильный нетоксичный белок отделяют от нейротоксина при рН около 7 или выше, и, как следствие, токсичность постепенно теряется. В частности, известно, что токсичность уменьшается по мере роста рН и температуры.
Ботулинический токсин является смертельным для человеческого организма даже в небольших количествах и легко производится в больших количествах. Таким образом, этот токсин представляет собой один из четырех основных боевых средств биотеррора вместе с Bacillus anthracis, Yersinia pestis и вирусом натуральной оспы. Тем не менее, было обнаружено, что, когда ботулинический токсин типа А вводят в дозе, которая систематически не влияет на человеческий организм, токсин может парализовать локальную мышцу в инъецируемом участке. На основании этой характеристики, ботулинический токсин типа А может быть использован в широком диапазоне применений, включая агенты для удаления морщин, агенты для лечения спастической гемиплегии и церебрального паралича и т.д. Таким образом, спрос на ботулинический токсин типа А растет и активно проводятся исследования способов получения ботулинического токсина для удовлетворения спроса.
Текущий типичный коммерческий продукт BOTOX® (очищенный нейротоксиновый комплекс ботулинического токсина типа А) коммерчески доступен у Allergan, Inc., США. Флакон BOTOX® на 100 единиц состоит из примерно 5 нг очищенного нейротоксинового комплекса ботулинического токсина типа А, 0,5 мг человеческого сывороточного альбумина и 0,9 мг хлорида натрия и восстанавливается с помощью стерильного физиологического раствора без консерванта (инъекция 0,9 % хлорид натрия). Другие коммерческие продукты включают Dysport® (комплекс ботунилинического токсина А типа из Clostridium и гемагглютинин, который имеет лактозу и человеческий сывороточный альбумин в фармацевтической композиции, содержащей ботулинический токсин и восстанавливается 0,9% хлоридом натрия перед использованием), который является коммерчески доступным у Ipsen Ltd., Великобритания, Myobloc® (инъекционный раствор (рН около 5,6), содержащий ботулинический токсин типа В, человеческий сывороточный альбумин, сукцинат натрия и хлорид натрия), который является коммерчески доступным у Solstice Neurosciences, Inc.
Среда для культивирования Clostridium botulinum, которая обычно используется в способе получения ботулинического токсина, как описано в патенте Кореи 10-1339349, содержит компоненты животного происхождения. Таким образом, если аномальный прион животного, известный как агент, который вызывает трансмиссивную губчатую энцефалопатию, содержится в компонентах животных из-за загрязнения, то это создает проблемы в процессе получения ботулинического токсина.
Трансмиссивная губчатая энцефалопатия (TSE) известна как нейродегенеративное расстройство, вызывающее серьезную дегенерацию нейронов, и ее примеры включают коровью губчатую энцефалопатию (BSE), почесуху, болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD), синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, куру, трансмиссивную энцефалопатию норок, хроническую изнуряющую болезнь, кошачью губчатую энцефалопатию и т.д., которые влияют на людей и животных. Сообщалось, что BSE пересекает видовой барьер и поражает даже людей.
У агента, который вызывает трансмиссивную губчатую энцефалопатию (TSE), есть особенности, которые заключаются в том, что он не имеет иммуногенности и инкубационный период является длинным. Из гистопатологического анализа BSE-пораженной ткани головного мозга крупного рогатого скота, можно видеть, что специальные губчатые вакуоли сформировались в головном мозге из-за повреждения нейронов и отложения аномальных белковых волокон.
Причиной TSE является белковые инфекционные частицы, известные как аномальный прион. В отличие от обычных вирусов, которые требуют нуклеиновой кислоты, аномальный прион представляет собой инфекционную частицу, состоящую только из белка, без нуклеиновой кислоты. Что касается TSE, то известно, что, когда аномальный прион (PrPsc), который представляет собой инфекционную частицу связываются с аномальным прионом (PrPc), то он превращается в патогенный прион, который затем накапливается в головном мозге (Prusiner SB, Alzheimer Dis Assoc Disord., 3:52-78, 1989).
Болезнь Крейтцфельдта-Якоба является редким нейродегенеративным расстройством человеческой трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE), при которой трансмиссивный агент представляет собой, по-видимому аномальную форму прионного белка. У индивидуума с болезнью Крейтцфельдта-Якоба кажущееся совершенное здоровье может ухудшиться в акинетический мутизм в течение шести месяцев. Таким образом, может иметь место потенциальный риск приобретения прион-опосредованного заболевания, такого как болезнь Крейтцфельдта-Якоба, из-за введения фармацевтической композиции, которая содержит биологический агент, такой как ботулинический токсин, полученный с использованием продуктов животного происхождения. Таким образом, если фармацевтическую композицию получают с помощью лекарственного вещества, полученного с использованием компонентов животного происхождения, она может подвергнуть пациента потенциальному риску получения различных патогенов или инфекционных агентов.
В соответствии с этим предшествующим уровнем техники, авторы настоящего изобретения обнаружили, что, когда среда содержит полученный из растений пептон без трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE) и минеральные компоненты, используется для культивирования Clostridium botulinum для предотвращения риска развития вышеописанного прион-опосредованного заболевания, риск развития прион-опосредованного заболевания, которое может произойти в среде, используется в настоящее время (оригинальная среда) может быть исключен, а скорость роста Clostridium botulinum в среде может быть увеличена по сравнению со средой, которая используется в настоящее время, в результате чего выполняется настоящее изобретение.
Раскрытие изобретения
Техническая проблема
Задача настоящего изобретения заключается в создании композиции среды, содержащей пептоны растительного происхождения, не имеющие никакого риска инфекции трансмиссивной губчатой энцефалопатией (TSE), а также в способе производства ботулинического токсина, который улучшает выработку ботулинического токсина путем культивирования Clostridium botulinum в композиции среды.
Техническое решение
Для достижения вышеуказанной цели настоящее изобретение обеспечивает композицию среды для культивирования Clostridium botulinum, содержащей: по меньшей мере, один пептон растительного происхождения, выбранный из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы.
Настоящее изобретение также относится к способу получения ботулинического токсина, включающему следующие стадии: (а) культивирование Clostridium botulinum, с использованием вышеописанной композиции среды для получения ботулинического токсина; и (b) выделение полученного ботулинического токсина.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 демонстрирует рост Clostridium botulinum в среде (APF-среде), содержащей пептоны растительного происхождения.
Фиг. 2 демонстрирует рост Clostridium botulinum в среде, содержащей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины.
Фиг. 3 демонстрирует результаты изучения образования осадка после стерилизации среды, содержащей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины.
Фиг. 4 демонстрирует результаты изучения образования осадка после стерилизации среды, содержащей пептоны растительного происхождения и минеральные вещества.
Фиг. 5 демонстрирует рост Clostridium botulinum в средах, полученных путем дополнительного добавления витаминов, аминокислот и «BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine» к среде для культивирования бактерии, которая содержит пептоны растительного происхождения и минеральные вещества.
Фиг. 6 демонстрирует рост Clostridium botulinum в средах для культивирования бактерии, которые содержат различные виды пептонов растительного происхождения.
Фиг. 7 демонстрирует контурные диаграммы FFD для минерального скрининга и оптимизации отклика. Фиг. 7а (А) контурная диаграмма для высоких настроек; фиг. 7b (В) контурная диаграмма для средних настроек; фиг. 7c (С) контурная диаграмма для низких настроек; а фиг. 7d (D) Оптимизация ответа для максимального OD.
Фиг. 8 демонстрирует контурные диаграммы FFD для минерального скрининга и оптимизации ответа. Фиг. 8а контурная диаграмма для высоких настроек; фиг. 8b контурная диаграмма для средних настроек; фиг. 8c контурная диаграмма для низких настроек; а также фиг. 8d оптимизация ответа для максимальной оптической плотности.
Фиг. 9 демонстрирует контурные диаграммы для скрининга растительного пептона и оптимизации ответа. Фиг. 9а контурная диаграмма для средних настроек; фиг. 9b контурная диаграмма для низких настроек; и фиг. 9c оптимизация ответа для максимального OD.
Фиг. 10 демонстрирует кривую роста Clostridium botulinum в окончательно подобранной APF-среде, и изменение концентрации токсина.
