RU2582044C2 - Состав для ферментативного удаления слизи из масел - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к пищевой промышленности. Способ уменьшения эмульгируемости растительного масла в водных фазах, вклчающий приведение в контакт неочищенного растительного масла или слизи растительного масла с составом, включающим в себя первый ферментный компонент, включающий в себя по меньшей мер, один расщепляющий фосфолипид фермент, а также второй ферментный компонент, включающий в себя по меньшей мере один не расщепляющий фосфолипид фермент, причем вторым ферментным компонентом является альфа-амилаза. Далее осуществляют отделение слизей от растительного масла, причем до приведения в контакт, согласно первому этапу, неочищенное растительное масло контактирует с водой и/или кислотой, но отделения водной фазы до первого этапа не происходит, наоборот, предварительно кондиционированное масло используется непосредственно на первом этапе. Изобретение позволяет за счет комбинации двух видов ферментов снизить содержание фосфолипидов растительного масла, увеличить выход масла, повысить скорость реакции при ферментативном удалении слизи, уменьшить объем слизи и улучшить отделяемость образовавшейся слизистой фазы. 9 з.п. ф-лы, 8 ил., 9 табл., 2 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к составу, включающему в себя, по меньшей мере, один расщепляющий фосфолипид фермент. Кроме того, изобретение относится к способу удаления слизи из неочищенных масел с применением соответствующего изобретению состава, а также применению соответствующего изобретению состава для удаления слизи из триглицеридов, в частности, не очищенных растительных масел.

Уровень техники

Неочищенные масла содержат фосфатиды, содержащие белки и углеводы вещества, растительные слизистые вещества, а также коллоидные соединения, которые сильно снижают сохраняемость масла. Поэтому эти вещества должны удаляться.

Под слизистой фазой/слизистыми веществами здесь в нижеследующем тексте понимают всю группу этих веществ, которые после обработки содержащим кислоту и/или водным раствором выпадают в осадок из масла в виде тяжелой фазы (Bokisch, М. (Nahrungsfette und - öle, Handbuch der Lebensmittel-Technologie - Пищевые жиры и масла, учебник по технологии пищевых продуктов), Ulmer Verlag, 342-433).

Под рафинацией понимают удаление нежелательных сопутствующих веществ. Проводят различие между химической и физической рафинацией. Химическая рафинация состоит из процессов: 1 - удаление слизи, 2 - нейтрализация, 3 - осветление, 4 - дезодорация. При удалении слизи из масла удаляются фосфолипиды и ионы металлов. Нейтрализация служит для экстракции жирных кислот. При осветлении удаляются красящие вещества, другие ионы металлов и остаточные слизистые вещества. Что касается дезодорации, то речь идет о дистилляции водяным паром, при которой удаляются соединения, которые ухудшают запах и вкус масла. При физической рафинации проводится удаление кислот вместе с дезодорацией в конце процесса рафинации.

Удаление слизи из масел может происходить путем экстракции фосфолипидов водой или водным раствором кислоты, которая комплексует ионы Са²⁺ и Mg²⁺, как например лимонная кислота или фосфорная кислота. Часто при этом проводят сначала водное, так называемое предварительное удаление слизи, с помощью которого удаляются водорастворимые фосфолипиды.

При этом говорят о гидратируемых фосфолипидах. Тематика гидратируемых и негидратируемых фосфолипидов описана, например, в Nielsen, К. (Composition of difficultly extractable soy bean phosphatides - Состав трудно экстрагируемых фосфатидов сои), J. Am. Oil. Chem. Soc. 1960, 37, 217-219 и A.J. Dijkstra, (Enzymatic degurnming - Ферментативное удаление слизи), Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2010,112, 1178-1189. При этом речь идет, в частности, о фосфатидил-холине и фосфатидил-инозите. Обработка разбавленными водой комплексирующими кальций и магний кислотами, как например лимонной кислотой или фосфорной кислотой, приводит, согласно уровню техники, к тому, что негидратируемые фосфолипиды переводятся в гидратируемые фосфолипиды. Исходят из того, что механизм этой реакции основывается на том, что ионы кальция, которые связывают мостиком у фосфатных групп и стабилизируют различные молекулы фосфолипидов, как например фосфатидные кислоты, удаляются из масла. Это приводит к улучшенной экстракции этих фосфолипидов водой. Хотя путем водного предварительного удаления и обработки водными кислотами в случае некоторых масел, например, пальмового масла, достигается достаточно хорошее удаление слизи, в случае других типов растительных масел, например, масла канолы, рапсового масла или соевого масла эти оба этапа экстракции приводят очень часто к недостаточному уменьшению содержания слизистых веществ. Обычно стремятся при этом к уменьшению содержания фосфора до 10 млн^-1 или меньше в масле, предназначенном для использования в продуктах питания (согласно уровню техники, определяемому методом ICP/AES-анализа масла). Более высокие требования к содержанию фосфора в масле предъявляются тогда, когда масла используются, например, для изготовления дизельного биотоплива. Тогда ЕС-нормой содержание фосфора в дизельном биотопливе ограничивается 5 млн^-1 и целесообразно уменьшать содержание фосфора уже в масле. Кроме того, особенно низкое содержание фосфора, т.е. содержание фосфора, которое является настолько низким, насколько это возможно, и по возможности равно 0, необходимо тогда, когда масла на последующих этапах обработки или гидрируют для использования в пищевых продуктах, т.е. ненасыщенные жирные кислоты переводят насыщенные, или когда гидрирование проводят согласно процессу NExBTL фирмы Neste так, что в качестве конечного продукта получаются алканы, т.е. обычное дизельное биотопливо, изготовленное, однако, из растительного масла. Эти процессы предъявляют, как сказано до этого, экстремально высокие требования к низкому содержанию фосфора в масле, и использование таких процессов будет возрастать в той мере, как растительные масла будут использоваться в качестве сырья для химической промышленности.

Другой вариант представляет так называемая «каустическая рафинация». Этот способ используется, чтобы удалить из масла по возможности все фосфолипиды вместе со свободными жирными кислотами. Этот процесс описан, например, в WO 08/094847 фирмы Bunge. При этом способе неочищенное или предварительно очищенное водой от слизи масло сначала смешивается с небольшими количествами лимонной кислоты или фосфорной кислоты и интенсивно перемешивается. При этом, как уже рассматривалось выше, соли негидратируемых фосфолипидов становятся более гидратируемыми. Затем добавляется разбавленный раствор едкого натра, причем количество его рассчитывается так, что получают небольшой избыток относительно необходимого для нейтрализации свободных жирных кислот количества. Вследствие этого образуются соли жирных кислот. Путем осаждения и последующего центрифугирования смесь затем разделяется и получают водный раствор жирных кислот в качестве остатка, в котором находятся и фосфолипиды. Масло вслед за этим затем еще раз промывается умягченной водой. Обработка NaOH имеет недостаток, заключающийся в том, что частично происходит также омыление масла, вследствие чего выход его снижается.

Согласно уровню техники дальнейшее уменьшение содержания фосфора в масле может достигаться посредством того, что проводят или адсорбирующую обработку отбеливающей глиной или специальным силикагелем или удаляют слизи из растительных масел ферментативно. Обработка адсорбентом имеет недостаток, заключающийся в том, что после обработки адсорбентом на адсорбенте остается растительное масло, которое уменьшает выход масла во всем процессе рафинации. Кроме того, использованная отбеливающая глина представляет собой «отход», для которого должны изыскиваться возможности утилизации.

Другой недостаток обычных процессов удаления слизи из масел состоит в том, что как водное предварительное удаление слизи, так и обработка водными кислотами приводят к потерям масла, которые вызваны тем, что переведенные в воду фосфолипиды представляют собой эмульгаторы, которые эмульгируют, хотя и малую, но все же значительную часть растительного масла в водной фазе, вследствие чего масло теряется. Эти потери могут составлять порядка нескольких процентов в расчете на первоначально использованное неочищенное масло. Согласно эмпирическому правилу, каждыми двумя молекулами фосфолипида эмульгируется примерно одна Молекула триглицерида (описано в WO 08/094847).

Так называемое ферментативное удаление слизи предотвращает многие недостатки существующих способов или совершенствует способы экстракции. Так, не образуется никакого дополнительного отхода, как при использовании адсорбентов, и было показано, что при ферментативном удалении слизи потери масла могут уменьшаться в еще большей степени.

Так называемое ферментативное удаление слизи достигается согласно уровню техники использованием фосфолипаз, в частности, фосфолипазы А1 и А2 или фосфолипазы С или комбинации фосфолипаз.

Фосфолипазы являются ферментами, которые относятся к группе гидролаз, которые гидролизуют эфирную связь фосфолипидов. Фосфолипазы по их региоизбирательности по отношению к фосфолипидам подразделяются на 5 групп:

Фосфолипазы A₁ (PLA₁), которые отщепляют жирные кислоты в sn1-положении с образованием 2-лизофосфолипида.

