CN104245908A - 用于酶法油脱胶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包括至少一种磷脂切割酶的组合物。本发明还涉及使用根据本发明的组合物使原料油脱胶的方法以及根据本发明的组合物用于使原料油脱胶的用途。

Description

用于酶法油脱胶的方法
技术领域
本发明涉及包括至少一种磷脂切割酶的组合物。本发明还涉及使用本发明的组合物使粗油脱胶的方法，以及本发明的组合物用于使甘油三酯特别是粗植物油脱胶的用途。
背景技术
粗油包含大大降低油寿命的磷脂、含有蛋白质和碳水化合物的物质、植物胶以及胶质化合物。因此须移除这些物质。
在下文中，胶质相/胶质(gum)被理解为意指这些物质的整个群组，在经含酸和/或含水的溶液处理之后从油作为重相而得到(Bokisch,M,Nahrungsfette undHandbuch der Lebensmittel-Technologie,Ulmer Verlag,342-433)。
植物油的精制被理解为意指移除不期望的相关物质。在化学精制与物理精制之间有区别。化学精制由以下工艺组成：1.脱胶，2.中和，3.漂白，4.除臭。在脱胶过程中，从油中移除磷脂和金属离子。中和起到提取脂肪酸的作用。在漂白过程中，移除着色剂、其它金属离子和残余的胶质。除臭是蒸汽蒸馏，其中移除破坏油的气味和味道的其它化合物。在物理精制过程中，在精制工艺结束时脱酸与除臭一起进行。
油的脱胶可以通过用水或与Ca2+和Mg2+离子复合的酸例如柠檬酸或磷酸的水溶液来萃取磷脂而进行。通常首先进行水性的所谓的预脱胶，借此移除水溶性磷脂。
这些指的是能水合的磷脂。能水合和不能水合的磷脂的主题描述于例如Nielsen,K.,composition of difficultly extractable soy beanphosphatides,J.Am.Oil.Chem.Soc.1960,37,217-219和A.J.Dijkstra,Enzymatic degumming,Eur.J.Lipid Sci.Technol.2010,112,1178-1189。这些特别是磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇。经稀的水性钙复合酸和镁复合酸(例如柠檬酸或磷酸)的处理根据现有技术的结果是将不能水合的磷脂转化为能水合的磷脂。认为该反应的机理基于如下事实，即桥接各种磷脂分子例如磷酸基上的磷脂酸并使其稳定的钙离子从油中被移除。这改善了用水对这些磷脂的萃取。尽管在一些油例如棕榈油的情况中通过水性预脱胶和用水性酸处理实现了足够好的脱胶，但是这两个萃取步骤对其它的植物油类型例如芥花油、油菜籽油或大豆油经常引起不令人满意的胶质减少。对于食品应用，通常期望油中磷含量减少至10ppm磷或更少(根据现有技术通过油的ICP/AES分析确定)。当将油用于例如制造生物柴油时，对油的磷含量制定了更严的要求。在这种情况下，生物柴油的磷含量根据EU标准被限为5ppm，且对油执行减磷是有利的。另外，当油在进一步的处理步骤中被氢化用于食品，即不饱和脂肪酸被转化为脂肪酸时，或当根据Neste的NExBTL工艺以获得烷烃作为终产物的方式进行氢化，即获得产自植物油的常规生物柴油燃料时，需要特别低的磷含量，即尽可能低且可能是0的磷含量。如上所述，这些工艺对油中低磷含量的要求极高，且这些工艺的使用会随着植物油作为化工业用原料的使用的增加而增加。
另一变型是所谓的“碱炼(caustic refining)”。该工艺被用来从油中移除(如果可能)所有的磷脂以及游离的脂肪酸。该工艺描述于例如Bunge的WO08/094847中。在该工艺中，粗油或经水预脱胶的油首先与少量的柠檬酸或磷酸混合并剧烈搅拌。如以上已解释的，由此使得不能水合的磷脂的盐更加能水合。然后添加稀氢氧化钠溶液，其中计算用量使得相对于中和游离脂肪酸所需的量稍微过量。由此形成脂肪酸盐。然后通过沉积和随后的离心分离混合物，并获得脂肪酸水溶液作为残余物，其中也可以找到磷脂。随后用软化水再次洗涤油。NaOH处理具有如下缺点，即还出现一定程度的油皂化，结果减少其收率。
根据现有技术，油中磷含量的进一步减少可以通过用漂白土或特殊硅胶进行吸附处理而实现，或者可以通过使植物油酶法脱胶而实现。吸附处理具有如下缺点，即在吸附处理之后植物油残留在吸附剂上，这减少精制工艺整体的油收率。此外，所使用的漂白土代表“废料”，对其须找到可能的处理方法。
常规油脱胶工艺的进一步的缺点是水性预脱胶和水性酸处理均引起油损失，其出现是因为转移到水中的磷脂是使少量但仍然很大一部分的植物油在水相中乳化的乳化剂，使得植物油损失。这些损失基于初始使用的粗油可以在较少百分比范围内。根据经验，使用每两个分子的磷脂，乳化约一个甘油三酯分子(描述于WO08/094847)。
所谓的酶法脱胶避免了现有方法的若干缺点，或者进一步改善了萃取方法。例如，在酶法脱胶的情况下，在使用吸附剂时没有形成额外的废料，并且已显示可以进一步减少油损失。
所谓的酶法脱胶在现有技术中通过使用磷脂酶特别是磷脂酶A1和A2或磷脂酶C或磷脂酶的组合来实现。
磷脂酶是属于使磷脂的酯键水解的水解酶的酶。磷脂酶根据其对磷脂的区域选择性分为5组：
磷脂酶A1(PLA1)，其在sn1-位切割脂肪酸，形成2-溶血磷脂。
磷脂酶A2(PLA2)，其在sn2-位切割脂肪酸，形成1-溶血磷脂。
磷脂酶C(PLC)，其切割磷酸单酯。
磷脂酶D(PLD)，其切割或替换头基(headgroup)。
磷脂酶B(PLB)，其在sn1-位和sn2-位同时切割脂肪酸，形成1,2-溶血磷脂。
这些反应通常在聚结底物的界面发生。
磷脂酶特别是磷脂酶A用于粗油的脱胶在例如EP0513709B1(称为Lurgi的Enzymax process，Frankfurt)中得到保护。认为脂肪酸的切割产生溶血卵磷脂，其具有相当低的油乳化能力且还具有相当高的水溶性。结果，改善油收率并且改善难水合磷脂的水溶性。Clausen,Enzymatic oil-degumming by novel microbial phospholipase,Eur.J.LipidSci.Technol.103(2001)333-340的文章描述了磷脂酶A1用于酶法油脱胶的开发和用途并且对磷脂酶A1的使用和磷脂酶A2的使用进行了比较。与酶法油脱胶相关的现有技术状态概述于A.J.Dijkstra的两篇文章，Recent developments in edible oil processing,Eur.J.Lipid Sci.Technol.2009,111,857-864，以及A.J.Dijkstra的文章，Enzymatic degumming,Eur.J.Lipid Sci.Technol.2010,112,1178-1189。在其中讨论了各个磷脂酶用于酶法油脱胶的优点和缺点，并且也呈现了使用不同酸的预处理方法。
