ES2846927T3

ES2846927T3 - Composición de medio para la preparación de toxina botulínica

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Publication number: ES2846927T3
Application number: ES16786751T
Authority: ES
Inventors: Kyoung-Yun Kim; Hye-Young Sul; Kyoung-Min Min
Original assignee: Daewoong Co Ltd
Current assignee: Daewoong Co Ltd
Priority date: 2015-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2036-04-28
Also published as: US9926549B2; JP6888049B2; AR104419A1; CN107109354A; DK3289069T3; WO2016175565A1; EP3289069A1; US10465179B2; EP3289069B1; MX2017008197A; KR101723167B1; HRP20210092T1; AU2016253788B2; PL3289069T3; US20180163193A1; JP2018500880A; US20170247675A1; BR112017012885A2; PT3289069T; AU2016253788A1

Abstract

Una composición de medio libre de proteínas animales (APF) para su uso en el cultivo de Clostridium botulinum, comprendiendo la composición de medio: peptonas de origen vegetal que comprenden un hidrolizado de guisante de jardín, un hidrolizado de semilla de algodón y un hidrolizado de gluten de trigo con una proporción de 1:0,24-43,62:0,01-50,57 en peso; una fuente de carbono; y al menos un mineral seleccionado del grupo que consiste en K2HPO4 (fosfato dipotásico), Na2HPO4 (fosfato disódico) y KH2PO4 (fosfato monopotásico).

Description

DESCRIPCIÓN

Composición de medio para la preparación de toxina botulínica

CAMPO TÉCNICO

[0001] La presente invención se refiere a una composición de medio para la producción de la toxina botulínica y, más particularmente, a una composición de medio para el cultivo de cepas de Clostridium capaces de producir toxina botulínica. La composición de medio de la presente invención comprende al menos una peptona derivada de plantas seleccionada del grupo que consiste en un hidrolizado de guisante, un hidrolizado de semilla de algodón y un hidrolizado de gluten de trigo.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

[0002] Se ha descubierto una variedad de cepas de Clostridium sp. que secretan toxinas neurotóxicas desde la década de 1890, y la caracterización de las toxinas que son secretadas por estas bacterias se ha realizado durante los últimos 70 años (Schant, EJ et al., Microbiol. Rev., 56:80, 1992).

[0003] Las toxinas neurotóxicas derivadas de Clostridium sp., es decir, las toxinas botulínicas, se clasifican en siete serotipos (serotipos A a G) dependiendo de sus propiedades serológicas. Cada una de las toxinas tiene una proteína de toxina que tiene un tamaño de aproximadamente 150 kDa y contiene naturalmente un complejo de varias proteínas no tóxicas unidas a las mismas. Un complejo mediano (300 kDa) está compuesto por una proteína toxina y una proteína no hemaglutinina no tóxica, y un complejo grande (450 kDa) y un complejo muy grande (900 kDa) están compuestos por el complejo de tamaño mediano unido a hemaglutinina (Sugiyama, H., Microbiol. Rev., 44: 419, 1980). Se sabe que tales proteínas de hemaglutinina no tóxicas funcionan para proteger la toxina del pH bajo y diversas proteasas en los intestinos.

[0004] La toxina se sintetiza como un único polipéptido que tiene un peso molecular de aproximadamente 150 kDa en las células, y luego escindido en una posición de un tercio a partir del extremo N-terminal por la acción de la proteasa o el tratamiento intracelular con una enzima artificial como la tripsina en dos unidades: una cadena ligera (L; peso molecular: 50 kDa) y una cadena pesada (H; peso molecular: 100 kDa). La toxina escindida tiene una toxicidad mucho mayor en comparación con el polipéptido individual. Las dos unidades están unidas entre sí por un enlace disulfuro y tienen funciones diferentes. La cadena pesada se une a un receptor de una célula diana (Park. MK et al., FEMS Microbiol. Lett., 72: 243, 1990) y funciona para interactuar con una biomembrana a pH bajo (pH 4) para formar un canal (Mantecucco, C. et al., TIBS., 18: 324, 1993), y la cadena ligera tiene la actividad farmacológica de interferir en la secreción de neurotransmisores, cuando es permeable a las células o se introduce por electroporación, etc. (Poulain, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 85: 4090, 1988).

[0005] La toxina inhibe la exocitosis de la acetilcolina en la presinapsis colinérgica de una unión neuromuscular para causar astenia. Se ha considerado que incluso el tratamiento con una cantidad muy pequeña de la toxina presenta toxicidad, lo que sugiere que la toxina tiene alguna actividad enzimática (Simpson, L. L. et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 26: 427, 1986).

[0006] De acuerdo con un informe reciente, la toxina tiene actividad metalopeptidasa, y sus sustratos incluyen sinaptobrevina, sintaxina, una proteína asociada sinaptosomal de 25 kDa (SNAP25), etc., que son las proteínas unidad de una exocitosis maquinaria compleja. Cada tipo de toxina usa una de las tres proteínas descritas anteriormente como sustrato, y se sabe que las toxinas de tipo B, D, F y G escinden la sinaptobrevina en un sitio específico, las toxinas de tipo A y E escinden SNAP25 en un sitio específico, y el tipo C escinde la sintaxina en un sitio específico (Binz, T. et al., J. Biol. Chem., 265: 9153, 1994).

[0007] En particular, el tipo A de toxina botulínica se sabe que es soluble en una solución acuosa diluida a un pH de 4,0 a 6,8. Se sabe que una proteína estable no tóxica se separa de la neurotoxina a un pH de aproximadamente 7 o superior y, como resultado, la toxicidad se pierde gradualmente. En particular, se sabe que la toxicidad disminuye a medida que aumentan el pH y la temperatura.

