CN103215310B - 用于发酵的棉籽蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种用于发酵的棉籽蛋白及其制备方法和应用，通过向湿棉粕上喷洒营养液后经烘干并去绒后得到棉籽蛋白；所述的营养液中每100mL含有：1.0-50g酶解棉籽蛋白胨、1.0-40g甜菜碱、1.0-10g CuSO₄·5H₂O、1.0-10g MgSO₄·7H₂O、0.1-1.0g CoCl₂·7H₂O以及0.01-0.5g Triton X100。本发明能够保持现有棉籽蛋白产品在稳定发酵工艺的优势基础上促进菌体繁殖，提高细胞生长速率，增加生长期的生物量和缩短生长期；同时可以促进代谢产物从胞内向胞外释放，从而提高目标产物产量，甚至提升产品质量或缩短发酵周期。

Description

用于发酵的棉籽蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及的是一种发酵技术领域的方法，具体是一种用于发酵的棉籽蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

发酵技术是生物制药、化工产品、食品和饮料等生产或加工中的重要生产技术。发酵过程包括了菌体生长和产物生成两个阶段，对于以次级代谢产物为产品的微生物药物发酵生产过程而言，菌体生长和产物形成两个阶段往往是非偶联的。发酵前期为生长阶段，这一阶段以快速繁殖菌体为目的，当细胞繁殖达到一定数量、底物消耗和代谢产物到一定水平后，发酵过程逐渐迁移到以产物形成为主的生产阶段，在生产阶段，细胞生长处于维持状态，产物以稳定的速率生成，直到底物或产物或其他某些发酵参数成为限制因素而结束发酵。

工业微生物发酵培养基是影响发酵技术水平的关键因素，发酵培养基的设计和加工制造需要考虑尽可能加快菌体生长繁殖速率，缩短生长期；尽可能维持整个发酵过程中工艺参数的稳定性，延长生产期，最终达到提高发酵产量的目的。培养基配方组成中有机氮源是一类重要的营养因子，有机氮源种类多、来源广泛、成分复杂、质量波动大，对菌体生长和发酵工艺稳定性影响最为显著，倍受用户和生产企业关注。来源于棉籽深加工的棉籽蛋白、棉籽胨，由于有相对其他来源的有机氮源更集中的种植区域、相对单一的品种品质、更高的稳定性和较高的蛋白含量，而越来越受到制药领域发酵企业的青睐。棉籽蛋白作物一种非粮作物来源的原材料替代粮食作物来源的黄豆饼粉等原材料也是解决与人争粮的环境和资源问题的一条途径。

棉籽蛋白产品作为一种迟效氮源，有缓释特性，在维持生产阶段工艺参数的稳定方面发挥了重要作用，而在发酵前期，由于菌体浓度较低，释放各种水解酶数量和种类较少的情况下，利用速率较慢。因此，现在市场上的棉籽蛋白产品在缩短发酵过程的生长期方面没有优势，这也是其它有机氮源共同的特点，如黄豆饼粉、花生饼粉等都存在类似的问题。因此，需要在棉籽蛋白优良品种的基础上，设计和开发棉籽蛋白类产品，以使其能够兼顾发酵过程的生长期和生产期的不同需要，即在生长期能够促进菌体分离增殖，加快菌体生长，缩短生长期；而在生产期又能维持氮源的稳定释放，维持工艺参数的稳定性，延长生产期，最终提高发酵产量和综合指数。

经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN1306078公开日2001-08-01，公开了一种棉籽的处理方法，该技术通过将棉籽壳仁分离后对棉仁进行预处理；烘干后的棉仁采用6#溶剂油一次浸出油脂，脱除溶剂后得到毛油；含溶湿粕采用甲醇萃取棉酚；沥干后的湿粕经机械挤压脱溶后进行烘干，得到棉籽蛋白；采用分离方法将脂溶性物质及固体杂质去除，干燥后得到粗品低聚糖。但该技术所得的棉籽蛋白与豆饼粉、花生粉等其它常用的迟效氮源一样，不利于发酵初期菌体的快速利用，导致延滞期较长；因此其发酵产量难以满足现阶段工业需求。中国专利文献号CN101665534公开日2010-03-10，公开了一种棉籽浓缩蛋白的制备方法及其加工生产线，该技术将脱酚棉籽蛋白原料经20～40目筛去除壳、绒，溶于6-8倍水，加入各占原料质量0.5～0.6‰、1.0～1.2‰和0.4～0.5‰的淀粉酶、纤维素酶和果胶酶，温度30～40℃，1～3H，升温至85～90℃灭酶15～20MIN;降温后用盐酸等调PH值至4.0～4.5，1～1.5H，再用NAOH或CA(OH)2调PH值至中性，1～1.5H;将物料在离心机(80-100目滤布)内分离:滤液真空浓缩至1/5～1/4体积后喷雾干燥，得到副产品(蛋白含量35-40%);滤饼真空烘干后粉碎，得到棉籽浓缩蛋白产品(蛋白含量65-70%)。该技术虽然可以去除棉籽蛋白中含有的少量未去除干净的壳、绒、淀粉、纤维等，提高蛋白的含量，但在促进菌体快速利用和缩短延滞期方面没有改善。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种用于发酵的棉籽蛋白及其制备方法和应用，能够保持现有棉籽蛋白产品在稳定发酵工艺的优势基础上促进菌体繁殖，提高细胞生长速率，增加生长期的生物量和缩短生长期；同时可以促进代谢产物从胞内向胞外释放，从而提高目标产物产量，甚至提升产品质量或缩短发酵周期。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过向湿棉粕上喷洒营养液后经烘干并去绒后得到棉籽蛋白。