Фосфолипазы А₂ (PLA₂), которые отщепляют жирные кислоты в sn2-положении с образованием 1-лизофосфолипида.

Фосфолипазы С (PLC), которые отщепляют моноэфир фосфорной кислоты.

Фосфолипазы D (PLD), которые отщепляют или обменивают головную группу.

Фосфолипазы В (PLB), которые отщепляют жирные кислоты как в snl-положении, так и в sn2-положении с образованием 1, 2-лизофосфолипида.

Эти реакции всегда происходят на поверхности раздела агрегированных субстратов.

Применение фосфолипаз, прежде всего фосфолипазы А, для удаления слизи из неочищенных масел защищено, например, в ЕР 0513709 В1 (так называемый Enzymax-процесс фирмы Lurgi, Франкфурт). Исходят из того, что отщепление жирной кислоты приводит к образованию лизолецитина, который отличается значительно меньшей эмульгирующей способностью по отношению к маслу, а также значительно большей растворимостью в воде. Вследствие этого не только повышается выход масла, но и улучшается растворимость трудно гидратируемых фосфолипидов в воде. Статья Clausen, (Enzymatic oil-degumming by novel microbial phospholipase - ферментативное удаление слизи новой микробной фосфолипазой), Eur. J. Lipid Sci. Technol. 103 (2001) 333-340, описывает получение и использование фосфолипазы А1 для ферментативного удаления слизи и сравнивает использование фосфолипазы А1 с использованием фосфолипазы А2. Современный уровень техники по ферментативному удалению слизей из масла обобщен в двух статьях A.J. Dijkstra, (Recent developments in edible oil processing - Новейшие успехи в переработке пищевых масел), Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2009, 111, 857-864, и статье A.J. Dijkstra (Enzymatic degumming - ферментное удаление слизи), Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2010, 112, 1178-1189. В них обсуждаются преимущества и недостатки отдельных фосфолипаз для ферментативного удаления слизи из масла, а также приводятся методы предварительной обработки различными кислотами.

Альтернативную концепцию удаления слизи из масла представляют системы фирмы Danisco, в которых используется липидацилтрансфераза. Этот фермент также создает из фосфолипида лизофосфолипид, переносит, однако, остаток жирной кислоты к стеролу в масляной фазе. Соответствующие ферменты и способы для использования этих ферментов описаны в WO 2006/008508 и WO 2009/081094.

С точки зрения выхода масла для ферментативного удаления слизи наиболее выгодно было бы использовать высокоэффективную фосфолипазу С, которая в качестве продукта производит диглицерид, растворимый в масле, и остаток фосфатидила, как например фосфатидил-холин (происходящий от лецитина), который является очень хорошо растворимым в воде. Такие ферменты фирма Verenium описала в US 7,226,771. В обзорной статье Dijkstra на тему «Ферментное удаление слизи» в качестве недостатка этой системы приводится то, что она преобразует не все фосфолипиды, а только лишь лецитины, т.е. фосфатидил-холин и фосфатидил-инозитол, в то время как трудно гидратируемые этаноламины и фосфатидные кислоты остаются нетронутыми. Этот недостаток приводил к тому, что в последующих разработках фосфолипаза С комбинировалась или с фосфолипазами А или с липидацилтрансферазами. Комбинация фосфолипаз А с фосфолипазами С для удаления слизи из масла описана в WO 08/094847. В этом патентном документе указывается, что смесь фосфолипазы А и фосфолипазы С, с одной стороны, приводит к синергистическому эффекту в отношении выхода масла, с другой стороны, вследствие этого могут устанавливаться очень низкие уровни содержания фосфора в масле при допустимых продолжительностях реакций.

Комбинация фосфолипазы С с липидацилтрансферазами описана в WO 2009/081094. И здесь указывается, что комбинация ацилтрансферазы с фосфолипазой С приводит к увеличению выхода масла. Другой вариант ферментативного удаления слизи из масла представляет ферментативная обработка отделенной слизистой фазы, после того, как слизь была удалена из масла обычными способами, как например водой и/или лимонной кислотой. Посредством такой обработки можно вновь извлечь часть эмульгированного в слизистой фазе растительного масла. Этот процесс обсуждается, например, и в обзорной статье A.J. Dijkstra, (Enzymatic degurnming - ферментное удаление слизи), Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2010, 112, 1178-1189 S. 1184. Соответствующие способы описаны также в следующих патентных документах:

ЕР 01624047 описывает извлечение масла из слизи путем использования фосфолиполитических средств, причем фосфолиполитические средства могут быть как кислотами, так и фосфолипазами.

WO 2009/01624 47 описывает наряду с выше приведенными аспектами и ферментативную обработку отделенной слизистой фазы ацилтрансферазой и смесями из ацилтрансферазы и фосфолипазы С.

WO 2009/088980 описывает ферментативную обработку «слизи» фосфолипазой С и фосфолипазой А.

Аспект устойчивости использования фосфолипаз по сравнению с другими методами удаления слизи описан, наконец, в статье L. De Maria & J. Vind & К. M. Oxenboll & A. Svendsen & S. Patkar, (Phospholipases and their industrial applications - Фосфолипазы и области их промышленного применения), Appl Microbiol Biotechnol (2007) 74:290-300 S. 96 и 97. На примере маслоэкстракционной установки, которая была перенастроена с обычного процесса удаления слизи на процесс с фосфолипазой А и которой в год очищается 266000 т соевого масла, было показано, что там в год могут экономиться 120000 ГДж энергии и 12000 т СО₂ эквивалентов. Сэкономленные СО₂-эквиваленты соответствуют эмиссиям 1600 средних жителей Земли.

Раскрытие изобретения

По причине дальнейшего роста потребления пищевого масла в мире и все увеличивающегося использования растительных масел в качестве сырья для химической промышленности и в качестве топлива постоянно существует дополнительная потребность, и дальше улучшать удаление слизи из растительных масел и, в частности, ферментативное удаление слизи из растительных масел. Изобретатели настоящей заявки поставили, поэтому, перед собой задачу, разработать составы для ферментативного удаления слизи, с помощью которых содержание фосфора в масле, из которого должна удаляться слизь, уменьшается еще больше и/или скорости повышаются реакций ферментативного удаления слизи. Одновременно эти составы должны, к тому же, и делать возможным экономичное проведение метода в промышленном масштабе.

Задача решена за счет состава, который (включает в себя) первый ферментный компонент, включает, по меньшей мере, один расщепляющий фосфолипид фермент, а также второй ферментный компонент, включающий в себя, по меньшей мере, один не расщепляющий фосфолипид фермент. Преимущественно не расщепляющий фосфолипид фермент является расщепляющим сахар ферментом, который известен также как фермент, расщепляющий гликозид, или гликозидаза. Под термин «фермент, расщепляющий гликозид», подпадают также все другие ферменты из других классов ферментов, которые обладают расщепляющей гликозид побочной активностью.

Под термином «первый ферментный компонент» понимается при этом в смысле настоящего изобретения любой состав, который содержит, по меньшей мере, один расщепляющий фосфолипид фермент или состоит из него.

Что касается «расщепляющего фосфолипид фермента», речь может идти о фосфолипазе, которая может отщеплять от фосфолипида или остаток жирной кислоты или остаток фосфатидила или головную группу. Кроме этого, речь может идти также о так называемой ацилтрансферазе, с которой связано отщепление остатка жирной кислоты с переносом этого остатка, с последующим образованием эфирной связи со свободным стеролом в масляной фазе.

В одной из предпочтительных форм осуществления настоящее изобретение относится, поэтому, к составу, в котором первый ферментный компонент выбирается из группы, состоящей из фосфолипазы А1, фосфолипазы А2, фосфолипазы С, фосфолипазы В, фосфолипазы D и ацилтрансферазы. Типичными имеющимися на рынке ферментами из этой группы являются Lecitase®Ultra фирмы Novozymes®, фосфолипаза Al, Lecitinase® фирмы Novozymes, фосфолипаза А2, Rohalase® MPL, фосфолипаза А2 компании АВ Enzymes, Дармштадт (D), Pmifine®, фосфолипаза С фирмы Elementis, Сан Диего, США, Lysomax®, ацилтрансфераза фирмы Danisco. При этом в первом ферментном компоненте может использоваться также комбинация из двух или большего числа вышеупомянутых расщепляющих фосфолипид ферментов. Ферменты могут при этом происходить от любого организма (например, также быть изолированными из термофильного организма) или синтетического источника. В рамках настоящего изобретения возможно также, что в первом ферментном компоненте используются ферменты одинакового вида, которые, однако, происходят из различных источников или видов. Также включены рекомбинантно изготовленные, химерные объединенные белки из двух или нескольких различных видов с ферментативной активностью.

Под термином «второй ферментный компонент» понимается при этом в смысле настоящего изобретения любой состав, который содержит или состоит, по меньшей мере, из одного фермента, который не действует на фосфолипиды, т.е. не изменяет их химической структуры.

