TWI592484B - 製備肉毒桿菌毒素的培養基組成物 - Google Patents
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Description
本發明係提供一種用於生產肉毒桿菌毒素的培養基組成物,更特別地,涉及一種用於培養能夠產生肉毒桿菌毒素的梭菌屬之菌株的培養基組成物。本發明的培養基組成物包含從豌豆水解物、棉籽水解物以及小麥麵筋水解物構成的組中選擇出的至少一種植物源性蛋白腖。
分泌神經毒素的各種梭菌屬菌株從19世紀90年代被發現,並認為從這些細菌分泌出的毒素的特性描述已在過去的70年中進行了展開(Schant,EJ等人,Microbiol. Rev.
,56:80,1992年)。
從梭菌屬衍生出的神經毒素,即,肉毒桿菌毒素,根據它們的血清學性質分類為七種血清型(A至G血清型)。每一毒素具有大約150 kDa大小的一毒素蛋白且天然包含與毒素蛋白結合的幾個非毒性蛋白質的複合物。中型複合物(300 kDa)由一毒素蛋白和一非毒性非血球凝集素蛋白組成,並且大型複合物(450 kDa)和極大型複合物(900 kDa)由結合至血球凝集素的中等大小的複合物組成(Sugiyama, H.,Microbiol. Rev.
,44:419,1980年)。這種非毒性的血球凝集素蛋白已知的功能在於,用以在低pH值和腸道內的各種蛋白酶中保護毒素。
毒素合成為在細胞內具有大約150 kDa分子量的單個多肽,然後在細胞內蛋白酶的作用下或使用人工酶例如胰蛋白酶的作用下,在從N-端開始的1/3位置裂開成兩個單元:一輕鏈(L;分子量:50kDa)以及一重鏈(H;分子量:100 kDa)。裂開的毒素相比較於單個的多肽大大增強了毒性。這兩個單元透過一雙硫鍵彼此鏈接並具有不同的功能。重鏈結合至一靶細胞的受體(Park. M.K等人,FEMS Microbiol. Lett.
,72:243,1990年)且功能上在低pH值(pH值為4)與生物膜相互作用以形成一通道(Mantecucco,C等人,TIBS
,18:324,1993年),並且輕鏈當透過使用清潔劑滲透到細胞或透過電穿孔等引入到細胞中時,具有干擾神經遞質的分泌的藥理作用,(Poulain, B等人,Proc. Natl. Acad. Sc.
美國,85:4090,1988年)。
此毒素在神經肌肉接點的膽鹼素突觸前抑制乙酰膽鹼的胞吐作用,而引起乏力。認為即使使用很少量的毒素治療也會表現出毒性,這表明毒素具有任何的酶活性(Simpson,L.L等人,Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.
,26:427,1986年)。
根據最近的一份報告,這種毒素具有金屬肽酶活性,並且它的基底由小突觸泡蛋白、突觸融合蛋白、25 kDa的突觸體相關蛋白(SNAP25)等組成,這些蛋白為胞吐機制複合體的單元蛋白質。每一類型的毒素使用上述三種蛋白質的一種作為其基底,並且已知B、D、F以及G型的毒素在一特定位點裂開小突觸泡蛋白,A及E型的毒素在特定位點裂開SNAP25,並且C型在特定位點裂開突觸融合蛋白(Binz,T等人,J. Biol. Chem
,265:9153,1994年)。
特別地,A型的肉毒桿菌毒素已知在4.0-6.8pH下可溶於一稀釋的水溶液。已知一穩定的非毒性蛋白在大約7或更高pH下從神經毒素分離,並且結果,毒性逐漸喪失。特別地,已知毒性隨著pH和溫度的增加而降低。
肉毒桿菌毒素即使少量對人體也是致命的,並且容易大量產生。因此,它與炭疽桿菌、鼠疫桿菌以及天花病毒一起構成四大生物恐怖武器。然而,我們發現,當A型肉毒桿菌毒素在沒有系統地影響人體的劑量下注射時,它可以在注射部位癱瘓局部肌肉。根據這個特點,A型肉毒桿菌毒素可應用於廣泛的領域中,包括祛皺劑、用於治療痙攣性偏癱和腦癱的藥劑等。因此,對A型肉毒桿菌毒素的需求增加,並且研究肉毒桿菌毒素的產生方法積極地進行來滿足需求。