Наилучшее воплощение изобретения
В настоящем изобретении, была сделана попытка приготовить среду, которая еще больше повысит скорость роста Clostridium botulinum по сравнению со средой, используется в настоящее время (исходной среде) и которая не имеет никакого риска инфекции TSE или чем-либо подобным. Таким образом, была использована среда без животных белков (APF), содержащая пептоны растительного происхождения и исследован рост бактерий в среде APF. В результате APF-среда показала повышенную скорость роста бактерий по сравнению со средой, которая используется в настоящее время. Таким образом, если используется APF-среда, может быть получена высокая концентрация ботулинического токсина путем культивирования бактерии безопасным образом в условиях, свободных от TSE.
При использовании в данном описании, термин «среда, используемая в настоящее время или исходная среда» означает среду, содержащую гидролизат казеина, дрожжевой экстракт и тиогликолевую среду, которые являются компонентами среды животного происхождения. Термин «APF-среда (среда без животного белка)» означает среду, которая содержит неживотный белок, и которая содержит пептоны растительного происхождения, минеральные вещества и глюкозу.
В одном из примеров настоящего изобретения, для того чтобы произвести ботулинический токсин путем культивирования Clostridium botulinum в условиях, свободных от трансмиссивной губчатой энцефалопатии (TSE), APF-среду, содержащую пептон растительного происхождения, свободный от TSE, готовили и сравнивали со средой, используется в настоящее время (содержащей животный компонент). В результате, можно увидеть, что оптимальная композиция среды для культивирования Clostridium botulinum является композицией, содержащей пептон растительного происхождения, по меньшей мере, одно минеральное вещество, выбранное из группы, состоящей из KH2PO4, K2HPO4 и Na2HPO4, и источник углерода (например, глюкозу), и в этой среде был обнаружен оптимальный рост бактерий. В результате, как показано в таблице 13, было установлено, что оптимальное содержание пептонов растительного происхождения в окончательно подобранной композиции среды для культивирования Clostridium botulinum представляет собой 5 г/л Hy-Pea™ 7404, 10 г/л UltraPep™ Cotton и 5 г/л HyPep™ 4601N, а оптимальное содержание минеральных веществ в композиции среды представляет собой 5,5 г/л К2HPO4 и 3 г/л Na2HPO4.
В другом примере настоящего изобретения, измеряли паттерн роста Clostridium botulinum в окончательно подобранной APF-среде, содержащей пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, и концентрацию токсина. В результате, как показано в таблице 12 и на фиг. 10, значение OD начало расти после 12 часов культивирования Clostridium botulinum, а через 24 часов культивирования, культуральная среда продемонстрировала OD540нм равное 3,5465 и OD600нм равное 3,0695. Затем, значение OD постепенно уменьшалось, а через 48 часов культивирования, культуральная среда продемонстрировала OD540нм равное 0,792 и OD600нм равное 0,7224. Концентрация токсина в надосадочной жидкости культуральной среды Clostridium botulinum начала расти после 5 часов культивирования и показала конечное значение 31,41 мкг/мл. Когда концентрацию токсина измеряли после разрушения бактерии, токсин начал вырабатываться после 5 часов культивирования, и концентрация токсина продолжала расти, поддерживалась на одном уровне после 28 часов культивирования, и показала конечное значение 38,39 мкг/мл.
Исходя из этого, в одном аспекте, настоящее изобретение относится к составу среды для культивирования Clostridium botulinum, содержащей: по меньшей мере, один пептон растительного происхождения, выбранный из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы.
При использовании в данном описании, термин «пептон растительного происхождения» означает пептон, извлеченный из садового гороха, семян хлопчатника или клейковины пшеницы. Предпочтительно, пептон растительного происхождения может быть коммерчески доступным Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504 или HyPep™ 4601N, без ограничения указанным.
При использовании в данном описании, термин «пептон растительного происхождения» или «гидролизат растительного происхождения» означает продукт, полученный путем деградации белка, выделенного из растения. Например, пептон садового гороха (гидролизат садового гороха) означает продукт, полученный путем деградации общего белка, выделенного из садового гороха.
Деградацию белка растительного происхождения предпочтительно осуществляют путем частичного гидролиза. Деградацию белка предпочтительно осуществляют путем обработки кислотой, обработки основанием, ферментативной обработкой, обработки под высоким давлением, термической обработкой или физической обработкой. Более предпочтительно, пептон растительного происхождения может быть получен путем обработки ферментом. Физическая обработка представляет собой, например, дробление.
Пептон растительного происхождения, который используется в настоящем изобретении, представляет собой продукт частичной деградации белка растительного происхождения, представляет собой смесь, содержащую не только аминокислоты, которые являются отдельными молекулами, но также и пептиды, состоящие от нескольких до нескольких десятков аминокислот, и интактные молекулы белка.
В настоящем изобретении, содержание пептонов растительного происхождения в составе среды могут составлять 0,1-10% масс./об. (1-100 г/л), предпочтительно 0,2-5% масс./об. (2-50 г/л), более предпочтительно, 0,5-2% масс./об. (5-20 г/л).
В настоящее изобретении композиция среды содержит все из числа гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопка и гидролизата пшеничной клейковины, и относительное содержание гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы в композиции среды может составлять 1: 0,24-43,62: 0,01-50,57 по массе, предпочтительно от 1: 0,68-14,46: 0,09-9,87 по массе, более предпочтительно от 1: 1,6-2,4: 0,6-1,4 по массе.
В настоящем изобретении композиция среды для культивирования Clostridium botulinum может дополнительно содержать источник углерода и, по меньшей мере, одно минеральное вещество, выбранное из группы, состоящей из K2HPO4 (дикалий фосфат), Na2HPO4 (динатрий фосфат) и КН2РО4 (монокалийфосфат).
В данном случае примеры источника углерода включают, без ограничения указанным, моносахариды (например, глюкозу, фруктозу и т.д.), дисахариды (например, мальтозу, сахарозу и т.д.), олигосахариды, полисахариды (например, декстрин, циклодекстрин, крахмал и т.д.), сахарные спирты (например, ксилит, сорбит, эритрит и т.д.).
В настоящем изобретении содержание минерала в композиции среды может составлять 0,05-3,5 масс./об.% (0,5-35 г/л), предпочтительно 0,1-1,75 масс./об.% (1-17,5 г/л), и более предпочтительно 0,25-0,7 масс./об.% (2,5-7 г/л).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ботулинического токсина, включающему следующие стадии: (а) культивирование Clostridium botulinum, с использованием описанной выше композиции среды для получения ботулинического токсина; и (b) выделение полученного ботулинического токсина.
В настоящем изобретении, культивирование можно проводить в анаэробных условиях, и ботулинический токсин может быть выбран из группы, состоящей из ботулинического токсина типов A, B, C, D, E, F и G.
Примеры
В дальнейшем настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Для специалиста, имеющего обычный опыт в данной области техники, будет очевидно, что эти примеры представлены только в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения будет определен приложенной формулой изобретения и ее эквивалентами.
Пример 1. Культивирование Clostridium botulinum в среде с пептоном растительного происхождения
1-1. Композиция среды, используемой в настоящее время при культивировании
Реагенты и компоненты среды, используемые в настоящем изобретении, были приобретены у Sigma (США), Kerry Inc. (США), BD Biosciences (США), Gibco Life Technologies (США) и Quest (США).
Среда, используемая в настоящее время, имеет композицию, включающую 2% гидролизата казеина (20 г/л), 1% дрожжевого экстракта (10 г/л), 1% глюкозы (10 г/л) и 0,5% тиогликолевой среды (5 г/л), использовалась для посевной культуры и основной культуры Clostridium botulinum для выработки ботулинического токсина. 5 г тиогликолевой среды на литр среды, используемой в настоящее время, которая состоит из 2,52 г ферментативного гидролизата казеина, 0,84 г дрожжевого экстракта, 0,925 г декстрозы, 0,085 г тиогликолята натрия, 0,42 г NaCl, 0,085 г L-цистеина, 0,00014 г ресазурина и 0,125 г бактериологического агара.