[0008] La toxina botulínica es fatal para el cuerpo humano incluso en pequeñas cantidades y es fácil de producir en grandes cantidades. Por lo tanto, constituye cuatro armas principales de bioterrorismo junto con Bacillus anthracis, Yersinia pestis y el virus de la viruela. Sin embargo, se encontró que, cuando se inyecta la toxina botulínica tipo A en una dosis que no afecta sistemáticamente al cuerpo humano, puede paralizar el músculo local en el sitio de la inyección. Con base en esta característica, la toxina botulínica tipo A se puede utilizar en una amplia gama de aplicaciones, incluidos agentes eliminadores de arrugas, agentes para el tratamiento de la hemiplejía espástica y la parálisis cerebral, etc. Por lo tanto, la demanda de toxina botulínica tipo A ha aumentado y los estudios sobre se han llevado a cabo activamente métodos de producción de toxina botulínica para satisfacer la demanda.

[0009] Un producto comercial típico actual es BOTOX® (un complejo de neurotoxina purificada de toxina botulínica tipo A) que está comercialmente disponible de Allergan, Inc., EE.Uu . Un vial de 100 unidades de BOTOX® está compuesto por aproximadamente 5 ng de un complejo de neurotoxina purificado de toxina botulínica tipo A, 0,5 mg de albúmina de suero humano y 0,9 mg de cloruro de sodio y se reconstituye con solución salina estéril sin conservante (inyección de 0,9% cloruro de sodio). Otros productos comerciales incluyen Dysport® (un complejo de toxina de Clostridium botulinum tipo A y hemaglutinina, que tiene lactosa y albúmina de suero humano en una composición farmacéutica que comprende toxina botulínica y se reconstituye con cloruro de sodio al 0,9% antes de su uso) que está disponible comercialmente en Ipsen Ltd., Reino Unido, MyoBloc® (una solución inyectable (un pH de aproximadamente 5,6) que comprende la toxina botulínica de tipo B, albúmina de suero humano, succinato de sodio y cloruro de sodio) que está disponible comercialmente de Solstice Neurosciences, Inc.

[0010] Un medio a el cultivo de Clostridium botulinum, que se utiliza generalmente en un método para la producción de toxina botulínica como se describe en la patente coreana n° 10-1339349, contiene componentes animales. Por tanto, si un prión animal anormal conocido como agente que causa encefalopatía espongiforme transmisible está contenido en los componentes animales debido a la contaminación, plantea problemas en un proceso para producir toxina botulínica.

[0011] La encefalopatía espongiforme transmisible (EET) se conoce como un trastorno neurodegenerativo que causa degeneración grave de las neuronas, y ejemplos del mismo que incluye la encefalopatía espongiforme bovina (EEB), Tembladera, enfermedad Creutzfeldt-Jakob (CJD), síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Kuru, encefalopatía del visón transmisible, emaciación crónica, encefalopatía espongiforme felina, etc., que afectan a humanos y animales. Se informó que la EEB atraviesa la barrera de las especies e infecta incluso a los seres humanos.

[0012] El agente que causa la encefalopatía espongiforme transmisible (EET) tiene características en que no tiene inmunogenicidad y el período de incubación es largo. A partir del análisis histopatológico del tejido cerebral bovino afectado por EEB, se puede observar que se formaron vacuolas espongiformes especiales en el cerebro debido al daño a las neuronas y al depósito de fibras proteicas anormales.

[0013] La causa de la EET es una partícula infecciosa proteinácea conocida como el prión anormal. A diferencia de los virus generales que requieren ácido nucleico, el prión anormal es una partícula infecciosa compuesta de proteína sola sin contener ácido nucleico. En cuanto a las EET, se sabe que cuando un prión anormal (PrPsc) que es una partícula infecciosa se une a un prión normal (PrPc), se convierte en un prión patógeno que luego se acumula en el cerebro (Prusiner SB, Alzheimer Dis Assoc Disord., 3: 52-78, 1989).

[0014] La enfermedad de Creutzfeldt-Jakob es un trastorno neurodegenerativo raro de la encefalopatía espongiforme transmisible humana (EET) en donde el agente transmisible es aparentemente una isoforma anormal de una proteína priónica. Un individuo con la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob puede deteriorarse desde una aparente salud perfecta hasta un mutismo acinético en seis meses. Por tanto, puede existir un riesgo potencial de adquirir una enfermedad mediada por priones, como la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, a partir de la administración de una composición farmacéutica que contiene un biológico, como una toxina botulínica, obtenida usando productos derivados de animales. Por tanto, si una composición farmacéutica se prepara con una sustancia farmacéutica producida utilizando componentes derivados de animales, puede someter al paciente a un riesgo potencial de recibir diversos patógenos o agentes infecciosos.

[0015] El documento EP 2865748 A1 correspondiente al documento WO2013/177647 describe un medio de cultivo libre de producto animal para C. histolyticum, caracterizado por comprender peptonas de origen no animal, preferiblemente peptonas vegetales, extracto de levadura y los aminoácidos cisteína y arginina.

[0016] El documento WO2006/042542 A1 describe un medio de fermentación para producir toxinas bacterianas, en donde la fuente de proteína es proteína no derivada de animales ni de soja, por ejemplo, peptona de patata, peptona de trigo, peptona de arroz, peptona de arroz-trigo, peptona de algodón, peptona de guisante, o peptona de levadura.

[0017] El documento EP 2 133 415 A1 describe una composición para apoyar el crecimiento de Clostridium histolyticum y la secreción de colagenasa, la composición comprende agua, una peptona de origen no mamífero y una gelatina de pescado.

[0018] El documento US 2005/0069562 A1 describe una composición que comprende un Clostridium botulinum y un medio de cultivo para producir una toxina botulínica en donde el medio está sustancialmente libre de un producto derivado de animales y comprende una soja hidrolizada.