一現有的典型市售產品為BOTOX®
(A型肉毒桿菌毒素的一純化的神經毒素複合物),這種產品購自美國的Allergan公司。BOTOX®
的100單位小瓶由大約5ng的A型肉毒桿菌毒素的一純化神經毒素複合物、0.5 mg的人血清白蛋白以及0.9mg的氯化鈉組成且使用不含防腐劑的無菌鹽水復原(0.9%的氯化鈉注射)。其它的市售產品包括Dysport®
(肉毒桿菌A型毒素和血球凝集素的複合物,其在含有肉毒桿菌毒素的一藥物組成物中具有乳糖和人血清白蛋白,並在使用之前使用0.9%的氯化鈉重建),這種產品購自英國的Ipsen公司,以及MyoBloc®
(一可注射溶液(大約5.6的pH),包含肉毒桿菌B型毒素、人血清白蛋白、琥珀酸鈉以及氯化鈉),這種產品購自Solstice Neurosciences公司。
一種用於培養肉毒桿菌的培養基包含有動物成分,這種培養基通常用於生產肉毒桿菌毒素的方法中,例如在韓國專利號10-1339349中具有公開。因此,如果已知作為引起傳染性海綿狀腦病之試劑的一動物異常朊病毒由於污染而包含在動物的成分中,則在製備肉毒桿菌毒素的過程中會引起問題。
傳染性海綿狀腦病(TSE)已知為引起神經元嚴重退化的神經變性疾病,並且其實例包含牛海綿狀腦病(BSE)、綿羊癢病、克雅氏病(CJD)、格 - 斯二氏綜合徵(Gerstmann-Straussler-Scheinker, GSS)、庫魯病、傳染性水貂性腦病、慢性消耗性疾病、貓海綿狀腦病等,這些病會影響人類和動物。據報導牛海綿狀腦病(BSE)跨越物種屏障並感染了人類。
導致傳染性海綿狀腦病(TSE)的動因具有的特徵在於,它具有無免疫原性且潛伏期長。根據感染牛海綿狀腦病(BSE)的牛腦組織的組織病理學分析,可以看出由於對神經元和異常蛋白纖維的沉積的損害,特殊海綿狀腦病液泡形成於大腦中。
傳染性海綿狀腦病(TSE)的原因是稱為異常朊病毒的蛋白質感染微粒。與需要核酸的一般病毒不相同,異常朊病毒為僅由蛋白質組成而不包含核酸的感染微粒。關於傳染性海綿狀腦病(TSE),已知的是,當為傳染性微粒的一異常朊病毒(PrPsc)結合至一正常朊病毒(PrPc)時,異常朊病毒轉換為一致病性朊病毒,然後在腦中累積(Prusiner SB,Alzheimer Dis Assoc Disord
,3:52-78,1989年)。
克雅氏病是人類傳染性海綿狀腦病(TSE)的一種罕見的神經變性疾病,其中傳染性因子顯然是一朊病毒蛋白的異常同種型。具有克雅病的個體可以六個月內從明顯的健康身體惡化到無動性緘默。因此,從施用包含生物性,例如使用動物產品得到的一肉毒桿菌毒素的藥物組成物中,可能存在引起朊病毒介導的疾病,例如Creutzfeldt-Jacob病的潛在風險。因此,如果藥物組成物是透過使用動物源性成分產生的藥物物質,則病人可受到接受各種病原體或感染因子的潛在風險。
在這種技術背景下,本發明的發明人已發現,當包括無-傳染性海綿狀腦病(TSE)的植物源性蛋白腖及礦物質成分的一培養基用於培養肉毒桿菌,以防止產生上述朊病毒介導的疾病時,可以排除在目前使用的培養基(原始培養基)中可能出現朊病毒介導的疾病的風險,並且相比較於在目前使用的培養基,此培養基中的肉毒桿菌的生長速率增加,從而完成了本發明。
本發明技術問題
本發明的一個目的在於提供一種培養基組成物,這種培養基組成物包含沒有傳染性海綿狀腦病(TSE)感染風險的植物源性蛋白腖,並且在於提供一種肉毒桿菌毒素的生產方法,這種生產方法透過在培養基組成物中培養肉毒桿菌改善了肉毒桿菌毒素的生產。
技術方案