1-2. Композиция APF-среды, используемой при культивировании
Среду отрицательного контроля получали путем удаления гидролизата казеина, дрожжевого экстракта и тиогликолевой среды из среды, используемой в настоящее время (оригинальная среда), для культивирования Clostridium botulinum, и среду, которая не содержит белки животного происхождения (APF), получали путем добавления четырех кандидатов пептонов растительного происхождения (Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504 и HyPep™ 4601N) к среде отрицательного контроля (таблица 1).
В таблице 1 показаны компоненты APF-среды, содержащей пептон растительного происхождения для культивирования Clostridium botulinum, в сравнении со средой, которая используется в настоящее время.
Таблица 1
| Компоненты среды | Концентрация (г/л) | Среда, которая используется в настоящее время | Отрицательный контроль |
APF-среда |
| Глюкоза | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Хлорид натрия (NaCl) | 0,42 | 0,42 | 0,42 | 0,42 |
| Гидролизат казеина | 20 | 20 | - | - |
| Экстракт дрожжей | 10 | 10 | - | - |
| Тиогликолевая среда | 5 | 5 | - | - |
| Hv-Pea™ 7404 | 20 | - | - | 20 |
| UltraPep™ Cotton | 10 | - | - | 10 |
| HyPep™ 7504 | 10 | - | - | 10 |
| HyPep™ 4601N | 10 | - | - | 10 |
1-3. Посевная культура Clostridium botulinum
20 мкл Clostridium botulinum (Корейские центры по контролю и профилактике заболеваний, Учетный номер: 4-029-CBB-IS-001) высевали в культуральную пробирку, содержащую 10 мл стерильной среды, имеющей каждую из композиций, описанных в примерах 1 -1 и 1-2 и подвергали первичному посевному культивированию (стационарные культуры) при 35°C в течение 22-30 часов в анаэробных условиях. Когда рост бактерий в первичной посевной культуре был подтвержден, 8 мл первичной посевной культуры инокулировали в 1-литровую культуральную бутыль, содержащую 800 мл стерильной среды, имеющей такую же композицию среды, и подвергали второму посевному культивированию (стационарная культура) при 35°C в течение 8-15 часов в анаэробных условиях.
1-4. Основная культура Clostridium botulinum
Для того чтобы получить ботулинический токсин путем культивирования Clostridium botulinum, была получена основная культура бактерий. В частности, 9,3 литра среды, имеющей каждую из композиций, описанных в примерах 1-1 и 1-2, получали и помещали в 10 литровый инкубатор после стерилизации среды. Подавали азот для создания анаэробных условий и рост бактерий проводили при температуре 35°C и скорости перемешивания 50 оборотов в минуту.
Вторичную посевную культуру в 1-литровой культуральной бутыли в примере 1-3, вносили в 10-литровый инкубатор через инокуляционную линию, подключенную к порту для инокуляции 10-литрового инкубатора. Clostridium botulinum в 10-литровом инкубаторе культивировали в условиях 35°C при 50 оборотах в минуту, и набор условий культивирования контролировали и записали. Когда бактерии культивировали в течение 100 часов или более, основную культуру завершали.
Рост Clostridium botulinum в среде без животных белков (AFP), полученной путем добавления четырех пептонов-кандидатов растительного происхождения (Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504 и HyPep™ 4601N) к среде отрицательного контроля сравнивали с ростом бактерии в среде отрицательного контроля, полученной путем удаления гидролизат казеина, дрожжевого экстракта и тиогликолевой среды из среды, которая используется в настоящее время (исходная среда) (таблица 1).
В результате, как показано в таблице 1 и на фиг. 1, Clostridium botulinum не росли в среде отрицательного контроля, но начали расти в исходной среде (среде, которая используется в настоящее время) в течение 24 часов после инокуляции бактерий и начали расти в среде содержащей пептон растительного происхождения через 30 часов после инокуляции бактерии.
Пример 2. Культура Clostridium botulinum в среде, содержащей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины
Поскольку рост Clostridium botulinum в среде, приготовленной путем добавления четырех пептонов растительного происхождения в примере 1, был медленнее, чем в исходной среде, к ней были добавлены растворы, как указано далее.
1) Для того чтобы изучить эффект функционирования тиогликолята для получения анаэробных условий, тиогликолят удаляли из исходной среды (среды, используемой в настоящее время), и анализировали изменение скорости роста бактерий в среде без тиогликолята.
2) Поскольку замедленная скорость роста может быть результатом отсутствия источника азота, концентрация пептона в среде, используемой для культивирования бактерий, была увеличена в два раза.
3) Рост Clostridium botulinum в среде, полученной добавлением минеральных веществ, аминокислот и витаминов в среду, содержащую пептон растительного происхождения, сравнивали с ростом Clostridium botulinum в AFP-среде, раскрытой в патенте США № 8 012 716 (Allergan) (таблица 2).
В таблице 2 показаны компоненты среды для культивирования Clostridium botulinum, которая содержит пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины.
Таблица 2
| Компоненты среды | г/л | Среда, которая используется в настоящее время | 1 (Кандидат APF-среды) |
2 (Кандидат APF-среды) |
3 (Кандидат APF-среды) |
4 (Кандидат APF-среды) |
APF Среда Allergan Company |
| глюкоза | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 15 |
| Хлорид натрия (NaCl) | 0,42 | 0,42 | 0,42 | 0,42 | 0,42 | 0,42 | - |
| Гидролизат казеина | 20 | 20 | 20 | - | - | - | - |
| Экстракт дрожжей | 10 | 10 | 10 | - | - | - | 12 |
| Тиогликолевая среда | 5 | 5 | - | - | - | - | - |
| Hy-Pea™ 7404 | 20 | - | - | 20 | 40 | 20 | - |
| UltraPep™ Cotton | 10 | - | - | 10 | 20 | 10 | - |
| HyPep™ 7504 | 10 | - | - | 10 | 20 | 10 | - |
| HyPep™ 4601N | 10 | - | - | 10 | 20 | 10 | - |
| KH2PO4 | 7 | - | - | - | - | 4 | - |
| K2HPO4 | 5,5 | - | - | - | - | 5,5 | |
| Na2HPO4 | 5 | - | - | - | - | 5 | - |
| MgSO4 7H2O | 10 | - | - | - | - | 10 | - |
| Витаминный набор 100X | - | - | - | - | 1X | - | |
| Аминокислотная смесь 50X | - | - | - | - | 1X | - | |
| Соевый пептон | 32,5 | - | - | - | - | - | 32,5 |
В результате, как показано в таблице 2 и на фиг. 2, когда бактерию культивировали в среде, используемой в настоящее время, без тиогликолята, скорость роста бактерий в среде была медленнее, чем в тиогликолят-содержащей среде, что говорит о том, что тиогликолят влияет на скорость роста бактерии. Когда концентрация пептона в среде выросла в два раза, бактерия в среде не росла. В случае, когда минеральные компоненты, аминокислоты и витамины были добавлены к пептон-содержащей среде, скорость роста бактерии была похожа на скорость в среде, которая используется в настоящее время, но после стерилизации среды образовался осадок. Кроме того, было видно, что скорость роста бактерий в APF-среде Allergan’s была похожа на скорость в среде, которая используется в настоящее время.
Пример 3. Получение осадка путем стерилизации среды, содержащей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоту и витамин
В примере 2, было обнаружено, что скорость роста Clostridium botulinum в среде, содержащей пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины, из числа кандидатов APF-среды 2-4, представленных в таблице 2, были похожими на среду, используемую в настоящее время. Однако после стерилизации среды имело место образование осадка, и была исследована причина этого (таблица 3).
В таблице 3 показаны компоненты среды для культивирования Clostridium botulinum, которая была использована для стерилизации, включающие пептоны растительного происхождения, минеральные вещества, аминокислоты и витамины.