用于油脱胶的可选概念由Danisco的体系代表，其中使用脂质酰基转移酶。该酶也由磷脂生成溶血磷脂，但是其将脂肪酸残基转移到油相中的甾醇。相应的酶和这些酶的使用方法描述于WO2006/008508和WO2009/081094。
从油收率的观点出发，最有利的是将高度活性的磷脂酶C用于酶法脱胶，该磷脂酶C产生在油中可溶的甘油二酯以及很易于水溶的磷脂酰残基例如磷脂酰胆碱(由卵磷脂开始)作为产物。这样的酶已由Verenium在US7,226,771中描述。在Dijkstra对于“酶法脱胶”主题的综述文章中，提到该体系的缺点是其并不转化所有的磷脂而仅转化卵磷脂，即磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇，而难水合的乙醇胺和磷脂酸保持不变。该缺点使得在随后的开发中将磷脂酶C与磷脂酶A或与脂质酰基转移酶结合。磷脂酶A与磷脂酶C结合用于油脱胶描述于WO08/094847。在该专利说明书中，一方面描述了磷脂酶A和磷脂酶C的混合物对油收率引起协同效应，且另一方面从而可以用适合的反应时间建立非常低的磷含量。
磷脂酶C与脂质酰基转移酶的结合描述于WO2009/081094。其中也说明了酰基转移酶与磷脂酶C的结合引起油收率增加。酶法油脱胶的另一变型是在通过常规方法例如用水和/或柠檬酸使油脱胶之后酶法处理分离的树脂相。该处理使得可以恢复胶质相中乳化的一些植物油。该方法也讨论于例如综述文章，A.J.Dijkstra,Enzymatic degumming,Eur.J.Lipid Sci.Technol.2010,112,1178-1189p.1184。相应的方法也描述于以下专利说明书中：
EP01624047描述了通过使用磷酸脂解(phospholipolytic)剂从胶质中回收油，其中磷酸脂解剂可以是酸和磷脂酶两者。
除描述上述的方面之外，WO2009/081094还描述了用酰基转移酶以及酰基转移酶与磷脂酶C的混合物酶法处理分离的胶质相。
WO2009/088980描述了用磷脂酶C和磷脂酶A酶法处理胶质。
最终，磷脂酶与其它脱胶方法相比的使用持续性方面描述于文章L.De Maria&J.Vind&K.M.&A.Svendsen&S.Patkar,Phospholipases and their industrial applications,Appl MicrobiolBiotechnol(2007)74:290-300，第96和97页。使用油厂(oil mill)的例子，其中该油厂由常规的脱胶工艺转换为使用磷脂酶A的工艺且其中每年纯化266,000t大豆油，已显示每年可节约120,000GJ能量和12,000t CO2等同物。节约的CO2等同物相当于1600个普通陆地生物的释放。
发明内容
由于全世界可食用油消耗的增加且植物油作为化工业用原料和作为燃料的日益增加的使用，存在进一步改善植物油的脱胶并且具体为植物油的酶法脱胶的持续进一步的需求。本申请的发明人因此设定了开发酶法脱胶用组合物的目的，经该组合物进一步降低待脱胶的油的磷含量、减少油损失且/或增加酶法脱胶的反应速率。同时，这些组合物另外还使该方法以工艺规模经济地进行。
该目的已通过第一酶组分包括至少一种磷脂切割酶且第二酶组分包括至少一种非磷脂切割酶的组合物得到实现。非磷脂切割酶优选为糖切割酶，其也被称为糖苷切割酶或糖苷酶。表述“糖苷切割酶”还包括所有来自具有辅助的糖苷切割活性的其它酶类的另外的酶。
在本发明的含义内，表述“第一酶组分”被理解为意指包括至少一种磷脂切割酶或由至少一种磷脂切割酶组成的任何组合物。
“磷脂切割酶”可以是能够从磷脂切割脂肪酸残基或磷脂酰残基或头基的磷脂酶。另外，其也可以是所谓的酰基转移酶，其中脂肪酸残基的切割结合该残基的转移，随后与油相中的游离甾醇形成酯。
因此，在优选的实施方式中，本发明涉及一种组合物，其中第一酶组分选自磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶B、磷脂酶D和酰基转移酶。市场上可得的典型的该组的酶是的一种磷脂酶A1；Novozymes的一种磷脂酶A2；AB Enzymes,Darmstadt(D)的一种磷脂酶A2；Elementis,San Diego USA的一种磷脂酶C；Danisco的一种酰基转移酶。还可以将两种或更多种上述磷脂切割酶的组合用于第一酶组分。酶可以源自任何期望的生物体(例如还可以从嗜热生物体分离)或合成来源。在本发明范围内还可以的是将相同类型但源自不同来源或物种的酶用于第一酶组分。还包括的是通过重组方法由两种或更多种具有酶活性的不同物种产生的嵌合融合蛋白。
在本发明的含义内，表述“第二酶组分”被理解为意指包括至少一种不作用于磷脂(也就是说不改变其化学结构)的酶或由至少一种不作用于磷脂的酶组成的任何组合物。
因此，在优选实施方式中，本发明涉及一种组合物，其中第二酶组分选自切割糖苷键的水解酶，包括例如淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、硫葡糖苷酶白芥子(laminaranase)、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶、普鲁兰酶、阿拉伯糖酶、右旋糖酐酶。还可以将两种或更多种上述糖苷切割酶的组合用于第二酶组分。酶可以源自任何期望的生物体(例如还可以从嗜热生物体分离)或合成来源。在本发明范围内还可以的是将相同类型但源自不同来源或物种的酶用于第二酶组分。还包括的是通过重组方法由两种或更多种具有酶活性的不同物种产生的嵌合融合蛋白。
在本发明的优选实施方式中，将组合物用于使植物油脱胶或用于减少植物油在水相中的乳化性的方法。
表述“预脱胶”或“湿脱胶”被理解为意指用水或水性酸溶液处理粗油以尽可能地从油中移除水溶性磷脂。预脱胶或湿脱胶在添加酸之后还可以任选地包括添加碱以便中和酸。在添加酶之前，分离出水相。在预脱胶之后，粗油中的磷含量降低约500-1500ppm，例如对于大豆和油菜籽降低至在预脱胶的油中少于200ppm。通过预脱胶，例如，卵磷脂可以获自所得的胶质相，或者胶质相可以发展为饲料。然而，分离水相或降低磷含量的缺点是油方面损失收率。转移到水相中的磷脂具有乳化作用且引起部分油在水相中乳化并与其分离。然后可以进一步酶法处理油(其中在另一步骤中须分离出酶)。
术语油的“预处理”在以下申请中被理解为意指向未处理的粗油添加水或水性酸溶液。然后通过添加碱例如氢氧化钠溶液来建立发生随后的酶促反应的pH。理想地，建立用于酶反应的最佳pH。对于磷脂切割酶，其为4.5的pH。然而，这之后不是分离水相而是立即添加酶。存在的胶质因此暂时保留在油中或乳液中。水相的分离并因此酶的分离仅在酶已作用于(任选地预处理的)粗油之后发生。