為了達到上述目的,本發明提供了用於培養肉毒桿菌的培養基組成物,這種培養基組成物包含:從一豌豆水解物、一棉籽水解物以及一小麥麵筋水解物構成的組中選擇出的至少一種植物源性蛋白腖。
本發明還提供了一種肉毒桿菌毒素的生產方法,包含以下步驟:(a)使用上述培養基組成物培養肉毒桿菌,以產生肉毒桿菌毒素;以及(b)回收所產生的肉毒桿菌毒素。
本發明的最佳實施方式
在本發明中,嘗試製備一種培養基,這種培養基相比較於目前使用的培養基(原始培養基)進一步增加了肉毒桿菌的生長速率,並且沒有感染傳染性海綿狀腦病(TSE)等危險。因此,使用含有植物源性蛋白腖的一無動物蛋白(APF)培養基,並檢測在無動物蛋白(APF)培養基中的細菌生長。結果,相比較於目前使用的培養基,無動物蛋白(APF)培養基表現出細菌增加的生長速率。因此,如果使用無動物蛋白(APF)培養基,則透過在無-傳染性海綿狀腦病(TSE)條件下以安全的方式培養細菌,能夠產生肉毒桿菌毒素的高濃度。
如本文所使用,用語「目前使用的培養基或原始培養基」係指包含酪蛋白水解物、酵母提取物以及巰乙酸鹽(thioglycollate)培養基的一培養基,其中酪蛋白水解物是動物源性培養基成分。用語「APF培養基(無動物蛋白培養基)」係指不包含動物源性蛋白質且包含植物源性蛋白腖、礦物質以及葡萄糖的培養基。
在本發明的一個實例中,為了透過在無-傳染性海綿狀腦病(TSE)的條件下培養肉毒桿菌以產生肉毒桿菌毒素,製備包含無-傳染性海綿狀腦病(TSE)植物源性蛋白腖的無動物蛋白(APF)培養基,並且與目前使用的培養基(包含動物成分)相比較。結果,可以看出,用於培養肉毒桿菌的最佳培養基組成物為包含:一植物源性蛋白腖、由KH2
PO4
、K2
HPO4
以及Na2
HPO4
構成的組中選擇的至少一種礦物質、以及一碳源(例如,葡萄糖),並且發現了培養基中細菌的最佳生長。結果,如表13所示,確定用於培養肉毒桿菌的最終選擇的培養基組成物中植物源性蛋白腖的最佳含量是5g/L的Hy-Pea™ 7404、10g/L的UltraPep™棉以及5g/L的HyPep™4601N,並且培養基組成物中的礦物質的最佳含量是5.5g/L的K2
HPO4
以及3g/L的Na2
HPO4
。
在本發明的另一實例中,測定在含有植物源性蛋白腖和礦物質的最終選擇的無動物蛋白(APF)培養基中肉毒桿菌的生長模式以及毒素濃度。結果,如表12和圖10所示,在肉毒桿菌培養12小時之後OD值開始增加,並且在培養24小時後,培養基顯示出3.5465的OD540nm
和3.0695的OD600nm
。然後,OD值逐漸下降,並且在培養48小時後,培養基顯示0.792的OD540nm
和0.7224的OD600nm
。在培養5小時之後,肉毒桿菌的培養上清液中的毒素濃度開始增加,並表現出31.41㎍/ml的一最終值。當在破裂細菌之後測量毒素濃度時,在5小時培養之後毒素開始產生,並且毒素濃度繼續增加,在培養的28小時之後保持在一均勻的水平,並且顯示出38.39㎍/ml的一最終值。
基於此,一個方面,本發明涉及用於培養肉毒桿菌的一培養基組成物,這種培養基組成物包含:從一豌豆水解物、一棉籽水解物以及小麥麵筋水解物構成的組中選擇出的至少一種植物源性蛋白腖。
如本文所使用,用語「植物源性蛋白腖」係指從豌豆、棉籽或小麥麵筋中提取的一蛋白腖。優選地,植物源性蛋白腖可以是市售的Hy-Pea™7404、UltraPep™棉或HyPep™4601N,但不限於此。
如本文所用,用語「植物源性蛋白腖」或「植物源性水解物」係指透過降解從植物中分離的蛋白質而獲得的產物。舉例而言,豌豆蛋白腖(豌豆水解物)係指透過降解從豌豆中分離的一總蛋白得到的產物。
植物源性蛋白質的降解較佳透過部分消化進行。蛋白質的降解較佳透過酸處理、鹼處理、酶處理、高壓處理、熱處理或物理處理進行。更佳地,植物源性蛋白腖可透過酶處理而獲得的一種。物理處理為,例如研磨。