Таблица 3
| Компоненты среды | г/л | Среда, которая используется в настоящее время | 1 (Кандидат APF-среды) |
2 (Кандидат APF-среды) |
3 (Кандидат APF-среды) |
4 (Кандидат APF-среды) |
| Глюкоза | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Хлорид натрия (NaCl) | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Гидролизат казеина | 20 | 20 | - | - | - | - |
| Экстракт дрожжей | 10 | 10 | - | - | - | - |
| Тиогликолевая среда | 5 | 5 | - | - | - | - |
| Hv-Pea™ 7404 | 20 | - | 20 | 20 | 20 | 20 |
| UltraPep™ Cotton | 10 | - | 10 | 10 | 10 | 10 |
| HyPep™ 7504 | 10 | - | 10 | 10 | 10 | 10 |
| HyPep™ 4601N | 10 | - | 10 | 10 | 10 | 10 |
| KH2PO4 | 7 | - | - | 7 | - | - |
| K2HPO4 | 5,5 | - | 5,5 | 5,5 | - | - |
| Na2HPO4 | 5 | - | 5 | 5 | - | - |
| MgSO4 7H2O | 10 | - | 10 | 10 | - | - |
| Витаминный набор 100x |
- | 1X | - | 1X | 1X (добавление после стерилизации) | |
| Аминокислотная смесь 50 х | - | 1X | - | 1X | 1X (добавление после стерилизации) |
В результате, как показано в таблице 3 и на фиг. 3, осадок после стерилизации среды образовывался только в том случае, когда минеральные вещества были добавлены к среде, содержащей пептон растительного происхождения, что свидетельствует о том, что основной причиной образования осадка являлись минеральные вещества. Это, как предполагается, происходило потому, что минеральные компоненты взаимодействуют друг с другом в условиях высокой температуры и высокого давления во время стерилизации среды.
Пример 4. Образование осадка при стерилизации среды, содержащей пептоны растительного происхождения и минеральные вещества
Для того чтобы определить минеральные компоненты, участвующие в формировании осадка, вызванного стерилизацией, подтвержденного в примере 3, добавляли различные комбинации различных компонентов в среды с последующей стерилизацией (таблица 4).
В таблице 4 показаны компоненты сред для культивирования Clostridium botulinum, которые содержат пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, а также результаты стерилизации этих сред.
Таблица 4
| Компоненты среды | г/л | Среда, которая используется в настоящее время | 1 (кандидат APF- Среды) |
2 (кандидат APF- Среды) |
3 (кандидат APF- Среды) |
4 (кандидат APF- Среды) |
5 (кандидат APF- Среды) |
6 (кандидат APF- Среды) |
7 (кандидат APF- Среды) |
8 (кандидат APF- Среды) |
9 (кандидат APF- Среды) |
10 (кандидат APF- Среды) |
11 (кандидат APF- Среды) |
12 (кандидат APF- Среды) |
| глюкоза | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Хлорид натрия (NaCl) |
0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Гидролизат казеина | 20 | 20 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Экстракт дрожжей | 10 | 10 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Тиогликолевая среда | 5 | 5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Hv-Pea™ 7404 | 20 | - | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
| UltraPep™ Cotton | 10 | - | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| HyPep™ 7504 | 10 | - | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| HyPep™ 4601N | 10 | - | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| KH2PO4 | 7 | - | - | 7 | - | 7 | 7 | 7 | - | 7 | 7 | - | - | 10 |
| K2HPO4 | 5,5 | - | - | 5,5 | 5,5 | - | 5,5 | 5,5 | - | - | 5,5 | 5,5 | 5,5 | - |
| Na2HPO4 | 5 | - | - | 5 | 5 | 5 | - | 5 | 5 | - | - | 5 | - | 5 |
| MgSO4 7H2O | 10 | - | - | 10 | 10 | 10 | 10 | - | 10 | 10 | - | - | 10 | - |
| осадок, агрегация | x | 0 | 0 | 0 | 0 | x | 0 | x | x | x | 0 | x |
В результате, как показано в таблице 4 и на фиг. 4, среди сред, содержащих пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, среда, содержащая MgSO4 7H2O и K2HPO4 и среда, содержащая MgSO4 7H2O и Na2HPO4, образовали осадок после стерилизации.
Пример 5. Культивирование Clostridium botulinum в условиях, в которых не образуется осадок в APF-среде
Эксперимент был проведен для того, чтобы определить, возможно ли культивирование Clostridium botulinum, когда в APF-среду примера 4, содержащей пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, дополнительно добавлены витамины и аминокислоты. Кроме того, был проведен эксперимент для исследования возможности культивировании бактерии в среде, которая не содержит пептон растительного происхождения и минеральные вещества и содержит витамины, аминокислоты и/или «BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine» (каталожный № 670002, BD Bioscience) (компонент среды на основе дрожжевого экстракта без глюкозы и L-глутамина) (таблица 5).
В таблице 5 показаны компоненты сред, полученных путем дополнительного добавления витаминов, аминокислот и «BD Recharge™ без глюкозы и L-глутамин» к среде для культивирования Clostridium botulinum, которая содержит пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, и темпы роста бактерии в средах.
Таблица 5
| Компоненты среды | г/л | Среда, которая используется в настоящее время | 1 (кандидат APF- Среды) |
2 (кандидат APF- Среды) |
3 (кандидат APF- Среды) |
4 (кандидат APF- Среды) |
5 (кандидат APF- Среды) |
6 (кандидат APF- Среды) |
7 (кандидат APF- Среды) |
8 (кандидат APF- Среды) |
9 (кандидат APF- Среды) |
10 (кандидат APF- Среды) |
11 (кандидат APF- Среды) |
12 (кандидат APF- Среды) |
| глюкоза | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Хлорид натрия (NaCl) |
0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Гидролизат Казеина | 20 | 20 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Экстракт дрожжей | 10 | 10 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Тиогликолевая среда | 5 | 5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Тиогликолят натрия | 1 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 1 | - | - | - |
| Hy-Pea™ 7404 | 20 | - | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 2d | 20 | - | - |
| UltraPep™ Cotton | 10 | - | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | - | - |
| HyPep™ 7504 | 10 | - | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | - | - |
| НуPep™ 460IN | 10 | - | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | - | - |
| KH2PO4 | 7 | - | - | 7 | 7 | 7 | - | 7 | - | - | - | - | - | - |
| K2HPO4 | 5,5 | - | - | 5,5 | - | 5,5 | 5,5 | - | - | - | - | - | - | - |
| Na2HPO4 | 5 | - | - | 5 | - | - | - | 5 | - | - | - | - | - | - |
| MgSO4 7H2O | 10 | - | - | - | 10 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Витаминный набор, 100X | - | - | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | - | - | 1X | - | 1X | |
| Аминокислотная смесь, 50X | - | - | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | - | - | 1X | - | 1X | |
| Без глюкозы и L-глютамина | 45,42 | - | - | - | - | - | - | - | - | 45,42 | - | 45,42 | 45,42 | 45,42 |
| Рост | X | 0 | X | 0 | 0 | 0 | X | X | X | X | Х | 0 | ||
| Подробности | Рост в те-че-ние 24 ч | Рост в те-че-ние 24 ч | Рост в тече-ние 24 ч | Рост в тече-ние 24 ч | Рост в тече-ние 24 ч |
В результате, как показано в таблице 5 и на фиг. 5, только в том случае, когда среда содержала пептоны растительного происхождения и комбинацию двух или более минералов KH2PO4, K2HPO4 и Na2HPO4 и дополнительно содержала витамины и аминокислоты, Clostridium botulinum росли в пределах 24 часов после инокуляции бактерий. Кроме того, в случае, когда среда не содержала пептона растительного происхождения и содержала минеральные вещества и витамины, аминокислоты и «BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine», бактерия росла в пределах 48 часов после инокуляции бактерии. В заключение необходимо отметить, что наиболее подходящая композиция среды для культивирования Clostridium botulinum включает пептоны растительного происхождения, KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4, аминокислоты и витамины.
Пример 6. Культивирование Clostridium botulinum в среде, содержащей различные пептоны растительного происхождения
Эксперимент проводили с целью изучения возможности культивирования Clostridium botulinum при добавлении различных комбинаций пептонов растительного происхождения к APF-среде примера 5.
В таблице 6 показаны компоненты сред для культивирования Clostridium botulinum, которые содержат различные пептоны растительные происхождения, и результаты изучения роста бактерии в средах.