在优选的实施方式中，在预处理的情况下可以执行向粗油添加水或水性酸溶液并且任选地添加用于中和酸的碱，但省略了添加酶(在湿预脱胶的情况下)之前的水相分离。通过省略添加酶之前的分离步骤，可以增加油收率。将油收率增加一个百分点具有巨大的经济重要性，因为该百分数基于大豆油的年产量相应于约400,000t的油。相应地，根据本发明的方法允许直接使用来自磷含量为500～1500ppm磷的大豆或油菜籽的粗油。此外，这代表了方法的简化，因为省略了在添加酶之前的分离步骤。
当添加水时，应注意以下：为从油中移除磷脂，基于油的体积需要约1％体积的水来移除约400ppm的磷。相应地，基于油的体积添加约5％体积的水足以使即使具有高磷含量的油也完全没有磷。然而，这样的步骤的影响是使方法变得不经济，因为须提供甚至更大的反应体积。此外，较大的水加入量意味着在分离方面的较高花费以及较低的油收率；较少添加的水因此也意味着更高的油收率。因此，通常在各种情况下基于油体积应向油中添加不大于4％体积的水，优选不大于3％体积的水。
在进一步优选的实施方式中，除已存在于油中的乳化剂例如卵磷脂之外，在精制步骤中不添加额外的乳化剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)。根据本发明的方法同样地优选在不添加盐例如氯化钙(CaCl2)的情况下进行。
在优选的实施方式中，第一酶组分的酶的酶活性选择为在0.01～6单位/g油的范围内，更优选在0.1～3单位/g油的范围内，特别优选在0.2～2.5单位/g油的范围内，且最优选在0.3～1单位/g油的范围内。在进一步优选的实施方式中，第二酶组分的酶活性选择为在0.01～6单位/g油的范围内，优选0.1～3单位/g油，且特别优选在0.2～2.5单位/g油的范围内，且最优选在0.3～1单位/g油的范围内。(单位：酶活性的国际单位；1单位相应于1μmol/min的底物转化)。
在本发明的范围内特别优选组合物中第一酶组分的酶活性与第二酶组分的酶活性的比率在0.01:6单位/g油～6:0.01单位/g油的范围内，优选在0.1:3单位/g油～3:0.1单位/g油的范围内。还优选的是第一酶组分的比例和第二酶组分的比例相等，例如两个组分都选在0.1～0.5单位/g油的范围内，优选在0.2～0.3单位/g油的范围内。
通过保持根据本发明的磷脂切割酶与糖苷切割酶的比率，可以减小胶质相的体积。这意味着油收率增加。
第一酶组分和/或第二酶组分的酶例如可以被冻干并在相应的酶缓冲液(各个酶的标准缓冲液描述于文献中)中以溶液使用，例如柠檬酸盐缓冲液0.1M，pH5或乙酸盐缓冲液0.1M，pH5。在优选的实施方式中，将酶吸收到酶缓冲液中并添加至粗油。为实现酶特别是在含有磷脂的混合物中的更好的溶解性，也可以添加有机溶剂。这些例如用于磷脂的分离并且描述于文献中。优选使用非极性有机溶剂，例如己烷或丙酮或混合物，优选使用量为1～30重量％(可能的溶剂的例子描述于EP1531182A2)。
在进一步优选的实施方式中，第一酶组分和/或第二酶组分以固定化形式使用。因为磷脂切割酶具体是与大量酶(bulk enzyme)例如碳水化合物降解酶(淀粉酶、葡糖苷酶)相比衡量为价格校高的特殊酶，在本发明的范围内优选的是至少组合物的磷脂切割酶以固定化形式使用。在本发明的范围内优选的载体材料是无机载体材料例如硅胶、沉淀硅石、硅酸盐或硅酸铝，以及有机载体材料例如甲基丙烯酸酯或离子交换树脂。载体材料促进(相对昂贵的)酶在以下方法步骤中从油/水乳液中的再循环能力并有助于方法的经济性。
在同样优选的实施方式中，第一酶组分和/或第二酶组分包括一种或多种其它组分，特别优选选自柠檬酸盐缓冲液和乙酸盐缓冲液。
在根据本发明的组合物的特别优选的实施方式(其不以任何方式限制本发明的范围)中，第一酶组分包括至少一种选自磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶C的酶，并且第二酶组分优选包括至少一种选自α-淀粉酶和甘露聚糖酶的酶，其中酶特别优选为存在于选自柠檬酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液的缓冲液中的冻干酶。此外，最优选至少第一酶组分的酶与优选选自无机载体材料例如硅胶、沉淀硅石、硅酸盐或硅酸铝以及有机载体材料例如甲基丙烯酸酯或离子交换树脂的载体吸附地结合或共价地结合。在该特别优选的实施方式中，同样优选第一酶组分的酶活性与第二酶组分的酶活性的比率在0.01:6单位/g油～6:0.01单位/g油的范围内，优选在0.1:3单位/g油～3:0.1单位/g油的范围内。还优选第一酶组分的比例和第二酶组分的比例相等，例如两个组分都选在0.1～0.5单位/g油的范围内，优选在0.2～0.3单位/g油的范围内。
本发明组合物的发明人意外地发现，以上限定的酶组分(第一和第二酶组分)的组合特别高效且有效地减小植物油在水相中的乳化性。根据本发明的组合物可以特别有利地用于粗植物油的脱胶或还用于植物油胶质的纯化。当用于使粗植物油脱胶时，可以例如通过常规的脱胶方法(如同样描述于本申请的范围内)或通过根据本发明的方法得到胶质相。
因此，本发明在又一方面涉及以上更详细地限定的组合物用于减小植物油在水相中的乳化性的用途。
此外，本发明还涉及用于减小植物油在水相中的乳化性的方法，包括以下步骤：
a)使粗植物油与以上限定的组合物接触；
b)从植物油中分离胶质。
意外地发现，与单独使用磷脂切割酶相比，可以通过将第一酶组分的磷脂切割酶与第二酶组分的糖苷切割酶组合来进一步减少粗油的磷脂含量，以提高油收率，提高酶法脱胶中的反应速率，降低胶质体积且/或改善所形成的胶质相的分离性。
本发明的方法特别有利，因为通过使用包括至少一种糖苷切割酶的其它酶组分(第二酶组分)，可以发生胶质相中所存在的其它组分的切割并且相应地改善磷脂切割酶的作用。通过使用第二酶组分，可以例如降低油胶质相的粘性、由于切割干扰组分而增加磷脂的移动性、或获得更好的磷脂可及性。很可能还增加位于胶质相/油界面的磷脂分子对磷脂切割酶的可及性。
例如，通过使用糖苷酶，可以切割糖脂。糖脂类包括大量的化合物。然而，根据文献，胶质相或植物磷脂含有特别是甾醇糖苷、脑苷脂和半乳糖基脂类(Selmair,P.L.,Koehler,P.in Molecular Structureand Baking Performance of Individual Glycolipid Classes from Lecithins,J.Agric.Food Chem.2009,57,5597-5609)。例如，已显示脱脂的大豆卵磷脂含有高达10％的糖脂。这也描述于另一文献参考，即Bueschelberger,H.G.,Lecithins,Emulsifiers in Food Technology,Whitehurst,R.J.,Ed.；Blackwell Publishing:Oxford,U.K.,2004；pp.1-10，以及Clayton,T.A.的Identification of wheat flour lipids by thin-layer chromatography,J.Chromatogr.1970,47,277-281。在又一参考文献Pardun,H.,Eigenschaften der Pflanzenlecithine,in Pflanzenlecithine；Pardun,H.,Ed.；Verlag für chemische Industrie H.Ziolkowsky KG:Augsburg,Germany,1988；pp.195-202中，表明了6.5～11％的范围。假定将这些分子切割为可以任选地再次溶于油中的极性残基和水溶性头基有助于使磷脂以更浓的形式在胶质相的胶束中存在，因此能够通过磷脂酶更迅速地转化。相同的考虑适用于油/胶界面处的磷脂。