В одной из предпочтительных форм осуществления настоящее изобретение относится, поэтому, к составу, в котором второй ферментный компонент выбирается из группы гидролаз, которые расщепляют гликозидные связи, включающей, например, амилазу, амилоглюкозидазу, ламинараназу, глюкоамилазу, глюклозидазу, галактозидазу, глюканазу, маннаназу, пектиназу, целлюлазу, ксиланазу, пуллуланазу, арабиназу, декстраназу. При этом во втором ферментном компоненте может использоваться также комбинация из двух или большего числа вышеупомянутых расщепляющих гликозид ферментов. Ферменты могут при этом происходить от любого организма (например, также быть изолированными из термофильного организма) или синтетического источника. В рамках настоящего изобретения возможно также, что во втором компоненте используются ферменты одинакового вида, которые, однако, происходят из различных источников или видов. Также включены рекомбинантно изготовленные, химерные объединенные белки из двух или нескольких различных видов с ферментативной активностью.

В одной из предпочтительных форм осуществления настоящего изобретения состав используется в способе для удаления слизи из растительных масел или для уменьшения эмульгируемости растительных масел в водных фазах.

Под термином «предварительное удаление слизи» или «сырое удаление слизи» понимается обработка неочищенного масла водой или водным раствором кислоты, чтобы в значительной степени удалить из масла фосфолипиды. Также в рамках предварительного или сырого удаления слизи после добавления кислоты, при необходимости, может происходить добавление щелочи, чтобы нейтрализовать кислоту. Пред добавлением фермента происходит отделение водной фазы, после предварительного удаления слизи понижается содержание фосфора в неочищенном масле с 500-1500 млн^-1, например, для сои и рапса до меньше 200 млн^-1 в предварительно очищенном масле. Посредством предварительного удаления слизи может, например, добываться лецитин из образовавшейся слизистой фазы или слизистая фаза может перерабатываться в качестве кормового средства. Недостатком отделения водной фазы или снижения содержания фосфора является, однако, потеря выхода в отношении масла. Переходящие в водную фазу фосфатиды действуют эмульгирующе и приводят к тому, что часть масла эмульгируется в водной фазе и отделяется вместе с нею. В дальнейшем масло может продолжать обрабатываться ферментативно (причем ферменты должны отделяться в одном из дальнейших этапов).

Под термином «предварительное кондиционирование» масла понимается в следующей заявке добавление воды или водного раствора кислоты к необработанному неочищенному маслу. Затем путем добавления щелочи, например, раствора едкого натра, устанавливается показатель рН, при котором происходит следующая ферментативная реакция. В идеальном случае, устанавливается оптимальный для ферментативной реакции показатель рН. Таковым для расщепляющего фосфолипид фермента является показатель рН 4-5. Затем происходит, однако, не отделение водной фазы, а непосредственно добавление фермента. Содержащиеся слизистые вещества остаются, следовательно, пока в масле или в эмульсии. Отделение водной фазы и, следовательно, фермента происходит лишь после воздействия фермента на (в зависимости от обстоятельств) предварительно кондиционированное неочищенное масло.

В одной из предпочтительных форм осуществления добавление к неочищенному маслу воды или водного раствора кислоты и, при необходимости, щелочи для нейтрализации кислоты может происходить в смысле предварительного кондиционирования, однако, не происходит отделения водной фазы перед добавлением фермента (в смысле сырого предварительного удаления слизи). Благодаря исключению этапа отделения перед добавлением фермента возможно повышение выхода масла. Повышение выхода масла на одну процентную единицу имеет огромное экономическое значение, так как этот процент соответствует примерно 400000 т масла, в расчете на годовое производство соевого масла. Соответствующий изобретению способ допускает, таким образом, непосредственное применение неочищенных масел из сои или рапса с содержаниями фосфора 500-1500 млн^-1 фосфора. Кроме того, это представляет собой упрощение способа, потому что отпадает этап отделения перед добавлением фермента.

При добавлении воды следует принимать во внимание следующее: чтобы удалить фосфатиды из масла, необходим примерно 1 объем. % воды, в расчете на объем масла, чтобы удалить примерно 400 млн^-1 фосфора. Учитывая это, достаточно добавления примерно 5 объем. % воды, в расчете на объем масла, чтобы полностью освободить от фосфора и масло с высоким содержанием фосфора. Правда, такой порядок действий приводит к тому, что способ становится неэкономичным, так как постоянно должны использоваться увеличенные объемы, в которых проходят реакции. Кроме того, увеличенный добавленный объем воды обусловливает повышенные затраты на разделение и меньший выход масла; меньше добавленной воды означает, тем самым, и повышенный выход масла. Вообще, к маслу должно добавляться, поэтому, не больше, чем 4 объем. % воды, преимущественно не более, чем 3 объем. % вод, соответственно в расчете на объем масла.

В еще одной предпочтительной форме осуществления в этапе рафинации не добавляется - за исключением уже имеющихся масле эмульгаторов, как например лецитина - никаких других дополнительных эмульгаторов, как например натрия доцецилсульфата (SDS). Также соответствующий изобретению способ предпочтительно обходится без добавления солей, как например хлорида кальция (СаCl₂).

В одной из предпочтительных форм осуществления ферментативная активность фермента/ферментов первого ферментного компонента выбирается в диапазоне от 0,01 до 6 единиц/г масла, предпочтительней в диапазоне от 0,1 до 3 единиц/г масла, особенно предпочтительно в диапазоне от 0,2 до 2,5 единиц/г масла и наиболее предпочтительно в диапазоне от 0,3 до 1 единицы/г масла. В еще одной предпочтительной форме осуществления ферментативная активность второго ферментного компонента выбирается в диапазоне от 0,01 до 6 единиц/г масла, предпочтительно 0,1-3 единиц/г масла и особенно предпочтительно в диапазоне от 0,2 до 2,5 единиц/г масла, а наиболее предпочтительно в диапазоне от 0,3 до 1 единицы/г масла, (единица: Международная единица для ферментативной активности; 1 единица соответствует скорости превращения субстрата 1 мкмоль/мин.

Особенно предпочтительны в рамках настоящего изобретения составы, в которых отношение ферментативной активности первого ферментного компонента к ферментативной активности второго ферментного компонента находится в диапазоне от 0,01:6 единиц/г масла до 6:0,01 единиц/г масла, предпочтительно в диапазоне от 0,1:3 единиц/г масла до 3:0,1 единиц/г масла. При этом предпочтительно также, когда доля первого ферментного компонента и доля второго ферментного компонента являются одинаковыми, например, обе доли выбираются в диапазоне от 0,1 до 0,5 единиц/г масла, предпочтительно в диапазоне 0,2-0,3 единицы/г масла.

За счет соблюдения соответствующего изобретению отношения расщепляющего фосфолипид фермента к расщепляющему гликозид ферменту может уменьшаться объем слизистой фазы. Это означает повышение выхода масла.

Ферменты первого и/или второго ферментного компонента могут при этом, применяться, например, сублимированными и растворенными в соответствующем ферментном буфере (стандартные буферы для каждого фермента описаны в литературе), например, цитратный буфер, 0,1 М, рН 5 или ацетатный буфер, 0,1 М, рН 5. В одной из предпочтительных форм осуществления ферменты включаются в ферментный буфер и добавляются к неочищенному маслу. Чтобы достичь лучшей растворимости фермента - в частности, в содержащих фосфолипиды смесях - возможно также добавление органических растворителей. Таковые находят применение, например, при разделении фосфолипидов и описаны в литературе. Предпочтительно применяются неполярные органические растворители, как например гексан или ацетон или смеси, предпочтительно в количестве от 1 до 30 вес. % (примеры возможных растворителей описаны в ЕР 1531182 А2).

В еще одной предпочтительной форме осуществления первый и/или второй ферментный компонент используется на носителе. Поскольку, в частности, расщепляющие фосфолипид ферменты, являются специальными ферментами, цена на которые, в сравнении с массивными ферментами, как например разлагающими углевод ферментами (амилазы, глюкозидазы) относительно высока, в рамках настоящего изобретения предпочтительно, когда, по меньшей мере, один расщепляющий/ие фосфолипид фермент/ы состава используется/ются на носителе. В рамках настоящего изобретения предпочтительными материалами для носителя являются неорганические материалы для носителей, как например силикагель, осаждающие кремниевые кислоты, силикаты или алюмосиликаты, и органические материалы для носителя, как например метакрилат или ионообменная смола. Материалы для носителя облегчают повторное использование (относительно дорогих) ферментов из водно-масляной эмульсии в одном из следующих этапов способа и способствуют экономичности способа.

В еще одной также предпочтительной форме осуществления первый и/или второй ферментный компонент включает в себя одну или несколько других составных частей, особенно предпочтительно выбранных из группы, состоящей из цитратного буфера и ацетатного буфера.