Таблица 6
| Компоненты среды | г/л | Среда, которая используется в настоящее время | 1 (кандидат APF- Среды) |
2 (кандидат APF- Среды) |
3 (кандидат APF- Среды) |
4 (кандидат APF- Среды) |
5 (кандидат APF- Среды) |
6 (кандидат APF- Среды) |
7 (кандидат APF- Среды) |
8 (кандидат APF- Среды) |
9 (кандидат APF- Среды) |
10 (кандидат APF- Среды) |
11 (кандидат APF- Среды) |
12 (кандидат APF- Среды) |
13 (кандидат APF- Среды) |
| Глюкоза | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Хлорид натрия (NaCl) | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Гидролизат казеина | 20 | 20 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Дрожжевой экстракт | 10 | 10 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Тиогликолевая среда | 5 | 5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Тиогликолят натрия | 0,1 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 0,1 | - |
| Hy-Pea™ 7404 | 10 | - | 10 | 10 | - | - | - | - | - | - | 10 | 10 | 10 | - | - |
| UltraPep™ Cotton | 10 | - | 10 | - | 10 | - | - | - | 10 | 10 | - | - | 10 | - | - |
| Ну Pep™ 7504 | 10 | - | 10 | - | - | 10 | - | 10 | - | 10 | - | 10 | - | - | - |
| HyPep™ 4601N | 10 | - | 10 | - | - | - | 10 | 10 | 10 | - | 10 | - | - | - | - |
| KH2PO4 | - | 7 | - | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | - | 7 | |
| K2HPO4 | 5,5 | - | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | - | 5,5 |
| Na2HPO4 | 5 | - | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | - | 5 |
| MgSO4 7H2O | 10 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Витаминный набор 100X | - | - | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | |
| Аминокислотная смесь 50 X | - | - | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | 1X | |
| Без глюкозы и L-глютамина | 45,42 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 45,42 | 45,42 |
| Рост | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | x | x |
В результате, как показано в таблице 6 и на фиг. 6, даже тогда, когда только или два из четырех пептонов растительного происхождения были добавлены к среде, культивирование Clostridium botulinum было возможно.
Принимая в расчет результаты примеров 5 и 6, можно увидеть, что, по меньшей мере, один пептон растительного происхождения должен содержаться в среде и что пептон растительного происхождения не может быть замещен «BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine» (кат. № 670002, BD Bioscience) (компонент среды на основе дрожжевого экстракта без глюкозы и L-глутамина).
Пример 7. Эксперимент по отбору двух из трех типов минеральных веществ, содержащихся в среде
В примерах с 1 по 7, было установлено, что композиция APF-среды, используемой для культивирования Clostridium botulinum, включает глюкозу, хлорид натрия (NaCl), четыре пептона растительного происхождения, три минеральных вещества, аминокислоты и витамины. Из числа этих компонентов среды, компоненты среды, не оказывающие существенного влияния на рост бактерии, были удалены для того, чтобы уменьшить количество компонентов среды. Таким образом, был сделан вывод, что аминокислоты и витамины не оказывают существенного влияния на рост Clostridium botulinum, и согласно этому суждению, аминокислоты и витамины были удалены из компонентов среды. Кроме того, для того чтобы выбрать два из трех типов минеральных веществ, бактерию культивировали с использованием композиций среды, приведенной в таблице 7, и значения OD (540 нм и 600 нм) через 24 и 48 часов после инокуляции бактерии измеряли и сравнивали.
В таблице 7 представлены композиции сред, полученные в результате отбора минеральных веществ первой стадии, и рост Clostridium botulinum в этих средах.
Таблица 7
| Компоненты среды | г/л | Среда, которая используется в настоящее время | 1 (кандидат APF- Среды) |
2 (кандидат APF- Среды) |
3 (кандидат APF- Среды) |
4 (кандидат APF- Среды) |
5 (кандидат APF- Среды) |
6 (кандидат APF- Среды) |
7 (кандидат APF- Среды) |
8 (кандидат APF- Среды) |
9 (кандидат APF- Среды) |
10 (кандидат APF- Среды) |
11 (кандидат APF- Среды) |
| глюкоза | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Хлорид натрия (NaCl) |
0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Гидролизат казеина | 20 | 20 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Экстракт дрожжей | 10 | 10 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Тиогликолевая кислота | 5 | 5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Hv-Pep™ 7404 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| UltraPep™ Cotton | 10 | _ | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| HyPep™ 7504 | 10 | - | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Ну Pep™ 460 IN | 10 | - | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| KH2PO4 | 7 | - | - | 7 | - | 7 | - | 7 | - | 7 | 3,5 | 3,5 | 3,5 |
| K2HPO4 | 5,5 | - | - | - | 5,5 | 5,5 | - | - | 5,5 | 5,5 | 2,75 | 2,75 | 2,75 |
| Na2HPO4 | 5 | - | - | - | - | - | - | - | 5 | 5 | 2,5 | 2,5 | 2,5 |
| OD 24 ч культуры |
540 нм | 0,942 | -0,017 | -0,024 | 4,396 | 3,226 | 4,218 | 3,214 | 4,964 | 3,991 | 3,951 | 3,938 | 3,594 |
| 600 нм | 0,780 | -0,016 | -0,020 | 3,832 | 2,691 | 3,593 | 2,680 | 4,304 | 3,351 | 3,341 | 3,335 | 3,036 | |
| OD 48 ч культуры |
540 нм | 2,459 | -0,014 | -0,019 | 4,716 | 5,220 | 3,502 | 5,460 | 2,056 | 2,603 | 5,726 | 5,682 | 5,434 |
| 600 нм | 2,057 | -0,015 | -0,018 | 3,852 | 4,288 | 2,989 | 4,480 | 1,587 | 2,020 | 4,688 | 4,647 | 4,459 |
В результате, как показано в таблице 7, через 24 часа после инокуляции бактерии, среда, которая используется в настоящее время, продемонстрировала значение OD (540 нм) 0,942, а APF-среда, содержащая K2HPO4 и Na2HPO4, показала самое высокое значение OD (540 нм), равное 4,964, среди AFP-сред. Кроме того, через 48 часов после инокуляции бактерий, APF-среда, содержащая KH2PO4 и Na2HPO4 показала самое высокое значение OD и активный бактериальный рост.
Тем временем, как показано на фиг. 7а–7d, были созданы контурные диаграммы K2HPO4 и Na2HPO4, демонстрирующие высокие основные эффекты. В результате, поскольку концентрации K2HPO4 и Na2HPO4 увеличились, увеличилось и значение OD. И Clostridium botulinum показали самый высокий рост, когда к среде были добавлены минеральные вещества в концентрации КН2РО4 = 0 г/л, K2HPO4 = 5,5 г/л, и Na2HPO4 = 5 г/л.
Тем временем, для того чтобы подтвердить результаты бактериальной культуры в соответствии с более точным добавлением минералов, провели вторую стадию эксперимента с использованием методологии поверхности отклика. Так как композиция среды не может иметь отрицательное значение, был запланирован эксперимент с использованием центрального композиционного плана (CCF, central composite faced) и было проведено культивирование бактерии в композициях среды, показанных в таблице 8. Затем, экспериментальные результаты были объединены с результатами ранее выполненного FFD и подвергнуты статистическому анализу.
В таблице 8 представлены композиции сред, полученные в результате отбора минеральных веществ второй стадии, и рост Clostridium botulinum в этих средах.