经糖苷切割酶处理之后的胶质相的脂质的减小的乳化能力额外有助于使油收率能够进一步增加。多糖-和细胞壁组分-切割酶的效果可以解释如下：磷脂变得更好地接近磷脂酶，并且也可以增加反应率。如例如Scholfield,C.R.,Composition of Soybean Lecithin,JAOCS,Vol.58,no.10(October1981),pp.889-892所公开的，碳水化合物的存在通过大豆卵磷脂的分析确证，粗卵磷脂还含有碳水化合物。
因此，例如，细胞壁果胶和多糖一定程度具有显著的增稠作用，并且其它的细胞壁组分具有显著的增稠作用。由其引起的粘度增加在一些情况下可以降低磷脂酶的反应率。通过将这些细胞壁成分和/或多糖切割为不增加粘度的易水溶的片断，可以解释所添加的酶对磷脂酶的有效性的作用。
通过根据本发明将磷脂切割酶与糖苷切割酶结合，可以减少磷脂切割酶(例如任选地与磷脂酶C结合的磷脂酶A1或A2)的添加量，由此同时获得以上对于方法所列的优点，且节约成本。与磷脂切割酶结合的糖苷切割酶通常是相比于例如磷脂酶是较不昂贵的酶，且可大量获得。结合有利的反应程序，也就是与所使用的特定酶匹配的工艺条件，根据本发明的方法在时长以及能量和原料消耗方面可以得到进一步改善。
根据本发明，优选使用的是：磷脂酶A1，其源自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporium)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、李斯特单核细胞增生菌(Listeria monocytogenes)、假单孢菌物种(Pseudomonas species)、猪胰脏或牛胰脏；和/或磷脂酶A2，其独立地源自猪胰脏、牛胰脏、紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)、莫桑比克射毒眼镜蛇(Naja mossambica)、疏棉状嗜热丝孢菌、尖孢镰刀菌、米曲霉、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、李斯特单核细胞增生菌或假单孢菌物种；和/或磷脂酶C，其独立地源自蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、李斯特单核细胞增生菌、疏棉状嗜热丝孢菌、尖孢镰刀菌、米曲霉、蜡样芽孢杆菌或假单孢菌物种；和/或磷脂酶B，其独立地源自疏棉状嗜热丝孢菌、尖孢镰刀菌、米曲霉、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、李斯特单核细胞增生菌、假单孢菌物种、猪胰脏或牛胰脏。
特别优选来自疏棉状嗜热丝孢菌或尖孢镰刀菌的磷脂酶A1，和/或独立地来自猪胰脏、牛胰脏、紫红链霉菌或莫桑比克射毒眼镜蛇的磷脂酶A2，和/或独立地来自蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌或李斯特单核细胞增生菌的磷脂酶C。
关于糖苷切割酶，优选切割α(1-4)糖苷键、α(1-2)糖苷键、α(1-6)糖苷键、β(1-3)糖苷键、β(1-4)糖苷键和/或β(1-6)糖苷键的那些。
进一步优选淀粉酶，特别是α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶和异淀粉酶，还优选甘露聚糖酶。
关于淀粉酶和甘露聚糖酶，优选来自芽孢杆菌或假单孢菌或真菌物种或者来自胰脏的那些，特别是来自芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeroginosus)、荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)、米曲霉、黑曲霉(Aspergillus niger)或里氏木霉(Trichoderma reesei)的那些。在甘露聚糖酶的情况下，特别优选来自里氏木霉的甘露聚糖酶。
对于大豆油的脱胶，特别优选来自疏棉状嗜热丝孢菌或尖孢镰刀菌的磷脂酶A1和/或来自猪胰脏或牛胰脏的磷脂酶A2与来自芽孢杆菌物种的α-淀粉酶和/或来自木霉物种的甘露聚糖酶的组合。对于油菜籽油的脱胶，特别优选来自疏棉状嗜热丝孢菌或尖孢镰刀菌的磷脂酶A1和/或来自猪胰脏或牛胰脏的磷脂酶A2与来自芽孢杆菌物种或曲霉物种的α-淀粉酶的组合。
表述“粗植物油”被理解为意指植物来源的任何粗油。本发明范围内的优选粗油是粗大豆油、粗油菜籽油、粗葵花油、粗橄榄油、粗棕榈油、粗麻疯果油、粗海藻油、粗亚麻荠油(crude cameline oil)、粗棉籽油，特别是粗大豆油、粗油菜籽油、粗麻疯果油、粗亚麻荠油和粗葵花油。术语“粗”是指油尚未进行脱胶、中和、漂白和/或脱臭步骤的事实。在根据本发明的方法的范围内还可以的是使用或预处理多种粗油的混合物，用酶处理经预处理或预脱胶的油。
“接触”在根据本发明的方法的范围内可以以任何本领域技术人员已知适用于本发明目的的方式进行。优选的接触类型是使粗油与根据本发明的组合物混合。
在使粗油与根据本发明的组合物接触之后，优选搅拌粗油与组合物的混合物，特别优选用桨式搅拌器以200～800rpm搅拌，优选250～600rpm，且最优选300～500rpm。
接触过程中混合物的温度优选在15～99℃的范围内，更优选在20～95℃的范围内，更优选22～80℃，同样优选25～65℃，更优选27～55℃，且最优选30～45℃。混合物的温度通常须选择为使得不超过酶的变性温度，混合物的温度优选为比酶的变性温度或数种酶的最低变性温度低至少5℃。其中当使用从嗜热生物体分离的酶时，原则上优选较高的温度。如果在本发明的范围内使用一种或多种热稳定酶，方法温度优选在80～120℃的范围内，更优选在85～100℃的范围内。使用热稳定酶具有如下优点，即可以相应地选择提高的方法温度，借此降低植物油的粘度且可以缩短方法整体－也是由于提高的酶反应速率。此外，在预处理(其同样在升高的温度有利地进行)的情况下，不需要随后进行低于所用酶的较低变性温度的冷却。总的来说，使用热稳定酶相应地引起方法的缩短和成本的降低。