В особенно предпочтительных формах осуществления соответствующего изобретению состава, которые никоим образом не ограничивают рамки настоящего изобретения, первый ферментный компонент включает в себя, по меньшей мере, один фермент, выбранный из группы, состоящей из фосфолипазы А1, фосфолипазы А2 и фосфолипазы С, и второй ферментный компонент, включает в себя предпочтительно, по меньшей мере, один фермент, выбранный из группы, состоящей, из α-амилазы и маннаназы, причем особенно предпочтительно речь идет о сублимированном ферменте, который находится в буфере, выбранном из группы, состоящей из цитратного буфера или ацетатного буфера. Наиболее предпочтительно, к тому же, когда, по меньшей мере, фермент первого ферментного компонента находится в адсорбционно или ковалентно связанном состоянии на носителе, который предпочтительно выбирается из группы, состоящей из неорганических материалов для носителя, как например силикагеля, осаждающих кремниевых кислот, силикатов или алюмосиликатов, и органических материалов для носителя, как например метакрилатов или ионообменных смол. Также является предпочтительным при этой особенно предпочтительной форме осуществления, когда отношение ферментативной активности первого ферментного компонента к ферментной активности второго ферментного компонента находится в диапазоне от 0,01:6 единиц/г масла до 6:0,01 единиц/г масла, предпочтительно в диапазоне от 0,1:3 единиц г/ масла до 3:0,1 единиц/г масла. При этом предпочтительно также, когда доля первого ферментного компонента равна доле второго ферментного компонента, например, обе доли выбираются в диапазоне от 0,1 до 0,5 единиц/г масла, предпочтительно в диапазоне 0,2-0,3 единиц/г масла.

Изобретатели настоящего состава неожиданно установили, что комбинация ферментных компонентов (первый и второй ферментные компоненты), которым было дано определение выше, уменьшает эмульгируемость растительных масел в водных фазах особенно сильно и эффективно. При этом соответствующий изобретению состав с особенно большими преимуществами может использоваться для удаления слизи их неочищенного растительного масла или же для обработки слизи растительных масел. Слизистая фаза может при этом получаться, например, обычным способом для удаления слизи (каковой также описан в рамках заявки) или соответствующим изобретению способом, если он используется для удаления слизи из неочищенного масла.

Настоящее изобретение относится, поэтому, в еще одном аспекте к применению состава, как выше определено более подробно, для уменьшения эмульгируемости растительного масла в водных фазах.

К тому же, настоящее изобретение относится также к способу для уменьшения эмульгируемости растительного масла в водных фазах, включающему этапы

a) приведение в контакт неочищенного растительного масла с составом как изложено выше;

b) отделение слизистых веществ от растительного масла.

К удивлению, при этом было установлено, что за счет комбинации расщепляющего фосфолипид фермента(ов) первого ферментного компонента с расщепляющим гликозид ферментом(ами) второго ферментного компонента по сравнению с использованием только лишь расщепляющего фосфолипид фермента удалось еще более снизить содержание фосфолипида растительного масла, увеличить выход масла, повысить скорость реакции при ферментативном удалении слизи, уменьшить объем слизи и/или улучшить отделяемость образовавшейся слизистой фазы.

Способ настоящего изобретения приносит при этом особые преимущества, так как за счет использования еще одного ферментного компонента (второй ферментный компонент), который включает в себя, по меньшей мере, один расщепляющий гликозид фермент, может происходить расщепление других компонентов, которые присутствуют в слизистой фазе и, тем самым, улучшается действие расщепляющего фосфолипид фермента. За счет использования второго ферментного компонента может, например, достигаться снижение вязкости слизистой фазы масла, повышение подвижности фосфолипидов вследствие расщепления мешающих компонентов или лучшая доступность липидов. Также, вероятно, повышается доступность для расщепляющего фосфолипид фермента таких молекул фосфолипида, которые находятся на поверхности раздела слизистая фаза/масло.

Например, путем использования гликозид аз могут расщепляться гликолипиды. Класс гликолипидов включает в себя многообразие соединений. Согласно литературным данным, однако, в слизистой фазе или в растительных фосфолипид ах содержатся прежде всего стерилгликозиды, цереброзиды и галактозиллипиды ((Selmair, P.L., Koehler, P. (in Molecular Structure and Baking Performance of Individual Glycolipid Classes from Lecithins - в «Молекулярная структура и пекарские свойства конкретных классов гликолипида из группы лецитинов»), J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 5597-5609)). Так, оказалось, например, что обезжиренный лецитин сои содержит до 10% гликолипида. Это описано также и в другом литературном источнике, а именно в Bueschelberger, H.G., (Lecithins, Emulsifiers in Food Technology - Лецитины, эмульсификаторы в пищевой технологии), Whitehurst, R.J., Ed.; Blackwell Publishing: Oxford, U.K., 2004; pp 1-10, как и в Clayton, T.A., (Identification of wheat flour lipids by thin-layer chromatography - Идентификация липидов пшеничной муки методом тонкослойной хроматографии), J. Chromatogr. 1970, 47, 277-281. В другом месте в Pardun, Н., (Eigenschaften der Pflanzenlecithine, in Pflanzenecithine - «Свойства растительных лецитинов», в «Растительные лецитины»); Pardun, Н., Ed.; Verlag fur chemische Industrie H. Ziolkowsky KG: Augsburg, Germany, 1988; pp 195-202, приводится диапазон от 6,5 до 11%. Предполагается, что расщепление этих молекул на полярный остаток и водорастворимую головную группу, которая, при определенных условиях, может снова отделяться в масло, способствует тому, что фосфолипиды присутствуют в концентрированной форме в мицеллах слизистой фазы и, поэтому, могут быстрее преобразовываться фосфолипазами. То же самое рассмотрение применимо к фосфолипидам на поверхности раздела масло/слизь.

Уменьшенная способность липидов слизистой фазы к эмульгированию после обработки расщепляющими гликозид ферментами приводит, кроме того, к тому, что выход масла может повышаться в еще большей степени. Действие расщепляющего на составную часть полисахарида и клеточной стенки фермента может быть объяснено тем, что фосфолипиды становятся более доступными для фосфолипаз и что, при определенных условиях, повышается также скорость реакции. Наличие углеводов подтверждается анализами лецитина сои, как например, опубликовано Scholfield, C.R., Composition of Soybean Lecithin (Состав лецитина соевых бобов), JAOCS, vol. 58, no 10 (October 1981), pp 889-892, что неочищенный лецитин содержит также углеводы.

Так, например, пектины клеточной стенки и полисахариды проявляют частичное, а другие составные части клеточной стенки сильное сгущающее действие. Вызванное этим повышение вязкости может при определенных условиях уменьшить скорость реакции фосфолипаз. Расщеплением этих составных частей клеточной стенки и/или полисахаридов на хорошо растворимые в воде, не повышающие вязкость фрагменты может быть объяснено влияние добавленных ферментов на эффективность фосфолипаз.

Путем соответствующего изобретению комбинирования расщепляющих фосфолипид ферментов с расщепляющими гликозид ферментами можно уменьшить дозировку расщепляющих фосфолипид ферментов, как например фосфолипазы А1 или А2, при определенных условиях, в комбинации с фосфолипазой С, и, таким образом, наряду с выше указанными преимуществами для процесса сэкономить и затраты. Расщепляющие гликозид ферменты, которые могут комбинироваться с расщепляющими фосфолипид ферментами, являются, как правило, являются более выгодными с точки зрения затрат ферментами, чем, например, фосфолипазы, и имеются в больших количествах. В комбинации с обеспечивающим преимущества ведением реакции, т.е. условиями процесса, которые могут настраиваться соответственно применяемому ферменту, соответствующий изобретению способ может в отношении длительности, а также потребления энергии и сырья улучшаться в еще большей степени.

Согласно изобретению предпочтительно применяются: фосфолипаза А1, которая происходит из Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, видов Pseudomonas, поджелудочной железы свиней или поджелудочной железы крупного рогатого скота; и/или независимо фосфолипаза А2, которая происходит из поджелудочной железы свиней, поджелудочной железы крупного рогатого скота, Streptomyces violaceoruber, Naja mossambica, Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes или видов Pseudomonas; и/или независимо фосфолипаза С, которая происходит из Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus или видов Pseudomonas; и/или независимо фосфолипаза В, которая происходит из Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, видов Pseudomonas, поджелудочной железы свиней или поджелудочной железы крупного рогатого скота.

Особенно предпочтительны фосфолипаза А1 из Thermomyces lanuginosus или Fusarium oxysporium, и/или независимо фосфолипаза А2 из поджелуточной железы свиней, поджелудочной железы крупного рогатого скота, Streptomyces violaceoruber или Naja mossambica, и/или независимо фосфолипаза С из Bacillus cereus, Clostridium perfringens или Listeria monocytogenes.

