BR112019019581A2

BR112019019581A2 - métodos para refinar um óleo vegetal e para produzir um polipeptídeo, uso de uma enzima, óleo vegetal refinado ou borra, polipeptídeo isolado ou purificado, composição, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, e, célula hospedeira recombinante

Info

Publication number: BR112019019581A2
Application number: BR112019019581A
Authority: BR
Inventors: Noergaard Allan; Longin Fanny; Maria Lilbaek Hanna; Christian Holm Hans; Brask Jesper; Borch Kim; Linde Damstrup Marianne; Li Ming; Munk Nielsen Per; Piotr Olinski Robert; Maria Landvik Sara; Sun Tianqi
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2017-03-20
Filing date: 2018-03-19
Publication date: 2020-04-14
Also published as: US20230332069A1; RU2019133104A; US20200010778A1; CN114891560A; EP3601507A4; WO2018171552A1; MX2019011162A; EP3601507A1; RU2019133104A3; CN110446777A

Abstract

trata-se no presente documento de refino de óleo vegetal. são fornecidos, ainda, processos em que os fosfolipídios presentes no óleo vegetal são hidrolisados e o óleo é subsequentemente submetido a refino químico.

Description

MÉTODOS PARA REFINAR UM ÓLEO VEGETAL E PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, USO DE UMA ENZIMA, ÓLEO VEGETAL REFINADO OU BORRA, POLIPEPTÍDEO ISOLADO OU PURIFICADO, COMPOSIÇÃO, CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO OU VETOR DE EXPRESSÃO, E, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE

Referência a uma listagem de sequências [001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador que está incorporada ao presente documento a título de referência.

Campo da Invenção [002] A presente invenção refere-se a métodos para degomar e refinar óleo vegetal. A presente invenção refere-se, ainda, a polipeptídeos que têm atividade de fosfolipase A, a polipeptídeos que têm atividade de fosfolipase Cea polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. A invenção também se refere a construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos, assim como métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

Antecedentes da invenção [003] Seja destinado ao consumo humano ou como matéria-prima na produção de produtos oleoquímicos ou biodiesel, o óleo vegetal precisa ser pré-tratado para remover impurezas, tais como fosfolipídios (gomas) e ácidos graxos livres. O pré-tratamento inclui Degomagem, Refino (também denominado uma Neutralização, Branqueamento e Desodorização).

[004] O propósito do processo de degomagem é remover fosfolipídios ou gomas hidratáveis e não hidratáveis presentes no óleo. Tradicionalmente, o processo de degomagem foi baseado no uso de extração de água (degomagem aquosa), que envolve tratar o óleo com água e separação dos fosfolipídios ou gomas hidratáveis do óleo triglicerídeo. Dependendo da fonte de óleo, a degomagem aquosa pode ser combinada com

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2/79 degomagem ácida, em que o óleo é tratado com ácido, as gomas não hidratáveis são separadas do óleo triglicerídeo.

[005] A degomagem enzimática é realizada em óleos que sofreram degomagem aquosa assim como em óleos brutos. No processo de degomagem enzimática, os fosfolipídios são hidrolisados em uma reação catalisada por enzimas que têm atividade de fosfolipase e são, assim convertidos em componentes solúveis em água e extraíveis com água.

[006] Há dois tipos gerais de refino: Refino químico (também denominado refino com álcali) e Refino físico. O refino químico, que compreende tratamento do óleo com uma solução de álcali ou outra solução de refino, é realizado para reduzir o teor de ácido graxo livre e também removerá outras impurezas, tais como fosfolipídios, substâncias proteicas e mucilaginosas e compostos coloridos. Esse processo resulta em uma grande redução de ácidos graxos através de sua conversão em sabões de alta gravidade específica, que são removidos por centrifugação com alguma perda de óleo neutro. A maior parte dos fosfatídeos e substâncias mucilaginosas é solúvel no óleo apenas em uma forma anidra e, mediante hidratação com a soda cáustica ou outra solução de refino, são facilmente separados. Após o refino de álcali, a gordura ou óleo é lavado com água para remover sabão residual.

[007] Óleos com baixo teor de fosfolipídio (palma e coco) podem ser fisicamente refinados (isto é, extirpados por vapor) para remover ácidos graxos livres. No refino físico, os ácidos graxos livres em óleo bruto ou que passou por degomagem aquosa são removidos por evaporação em vez de serem neutralizados e removidos como sabão em um processo de refino alcalino.

[008] Embora a degomagem enzimática tenha se tomado recentemente mais difundida, a mesma nunca foi aceita pela indústria como um processo integrado com o refino químico. A preocupação tem sido que a

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3/79 produção de muito FFA podería levar ao aumento indesejado de formação de sabão no refino ou que a tecnologia de enzima poderia não ser compatível nas condições de pH no refino químico: No refino químico, o primeiro estágio é uma etapa de quelação ácida seguida por condições de alto pH a partir da adição alcalina. Portanto, o refino químico é tipicamente aplicado a óleo bruto ou, conforme mostrado na Figura 2 no presente documento, a óleo que foi submetido à degomagem aquosa e/ou à degomagem ácida. A pessoa versada também saberá que, em processos convencionais, o refino químico está associado à perda de rendimento considerável se as gomas hidratáveis e não hidratáveis não forem removidas antes da aplicação da soda cáustica ou outro agente (ou agentes) de refino.

[009] A despeito dos avanços recentes em degomagem e refino de óleo, há uma necessidade de fornecer métodos simplificados inovadores para degomagem e refino de óleo vegetal em que a perda de óleo seja minimizada. A presente invenção refere-se a tais métodos inovadores, a polipeptídeos inovadores que têm atividade de fosfolipase A, a polipeptídeos inovadores que têm atividade de fosfolipase Cea polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos.

Sumário da invenção [0010] [0010] Ao contrário do que se acreditava anteriormente, os inventores observaram que, ao refinar um óleo vegetal contendo fosfolipídios, vantagens consideráveis são fornecidas quando os fosfolipídios são submetidos a hidrólise enzimática e o óleo é subsequentemente submetido a refino químico sem separação de fase gomosa entre a hidrólise e a etapa de refino. Em particular, os inventores observaram um aumento de rendimento significativo em comparação a realizar refino químico em óleo bruto ou em óleo que foi submetido a degomagem aquosa.

[0011] Consequentemente, a presente invenção fornece em um primeiro aspecto um método para refinar um óleo vegetal contendo

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4/79 fosfolipídios que compreende submeter os fosfolipídios a hidrólise enzimática colocando-se o óleo vegetal em contato com uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio e, depois disso, submetendo-se o óleo vegetal a refino químico.

[0012] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se ao uso de uma enzima de degradação de fosfolipídio para hidrolisar fosfolipídios em um óleo vegetal, em que o óleo vegetal é colocado em contato com a enzima de degradação de fosfolipídio e, depois disso, submetido a refino químico.

[0013] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece um óleo vegetal refinado ou uma borra, que é obtenível ou é obtida pelo método de acordo com a invenção.

[0014] Em um quarto aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo isolado ou purificado que tem atividade de A selecionado dentre o grupo que consiste em:

a. Um polipeptídeo que tem pelo menos 75% de identidade de sequência, tal como pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 3 e 5,

b. Um polipeptídeo que tem pelo menos 75% de identidade de sequência, tal como pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 e 6;

c. Um fragmento do polipeptídeo de (a) ou (b) que tem atividade de fosfolipase A.

[0015] Em um quinto aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo

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5/79 isolado ou purificado que tem atividade de C selecionado dentre o grupo que consiste em:

i) Um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19,21,23, ii) Um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 20, 22, 24: e iii) Um fragmento do polipeptídeo de (a) ou (b) que tem atividade de fosfolipase C.

[0016] Em um sexto aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende o polipeptídeo de acordo com a invenção.

[0017] Em um sétimo aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado ou purificado que codifica o polipeptídeo da invenção.

[0018] Em um oitavo aspecto, a invenção refere-se a um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo da invenção, em que o polinucleotídeo é, de preferência, ligado de maneira funcional a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[0019] Em um nono aspecto, a invenção refere-se a uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo da invenção, ligado de maneira funcional a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo.

[0020] Em um décimo aspecto, a invenção fornece um método para produzir o polipeptídeo da invenção que compreende cultivar uma célula, que em sua forma do tipo selvagem, produz o polipeptídeo, sob condições apropriadas à produção do polipeptídeo.

[0021] Em um décimo primeiro aspecto, a invenção refere-se a um método para produzir um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A ou

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6/79 um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase C que compreende cultivar a célula hospedeira recombinante da invenção, sob condições apropriadas à produção do polipeptídeo.

Breve Descrição dos Desenhos [0022] O termo Lipr287 refere-se a PLC de Bacillus macauensis: Polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 [0023] A Figura 1 ilustra onde diferentes fosfolipases clivam um fosfolipídeo, bem como os quatro principais grupos funcionais de fosfolipídeos.

[0024] A Figure 2 ilustra processos para o tratamento de óleo vegetal, incluindo degomagem e refino.

[0025] A Figura 3 mostra a estimativa de rendimento após a centrifugação final. Polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 como prétratamento para degomagem alcalina; 70 °C, 1 hora de reação enzimática, 3% de água total, 1.141 ppm de NaOH total.

[0026] A Figura 4 mostra o teor de delta diglicerídeo. Polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 como pré-tratamento para degomagem alcalina; 0 °C, 1 hora de reação enzimática, 3% de água total, 1.141 ppm de NaOH total.

[0027] A Figura 5 mostra fosfolipídios intactos. Polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 como pré-tratamento para degomagem alcalina; 70 °C, 1 hora de reação enzimática, 3% de água total, 1.141 ppm de NaOH total.

[0028] A Figura 6 mostra fosfolipídios hidrolisados (todos os 4). Polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 como pré-tratamento para degomagem alcalina; 70 °C, 1 hora de reação enzimática, 3% de água total, 1.141 ppm de NaOH.

[0029] A Figura 7 mostra PC + PE hidrolisados. Polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 como pré-tratamento para degomagem alcalina; 70 °C, 1 hora de reação enzimática, 3% de água total, 1.141 ppm de NaOH total.

[0030] A Figura 8 mostra o teor total de fósforo após a centrifugação

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7/79 final. Polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 como pré-tratamento para degomagem alcalina; 70 °C, 1 hora de reação enzimática, 3% de água total, 1.141 ppm de NaOH total.

[0031] A Figura 9 mostra óleo total após a centrifugação final; 650 ppm de Ca, 2,5% de água total, 3.000 ppm de NaOH para tratamento alcalino a 70 °C.

[0032] A Figura 10 mostra o ganho de rendimento em comparação com o branco. 650 ppm de Ca, 2,5% de água total, 3.000 ppm de NaOH para tratamento alcalino a 70 °C em óleo com baixo teor de NHP (15 ppm de P).

[0033] A Figura 11 mostra o teor de FFA antes e depois tratamento alcalino; 650 ppm de Ca, 2,5% de água total, 3.000 ppm de NaOH para tratamento alcalino a 70 °C.

[0034] A Figura 12 mostra o teor de delta diglicerídeo; 650 ppm de Ca, 2,5% de água total, 3.000 ppm de NaOH para tratamento alcalino a 70 °C.

Descrição detalhada da invenção

Definições [0035] Álcali: No presente contexto, álcali refere-se de forma intercambiável a uma base que é solúvel em água e forma íons de hidróxido, tal como NaOH, KOH, carbonato de sódio, Ca(OH)2 e Mg(OH)2, e à solução de uma base em água.

[0036] Branqueamento: O termo branqueamento refere-se ao processo para remover substâncias que produzem cor e para purificar adicionalmente a gordura ou o óleo. Normalmente, o branqueamento é realizado após o óleo ter sido refinado.

[0037] Refino químico: No presente pedido, o termo refino químico” é usado como sinônimo de refino com álcali e refino alcalino; em que o termo também abrange refino cáustico e neutralização cáustica.

[0038] Oleo bruto: O termo “óleo bruto” refere-se a um óleo não refinado e não processado prensado ou extraído de uma fonte vegetal,

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8/79 incluindo, porém sem limitação, óleo de açaí, óleo de amêndoa, óleo de babaçu, óleo de semente de groselha negra, óleo de semente de borragem, óleo de canola, óleo de caju, óleo de rícino, óleo de coco, óleo de coentro, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de crambe, óleo de semente de linhaça, óleo de semente de uva, óleo de avelãs, óleo de semente de cânhamo, óleo de pinhão manso, óleo de jojoba, óleo de semente de linho, óleo de noz de macadâmia, óleo de caroço de manga, óleo de limnanto, óleo de mostarda, óleo de pata de boi, azeite, óleo de palma, óleo de palmiste, oleína de palma, óleo de amendoim, óleo de noz pecã, óleo de pinhão, óleo de pistacho, óleo de sementes de papoila, óleo de colza, óleo de farelo de arroz, óleo de cártamo, óleo de camélia sasanqua, óleo de sésamo, manteiga de karité, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de tall, óleo de camélia tsubaki, óleo de noz, variedades de óleos “naturais” possuindo composições de ácido graxo alteradas por meio de Organismos Geneticamente Modificados (OGM) ou de filiação tradicional como óleos com alto teor de ácido oleico, baixo teor de ácido linolênico ou pouco saturados (óleo de canola com alto teor de ácido oleico, óleo de soja com baixo teor de ácido linolênico ou óleos de girassol com alto teor de ácido esteárico). O termo também abrange uma mistura de diversos óleos não refinados e não processados prensados ou extraídos de fontes conforme definido acima.

[0039] Desodorização: Desodorização” é um processos de destilação por vapor a vácuo para o propósito de remover constituintes vestigiais que dão origem a sabores, cores e odores indesejáveis em gorduras e óleos. Normalmente, esse processo é realizado após o refino e o branqueamento.

[0040] Fracionamento: O fracionamento é o processo para separar triglicerídeos em gorduras e óleos pela diferença em pontos de fusão, solubilidade ou volatilidade. E mais comumente usado para separar gorduras que são sólidas à temperatura ambiente, mas também é usado para separar

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9/79 triglicerídeos encontrados em óleos líquidos.

[0041] Goma: No contexto da presente invenção, goma, gomas ou fração gomosa refere-se a uma fração enriquecida em fosfatídeos, que é separada do volume de óleo vegetal durante um processo de degomagem. As gomas consistem principalmente em fosfatídeos, mas também contêm óleo arrastado, contêm nitrogênio e açúcar e partículas de farelo.

[0042] Heterólogo: O termo heterólogo significa, em relação a uma célula hospedeira, que um polipeptídeo ou ácido nucleico não é de ocorrência natural em uma célula hospedeira. O termo heterólogo significa, em relação a um polipeptídeo ou ácido nucleico, que uma sequência de controle, por exemplo, promotor, ou domínio de um polipeptídeo ou ácido nucleico não está naturalmente associada ao polipeptídeo ou ácido nucleico, isto é, a sequência de controle é de um gene diferente do gene que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1.

[0043] Célula hospedeira: O termo célula hospedeira significa qualquer célula microbiana ou vegetal em que um construção de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção foi introduzido. Os métodos para introdução incluem, porém sem limitação, fusão de protoplasto, transfecção, transformação, eletroporação, conjugação e transdução. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira recombinante isolada que é parcial ou completamente separada de pelo menos um outro componente com, incluindo porém sem limitação, por exemplo, proteínas, ácidos nucleicos, células, etc.

[0044] Isolado: O termo isolado significa um polipeptídeo, ácido nucleico, célula ou outro material ou componente especificado que é separado de pelo menos um outro material ou componente com o qual o mesmo está naturalmente associado conforme encontrado na natureza, incluindo, porém sem limitação, por exemplo, outras proteínas, ácidos nucleicos, células, etc. Um polipeptídeo isolado inclui, porém sem limitação, um caldo de cultura

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10/79 contendo o polipeptídeo secretado.

[0045] Lisofosfolipase: Uma lisofosfolipase (EC 3.1.1.5) é uma enzima que pode hidrolisar 2-lisofosfolídeos para liberar ácido graxo.

[0046] A atividade de lisofosfolipase (LLU) pode ser medida com o uso de L-a-lisolecitina de gema de ovo como o substrato com um kit de ensaio NEFA C. 20 μΐ de amostra são misturados com 100 μΐ de tampão acetato de sódio 20 mM (pH 4,5) e 100 μΐ de solução de L-a-lisolecitina a 1% e incubados a 55 °C por 20 min. Após 20 min, a mistura de reação é transferida para o tubo contendo 30 μΐ de Solução A em kit NEFA préaquecido a 37 °C. Após 10 min de incubação a 37 °C, 600 μΐ de Solução B em kit NEFA são adicionados à mistura de reação e incubados a 37 °C por 10 min. A atividade é medida a 555 nm em um espectrofotômetro. Uma unidade de atividade de lisofosfolipase (1 LLU) é definida como a quantidade de enzima que pode aumentar ο A550 de 0,01 por minuto a 55 °C.