[0019] Fang, A., Gerson, DF y Demain, AL, 2009. La producción de la toxina de Clostridium difficile en un medio totalmente libre de tanto animales como proteínas o digestos lácteos. Proceedings of the National Academy of Sciences, 106 (32), pp,13225-13229, describe un medio de fermentación para la bacteria que da como resultado la formación de Toxina A y no contiene carne ni productos lácteos, que comprenden especialmente Peptona de Soja A3.

[0020] En virtud de este fondo técnico, los presentes inventores han encontrado que, cuando se utiliza un medio que comprende la encefalopatía espongiforme transmisible (EET) de peptona de origen vegetal exento y componentes minerales para el cultivo de Clostridium botulinum con el fin de prevenir el riesgo de desarrollar la enfermedad anteriormente mediada por priones descrita, se puede excluir el riesgo de desarrollo de la enfermedad mediada por priones que puede ocurrir en un medio que está en uso actual (medio original), y se puede comparar la tasa de crecimiento de Clostridium botulinum en el medio a la del medio que se usa actualmente, completando así la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

PROBLEMA TÉCNICO

[0021] Un objeto de la presente invención es proporcionar una composición de medio que comprende peptonas de origen vegetal que no tengan riesgo de infección de encefalopatía espongiforme transmisible (EET), y un método para la producción de botulinum toxina, lo que mejora la producción de toxina botulínica cultivando Clostridium botulinum en la composición del medio.

SOLUCIÓN TÉCNICA

[0022] Para lograr el objeto anterior, la presente invención proporciona una composición de medio para el cultivo de Clostridium botulinum, comprendiendo la composición del medio: al menos una peptona de origen vegetal seleccionado del grupo que consiste de un hidrolizado de guisantes de jardín, un hidrolizado de semillas de algodón y un hidrolizado de gluten de trigo.

[0023] La presente invención también proporciona un método para la producción de la toxina botulínica, que comprende las etapas de: (a) cultivar Clostridium botulinum usando la composición del medio se ha descrito anteriormente para producir la toxina botulínica; y (b) recuperar la toxina botulínica producida.

[0024] Las realizaciones de la presente invención se reflejan en las reivindicaciones independientes 1 y 5.

[0025] Las formas de realización preferidas de la presente invención se reflejan en las reivindicaciones dependientes 2 a 4, así como 6 y 7.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0026]

FIG. 1 muestra el crecimiento de Clostridium botulinum en un medio (medio APF) que contiene peptonas de origen vegetal.

FIG. 2 muestra el crecimiento de Clostridium botulinum en un medio que contiene peptonas, minerales, aminoácidos y vitaminas de origen vegetal.

FIG. 3 muestra los resultados de examinar si se forma un precipitado después de la esterilización de un medio que contiene peptonas, minerales, aminoácidos y vitaminas de origen vegetal.

FIG. 4 muestra los resultados de examinar si se forma un precipitado después de la esterilización de un medio que contiene peptonas y minerales de origen vegetal.

FIG. 5 muestra el crecimiento de Clostridium botulinum en medios obtenidos añadiendo adicionalmente vitaminas, aminoácidos y "BD Recharge™ sin glucosa y L-glutamina" a los medios para el cultivo de la bacteria, que contienen peptonas y minerales de origen vegetal.

FIG. 6 muestra el crecimiento de Clostridium botulinum en medios para el cultivo de la bacteria, que contienen varios tipos de peptonas de origen vegetal.

FIG. 7 muestra gráficos de contorno de FFD para cribado de minerales y optimización de respuesta. FIG. 7a gráfico de contorno para ajuste alto; FIG. 7b Gráfico de contorno para ajuste medio; FIG. 7c Gráfico de contorno para ajuste bajo; y FIG. 7d Optimización de respuesta para máxima OD.

FIG. 8 muestra gráficas de contorno de FFD para cribado de minerales y optimización de respuesta. FIG. 8a Gráfico de contorno para ajuste alto; FIG. 8b Gráfico de contorno para ajuste medio; FIG. 8c Gráfico de contorno para ajuste bajo; y FIG. 8d Optimización de respuesta para máxima OD.

FIG. 9 muestra gráficos de contorno para el cribado de peptona vegetal y la optimización de la respuesta. FIG. 9a Gráfico de contorno para ajuste medio; FIG. 9b Gráfico de contorno para ajuste bajo; y FIG. 9c Optimización de la respuesta para una OD máxima.

FIG. 10 muestra la curva de crecimiento de Clostridium botulinum en el medio APF finalmente seleccionado y un cambio en la concentración de toxina.

MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

[0027] En la presente invención, se intentó preparar un medio que aumenta aún más la tasa de crecimiento de Clostridium botulinum en comparación con un medio que es de uso corriente (medio original) y no tienen ningún riesgo de infección con EET o similar. Por tanto, se utilizó un medio libre de proteína animal (APF) que contenía peptonas de origen vegetal y se examinó el crecimiento de una bacteria en el medio APF. Como resultado, el medio a Pf mostró una mayor tasa de crecimiento de la bacteria en comparación con un medio que se usa actualmente. Por tanto, si se usa el medio APF, se puede producir una alta concentración de toxina botulínica cultivando una bacteria de manera segura en condiciones libres de EET.

[0028] Como se usa en el presente documento, el término "medio que está en uso actual o medio original" significa un medio que comprende caseína hidrolizada, extracto de levadura y medio tioglicolato, que son los componentes del medio de origen animal. El término "medio APF (medio libre de proteínas animales)" significa un medio que no contiene proteínas de origen animal y que contiene peptonas, minerales y glucosa de origen vegetal.