接触的时长优选在1分钟至12小时的范围内，更优选5分钟至10小时，同样优选10分钟至6小时，更优选20分钟至3小时。
在接触过程中混合物的pH优选在pH3至pH7.5的范围内，更优选在pH4至pH6的范围内，且特别优选在pH4.0至pH5.2的范围内。
粗植物油与根据本发明的组合物的第一和第二酶组分的接触可以同时或相继发生。当接触相继发生时，在本发明的范围内优选粗植物油首先与第二酶组分接触。当粗植物油首先与一个酶组分接触然后与另一酶组分接触时，特别优选在添加一个组分之后在添加另一组分之前将混合物搅拌30～300分钟，优选60～240分钟，同样优选70～120分钟。
根据本发明方法的步骤b)的胶质的“分离”可以以本领域技术人员已知适用于本发明目的的任何方式进行。然而，分离优选通过离心或过滤进行，其中优选离心。在离心的情况下，发生混合物的相分离，使得经处理的植物油、胶质和酶组合物存在于可易于彼此分离的单独的相中。
在优选的实施方式中，含有胶质的相和含有本发明组合物的相与经处理的油分离。特别优选与胶质同时分离出第一和/或第二酶组分。
在分离之后，酶可以再生或纯化，并且例如用于新的纯化工序中。在这种情况下，同样有利的也是再次与本发明的组合物工作，通过使用其它糖苷切割酶直接结合固定化的磷脂酶或脂质酰基转移酶，或通过使用本发明的组合物，从而移除例如附着于固定化磷脂酶的植物油胶质，以便能够更好地在新方法中再使用固定化酶。
本发明的又一优选实施方式另外涉及如上所述的方法，还包括步骤：
c)使根据步骤b)的植物油再次与第一和/或第二酶组分接触。
“接触”优选在与上述用于本发明方法的步骤a)中相同的条件下进行。在特别优选的实施方式中，第一和/或第二酶组分在再次进行接触之前进行再生或纯化。
在特别优选的实施方式中，粗植物油与水和/或酸在根据本发明方法的步骤a)的接触之前接触。优选的酸是钙-和镁-复合酸自身或与例如柠檬酸和磷酸的组合。这被称为所谓的“预处理”。
在根据本发明方法的优选实施方式中，与水的接触在30℃～90℃的温度进行15～60分钟，优选30～60分钟，其中优选35～85℃的温度，且特别优选40～80℃的温度。与酸特别是柠檬酸或磷酸的接触在本发明方法的范围内优选在30℃～90℃的温度进行5～60分钟，优选15～60分钟，其中优选35～85℃的温度且特别优选40～80℃的温度。在优选实施方式中，在酸处理之后，与相应的碱进行中和步骤，以便达到pH3.5～8.0，优选4～7。根据本发明的方法优选的是将本发明的组合物直接添加到植物油而不预先进行分离步骤。
然而，在添加磷脂酶和/或其它酶之前，须保证反应温度不超过酶的最佳温度范围，以便防止酶的变性。35～65℃的温度优选45～55℃是合适的，借此使用来自嗜热生物体的酶(即对于温度特别稳定的酶)可以允许在80～100℃进行使用，使得在使粗植物油与水和/或酸接触和与本发明的组合物接触之间不需进行温度降低。温度稳定性的增加也可以通过使酶组分的酶固定化而实现。因为许多酶对有机溶剂表现出一定的耐受性(Faber,K.,Biotransformations in Organic Chemistry(2001),Springer-Verlag,Heidelberg)，因此在本发明的范围内还可以用酶相应地处理经预处理的油或胶质。
在特别优选的实施方式(其不以任何方式限制本发明的范围)中，本发明的方法包括以下步骤。
优选的实施方式A)
a)使选自大豆油和/或油菜籽油的粗植物油与包括第一酶组分和第二酶组分的组合物接触，第一酶组分具有至少一种选自磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶C的酶，第二酶组分具有至少一种选自α-淀粉酶和甘露聚糖酶的酶；
b)通过离心从植物油中分离胶质。
在根据本发明方法的进一步优选的实施方式中，所谓的预处理在方法的步骤a)之前进行，其中将粗油与1.5～3ml/l油的量的有机酸，优选柠檬酸，在单独的方法步骤中混合。优选将混合物的温度调节为35～60℃，特别优选48℃。在30分钟至2小时优选1小时的反应时间之后，通过添加化学计量量的碱性溶液，优选氢氧化钠溶液，以优选0.5～2mol/l特别优选1mol/l的量，将混合物调节为pH5。仅在此之后进行根据本发明方法的步骤a)的程序。
优选的实施方式B)
a)使选自大豆油和/或油菜籽油的粗植物油与包括第一酶组分和第二酶组分的组合物接触，第一酶组分具有至少一种选自磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶C的酶，第二酶组分具有至少一种选自α-淀粉酶和甘露聚糖酶的酶，其中特别优选第一酶组分的至少一种酶以固定化形式存在于载体上；
特别优选第一和/或第二酶组分的酶在水相中(缓冲液，优选在pH4.0-5.5范围，特别优选pH4.0-5.0)以0.05～5％w/v的浓度使用。
接触优选在20～70℃的温度下进行，更优选40～65℃。
b)通过离心从植物油中分离胶质。
该根据B)的特别优选的实施方式在同样特别优选的实施方式中与通过添加有机酸和/或碱性溶液(在步骤b之后)的后脱胶结合。因此优选将混合物的温度调节为35～60℃，特别优选48℃。在30分钟至2小时优选1小时的反应时间之后，通过添加碱性溶液，优选氢氧化钠溶液，以优选0.5～2mol/l特别优选1mol/l的浓度将混合物调节为pH 5。
优选的实施方式C)
根据优选的实施方式C)，代替粗植物油，使通过常规脱胶方法或通过本发明的方法分离的胶质相与本发明的组合物“接触”。该方法优选根据实施方式A)、B)或D)进行。该方法允许例如与胶质相分离的脱胶油的回收，因此使油回收并相应地引起油收率的间接增加。
优选的实施方式D)
a)使选自大豆油和/或油菜籽油的粗植物油与包括第一酶组分和第二酶组分的组合物接触，第一酶组分具有至少一种选自磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶C的酶，第二酶组分具有至少一种选自α-淀粉酶和甘露聚糖酶的酶，其中特别优选第一酶组分的至少一种酶以固定化形式存在于载体上；
接触因此优选在70～100℃的温度进行，更优选75～85℃，且仅使用热稳定酶，或变性温度比方法温度高至少1℃，优选5℃的酶。
在根据本发明方法的进一步优选的实施方式中，预处理在方法的步骤a)之前进行，其中将粗油与1.5～5ml/l油的量的有机酸，优选1.5～2ml/l油的量的柠檬酸，在单独的方法步骤中混合。优选将混合物的温度调节为35～60℃，特别优选48℃。在30分钟至2小时优选1小时的反应时间之后，通过添加碱性溶液，优选氢氧化钠溶液，以优选0.5～2mol/l特别优选1mol/l的量，调节混合物。仅在此之后进行根据本发明的方法的步骤a)的程序。