[0047] Polipeptídeo maduro: O termo polipeptídeo maduro significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação e remoção de peptídeos de sinalização, pró-peptídeos e pré-pró-peptídeos. Sabe-se na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. E também conhecido na técnica que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos diferentemente, e, assim, uma célula hospedeira que expressa um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (por exemplo, que tem um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com outra célula hospedeira expressando o mesmo polinucleotídeo.

[0048] Construto de ácido nucleico: O termo construto de ácido

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11/79 nucleico significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou é modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos de maneira que não existiría de outro modo na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0049] Operacionalmente ligado: O termo “ligado de maneira funcional” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência de codificação de um polinucleotídeo de modo que a sequência de controle direcione a expressão da sequência de codificação.

[0050] Atividade de fosfolipase A: No contexto da presente invenção, o termo atividade de fosfolipase A compreende enzimas que têm atividade de fosfolipase Al e/ou fosfolipase A2 (Al ou A2, EC 3.1.1.32 ou EC 3.1.1.4), isto é, atividade hidrolítica em relação a uma ou ambas as ligações de éster carboxílico em fosfolipídios, tal como lecitina. Uma fosfolipase que tem atividade tanto de Al quanto de A2 é denominada uma fosfolipase B.

[0051] Para os propósitos da presente invenção, a atividade de fosfolipase A é, de preferência, determinada de acordo com o seguinte procedimento:

Atividade de fosfolipase A (LEU) [0052] No ensaio de LEU, a atividade de fosfolipase A é determinada a partir da capacidade de hidrolisar lecitina em pH 8,0, 40 °C. A reação de hidrólise pode ser seguida por titulação com NaOH por um tempo de reação de 2 minutos. A fosfolipase de Fusarium oxysporum (LIPOPAN F) revelada no documento n² WO 1998/26057 tem uma atividade de 1.540 LEU/mg de proteína enzimática e pode ser usada como um padrão.

Ensaio de placa [0053] A) Tampões são uma mistura de HEPES 100 rnM e Citrato

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100 rnM com pH ajustado de pH 3,0 para pH 7,0.

[0054] B) 2% de Agarose (Litex HSA 1000) são preparados por mistura e cozimento em tampões (A)) por 5 minutos seguidos por resfriamento até aproximadamente 60 °C.

[0055] C) O substrato é L-alfa Fosfatidilcolina, 95% de Soja (Avanti 441601) dispersos em água (MilliQ) a 60 °C por 1 minuto com Ultra Turrax.

[0056] D) Soluções de enzimas purificadas de LECITASE ULTRA e a fosfolipase madura da SEQ ID NO: 2 foram diluídas até 0,4 mg/ml.

[0057] As placas são fundidas por mistura de 5 ml de substrato (C)) e 5 ml de Agarose (B)) misturados suavemente em placas de Petri com diâmetro de 7 cm e resfriadas até a temperatura ambiente antes de furos com um diâmetro de aproximadamente 3 mm serem perfurados por vácuo. Dez microlitros de enzima diluída (D)) são adicionados em cada poço antes de as placas serem vedadas por parafilme e colocadas em uma incubadora a 55 °C por 48 horas. As placas são retiradas para fotografia em intervalos regulares.

[0058] Atividade de fosfolipase: No contexto da presente invenção, o termo atividade de fosfolipase refere-se à catálise da hidrólise de um glicerofosfolipídio ou fosfolipídio à base de glicerol.

[0059] Condições que facilitam a hidrólise de fosfolipídios: A seleção das condições que facilitam a hidrólise de fosfolipídios por enzimas de degradação de fosfolipídio está dentro da habilidade de uma pessoa versada na técnica e inclui, por exemplo, ajustar pH e/ou temperatura em que a enzima de degradação de fosfolipídio é ativa.

[0060] Atividade de fosfolipase C: O termo “atividade de fosfolipase C” ou “atividade de PLC” refere-se a uma atividade enzimática que remove a porção química éster de fosfato de um fosfolipídeo para produzir um 1,2 diacilglicerol (consultar a Figura 1). A maioria das enzimas PLC pertence à família das hidrolases e fosfodiesterases e são, de modo geral, classificadas como EC 3.1.4.3, E.C. 3.1.4.11 ou EC 4.6.1.13. A atividade de fosfolipase C

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13/79 pode ser determinada de acordo com o procedimento descrito no seguinte ensaio de fosfolipase C:

[0061] Ensaio de atividade de fosfolipase C: Misturas de reação que compreendem 10 microl de uma solução de p-nitrofenil fosforila colina (pNPPC) 100 mM em tampão Borax-HCl 100 mM, pH 7,5 e 90 microl da solução de enzima são misturadas em um poço de placa de microtitulação à temperatura ambiente. A placa de microtitulação é, então, colocada em um leitor de placas de microtitulação e o p-nitrofenol liberado é quantificado por medição da absorbância a 410 nm. As medições são registradas durante 30 min em intervalos de 1 min. As curvas de calibração na faixa de 0,01 a 1 microl/ml de p-nitrofenol são preparadas diluindo-se uma solução de estoque de p-nitrofenol a 10 micromol/ml da Sigma em tampão Borax-HCl. Uma unidade liberará 1,0 micromol/minuto de p-NPPC à temperatura ambiente.

[0062] Especificidade de fosfolipase C: O termo “especificidade de fosfolipase C” refere-se a um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase C, em que a atividade é específica em relação a um ou mais fosfolipídeos, com os quatro mais importantes sendo fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA) e fosfatidil inositol (PI) (consultar a Figura 1). A especificidade de fosfolipase C pode ser determinada por RMN de ³¹P conforme descrito acima em relação ao termo atividade de fosfolipase.

[0063] Fosfolipase C específica para PC e PE: Os termos fosfolipase C específica para PC e PEC e fosfolipase C que tem especificidade para fosfatidil colina (PC) e fosfatidil etanolamina (PE) e polipeptídeo que tem atividade em relação à fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE) são usados de forma intercambiável. Os mesmos referem-se a um polipeptídeo que tem atividade em relação a fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE). Adicionalmente à especificidade para PC e PE, a mesma pode também ter alguma atividade em relação a ácido fosfatídico (PA) e fosfatidil inositol (PI). De preferência, uma fosfolipase C

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14/79 específica para PC e PE remove pelo menos 30% de PC e pelo menos 30% de PE de um óleo ou gordura com pelo menos 100 ppm de PC e 100 ppm de PE ao usar o ensaio P-NMR do Exemplo 1 com o pH ideal da enzima e uma dosagem de enzima de 10 mg/kg. Mais preferencialmente, remove 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%, ainda mais preferencialmente, remove 90% e, com máxima preferência, remove entre 90% e 100% de PC no óleo ou gordura e 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%, ainda mais preferencialmente, remove 90% e, com máxima preferência, remove entre 90% e 100% de PE no óleo ou gordura.

[0064] Fosfolipase C específica para PI: Os termos fosfolipase C específica para PI, fosfolipase C fosfatidilinositol e polipeptídeo que tem atividade em relação a fosfatidilinositol (PI) são usados de forma intercambiável. Os mesmos referem-se a um polipeptídeo que tem atividade em relação a fosfatidilinositol (PI), significando que a sua atividade em relação a fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA) é baixa em comparação com a atividade de PI. As enzimas fosfolipase C específicas para PI podem pertencer à família das hidrolases e fosfodiesterases classificadas como EC 3.1.4.11 ou à família das liases classificadas como EC 4.6.1.13. A atividade de fosfolipase C específica para PI pode ser determinada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo

5. De preferência, uma fosfolipase C específica para PI remove pelo menos 30% de PI de um óleo ou gordura com pelo menos 50 ppm de PI ao usar o ensaio P-NMR do Exemplo 1 com o pH ideal da enzima e uma dosagem de enzimas de 10 mg/kg. Mais preferencialmente, remove 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%, ainda mais preferencialmente, remove 90% e, com máxima preferência, remove entre 90% e 100% de PI no óleo ou gordura.

[0065] De preferência, uma fosfolipase C específica para PI remove pelo menos 20% mais PI em comparação com a quantidade de PC, PE ou PA que pode remover, mais preferencialmente, pelo menos 30%, 40%, ainda mais

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15/79 preferencialmente, pelo menos 50% e, com máxima preferência, pelo menos 60% mais PI em comparação com a quantidade de PC, PE ou PA que pode remover.

[0066] Fosfolipase C específica para PC, PE, PA e PI: Os termos fosfolipase C específica para PC, PE, PA e PI e polipeptídeo que tem atividade em relação a fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanoamina (PE), ácido fosfatídico (PA) e fosfatidilinositol (PI) são usados de forma intercambiável. Os mesmos referem-se a um polipeptídeo que tem atividade em relação a fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanoamina (PE), ácido fosfatídico (PA) e fosfatidil inositol (PI). De preferência, uma fosfolipase C específica para PC, PE, PA e PI remove pelo menos 30% de cada uma das quatro espécies de fosfolipídio de um óleo ou gordura com pelo menos 100 ppm de PC, 75 ppm de PE, 5ppm de PA e 50 ppm de PI ao usar o ensaio de RMN de P do Exemplo 1 no pH ideal da enzima e uma dosagem de enzima de 10 mg/kg. Mais preferencialmente, remove 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%, ainda mais preferencialmente, remove 90% e, com máxima preferência, remove entre 90% e 100% de PC no óleo ou gordura e 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%, ainda mais preferencialmente, remove 90% e, com máxima preferência, remove entre 90% e 100% de PE no óleo ou gordura.

[0067] Purificado: O termo purificado significa um ácido nucleico ou polipeptídeo que é substancialmente isento de outros componentes com os quais está associado na natureza, conforme determinado por técnicas analíticas bem conhecidas na técnica (por exemplo, um polipeptídeo ou ácido nucleico purificado por formar uma banda discreta em um gel eletroforético, eluado cromatográfico e/ou um meio submetido a centrifugação por gradiente de densidade). Um ácido nucleico ou polipeptídeo purificado é pelos menos cerca de 50% puro, usualmente, pelo menos cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%,

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16/79 cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 99,5%, cerca de 99,6%, cerca de 99,7%, cerca de 99,8% ou mais puro (por exemplo, por cento em peso em uma base molar). Em um sentido relacionado, uma composição é enriquecida por uma molécula quando há um aumento substancial na concentração da molécula após a aplicação de uma técnica de purificação ou enriquecimento. O termo enriquecido refere-se a um composto, polipeptídeo, célula, ácido nucleico, aminoácido ou outro material ou componente especificado que esteja presente em uma composição em uma concentração relativa ou absoluta que seja maior que uma composição inicial. [0068] Recombinante: O termo recombinante, quando usado em referência a uma célula, ácido nucleico, proteína ou vetor em questão, indica que o sujeito foi modificado de seu estado nativo. Assim, por exemplo, as células recombinantes expressam genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos em diferentes níveis ou sob diferentes condições em relação ao encontrado na natureza. Os ácidos nucleicos recombinantes diferem-se de uma sequência nativa por um ou mais nucleotídeos e/ou são ligados de maneira funcional a sequências heterólogas, por exemplo, um promotor heterólogo em um vetor de expressão. As proteínas recombinantes podem se diferir de uma sequência nativa por um ou mais aminoácidos e/ou são fundidas a sequências heterólogas. Um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo é um vetor recombinante. O termo recombinante” é sinônimo de geneticamente modificado e transgênico.

[0069] Taxa de reação: Para os propósitos da presente invenção, taxa de reação” é sinônimo de taxa da reação e é definido de acordo com a IUPAC, Compendium of Chemical Terminology, 2- edição (o Gold Book) (1997): Rate of reaction.

[0070] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo

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17/79 parâmetro “identidade de sequência”.

[0071] Para os propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada como o resultado de “identidade mais longa” com o uso do algoritmo de NeedlemanWunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277), de preferência, versão 6.6.0 ou posterior. Os parâmetros usados são uma penalidade de abertura de lacuna de 10, uma penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). A fim de que o programa de Needle relate a identidade mais longa, a opção -nobrief precisa ser especificada na linha de comando. A saída de Needle identificada como identificada mais longa” é calculada conforme segue:

[0072] (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento Número Total de Lacunas no Alinhamento).

[0073] Borra: Nos presentes contextos, borra refere-se a uma fração contendo sabões, que é separada do volume de óleo vegetal durante um processo de refino químico. Os sabões são formados por reação de um produto químico de refino, tal como alcalino, com ácidos graxos livres presentes no óleo vegetal. A composição exata das borras depende da fonte de óleo vegetal da qual as mesmas são obtidas; borra de semente de algodão, por exemplo, mostrou ser principalmente composta por hidratação e solvente, ácidos graxos, fosfatos orgânicos, monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos, esteróis, poliálcoois, carboidratos e outros componentes variados. A maior parte dessas classes de compostos orgânicos é encontrada em borras de outros óleos vegetais.

[0074] Quantidade estequiométrica: O termo quantidade estequiométrica significa, efetivamente, a medida de quantidade necessária

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18/79 para estequiometria; isto é, a quantidade ideal em que, assumindo-se que a reação prossegue até a conclusão, todo o reagente é consumido, não há deficiência do reagente e não há excesso do reagente.

[0075] No contexto da invenção, quantidade estequiométrica referese em particular ao número de moles de um reagente (por exemplo, álcali, tal como NaOH) adicionado a uma mistura de reação, que é igual ao número de moles dos compostos (por exemplo, ácidos graxos livres e/ou ácido adicionado como agente quelante de cálcio, tal como ácido cítrico) com o qual o reagente reage na dita mistura de reação.

[0076] Degomagem aquosa: O termo degomagem aquosa refere-se a um processo que envolve tratar óleo bruto com uma quantidade de água para hidratar os fosfolipídios presentes no óleo e toma os mesmos separáveis por centrifugação.

[0077] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um método para refinar um óleo vegetal contendo fosfolipídios que compreende submeter os fosfolipídios a hidrólise enzimática colocando-se o óleo vegetal em contato com uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio sob condições que facilitar a hidrólise de fosfolipídios, submetendo, depois disso, o óleo vegetal a refino químico.

[0078] Nas modalidades preferenciais da invenção, há pouca ou nenhuma separação dos produtos de reação da hidrólise enzimática do óleo, antes do dito refino químico. Portanto, a hidrólise enzimática dos fosfolipídios pode ser realizada em um primeiro vaso de reação e o refino químico pode ser realizado em um segundo vaso de reação, em que os dois vasos de reação são conectados de modo fluido e/ou são conectados de modo a permitir a passagem de líquido do primeiro para o segundo vaso de reação.

[0079] Em outras modalidades preferenciais, a hidrólise enzimática dos fosfolipídios e o refino químico são realizados no mesmo vaso. Ou seja, a hidrólise enzimática dos fosfolipídios é realizada em um vaso de reação, e o

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19/79 refino químico é realizado após a hidrólise enzimática, no mesmo vaso de reação. Tais modalidades evita a necessidade de transferir o conteúdo de um primeiro vaso de reação para um segundo vaso de reação, já que ambas as reações ocorrem em um e no mesmo vaso de reação.

[0080] Em outras modalidades, o refino químico é realizado simultaneamente com ou subsequentemente à hidrólise enzimática, de preferência, subsequentemente à hidrólise enzimática.

[0081] O método da invenção pode ser realizado como um processo em batelada ou um processo contínuo. Assim, o processo pode se ajustar à configuração de processo existente seja uma operação a batelada ou o processo contínuo típico usado na indústria. Uma modalidade particular refere-se ao método de acordo com a invenção em que o refino químico é realizado imediatamente após a hidrólise enzimática; de preferência, em uma operação de processo contínuo.

[0082] Deve-se entender, ainda, que a hidrólise enzimática dos fosfolipídios pode ser realizada em um primeiro vaso de reação e o refino químico pode ser realizado em um segundo vaso de reação, em que a conexão fluida entre os vasos de reação ou a passagem de líquido do primeiro para o segundo vaso de reação não é por meio de um dispositivo de separação, tal como uma centrífuga.

[0083] Em algumas modalidades, o método de acordo com a invenção é aquele em que a hidrólise enzimática é realizada em uma mistura de reação que compreende uma fase pesada ou uma fase aquosa e uma fase leve ou uma fase oleosa/fase hidrofóbica e não há redução ou não há redução substancial do volume de fase pesada ou separação de gomas/fase pesada do óleo antes do dito refino químico.

[0084] Na degomagem convencional, as duas fases são misturadas,

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20/79 por exemplo, com o uso de um misturador de alto cisalhamento, e uma emulsão é criada, na emulsão, a enzima reage com os fosfolipídios para produzir produtos de reação solúveis em água. A emulsão é quebrada, por exemplo, por centrifugação, separando os produtos de reação solúveis em água do óleo. O método de acordo com a invenção, de preferência, não inclui qualquer etapa para separar a fase pesada/fase aquosa ou parte da mesma contendo produtos de reação solúveis em água, da fase leve, fase oleosa ou fase hidrofóbica.