[0029] En un ejemplo de la presente invención, con el fin de producir la toxina botulínica cultivando Clostridium botulinum en virtud de las condiciones libres de encefalopatía espongiforme transmisible (EET), un medio APF que comprende peptona vegetal libre de EET se preparó y se comparó con un medio que es en uso actual (que contiene un componente animal). Como resultado, se pudo ver que una composición de medio óptima para cultivar Clostridium botulinum es una que comprende una peptona derivada de plantas, al menos un mineral seleccionado del grupo que consiste en KH²PO⁴, K²HPO⁴y Na²HPO⁴, y una fuente de carbono (p. ej., glucosa), y se encontró el crecimiento óptimo de la bacteria en este medio. Como resultado, como se muestra en la Tabla 13, se determinó que los contenidos óptimos de peptonas de origen vegetal en la composición del medio finalmente seleccionada para el cultivo de Clostridium botulinum son 5 g/L Hy-Pea™ 7404, 10 g/L UltraPep™ Cotton y 5 g/L HyPep™ 4601N, y los contenidos óptimos de minerales en la composición del medio son 5,5 g/L K²HPO⁴y 3g/L Na²HPO⁴.

[0030] En otro ejemplo de la presente invención, el patrón de crecimiento de Clostridium botulinum en el medio APF finalmente seleccionado comprendiendo peptonas y minerales derivados de las plantas, y la concentración de toxina. Como resultado, como se muestra en la Tabla 12 y la FIG. 10, el valor de OD comenzó a aumentar después de 12 horas de cultivo de Clostridium botulinum, y a las 24 horas de cultivo, el medio de cultivo mostró un OD⁵⁴⁰nmde 3,5465 y un OD⁶⁰⁰nm de 3,0695. Luego, el valor de OD disminuyó gradualmente, y a las 48 horas de cultivo, el medio de cultivo mostró una OD⁵⁴⁰nm de 0,792 y una OD⁶⁰⁰nm de 0,7224. La concentración de toxina en el sobrenadante de cultivo de Clostridium botulinum comenzó a aumentar después de 5 horas de cultivo y mostró un valor final de 31,41 mg/ml. Cuando se midió la concentración de toxina después de romper la bacteria, la toxina comenzó a producirse después de 5 horas de cultivo, y la concentración de toxina continuó aumentando, se mantuvo a un nivel uniforme después de 28 horas de cultivo y mostró un valor final de 38,39 pg/ml.

[0031] En base a esto, en un aspecto, la presente invención se dirige a una composición de medio para cultivo de Clostridium botulinum, comprendiendo la composición de medio: al menos una peptona derivada de plantas seleccionada del grupo que consiste en un hidrolizado de guisante de jardín, un hidrolizado de semilla de algodón y un hidrolizado de gluten de trigo.

[0032] Como se usa en este documento, el término "peptona de origen vegetal" significa una peptona extraída de guisante de jardín, semilla de algodón o gluten de trigo. Preferiblemente, la peptona de origen vegetal puede ser Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504 o HyPep™ 4601N disponibles comercialmente, pero no se limita a ellos.

[0033] Como se usa en este documento, el término "peptona de origen vegetal" o "hidrolizado derivado de plantas" significa un producto obtenido mediante la degradación de una proteína aislada de una planta. Por ejemplo, la peptona de guisante de jardín (hidrolizado de guisante de jardín) significa un producto obtenido al degradar una proteína total aislada del guisante de jardín.

[0034] La degradación de la proteína de origen vegetal se realiza preferiblemente mediante digestión parcial. La degradación de la proteína se realiza preferiblemente mediante tratamiento ácido, tratamiento básico, tratamiento enzimático, tratamiento a alta presión, tratamiento térmico o tratamiento físico. Más preferiblemente, la peptona derivada de plantas puede ser una obtenida mediante tratamiento enzimático. El tratamiento físico es, por ejemplo, trituración.

[0035] La peptona de origen vegetal que se utiliza en la presente invención es un producto de degradación parcial del derivado de plantas proteína, es una mezcla que comprende no sólo los aminoácidos que son moléculas individuales, sino también péptidos compuestos de varios a varias decenas de aminoácidos y moléculas de proteína intactas.

[0036] En la presente invención, el contenido de las peptonas de origen vegetal en la composición del medio puede ser 0,1-10 p/v% (1-100 g/L), preferiblemente 0,2-5 p/v% (2-50 g/L), más preferiblemente 0,5-2% p/v (5-20 g/L).

[0037] En la presente invención, la composición del medio que contiene todo el hidrolizado de guisante de jardín, el hidrolizado de semilla de algodón y el hidrolizado de gluten de trigo, y la relación de contenido del hidrolizado de guisante de jardín, la semilla de algodón hidrolizado y el hidrolizado de gluten de trigo en el medio la composición es 1:0,24-43,62: 0,01-50,57 en peso, preferiblemente 1:0,68-14,46: 0,09-9,87 en peso, más preferiblemente 1:1,6-2,4: 0,6-1,4 en peso.

[0038] En la presente invención, la composición del medio para el cultivo de Clostridium botulinum contiene además una fuente de carbono y al menos un mineral seleccionado del grupo que consiste de K²HPO⁴(fosfato dipotásico), Na²HPO⁴(fosfato disódico) y KH²PO⁴(fosfato monopotásico).

[0039] En la presente memoria, los ejemplos de la fuente de carbono incluyen, pero no se limitan a monosacáridos (p. ej., glucosa, fructosa, etc.), disacáridos (p. ej., maltosa, sacarosa, etc.), oligosacáridos, polisacáridos (p. ej., dextrina, ciclodextrina, almidón, etc.), alcoholes de azúcar (p. ej., xilitol, sorbitol, eritritol, etc.).

[0040] En la presente invención, el contenido del mineral en la composición del medio puede ser 0,05 a 3,5 p/v% (0,5 35 g/L), preferiblemente 0,1 a 1,75 p/v% (1-17,5 g/L), y más preferiblemente 0,25-0,7% p/v (2,5-7 g/L).