Таблица 8
| Компоненты среды | г/л | 1 (кандидат APF- Среды) |
2 (кандидат APF- Среды) |
3 (кандидат APF- Среды) |
4 (кандидат APF- Среды) |
5 (кандидат APF- Среды) |
6 (кандидат APF- Среды) |
7 (кандидат APF- Среды) |
8 (кандидат APF- Среды) |
9 (кандидат APF- Среды) |
Среда, которая используется в настоящее время |
| Глюкоза | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Хлорид натрия (NaCl) | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | - |
| Гидролизат казеина | 20 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 20 |
| Экстракт дрожжей | 10 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 10 |
| Тиогликолевая среда | 5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 5 |
| Hy-Pea™ 7404 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | - |
| UltraPep™ Cotton | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | - |
| Ну Pep™ 7504 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | - |
| Ну Pep™ 4601N | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | - |
| KH2PO4 | 7 | - | 7 | 3,5 | 3,5 | 3,5 | 3,5 | 3,5 | 3,5 | 3,5 | - |
| К2НРО4 | 5,5 | 2,75 | 2,75 | 2,75 | 2,75 | 2,75 | 2,75 | 2,75 | 2,75 | 2,75 | - |
| Na2HPO4 | 5 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | - | 5 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | - |
| OD 24 ч | 540 нм | 4,408 | 3,587 | 2,233 | 4,639 | 1,778 | 4,332 | 3,904 | 3,907 | 4,046 | 1,556 |
| 600 нм | 3,836 | 3,086 | 1,896 | 4,068 | 1,503 | 3,777 | 3,366 | 3,368 | 3,505 | 1,307 | |
| OD 48 ч | 540 нм | 5,021 | 5,760 | 4,359 | 3,594 | 4,529 | 4,054 | 6,492 | 5,621 | 5,473 | 3,622 |
| 600 нм | 4,284 | 4,925 | 3,695 | 3,049 | 3,832 | 3,457 | 5,603 | 4,830 | 4,677 | 3,062 |
Контурные диаграммы были составлены и использованы для сравнения. Как показано на фиг. 8а-8d, значение OD увеличивается по мере уменьшения концентрации КН2РО4. При сравнении оптимальных условий, результаты отличались от результатов FFD из-за эффекта кривизны, а величина K2HPO4 была такой же, но величина Na2HPO4 изменяется от 5 г/л до 3,1313 г/л. Таким образом, путем статистического анализа было подтверждено, что оптимальные минеральные условия среды представляют собой 5,5 г/л К2HPO4 и 3 г/л Na2HPO4.
Пример 8. Эксперимент по отбору пептонов растительного происхождения, содержащихся в среде
Как показано в таблицах 9 и 10, пептоны растительного происхождения были объединены в соответствии с дизайном смеси, и был исследован рост Clostridium botulinum в среде, содержащей комбинацию пептонов растительного происхождения.
В таблице 9 представлены композиции сред, полученных отбором первой стадии из пептонов растительного происхождения и рост Clostridium botulinum с использованием данных сред.
Таблица 9
| Компоненты среды | г/л | 1 (кандидат APF- Среды) |
2 (кандидат APF- Среды) |
3 (кандидат APF- Среды) |
4 (кандидат APF- Среды) |
5 (кандидат APF- Среды) |
6 (кандидат APF- Среды) |
7 (кандидат APF- Среды) |
8 (кандидат APF- Среды) |
9 (кандидат APF- Среды) |
10 (кандидат APF- Среды) |
11 (кандидат APF- Среды) |
Среда, которая используется в настоящее время |
| глюкоза | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Хлорид натрия (NaCl) |
0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | - |
| Гидролизат казеина | 20 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 20 |
| Экстракт дрожжей | 10 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 10 |
| Тиогликолевая среда | 5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 5 |
| Hy-Pea™ 7404 | 10 | 5 | 10 | 5 | 5 | - | - | 6,667 | 6,667 | - | - | 10 | - |
| UltraPep™ Cotton | 10 | 5 | - | 5 | 5 | 10 | - | 6,667 | 6,667 | 20 | - | 10 | - |
| HyPep™ 7504 | 10 | 5 | 10 | 5 | 5 | - | 10 | - | 6 667 | - | 20 | 10 | - |
| HyPep™ 4601N | 10 | 5 | - | 5 | 5 | 10 | 10 | 6,667 | - | - | - | 10 | - |
| K2HPO4 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | - |
| NA2HPO4 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | - |
| OD 24 ч | 540 нм | 3,541 | 2,440 | 3,345 | 3,305 | 3,317 | 2,852 | 3,695 | 2,772 | 2,353 | 1,688 | 4,842 | 2,239 |
| 600 нм | 3,058 | 2,066 | 2,868 | 2,831 | 2,853 | 2,445 | 3,183 | 2,376 | 2,014 | 1,419 | 4,245 | 1,893 | |
| OD 48 ч | 540 нм | 0,811 | 0,935 | 0,731 | 0,799 | 1,400 | 0,777 | 1,660 | 1,090 | 1,810 | 1,402 | 2,093 | 3,341 |
| 600 нм | 0,714 | 0,795 | 0,647 | 0,694 | 1,199 | 0,680 | 1,403 | 0,929 | 1,548 | 1,210 | 1,764 | 2,812 |
В таблице 10 представлены композиции сред, полученные отбором второй стадии из пептонов растительного происхождения и рост Clostridium botulinum с использованием данных сред.
Таблица 10
| Компоненты среды | г/л | 1 (кандидат APF- Среды) |
2 (кандидат APF- Среды) |
3 (кандидат APF- Среды) |
4 (кандидат APF- Среды) |
5 (кандидат APF- Среды) |
6 (кандидат APF- Среды) |
7 (кандидат APF- Среды) |
8 (кандидат APF- Среды) |
9 (кандидат APF- Среды) |
10 (кандидат APF- Среды) |
11 (кандидат APF- Среды) |
12 (кандидат APF- Среды) |
13 (кандидат APF- Среды) |
Среда, которая используется в настоящее время |
| глюкоза | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Хлорид натрия (NaCl) |
0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | - |
| Гидролизат казеина | 20 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 20 |
| Экстракт дрожжей | 10 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 10 |
| Тиогликолевая среда | 5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 5 |
| Hy-Pea™ 7404 | 10 | 5 | 5 | 10 | 10 | 5 | 20 | 6,667 | 10 | 10 | 10 | - | |||
| UltraPep™ Cotton | 10 | 5 | 5 | 10 | 6,667 | 10 | - | 5 | - | - | - | 10 | 10 | 10 | - |
| HyPep™ 7504 | 10 | 5 | 5 | 10 | 6,667 | - | - | 5 | - | - | 6,667 | 10 | 10 | 10 | - |
| Ну Pep™ 4601N | 10 | 5 | 5 | - | 6,667 | - | 10 | 5 | - | 20 | 6,667 | 10 | 10 | 10 | - |
| K2HPO4 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | - |
| Na2HPO4 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | - | |
| OD 24 ч | 540 нм | 3,425 | 3,640 | 2,349 | 2,581 | 3,272 | 1,289 | 3,514 | 0,776 | 1,257 | 3,457 | 5,376 | 5,235 | 4,809 | 2,208 |
| 600 нм | 2,969 | 3,159 | 2,029 | 2,244 | 1,096 | 1,096 | 3,032 | 0,649 | 1,098 | 2,950 | 4,689 | 4,534 | 4,246 | 1,863 | |
| OD 48 ч | 540 нм | 0,769 | 0,836 | 1,633 | 0,961 | 1,501 | 1,148 | 0,803 | 0,880 | 1,278 | 0,962 | 1,986 | 1,994 | 2,010 | 3,185 |
| 600 нм | 0,675 | 0,732 | 1,420 | 0,854 | 1,270 | 0,982 | 0,698 | 0,744 | 1,124 | 0,818 | 1,708 | 1,710 | 1,717 | 2,708 |
В результате, как показано на фиг. 9а-9с, были получены контурные диаграммы, которые использовались для анализа. Было установлено, что HyPep™ 7504, соответствующий компоненту С, оказывает самое слабое влияние на рост Clostridium botulinum. Исходя из этого определения, HyPep™ 7504 был исключен из компонентов среды. В заключение, было установлено, что композиция окончательно подобранных пептонов растительного происхождения, которые содержатся в среде, включает 5 г/л Hy-Pea™ 7404, 10 г/л UltraPep™ Cotton и 5 г/л HyPep™ 4601N.
Пример 9. Культивирование Clostridium botulinum в среде, содержащей или не содержащей NaCl
Композиции сред, используемых в примерах 1-8, содержат небольшое количество (0,5 г/л) NaCl. Для того чтобы исследовать рост Clostridium botulinum в соответствии с изменением концентрации NaCl, содержание NaCl в среде доводили до диапазона от 0 до 1 г/л, с последующим культивированием бактерии в среде.
В таблице 11 показаны компоненты NaCl-содержащей среды для культивирования Clostridium botulinum и рост Clostridium botulinum в средах.