[0085] De preferência, a hidrólise enzimática é realizada colocando-se o dito óleo vegetal em contato com uma ou mais enzimas que têm atividade de fosfolipase.

O método de acordo com a invenção pode compreender

i) Fornecer uma mistura de reação que compreende o dito óleo vegetal e uma ou mais enzimas que têm atividade de degradação de fosfolipídio, tal como uma mistura de reação que compreende uma fase pesada, ou fase aquosa, e uma fase leve, ou fase oleosa/fase hidrofóbica;

ii) Submeter a mistura de reação a condições que permitem a hidrólise enzimática de fosfolipídios no óleo, para fornecer uma mistura reagida do dito óleo vegetal; e iii) Submeter a mistura reagida do dito óleo vegetal a refino químico.

[0086] O método de acordo com a invenção pode compreender, ainda, submeter o óleo vegetal a degomagem aquosa antes de colocar o mesmo em contato com a uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio.

[0087] Em outras modalidades, o óleo vegetal é selecionado dentre o grupo que consiste em óleo de açaí, óleo de amêndoa, óleo de babaçu, óleo de semente de groselha negra, óleo de semente de borragem, óleo de canola, óleo de caju, óleo de rícino, óleo de coco, óleo de coentro, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de crambe, óleo de semente de linho, óleo de

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21/79 semente de uva, óleo de avelã, óleo de semente de cânhamo, óleo de pinhão manso, óleo de jojoba, óleo de linhaça, óleo de noz macadâmia, óleo de caroço de manga, óleo de limnanto, óleo de mostarda, óleo de pé de boi, azeite de oliva, óleo de palma, óleo de caroço de palma, oleína de palma, óleo de amendoim, óleo de noz pecã, óleo de pinhão, óleo de pistache, óleo de semente de papoula, óleo de semente de colza, óleo de farelo de arroz, óleo de girassol, óleo de sasanqua, óleo de gergelim, manteiga de karité, óleo de soja, óleo de semente de girassol, resina líquida, óleo de tsubaki e óleo de noz.

[0088] Em modalidades preferenciais da invenção, o óleo vegetal é selecionado dentre o grupo que consiste em óleo de semente de colza, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de palma, óleo de coco, óleo de farelo de arroz e óleo de amendoim. Esses óleos vegetais são, de um ponto de vista comercial, considerados importantes visto que são abundantes e grandes volumes do óleo são processados para atender as preferências dos consumidores por óleo de cozinha com cor muito suave ou são usados como matéria-prima para a produção de biocombustível.

[0089] Em algumas das modalidades da invenção, o óleo vegetal, que está em contato com uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio, é um óleo vegetal bruto.

[0090] O método de acordo com a invenção pode compreender colocar o óleo vegetal em contato com um ou mais agentes de quelação com capacidade para formar complexos de íons de Ca e/ou Mg antes de colocar o mesmo em contato com a uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio. Os agentes de quelação adequados podem ser selecionados dentre o grupo que consiste em ácido cítrico, ácido fosfórico, ácido láctico e ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA).

[0091] A mistura de reação pode ter um pH que está na faixa de 1,5 a

7. Como a pessoa versada entenderá, os requisitos para ajuste de pH dependem do requisito da enzima (ou enzimas) usada e das quantidades de

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22/79 qualquer agente quelante que foi adicionado. Em particular, o pH podem estar dentro da faixa de 3 a 7, tal como 3,5 a 6,6, dentro da faixa de 3 a 5, tal como

3,5 a 4,5 ou dentro da faixa de 5 a 7, tal como 4,5 a 6,5.

[0092] Em uma modalidade, o pH é ajustado por adição de base, por exemplo, por adição de NaOH, KOH, carbonato de sódio ou combinações dos mesmos. Em modalidades particulares, a quantidade de equivalentes de base usados para neutralizar o ácido do pré-tratamento está na faixa de 1,2 a 7 equivalentes, tal como de 1,5 a 6, 1,5 a 5 equivalentes; ou, por exemplo, 2 a 7, 3 a 7 ou tal como 3 a 7 ou 3 a 5 equivalentes ao ácido; mais particularmente, a uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio compreendem ou consistem em SEQ ID NO. lie SEQ ID NO: 13.

[0093] No método de acordo com a invenção, a mistura de reação tem um teor de água na faixa de 0,5 a 10% (p/p), tal como na faixa de 1 a 10% (p/p), na faixa de 1 a 5% (p/p), tal como na faixa de 0,5 a 5% (p/p), tal como um teor de água de 5% (p/p) ou menos, tal como um teor de água de 4% ou menos ou tal como um teor de água de 3% ou menos.

[0094] O óleo vegetal é colocado em contato com a uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio a uma temperatura, que está na faixa de 45 a 90 °C, tal como na faixa de 50 a 90 °C, 60 a 90 °C, 60 a 80 °C, 65 a 75 °C ou tal como 65 a 75 °C.

[0095] A hidrólise enzimática dos fosfolipídios pode ter uma duração de 6 horas ou menos, tal como 4 horas ou menos, tal como uma duração de 0,5 a 6 horas ou 0,5 a 4 horas, ou tal como duração de 5 minutos a 4 horas, tal como 5 minutos a 2 horas, 5 minutos a 1 hora ou tal como 5 a 30 minutos.

[0096] A uma ou mais enzimas que têm atividade de degradação de fosfolipídio podem ser dosadas em uma quantidade total correspondente a 0,1 a 30 mg de proteína enzimática.

[0097] No método de acordo com a invenção, o óleo vegetal é, de preferência, colocado em contato com uma ou mais enzimas de degradação de

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23/79 fosfolipídio sob condições de modo que o número de moléculas de fosfolipídio intactas seja reduzido em 30 a 100%, tal como em 30 a 90%, 30 a 80%, 30 a 70% ou tal como em 30 a 60% durante a hidrólise enzimática. A porcentagem de moléculas de fosfolipídio intactas pode ser determinada pela porcentagem de fosfatidilcolina (PC) +, fosfatidiletanoamina (PE) + fosfatidilinositol (PI)) + ácido fosfatídico (PA (PC+PE+PI+PA) presente após a reação em relação ao teor de PC+PE+PI+PA no óleo antes da reação. O teor dos fosfolipídios pode ser determinado por análise por RMN de ³¹P ou por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS). Em algumas modalidades, o óleo vegetal é colocado em contato com uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio sob condições de modo que a reação enzimática resulte em uma redução de pelo menos 10% no teor de PC+PE+PI+PA no óleo, tal como pelo menos 25%, ou pelo menos uma redução de 40% no teor de PC+PE+PI+PA no óleo. Deve-se entender que o benefício em termos de rendimento aumentado fornecido pelo processo da invenção não exige uma hidrólise completa ou quase completa dos fosfolipídios; mesmo uma hidrólise parcial dos fosfolipídios presentes no óleo melhorará o rendimento de óleo e a facilidade de separação da fase de sabão após o refino químico.

[0098] E preferencial que o óleo vegetal, quando foi submetido a refino químico de acordo com o método da invenção, contenha fosfolipídios em quantidades correspondentes a 20 ppm de fósforo ou menos, tal como 15 ppm ou menos, tal como 10 ppm ou menos ou tal como 5 ppm ou menos. De preferência, as quantidades de fosfolipídios são determinadas de acordo com o Método Oficial AOCS Ca 20-99 (2009), Análise para Fósforo em Óleo por Espectroscopia de Emissão Óptica por Plasma Indutivamente Acoplado (ICPOES), Métodos Oficiais e Práticas Recomendadas do AOCS, AOCS Press, Champaign IL. Orientação adicional sobre como determinar as quantidades de fósforo no óleo é fornecida em Z. Benzo et al.: Determination of phosphorus

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24/79 in edible oils by inductively coupled plasma—Atomic emission spectrometry and oil-in-water emulsion of sample introduction, Journal of the American Oil Chemists' Society, dezembro de 2000, Volume 77, Edição 9, páginas 997 a 1.000.

[0099] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o óleo vegetal e a dita uma ou mais enzimas que têm atividade de degradação de fosfolipídio são incubados por 0,1 a 6 horas, tal como, por exemplo, 0,25 a 6 horas ou, por exemplo, 0,5 a 6 horas sob um conjunto de condições que compreendem

a) Uma temperatura na faixa de 45 a 90 °C ou tal como na faixa de 60 a 80 °C;

b) Um pH na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 12,0, tal como na faixa de 1,5 a 7,0, na faixa de pH 4 a 7, na faixa de 3 a 6, na faixa de 6 a 9 ou na faixa de pH 7 a 12.

c) Agitação ou mistura, tal como por mistura por cisalhamento, mistura por alto cisalhamento, mistura por cavitação ou ultrassom.

[00100] Em modalidades preferenciais da invenção, o refino químico é realizado subsequentemente à hidrólise enzimática. Em outras modalidades preferenciais, o refino químico é realizado imediatamente antes da hidrólise enzimática, sem etapas intermediárias de separação. Conforme mencionado acima, a etapa de refino químico pode ser realizada no mesmo vaso de reação em que a hidrólise enzimática foi realizada.

[00101] O refino químico, quando realizado de acordo com a invenção, pode compreender o fornecimento de uma mistura por adição do óleo vegetal com álcali, tal como uma mistura por adição da mistura reagida do dito óleo vegetal, conforme definido acima, com álcali.

[00102] O álcali é, de preferência, dosado em quantidades que são maiores do que quantidades estequiométricas em relação às quantidades de

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25/79 ácidos graxos livres presentes no óleo. Como a pessoa versada entenderá no contexto da presente revelação, a quantidade de álcali dosado no processo é, de preferência, maior que a quantidade que é suficiente para neutralizar os ácidos graxos livres e qualquer agente quelante, tal como ácido cítrico, láctico ou fosfórico.

[00103] Em particular, o álcali pode ser selecionado dentre NaOH, KOH, carbonato de sódio e combinações dos mesmos.

[00104] Os inventores mostraram que, surpreendentemente, a relação entre as quantidades de álcali usadas para neutralizar qualquer pré-tratamento ácido e a quantidade de álcali dosada no refino químico pode ter um efeito benéfico sobre a redução de fósforo e teor de ácido FFA na amostra final (consultar o Exemplo 12). Consequentemente, as modalidades particulares da invenção referem-se a métodos de acordo com a invenção em que a quantidade de álcali adicionado no refino químico constitui pelo menos 60% da quantidade total de álcali adicionado no método (isto é, o álcali adicionado após o pré-tratamento ácido a fim de ajustar o pH antes da hidrólise enzimática, juntamente com o álcali adicionado para o refino químico); de preferência, a dita quantidade de álcali adicionado na etapa de refino alcalino está na faixa de 60 a 90%, tal como de 60 a 85%, 60 a 80%, 60 a 78% ou, por exemplo, de 62 a 76%.

[00105] Altemativamente, a invenção pode ser descrita como em que a quantidade de álcali (por exemplo, NaOH) adicionado na etapa de ajuste de pH após o pré-tratamento ácido constitui no máximo 40% da quantidade total de álcali (isto é, o álcali adicionado após o pré-tratamento ácido a fim de ajustar o pH antes da hidrólise enzimática, juntamente com o álcali adicionado para o refino químico); de preferência, a dita quantidade de base adicionada na etapa de ajuste de pH está na faixa de 10 a 40%, tal como de 15 a 40%, 20 a 40%, tal como 40 a 22% ou, por exemplo, de 24% a 48%.

[00106] No processo de acordo com a invenção, a mistura por adição

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26/79 do dito óleo vegetal e do dito álcali é, de preferência, incubada de 1 minuto a 8 horas, tal como de 1 minuto a 5 horas, de 1 minuto a 2 horas, de 5 minutos a 8 horas, de 5 minutos a 5 horas, de 5 minutos a 2 horas, de 10 minutos a 5 horas, de 10 minutos a 2 horas, de 20 minutos a 5 horas ou de 20 minutos a 2 horas.

[00107] Os inventores mostraram surpreendentemente que a introdução de outra etapa de acidificação, realizada após a hidrólise enzimática e antes do refino químico pode reduzir a quantidade de fósforo na amostra final após a degomagem (consultar o Exemplo 14). Assim, algumas modalidades referemse ao método de acordo com a invenção que compreende, ainda, uma etapa de acidificação, realizada após a hidrólise enzimática e antes do refino químico.

[00108] As modalidades particulares da invenção refere-se a quando a quantidade de equivalentes de base usada para neutralizar o ácido do prétratamento está na faixa de 0,5 a 7 equivalentes, tal como 0,5 a 6, 0,5 a 5 ou tal como 1,2 a 7 equivalentes, tal como de 1,5 a 6, 1,5 a 5 equivalentes; ou, por exemplo, 2 a 7, 3 a 7 ou tal como 3 a 7 ou 3 a 5 equivalentes ao ácido, e o método compreende uma etapa de acidificação adicional, conforme descrito.

[00109] Em modalidades particulares da invenção que compreendem a etapa de acidificação adicional, a uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio compreendem ou consistem na SEQ ID NO. 11 e na SEQ ID NO:

13.

[00110] O refino químico, conforme realizado de acordo com a invenção, de preferência, compreende separar gomas e/ou borra do óleo.

[00111] Consequentemente, o método da invenção pode compreender transferir a mistura por adição de óleo vegetal e um produto químico, tal como a mistura por adição da mistura reagida do dito óleo vegetal e um produto químico, a um separador, de preferência um separador por centrifugação ou um assentador horizontal.

[00112] Na indústria, o refino químico é, de modo geral, realizado com

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27/79 o uso dos processos assim chamados Mistura Longa ou Mistura Curta ou variações dos mesmos. No processo de Mistura Longa, um excesso relativamente grande de soda cáustica é misturado no óleo a uma temperatura relativamente baixa (por exemplo, 20 a 40 °C), em que um tempo de retenção com agitação de 3 a 6 minutos é introduzindo, mediante o qual a mistura de óleo/sabão é quebrada por aquecimento da mesma a 60 a 80 °C. A mistura é, então, alimentada a um separador; por exemplo, um separador por centrifugação, e a corrente de óleo que deixa a centrífuga é aquecida, lavada com água e seca; por exemplo, em um secador por aspersão a vácuo. No processo de Mistura Curta, um excesso relativamente pequeno de álcali é adicionado ao óleo, mediante o qual a mistura é alimentada quase imediatamente ao separador; por exemplo, um separador por centrifugação, lavada com água e seca.

[00113] Em ambos os processos, o óleo pode ser subsequentemente branqueado para remover compostos coloridos e desodorizado para remover compostos voláteis de odor e sabor.

[00114] Portanto, em modalidades particulares, o método de acordo com a invenção compreende

i) Misturar por adição o óleo vegetal ou a mistura reagida, conforme definido acima no presente documento, com álcali a uma temperatura de 20 a 90 °C, por exemplo, 20 a 80 °C, tal como 20 a 40 °C, em que as quantidades de álcali são maiores que as quantidades estequiométricas, ii) Incubar a mistura por adição de óleo vegetal e álcali ou a mistura por adição de mistura reagida e álcali a uma temperatura de 20 a 80 °C, tal como de 20 a 40 °C, por 2 a 15 minutos com agitação;

iii) Aumentar a temperatura da mistura por adição até 55 a 95 °C, tal como até 55 a 85 °C; e iv) Quando uma temperatura de 55 a 95 °C, tal como 55 a 85 °C, tiver sido atingida, alimentar a mistura por adição a um separador para

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28/79 separar gomas e/ou borra do óleo.

[00115] Em modalidades alternativas da invenção, o método compreende [00116] i) Misturar por adição o óleo vegetal ou a mistura reagida , conforme definido acima, com álcali, em que as quantidades de álcali são maiores que quantidades estequiométricas.

[00117] ii) Alimentar a mistura por adição de óleo vegetal, ácido e álcali ou a mistura por adição de mistura reagida, ácido e álcali a um separador para separar gomas e/ou borra do óleo.

[00118] Os processos de Mistura Curta e Mistura Longa para refino cáustico são revelados, por exemplo, em: A.J. Dijkstra: Degumming, Refining, Washing and Drying Fats and Oils; in Proceedings of the World Conference on Oilseed Technology and Utilization (1992), Budapest, Hungary; T. H. Applewhite (ed); páginas 138 a 151; e em: Lipid Handbook,

3- Edição; F.D. Gunstone, J.L. Harwood, A.J. Dijkstra (Eds.), CRC Press, Taylor & Francis Group, 6000 Broken Sound Parkway NW, Suite 300, Boca Raton, FL 33487-2742, © 2007 by Taylor & Francis Group, LLC; consultar o capítulo 3: Production and refining of oils and fats, A.J. Dijkstra e J.C. Segers: o processo de Mistura Longa é descrito na página 193, o processo de Mistura Curta é descrito na página 195.:

[00119] O refino cáustico com o uso de equipamento pressurizado com o uso do Processo de Nanoneutralização é revelado em www.nanoneutralization.com.