[0041] En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para producir la toxina botulínica, que comprende las etapas de: (a) cultivo de Clostridium botulinum usando la composición del medio se ha descrito anteriormente para producir la toxina botulínica; y (b) recuperar la toxina botulínica producida.

[0042] En la presente invención, el cultivo puede realizarse bajo condiciones anaeróbicas, y la toxina botulínica se puede seleccionar del grupo que consiste en toxina botulínica tipos A, B, C, D, E, F y G.

EJEMPLOS

[0043] A continuación, se describirá la presente invención con más detalle con referencia a ejemplos. Será obvio para una persona con experiencia normal en la técnica que estos ejemplos son únicamente con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente invención. Por tanto, el alcance sustancial de la presente invención estará definido por las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1: Cultivo de Clostridium botu linum en medio de peptona de origen vegetal

1-1: Composición de un medio utilizado actualmente en cultivo

[0044] Los reactivos y componentes del medio utilizados en la presente invención se adquirieron de Sigma (EE. UU.), Kerry Inc. (EE. UU.), BD Biosciences (EE. UU.), Gibco Life Technologies (EE. UU.) y Quest (EE. UU.).

[0045] Un medio que está en uso corriente que tiene una composición que comprende 2% de hidrolizado de caseína (20 g/L), 1% de extracto de levadura (10 g/L), 1% de glucosa (10 g/L) y 0,5% de medio de tioglicolato (5 g/L) se utilizó para el cultivo de semillas y el cultivo principal de Clostridium botulinum para producir toxina botulínica. 5 g del medio tioglicolato por litro del medio que es en uso actual se compone de 2,52 g de un digerido enzimático de caseína, 0,84 g de extracto de levadura, 0,925 g de dextrosa, 0,085 g de tioglicolato de sodio, 0,42 g de NaCl, 0,085 g de L-cisteína, 0,00014 g de Resazurina y 0,125 g de agar bacteriológico.

1-2: Composición de medio APF usado en cultivo

[0046] Un medio de control negativo se preparó mediante la eliminación de hidrolizado de caseína, extracto de levadura y medio de tioglicolato del medio que está en uso actual (medio original) para el cultivo de Clostridium botulinum, y se preparó un medio libre de proteína animal (APF) añadiendo cuatro candidatos a peptona de origen vegetal (Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504 y HyPep™ 4601N) al medio de control negativo (Tabla 1).

[0047] La Tabla 1 muestra los componentes del medio APF que contiene peptona derivada de plantas para el cultivo de Clostridium botulinum en comparación con el medio que se usa actualmente.

Tabla 1

1-3: Cultivo de semillas de Clostridium botulinum

[0048] Se inocularon 20 pl de Clostridium botulinum (número de acceso de los Centros Coreanos para el Control y la Prevención de Enfermedades: 4-029 - CBB-IS-001) en un tubo de cultivo que contenía 10 ml de un medio estéril que tiene cada una de las composiciones descritas en los Ejemplos 1-1 y 1-2 y se sometió a cultivo de siembra primario (cultivo estacionario) a 35°C durante 22-30 horas en condiciones anaeróbicas. Cuando se confirmó el crecimiento de la bacteria en el cultivo de siembra primario, se inocularon 8 ml del cultivo de siembra primario en una botella de cultivo de 1 litro que contenía 800 ml de un medio estéril con la misma composición de medio y se sometió a cultivo de siembra secundario (cultivo estacionario) a 35°C durante 8-15 horas en condiciones anaeróbicas.

1-4: Cultivo principal de Clostridium botulinum

[0049] Con el fin de producir una toxina botulínica cultivando Clostridium botulinum, se realizó el cultivo principal de la bacteria. Específicamente, se prepararon 9,3 L de un medio que tenía cada una de las composiciones descritas en los Ejemplos 1-1 y 1-2 y se colocaron en una incubadora de 10 litros, seguido de la esterilización del medio. Se suministró nitrógeno para crear condiciones anaeróbicas y el crecimiento de la bacteria se realizó a una temperatura de 35°C y una velocidad de agitación de 50 rpm.

[0050] El cultivo de siembra secundario en la botella de cultivo de 1 litro en el Ejemplo 1-3 se inoculó en una incubadora de 10 litros a través de una línea de inoculación conectada al puerto de la inoculación de la incubadora de 10 litros. Se cultivó Clostridium botulinum en la incubadora de 10 litros en las condiciones de 35°C y 50 rpm y se controlaron y registraron las condiciones de cultivo establecidas. Cuando la bacteria se cultivó durante 100 horas o más, se terminó el cultivo principal.

[0051] El crecimiento de Clostridium botulinum en el medio libre de proteínas de animales (APF) preparado mediante la adición de cuatro candidatos peptona derivados de planta (Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504, y HyPep™ 4601N) al medio de control negativo se comparó con el de la bacteria en el medio de control negativo preparado eliminando el hidrolizado de caseína, el extracto de levadura y el medio de tioglicolato del medio que se usa actualmente (medio original) (Tabla 1).

[0052] Como resultado, como se muestra en la Tabla 1 y la FIG. 1, Clostridium botulinum no creció en el medio de control negativo, pero comenzó a crecer en el medio original (medio que está en uso actual) a las 24 horas después de la inoculación de la bacteria y comenzó a crecer en el medio que contiene peptona de origen vegetal. 30 horas después de la inoculación de la bacteria.

Ejemplo 2: Cultivo de Clostridium botulinum en un medio que contiene peptonas, minerales, aminoácidos y vitaminas de origen vegetal

[0053] Debido al crecimiento de Clostridium botulinum en el medio preparado mediante la adición de cuatro peptonas de origen vegetal en el Ejemplo 1 fue más lento que en el medio original, las soluciones al mismo se proporcionaron como sigue.