Что касается расщепляющих гликозид ферментов, предпочтительны такие, которые расщепляют α (1-4) гликозидные, α (1-2) гликозидные, α (1-6) гликозидные, β (1-3) гликозидные, β (1-4) гликозидные и/или β (1-6) гликозидные соединения. Кроме того, предпочтительны амилазы, в частности, α-амилазы, β-амилазы, γ-амилазы и изоамилазы, а также маннаназы.

Что касается амилаз и маннаназ, таковые предпочтительны из видов Bacillus или Pseudomonas или грибных видов или из поджелудочной железы, в частности таковые из Bacillus sp., Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas aeroginosus, Pseudomonas fluorescens, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger или Trichoderma reesei. В случае маннаназы особенно предпочтительна таковая из Trichoderma reesei.

Для удаления слизи из соевого масла особенно предпочтительна комбинация из фосфолипазы А1 из Thermomyces lanuginosus или Fusarium oxysporium и/или фосфолипаза А2 из поджелудочной железы свиней или поджелудочной железы крупного рогатого скота с α-амилазой из видов Bacillus и/или маннаназа из видов Trichoderma. Для удаления слизей из рапсового масла особенно предпочтительна комбинация из фосфолипазы А1 из Thermomyces lanuginosus или Fusarium oxysporium и/или фосфолипазы А2 из поджелудочной железы свиней или поджелудочной железы крупного рогатого скота с α-амилазой из видов Bacillus или видов Aspergillus.

Под термином «неочищенное растительное масло» понимается здесь любое масло растительного происхождения. Предпочтительными неочищенными маслами в рамках настоящего изобретения являются неочищенное соевое масло, неочищенное рапсовое масло, неочищенное подсолнечное масло, неочищенное оливковое масло, неочищенное пальмовое масло, неочищенное масло ятрофы, неочищенное водорослевое масло, неочищенное льняное масло, неочищенное масло рыжика, неочищенное масло из семян хлопчатника, особенно, неочищенное соевое масло, неочищенное рапсовое масло, неочищенное масло ятрофы, неочищенное масло рыжика и неочищенное масло подсолнечника. Обозначение «неочищенное» относится при этом к тому, что масло еще не подверглось никакому из этапов удаления слизи, нейтрализации, осветлению и/или дезодорации. В рамках настоящего изобретения возможно также, что используется смесь нескольких неочищенных масел или предварительно обработанные, например, предварительно кондиционированные или подвергнутые предварительной обработке по удалению слизей масла обрабатываются ферментами.

«Приведение в контакт» в рамках соответствующего изобретению способа может происходить любым способом, который известен специалисту как пригодный для соответствующей изобретению цели. Предпочтительным видом приведения в контакт является при этом смешивание неочищенного масла и соответствующего изобретению состава.

После приведения в контакт неочищенного масла с соответствующим изобретению составом смесь из неочищенного масла и состава предпочтительно перемешивается, особенно предпочтительно лопастной мешалкой при 200-800 оборотах/мин, предпочтительно 250-600 оборотах/мин и наиболее предпочтительно при 300-500 оборотах/мин.

Температура смеси находится во время приведения в контакт предпочтительно в диапазоне от 15 до 99°С, более предпочтительно в диапазоне от 20 до 95°С, еще более предпочтительно от 22 до 80°С, также предпочтительно от 25 до 65°С, более предпочтительно от 27 до 55°С и наиболее предпочтительно от 30 до 45°С. При этом температура смеси должна всегда выбираться так, чтобы не превышалась температура денатурирования фермента, предпочтительно температура смеси минимум на 5°С ниже температуры денатурирования фермента или самой низкой температуры денатурирования фермента. Причем при использовании ферментов, которые изолируют из термофильных организмов, в принципе следует предпочитать более высокие температуры. Если в рамках настоящего изобретения используется один или несколько термоустойчивых ферментов, то температура процесса предпочтительно находится в диапазоне от 80 до 120°С, более предпочтительно в диапазоне от 85 до 100°С. Применение термоустойчивых ферментов имеет преимущество в том, что за счет этого может выбираться более высокая температура процесса, вследствие чего вязкость растительного масла уменьшается, и способ в целом может укорачивается - также по причине увеличенной скорости реакции фермента. Кроме того, в случае предварительной обработки, которая с получением преимуществ проводится также при увеличенных температурах, становится излишним последующее охлаждение ниже более низкой температуры денатурирования использованного фермента. В целом, применение термоустойчивых ферментов приводит, следовательно, к укорачиванию способа и снижению затрат.

Продолжительность приведения в контакт находится при этом преимущественно в диапазоне от 1 минуты до 12 часов, преимущественно от 5 минут до 10 часов, также предпочтительно от 10 минут до 6 часов, более предпочтительно от 20 минут до 3 часов.

рН смеси находится во время приведения в контакт предпочтительно в диапазоне от рН 3 до рН 7,5, предпочтительнее в диапазоне от рН 4 до рН 6 и особенно предпочтительно в диапазоне от рН 4,0 до рН 5,2.

Приведение в контакт неочищенного растительного масла с первым и вторым ферментным компонентом соответствующего изобретению состава может при этом происходить одновременно или поочередно. Если приведение в контакт происходит поочередно, в рамках настоящего изобретения предпочтительно, когда неочищенное растительное масло сначала приводится в контакт со вторым ферментным компонентом. В случае, когда неочищенное растительное масло сначала приводится в контакт с одним ферментным компонентом, а затем с другим ферментным компонентом, особенно предпочтительно, когда после добавления одного компонента смесь перемешивается в течение 30-300 минут, предпочтительно 60-240 минут, также предпочтительно от 70 до 120 минут, прежде чем произойдет добавление другого компонента.

«Отделение» слизистых веществ согласно этапу b) соответствующего изобретению способа может происходить любым способом, который известен специалисту как пригодный для соответствующей изобретению цели. Предпочтительно отделение происходит, однако, путем центрифугирования или фильтрации, причем предпочтительным является центрифугирование. При центрифугировании происходит фазовое разделение смеси, так что обработанное растительное масло, слизистые вещества и ферментный состав находятся в отдельных фазах, которые могут легко отделяться одна от другой.

В одном из предпочтительных форм осуществления отделяется при этом фаза, содержащая слизистые вещества, а также фаза, содержащая соответствующий изобретению состав, от обработанного масла. Особенно предпочтительно при этом, когда одновременно со слизистыми веществами отделяется первый и/или второй ферментный компонент.

Ферменты могут после отделения регенерироваться или очищаться и, например, использоваться в новом процессе очистки. И в этом случае также выгодно, снова работать с соответствующим изобретению составом, или используя другие расщепляющие гликозид ферменты непосредственно в комбинации с находящимися на носителе фосфолипазами или липидацилтрансферазами, или используя соответствующий изобретению состав, чтобы удалить слизь растительного масла, которая, например, прилипает к находящимся на носителе фосфолипазам, чтобы находящиеся на носителе ферменты можно было лучше использовать снова в новом процессе.

Еще одна предпочтительная форма осуществления настоящего изобретения относится, кроме того, к способу как описанный выше, дополнительно включающему в себя этап

с) повторное приведение в контакт растительного масла согласно этапу b) с первым и/или вторым ферментным компонентом.

«Приведение в контакт» происходит при этом предпочтительно при таких же условиях, как описанные выше для этапа а) соответствующего изобретению способа. При этом в еще одной особенно предпочтительной форме осуществления первый и/или второй ферментный компонент перед повторным приведением в контакт подвергается регенерации или очистке.

В одной из особенно предпочтительных форм осуществления неочищенное растительное масло перед приведением в контакт согласно этапу а) соответствующего изобретению способа вводится в контакт с водой и/или кислотой. Предпочтительными кислотами являются при этом комплексирующие кальций и магний кислоты поотдельности или в комбинации, как например лимонная кислота и фосфорная кислота. Здесь говорят о так называемом «предварительном кондиционировании».

В одной из предпочтительных форм осуществления соответствующего изобретению способа приведение в контакт с водой происходит при температуре от 30°С до 90°С в течение 15-60 минут, предпочтительно 30-60 минут, причем предпочтительна температура 35-85°С и особенно предпочтительна температура 40-80°С. Приведение в контакт с кислотой, в частности, лимонной кислотой или фосфорной кислотой происходит при температуре от 30°С до 90°С в течение 5-60 минут, предпочтительно 15-60 минут, причем предпочтительна температура 35-85°С и особенно предпочтительна температура 40-80°С. В одной из предпочтительных форм осуществления после обработки кислотой происходит этап нейтрализации соответствующей щелочью, чтобы довести показатель рН до 3,5-8,0, предпочтительно 4-7. Согласно способу настоящего изобретения предпочтительно, когда соответствующий изобретению состав добавляется непосредственно к растительному маслу, без предварительного проведения этапа отделения.