[00120] A dita uma ou mais enzimas que têm atividade de degradação de fosfolipídio podem compreender uma enzima que tem atividade de fosfolipase A, uma enzima que tem atividade de fosfolipase C, uma lisofosfolipase ou uma mistura das mesmas.

[00121] São conhecidos vários tipos de fosfolipases que diferem na sua especificidade de acordo com a posição da ligação atacada na molécula de

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29/79 fosfolipídeo. A fosfolipase Al (PLA1) remove o ácido graxo da posição 1 para produzir ácido graxo livre e l-liso-2-acilfosfolipídeo. A fosfolipase A2 (PLA2) remove o ácido graxo da posição 2 para produzir ácido graxo livre e l-acil-2-lisofosfolipídeo. O termo fosfolipase B (PLB) é usado para fosfolipases que têm atividade de Al e A2. A fosfolipase C (PLC) remove a porção química fosfato para produzir 1,2-diacilglicerol e éster de fosfato. A fosfolipase D (PLD) produz 1,2-diacilglicero-fosfato e grupo base (consultar a Figura 1).

[00122] Para uma análise sobre degomagem enzimática, consultar Dijkstra 2010 Eur. J. Lipid Sei. Technol. 112, 1.178. O uso de fosfolipase A e/ou fosfolipase C na degomagem é, por exemplo, descrito em Clausen 2001 Eur J Lipid Sei Techno 103 333-340, WO 2003/089620 e WO 2008/094847. As soluções de fosfolipase A geram lisofosfolipídeos e ácidos graxos livres, resultando em perda de óleo. A fosfolipase C, por outro lado, tem a vantagem de produzir diglicerídeos (Figura 2) que permanecerão no óleo e, portanto, reduzirão as perdas. Há quatro fosfolipídeos principais no óleo vegetal: fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA) e fosfatidil inositol (PI). As enzimas fosfolipase C têm especificidade diferente em relação a esses fosfolipídeos. Uma fosfolipase C comercialmente disponível é Purifine de Verenium/DSM (Dijkstra, 101 st AOCS Annual Meeting 10. maio de 2010) que tem especificidade em relação a PC e PE. O documento n- WO07/059927 descreve uma PLC de Bacillus termoestável para degomagem. O documento n- WO 2012/062817 descreve uma PLC fúngica com especificidade em relação a todos os quatro fosfolipídeos.

[00123] Para o propósito da presente invenção, pode ser preferencial que a enzima ou enzimas que têm atividade de degradação de fosfolipase incluem uma PLC: Além do aumento de rendimento observado pelos inventores, é também de relevância que a hidrólise de fosfolipídios por PLC não leve à formação de ácido graxos livres. Em geral, é desejado que a

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30/79 produção de ácidos graxos livres seja minimizada durante o processamento de óleo vegetal.

[00124] No contexto da presente invenção, foi observado que o ganho de rendimento é, de modo geral, reduzido ao usar um PLA para hidrolisar os fosfolipídios antes do refino químico, em comparação com o uso de PLC. Entretanto, os benefícios adicionais do processo de acordo com a presente invenção, que inclui níveis mais baixos de fosfolipídios na borra resultante e uma viscosidade mais baixa da borra, são também atingidos com o uso de uma PLA. Em certas modalidades da invenção, uma lisofosfolipase pode ser preferencial visto que a mesma converte Liso-fosfolipídios emulsificantes e compostos não emulsificantes.

[00125] Em relação ao método da invenção, a uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio podem ter uma ou mais das seguintes propriedades:

i) Uma temperatura de dissociação (Td) na faixa de 50 a 95 °C, por exemplo, 60 a 95 °C, 70 a 95 °C, tal como na faixa de 70 a 90 °C;

ii) Um pH ideal na faixa de pH 3 a 12, tal como na faixa de pH 4 a 7 ou tal como um pH na faixa de 3 a 6, por exemplo, 3,5 a 6 ou 4 a 6, ou tal como um pH na faixa de 5 a 9, por exemplo, 6 a 9 ou 6 a 8, ou tal como na faixa de pH 7 a 12, por exemplo, 8al2ou8al0;

[00126] De preferência, a uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio têm uma taxa de reação em relação aos fosfolipídios em um óleo vegetal ao qual um ou mais agentes de quelação com capacidade para formar complexo de íons de Ca e/ou Mg foram adicionados, em que a dita taxa de reação é pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% pelo menos 80% ou tal como pelo menos 90% da taxa de reação da uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio em relação aos fosfolipídios no dito óleo vegetal ao qual nenhum agente de quelação foi adicionado. Conforme apresentado acima, os agentes de

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31/79 quelação adequados podem ser selecionados dentre o grupo que consiste em ácido cítrico, ácido fosfórico, ácido láctico e EDTA. Nessas modalidades, o óleo vegetal é, de preferência, óleo de soja bruto e o agente quelante é, de preferência, ácido cítrico, adicionado em quantidades correspondentes a 500 a 1.000 ppm, tal como 650 ppm.

[00127] A uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio pode, em particular, ser selecionadas dentre o grupo que consiste em:

a. Uma fosfolipase C que tem especificidade para Fosfatidilinositol (PI),

b. Uma fosfolipase C que tem especificidade para fosfatidil colina (PC) e fosfatidil etanolamina (PE), de preferência, PLC de Bacillus macauensis, SEQ ID NO. 9

c. Uma fosfolipase C que tem especificidade para fosfatidil colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE) ácido fosfatídico (PA) e fosfatidilinositol (PI),

d. Uma combinação de uma fosfolipase A e uma fosfolipase C, tal como uma fosfolipase C conforme definido em a) ou b),

e. Uma combinação de uma fosfolipase A e uma lisofosfolipase.

f. Uma fosfolipase A,

g. Uma combinação de a) e b) ou combinações das mesmas.

[00128] Em modalidades específicas da invenção, a fosfolipase A é selecionada dentre o grupo que consiste em:

a. Um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência, tal como pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência com o

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32/79 polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4 e 7

b. Um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência, tal como pelo menos 75% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 5 e 8;

[00129] Em outras modalidades específicas da invenção, a fosfolipase A é selecionada dentre o grupo de PLAs comercialmente disponíveis, incluindo PLA Lecitase® 10L, Lecitase® Novo, Lecitase® Ultra e Quara® LowP, todos disponíveis junto à Novozymes A/S, e GumZyme™ disponível junto à DSM, Óleo LysoMax® disponível junto à DuPont, e ROHALASE® PL-XTRA e ROHALASE® mpl, disponíveis junto à AB Enzymes.

[00130] De preferência, os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% da atividade de fosfolipase A do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 e/ou do polipeptídeo da SEQ ID NO: 3.

[00131] Em modalidades particulares de acordo com a invenção, uma dentre a dita uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio é uma variante do polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4 e 7 ou é uma variante do polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 5 e 8 que compreende uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção em uma ou mais posições.

[00132] Em particular, a dita variante pode compreender uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção em não mais que 20 posições, tal

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33/79 como em não mais que 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 posições.

[00133] Em outras modalidades, uma dentre a dita uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio compreende, consiste essencialmente ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 5 e 8.

[00134] No método de acordo com a invenção, a dita fosfolipase C pode ser selecionada dentre o grupo que consiste em:

a. Um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência, tal como pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 9 (PLC de Bacillus macauensis), 11 (PLC de Bacillus thuringiensis), 13 (PLC específica para PI de Pseudomonas sp.), 15 (PLC de P. emersonii); 17 (PLC de Kionochaeta), 19 (PLC de N. mariannaeae), 22 (PLC de Rasamsonia), 25 (PLC de T. Spiralis), 28 (PLC de T. harzianum),

b. Um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência, tal como pelo menos 75% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 23, 26, 29; e

c. Um fragmento do polipeptídeo de (a) ou (b) que tem atividade de fosfolipase C.

[00135] Em particular, uma dentre a dita uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio pode ser uma variante do polipeptídeo maduro de

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34/79 qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 22, 25 e 28 ou é uma variante do polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 23, 26 e 29, que compreende uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção em uma ou mais posições.

[00136] Em outras modalidades, a uma dentre a dita uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio compreende, consiste essencialmente ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18,20, 23, 26 e 29.

[00137] Em outras modalidades específicas da invenção, a fosfolipase C é selecionada dentre o grupo de PLCs comercialmente disponíveis, incluindo Purifine®, disponível junto à DSM, e Quara® Boost, disponível junto à Novozymes A/S.

[00138] Uma modalidade preferencial refere-se a quando a dita pelo menos uma enzima de degradação de fosfolipídio compreende ou consiste na SEQ ID NO. 9, (PLC de Bacillus macauensis).

[00139] Outras modalidades preferenciais referem-se a quando a dita pelo menos uma enzima de degradação de fosfolipídio compreende ou consiste em uma fosfolipase C que tem especificidade para fosfatidilinositol (PI) e uma fosfolipase C que tem especificidade para fosfatidil colina (PC) e fosfatidil etanolamina (PE), de preferência, PLC de Bacillus macauensis, SEQ ID NO. 9.

[00140] A lisofosfolipase pode ser selecionada dentre o grupo de lisofosfolipases comercialmente disponíveis, incluindo Finizym™, que está disponível junto à Novozymes.

[00141] O processo da invenção pode incluir, ainda, as etapas de branqueamento, desodorização e fracionamento.

[00142] O método usual de branqueamento é por adsorção das substâncias que produzem cor em um material adsovente. A terra ou argila de branqueamento ativado por ácido, algumas vezes chamada de bentonita, é o

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35/79 material adsovente que foi usado mais extensivamente. Essa substância consiste principalmente em silicato de alumínio hidratado. Gel de silica anidro e carvão ativado também são usados como adsorventes de branqueamento até um ponto limitado.

[00143] A desodorização de gorduras e óleos é a remoção dos componentes relativamente voláteis da gordura ou óleo com o uso de vapor. Isso é viável devido às grandes diferenças em volatilidade entre as substâncias que geram sabores, cores e odores a gorduras e óleos e os triglicerídeos. A desodorização é executada sob vácuo para facilitar a remoção das substâncias voláteis, para evitar hidrólise indevida da gordura e para tomar mais eficiente o uso do vapor. No caso de óleos vegetais, tocoferóis suficientes permanecem nos óleos finalizados após a desodorização para fornecer estabilidade.

[00144] A desodorização não tem qualquer efeito significativo sobre a composição de ácido graxo da maioria das gorduras e óleos. Dependendo do grau de insaturação do óleo que é desodorizado, quantidade pequenas de ácidos graxos trans podem ser formadas por isomerização.

[00145] As gorduras que são sólidas à temperatura ambiente usualmente contêm uma mistura de muitos triglicerídeos individuais, todos os quais têm diferentes pontos de fusão. Esses componentes podem ser separados um do outro pelo processo de fracionamento.

[00146] O resultado do fracionamento é a produção de dois componentes, chamadas frações que tipicamente diferem significativamente uma da outra em suas propriedades físicas. As frações podem ser fracionadas novamente (fracionamento duplo) para produzir frações adicionais, que terão propriedades físicas exclusivas. O processo foi originalmente desenvolvido para fracionar gorduras animais, tal como sebo bovino.

[00147] Há dois tipos de técnicas de fracionamento: seco e úmido. O fracionamento seco refere-se a um processo que não usa um solvente para auxiliar na separação dos componentes da gordura. A gordura é

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36/79 primeiramente fundida e, então, resfriada lentamente para gerar cristais de gordura grandes de alto ponto de fusão. A pasta fluida de cristais suspensa no óleo líquido é transferida para uma prensa de filtro de alta pressão, onde a fração líquida (oleína) é espremida para fora e a gordura dura (estearina) é retida no filtro. Esse processo é amplamente aplicado a óleo de palma e óleo de caroço de palma para gerar diversos produtos exclusivos a partir de uma única fonte natural, sem a necessidade de processamento químico. As frações produzidas dessa forma podem ser mescladas juntas ou misturadas com óleos vegetais líquidos para produzir uma ampla variedade de produtos funcionais para muitas aplicações alimentícias.

[00148] Um segundo aspecto da invenção fornece o uso de uma enzima de degradação de fosfolipídio para hidrolisar fosfolipídios em um óleo vegetal, em que o óleo vegetal é colocado em contato com a enzima de degradação de fosfolipídio e, depois disso, submetido a refino químico.

[00149] Ao usar a enzima de degradação de fosfolipídio de acordo com a invenção, é preferencial que a hidrólise enzimática dos ditos fosfolipídios é realizada em uma mistura de reação que compreende uma fase pesada ou uma fase aquosa e uma fase leve ou uma fase oleosa/fase hidrofóbica e não há redução ou não há redução substancial do volume de fase pesada ou separação de gomas/fase pesada do óleo antes do dito refino químico.

[00150] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece um óleo vegetal refinado, uma fração gomosa separada ou uma borra, que é obtenível ou é obtida por um método conforme definido no primeiro aspecto da invenção. Em modalidades particulares, o óleo de acordo com a invenção contém uma quantidade de diglicerídeos de 0,1% (p/p), tal como 0,2% (p/p) ou mais, ou tal como 0,3% (p/p) ou mais. A borra pode ter uma viscosidade mais baixa e pode ter um teor mais baixo de fosfolipídios do que a borra de um processo de

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37/79 refino químico convencional.

[00151] Em um quarto aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo isolado ou purificado que tem atividade de A selecionado dentre o grupo que consiste em:

a. Um polipeptídeo que tem pelo menos 75% de identidade de sequência, tal como pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 e 7,

b. Um polipeptídeo que tem pelo menos 75% de identidade de sequência, tal como pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 e 8;

[00152] Em certas modalidades, o polipeptídeo é uma variante do polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 e 7 ou pode ser uma variante do polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5 e 8 que compreende uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção em uma ou mais posições. Em particular, a dita variante pode compreender uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção em não mais que 20 posições, tal como em não mais que 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 posições.

[00153] Em particular, o polipeptídeo pode compreender, consistir essencialmente ou consistir na sequência apresentada na SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 8.

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38/79 [00154] Em um quinto aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo isolado ou purificado que tem atividade de C selecionado dentre o grupo que consiste em:

a. Um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22, 25 e 28,

b. Um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 23, 26 e 29; e

[00155] Em algumas modalidades da invenção, o polipeptídeo é uma variante do polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22, 25 e 28 ou é uma variante do polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 23, 26 e 29 que compreende uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção em uma ou mais posições. Em particular, a dita variante pode compreender uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção em não mais que 20 posições, tal como em não mais que 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 posições.

[00156] O polipeptídeo pode compreender, consistir essencialmente ou consistir na sequência apresentada na SEQ ID NO: 23, 26 ou 29.

[00157] Em um sexto aspecto, a invenção compreende uma composição que compreende o polipeptídeo de acordo com o quarto ou o quinto aspectos da invenção, conforme apresentado acima.

[00158] Em um sétimo aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado ou purificado que codifica o polipeptídeo de acordo com o quarto ou o quinto aspectos da invenção, conforme apresentado acima.

[00159] A sequência de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 4 ou 5 é apresentada na SEQ ID NO: 3. A

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39/79 sequência de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 7 ou 8 é apresentada na SEQ ID NO: 6.

[00160] A sequência de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 22 ou 23 é apresentada na SEQ ID NO: 21. A sequência de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 25 ou 26 é apresentada na SEQ ID NO: 24. A sequência de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 28 ou 29 é apresentada na SEQ ID NO: 27.

[00161] Em um oitavo aspecto, a invenção fornece um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo conforme fornecido no sétimo aspecto da invenção, em que o polinucleotídeo é, de preferência, ligado de maneira funcional a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[00162] Em um nono aspecto, a invenção fornece uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo conforme fornecido no sétimo aspecto da invenção, ligado de maneira funcional a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo.

[00163] Em particular, a invenção refere-se a uma célula hospedeira, em que o polipeptídeo é heterólogo à célula hospedeira recombinante.

[00164] A célula hospedeira recombinante pode ser aquela em que pelo menos uma dentre a uma ou mais sequências de controle é heteróloga ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.

[00165] Em um décimo aspecto, a invenção fornece um método para produzir o polipeptídeo de acordo com o quarto ou o quinto aspectos da invenção que compreende cultivar uma célula, que em sua forma do tipo selvagem, produz o polipeptídeo, sob condições apropriadas à produção do polipeptídeo.

[00166] O método pode compreender, ainda, uma etapa de recuperar o

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40/79 polipeptídeo.

[00167] O décimo primeiro aspecto da invenção refere-se a um método para produzir um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A ou um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase C que compreende cultivar a célula hospedeira recombinante de acordo com o nono aspecto da invenção, sob condições apropriadas à produção do polipeptídeo.

[00168] O método pode compreender, ainda, uma etapa de recuperar o polipeptídeo.