在本發明中使用的植物源性蛋白腖是蛋白質的一部分降解產物,為不僅包含為單個分子的氨基酸,而且包含肽組成的幾個到幾十個氨基酸組成的肽,以及完整蛋白質分子的一混合物。
在本發明中,培養基組成物中的植物源性蛋白腖的含量可以為0.1-10 w/v%(1-100 g/L)、較佳為0.2-5 w/v%(2-50 g/L)、更佳為0.5-2 w/v%(5-20 g/L)。
在本發明中,培養基組成物包含所有的豌豆水解物、棉籽水解物以及小麥麵筋水解物,並且培養基組成物中的豌豆水解物、棉籽水解物以及小麥麵筋水解物的含量比可以是1:0.24-43.62:0.01-50.57(按重量),較佳為1:0.68-14.46:0.09-9.87(按重量),更佳為1:1.6-2.4:0.6-1.4(按重量)。
在本發明中,用於培養肉毒桿菌的培養基組成物可進一步包含一碳源和從KH2
PO4
(磷酸氫二鉀)、Na2
HPO4
(磷酸氫二鈉)以及K2
HPO4
(磷酸二氫鉀)構成的組中選擇的至少一種礦物質。
這裡,碳源的實例包括但不限於,單糖(例如,葡萄糖、果糖等)、二糖(例如,麥芽糖、蔗糖等)、寡糖、多醣(例如,糊精、環糊精、澱粉等)、糖醇(例如,木糖醇、山梨糖醇、赤藻糖醇等)。
在本發明中,培養基組成物中的礦物質的含量可以是0.05-3.5 w/v%(0.5-35g/L)、較佳為0.1-1.75 w/v%(1-17.5g/L)、並且更佳為0.25-0.7 w/v%(2.5-7g/L)。
在另一方面,本發明涉及一種用於生產肉毒桿菌毒素的方法,包含以下步驟:(a)使用上述培養基組成物培養肉毒桿菌毒素,以產生肉毒毒素;以及(b)回收所產生的肉毒桿菌毒素。
在本發明中,培養可以在厭氧條件下進行,並且肉毒桿菌毒素可以從包括A、B、C、D、E、F以及G型肉毒桿菌毒素的組中選擇。實例
以下,將結合實例更詳細地描述本發明。對本領域的普通技術人員顯而易見的是這些實例僅是說明性的目的,並不解釋為限制本發明的範圍。因此,本發明的實質範圍將由所附的專利申請範圍及其等同物來限定。 實 例 1 :植物源性蛋白腖培養基 中 肉毒桿菌的 培養 1-1 : 培養中 目前 使用的培養基組成物
本發明中使用的試劑和培養基成分購自Sigma(美國)、Kerry公司(美國)、BD Biosciences公司(美國)、Gibco生命技術公司(美國)、以及Quest公司(美國)。
具有包含2%酪蛋白水解物(20 g/L)、1%酵母提取物(10 g/L)、1%葡萄糖(10 g/L)以及0.5%巰乙酸鹽培養基(5 g/L)之組成物的目前使用的一培養基用於肉毒桿菌的種菌培養和主培養,以生產肉毒桿菌毒素。目前使用的每升這種培養基中5克的巰乙酸鹽培養基由2.52克的一酪蛋白酶消化物、0.84克的酵母提取物、0.925克的右旋糖、0.085克的巰乙酸鈉、0.42克的氯化鈉、0.085克的L-半胱氨酸、0.00014克的刃天青以及0.125克的細菌瓊脂組成。1-2 : 培養中使用的 APF 培養基的組成 物
一陰性對照培養基透過從用於肉毒桿菌培養的目前使用的培養基(原始培養基)中除去酪蛋白水解物、酵母提取物以及巰乙酸鹽培養基來製備,並且一無動物蛋白(APF)培養基透過向陰性對照培養基加入四種植物源性蛋白腖候選物(Hy-Pea™7404、UltraPep™棉、HyPep™7504、以及HyPep™4601N來製備(表1)。
表1表示相比較於目前使用的培養基,用於培養肉毒桿菌的包含-植物源性蛋白腖的APF培養基的成分。表 1 1-3 :肉毒桿菌的種菌培養