所述的湿棉粕是指：棉籽经去壳、压胚、浸提棉籽油、脱酚并回收低聚糖、脱溶后，得湿棉粕。

所述的喷洒是指：采用喷淋器按照每公斤湿棉粕加入5-15mL营养液的比例均匀喷撒到湿棉粕上。

所述的营养液中每100mL含有：1.0-50g酶解棉籽蛋白胨、1.0-40g甜菜碱、1.0-10gCuSO₄·5H₂O、1.0-10g MgSO₄·7H₂O、0.1-1.0g CoCl₂·7H₂O以及0.01-0.5gTriton X100（聚乙二醇辛基苯基醚）。

所述的酶解棉籽蛋白胨通过以下方式制备得到：

1）将预处理后的棉籽用6#溶剂油浸出棉籽油，并用甲醇脱除棉酚，然后进行100℃～120℃高温烘干熟化10-30分钟；

2）将熟化后的产物放入酶解反应罐中，加入蛋白酶进行水解反应，然后对酶解后的蛋白浆液在干燥塔中进行干燥。

所述的烘干是指：经布料器将经过喷洒的棉粕打散后均匀分布在烘干机转盘上，控制烘干时温度不超过80℃、料层厚度低于50mm、烘干至含湿量5%以下，残溶小于2000ppm。

所述的去绒是指：将烘干后的棉粕经过两级或更多筛网分筛后得到的不同细度的棉籽蛋白粉，然后采用振动筛进行去绒处理。

本发明涉及上述方法制备得到的棉籽蛋白的应用，将棉籽蛋白替代有机氮源，用于发酵。

所述的有机氮源包括：黄豆饼粉、花生饼粉、豆粕粉、玉米浆/玉米浆干粉、棉籽饼粉。

技术效果

经试验发现，按照本发明制得的棉籽蛋白用于抗生素发酵中，能够促进生长期细胞分裂增殖、促进生产期抗生素分泌，维持发酵过程稳定，能提高抗生素产品产量和改善抗生素组分含量。如在红霉素发酵中提高了红霉素产量和改善了红霉素组分；以及在头孢菌素发酵中的提高发酵效价的应用效果。

附图说明

图1为本发明步骤示意图。

图2为实施例中不同有机氮源的红色糖多孢菌生长的影响示意图。

图3为实施例中不同有机氮源对头孢菌素C发酵产量的影响示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

采用本领域常规方式对棉籽进行的脱绒、剥壳、棉仁软化、压胚、烘干、提油、脱酚、部分脱溶的处理，得湿棉粕后如图1所示按如下流程及条件制备：

步骤1、湿棉粕经送料机以匀速方式输送到烘干机，湿粕在进入烘干机之前先经过喷淋器，湿棉粕在向前推进过程中，由喷淋器将营养液均匀喷到湿棉粕上。

营养液的配制：3.75g/100mL CuSO₄·5H₂O，7g/100mL MgSO₄·7H₂O，0.6g/100mLCoCl₂·7H₂O，10g/100mL甜菜碱，20g/100mL酶解棉籽蛋白胨，0.05g/100mL Triton X100。营养液的加量为每千克棉粕中加入10mL营养液。

步骤2、湿棉粕送入烘干机后，经布料器将棉粕打散后均匀分布在烘干机转盘上，摊薄料层，加速烘干和残留溶剂的蒸发。控制烘干时温度不超过80℃、料层厚度低于50mm、烘干至含湿量5%以下，残溶小于2000ppm。营养液的喷淋装置也可以安置在布料器之后，烘干之前完成喷淋。