EXEMPLOS

Exemplo 1:

[00169] Enzima: PLC de Bacillus macauensis: Polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 [00170] Oleo: Oleo de soja bruto. O teor dos componentes de fosfolipídio individuais é medido pela quantidade de fósforo (P) dos componentes como ppm de P.

PC PI PE PA

433 ppm de P 231 ppm de P 327 ppm de P 90 ppm de P

Reação enzimática e ensaio de refino alcalino [00171] O desempenho da enzima foi testado em um ensaio de reação enzimática que simula condições de escala industrial.

[00172] Oleo de soja bruto (75 g) foi inicialmente pré-tratado com ácido por adição de 650 ppm de ácido cítrico. Nas amostras de teste, o pH foi elevado até ~6 por adição de 1,5 equivalente de NaOH; amostras de controle (branco; sem enzima), o pH foi mantido em ~4. As amostras foram submetidas a mistura em banho ultrassônico (BRANSON 5800) por 5 min e incubação em rotador por 15 min a 70 °C. A reação enzimática foi conduzida em sistema com baixo teor aquoso (2% de água total com base na quantidade de óleo) em tubos de centrifugação de 100 ml, cilíndricos, com fundo cônico. As amostras foram tratadas com ultrassom por 5 min, seguido por incubação no rotador em um gabinete aquecido a 70 °C com agitação a 20 rpm por 1

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41/79 hora. Após a reação enzimática, um alta quantidade de alcalino foi adicionado à solução pelo seguinte procedimento:

i) 1.141 ppm de NaOH foram adicionados ao óleo;

ii) os tubos de reator foram agitados manualmente por 10 s e 5 min no banho ultrassônico;

iii) A reação foi deixada por 0,5 h a 70 °C a 20 rpm;

iv) Após a reação, amostras de 10 ml foram centrifugadas em centrífuga Hot spin; a 700 g a 85 °C por 5 min (Koehler Instruments, centrífuga de óleo K600X2).

[00173] Amostras e condições:

Tabela 1

Frasco	Marcador	Concentração enzimática	Condições ácidas/básicas para reação enzimática
1	Branco	-	650 ppm de ácido cítrico ~pH 4
2	Branco	-
3	PLC de B. macauensis	2 mg de EP/kg de óleo	650 ppm de ácido cítrico t- 1,5 equivalente NaOH ~pH 6
4	PLC de B. macauensis
5	PLC de B. macauensis	4 mg de EP/kg de óleo
6	PLC de B. macauensis

Tabela 1: Condição de amostra; pH 4 e 6 a 70 °C por 1 hora para reação enzimática [00174] Estimativa de rendimento por volume de gomas:

[00175] O volume de goma foi por leitura visual com o uso da escala de tubo de vidro em tubos de centrifugação ASTM D91 e os volumes de goma foram, então, usados para calcular o rendimento de óleo.

[00176] O teor de matéria seca das gomas foi considerado ao calcular o rendimento de óleo a fim de propósitos de precisão: Os volumes de gomas podem ter o mesmo valor em uma amostra tratada com enzima ou branca, mas os teores de matéria seca são significativamente diferentes. O teor de óleo relativo é, assim, calculado com o uso das seguintes equações:

,Matéria seca %

Oleoj - Gomas*---atw--Rendimento = ----------;-------------X 100%

Oleoj

Óleo: Volume inicial do óleo bruto antes da degomagem

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42/79 (ml)

Gomas: Volume de goma medido (ml)

Matéria seca: O teor de matéria seca nas gomas (%) Rendimento: O rendimento é uma estimativa do volume de óleo recuperado (%)

Teor de diglicerídeo:

[00177] O teor de diglicerídeo foi determinado por cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) acoplada ao Detector de Aerossol Carregado (Corona Veo) de acordo com os princípios descritos no Método Oficial AOCS Cd lld-96. Equipamento DIONEX e Kinetex 2,6u HILIC 100A, 150 x 4,6 mm, coluna Phenomenex foram aplicados.

[00178] Quantificação de fosfolipídios [00179] Os fosfolipídios em óleo foram determinados por quantificação por RMN de ³¹P com o uso do seguinte procedimento: A amostra de óleo, foi adicionado 0,500 ml de solução de padrão interno (IS), seguido por 0,5 ml de CDCI3 e 0,5 ml de tampão Cs-EDTA. A amostra foi agitada por 5 min e, então, centrifugada (centrífuga de mesa, 5 min, 13.400 rpm) para obter separação de fases. A fase inferior foi transferida para um tubo de RMN. A RMN de P foi realizada com 128 varreduras e um tempo de atraso de 5 s. Todos os sinais foram integrados. Atribuições (aproximadamente em ppm): 1,5 (PA), -0,1 (PE), -0,6 (PI), -0,8 (PC). A concentração de cada espécie foi calculada como ppm de P, isto é mg de P elementar por kg de amostra de óleo. Portanto, ppm P = I/I(IS) * n(IS) * M(P) / m(óleo). O teor de fosfolipídio residual foi calculado como a razão de amostra tratada com enzima vs branco. A solução de padrão interno é 2 mg/ml de trifenilfosfato em metanol. O tampão Cs-EDTA foi preparado conforme segue: EDTA (17,55 g) foi disperso em água (aproximadamente 20 ml). O pH foi ajustado em 7,5 com o uso de 50% em p/p de CsOH. Isso gerou um solução transparente. Agua foi adicionada até 100 ml para gerar uma

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43/79 concentração de EDTA 0,6 Μ.

Fósforo total:

[00180] O fósforo total foi medido por espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) com uma precisão de aproximadamente ± 1 ppm de P.

Resultados:

[00181] O rendimento foi medido por nível de gomas e o teor de matéria seca das gomas. Houve um benefício claro e significativo ao usar PLC de B. macauensis antes da degomagem alcalina. O rendimento é igual para ambas as concentrações de enzimas. O ganho estimado é 1,4% mais óleo que o branco. Os resultados são mostrados na Figura 3.

[00182] O teor de diglicerídeo foi medido ao longo do tempo para acompanhar a atividade enzimática de PLC. O branco não tem, conforme esperado, nenhum aumento do teor de diglicerídeo. A PLC de B. macauensis tem teor aumentado de diglicerídeo significativo em comparação com o branco e com o óleo bruto, 1,08 a 1,33% mais DG. As duas dosagens de enzima têm mais ou menos o mesmo aumento de teor de diglicerídeo.

[00183] Um pequeno aumento no nível de diglicerídeo após o estágio alcalino foi observado. O 0,1 a 0,2% de diglicerídeos extras potencialmente formados durante o estágio alcalino não é alarmantemente alto. Os resultados são mostrados na Figura 4.

[00184] Os fosfolipídios intactos foram medidos para acompanhar a conversão de fosfolipídios. A PLC de B. macauensis converte 66% de todos os quatro fosfolipídios após tempo de reação de 1 hora. A PLC de B. macauensis é específica para PC e PE e para essas duas espécies de fosfolipídio a hidrólise atinge 92%. Os resultados são mostrados nas Figuras 5, 6e7.

Conclusões:

[00185] O teste confirmou o alto ganho de rendimento (1,4%) entregue

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44/79 pelo tratamento com a PLC de B. macauensis. Não há diferença significativa entre uma dosagem de 2 e 4 mg de proteína enzimática/kg de PLC de B. macauensis. A dosagem 2 mg de EP/kg de óleo parece ser suficiente ou pode ser ainda uma dosagem alta. Apenas o tempo de reação enzimática de 1 hora gerou alta hidrólise de PC e PE (92%). Degomagem completa observada; fósforo residual em óleo é baixo o suficiente

Exemplo 2:

[00186] Enzima: PLA de T. leycettanus; polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 [00187] PLC de Bacillus macauensis: Polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9

Oleo: Oleo de soja bruto; conforme revelado no Exemplo 1

Reação enzimática e refino alcalino [00188] O desempenho das enzimas foi testado em um ensaio de reação enzimática, seguindo o procedimento apresentado no Exemplo 1. Oleo de soja bruto (75 g) foi inicialmente pré-tratado com ácido por adição de 650 ppm de ácido cítrico. Nas amostras para teste de PLC de Bacillus macauensis, o pH foi elevado até ~6 por adição de 1,5 equivalente de NaOH; em amostras de controle (branco; sem enzima) e amostras para teste de PLA de T. leycettanus, o pH foi mantido em ~4.

[00189] Após a reação enzimática, produto alcalino foi adicionado seguindo o procedimento descrito no Exemplo 1.

Tabela 2: Amostras e condições

Frasco	Marcador	Concentração enzimática	Condição ácida/básica para reação enzimática
1	Branco	-	650 ppm de ácido cítrico ~pH 4
2	Branco	-
3	PLA de T. leycettanus	30 ppm de produto
4
5
6	PLC de B. macauensis	2 mg de proteína enzimática/kg de óleo	650 ppm de ácido cítrico +1,5 equivalente NaOH ~pH 6
7
8

Tabela 2: Condição de amostra; pH 4 e 6 a 70 °C por 2 horas para reação

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45/79 enzimática [00190] A estimativa de rendimento por volume de goma e teor de diglicerídeo foram determinados conforme apresentado no Exemplo 1.

[00191] O teor de ácidos graxos livres foi determinado de acordo com o Método Oficial AOCS Ca 5a-40. Em resumo, uma massa conhecida de óleo foi dissolvida em 2-propanol, e fenolftaleína foi adicionada como indicador. Os ácidos graxos livres foram, então, neutralizados por titulação com uma solução de NaOH até a ocorrência da primeira cor rosa pálida permanente.

Resultados:

[00192] O rendimento foi medido por nível de gomas e o teor de matéria seca das gomas. Há um benefício claro e significativo ao usar 30 ppm de PLA de T. leycettanus ou 2 mg de EP/kg de óleo de PLC de B. macauensis antes da degomagem alcalina. O ganho é 0,3% para PLA de T. leycettanus e 0,8% para PLC de B. macauensis. Os resultados são mostrados nas Figuras 9 e 10.

[00193] A própria fase gomosa foi bastante heterogênea após a centrifugação e formou cristais brancos duros. Durante a dissolução das gomas novamente com hidróxido de sódio (NaOH), foi quase impossível agitação manual e banho ultrassônico. Uma mistura adequada podería levar a maior rendimento para o tratamento enzimático.

[00194] O teor de FFA foi medido ao longo do tempo para acompanhar a atividade enzimática de PLA. Os resultados são mostrados na Figura 11.

[00195] O teor de diglicerídeo foi medido ao longo do tempo para acompanhar a atividade enzimática de PLC. Os resultados são mostrados na Figura 12. Conforme esperado, o PLA de T. leycettanus e o branco não tiveram aumento de teor de diglicerídeo. O PLC de B. macauensis teve teor de diglicerídeo significativo em comparação com o branco. Há uma variação padrão alta do teor de DG para o PLC de B. macauensis. A razão poderíam ser que os tubos de enzima usados precisaram ser descongelados e congelados

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46/79 diversas vezes.

Exemplo 3: PLA de Cryphonectria parasitica e PLA de Gloeophyllum trabeum', atividade hidrolítica e especificidade de substrato conforme determinado por ensaio por RMN de P.

Origem [00196] A PLA de Cryphonectria parasitica foi clonada a partir de Cryphonectria parasitica Doador NN008388, da Suécia; 1994.

[00197] A PLA de Gloeophyllum trabeum foi clonada a partir de Gloeophyllum trabeum Doador NN050212, da Rússia; 1997.

Atividade hidrolítica e especificidade de substratos

Conceito [00198] O ensaio foi conduzido incubando-se a fosfolipase com uma mistura a 10:1 de um óleo vegetal bruto e tampão aquoso. A concentração enzimática foi 10 mg/kg (mg de EP por kg de óleo). A mistura foi incubada com agitação vigorosa a 50 °C por 2 h. A mistura de reação foi, então, analisada por RMN de ³¹P e a quantidade de fosfolipídio remanescente (não hidrolisado, intacto) quantificada. O resultado é uma medida de atividade hidrolítica e especificidade de substrato da enzima.

Procedimento de ensaio [00199] A enzima purificada foi diluída a 0,09 mg/ml em tampão citrato 100 mM pH 4,0, 5,5 e 7,0. O ensaio foi iniciado adicionando-se 25 ul de enzima diluída a 250 ul de óleo vegetal bruto em um tubo Eppendorf de 2 ml e incubando-se a mistura em um termoagitador a 50 °C por 2 h. O óleo usado foi um óleo de soja bruto contendo uma quantidade significativa de PA, PE, PI e PC (100 a 200 ppm de P de cada).

Análise por RMN [00200] A amostra de óleo, foi, então, adicionado 0,500 ml de solução de padrão interno (IS), seguido por 0,5 ml de CDC1₃ e 0,5 ml de tampão CsEDTA. A amostra foi agitada por 5 min e, então, centrifugada (centrífuga de

Petição 870190093966, de 19/09/2019, pág. 60/121 /79 mesa, 5 min, 13.400 rpm) para obter separação de fases. A fase inferior foi transferida para um tubo de RMN. A RMN de ³¹P foi realizada com 128 varreduras e um tempo de atraso de 5 s. Todos os sinais foram integrados. Atribuições (aproximadamente em ppm): 1,5 (PA), -0,1 (PE), -0,6 (PI), -0,8 (PC). A concentração de cada espécie foi calculada como ppm de P, isto é mg de P elementar por kg de amostra de óleo. Portanto, ppm P = I/I(IS) * n(IS) * M(P) / m(óleo). A solução de IS é 2 mg/ml de trifenilfosfato em MeOH. O tampão Cs-EDTA foi preparado como: EDTA (5,85 g) foi disperso em água (aproximadamente 50 ml). O pH foi ajustado em 7,5 com o uso de 50% em p/p de CsOH. Isso gerou um solução transparente. Agua foi adicionada até 100 ml para gerar uma concentração de EDTA 0,2 M. Resultados [00201] Os resultados nas tabelas 14 e 15 abaixo mostram que ambas as enzimas são ativas em todos os quatro fosfolipídios e ambas preferem pH 4 em vez de pH 5,5 e 7,0.

Tabela 14. Teor de fosfolipídio (ppm de P) de óleo de soja incubado com PLA de Gloeophyllum trabeum.__________________________________________

	Óleo	pH 4	pH 5,5	pH 7
PA	120	0	112	120
PE	120	0	112	112
PI	79	0	87	79
PC	132	0	141	141

Tabela 15. Teor de fosfolipídio (ppm de P) de óleo de soja incubado com PLA de Cryphonectria parasitica. _______________________________________

	Óleo	pH 4	pH 5,5	pH 7
PA	116	41	112	112
PE	107	12	12	112
PI	83	45	79	83
PC	136	29	132	136

Exemplo 16: PLC de Trichoderma harzianuiir. Clonagem, expressão, fermentação e purificação [00202] DNA genômico foi extraído da cepa NN051266 Trichoderma harzianum, com o uso do Kit Fast DNA Spin for Soil Número de catálogo 6560-200 da MP Biochemicals, seguindo o protocolo do fornecedor.

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48/79 [00203] O gene D23CR9, P33XXG (SEQ ID NO. 27) foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico. A PCR foi composta por 1 μΐ de DNA genômico da cepa; 2,5 μΐ de iniciador de clonagem direto (SEQ ID NO: 52; e 53) (10 pmol/μΐ), 2,5 μΐ de iniciador de clonagem reverso (SEQ ID NO: 54; e 55) (10 pmol/μΐ), 25 μΐ de Mistura Mestre iProof HF (BioRad número de catálogo 172-5310) e 19 μΐ de água de grau de PCR.

[00204] A reação de amplificação foi realizada com o uso de um Ciclador Térmico programado para 2 minutos a 98 °C seguidos por 30 ciclos a 98 °C por 10 segundos e 60 °C por 10 segundos, seguido por um ciclo a 72 °C por 5 minutos.

P8_43-F5’

ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCCCAGCTCGACGC-3’

P8_43-F5’

ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCCCAGCTCGACGC-3'

P8.43-R5’

AGATCTCGAGAAGCTTAAGCCTTGGCTTTCAACTCATTAGCC 3’

P7.30-R5'

AGATCTCGAGAAGCTTAAGCCTTGGCTTTCAACTCATTGGC 3’ [00205] O país de origem para Trichoderma harzianum NN051266 é a China (2008).