Таблица 11
| Компоненты среды | г/л | 1 (кандидат APF- Среды) |
2 (кандидат APF- Среды) |
3 (кандидат APF- Среды) |
4 (кандидат APF- Среды) |
5 (кандидат APF- Среды) |
6 (кандидат APF- Среды) |
7 (кандидат APF- Среды) |
8 (кандидат APF- Среды) |
9 (кандидат APF- Среды) |
| глюкоза | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Хлорид натрия (NaCl) |
0,5 | - | - | - | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 1 | 1 | 1 |
| Hy-Pea™ 7404 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| UltraPep™ Cotton | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| HyPep™ 4601N | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| K2HPO4 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 |
| Na2HPO4 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| OD 24 ч | 540 нм | 2,166 | 2,154 | 2,151 | 2,148 | 2,115 | 2,120 | 2,145 | 2,147 | 2,140 |
| 600 нм | 1,940 | 1,923 | 1,922 | 1,922 | 1,892 | 1,896 | 1,919 | 1,922 | 1,917 |
В результате, как показано на фиг. 11, не было никакой разницы в росте бактерий, из-за наличия или отсутствия в среде NaCl. Таким образом, NaCl, был исключен из конечных компонентов APF-среды.
Пример 10. Измерение паттерна роста Clostridium botulinum в окончательно подобранной APF-среде и концентрации токсина
Clostridium botulinum высевали в окончательно подобранную среду для культивирования Clostridium botulinum (10 г/л глюкозы, 5 г/л Hy-Pea™ 7404, 10 г/л UltraPep™ Cotton, 5 г/л HyPep™ 4601N, 5,5 г/л К2HPO4, и 3 г/л Na2HPO4), определенной на основании результатов примеров 1-9, а затем измеряли паттерн роста бактерий и концентрацию токсина.
Таблица 12 показывает времязависимое значение OD и концентрации токсина Clostridium botulinum, выращенной в окончательно подобранной AFP-среде.
Таблица 12
| Время Культивирования (час) | OD | Концентрация токсина в надосадочной жидкости (мкг/мл) |
Общая концентрация токсина после разрыва штамма (мкг/мл) | |
| 540 нм | 600 нм | |||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 6 | 0,0953 | 0,0393 | 0,00 | 0,00 |
| 9 | 0,0648 | 0,0525 | 0,00 | 0,00 |
| 12 | 0,5003 | 0,4411 | 0,00 | 0,00 |
| 14 | 1,1328 | 0,9958 | 2,18 | 2,04 |
| 16 | 1,6252 | 1,4484 | 4,64 | 10,22 |
| 18 | 2,3435 | 2,0215 | 6,77 | 18,15 |
| 20 | 2,777 | 2,4015 | 8,47 | 29,26 |
| 22 | 3,3485 | 2,896 | 9,46 | 31,86 |
| 24 | 3,5465 | 3,0695 | - | 31,73 |
| 28 | 3,452 | 2,982 | - | 37,31 |
| 36 | 2,5955 | 2,242 | 21,20 | 38,00 |
| 48 | 0,792 | 0,7224 | 31,41 | 38,39 |
В результате, как показано в таблице 12 и на фиг. 10, значение OD начало расти через 12 часов культивирования Clostridium botulinum, а через 24 часа культивирования культуральная среда показала OD540нм 3,5465 и OD600нм 3,0695. Затем, значение OD постепенно уменьшалось, а через 48 часов культивирования, культуральная среда показала OD540нм 0,792 и OD600нм 0,7224. Концентрация токсина в надосадочной жидкости Clostridium botulinum начала расти после 24 часов культивирования и показала конечное значение 31,41 мкг/мл. Когда концентрацию токсина измеряли после разрушения бактерии, токсин начал продуцироваться после 5 часов культивирования, и концентрация токсина продолжала расти, поддерживалась на одном уровне через 28 часов культивирования, и показала конечное значение 38,39 мкг/мл.
В заключении следует отметить, что, окончательно подобранная APF-композиция (среда без животных белков) была определена на основании результатов примеров 1-10, резюмированных в таблице 13.
Таблица 13
| Компоненты среды | г/л | |
| Источник углерода | глюкоза | 10 |
| Источник азота (растительный пептон) | Hy-Pea™ 7404 | 5 |
| UltraPep™ Cotton | 10 | |
| HyPep™ 4601N | 5 | |
| Минерал | K2HPO4 | 5,5 |
| Na2HPO4 | 3 | |
Промышленная применимость
Как описано выше, когда среда в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит пептоны растительного происхождения и минеральные вещества, используется для культивирования Clostridium botulinum, скорость роста бактерий в данной среде оказалась почти в 1,5-2 раза выше, чем в среде, которая используется в настоящее время. Кроме того, когда ботулинический токсин получают культивированием бактерии в данной среде, инфекция трансмиссивной губчатой энцефалопатией (TSE) или чем-либо подобным может быть предотвращена путем блокирования введения компонентов животного происхождения.
Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на специфические признаки, специалистам в данной области техники будет очевидно, что это описание предназначено только для описания предпочтительного воплощения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения будет определен приложенной формулой изобретения и ее эквивалентами.
Claims (10)
1. Композиция среды для культивирования Clostridium botulinum, которая включает:
0,1-10 масс./об.% по меньшей мере одного пептона растительного происхождения, выбранного из группы, состоящей из гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопчатника и гидролизата клейковины пшеницы,
0,25-1,5 масс./об.% источника углерода,
0,05-3,5 масс./об.% по меньшей мере одного минерального вещества, выбранного из группы, включающей K2HPO4 (дикалийфосфат), Na2HPO4 (динатрийфосфат) и KH2PO4 (монокалийфосфат).
2. Композиция среды по п. 1, отличающаяся тем, что содержание гидролизата садового гороха, гидролизата семян хлопка и гидролизата клейковины пшеницы в композиции среды имеет соотношение 1:0,24-43,62:0,01-50,57 по массе, при условии, что композиция среды содержит гидролизат садового гороха, гидролизат семян хлопка и гидролизат клейковины пшеницы.
3. Композиция среды по п. 1, отличающаяся тем, что пептон растительного происхождения подвергают обработке ферментом.