1) Para examinar el efecto del funcionamiento del tioglicolato para generar condiciones anaeróbicas, se eliminó el tioglicolato del medio original (medio que se usa actualmente) y se analizó un cambio en la tasa de crecimiento de la bacteria en el medio sin tioglicolato.

2) Debido a que la tasa de crecimiento más lenta podría deberse a la falta de la fuente de nitrógeno, la concentración de peptona en el medio utilizado para el cultivo de la bacteria se incrementó dos veces. 3) El crecimiento de Clostridium botulinum en un medio obtenido mediante la adición de minerales, aminoácidos y vitaminas al medio que contiene peptona de origen vegetal se comparó con el crecimiento de Clostridium botulinum en un medio APF descrito en la Patente de los Estados Unidos N° 8,012,716 (Allergan) (Tabla 2).

[0054] La Tabla 2 muestra los componentes del medio para cultivo de Clostridium botulinum, que contiene peptonas, minerales, aminoácidos y vitaminas de origen vegetal.

Tabla 2

(Continuación)

[0055] Como resultado, como se muestra en la Tabla 2 y la Fig. 2, cuando la bacteria se cultivó en el medio que se encuentra en uso actual sin tioglicolato, la tasa de crecimiento de la bacteria en el medio era más lenta que en el medio que contiene tioglicolato, lo que indica que tioglicolato influye en la tasa de crecimiento de la bacteria. Cuando la concentración de peptona en el medio se incrementó dos veces, la bacteria no creció en el medio. Cuando en el caso en donde se agregaron componentes minerales, aminoácidos y vitaminas al medio que contiene peptona, la tasa de crecimiento del bacaterio fue similar a la del medio que se usa actualmente, pero se formó un precipitado después de la esterilización del medio. Además, se vio que la tasa de crecimiento de la bacteria en el medio APF de Allergan era similar a la del medio que se usa actualmente.

Ejemplo 3: Producción de precipitado por esterilización de medio que contiene peptonas, minerales, aminoácidos y vitaminas de origen vegetal

[0056] En el Ejemplo 2, se observó que la tasa de crecimiento de Clostridium botulinum en el medio que contiene peptonas, minerales y aminoácidos de origen vegetal y vitaminas, entre los candidatos a medio APF 2 a 4 que se muestran en la Tabla 2, fue similar a la del medio que se usa actualmente. Sin embargo, apareció la formación de un precipitado después de la esterilización del medio y, por tanto, se examinó la causa del mismo (Tabla 3).

[0057] La tabla 3 muestra los componentes de un medio para cultivo de Clostridium botulinum, que se utilizó en esterilización y contiene peptonas, minerales, aminoácidos y vitaminas de origen vegetal.

Tabla 3

(Continuación)

[0058] Como resultado, como se muestra en la Tabla 3 y la FIG. 3, solo en el caso en donde se añadieron minerales al medio que contiene peptona de origen vegetal, se formó un precipitado después de la esterilización del medio, lo que indica que la principal causa de formación del precipitado fueron los minerales. Se cree que esto se debe a que los componentes minerales interactuaron entre sí en las condiciones de alta temperatura y alta presión durante la esterilización del medio.

Ejemplo 4: Formación de precipitado mediante esterilización de medio que contiene peptonas y minerales de origen vegetal

[0059] Con el fin de identificar los componentes minerales que participan en la formación de precipitado causada por la esterilización como se ha confirmado en el Ejemplo 3, se añadieron diversas combinaciones de diferentes componentes al medio, seguido de esterilización (Tabla 4).

[0060] La Tabla 4 muestra los componentes de los medios para el cultivo de Clostridium botulinum, que contienen peptonas y minerales derivados de plantas, y los resultados de la esterilización de los medios.

[0061] Como resultado, como se muestra en la Tabla 4 y la FIG. 4, entre los medios que contienen peptonas y minerales de origen vegetal, conteniendo el medio MgSO⁴-⁷H²O y K²HPO⁴y el medio que contiene MgSO⁴-⁷H²O y Na²HPO⁴formaron un precipitado después de la esterilización.

Ejemplo 5: Cultivo de Clostridium botulinum en condiciones en las que no se forma precipitado en medio APF

[0062] Se realizó un experimento para determinar si el cultivo de Clostridium botulinum es posible cuando vitaminas y aminoácidos se añaden adicionalmente al medio APF del Ejemplo 4 que contiene peptonas y minerales de origen vegetal. Además, se realizó un experimento para examinar si el cultivo de la bacteria es posible en un medio libre de peptonas y minerales de origen vegetal y que contiene vitaminas, aminoácidos y/o "BD Recharge™ sin glucosa y L-glutamina" (Cat N° 670002, BD Bioscience) (un componente de medio a base de extracto de levadura libre de glucosa y L-glutamina) (Tabla 5).

[0063] La Tabla 5 muestra los componentes de los medios obtenidos al agregar adicionalmente vitaminas, aminoácidos y "BD Recharge™ sin glucosa y L-glutamina" al medio para el cultivo de Clostridium botulinum, que contiene peptonas y minerales derivados de plantas, y las tasas de crecimiento. de la bacteria en los medios.

[0064] Como resultado, como se muestra en la Tabla 5 y la FIG. 5, solo en el caso en donde el medio contenía peptonas de origen vegetal y una combinación de dos o más minerales de KH²PO⁴, K²HPO⁴y Na²HPO⁴y además contenía vitaminas y aminoácidos, Clostridium botulinum creció dentro de las 24 horas posteriores a la inoculación de la bacteria. Además, en el caso en donde el medio estaba libre de peptonas y minerales de origen vegetal y contenía vitaminas, aminoácidos y "BD Recharge™ sin glucosa y L-glutamina", la bacteria creció dentro de las 48 horas posteriores a la inoculación de la bacteria. En conclusión, la composición de medio más adecuada para el cultivo de Clostridium botulinum comprende peptonas de origen vegetal, KH²PO⁴, K²HPO⁴, Na²HPO⁴, aminoácidos y vitaminas.