[00206] 4 μί do produto de PCR foram visualizados em uma eletroforese em gel de agarose a 1,0% com o uso de tampão TAE. O produto de PCR remanescente foi purificado com o uso de um Kit GFX® PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare, Hillerpd, Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante. O produto de PCR purificado, correspondente ao gene D23CR9 de PLC de Trichoderma harzianum NN051266, foi clonado no vetor de expressão pDAu!09 (WO 2005/042735) anteriormente linearizado com Bam HI e Hind III, com o uso de um Kit de Clonagem por PCR IN-FUSION™ Dry-Down (BD Biosciences, Palo Alto,

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49/79

CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

[00207] Um volume de 1 μΐ da mistura de ligação não diluída foi usado para transformar BD Phusion-Blue (Clontech). Uma colônia foi selecionada em uma placa de ágar LB contendo 100 pg de ampicilina por ml e cultivada durante a noite em 2 ml de meio LB suplementado com 100 pg de ampicilina por ml. DNA de plasmídeo foi purificado com o uso de um Kit Jetquick Plasmid Miniprep Spin (Genomed GmbH, Lphne, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As sequências do gene D23CR9 de PLC de Trichoderma harzianum NN051266 PLC foram verificadas por sequenciamento de Sanger antes da expressão heteróloga. Um plasmídeo designado P8_43 (contendo gene SEQ ID NO: 27) foi selecionado para expressão heteróloga dos genes de PLC em células hospedeiras de Aspergillus oryzae MT3568.

[00208] A cepa MT3568 de Aspergillus oryzae foi usada para expressão heteróloga do gene D23CR9, P33XXG. A. oryzae MT3568 é um derivado de gene rompido amdS (acetamidase) de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694) em que a auxotrofia de pyrG foi restaurada rompendo-se o gene de acetamidase de A. oryzae (amdS) com o gene pyrG. Protoplastos de Aspergillus oryzae MT3568 foram preparados de acordo com WO 95/002043. [00209] Cem pl de protoplastos de Aspergillus oryzae MT3568 foram misturados com 1 a 2 pg do vetor de expressão de Aspergillus com o gene D23CR9 clonado e 250 pl de PEG 4000 a 60% (Applichem, Darmstadt, Alemanha) (polietileno glicol, peso molecular 4.000), CaCk 10 mM e TrisHCÍ 10 mM pH 7,5 e suavemente misturados. Após 30 min de incubação a 37 °C, 4 ml de ágar de topo (temp. 40 °C) foram adicionados, e os protoplastos foram espalhados em placas COVE para seleção. Após incubação durante 4 a 7 dias a 37 °C, os esporos de quatro transformantes foram inoculados em 0,5 ml de meio DAP-4C-01 em placas com 96 poços profundos. Após cultivo de 4 a 5 dias a 30 °C, os caldos de cultura foram analisados por SDS-PAGE para

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50/79 identificar os transformantes que produzem a maior quantidade de fosfolipase C recombinante de Trichoderma harzianum NN051266.

[00210] Os esporos do melhor transformante com gene D23CR9 de PLC de Trichoderma harzianum NN051266 foram espalhados em placas COVE contendo TRITON® X-100 a 0,01 % de modo a isolar colônias únicas. O espalhamento foi repetido mais uma vez antes da preservação dos clones. Fermentação para purificação [00211] Um transformante de Aspergillus oryzae construído conforme descrito acima foi fermentado em 150 ml de meio DAP-4C-01 em frascos de agitação canelados de 500 ml incubados a 30 °C em um incubador com plataforma de agitação que gira a 150 rpm durante 5 dias e adicionalmente usado para ensaios conforme descrito em baixo.

Exemplo 4: PLC de Trichurus spiralis; Clonagem, expressão e fermentação:

[00212] DNA genômico foi extraído da cepa NN009739 Trichurus spiralis, com o uso do Kit Fast DNA Spin for Soil Número de catálogo 6560200 da MP Biochemicals, seguindo o protocolo do fornecedor.

[00213] O gene D23YRT, P34CUT (SEQ ID NO. 26) foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico. A PCR foi composta por 1 μΐ de DNA genômico da cepa; 2,5 μί de iniciador de clonagem direto (P7_37-F) (10 pmol/μί), 2,5 μί de iniciador de clonagem reverso (P7_37-R) (10 pmol/μί), 25 μί de Mistura Mestre iProof HF (BioRad número de catálogo 172-5310) e 19 μί de água de grau de PCR.

[00214] A reação de amplificação foi realizada com o uso de um Ciclador Térmico programado para 2 minutos a 98 °C seguidos por 30 ciclos a 98 °C por 10 segundos e 60 °C por 10 segundos, seguido por um ciclo a 72 °C por 5 minutos.

P7_37-F 5'

ACACAACTGGGGATCCACCATGCATCTCACTCGCGTCGC-3’

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51/79

P7.37-R 5'

AGATCTCGAGAAGCTTAGATTAGGAGTCTCTTGTTCTCCTCGACC 3 ’ [00215] O país de origem para Trichurus spiralis NN009739 é a Dinamarca (1996).

[00216] 4 pl do produto de PCR foram visualizados em uma eletroforese em gel de agarose a 1,0% com o uso de tampão TAE. O produto de PCR remanescente foi purificado com o uso de um Kit GFX® PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare, Hillerpd, Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante. O produto de PCR purificado, correspondente ao gene D23YRT de PLC de Trichurus spiralis NN009739, foi clonado no vetor de expressão pDAulO9 (WO 2005042735) anteriormente linearizado com Bam HI e Hind III, com o uso de um Kit de Clonagem por PCR IN-FUSION™ Dry-Down (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

[00217] Um volume de 1 pl da mistura de ligação não diluída foi usado para transformar BD Phusion-Blue (Clontech). Uma colônia foi selecionada em uma placa de ágar LB contendo 100 pg de ampicilina por ml e cultivada durante a noite em 2 ml de meio LB suplementado com 100 pg de ampicilina por ml. DNA de plasmídeo foi purificado com o uso de um Kit Jetquick Plasmid Miniprep Spin (Genomed GmbH, Lphne, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência do gene D23YRT de PLC de Trichurus spiralis NN009739 PLC foi verificada por sequenciamento de Sanger antes da expressão heteróloga. Um plasmídeo designado P7_37 (contendo gene SEQ ID NO: 14) foi selecionado para expressão heteróloga do gene de PLC em uma célula hospedeira de Aspergillus oryzae MT3568.

[00218] A cepa MT3568 de Aspergillus oryzae foi usada para expressão heteróloga de D23YRT, P34CUT. A. oryzae MT3568 é um derivado de gene rompido amdS (acetamidase) de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694) em que a auxotrofia de pyrG foi restaurada rompendo-se o

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52/79 gene de acetamidase de A. oryzae (amdS) com o gene pyrG. Protoplastos de Aspergillus oryzae MT3568 foram preparados de acordo com WO 95/002043. [00219] Cem μΐ de protoplastos de Aspergillus oryzae MT3568 foram misturados com 1 a 2 pg do vetor de expressão de Aspergillus com o gene D23YRT clonado e 250 μΐ de PEG 4000 a 60% (Applichem, Darmstadt, Alemanha) (polietileno glicol, peso molecular 4.000), CaCP 10 mM e TrisHC1 10 mM pH 7,5 e suavemente misturados. Após 30 min de incubação a 37 °C, 4 ml de ágar de topo (temp. 40 °C) foram adicionados, e os protoplastos foram espalhados em placas COVE para seleção. Após incubação durante 4 a 7 dias a 37 °C, os esporos de quatro transformantes foram inoculados em 0,5 ml de meio DAP-4C-01 em placas com 96 poços profundos. Após cultivo de 4 a 5 dias a 30 °C, os caldos de cultura foram analisados por SDS-PAGE para identificar os transformantes que produzem a maior quantidade de fosfolipase C recombinante de Trichurus spiralis NN009739, e os caldos de cultura foram também analisados em ensaios para confirmação da atividade.

[00220] Os esporos do melhor transformante foram espalhados em placas COVE contendo TRITON® X-100 a 0,01 % de modo a isolar colônias únicas. O espalhamento foi repetido mais uma vez antes da preservação do clone.

Fermentação para purificação [00221] Um transformante de Aspergillus oryzae construído conforme descrito acima foi fermentado em 150 ml de meio DAP-4C-01 em frascos de agitação canelados de 500 ml incubados a 30 °C em um incubador com plataforma de agitação que gira a 150 rpm durante 5 dias e adicionalmente usado para ensaios conforme descrito em baixo.

Meios usados [00222] As placas LB foram compostas por 10 g de Triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, 15 g de ágar Bacto e água deionizada até 1 litro.

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53/79 [00223] O meio LB foi composto por 10 g de Triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio e água deionizada até 1 litro.

DAP-4C-1 g de MgSO4,7H2O g de KH2PO4 g de C6H8O7,H2O g de Dextrose g de Maltrose

5,2 g de K3PO4,H2O

0,5 g de Extrato de Levedura

0,5 ml de Sol. de metais vestigiais KU6 (AMG) (MSA-SUBFS-0042)

Misturar até completamente dissolvidos ml de Dowfax 63N10 é adicionado

Ajustar volume com água Milli-Q até 1.000 ml tablete de CaCO3 de0,5 g (adicionar 1 tablete/200ml)

Antes da inoculação, a cada frasco de agitação de 150 ml são adicionados 3,5 ml de Hidrogenofosfato de diamônio (ΝΗ₄)₂ΗΡΟ4 a 50% e 5,0 ml de Ácido láctico a 20 %.

Sol. de metais vestigiais KU6 (AMG) (MSA-SUB-FS-0042)

6,8 g de ZnCl₂

2,5 g de CuSO₄.5H₂O

0,13 g de Cloreto de Níquel anidro

13,9 g de FeSO4.7H₂O

8,45 g de MnSO₄.H₂O g de C₆H₈O₇.H₂O _____________Água de troca iônica até 1.000 ml ________________________

Matéria-prima	Fórmula química	Fornecedor	7-cif. n²	Quantidade
Cloreto de Zinco	ZnCh	Merck 108816	102-4965	6,8	g
Sulfato de Cobre	CuSO₄,5H₂O	Merck 102790	109-0771	2,5	g
Cloreto de Níquel Anidro	NÍC12	Merck 806722	101-6652	0,13	g______

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Sulfato de Ferro	FeSO4,7H₂O	Merck 103965	13,9	g
Sulfato e Manganês	MnSO₄.H₂O	Merck 105941	8,45	g
Ácido cítrico	CóHsOt.HiO	Merck 100244	3	g
Água de troca iônica até			1000	ml

[00224] As placas de sacarose COVE foram compostas por 342 g de sacarose, 20 g de ágar em pó, 20 ml de solução de sais COVE e água deionizada até 1 litro. O meio foi esterilizado por autoclavagem a 103,42 kPa (15 psi) por 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8^a Edição, Revisão A, 1998). O meio foi resfriado até 60 °C e foram adicionados acetamida 10 rnM, Triton X-100 (50 μ1/500 ml).

[00225] A solução de sais COVE foi composta por 26 g de MgSO4-7H₂O, 26 g de KC1, 26 g de KH2PO4, 50 ml de solução de metais vestigiais COVE e água deionizada até 1 litro.

[00226] A solução de metais vestigiais COVE foi composta por 0,04 g de Na₂B₄O₇· IOH2O, 0,4 g de CuSO₄-5H₂O, 1,2 g de FeSO₄-7H₂O, 0,7 g de MnSO4-H₂O, 0,8 g de Na₂MoO4-2H₂O, 10 g de ZnSO4-7H₂O e água deionizada até 1 litro.

Exemplo 5: PLC de Rasamsonia eburnean'. Clonagem e expressão [00227] O gene que codifica a fosfolipase foi clonado por técnicas convencionais a partir da cepa indicada e inserido no plasmídeo pCaHj505 (WO 2013/029496 Exemplo 1: Clonagem e expressão).

[00228] O gene que codifica a fosfolipase foi clonado por técnicas convencionais a partir da cepa indicada e inserido no plasmídeo pCaHj505 (WO 2013/029496). O gene foi expresso com o sinal de secreção nativo que tem a seguinte sequência de aminoácidos MRAFLITALASLATAAGA (resíduos de aminoácido 1 a 18 da SEQ ID NO: 22).

Expressão em A. Oryzae [00229] Um clone com a sequência de genes recombinante correta foi selecionado e o plasmídeo correspondente foi integrado no genoma da célula hospedeira Aspergillus oryzae MT3568. A. oryzae MT3568 é um derivado de gene rompido amdS (acetamidase) de A. oryzae JaL355 (WO 02/40694) em

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55/79 que a auxotrofia de pyrG foi restaurada rompendo-se o gene de acetamidase de A. oryzae (amdS) com o gene pyrG.

[00230] A atividade hidrolítica da fosfolipase produzida pelos transformantes de Aspergillus foi investigada com o uso de placas de lecitina/agarose (ensaio de placa descrito na seção de ensaio). Alíquotas de 20 pl do caldo de cultura dos diferentes transformantes ou tampão (controle negativo) foram distribuídos em furos perfurados com um diâmetro de 3 mm e incubados por 1 hora a 37 °C. As placas foram subsequentemente examinadas quanto à presença ou ausência de uma zona violeta escuro em tomo dos furos correspondentes à atividade de fosfolipase.

[00231] Um clone de Aspergillus oryzae recombinante contendo o construto de expressão integrado foi selecionado e foi cultivado em 2.400 ml de meio YPM (10 g de extrato de levedura, 20 g de Bacto-peptona, 20 g de maltose e água deionizada até 1.000 ml) em frascos de agitação durante 3 dias a uma temperatura de 30 °C sob 80 rpm de agitação. O caldo de cultura foi coletado por filtração usando um dispositivo de filtro de 0,2 pm. O caldo de fermentação filtrado foi usado para caracterização de enzima. O gene foi expresso com o sinal de secreção nativo que tem a seguinte sequência de aminoácidos MRAFLITALASLATAAGA (resíduos de aminoácido 1 a 18 da SEQ ID NO: 22).

Purificação [00232] O sobrenadante de cultura foi primeiramente precipitado por (NH4)2SO4 e, então, dialisado com 20 mm de Bis-Tris em pH 6,5. Então, a amostra foi aplicada à coluna cromatográfica de Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada com 20 mm de Bis-Tris em pH 6,5. Um aumento de gradiente de concentração de NaCl foi aplicado de zero a 0,35 M de NaCl com 15 CV (volume de coluna), então, a NaCl 0,5 M com 3 CV, finalmente a NaCl 1 M com 2 CV. As frações e amostras que passam pela coluna (fração de fluxo passante) foram verificadas por SDS-PAGE. Com base na figura de

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SDS, as frações η² 18 a η² 43 foram coletadas e adicionadas (NH^SCU até uma concentração final de 1,2 M.

[00233] As frações agrupadas foram carregadas em uma coluna de Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada com 20 mm de Bis-Tris em pH 6,5 com (NH^SCL 1,2 M adicionado. Uma diminuição de gradiente de concentração de (NH^SCU foi aplicada de 1,2 M a partir de Zero. As frações de eluição e a fração fluxo passante foram coletadas e testadas quanto à atividade de PLC por placa de lecitina em pH 5,5. As frações com atividade de PLC foram verificadas por SDS-PAGE. Ambas as frações de eluição η² 1 a n² 18 e fração fluxo passante tiveram boa atividade e pureza de PLC e foram coletadas como proteínas-alvo.

Processamento N e C-terminal

Sequenciamento N-terminal:

[00234] As análises de sequenciamento N-terminal foram realizadas com o uso de um sistema de sequenciamento de proteína Applied Biosystems Procise®. As amostras foram purificadas em um gel de poliacrilamida préfabricado 4 a 20% SDS da Novex® (Life Technologies). O gel foi usado de acordo com as instruções do fabricante e transferido para uma membrana PVDF ProBlott® (Applied Biosystems). Para sequenciamento de aminoácido N-terminal, a banda de proteína principal foi cortada e colocada no cartucho de blotting do sistema de sequenciamento de proteína Procise®. O sequenciamento N-terminal foi realizado com o uso do método run file para amostras de membrana PVDF (PVDF de líquido pulsado) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência de aminoácidos N-terminal foi deduzida dos 7 cromatogramas correspondentes a resíduos de aminoácidos 1 a 7 comparando-se o tempo de retenção dos picos nos cromatogramas com os tempos de retenção dos aminoácidos PTH no cromatograma padrão.

Identificação de proteína por sequenciamento por espectrometria de massa (MS/MS):

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57/79 [00235] A identificação de proteína foi realizada por análise por espectrometria de massa em tandem (MS/MS) de peptídeos trípticos de uma digestão em gel. A primeira amostra foi reduzida por DTT e alquilada com lodacetamida. A amostra reduzida e alquilada foi, então, aplicada à eletroforese em gel SDS.

[00236] O gel foi executado e manchado de acordo com as instruções do fabricante (Novex® precast 4 a 20% de gel de poliacrilamida SDS (Life Technologies). A banda de proteína principal foi cortada e o pedaço de gel digerido de um dia para o outro por tripsina de grau de sequenciamento (Roche). Após a digestão, os peptídeos trípticos gerados foram extraídos e analisados em um espectrômetro de massa Orbitrap LTQ XL (Thermo Scientific) em que as massas de peptídeo e as massas de fragmento de peptídeo foram medidas. Para identificação de proteína, as massas experimentalmente obtidas foram comparadas com as massas de peptídeo e as massas de fragmento de peptídeo teóricas de proteínas armazenadas nos bancos de dados pelo programa de pesquisa de massa Mascot (Matrix science).