20微升(μl)的肉毒桿菌(韓國疾病預防控制中心登錄號:4-029-CBB-IS-001)接種到含有10毫升(ml)的一培養管中,培養管中具有實例1-1及1-2中描述的每一組成物的無菌培養基,並在厭氧條件下在35℃進行22-30小時的初級種菌培養(靜止培養)。當確認完成了初級種菌培養中的細菌生長時,8毫升的初級培養物接種到包含800毫升具有相同培養基組成物的一無菌培養基的1-升培養瓶中,並在厭氧條件下在35℃進行8-15小時的一次級種菌培養(靜止培養)。1-4 :肉毒桿菌 的 主培養
為了透過培養肉毒桿菌來產生一肉毒桿菌毒素,進行細菌的主培養。特別地,製備9.3升的具有實例1-1和1-2中所描述的每一組成物的一培養基,並放置於一10-升的培養器中,然後是培養基的殺菌。供給氮氣來產生厭氧條件,並且在35℃的溫度和一50 rpm的攪拌速度下進行細菌的生長。
在實例1-3中的1-升培養瓶中的次級種菌培養物通過一接種線接種至一10-升培養器中,其中此接種線連接至這個10-升培養器的接種端口。在10-升培養器中的肉毒桿菌在35℃和50rpm的條件下培養,並且監測和記錄設置的培養條件。當細菌培養100小時或長時間時,主培養結束。
透過將四種植物源性蛋白腖候選物(Hy-Pea™7404、UltraPep™棉、HyPep™7504、以及HyPep™4601N)添加至陰性對照培養基而製備的無動物蛋白(APF)培養基中的肉毒桿菌的生長,與從目前使用的培養基(原始培養基)中去除酪蛋白水解物、酵母提取物以及巰乙酸鹽培養基來製備的陰性對照培養基中的細菌相比較(表1)。
結果,如表1和圖1所示,肉毒桿菌在陰性對照培養基中不生長,但在細菌接種24小時後在原始培養基中開始生長(目前使用的培養基),並且在細菌接種後30小時在含植物源性蛋白腖的培養基中開始生長。 實 例 2 : 在 含有植物源性蛋白腖 、 礦物質 、 氨基酸 以及 維生素 的培養基中 肉毒桿菌的 培養
因為透過在實例1中增加四種植物源性蛋白腖製備的培養基中肉毒桿菌的生長相比較於原始培養基較慢,因此向其提供如下的解決方案。 1)為了檢查巰乙酸鹽對產生厭氧條件的影響,巰乙酸鹽從原始培養基(目前使用的培養基)去除,並且分析在無巰乙酸鹽的培養基中細菌的生長速率的變化。 2)因為由於缺乏氮源生長速度較慢,因此在用於培養細菌的培養基中蛋白腖的濃度增加兩倍。 3)透過向含植物源性蛋白腖的培養基中添加礦物質、氨基酸以及維生素獲得的培養基中肉毒桿菌的生長,與在美國專利第8012716號案(Allergan公司)中揭露的無動物蛋白(APF)培養基中肉毒桿菌的生長相比較(表2)。
表2表示用於培養肉毒桿菌的包含植物源性蛋白腖、礦物質、氨基酸以及維生素的培養基的成分。表 2
結果,如表2和圖2所示,當細菌在係為目前使用的無巰乙酸鹽的培養基中培養時,這種培養基中細菌的生長速率相比較於含-巰乙酸鹽的培養基中更慢,表明巰乙酸鹽影響細菌的生長速率。當在培養基中蛋白腖的濃度增加兩倍時,細菌在培養基中不生長。當礦物成分、氨基酸以及維生素添加至含-蛋白腖的培養基中的情況下,細菌的生長速率類似於在目前使用的培養基中的情況,但是在培養基殺菌後形成沉澱物。此外,可以看出,在Allergan公司的無動物蛋白(APF)培養基中細菌的生長速率類似於目前使用的培養基。 實 例 3 : 透過殺菌 含有植物源性蛋白腖 、 礦物質 、 氨基酸 以及 維生素的 培養基的 沉澱物 產生
在實例2中,可以觀察到在表2中所示的無動物蛋白(APF)培養基候選物2至4中,含有植物源性蛋白腖、礦物質、氨基酸以及維生素的培養基中肉毒桿菌的生長速率類似於目前使用的培養基中肉毒桿菌的生長速率。但是,在培養物殺菌之後出現沉澱物的形成,並且因此檢查了其原因(表3)。
表3表示在殺菌中使用的用於培養肉毒桿菌且包含植物源性蛋白腖、礦物質、氨基酸以及維生素的一培養基的成分。表 3
結果,如表3和圖3所示,僅在礦物質添加至含植物源性蛋白腖培養基中的情況下,在培養基殺菌之後形成一沉澱物,表明形成沉澱物的主要原因是礦物質。這認為因為在培養基的殺菌期間在高溫和高壓的條件下,礦物質的成分彼此相互作用。 實 例 4 : 透過殺菌 含有植物源性蛋白腖和礦物的 培養基的 沉澱物 產生