Перед добавлением фосфолипазы (аз) и/или других ферментов следует, однако, стремиться к тому, чтобы температура реакции не превышала оптимального для фермента температурного диапазона, чтобы предотвратить денатурирование белка. Пригодны температуры 35-65°С, лучше 45-55°С, причем благодаря использованию ферментов из термофильных организмов, следовательно, особенно температуроустойчивых ферментов, возможно использование при 80-100°С, так что между приведением в контакт неочищенного растительного масла с водой и/или кислотой и приведением в контакт с соответствующим изобретению составом не должно происходить понижения температуры. Повышение устойчивости к температуре может также достигаться посредством иммобилизации фермента ферментного компонента. Поскольку многие ферменты проявляют определенную толерантность к органическим растворителям ((Faber, К., (Biotransformations in Organic Chemistry - Биотрансформации в органической химии) (2001), Springer-Verlag, Heidelberg)), в рамках настоящего изобретения ферментами могут обрабатываться и предварительно обработанные в соответствии с этим масла или слизи.

В особенно предпочтительных формах осуществления, которые никоим образом не ограничивают рамки настоящего изобретения, способ настоящего изобретения включает в себя этапы

Предпочтительная форма А) осуществления

a) приведение в контакт неочищенного растительного масла, выбранного из соевого масла и/или рапсового масла, с составом, включающим в себя первый ферментный компонент, по меньшей мере, с одним ферментом, выбранным из группы, состоящей из фосфолипазы А1, фосфолипазы А2 и фосфолипазы С, и второй ферментный компонент, по меньшей мере, с одним ферментом, выбранным из группы, состоящей из α-амилазы и маннаназы;

b) отделение слизистых веществ от растительного масла путем центрифугирования. В одной из других предпочтительных форм осуществления соответствующего

изобретению способа перед этапом а) способа проводится так называемое предварительное кондиционирование таким образом, что неочищенное масло в одном из специальных этапов смешивается с органической кислотой, предпочтительно лимонной кислотой в количестве 1,5-3 мл/л масла. Температура смеси при этом предпочтительно устанавливается на 35-60°С, особенно предпочтительно 48°С. После протекания реакции на протяжении от 30 минут до 2 часов, предпочтительно 1 часа, смесь путем добавления стехиометрического количества раствора щелочи, предпочтительно раствора едкого натра, в количестве предпочтительно 0,5-2 моль/л, особенно предпочтительно 1 моль/л, устанавливается на рН 5. Лишь после этого процесс проводится согласно этапу а) соответствующего изобретению способа.

Предпочтительная форма В) осуществления

а) приведение в контакт неочищенного растительного масла, выбранного из соевого масла и/или рапсового масла, с составом, включающим в себя первый ферментный компонент, по меньшей мере, с одним ферментом, выбранным из группы, состоящей из фосфолипазы А1, фосфолипазы А2 и фосфолипазы С, и второй ферментный компонент, по меньшей мере, с одним ферментом, выбранным из группы, состоящей из α-амилазы и маннаназы, причем особенно предпочтительно, когда, по меньшей мере, один фермент первого ферментного компонента находится в иммобилизованном состоянии на носителе;

При этом особенно предпочтительно, что ферменты первого и/или второго ферментного компонента используются в водной фазе (буфер предпочтительно в диапазоне рН 4,0-5,5, особенно предпочтительно рН 4,0-5,0) в концентрации от 0,05 до 5 вес/объем. %.

Приведение в контакт происходит при этом предпочтительно при температуре 20-70°С, предпочтительно 40-65°С.

b) отделение слизистых веществ от растительного масла путем центрифугирования.

Эта особенно предпочтительная форма осуществления согласно В) комбинируется в также особенно предпочтительной форме осуществления с последующим удалением слизи путем добавления органической кислоты и/или раствора щелочи (после этапа b). Температура смеси при этом устанавливается предпочтительно на 35-60°С, особенно предпочтительно 48°С. После протекания реакции в течение от 30 минут до 2 часов, предпочтительно 1 часа, смесь путем добавления раствора щелочи, предпочтительно раствора едкого натра, в концентрации предпочтительно 0,5-2 моль/л, особенно предпочтительно 1 моль/л, устанавливается на рН 5.

Предпочтительная форма С) осуществления

Согласно предпочтительной форме С) осуществления вместо неочищенного растительного масла с соответствующим изобретению составом «в контакт приводится» отделенная обычным способом для удаления слизи или соответствующим изобретению способом слизистая фаза. Способ реализуется предпочтительно согласно форме А), В) или D) осуществления. Этот способ делает возможным, например, возвращение в оборот отделенного от слизи масла, которое было отделено со слизистой фазой, делает возможным, следовательно, возвращение в оборот масла и приводит тем самым к непрямому повышению выхода масла.

Предпочтительная форма D) осуществления

а) приведение в контакт неочищенного растительного масла, выбранного из соевого масла и/или рапсового масла, с составом, включающим в себя первый ферментный компонент, по меньшей мере, с одним ферментом, выбранным из группы, состоящей из фосфолипазы А1, фосфолипазы А2 и фосфолипазы С, и второй ферментный компонент, по меньшей мере, с одним ферментом, выбранным из группы, состоящей из α-амилазы и маннаназы, причем особенно предпочтительно, когда, по меньшей мере, один фермент первого ферментного компонента находится в иммобилизованном состоянии на носителе;

Приведение в контакт при этом происходит предпочтительно при температуре 70-100°С, более предпочтительно 75-85°С и с применением исключительно устойчивых к термостойких ферментов или ферментов, температура денатурирования которых, находится, по меньшей мере, на 1°С, предпочтительно на 5°С выше температуры процесса.

В одной из других предпочтительных форм осуществления соответствующего изобретению способа перед этапом а) способа проводится предварительное кондиционирование, путем смешивания неочищенного масла в специальном этапе способа с органической кислотой в количестве 1,5-5 мл/л масла, предпочтительно 1,5-2 мл лимонной кислоты на 1 л масла. Температура смеси при этом предпочтительно устанавливается на 35-60°С, особенно предпочтительно 48°С. После протекания реакции в течение от 30 минут до 2 часов, предпочтительно 1 часа, смесь кондиционируется путем добавления раствора щелочи, предпочтительно раствора едкого натра, в количестве предпочтительно 0,5-2 моль/л, особенно предпочтительно 1 моль/л. Лишь после этого процесс проводится дальше согласно этапу а) соответствующего изобретению способа.

b) отделение слизистых веществ от растительного масла путем центрифугирования.

К тому же, могут продолжать восстанавливаться возможно имеющиеся, отделившиеся еще в растительном масле, и не расщепившиеся фосфолипазами фосфатидные кислоты, вследствие чего уменьшается содержание Са и/или Mg в обработанном согласно способу настоящего изобретения масле. Таким образом, приведенные выше, предпочтительные формы осуществления соответствующего изобретению способа в особенно предпочтительных формах осуществления дополняются еще последующим этапом, при котором путем повторного добавления комплексирующих средств, как например лимонной кислоты или фосфорной кислоты, еще более уменьшается содержание двухвалентных ионов и параллельно с этим содержание Р в масле.

Соответствующим изобретению способом можно значительно уменьшить показатель содержания фосфора в неочищенном растительном масле. При этом содержание фосфора снижается до уровня ниже 20 млн^-1, особенно предпочтительно до уровня ниже 10 млн^-1, совершенно предпочтительно до уровня ниже 4 млн^-1.

Кроме того, соответствующим изобретению способом содержание кальция и магния в неочищенном растительном масле можно снизить до уровня ниже 20 млн^-1, особенно предпочтительно до уровня ниже 15 млн^-1, совершенно предпочтительно до уровня ниже 10 млн^-1, также предпочтительно до уровня ниже 8 млн^-1 и более всего предпочтительно до уровня ниже 4 млн^-1. В совершенно особенно предпочтительной форме осуществления содержание кальция и магния понижается до уровня ниже 3 млн^-1.

Методы

Применялись следующие методы анализов:

Определение содержания фосфора в растительных маслах

Определение фосфора происходило с использованием ICP согласно DEV Е-22.

Определение содержания кальция и магния в растительных маслах Определение фосфора происходило с использованием ICP согласно DEV Е-22.

Определение содержания свободных жирных кислот (FFA)

Определяется содержание свободных жирных кислот по расходу хлорида натрия или хлорида калия через реакцию омыления. Получается процентное содержание свободных жирных кислот в исследованном масле. Определение происходило согласно DIN 53402 (метод DGF C-V 2).

Определение объема слизи

С помощью этого определения измеряется содержащаяся в масле слизистая фаза ферментативно не обработанной и ферментативно обработанной слизи. Стеклянная емкость на 10 мл для центрифуги нагревается до рабочей температуры реакционной смеси, пробы (2×2 мл) загружаются и с поддержанием постоянной температуры центрифугируются, по меньшей мере, в течение 4 минут при 3000 оборотах в минуту, чтобы отделить слизистую фазу от масла. Из верхних фаз масла отбираются пробы для проведения анализов. В целях документирования результат образования фаз дополнительно фотографируется.