Determinação do Peso Molecular:

[00237] As análises de peso molecular intacto foram realizadas com ο uso de um espectrômetro de massa de eletroaspersão MAXIS II (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, DE). As amostras foram diluídas até 1 mg/ml em água MQ. As amostras diluídas foram aplicadas a uma coluna Aeris Widepore C4 (Phenomenex). As amostras foram lavadas e eluídas a partir da coluna que executa um gradiente linear de acetonitrila e introduzidas à fonte de eletroaspersão com um fluxo de 300 ml/min por um sistema Ultimate 3000 LC (Dionex). A análise de dados é realizada com a versão 4.2 de DataAnalysis (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha). O peso molecular das amostras foi calculado por desconvolução dos dados brutos na faixa de 20.000 a 80.000 Da.

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Especificidade de substrato

Ensaio por RMN de P de enzimas PLC purificadas

Conceito [00238] O ensaio foi conduzido incubando-se a PLC com uma mistura a 10:1 de um óleo vegetal bruto e tampão citrato aquosos pH 5,5. A concentração enzimática foi 30 mg/kg (mg de EP por kg de óleo). A mistura foi incubada com agitação vigorosa a 50 °C por 2 h. A mistura de reação foi, então, analisada por RMN de ³¹P. Isso envolve uma etapa de extração aquosa durante a qual as espécie de fósforo liberadas pelo PLC são removidas da fase oleosa. Portanto, são detectadas apenas espécies P lipofílicas, incluindo fosfolipídio não reagido.

Enzimas:

[00239] Polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 22 (PLC de Rasamsonia), SEQ ID NO: 25 (PLC de T. Spiralis) e SEQ ID NO: 28 (PLC de T. harzianum),

Procedimento de ensaio [00240] A enzima purificada foi diluída a 0,27 mg/ml em tampão citrato 100 mM pH 5,5. O ensaio foi iniciado adicionando-se 25 ul de enzima diluída a 250 ul de óleo vegetal bruto em um tubo Eppendorf de 2 ml e incubando-se a mistura em um termoagitador a 50 °C por 2 h. O óleo usado foi um óleo de soja bruto contendo uma quantidade significativa de PA, PE, PI e PC (100 a 200 ppm de P de cada).

Análise por RMN [00241] A amostra de óleo, foi, então, adicionado 0,500 ml de solução de padrão interno (IS), seguido por 0,5 ml de CDC1₃ e 0,5 ml de tampão CsEDTA. A amostra foi agitada por 5 min e, então, centrifugada (centrífuga de mesa, 5 min, 13.400 rpm) para obter separação de fases. A fase inferior foi transferida para um tubo de RMN. A RMN de P foi realizada com 128 varreduras e um tempo de atraso de 5 s. Todos os sinais foram integrados.

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Atribuições (aproximadamente em ppm): 1,5 (PA), -0,1 (PE), -0,6 (PI), -0,8 (PC). A concentração de cada espécie foi calculada como ppm de P, isto é mg de P elementar por kg de amostra de óleo. Portanto, ppm P = I/I(IS) * n(IS) * M(P) / m(óleo). O teor de fosfolipídio residual foi calculado como a razão de amostra tratada com enzima vs branco. A solução de padrão interno é 2 mg/ml de trifenilfosfato em metanol. O tampão Cs-EDTA foi preparado como: EDTA (5,85 g) foi disperso em água (aproximadamente 50 ml). O pH foi ajustado em 7,5 com o uso de 50% em p/p de CsOH. Isso gerou um solução transparente. Agua foi adicionada até 100 ml para gerar uma concentração de EDTA 0,2 M.

Resultados [00242] A Tabela 2 abaixo mostra o teor residual de fosfolipídio em percentagem (0 significa hidrólise completa, 100 significa nenhuma hidrólise).

Tabela 2

Batelada n²	PA	PE	PI	PC
Spiralis
U4G2D	53	78	41	35
U3CC8	30	34	0	10
U3EY3	44	60	31	17
U3CWK	60	75	37	39
U3CWJ	52	69	42	32
U3CWH	59	72	38	35
U3CC7	54	72	38	33
Rasamsonia
U4BCJ	53	72	37	14
Harzianum
U4AVE	21	44	7	11
U4AVF	75	85	48	46
U4AVG	26	43	7	6
U39PX	46	67	36	29
U49A3	25	55	21	17

Perfil de temperatura de DCS

Determinação de Td por Calorimetria de Varredura Diferencial.

[00243] A termoestabilidade de Harzianum (U49A3) foi determinada por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) com o uso de um Calorímetro Diferencial de Varredura Capilar VP (MicroCai Inc., Piscataway,

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NJ, EUA). A temperatura de desnaturação térmica, Td (°C), foi registrada como o topo do pico de desnaturação (pico endotérmico principal) em termogramas (Cp vs. T) obtidos após o aquecimento de soluções enzimáticas (aproximadamente 0,5 mg/ml) em tampão (tampão acetato 50 mM a pH 5,0) a uma taxa de aquecimento constante programada de 200 K/h.

[00244] As soluções de amostra e referência (aproximadamente 0,2 ml) foram carregadas no calorímetro (referência: tampão sem enzima) a partir de condições de armazenamento a 10 °C e termicamente pré-equilibradas por 20 minutos a 20 °C antes de varredura por DSC de 20 °C a 100 °C. As temperaturas de desnaturação foram determinadas a uma precisão de aproximadamente +/- 1 °C. A Td obtida sob essas condições para U49A3 foi 79 °C.

[00245] A termoestabilidade de Spiralis (U4G2D) foi determinada por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) com o uso de um Calorímetro Diferencial de Varredura Capilar VP (MicroCai Inc., Piscataway, NJ, EUA). A temperatura de desnaturação térmica, Td (°C), foi registrada como o topo do pico de desnaturação (pico endotérmico principal) em termogramas (Cp vs. T) obtidos após o aquecimento de soluções enzimáticas (aproximadamente 0,5 mg/ml) em tampão (tampão acetato 50 rnM a pH 5,5) a uma taxa de aquecimento constante programada de 200 K/h.

[00246] As soluções de amostra e referência (aproximadamente 0,2 ml) foram carregadas no calorímetro (referência: tampão sem enzima) a partir de condições de armazenamento a 10 °C e termicamente pré-equilibradas por 20 minutos a 20 °C antes de varredura por DSC de 20 °C a 100 °C. As temperaturas de desnaturação foram determinadas a uma precisão de aproximadamente +/- 1 °C. A Td obtida sob essas condições para U4G2D foi 67 °C.

[00247] A termoestabilidade de Rasamsonia (U4BCJ) foi determinada por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) com o uso de um

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Calorímetro Diferencial de Varredura Capilar VP (MicroCai Inc., Piscataway, NJ, EUA). A temperatura de desnaturação térmica, Td (°C), foi registrada como o topo do pico de desnaturação (pico endotérmico principal) em termogramas (Cp vs. T) obtidos após o aquecimento de soluções enzimáticas (aproximadamente 0,5 mg/ml) em tampão (tampão acetato 50 mM a pH 5,5) a uma taxa de aquecimento constante programada de 200 K/h.

[00248] As soluções de amostra e referência (aproximadamente 0,2 ml) foram carregadas no calorímetro (referência: tampão sem enzima) a partir de condições de armazenamento a 10 °C e termicamente pré-equilibradas por 20 minutos a 20 °C antes de varredura por DSC de 20 °C a 100 °C. As temperaturas de desnaturação foram determinadas a uma precisão de aproximadamente +/- 1 °C. A Td obtida sob essas condições para U4BCJ foi 82 °C.

Desempenho de degomagem [00249] O desempenho da enzima fosfolipase C da presente invenção Rasamsonia, Harzianum e Spiralis foi testado em um ensaio de degomagem que simula a degomagem em escala industrial. O ensaio mediu um ou ambos os parâmetros a seguir na fase oleosa após o procedimento de degomagem descrito no parágrafo sobre ensaio de degomagem abaixo.

[00250] a) Teor de diglicerídeo por cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) acoplada ao Detector de Aerossol Carregado (Corona Veo) de acordo com os princípios descritos no Método Oficial AOCS Cd lld-96. Equipamento DIONEX e Lichrocart Si-60, 5 qm, Lichrosphere 2504mm, coluna MERCK foram aplicados.

[00251] b) Fósforo total e outros metais, tal como Ca, Mg, Zn, medido por espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) com uma precisão de aproximadamente ± 1 ppm de P.

Ensaio de degomagem [00252] Oleo de soja bruto (75 g) foi inicialmente pré-tratado com

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62/79 ácido/base para facilitar conversão de fosfolipídeos insolúveis em formas mais hidratáveis e assegurar um ambiente adequado para a enzima. O prétratamento ácido/básico foi realizado por adição de ácido de ácido Orto Fosfórico (75% de solução) ou ácido cítrico (50% de solução). Ácido foi aplicado em quantidades iguais a 0,065% ou 0,09% (100% de ácido orto fosfórico puro/100% de ácido cítrico puro) com base na quantidade de óleo e mistura em banho ultrassônico (BRANSON 5800) por 5 min e incubação em rotador por 15 min. O mesmo foi seguido por neutralização básica com NaOH 1 M aplicado em equivalentes (de 0,45 a 5) a ácido orto fosfórico puro (isto é, o ácido que foi usado no pré-tratamento) e misturado em banho ultrassônico por 5 min. A reação enzimática foi conduzida em sistema com baixo teor aquoso (3% de água total com base na quantidade de óleo) em tubos de centrifugação de 100 ml, cilíndricos, com fundo cônico. As amostras foram tratadas ultrassonicamente durante 5 minutos, seguido por incubação em uma câmara aquecida à temperatura selecionada (de 60 a 70 °C) com agitação a 20 rpm durante um tempo de incubação selecionado (de 1 a 24 horas). Para separar a mistura em uma fase oleosa e uma fase pesada de água/goma, as amostras foram centrifugadas a 700 g a 85 °C por 5 minutos (Koehler Instruments, centrífuga de óleo K600X2).

[00253] A composição de fósforo, cálcio, magnésio e zinco no óleo de soja bruto, usado nos experimentos, é indicada na Tabela 3.

Tabela 3: Composição de metal de óleo bruto medida por ICP-OES (mg/kg de óleo)____________________________________________________________________

Tabela 3: Composição de metal de óleo bruto medida por ICP-OES (mg/kg de óleo)
	P	Ca	Mg	Zn
óleo bruto 1- FS-2015-00022	743	168	115	10
óleo bruto 2-ex 2. FS-2015-00021	615	136	85	10
óleo bruto 3 FS-2014-00070.	631	102	69	3
óleo bruto 4-ex 4A FS-2015-00021.	479	146	92	11
óleo bruto 5-ex 4B - FS-2015-00022	465	147	93	11
óleo bruto 6-ex 5 FS-2015-00023	622	157	105	11

[00254] Os Exemplos 6 a 11 abaixo descrevem os resultados obtidos com o uso do ensaio de degomagem.

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Exemplo 6: Harzianum U4AVG em comparação com Mrs. Marianne U4DB1 a 60 °C (58,6 identidade) [00255] Harzianum (U4AVG) (polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 28) foi aplicado em ensaio de degomagem a 60 °C em comparação com N. mariannaeae (U4DB1) (polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 19) em dosagem de enzima de 10 mg de proteína enzimática por kg de óleo que aplica óleo 1. Foi medido o teor de diglicerídeos após degomagem enzimática por 2, 5 e 24 horas (óleo pré-tratado com 0,065% de ácido cítrico/1,5 equivalente de NaOH) assim como o teor de fósforo após 2, 5 e 24 horas de incubação medido por ICP. Os resultados (média de determinação dupla) e desvio padrão (STDEV) são apresentados na tabela 4A e 4B.

Tabelas 4A e 4B

	Tabela 4A: Aumento de diglicerídeo (% p/	p) após incubação enzimática em óleo 1
	AVE 2 h	STDEV 2 h	AVE5h	STDEV 5 h	AVE 24 h	STDEV 24 h
Branco	3,12	3,03	0,00	0,01	0,06	0,01
Harzianum	3,47	3,06	0,69	0,06	1,16	0,06
Mariannaeae	3,14	3,04	0,33	0,15	0,95	0,15
	Tabela 4B: Teor total de P após determinação dobb de degomagem (mg/kg=ppm)
	AVE2h	STDEV 2 h	AVE5h	STDEV 5 h	AVE 24 h	STDEV 24 h
Branco	51	1	47	5	43	1
Harzianum	45	8	34	9	22	6
Mariannaeae	49	3	44	7	23	9

[00256] A degomagem com Harzianum (U4AVG) a 60 °C resulta em formação de diglicerídeo superior em comparação com a formação de diglicerídeo por PLC de mariannaeae (U4DB1). Harzianum converte até 78% dos fosfolipídios nas condições testadas (60 °C, 24 horas). O cálculo de conversão baseia-se na suposição de que 743 ppm de P total medidos por ICP são iguais a 1,86% em peso de fosfolipídio (Mw de PL médio -772 g/mol, Mw P-31 g/mol) igual ao aumento de DG máximo de 1,49% obtenível (80% de molécula de fosfolipídio).

Exemplo 7: Estudo de resposta à dose de Harzianum (U4AVG) a 60 °C [00257] Harzianum (U4AVG) (polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 28) foi aplicado no ensaio de degomagem a 60 °C em várias dosagens de enzima de lx-2x-5x-10x mg de proteína enzimática por kg de óleo, aplicandoPetição 870190093966, de 19/09/2019, pág. 77/121

64/79 se óleo 2. O teor de diglicerídeo após a degomagem enzimática por 1, 2 e 4 horas foi medido (óleo pré-tratado com 0,09% de ácido fosfórico/1,5 equivalentes de NaOH). Os resultados são apresentados na tabela 5.

Tabela 5: Aumento de diglicerídeo______________________________________

Dosagem de enzima (mg de proteína enzimática/kg de óleo)	Tabela 5: Aumento de diglicerídeo (% p/p) após incubação enzimática em óleo 2 FS-2015-00021
	1 hora	2 horas	4 horas
IX	0,05	0,21	0,23
2Χ	0,06	0,30	0,38
5Χ	0,32	0,42	0,41
10Χ	0,59	0,87	1,06

[00258] A degomagem com Harzianum (U4AVG) a 60 °C mostrou formação de diglicerídeo aumentada em dosagem de enzima aumentada no intervalo testado (1 a 10X mg de EP/kg de óleo). Até 86% dos fosfolipídios foram convertidos nas condições testadas (60 °C, 4 horas, 10 mg de EP/kg de óleo). O cálculo de conversão baseia-se na suposição de que 615 ppm de P total medidos por ICP são iguais a 1,54% em peso de fosfolipídio (Mw de PL médio -772 g/mol, Mw P-31 g/mol) igual ao aumento de DG máximo de 1,23% obtenível (80% de molécula de fosfolipídio).

Exemplo 8: Desempenho de Rasamsonia (U3GPC) em comparação com PLC de P.emersonii (U4DB4) e Kionochaeta (U1A3F) a 60 °C aplicandose ácido fosfórico para pré-tratamento de óleo [00259] Rasamsonia (U3GPC) (polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 22) foi aplicado em ensaio de degomagem a 60 °C em comparação com PLC de Kionochaeta (U1A3F) (polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17) e P.emersonii (U1DW6) (polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 15) em dosagem de enzima de 30 mg de proteína enzimática por kg de óleo que aplica óleo 3. Foi medido o teor de diglicerídeos após degomagem enzimática por 2, 4, 6 e 24 horas (óleo pré-tratado com 0,09% de ácido fosfórico e +/- 1,5 equivalente de NaOH) assim como o teor de fósforo após 2 e 24 horas de incubação medido por ICP. Os resultados são apresentados na tabela 6.

Tabela 6: Aumento de diglicerídeo (% em p/p)__________________________

Tabela 6: Aumento de diglicerídeo (% p/p) e teor final de P após incubação enzimática em óleo 3 FS2014-00070

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Enzima	Pré-tratamento de óleo	Aumento de DG (% em peso) como função do tempo de reação (horas)	P total por ICP após degomagem de x horas
2	4	6	24	2	24
Branco	0,09% de PA + 1,5 equivalente	0,08	0,07	0,06	0,14	34	32
PLC de Rasamsonia	0,09% de PA + 1,5 equivalente	0,45	0,50	0,59	0,83	47	32
PLC de Kionochaeta	0,09% de PA + 1,5 equivalente	0,25	0,28	0,40	0,84	41	24
Emersonii	0,09% de PA	0,40	0,56	0,66	0,76	22	56

[00260] A degomagem com Rasamsonia a 60 °C mostrou formação de diglicerídeo acelerada em comparação com PLC de Kion durante as primeiras 6 horas (aplicando-se o mesmo pré-tratamento de óleo) e desempenho quase idêntico a P. emersonii testado sem qualquer adição cáustica (NAOH). Rasamsonia resultou em conversão de até 66% dos fosfolipídios nas condições testadas (60 °C, 24 horas, 30 mg de EP/kg de óleo, 0,09% de ácido fosfórico +1,5 equivalente de NaOH). O cálculo de conversão baseia-se na suposição de que 631 ppm de P total medidos por ICP são iguais a 1,58% em peso de fosfolipídio (Mw de PL médio -772 g/mol, Mw P-31 g/mol) igual ao aumento de DG máximo de 1,26% obtenível (80% de molécula de fosfolipídio).