為了識別實例3中證實的由殺菌引起起的沉澱物形成所涉及的礦物成分,不同成分的各種組合加入到培養基中,隨後殺菌(表4)。
表4表示含有植物源性蛋白腖和礦物質用於培養肉毒桿菌的培養基的成分,以及培養基的殺菌結果。表 4
結果,如表4和圖4所示,在含有植物源性蛋白腖和礦物質的培養物之中,在殺菌之後,含有MgSO4
·7H2
O及K2
HPO4
的培養基和含有MgSO4
·7H2
O及Na2
HPO4
的培養基形成沉澱物。 實例 5 : 在 APF 培養基中沒有 形成沉澱 物的條件下 肉毒桿菌的培養
進行一實驗,以確定當維生素和氨基酸另外添加至含植物源性蛋白腖和礦物質的實例4的APF培養基時,是否可能培養肉毒桿菌。此外,還執行一實驗,以檢查在不含植物源性蛋白腖和礦物質且含有維生素、氨基酸與/或「無葡萄糖及L-麩醯胺的BD Recharge™」(目錄號670002,BD Bioscience公司)(無葡萄糖及L-麩醯胺的基於提取物的酵母培養基成分)的一培養基中,是否可能培養細菌(表5)。
表5表示透過向培養肉毒桿菌的含有植物源性蛋白腖和礦物質的培養基另外添加維生素、氨基酸以及「無葡萄糖及L-麩醯胺的BD Recharge™」所得到的培養基的成分,以及培養基之細菌的生長速率。表 5
結果,如表5及圖5所示,僅在含有植物源性蛋白腖和KH2
PO4
、K2
HPO4
以及Na2
HPO4
中兩個或更多礦物質的組合,並進一步包含維生素和氨基酸的培養基的情況下,在細菌接種後的24小時之內肉毒桿菌生長。此外,在培養基無植物源性蛋白腖和礦物並含有維生素、氨基酸以及「無葡萄糖及L-麩醯胺的BD Recharge™」的情況下,細菌接種後的48小時之內細菌生長。總之,用於培養肉毒桿菌培養的最適合的培養基組成物包含植物源性蛋白腖、KH2
PO4
、K2
HPO4
、Na2
HPO4
、氨基酸以及維生素。 實 例 6 : 在 含 有 不同植物源性蛋白腖 的培養基中的 肉毒桿菌 培養
進行實驗以檢查當植物源性蛋白腖的不同組合添加至實例5的APF培養基時,是否可能培養肉毒桿菌。
表6表示含有不同的植物源性蛋白腖用於培養肉毒桿菌的培養基的成分,以及培養基中細菌是否生長的檢查結果。表 6
結果,如表6及圖6所示,即使四種植物源性蛋白腖中的一種或兩種添加至培養基中,也可能進行肉毒桿菌的培養。
考慮實例5及6的結果,可以看出,至少一種植物源性蛋白腖應包含在培養基中且植物源性蛋白腖不能夠由「無葡萄糖及L-麩醯胺的BD Recharge™」(目錄號670002,BD Bioscience公司)(無葡萄糖及L-麩醯胺的基於提取物的酵母培養基成分)取代。 實例 7 : 用於從 培養基中含有的三種類型的礦物中選擇兩種的實驗
在實例1至7中,確定用於培養肉毒桿菌的APF培養基組成物包含葡萄糖、氯化鈉(NaCl)、四種植物源性蛋白腖、三種礦物質、氨基酸以及維生素。在這些培養基成分中,去除對細菌的生長沒有顯著作用的培養基成分,以降低培養基成分的數量。因此,可以判斷出氨基酸和維生素對肉毒桿菌的生長沒有顯著效果,並且基於此判斷,氨基酸和維生素從培養基成分中去除。此外,為了從三種類型的礦物質中選擇兩種,使用表7中所示的培養基組成物培養細菌,並且在細菌接種後的24小時和48小時,測定和比較OD(540 nm和600 nm)值。
表7表示礦物質的第一階段選擇產生的培養基組成物和培養基中肉毒桿菌的生長。表 7
結果,如表7所示,在細菌接種之後的24小時,目前使用的培養基顯示出0.942的OD(540nm)值,以及在APF培養基中,含有K2
HPO4
和Na2
HPO4
的APF培養基表現出4.964的最高OD(540nm)值。此外,在細菌接種之後的48小時,含有KH2