b)通过离心从植物油中分离胶质。
此外，通过减小根据本发明方法处理的油的Ca和/或Mg含量，可以进一步减少任何仍溶于植物油且尚未被磷脂酶切割的磷脂酸。因此，对根据本发明方法的上述优选实施方式在特别优选的实施方式中补充随后的步骤，在该步骤中，通过再次添加复合剂例如柠檬酸或磷酸，进一步降低油中二价离子的含量并且同时降低油中P的含量。
通过本发明的方法，可以显著降低粗植物油中的磷值。磷值从而降低至低于20ppm，特别优选降低至低于10ppm，最特别优选降低至低于4ppm磷。
此外，通过本发明的方法可以将粗植物油的钙和镁含量降低至低于20ppm，特别优选降低至低于15ppm，最特别优选降低至低于10ppm，同样优选降低至低于8ppm，且最优选降低至低于4ppm。在最特别优选的实施方式中，将钙和镁含量降低至低于3ppm。
方法
使用以下分析方法：
测定植物油中的磷含量
通过ICP根据DEV E-22进行磷的测定。
测定植物油中的钙和镁含量
通过ICP根据DEV E-22进行磷的测定。
测定游离脂肪酸(FFA)的含量
经皂化反应通过氢氧化钠或氢氧化钾的消耗测定游离脂肪酸的含量。获得所研究的油中的游离脂肪酸的百分比含量。根据DIN53402(方法DGF C-V2)进行测定。
测定胶质体积
通过该测定，测量油中包含的酶促未处理和酶促处理的胶质的胶质相。将10ml的玻璃离心管加热至反应混合物的工作温度，并引入样品(2x2ml)并将其在3000rpm在受控温度下离心至少4分钟以便从油中分离胶质相。从上层油相取样用于分析。出于记录目的，另外拍摄相形成结果。
测定胶质相中的油含量
根据索氏提取(Soxhlet extraction)按照DIN ISO659进行胶质相中残余油含量的测定。
变型1：
将400～500g量待处理的粗油引入到1000ml DN120Duran反应器中，并移除样品用于分析。通过加热板将Duran反应器中的油加热至35～60℃的温度，特别是48℃，借此需要保持不使酶变性的温度。当达到该温度时，开始预处理。为此，根据油量将限定量的稀柠檬酸(例如450ppm，1.372ml)计量到油中。然后通过Ultraturrax将混合物充分混合1分钟。或者，将混合物在约600ppm的搅拌下孵育1小时，直到发生酸反应。然后添加限定量的氢氧化钠溶液(1mol/l，余量至2％v/v或3％v/v，减去来自酸添加和酶添加的水)，并将整体在搅拌下另外孵育10分钟。此时，添加酶混合物或固定物(immobilizate)的酶，其优选溶于缓冲液中。搅拌进酶，为此可将搅拌器速度增加较短时间(在900rpm下1分钟)，然后在较低速度下继续搅拌。
以限定的时间间隔移除样品。通过移液管移除样品，并将其引入到温控的玻璃离心管中(反应混合物的温度)并在3000rpm在受控的温度下离心至少4分钟，以便从油中分离胶质相。出于记录目的，拍摄相形成结果，取上清液样品用于测定磷、钙和镁含量。
变型2：
在进一步的程序中，向粗油中添加磷脂酶与其它酶作为游离酶或固定化酶的合适组合以及水相(酶缓冲液，pH5)0.05～5％w/v。把由水、酶、任选地酶载体和油组成的乳液充分混合。理想地，反应在20～70℃，优选40～65℃的受控温度下进行。然后等待相分离，固体沉积，或可以通过本领域技术人员已知的标准方法例如通过离心或过滤移除固体。作为后处理，油的残余脱胶可以用稀的酸(例如柠檬酸)或碱性溶液根据本领域技术人员已知为“脱胶”的工艺进行。
变型3：
在进一步的程序中，用酶处理胶质相。除磷脂酶之外，还向通过本领域技术人员已知为“脱胶”的工艺获得的胶质相添加其它的酶。这些可以溶于水相中或混悬于有机溶剂中。将该批次理想地调节至20～70℃的温度，优选调节至35～60℃的温度。充分混合该批次，直到完成该工序。这可以通过粘度测量或视觉上通过其它的固体胶质相的溶解而得到验证。可以通过离心实现相分离，并且可以分离出各个相。通常，顶相由所获得的油组成，中间相由磷脂组成，且底相是水相并含有酶。通过再使用水相，可以再循环且再次使用酶。取决于二价离子的含量，油或含有酶的水相在进一步使用之前须通过添加复合剂来纯化离子。
变型4：
在进一步的程序中，使粗油达到高温，尤其是70～100℃，更精确地75～85℃。用酸和碱性溶液通过上述工序处理粗油，保持温度，且添加热稳定酶。进一步的程序如已所述的。搅拌进酶，为此可将搅拌器速度增加较短时间(例如在900rpm下1分钟)，然后在600rpm继续搅拌直到反应结束。可以如上所述进行胶质相的分离。
实施例和附图：
以下通过附图和实施例更详细地说明本发明。强调的是实施例和附图仅仅是示例说明性的且示例说明本发明的特别优选的实施方式。实施例和附图均不限制本发明的范围。
附图说明
附图显示：
图1大豆油：以2％总水含量预处理；
图2大豆油：添加酶PLA10.3单位/g油和2％总水含量的预处理；
图3大豆油：添加酶PLA10.3单位/g油和α-淀粉酶芽孢杆菌物种1单位/g油、2％总水含量的预处理；
图4大豆油：添加酶PLA10.3单位/g油和甘露聚糖酶0.3单位/g油，2％总水含量的预处理；
图5油菜籽油：3％总水含量的预处理；
图6油菜籽油：添加酶PLA10.3单位/g油和3％总水含量的预处理；
图7油菜籽油：添加酶PLA10.3单位/g油和淀粉酶PET1单位/g油，3％总水含量的预处理；
图8油菜籽油：添加酶PLA10.3单位/g油和α-淀粉酶曲霉属1单位/g油，3％总水含量的预处理。
具体实施方式
实施例1：
根据反应变型1，使用具有以下起始含量的大豆油：磷700ppm、钙65.6ppm、镁62.6ppm和1％含量的游离脂肪酸。使粗油通过柠檬酸(450ppm)水溶液和氢氧化钠水溶液(1mol/l)进行预处理。以固定的间隔取样品(参见表1)。作为比较，通过添加酶即来自疏棉状嗜热丝孢菌生物体的磷脂酶A1(Sigma-Aldrich)进行相同的预处理(参见图2、表2)。图3、表3显示了通过添加酶PLA1和其它酶即来自芽孢杆菌物种生物体的α-淀粉酶(Sigma-Aldrich)的预处理结果。在图4、表4中，通过添加酶PLA1和其它酶即甘露聚糖酶(ASA-Spezialenzyme)再次进行相同的处理。
表1 2％总水含量的预处理，磷、钙、镁和FFA含量
时间[min] 10 60 120 180 240
Ca[ppm] 7.8 8.8 9.3 9.7 9.8
Mg[ppm] 4.1 3.2 3.1 3.3 3.2
P[ppm] 33 20 18 20 21
FFA[％] 0.75 0.76 0.78
胶质相[％] 4.5 4.5 4.5 4.0 4.0
表2 添加来自疏棉状嗜热丝孢菌的PLA10.3单位/g油和2％总水含量的预处理，磷、钙、镁和FFA含量
时间[min] 10 60 120 180 240
Ca[ppm] 9.6 9.9 9.3 8.1 7
Mg[ppm] 4.4 3.2 3.6 3 2.2