Определение содержания масла в слизистой фазе

Определение содержания остатка масла в слизистой фазе происходит экстракцией Сокслета согласно DIN ISO 659.

Вариант 1:

Подлежащее обработке количество неочищенного масла, 400-500 г, загружается в Duran-реактор DN120 1000 мл и отбираются пробы для проведения анализов. Масло в Duran-реакторе с помощью греющей пластины нагревается до 35-60°С, в частности, 48°С, причем должна поддерживаться температура, при которой фермент не денатурируется. После того, как температура достигнута, начинают проводить предварительное кондиционирование. Для этого к маслу добавляется определенное, зависимое от количества масла количество разбавленной лимонной кислоты (например, 450 млн^-1, 1,372 мл). Затем смесь перемешивается с помощью Ultraturrax в течение 1 минуты. В качестве альтернативы в процессе перемешивания при примерно 600 оборотах в минуту в течение 1 часа проводится инкубирование, чтобы выждать реакцию кислоты. Затем добавляется определенное количество раствора едкого натра (1 моль/л, остаточное количество до 2 объем./объем. %, или 3 объем./объем. % за вычетом воды из добавки кислоты и добавки фермента) и инкубирование при перемешивании проводится еще 10 минут. В этом месте происходит добавление фермента, фермент-смеси или иммобилизата, преимущественно растворенного в буфере. Фермент перемешивается, для чего число оборотов при перемешивании может увеличиваться на небольшое время (1 минута до 900 оборотов в минуту), в последующем перемешивание проводится при меньшем числе оборотов.

Отбор пробы производится через определенные промежутки времени. Проба отбирается с помощью пипетки, загружается в доведенную до постоянной температуры стеклянную емкость для центрифуги (температура реакционной смеси) и при постоянной температуре центрифугируется, по меньшей мере, в течение 4 минут при 3000 оборотах в минуту, чтобы отделить слизистую фазу от масла. Для документационных целей результат образования фаз фотографируется, от надосадочной жидкости отбираются пробы для определения содержания фосфора, кальция и магния.

Вариант 2:

В еще одном осуществлении фосфолипазы и дополнительные ферменты дополняются в необходимой комбинации в качестве свободных ферментов или иммобилизованных ферментов вместе с водной фазой (фермент-буфер, рН 5) 0,05-5 вес/объем % к неочищенному маслу. Эмульсия, состоящая из воды, фермента, возможно присутствующих носителей ферментов и масла, перемешивается. В идеальном случае реакция проводится при постоянной температуре 20-70°С, лучше 40-65°С. Затем ожидается разделение фаз, твердые вещества оседают или могут удаляться известным специалисту стандартным способом, например, посредством центрифугирования или фильтрации. В качестве дополнительной обработки масло может разбавленной кислотой (например, лимонной кислотой) и раствором щелочи очищаться от остатков слизи известным специалисту как «удаление слизи» способом.

Вариант 3:

В одном из других осуществлений слизистая фаза обрабатывается ферментами. К слизистой фазе, которая получается известным специалисту как «удаление слизи» способом, добавляются наряду с фосфолипазами другие ферменты. Они могут растворяться в водной фазе или находиться в суспендированном виде в органическом растворителе. Смесь в идеальном случае доводится до постоянной температуры 20-70°С, лучше до температуры 35-60°С. Смесь перемешивается до тех, пока процесс не закончится. Это может контролироваться измерениями вязкости или визуально, по растворению обычно плотной слизистой фазы. Путем центрифугирования может достигаться разделение фаз, отдельные фазы могут отделяться. Как правило, верхняя фаза состоит из извлеченного масла, средняя фаза из фосфолипидов, а нижняя фаза является водной фазой и содержит ферменты. Путем повторного использования водной фазы ферменты могут возвращаться в производственный цикл и использоваться повторно. В зависимости от содержания двухвалентных ионов масло или содержащая фермент водная фаза путем добавления комплексирующих средств перед дальнейшим использованием должна очищаться от ионов.

Вариант 4:

В еще одном осуществлении неочищенное масло нагревается до высокой температуры, преимущественно 70-100°С, точнее 75-85°С. Неочищенное масло выше описанным способом кондиционируется кислотой и раствором щелочи, поддерживается температура и добавляются термоустойчивые ферменты. В дальнейшем действуют так, как уже описано. Фермент перемешивается, для чего число оборотов мешалки может повышаться на непродолжительное время (например, в течение 1 минуты до 900 оборотов), затем перемешивание продолжается при 600 оборотах в минуту, пока не закончится реакция. Отделение слизистой фазы может происходить, как описано выше.

Примеры и фигуры:

Далее изобретение объясняется подробнее на основе фигур и примеров. При этом подчеркивается, что примеры и фигуры носят лишь демонстрирующий характер и демонстрируют особенно предпочтительные формы осуществления настоящего изобретения. Ни примеры, ни фигуры не ограничивают рамки настоящего изобретения.

Показывают:

фиг. 1 - соевое масло: предварительное кондиционирование с долей всей воды 2%;

фиг. 2 - соевое масло: предварительное кондиционирование с добавлением фермента PLA1 0,3 единицы/г масла и доля всей воды 2%;

фиг. 3 - соевое масло: предварительное кондиционирование с добавлением фермента PLA1 0,3 единицы/г масла и фермента α-амилаза видов Bacillus spec 1 единица/г масла, доля всей воды 2%;

фиг. 4 - соевое масло: предварительное кондиционирование с добавлением фермента PLA1 0,3 единицы/г масла и фермента маннаназа 0,3 единицы/г масла, доля всей воды 2%;

фиг. 5 - рапсовое масло: предварительное кондиционирование с долей всей воды 3%;

фиг. 6 - рапсовое масло: предварительное кондиционирование с добавлением фермента PLA1 0,3 единицы/г масла и доля всей воды 3%;

фиг. 7 - рапсовое масло: предварительное кондиционирование с добавлением фермента PLA1 0,3 единицы/г масла, долей всей воды 3%;

фиг. 8 - рапсовое масло: предварительное кондиционирование с добавлением фермента PLA1 0.3 единицы/г масла и фермента α-амилаза Aspergillus 1 единица/г масла, доля всей воды 3%.

Пример 1:

Согласно варианту 1 реакции применялось соевое масло со следующими исходными содержаниями: фосфор 700 млн^-1, кальций 65,6 млн^-1, магний 62,6 млн^-1 и содержание свободных жирных кислот 1%. Рапсовое масло подвергалось предварительному кондиционированию с помощью водной лимонной кислоты (450 млн^-1) и водного раствора едкого натра (1 моль/л). Регулярно отбирались пробы (смотри таблицу 1). Для сравнения такое же предварительное кондиционирование проводилось с добавлением фермента, фосфолипазы А1 из организма Thermomyces lanuginosus (фирма Sigma-Aldrich), (смотри фигуру 2, таблицу 2). На фиг. 3, в таблице 3 показаны результаты предварительного кондиционирования с добавлением фермента PLA1 и другого фермента, α-амилазы из организма Bacillus spec. (Sigma-Aldrich). На фиг. 4, в таблице 4 опять тот же самый процесс с добавлением фермента PLA1 и другого фермента, маннаназы (фирма ASA - Spezialenzyme).

Как видно из фиг. 1, воздействие кислоты и щелочного раствора на неочищенное масло в форме предварительного кондиционирования приводит к не такому и малому объему слизистой фазы, который в дальнейшем, несмотря на использование мешалки при 600 оборотах в минуту, уменьшается незначительно. Отдельная фотография относится при этом к одному отбору пробы, отборы проб происходят в моменты времени 10, 60, 120, 180 и 240 минут (соответственно, слева направо). В таблице 1 приведены соответствующие аналитические данные, в процессе реакции содержание фосфора после 240 минут снизилось с 33 млн^-1 до 21 млн^-1, в ходе реакции концентрация двухвалентных ионов кальция и магния увеличивается в случае кальция с 7,8 млн^-1 до 9,8 млн^-1, концентрация магния уменьшается с 4,1 млн^-1 до 3,2 млн^-1. Содержание свободных жирных кислот остается почти без изменения. Предварительное кондиционирование служит в качестве подготовительной реакции к удалению слизи из масла и одновременно как эталонная обработка.