Ejemplo 6: Cultivo de Clostridium botu linum en medios que contienen diferentes peptonas de origen vegetal

[0065] Se llevó a cabo el experimento para examinar si la cultivo de Clostridium botulinum es posible cuando se añaden diferentes combinaciones de peptonas de origen vegetal para el medio APF del Ejemplo 5.

[0066] La Tabla 6 muestra los componentes de los medios para el cultivo de Clostridium botulinum, que contienen diferentes peptonas de origen vegetal, y los resultados de examinar si la bacteria creció en el medio.

Como resultado, como se muestra en la Tabla 6 y la FIG. 6, incluso cuando sólo una o dos de las cuatro peptonas de origen vegetal se añadieron al medio, fue posible el cultivo de Clostridium botulinum.

[0067] Teniendo en cuenta los resultados de los Ejemplos 5 y 6, podría verse que al menos una peptona de origen vegetal debe estar contenida en el medio y que la peptona de origen vegetal no puede ser sustituida con "BD recarga™ sin glucosa y L-Glutamina" (Cat N° 670002, BD Bioscience) (un componente de medio a base de extracto de levadura libre de glucosa y L-glutamina).

Ejemplo 7: Experimento para la selección de dos de tres tipos de los minerales contenidos en el medio

[0068] En los ejemplos 1 a 7, se determinó que la composición del medio APF usado para el cultivo de Clostridium botulinum comprende glucosa, cloruro de sodio (NaCl), cuatro peptonas de origen vegetal, tres minerales, aminoácidos y vitaminas. Entre estos componentes del medio, se eliminaron los componentes del medio que no tienen un efecto significativo sobre el crecimiento de la bacteria para reducir el número de componentes del medio. Por tanto, se consideró que los aminoácidos y las vitaminas no tienen un efecto significativo sobre el crecimiento de Clostridium botulinum y, según este criterio, se eliminaron los aminoácidos y las vitaminas de los componentes del medio. Además, con el fin de seleccionar dos de tres tipos de minerales, la bacteria se cultivó usando las composiciones del medio que se muestran en la Tabla 7, y los valores de OD (540 nm y 600 nm) a las 24 horas y 48 horas después de la inoculación de la bacteria fueron medidos y comparados.

[0069] La Tabla 7 muestra las composiciones de los medios resultantes de la selección de minerales en la primera etapa y el crecimiento de Clostridium botulinum en los medios.

[0070] Como resultado, como se muestra en la Tabla 7, a las 24 horas después de la inoculación de la bacteria, el medio que está en uso actual mostró una OD (540 nm) valor de 0,942, y el medio APF que contiene K²HPO⁴y Na²HPO⁴mostró el valor de OD más alto (540 nm) de 4,964 entre los medios APF. Además, a las 48 horas después de la inoculación de la bacteria, el medio APF que contenía KH²PO⁴y Na²HPO⁴mostró el valor de OD más alto y el crecimiento bacteriano activo.

[0071] Mientras tanto, como se muestra en la Fig. 7a a la Fig. 7d, se dibujaron gráficos de contorno de K²HPO⁴y Na²HPO⁴que mostraban efectos principales elevados. Como resultado, a medida que aumentaban las concentraciones de K²HPO⁴y Na²HPO⁴, aumentaba el valor de OD. Y Clostridium botulinum mostró el mayor crecimiento cuando se agregaron minerales al medio en las concentraciones de KH²PO⁴= 0 g/L, K²HPO⁴= 5,5 g/L y Na²HPO⁴= 5 g/L.

[0072] Mientras tanto, con el fin de confirmar los resultados del cultivo bacteriano de acuerdo con adición más precisa de minerales, un experimento de la segunda etapa se realizó usando la metodología de superficie de respuesta. Debido a que la composición del medio no puede tener un valor negativo, el experimento se planificó utilizando un diseño CCF (cara compuesta central) y se realizó cultivando la bacteria en las composiciones del medio que se muestran en la Tabla 8. Luego, los resultados experimentales se combinaron con los resultados del FFD previamente realizado y sometido a análisis estadístico.

[0073] La Tabla 8 muestra las composiciones de los medios obtenidas mediante la selección de minerales en la segunda etapa y el crecimiento de Clostridium botulinum en los medios.

[0074] Diagramas de contorno fueron elaborados y utilizados para la comparación. Como se muestra en las FIGs. 8a a 8d, el valor de OD aumentó a medida que disminuyó la concentración de KH²PO⁴. Cuando se compararon las condiciones óptimas, los resultados fueron diferentes de los resultados de FFD debido al efecto de curvatura, y el valor de K²HPO⁴fue el mismo, pero el valor de Na²HPO⁴cambió de 5 g/L a 3,1313 g/L. Así, se confirmó que las condiciones minerales óptimas del medio mediante análisis estadístico son 5,5 g/L de K²HPO⁴y 3 g/L de Na²HPO⁴.

Ejemplo 8: Experimento para la selección de peptonas de origen vegetal contenidas en medio

[0075] Como se muestra en las Tablas 9 y 10, peptonas de origen vegetal se combinaron de acuerdo con un diseño de la mezcla, y se examinó el crecimiento de Clostridium botulinum en un medio que contiene las peptonas de origen vegetal combinadas.

[0076] La Tabla 9 muestra las composiciones de los medios obtenidas mediante la selección en la primera etapa de peptonas de origen vegetal y el crecimiento de Clostridium botulinum usando los medios.

[0077] La Tabla 10 muestra las composiciones de los medios obtenidas por la selección de segunda etapa de peptonas de origen vegetal y el crecimiento de Clostridium botulinum usando los medios.