P[ppm] 23 14 18 15 10
FFA[％] 0.79 1.24 1.32
胶质相[％] 4.8 3.0 2.8 2.5 2.5
表3 添加PLA10.3单位/g油和来自芽孢杆菌物种的α-淀粉酶1单位/g油，2％总水含量的预处理，磷、钙、镁和FFA含量
时间[min] 10 60 120 180 240
Ca[ppm] 4.1 7.1 5.6 4.8 4.1
Mg[ppm] 1.9 2.2 1.8 1.6 1.4
P[ppm] 13 11 9.4 8.9 6.2
FFA[％] 0.86 1.19 1.16
胶质相[％] 4.0 2.5 2.5 2.5
表4 添加PLA10.3单位/g油和甘露聚糖酶0.3单位/g油，2％总水含量的预处理，磷、钙、镁和FFA含量
时间[min] 10 60 120 180 240
Ca[ppm] 5.6 6 5.4 4.6 4.3
Mg[ppm] 3.5 2.3 2.1 1.8 1.7
P[ppm] 27 14 13 12 11
FFA[％] 0.75 1.19 1.24
胶质相[％] 4.5 2.8 2.6 2.5 2.5
从图1中明显的是，对粗油使用酸和碱性溶液作为预处理引起并不微少量的胶质相，这随后基本上不降低，尽管使用在600rpm的搅拌器。单张照片相应于一个移除的样品，在10、60、120、180和240分钟的时间取样品(在各种情况下从左至右)。相关的分析数据显示在表1中，磷含量在240分钟之后从33ppm下降到21ppm，二价离子钙和镁的浓度稍微增加，在钙的情况下从7.8ppm至9.8ppm，镁的浓度在反应过程中从4.1ppm下降到3.2ppm。游离脂肪酸的含量几乎保持不变。预处理用作为用于油脱胶的制备反应且同时作为参考处理。
在图2中，当使用来自疏棉状嗜热丝孢菌的磷脂酶A1(Sigma-Aldrich)时，在反应过程中可以观察到胶质相的减少(每次测量/取样，一张照片)。相关数据和取样品的时间显示在表2中。表2显示了钙浓度从9.6ppm降低到7ppm，镁浓度从4.4ppm降低到2.2ppm，且磷含量从23ppm降低到10ppm，游离脂肪酸的含量从0.79％增加到1.32％。从游离脂肪酸含量的增加和磷含量的降低可以得出结论，PLA1具有酶促活性，因此油脱胶成功地起作用。游离脂肪酸的增加是PLA1活性的指示，PLA1从磷脂分子切割脂肪酸并且胶质相也连续降低。为了对油开放宽范围的应用，目标是进一步降低磷含量。
图3显示经PLA1处理且另外经α-淀粉酶芽孢杆菌物种(Sigma-Aldrich)处理的预处理粗油的胶质相的体积。根据表3中的相关分析数据明显的是，令人意外地，在仅60分钟之后实现2.5％的胶质相减少。此外，游离脂肪酸的含量从0.86％增加到1.16％，因此指示磷脂酶的活性。磷含量从粗油中的700ppm下降到13ppm，最终在240分钟之后下降到6.2ppm。钙浓度稍微变化，镁稍微降低。
图4和表4显示使用其它的酶组合时的实验数据。再次使用磷脂酶A1和甘露聚糖酶(ASA-Spezialenzyme)。根据数据明显的是，在仅60分钟之后出现胶质相的显著减少。在经两种酶处理240分钟之后，游离脂肪酸的含量从0.75％增加到1.24％，磷含量从粗油中的700ppm经27ppm(10-分钟样品)下降到11ppm。二价离子的浓度在反应的整个过程中也降低。这些结果证明添加其它的糖苷-切割酶令人意外地引起胶质相更加快速且更加显著的减少。
实施例2：
根据反应变型1，使用具有以下起始含量的油菜籽油：磷1150ppm、钙370ppm、镁146ppm和1.95％含量的游离脂肪酸。使粗油通过柠檬酸(1000ppm)水溶液和氢氧化钠水溶液(4mol/l)进行预处理。以固定的时间间隔取样品(参见表5)。作为比较，通过添加酶即来自疏棉状嗜热丝孢菌生物体的磷脂酶A1(Sigma-Aldrich)进行相同的预处理(参见图6、表6)。图7、表7显示了通过添加酶PLA1和其它酶即来自枯草芽孢杆菌生物体的淀粉酶PET(ASA Spezialenzyme GmbH)的预处理结果。在图8、表8中，通过添加酶PLA1和其它酶即来自米曲霉的α-淀粉酶(Sigma-Aldrich)再次进行相同的处理。
表5 3％总水含量的预处理，磷、钙、镁和FFA含量
时间[min] 10 60 120 180 240
Ca[ppm] 76 11 9.5 9.4 9.5
Mg[ppm] 31 2.8 1.7 1.6 1.7
P[ppm] 247 20 14 13 14
FFA[％] 1.73 1.68 1.72
胶质相[％] 5.8 6.5 6.0 6.0 5.8
表6 来自疏棉状嗜热丝孢菌的PLA10.3单位/g油和3％总水含量的预处理，磷、钙、镁和FFA含量
时间[min] 10 60 120 180 240
Ca[ppm] 26 9.7 8.7 7.9 7.9
Mg[ppm] 9.7 2.1 1.8 1.4 1.5
P[ppm] 82 17 15 12 12
FFA[％] 1.76 2.35 2.14
胶质相[％] 6.5 5.6 5.0 4.5 5.5
表7 添加PLA10.3单位/g油和淀粉酶PET 1单位/g油，3％总水含量的预处理，磷、钙、镁和FFA含量
时间[min] 10 60 120 180 240
Ca[ppm] 16 14 13 12 11
Mg[ppm] 4.8 2.8 2.7 2.4 1.9
P[ppm] 38 21 19 15 13
FFA[％] 1.84 2.24 2.20
胶质相[％] 6.9 5.3 4.0 3.8 3.4
表8 添加PLA10.3单位/g油和来自曲霉属的α-淀粉酶单位/g油，3％总水含量的预处理，磷、钙、镁和FFA含量
时间[min] 10 60 120 180 240
Ca[ppm] 39 12 9.3 8.1 7.1
Mg[ppm] 15 3.2 2.2 1.7 1.3
P[ppm] 130 25 19 14 10
FFA[％] 1.92 2.49 2.45
胶质相[％] 6.5 5.1 4.6 4.4 3.6
从图5中明显的是，对粗油使用酸和碱性溶液作为预处理引起相当大量的胶质相，这随后基本上不降低，尽管使用在600rpm的搅拌器。单张照片相应于一个移除的样品，在10、60、120、180和240分钟的时间取样品(从左至右)。相关的分析数据显示在表5中，磷含量在240分钟之后从247ppm下降到14ppm，二价离子钙和镁的浓度降低，在钙的情况下从76ppm降低至9.5ppm，镁的浓度在反应过程中从31ppm下降到1.7ppm。游离脂肪酸的含量几乎保持不变。预处理用作为用于油脱胶的制备反应且同时作为参考处理。
在图6中，当使用来自疏棉状嗜热丝孢菌的磷脂酶A1(Sigma-Aldrich)时，在反应过程中可以观察到胶质相稍微减少(每次测量/取样，一张照片)，在反应结束时至约0.5％。相关数据和取样品的时间显示在表6中。游离脂肪酸的含量从1.76％增加到2.14％。游离脂肪酸的增加是PLA1活性的指示，PLA1从磷脂分子切割脂肪酸。