На фиг. 2 при применении фермента фосфолипаза А1 из Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich) видно уменьшение слизистой фазы в ходе реакции (фото на каждое измерение/отбор проб). Соответствующие данные и моменты времени отбора проб показаны в таблице 2. Из табл. 2 явствует уменьшение концентрации кальция с 9,6 млн-¹ до 7 млн^-1, уменьшение концентрации магния с 4,4 млн^-1 до 2,2 млн^-1 и уменьшение содержания фосфора с 23 млн^-1 до 10 млн^-1, содержание свободных жирных кислот повышается с 0,79% до 1,32%. Из повышения содержания свободных жирных кислот и снижения содержания фосфора можно сделать заключение, что PLA1 ферментативно активна и удаление слизи из масла происходит, следовательно, успешно. Возрастание уровня свободных жирных кислот является показателем для активности PLA1, которая отщепляет жирные кислоты от молекул фосфолипида, а также непрерывно уменьшает слизистую фазу. Чтобы раскрыть для масла более широкую гамму применений, преследуется цель, снизить содержание фосфора в еще большей степени.

На фиг. 3 показан объем слизистой фазы обработанного PLA1 и дополнительно альфа-амилазой Bacillus spec. (Sigma-Aldrich) предварительно кондиционированного неочищенного масла. Из относящихся к этому аналитических данных из таблицы 3 видно, что, к удивлению, уже через 60 минут достигается уменьшенная слизистая фаза 2,5%. Дополнительно повышается содержание свободных жирных кислот с 0,86% до 1,16% и указывает тем самым на активность фосфолипазы. Содержание фосфора понижено с 700 млн^-1 в неочищенном масле до 13 млн^-1 и, наконец, через 240 минут до 6,2 млн^-1. Концентрация кальция изменяется слабо, содержание магния уменьшается незначительно.

На фиг. 4 и в таблице 4 показаны экспериментальные данные при применении одной из других ферментных комбинаций. Снова применялась фосфолипаза А1 и маннаназа (ASA-Spezialenzyme). Из данных видно, что уже через 60 минут произошло очень сильное уменьшение слизистой фазы. Содержание свободных жирных кислот увеличивается с 0,75% до 1,24%, содержание фосфора уменьшается с 700 млн^-1 в неочищенном масле через 27 млн^-1 (проба через 10 минут) до 11 млн^-1 после обработки обоими ферментами в течение 240 минут. И концентрации двухвалентных ионов уменьшаются в течение всего хода реакции. Результаты подтверждают, что, к удивлению, вследствие дополнения другого расщепляющего гликозид фермента происходит более быстрое и более сильное уменьшение слизистой фазы.

Пример 2:

Согласно варианту 1 реакции применялось рапсовое масло со следующими исходными показателями содержания: фосфор 1150 млн^-1, кальций 370 млн^-1, магний 146 млн^-1 и содержанием свободных жирных кислот 1,95%. Неочищенное мало подвергалось предварительному кондиционированию с помощью водной лимонной кислоты (1000 млн^-1) и водного раствора едкого натра (4 моль/л). Регулярно отбирались пробы (смотри таблицу 5). Для сравнения проводилось именно это предварительное кондиционирование с добавлением фермента, фосфолипазы А1 из организма Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich) (смотри фигуру 6, таблицу 6. На фигуре 7, в таблице 7 показаны результаты предварительного кондиционирования с добавлением фермента PLA1 и другого фермента, амилазы PET из организма Bacillus subtilis (ASA Spezialenzyme GmbH). На фиг. 8, в таблице 8 снова тот же самый процесс с добавлением фермента PLA1 и другого фермента, α-амилазы из Aspergillus oryzae (Sigma-Aldrich).

Как видно из фигуры 5, воздействие кислоты и щелочи на неочищенное масло в качестве предварительного кондиционирования приводит к значительному объему слизистой фазы, которая впоследствии, несмотря на использование мешалки при 600 оборотах в минуту, существенно не уменьшается. Отдельное фото соответствует при этом отбору пробы, отборы проб происходили в моменты времени 10, 60, 120, 180 и 240 минут (слева направо). В таблице 5 приведены соответствующие аналитические данные, содержание фосфора в ходе реакции снизилось через 240 минут с 247 млн^-1 до 14 млн^-1, концентрация двухвалентных ионов кальция и магния уменьшается в случае кальция с 76 млн^-1 до 9,5 млн^-1, концентрация магния снижается с 31 млн^-1 до 1,7 млн^-1. Содержание свободных жирных кислот почти не изменяется. Предварительное кондиционирование служит в качестве подготовительной к удалению слизи из масла реакции и одновременно в качестве эталонной обработки.

На фиг. 6 при применении фермента фосфолипаза А1 из Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich) заметно небольшое уменьшение слизистой фазы в ходе реакции (одно фото на каждое измерение/отбор пробы) примерно до 5% в конце реакции. Соответствующие данные и моменты времени отбора проб приведены в таблице 6. Содержание свободных жирных кислот увеличивается с 1,76% до 2, 14%. Накопление свободных жирных кислот является показателем активности PLA1, которая отщепляет жирные кислоты от молекул фосфолипида.

К удивлению, было выявлено, что вследствие добавления расщепляющего гликозид фермента к фосфолипазе слизистая фаза обработки рапсового масла заметно уменьшается, смотри фигуры 7 и 8, а также соответствующие данные из таблиц 7 и 8. На фигуре 7 добавлена амилаза PET (ASA Spezialenzyme), на фигуре 8 α-амилаза из Aspergillus oryzae (Sigma-Aldrich). Результаты свидетельствуют и здесь, что, к удивлению, вследствие добавления другого расщепляющего гликозид фермента происходит более быстрое и сильное уменьшение слизистой фазы, что означает повышение выхода масла.

В таблице 9 показан общий выход масла (рапсового масла) в реакции из примера 2 после экстракции слизистой фазы по Сокслету. При этом видно, что добавляемый расщепляющий гликозид фермент в комбинации с PLA1 значительно увеличивает выход масла с выхода 96% при обработке без фермента (НЗСп) или выхода 97% при обработке одним ферментом PLA1, соответственно, до 98% (PLA1+α-амилаза Aspergillus) или 98,5% (PLA1+амилаза PET).

В мире ежегодно производится примерно 22,1 млн. тонн рапсового масла (USDA FAS - 2010). При увеличении выхода масла на 2-2,5% за счет изложенного в данном документе ферментативного процесса рапсового масла могло бы ежегодно производиться на 440000-550000 тон больше.

Claims (10)

1. Способ для уменьшения эмульгируемости растительного масла в водных фазах, включающий в себя этапы:
a) приведение в контакт неочищенного растительного масла или слизи растительного масла с составом, включающим в себя первый ферментный компонент, включающий в себя по меньшей мере один расщепляющий фосфолипид фермент, а также второй ферментный компонент, включающий в себя по меньшей мере один не расщепляющий фосфолипид фермент, причем вторым ферментным компонентом является α-амилаза;
b) отделение слизей от растительного масла, причем до приведения в контакт согласно этапу а) неочищенное растительное масло контактирует с водой и/или кислотой, но отделения водной фазы до первого этапа а) не происходит, наоборот, предварительно кондиционированное масло используется непосредственно в этапе а).

2. Способ по одному из п. 1, в котором первый ферментный компонент выбран из группы, состоящей из фосфолипазы A1, фосфолипазы A2, фосфолипазы С, фосфолипазы В, фосфолипазы D и ацилтрансферазы.

3. Способ по п. 2, в котором фосфолипаза A₁ происходит из Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, видов Pseudomonas, поджелудочной железы свиней или поджелудочной железы крупного рогатого скота; и/или независимо фосфолипаза A₂ происходит из поджелудочной железы свиней, поджелудочной железы крупного рогатого скота, Streptomyces violaceoruber, Naja mossambica, Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes или видов Pseudomonas; и/или независимо фосфолипаза С происходит из Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus или видов Pseudomonas; и/или независимо фосфолипаза В происходит из Thermomyces lanuginosus, Fusarium oxysporium, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, видов Pseudomonas, поджелудочной железы свиней или поджелудочной железы крупного рогатого скота.

4. Способ по п. 2 или 3, в котором фосфолипаза A₁ происходит из Thermomyces lanuginosus или Fusarium oxysporium, и или независимо фосфолипаза A₂ происходит из поджелудочной железы свиней, поджелудочной железы крупного рогатого скота, Streptomyces violaceoruber или Naja mossambica, и/или независимо фосфолипаза С происходит из Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes.

5. Способ по любому из пп. 1-3, в котором альфа-амилаза расщепляет альфа (1-4)-гликозидные, альфа (1-2)-гликозидные, альфа (1-6)-гликозидные, альфа (1-3)-гликозидные, альфа (1-4)-гликозидные и/или альфа (1-6)-гликозидные связи.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором альфа-амилаза является альфа-амилазой из Bacillus sp., Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas aeroginosus, Pseudomonas fluorescens, Aspergillus oryzae или Aspergillus niger.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором отношение ферментной активности первого ферментного компонента к ферментной активности второго ферментного компонента находится в диапазоне от 0,01:6 единиц/г масла до 6:0,01 единиц/г масла.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первый и/или второй ферментный компонент представлен/представлены в иммобилизованной форме.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первый и/или второй ферментный компонент также отделяется от растительного масла в то же самое время, что и слизи.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором используется слизь растительного масла.

Images