4. Способ получения ботулинического токсина, включающий следующие стадии:
(а) культивирование Clostridium botulinum с использованием композиции среды по любому из пп. 1-3 в анаэробных условиях, и
(b) выделение полученного ботулинического токсина.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что ботулинический токсин выбран из группы, состоящей из серотипов ботулинического токсина A, B, C, D, E, F и G.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2015-0059654 | 2015-04-28 | ||
| KR1020150059654A KR101723167B1 (ko) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물 |
| PCT/KR2016/004430 WO2016175565A1 (en) | 2015-04-28 | 2016-04-28 | Medium composition for preparing botulinum toxin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2663586C1 true RU2663586C1 (ru) | 2018-08-07 |
Family
ID=57199460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017120811A RU2663586C1 (ru) | 2015-04-28 | 2016-04-28 | Композиция среды и способ получения ботулинического токсина |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9926549B2 (ru) |
| EP (1) | EP3289069B1 (ru) |
| JP (2) | JP2018500880A (ru) |
| KR (1) | KR101723167B1 (ru) |
| CN (1) | CN107109354A (ru) |
| AR (1) | AR104419A1 (ru) |
| AU (1) | AU2016253788B2 (ru) |
| BR (1) | BR112017012885A2 (ru) |
| CA (1) | CA2968041A1 (ru) |
| DK (1) | DK3289069T3 (ru) |
| ES (1) | ES2846927T3 (ru) |
| HR (1) | HRP20210092T1 (ru) |
| HU (1) | HUE052935T2 (ru) |
| MX (1) | MX2017008197A (ru) |
| PL (1) | PL3289069T3 (ru) |
| PT (1) | PT3289069T (ru) |
| RU (1) | RU2663586C1 (ru) |
| SA (1) | SA517381720B1 (ru) |
| TW (1) | TWI592484B (ru) |
| WO (1) | WO2016175565A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2789552C1 (ru) * | 2019-03-29 | 2023-02-06 | Джетема Ко., Лтд. | Способ получения токсина |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101723167B1 (ko) | 2015-04-28 | 2017-04-05 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물 |
| KR101723168B1 (ko) * | 2015-04-28 | 2017-04-05 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물 |
| KR102209159B1 (ko) * | 2019-03-29 | 2021-01-29 | (주)제테마 | 독소의 제조방법 |
| GEP20247609B (en) * | 2019-12-20 | 2024-03-11 | Ipsen Biopharm Ltd | Ethod of producing botulinum toxin |
| KR102581772B1 (ko) * | 2021-03-30 | 2023-09-22 | 강원대학교 산학협력단 | 식물 및 곤충 단백질 가수 분해물을 이용한 배양육 제조를 위한 최적 배양 방법 및 그 응용 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050069562A1 (en) * | 2003-09-25 | 2005-03-31 | Allergan, Inc. | Animal product free media and processes for obtaining a botulinum toxin |
| RU2255761C1 (ru) * | 2004-07-01 | 2005-07-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Токсины и сопутствующие продукты" | Препарат для лечения мышечных дистоний из токсина культуры clostridium botulinum и способ его получения |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU5409799A (en) * | 1998-07-03 | 2000-01-24 | Dsm N.V. | Fermentation process to produce clavulanic acid at a low concentration of free amino acids |
| US6558926B1 (en) | 1999-07-16 | 2003-05-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for production of tetanus toxin using media substantially free of animal products |
| US7160699B2 (en) | 2003-09-25 | 2007-01-09 | Allergan, Inc. | Media for clostridium bacterium and processes for obtaining a clostridial toxin |
| WO2006042542A2 (en) | 2004-10-19 | 2006-04-27 | Statens Serum Institut | Production of tetanus, diphtheria, and pertussis toxins and toxoids using fermentation media containing no components of animal or soy origin |
| CA2556796C (en) * | 2005-03-03 | 2018-01-23 | Allergan, Inc. | Animal product free system and process for purifying a botulinum toxin |
| NL1029059C2 (nl) | 2005-05-17 | 2006-11-20 | Noord Nl Oliemolen Holding B V | Peptidenpreparaat voor het groeien en/of kweken van micro-organismen en/of cellen. |
| FR2918671B1 (fr) * | 2007-07-10 | 2010-10-15 | Sanofi Pasteur | Milieu de culture d'haemophilus influenzae type b. |
| CN101698826A (zh) * | 2007-12-19 | 2010-04-28 | 杨宇 | 胰酪胨肉毒梭菌增菌肉汤 |
| KR20090120222A (ko) | 2008-05-19 | 2009-11-24 | (주)메디톡스 | 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법 |
| US8236356B2 (en) * | 2008-06-11 | 2012-08-07 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Growth medium for Clostridium histolyticum |
| BR102012013110A2 (pt) | 2012-05-31 | 2014-05-27 | Cristalia Prod Quimicos Farm | Meio de cultura para bactérias do gênero clostridium livre de componentes de origem animal e processo para produção de sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica |
| BR122016023101B1 (pt) | 2012-10-21 | 2022-03-22 | Pfizer Inc | Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile |
| CN103215310B (zh) * | 2013-03-27 | 2015-01-21 | 中棉紫光生物科技（上海）有限公司 | 用于发酵的棉籽蛋白及其制备方法和应用 |
| KR101339349B1 (ko) | 2013-08-02 | 2013-12-09 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조방법 |
| KR101723167B1 (ko) | 2015-04-28 | 2017-04-05 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물 |
| KR101723168B1 (ko) * | 2015-04-28 | 2017-04-05 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물 |
| KR101729251B1 (ko) * | 2015-04-28 | 2017-04-21 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물 |
-
2015
- 2015-04-28 KR KR1020150059654A patent/KR101723167B1/ko active IP Right Grant
-
2016
- 2016-04-27 TW TW105113079A patent/TWI592484B/zh active
- 2016-04-27 AR ARP160101185A patent/AR104419A1/es unknown
- 2016-04-28 CN CN201680004195.4A patent/CN107109354A/zh active Pending
- 2016-04-28 HU HUE16786751A patent/HUE052935T2/hu unknown
- 2016-04-28 RU RU2017120811A patent/RU2663586C1/ru active
- 2016-04-28 DK DK16786751.4T patent/DK3289069T3/da active
- 2016-04-28 PL PL16786751T patent/PL3289069T3/pl unknown
- 2016-04-28 BR BR112017012885A patent/BR112017012885A2/pt active Search and Examination
- 2016-04-28 AU AU2016253788A patent/AU2016253788B2/en active Active
- 2016-04-28 ES ES16786751T patent/ES2846927T3/es active Active
- 2016-04-28 US US15/521,817 patent/US9926549B2/en active Active
- 2016-04-28 EP EP16786751.4A patent/EP3289069B1/en active Active
- 2016-04-28 JP JP2017524476A patent/JP2018500880A/ja active Pending
- 2016-04-28 PT PT167867514T patent/PT3289069T/pt unknown
- 2016-04-28 WO PCT/KR2016/004430 patent/WO2016175565A1/en active Application Filing
- 2016-04-28 MX MX2017008197A patent/MX2017008197A/es unknown
- 2016-04-28 CA CA2968041A patent/CA2968041A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-06-14 SA SA517381720A patent/SA517381720B1/ar unknown
-
2018
- 2018-02-09 US US15/893,297 patent/US10465179B2/en active Active
-
2019
- 2019-06-05 JP JP2019105170A patent/JP6888049B2/ja active Active
-
2021
- 2021-01-19 HR HRP20210092TT patent/HRP20210092T1/hr unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050069562A1 (en) * | 2003-09-25 | 2005-03-31 | Allergan, Inc. | Animal product free media and processes for obtaining a botulinum toxin |
| RU2255761C1 (ru) * | 2004-07-01 | 2005-07-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Токсины и сопутствующие продукты" | Препарат для лечения мышечных дистоний из токсина культуры clostridium botulinum и способ его получения |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| AIGI FANG, DONALD F., et.al., Production of Clostridium difficile toxin in a medium totally free of both animal and dairy proteins or digests, PNAS, 11, august, 2009, v.106, N. 2, p. 13225-13229. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2789552C1 (ru) * | 2019-03-29 | 2023-02-06 | Джетема Ко., Лтд. | Способ получения токсина |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2016253788B2 (en) | 2018-12-13 |
| CN107109354A (zh) | 2017-08-29 |
| BR112017012885A2 (pt) | 2018-01-30 |
| DK3289069T3 (da) | 2021-01-25 |
| AR104419A1 (es) | 2017-07-19 |
| US10465179B2 (en) | 2019-11-05 |
| PT3289069T (pt) | 2021-02-11 |
| KR20160127997A (ko) | 2016-11-07 |
| PL3289069T3 (pl) | 2021-07-05 |
| MX2017008197A (es) | 2017-09-13 |
| US20170247675A1 (en) | 2017-08-31 |
| KR101723167B1 (ko) | 2017-04-05 |
| EP3289069A4 (en) | 2018-10-03 |
| HUE052935T2 (hu) | 2021-05-28 |
| WO2016175565A1 (en) | 2016-11-03 |
| US20180163193A1 (en) | 2018-06-14 |
| US9926549B2 (en) | 2018-03-27 |
| TW201638328A (zh) | 2016-11-01 |
| SA517381720B1 (ar) | 2021-03-07 |
| AU2016253788A1 (en) | 2017-05-25 |
| JP6888049B2 (ja) | 2021-06-16 |
| EP3289069A1 (en) | 2018-03-07 |
| EP3289069B1 (en) | 2020-12-09 |
| HRP20210092T1 (hr) | 2021-04-30 |
| ES2846927T3 (es) | 2021-07-30 |
| JP2018500880A (ja) | 2018-01-18 |
| TWI592484B (zh) | 2017-07-21 |
| CA2968041A1 (en) | 2016-11-03 |
| JP2020022435A (ja) | 2020-02-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2663586C1 (ru) | Композиция среды и способ получения ботулинического токсина | |
| KR101100567B1 (ko) | 동물 산물이 없는 보툴리눔 독소를 얻기 위한 배지 및 방법 | |
| JP6887467B2 (ja) | ボツリヌス毒素の製造のための培地組成物 | |
| RU2679836C2 (ru) | Композиция среды для получения ботулинического токсина |