令人意外地，现在已发现，通过将糖苷-切割酶添加至磷脂酶，显著减少油菜籽油处理的胶质相，参见图7和8以及表7和8中的相关数据。在图7中，添加淀粉酶PET(ASA Spezialenzyme)，在图8中，添加来自米曲霉的α-淀粉酶(Sigma-Aldrich)。此处同样，结果证明添加其它的糖苷-切割酶令人意外地引起胶质相更加快速且更加显著的减少，这表明油收率的提高。
表9：油菜籽油：实施例2的反应在索氏提取胶质相之后的总油收率
表9显示实施例2的反应在索氏提取胶质相之后的总油收率(油菜籽油)。明显的是，额外的糖苷-切割酶结合PLA1将不用酶(H3Cit)处理的情况下的96％的油收率或仅用酶PLA1处理的情况下的97％的油收率分别显著提高到98％(PLA1+α-淀粉酶曲霉属)和98.5％(PLA1+淀粉酶PET)。
全世界每年制造约22.1百万公吨的油菜籽油(USDA FAS–2010)。通过用上述的酶促方法将油收率提高2～2.5％，每年可以制造约440,000～550,000公吨更多的油菜籽油。

Claims (15)

1.一种用于使甘油三酯酶法脱胶的方法，包括以下步骤：
a)使粗甘油三酯与组合物接触，所述组合物包括含有至少一种磷脂切割酶的第一酶组分和含有至少一种非磷脂切割酶的第二酶组分；
b)从所述甘油三酯中分离胶质。
2.根据权利要求1所述的用于使甘油三酯脱胶的方法，其中所述粗甘油三酯优选为粗植物油。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在根据步骤a)的接触之前，使粗植物油与水和/或水性酸接触，但在步骤a)之前不进行水相的分离，而是在步骤a)中直接使用预处理的粗油。
4.根据权利要求1～3中的一项所述的方法，其中所述非磷脂切割酶是糖苷-切割酶。
5.根据权利要求1～4中的一项所述的方法，其中所述第一酶组分选自磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶B、磷脂酶D和酰基转移酶。
6.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其中所述磷脂酶A1源自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporium)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、李斯特单核细胞增生菌(Listeriamonocytogenes)、假单孢菌物种(Pseudomonas species)、猪胰脏或牛胰脏；且/或磷脂酶A2独立地源自猪胰脏、牛胰脏、紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)、莫桑比克射毒眼镜蛇(Najamossambica)、疏棉状嗜热丝孢菌、尖孢镰刀菌、米曲霉、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、李斯特单核细胞增生菌或假单孢菌物种；且/或磷脂酶C独立地源自蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、李斯特单核细胞增生菌、疏棉状嗜热丝孢菌、尖孢镰刀菌、米曲霉、蜡样芽孢杆菌或假单孢菌物种；且/或磷脂酶B独立地源自疏棉状嗜热丝孢菌、尖孢镰刀菌、米曲霉、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、李斯特单核细胞增生菌、假单孢菌物种、猪胰脏或牛胰脏。
7.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其中所述磷脂酶A1源自疏棉状嗜热丝孢菌或尖孢镰刀菌，且/或磷脂酶A2独立地源自猪胰脏、牛胰脏、紫红链霉菌或莫桑比克射毒眼镜蛇，且/或磷脂酶C独立地源自蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌或李斯特单核细胞增生菌。
8.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其中所述糖苷-切割酶切割α(1-4)糖苷键、α(1-2)糖苷键、α(1-6)糖苷键、β(1-3)糖苷键、β(1-4)糖苷键和/或β(1-6)糖苷键。
9.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其中所述第二酶组分选自由淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、异淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、普鲁兰酶、阿拉伯糖酶、硫葡糖苷酶白芥子、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、右旋糖酐酶、果胶酶、纤维素酶、纤维二糖酶和木聚糖酶组成的糖苷酶。
10.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其中所述淀粉酶是α-淀粉酶，特别是源自芽孢杆菌(Bacillus sp.)、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeroginosus)、荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)的α-淀粉酶。
11.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其中所述甘露聚糖酶源自里氏木霉(Trichoderma reesei)。
12.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其中所述第一酶组分的酶活性与所述第二酶组分的酶活性的比例在0.01:6单位/g油至6:0.01单位/g油的范围内。
13.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其中所述第一酶组分和/或所述第二酶组分以固定化形式存在。
14.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其中在所述胶质从所述植物油中分离的同时，所述第一酶组分和/或所述第二酶组分也从所述植物油中分离。
15.根据前述权利要求中的一项所述的方法，其中使用植物油胶质代替植物油。
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