步骤3、烘干的棉粕送入分级筛进行筛分。分级筛可根据需要为两层筛网或多层筛网，从上到下筛网目数逐级增加。

步骤4、得到的不同细度的棉籽蛋白粉经过振动筛进行去绒处理，制得棉籽蛋白产品。实施例2

本实施例中所采用的营养液为：1.5g/100mL CuSO₄·5H₂O，10.0g/100mL MgSO₄·7H₂O，0.1g/100mL CoCl₂·7H₂O，5g/100mL甜菜碱，40g/100mL酶解棉籽蛋白胨，0.01g/100mL TritonX100。营养液的加量为每千克棉粕中加入10mL营养液。其它步骤及条件同实施例1。

实施例3

一、产品加工：

本实施例中所采用的营养液为：7.5g/100mL CuSO₄·5H₂O，2.5g/100mL MgSO₄·7H₂O，0.8g/100mL CoCl₂·7H₂O，10g/100mL甜菜碱，5g/100mL酶解棉籽蛋白胨，0.05g/100mL TritonX100。营养液的加量为每千克棉粕中加入10mL营养液。其它步骤及条件同实施例1。

二、实施例1-3的蛋白和棉酚含量检测指标

棉籽蛋白的蛋白和棉酚含量值如表1所示：

三、实施例1提高红霉素产量的作用检测

以实施例1和一般棉籽蛋白作为所试氮源，并以红霉素发酵中最常用的黄豆饼粉为对照，考察实施例1对红霉素发酵效价提高的影响。

检测方法如下：

a)菌种：红霉素生产菌，红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)，通过公开途径获取自中科院植物生理生态研究所。

b)方法：

1.培养方法

1.1.斜面培养

淀粉1.0，硫酸铵0.3，氯化钠0.3，玉米浆1.0，碳酸钙0.2，琼脂2.2。用接种环从沙土管/冻干管/甘油管或者新鲜的斜面挑取少量孢子或孢子悬液在新配制好的干燥斜面上划线，34℃培养7～10天。

1.2.种子培养

淀粉5%，玉米浆1.3%，有机氮源1.8%，氯化钠0.3%，硫酸铵0.12%，碳酸钙0.6%豆油4滴/50mL；装液量：50mL/500mL瓶，121℃灭菌30min。挖取新鲜斜面（0.5-1.0cm×0.5-1.0cm）接到摇瓶中，温度32℃，转速220r/min，培养48h。有机氮源分别为黄豆饼粉、一般棉籽蛋白、棉籽蛋白中的一种。

1.3.摇瓶发酵培养

淀粉6.0%，糊精4.0%，所试有机氮源3.0%，硫酸铵0.6%，碳酸钙0.6%，豆油5滴/50mL。培养条件：按5%接种量接种发酵瓶中，温度32℃，转速220r/min，培养6d。接种之后24h补加正丙醇0.5mL/50mL。所试有机氮源分别为黄豆饼粉、一般棉籽蛋白、棉籽蛋白中的一种。

1.4.发酵罐验证

淀粉4.0%，所试有机氮源3.0%，硫酸铵0.12%，豆油0.7%，碳酸钙0.7%，消前pH：7.4～7.6；体积：30L料液/50L发酵罐；121℃灭菌30min。接种量为10%，温度32℃，周期6天。发酵过程中根据溶氧、pH和其它参数设定要求，控制搅拌转速和补料速率（葡萄糖、豆油、正丙醇）。

1.5.生物效价

以生物效价作为分析指标。生物效价的检测方法如下：

取直径约90mm，高16－17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基20mL，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层，另取培养基适量加热融化后，放冷至48－50℃，加入短小芽孢杆菌菌悬液适量，摇匀，在每一双碟中分别加入5mL，使在底层上均匀摊布，作为上层含菌层。放置水平台上冷却后，在每一双碟中以等距离安置不锈钢小管（内径6.0mm±0.1mm，高1.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm）四个，用瓦盖覆盖备用。将样品分成高低两个浓度以磷酸缓冲液进行适当稀释后加入牛津杯。高低浓度的稀释倍数为2:1或4:1，二剂量法标准溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18－22mm以内。37℃培养14－16小时后，测量抑菌圈大小。

c)结果分析：表2数据表明，实施例1作为氮源用于红霉素发酵，对提高效价有显著作用。实施例1比一般棉籽蛋白有更好的效果，特别是在摇瓶120h就达到了很高的产量，有可能带来发酵周期提前，甚至可以缩短发酵周期近一天左右。在发酵罐上同样验证了实施例1对提高效价的积极效果。

表2不同氮源情况下的红霉素效价比较

实施例4

实施例1对菌体生长的促进作用

实施方法按照实施例1，以PMV作为生物量变化指标进行分析测试。

红色糖多孢菌菌体生物量检测

采用PMV（Packed Mass Volume）法测定。准确量取10mL发酵液于10mL离心管中，4000r/min离心10分钟，测得沉淀物的体积占10mL发酵液体积的百分含量即得PMV。