PO4
和Na2
HPO4
的APF培養基表現出最高OD值和活躍的細菌生長。
同時,如圖7a至圖7d所示,繪製出了具有高主要效果的K2
HPO4
和Na2
HPO4
的等值線圖。結果,隨著K2
HPO4
和Na2
HPO4
的濃度增加,OD值增加。並且當礦物質在KH2
PO4
= 0 g/L、K2
HPO4
= 5.5 g/L以及Na2
HPO4
= 5 g/L的濃度加入培養基中時,肉毒桿菌表現出最高的生長。
同時,為了確認細菌培養根據更精確的礦物質加入的結果,使用一回應面分析法進行一第二階段的實驗。因為培養基組成物不能夠具有一負值,因此實驗使用一CCF(中心複合面)設計進行計劃且透過在表8中所示的培養基組成物中培養細菌來進行。然後,實驗結果與先前進行的FFD的結果相結合,並進行統計分析。
表8表示由礦物質的第二階段選擇得到的培養基組成物和在培養基中肉毒桿菌的生長。表 8
繪製等值線圖且用於比較。如圖8a至圖8d所示,OD值隨著KH2
PO4
的濃度降低而增加。當最佳條件相當時,由於曲率效應,實驗結果與FFD的結果不相同,K2
HPO4
的值是相同的,但是Na2
HPO4
的值從5 g/L改變為3.1313 g/L。因此,透過統計分析可以確認培養基的最佳礦物質條件為5.5g/L的K2
HPO4
和3g/L的Na2
HPO4
。 實例 8 : 用於選擇 培養基中含 有的 植物源性蛋白腖 的 實驗
如表9及10所示,植物源性蛋白腖根據一混合物設計相結合,並且檢測在含有相結合的植物源性蛋白腖的培養基中肉毒桿菌的生長。
表9表示由植物源性蛋白腖的第一階段選擇得到的培養基組成物,以及使用這種培養基的肉毒桿菌的生長。表 9
表10表示由植物源性蛋白腖的第二階段選擇得到的培養基組成物,以及使用這種培養基的肉毒桿菌的生長。表 10
結果,如圖9a至圖9c所示,繪製等值線圖並用於分析。確定對應於成分C的HyPep™7504對肉毒桿菌的生長的具有最低的效果。根據此確定結果,HyPep™7504排除於培養基成分之外。總之,確定培養基中包含的最終選擇的植物源性蛋白腖的組成物包含5 g/L的Hy-Pea™7404、10g/L的UltraPep™棉以及5g/L 的HyPep™4601N。 實例 9 : 包含 或不 包 含氯化鈉 的培養基中 肉毒桿菌的 培養
實例1至8中使用的培養基組成物含有少量的NaCl(0.5g/L)。為了根據NaCl的濃度變化檢測肉毒桿菌的生長,培養基中NaCl的含量調節到從0至1 g/L的一範圍,然後在培養基中的進行細菌培養。
表11表示用於培養肉毒桿菌的含NaCl的培養基的成分,以及這種培養基中肉毒桿菌的生長。表 11
結果,如表11所示,培養基是否含有NaCl對細菌的生長沒有差異。因此,氯化鈉排除在最終的APF培養基成分之外。 實例 10 :最終選擇的 APF 培養基中 肉毒桿菌的 生 長模式和毒素濃度的測量
肉毒桿菌接種到根據實例1至9之結果確定的最終選擇的肉毒桿菌培養基(10 g/L葡萄糖、5g/L的Hy-Pea™7404、10g/L的UltraPep™棉、5g/L的HyPep™4601N、5.5g/L的K2
HPO4
以及3g/L的Na2
HPO4
)中,然後測量細菌的生長模式和毒素濃度。
表12表示在最終選擇的APF培養基中生長的肉毒桿菌的根據時間的OD值和毒素濃度。表 12
結果,如表12及圖10所示,在肉毒桿菌培養12小時之後,OD值開始增加,並在培養的24小時,培養基表示出3.5465的OD540nm
和3.0695的OD600nm
。然後,OD值逐漸降低,並且在培養的48小時,培養基表示出0.792的OD540nm
和0.7224的OD600nm