[0078] Como resultado, como se muestra en las FIGs. 9a a 9c, se dibujaron gráficos de contorno y se usaron para el análisis. Se determinó que HyPep™ 7504 correspondiente al componente C tiene el menor efecto sobre el crecimiento de Clostridium botulinum. Según esta determinación, HyPep™ 7504 se excluyó de los componentes del medio. En conclusión, se determinó que la composición de las peptonas de origen vegetal finalmente seleccionadas que están contenidas en el medio comprende 5 g/L de HyPea™ 7404, 10 g/L de UltraPep™ Cotton y 5 g/L de HyPep™ 4601N. Ejemplo 9: Cultivo de Clostridium botulinum en un medio con o sin adición de NaCI

[0079] Las composiciones de medio utilizadas en los Ejemplos 1 a 8 contenían una pequeña cantidad (0,5 g/L) de NaCl. Para examinar el crecimiento de Clostridium botulinum de acuerdo con el cambio de concentración de NaCl, el contenido de NaCl en el medio se ajustó a un rango de 0 a 1 g/L, seguido de cultivo de la bacteria en el medio.

[0080] La Tabla 11 muestra los componentes de los medios que contienen NaCl para el cultivo de Clostridium botulinum y el crecimiento de Clostridium botulinum en el medio.

[0081] Como resultado, como se muestra en la FIG. 11, no hubo diferencia en el crecimiento de la bacteria si el medio contenía NaCl o no. Por tanto, el NaCl se excluyó de los componentes finales del medio APF.

Ejemplo 10: Medición de patrón de crecim iento de Clostridium botulinum en medio APF finalmente seleccionado y concentración de toxina

[0082] Clostridium botulinum se inoculó en el medio de cultivo Clostridium botulinum finalmente seleccionado (10 g/L de glucosa, 5 g/L de Hy-Pea™ 7404, 10 g/L de UltraPep™ Cotton, 5 g/L de HyPep™ 4601N, 5,5 g/L de K²HPO⁴y 3 g/L de Na²HPO⁴) determinado en base a los resultados de los Ejemplos 1 a 9, y luego el patrón de crecimiento de la bacteria y se midió la concentración de toxina.

[0083] La Tabla 12 muestra el valor de OD dependiente del tiempo y la concentración de toxina de Clostridium botulinum cultivado en el medio APF finalmente seleccionado.

Tabla 12

[0084] Como resultado, como se muestra en la Tabla 12 y la FIG. 10, el valor de OD comenzó a aumentar después de 12 horas de cultivo de Clostridium botulinum, y a las 24 horas de cultivo, el medio de cultivo mostró una OD⁵⁴⁰nm de 3,5465 y una OD⁶⁰⁰nm de 3,0695. Luego, el valor de OD disminuyó gradualmente, y a las 48 horas de cultivo, el medio de cultivo mostró una OD⁵⁴⁰nm de 0,792 y una OD⁶⁰⁰nm de 0,7224. La concentración de toxina en el sobrenadante de Clostridium botulinum comenzó a aumentar después de 24 horas de cultivo y mostró un valor final de 31,41 mg/ml. Cuando se midió la concentración de toxina después de romper la bacteria, la toxina comenzó a producirse después de 5 horas de cultivo, y la concentración de toxina continuó aumentando, se mantuvo a un nivel uniforme después de 28 horas de cultivo y mostró un valor final de 38,39 pg/ml.

[0085] En conclusión, la composición de APF finalmente seleccionada (medio libre de proteína animal) determinada en base a los resultados de los Ejemplos 1 a 10 se resumió en la Tabla 13.

Tabla 13

APLICABILIDAD INDUSTRIAL

[0086] Como se ha descrito anteriormente, cuando el medio de acuerdo con la presente invención, que contiene peptonas y minerales de origen vegetal, se utiliza para el cultivo de Clostridium botulinum, la tasa de crecimiento de la bacteria en el medio es aproximadamente 1,5-2 veces mayor que la del medio que se utiliza actualmente. Además, cuando se produce toxina botulínica cultivando la bacteria en el medio, la infección con encefalopatía espongiforme transmisible (EET) o similar se puede prevenir bloqueando la introducción de componentes derivados de animales.

[0087] Aunque la presente invención ha sido descrita en detalle con referencia a las características específicas, será evidente para los expertos en la técnica que esta descripción es sólo para una realización preferida y no limita el alcance de la presente invención. Por tanto, el alcance sustancial de la presente invención estará definido por las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de medio libre de proteínas animales (APF) para su uso en el cultivo de Clostridium botulinum, comprendiendo la composición de medio:

peptonas de origen vegetal que comprenden un hidrolizado de guisante de jardín, un hidrolizado de semilla de algodón y un hidrolizado de gluten de trigo con una proporción de 1:0,24-43,62:0,01-50,57 en peso; una fuente de carbono; y al menos un mineral seleccionado del grupo que consiste en K²HPO⁴(fosfato dipotásico), Na²HPO⁴(fosfato disódico) y KH²PO⁴(fosfato monopotásico).

2. La composición de medio de la reivindicación 1, en donde las peptonas de origen vegetal están comprendidas con un contenido de 0,1 a 10% p/v.

3. La composición de medio según la reivindicación 1, en donde la peptona de origen vegetal se somete a un tratamiento enzimático.

4. La composición de medio de la reivindicación 1, en donde el mineral está comprendido en la composición de medio con un contenido de 0,05-3,5% p/v.

5. Un método para producir toxina botulínica, que comprende las etapas de:

(a) cultivar Clostridium botulinum usando la composición de medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para producir toxina botulínica; y

(b) recuperar la toxina botulínica producida.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el cultivo se realiza en condiciones anaeróbicas.

7. El método de la reivindicación 5, en donde la toxina botulínica se selecciona del grupo que consiste en los serotipos de toxina botulínica A, B, C, D, E, F y G.