实施结果：

如图2中结果显示，在摇瓶发酵实施中（每组3个重复），以实施例1为氮源的实施组，细胞更早进入对数生长期。说明棉籽蛋白有促进细胞分裂增殖，提高菌体生长速率的作用。

实施例5

实施例1对发酵中红霉素组分的影响

发酵方法参照实施例2和3，以实施例1和黄豆饼粉作对比，检测红霉素发酵液中A、B、C三种组分的含量变化。结果见表3。

发酵液中组分的液相分析方法：

1)标准液的制备：准确称取8～9毫克标品于10mL容量瓶中，加入流动相，超声助溶。

2)发酵液样品的制备：分析前加入适当的流动相，超声助溶。

3)组份的分析采用HPLC检测：

色谱柱：Hypersil BDS C18柱(250x4.6mm)。

流动相：69%A相(32mM磷酸盐缓冲液，pH8.0)，31%B相(乙腈/甲醇:75/25)。

检测条件：流速1mL/min，UV检测波长215nm，在Agilent1100HPLC system上分析时间为35分钟。

表3有机氮源对红霉素组分的影响

实施例6

实施例1对头孢菌素C发酵产量的影响

将顶头孢霉斜面菌种挖块接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，于28℃，220rpm转速下震荡培养60h，之后将种子液以10%接种量接入50mL发酵培养基中，于28℃，220rpm转速下震荡培养144h，以HPLC方法检测头孢菌素C含量。图3说明，与常用的头孢菌素C发酵用玉米浆氮源相比，棉籽蛋白显示出更优的效果，一般棉籽蛋白和棉籽蛋白使头孢菌素C的发酵单位分别能提高29%和34%。具体培养和分析条件如下：

种子培养基：葡萄糖0.5%，蔗糖3%，玉米浆3%，乙酸铵0.4%，DL-蛋氨酸0.05%，CaCO₃，0.5%；消前pH为6.5。

发酵培养基：淀粉5%，葡萄糖1.5%，玉米浆5%，豆油2%，DL-蛋氨酸0.6%，(NH₄)₂SO₄1.0%，MgSO₄0.3%，KH₂PO₄0.6%，CaCO₃1%，微量盐1mL/100mL。

微量盐组成：FeSO₄·7H₂O8g/L；MnSO₄·H₂O2g/L；CuSO₄·5H₂O2g/L；ZnSO₄·7H₂O2g/L。

头孢菌素C效价测定：Agilent1100series色谱仪，TSKgel ODS-100S4.6mm×250mm色谱柱；流动相：20mmol／L醋酸铵缓冲液(pH5．6)：乙腈=94：6，流速：1.0mL/min，紫外检测波长：254nm，室温，进样量20μL。

综上所述，本发明在原有棉籽蛋白高蛋白含量特性基础上，增加了促进生长期细胞增殖、加快生长的营养因子，如酶解棉籽蛋白胨、多种金属离子和促进细胞释放胞内物质的triton等。在维持发酵过程稳定的同时，缩短了生长期，提高抗生素产品产量和/或改善抗生素组分含量。

Claims (3)

1.一种用于发酵的棉籽蛋白的制备方法，其特征在于，通过向湿棉粕上喷洒营养液后经烘干并去绒后得到棉籽蛋白；

所述的营养液中每100mL含有：1.0-50g酶解棉籽蛋白胨、1.0-40g甜菜碱、1.0-10gCuSO₄·5H₂O、1.0-10g MgSO₄·7H₂O、0.1-1.0g CoCl₂·7H₂O以及0.01-0.5g Triton X100；

所述的喷洒是指：采用喷淋器按照每公斤湿棉粕加入5-15mL营养液的比例均匀喷洒到湿棉粕上；

所述的酶解棉籽蛋白胨通过以下方式制备得到：

1)将预处理后的棉籽用6#溶剂油浸出棉籽油，并用甲醇脱除棉酚，然后进行100℃～120℃高温烘干熟化10-30分钟；

2)将熟化后的产物放入酶解反应罐中，加入蛋白酶进行水解反应，然后对酶解后的蛋白浆液在干燥塔中进行干燥；

所述的去绒是指：将烘干后的棉粕经过两级或更多筛网分筛后得到的不同细度的棉籽蛋白粉，然后采用振动筛进行去绒处理。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的湿棉粕是指：棉籽经去壳、压胚、浸提棉籽油、脱酚并回收低聚糖、脱溶后，得湿棉粕。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的烘干是指：经布料器将经过喷洒的棉粕打散后均匀分布在烘干机转盘上，控制烘干时温度不超过80℃、料层厚度低于50mm、烘干至含湿量5％以下，残溶小于2000ppm。