。並且在培養24小時之後,肉毒桿菌上清液中毒素濃度開始增加,並且表現出31.41㎍/ ml的一最終值。當斷裂細菌之後測量毒素濃度時,在培養5小時之後開始生產毒素,並且毒素濃度繼續增加,在28小時的培養後保持在一均勻的水平,並且顯示出38.39㎍/ml的一最終值。
總之,根據實例1至10的結果確定的最終選擇的APF(無動物蛋白培養基)組成物在表13中作出總結。表 13
工業應用
如上所述,當根據本發明的含有植物源性蛋白腖及礦物質的培養基用於培養肉毒桿菌時,在這種培養基中細菌的生長速率相比較於目前使用的培養基高大約1.5-2倍。此外,當透過在這種培養基中培養細菌產生肉毒桿菌毒素時,透過防止引入動物源性成分能夠防止感染傳染性海綿狀腦病(TSE)等。
雖然本發明已參考特定特徵進行了詳細描述,但本領域的技術人員顯然可知的是,這種描述僅用於一優選的實施例,並且不限制本發明的範圍。因此,本發明的實質範圍將由所附的專利申請範圍及其等同物來限定。
無
圖1表示在包含植物源性蛋白腖的一培養基(無動物蛋白(APF)培養基)中肉毒桿菌的生長。 圖2表示在包含植物源性蛋白腖、礦物質、氨基酸以及維生素的培養基中肉毒桿菌的生長。 圖3表示在含有植物源性蛋白腖、礦物質、氨基酸以及維生素的培養基中的殺菌之後檢查是否形成一沉澱物的結果。 圖4表示在含有植物源性蛋白腖以及礦物質的培養基殺菌之後檢查是否形成一沉澱物的結果。 圖5表示對培養細菌的含有植物源性蛋白腖和礦物質的培養基中另外添加維生素、氨基酸以及「無葡萄糖及L-麩醯胺的BD Recharge™」所得到的培養基中肉毒桿菌的生長。 圖6表示在包含各種植物源性蛋白腖,用於培養細菌的培養基中肉毒桿菌的生長。 圖7表示用於礦物質篩選的FFD等值線圖,以及響應優化。圖7a係為高設置的等值線圖;圖7b係為中間設置的等值線圖;圖7c係為低設置的等值線圖;以及圖7d係為最大OD的響應優化。 圖8表示用於礦物質篩選的FFD等值線圖,以及響應優化。圖8a係為高設置的等值線圖;圖8b係為中間設置的等值線圖;圖8c係為低設置的等值線圖;以及圖8d係為最大OD的響應優化。 圖9表示用於植物蛋白腖篩選的等值線圖,以及響應優化。圖9a係為中間設置的等值線圖;圖9b係為低設置的等值線圖;以及圖9c係為最大OD的響應優化。以及 圖10表示在最終選擇的無動物蛋白(APF)培養基中肉毒桿菌的生長曲線,以及毒素濃度的變化。
Claims (8)
- 一種用於培養肉毒桿菌的培養基組成物,該培養基組成物包含:一豌豆水解物、一棉籽水解物以及一小麥麵筋水解物;其中,該豌豆水解物、該棉籽水解物以及該小麥麵筋水解物的重量比例為1:0.24-43.62:0.01-50.57。
- 如請求項1所述之用於培養肉毒桿菌的培養基組成物,其中該豌豆水解物、該棉籽水解物以及該小麥麵筋水解物之組合的含量為0.1-10w/v%。
- 如請求項1所述之用於培養肉毒桿菌的培養基組成物,其中該豌豆水解物、該棉籽水解物以及該小麥麵筋水解物之組合進行一酶處理。
- 如請求項1所述之用於培養肉毒桿菌的培養基組成物,進一步包含一碳源和從K2HPO4(磷酸氫二鉀)、Na2HPO4(磷酸氫二鈉)和KH2PO4(磷酸二氫鉀)構成的組中選擇的至少一種礦物質。
- 如請求項4所述之用於培養肉毒桿菌的培養基組成物,其中該培養基組成物中礦物質的含量為0.05-3.5w/v%。
- 一種肉毒桿菌毒素的生產方法,包含以下步驟:(a)使用請求項1至5中任意一項的該培養基組成物培養肉毒桿菌,以產生肉毒桿菌毒素;以及(b)回收所產生的該肉毒桿菌毒素。
- 如請求項6所述之肉毒桿菌毒素的生產方法,其中培養在厭氧條件下進行。
- 如請求項6所述之肉毒桿菌毒素的生產方法,其中該肉毒桿菌毒素從肉毒桿菌毒素血清型A、B、C、D、E、F以及G構成的組中選擇。
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