[00261] Exemplo 9: Desempenho de Rasamsonia (U4BCJ) a 60 °C e 70 °C com e sem pré-tratamento de óleo aplicando-se ácido cítrico para pré-tratamento de óleo (70C) e (60C).

[00262] Rasamsonia (U4BCJ) (polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 22) foi aplicado no ensaio de degomagem a 60 °C e 70 °C em dosagem de enzima de 10 mg de proteína enzimática por kg de óleo, aplicando-se óleo 4/óleo 5 e em comparação com PLC de P. emersonii (polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 15). Foi medido o teor de diglicerídeos após degomagem enzimática por 2, 5 e 24 horas. Os resultados são apresentados na tabela 7A e 7B.

Tabelas 7A e 7B

Tabela 7A: Aumento de diglicerídeo (% p/p) após incubação enzimática a 70°C em óleo 4 FS-201500021.
Enzima	Pré-tratamento de óleo	Tempo de reação (horas)
2 5 \|24

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nenhuma	Nenhuma	0,02	0,00	0,14
Rasamsonia	Nenhuma	0,20	3,32	0,74
nenhuma	650 ppm de CA + 0,4 equivalente de NaOH	0,01	0,00	0,00
Rasamsonia	650 ppm de CA + 0,4 equivalente de NaOH	0,10	0,13	0,92

Tabela 7B: Aumento de diglicerídeo (% p/p) após incubação enzimática a 60 °C em óleo 5 FS-201500022.
	Pré-tratamento de óleo	Tempo de reação (horas)
2	5	24
Branco	Degomagem aquosa	3,05	0,00	0,03
Rasamsonia	Degomagem aquosa	3,23	0,48	0,99
Branco	650 ppm de CA + 0,4 equivalente de NaOH	3,04	0,06	0,00
Rasamsonia	650 ppm de CA + 0,4 equivalente de NaOH	3,00	0,01	0,46
P.emersonii	650 ppm de CA + 0,4 equivalente de NaOH	3,15	0,23	0,69
Branco	650 ppm de CA + 1,0 equivalente de NaOH	3,02	0,00	0,03
Rasamsonia	650 ppm de CA + 1,0 equivalente de NaOH	0,05	0,11	0,55
Pemersonii	650 ppm de CA + 1,0 equivalente de NaOH	0,01	0,08	0,90

[00263] A degomagem com Rasamsonia mostrou formação de diglicerídeo aumentada ao longo do tempo e bom desempenho a 60 °C assim como 70 °C em óleo pré-tratado com ácido cítrico e soda cáustica assim como sem qualquer pré-tratamento do óleo. A conversão completa de aproximadamente 96 a 100% dos fosfolipídios foi obtida a 70 °C, 24 horas, 10 mg de EP/kg de óleo, 650 ppm de CA + 0,4 equivalente de NaOH assim como 60 °C, 24 horas, 10 mg de EP/kg de óleo, sem pré-tratamento de óleo). O cálculo de conversão baseia-se na suposição de que 465 a 479 ppm de P total medidos por ICP são iguais a -1,2% em peso de fosfolipídio (Mw de PL médio -772 g/mol, Mw P-31 g/mol) igual ao aumento de DG máximo de -0,96% obtenível (80% de molécula de fosfolipídio).

Exemplo 10: Desempenho de Spiralis (U4G2D) em comparação com Marianneaea (U4DB1) a 60 °C [00264] Spiralis (U4G2D) (polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 25) foi aplicado em ensaio de degomagem a 60 °C em comparação com Mariannaeae (U4DB1) (polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 19 em dosagem de enzima de 10 mg de proteína enzimática por kg de óleo que aplica óleo

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67/79 bruto 5. Foi medido o teor de diglicerídeos após degomagem enzimática por 2, 5 e 24 horas (óleo pré-tratado com 0,065 de ácido cítrico e 1,5 equivalente de NaOH) assim como o teor de fósforo após 5 e 24 horas de incubação medido por ICP. Os resultados (média de determinação dupla) são apresentados na tabela 8.

Tabela 8

Tabela 8: Aumento de diglicerídeo (% p/p) e teor final de P após incubação enzimática a 60 °C em óleo 5 FS-2015-00023.
	Tempo de reação (horas)	P total por ICP após degomagem de x horas
	2	5	24	5	24
Branco	0,05	0,06	3,12	87	76
Spiralis	0,23	0,34	3,66	32	28
Mariannaeae	0,15	0,26	0,81	35	24

[00265] Spiralis teve bom desempenho sob as condições de reação testadas e mostrou formação de diglicerídeo mais rápida após 2 e 5 horas em comparação com Mariannaeae, que mostrou formação de DG mais alta após 24 h. Spiralis resultou em até 53% de conversão dos fosfolipídios nas condições testadas (60 °C, 24 horas, 10 mg de EP/kg de óleo, 0,065% de ácido fosfórico +1,5 equivalente de NaOH). O cálculo de conversão baseia-se na suposição de que 622 ppm de P total medidos por ICP são iguais a 1,56% em peso de fosfolipídio (Mw de PL médio -772 g/mol, Mw P-31 g/mol) igual ao aumento de DG máximo de 1,24% obtenível (80% de molécula de fosfolipídio).

Exemplo 11: Desempenho de PLC de Harzianum, Rasamsonia e Spiralis em comparação com PLC de Mariannaeae, Kionochaeta sp. e P. emersonii a 60 °C

Degomagem_________________________________________

Harzianum	U4AVE
Rasamsonia	U4BCJ
Spiralis	U4G2D
Kiono em A. niger	U4GD4
Kiono em A. oryzae	U75FP
Mariannaeae	U4DB1
Emersonii	U4DB4

[00266] Harzianum, Rasamsonia e Spiralis (polipeptídeos maduros de

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SEQ ID NOs: 28, 22 e 25, respectivamente) foram aplicados em ensaio de degomagem a 60 °C em comparação com PLC de Kionochaeta sp. (polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 17) expresso em A. niger ou em A. oryzae, Mariannaeae e PLC de P. emersonii (polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 19 e 15, respectivamente) em dosagem de enzima de 10 mg de proteína enzimática por kg de óleo que aplica óleo bruto 8. O óleo foi pré-tratado com 0,065% de ácido cítrico e 0,4 equivalente molar ou 1,5 equivalente molar de NaOH antes da degomagem com PLC de P. emersonii e todas as outras enzimas, respectivamente. Os teores de diglicerídeos após a degomagem enzimática por 2, 5 e 24 horas foram medidos por HPLC, e o teor de fósforo total após 5 e 24 horas de incubação medido por ICP. Os resultados são apresentados na tabela 9.

Tabela 9

Tabela 9: Aumento de diglicerídeo (% p/p) e teor final de P após incubação enzimática a 60 °C em óleo 7 FS-2015-00025.
	Aumento de DG após degomagem de x horas (% em p/p)	P total por ICP após degomagem de x horas (ppm)
Tempo de reação (horas)	2	5	24	5	24
Branco	0,12	0,04	0,10	57	61
Harzianum	0,65	0,84	1,12	16	20
Rasamsonia	0,26	0,17	0,39	72	56
Spiralis	0,20	0,22	0,46	65	50
Kiono em A. niger	0,21	0,36	0,89	50	48
Kiono em A. oryzae	0,29	0,51	1,04	43	24
Mariannaeae	0,24	0,38	0,97	51	45
Emersonii	0,19	0,43	0,86	31	18

[00267] Sob as condições de reação dadas (60 °C, 10 mg de EP/kg de óleo, 0,065% de ácido cítrico +1,5 equivalente de NaOH), a degomagem com PLC de Harzianum resultou em aumento de diglicerídeo e redução de fósforo mais rápidos em comparação com as outras enzimas PLC. Além disso, o teor de diglicerídeo mais alto (1,12% em p/p) após 24 h foi atingido por PLC de Harzianum, correspondendo a aproximadamente 97% de conversão dos fosfolipídios. O cálculo de conversão baseia-se na suposição de que 574 ppm

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69/79 de P total medidos por ICP são iguais a 1,44% em peso de fosfolipidio (Mw de PL médio -772 g/mol, Mw P-31 g/mol) igual ao aumento de DG máximo de 1,15% obtenível (80% de molécula de fosfolipidio).

Análise quantitativa de fosfolipídeos por LCMS/MS [00268] Cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massa de quadrupolo triplo (LC/MS/MS) ou acoplada a espectrômetro de massa de quadrupolo por tempo de voo (LC/TOF/MS) foi usada para quantificar as espécies de fosfolipídeos individuais: fosfatidilcolina (PC); fosfatidilinositol (PI); fosfatidiletanolamina (PE) e ácido fosfatidico (fosfatidato) (PA). A sensibilidade do ensaio abaixa até menos de 1 mg de fósforo/kg de óleo por PC, PE e PI (ppm) e menos de 10 mg de fósforo/kg por PA. A amostra de óleo foi dissolvida em clorofórmio. O extrato foi, então, analisado em LCTOF-MS (ou em LC-MS/MS se forem necessários limites de detecção inferiores) com o uso das seguintes definições:

Definição de LC

Eluente A: Acetonitrila a 50%, água a 50%, ácido fórmico a 0,15%

Eluente B: Acido isopropiônico a 100%, ácido fórmico a 0,15%

Tempo de execução: 26,9 min

Fluxo: 0,50 ml/min

Temperatura da coluna: 50 °C

Temperatura de autoamostrador: 15 a 25 °C

Volume de injeção: 1 μΐ

Material do tipo de coluna: Híbrido de superfície carregado, comprimento: 50 mm, tamanho: 1,7 pm, ID: 2,1 mm

Definições de MS________________________________________________

ITOF/MS ImS/MS (Xevo) |

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Capilar: 3,50 kV

Cone: 28

Extrator: 2 V

Lente RF: 0,5 V

Temperatura da fonte: 125 °C

Temperatura de dessolvatação: 500 °C

Fluxo de Gás no Cone: 30 1/hora

Fluxo de Gás de Dessolvatação: 850 1/hora

Capilar: +3,50 / -2,0 kV □ Cone: Componente específico

Extrator: 2,5 V

Lente RF:

Temperatura da fonte: 150 °C

Temperatura de dessolvatação: 500 °C

Fluxo de Gás no Cone: 30 1/hora

Fluxo de Gás de Dessolvatação: 850 1/hora [00269] Os dados foram processados com o uso do software MassLynx versão 4.1. Nos exemplos abaixo, o método é apenas denominado LCMS.

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Resultados: Tabela 10

Tabela 10: Teor de fosfolipídio [ppm de P] em óleo após incubação enzimática a 60 °C em óleo 8, determinado por LC-MS
Enzima	Tempo de reação (horas)	LysoPA	LysoPC	LysoPE	LysoPI	PA	PC	PE	PI	Soma
Branco	2	0,3	0,0	0,0	0,0	55,5	3,2	11,6	2,4	73,2
Harzianum	2	0,0	0,0	0,0	0,0	15,3	2,5	8,4	3,8	30,2
Rasamsonia	2	0,4	0,0	0,0	0,0	58,8	3,6	10,9	2,0	75,7
Spiralis	2	0,2	0,0	0,0	0,0	4-8,8	4,5	13,9	2,5	69,9
Kiono em A. niger	2	0,6	0,0	0,0	0,0	43,9	3,5	13,2	2,8	64,0
Kiono em A. oryzae	2	0,5	0,0	0,0	0,0	34,1	3,1	10,2	3,3	51,3
Mariannaeae	2	0,3	0,0	0,0	0,0	37,2	3,9	10,9	2,3	54,5
Emersonii	2	0,1	0,0	0,0	0,0	13,5	4,9	12,3	4,7	35,7
Branco	5	0,3	0,0	0,0	0,0	47,7	3,6	14,0	2,8	68,5
Harzianum	5	0,0	0,0	0,0	0,0	3,4	2,2	4,2	2,7	12,4
Rasamsonia	5	0,4	0,0	0,1	0,1	47,4	6,1	13,8	7,0	74,8
Spiralis	5	0,3	0,0	0,0	0,0	32,0	3,5	11,7	3,3	50,8
Kiono em A. niger	5	0,3	0,0	0,0	0,0	25,6	4,1	8,4	2,4	40,8
Kiono em A. oryzae	5	0,6	0,0	0,0	0,0	19,2	2,8	8,3	2,6	33,7
Mariannaeae	5	0,2	0,0	0,0	0,0	18,4	3,3	10,5	2,3	34,7
Emersonii	5	0,0	0,0	0,0	0,0	9,1	3,9	11,0	3,4	27,5
Branco	24	0,3	0,0	0,1	0,0	36,8	6,5	14,7	5,1	63,6
Harzianum	24	0,0	0,0	0,0	0,0	0,9	0,1	0,8	0,7	2,4
Rasamsonia	24	0,4	0,0	0,1	0,0	29,3	2,6	14,4	4,8	51,6
Spiralis	24	0,2	0,0	0,0	0,0	24,0	2,5	14,9	2,4	44,1
Kiono em A. niger	24	0,1	0,0	0,0	0,0	8,0	1,7	8,6	2,4	20,9
Kiono em A. oryzae	24	0,0	0,0	0,0	0,0	1,2	0,8	2,5	1,6	6,2

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Mariannaeae	24	0,2	0,0	0,0	0,0	1,4	2,5	¢,4	1,9	10,4
Emersonii	24	0,2	0,0	0,0	0,0	0,6	0,5	1,7	2,0	5,1

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73/79 [00270] A composição de fosfolipídio dos óleos após 2, 5 e 24 h de incubação é mostrada na Tabela 10. E visto que as enzimas PLC reduzem o teor de todos os quatro fosfolipídios mediante incubação até 24 h. A degomagem aplicando PLC de Harzianum resulta em diminuição mais rápida de PA, PE e PC.

Exemplo 12- Neutralização de NaOH influencia o rendimento [00271] O experimento foi realizado conforme descrito acima (consultar o cabeçalho Degomagem). Especificamente, o ácido cítrico foi dosado a 650 ppm, e a enzima foi dosada a 200 ppm. A enzima usada em todas as amostras foi uma combinação de PLC de Bacillus thuringiensis (SEQ ID NO. 11) e PLC específica para PI de Pseudomonas sp. (SEQ ID NO. 13). A quantidade de equivalentes de NaOH usada para neutralizar o CA do prétratamento foi variada, consultar a tabela 11 abaixo. Aumentar o NaOH usado até 3 a 5 equivalentes do ácido no pré-tratamento melhora o rendimento e diminui a perda de matéria seca. Isso é observado em óleo tanto de semente de colza quanto de soja. Assim, assegurar o pH correto na reação de PLC aumenta a formação de DG.

[00272] As amostras foram conforme indicado na Tabela 11 abaixo.

Tabela 11.

Frasco	equivalente de NaOH	Tipo de óleo	Perda de matéria seca (%)*	Teor de Delta DG (%) em 0,5 h
1	1,5	Oleo de soja	3,5	0,49
2	2,0	Oleo de soja	3,3	0,90
3	3	Oleo de soja	2,6	1,20
4	3,5	Oleo de soja	2,6	1,22
5	4	Oleo de soja	2,6	1,29
6	1,5	Oleo de semente de colza	7,2	0,30
7	2,0	Oleo de semente de colza	5,9	0,39
8	3,5	Oleo de semente de colza	2,3	0,99
9	4,0	Oleo de semente de colza	2,1	1,20

* perda de matéria seca e delta DG são medidos conforme descrito acima [00273] Assim, nas modalidades preferenciais, a invenção refere-se ao método de acordo com a invenção em que o tratamento com NaOH é pelo

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74/79 menos 3,0 equivalentes ao ácido de pré-tratamento, por exemplo, de 3,0 a 6,0, tal como 3 a 5,5, 3 a 5,0, 3 a 4,5 ou 3 a 4,0 equivalentes.

Exemplo 13- Redução de teor residual de fósforo e FFA[00274] Conforme mostrado no Exemplo 12, aumentar NaOH pode aumentar o rendimento conforme medido por teor de delta DG e ao mesmo tempo reduzir a perda de matéria seca.

[00275] A degomagem foi realizada da mesma maneira conforme descrito acima (consultar o cabeçalho Degomagem), com as modificações a seguir.

[00276] O óleo foi óleo de semente de colza bruto. O pré-tratamento com ácido foi por adição de 750 ou 1.500 ppm de ácido fosfórico por 15 minutos a 70 °C. 1,33, 2,0 ou 3,0 equivalentes de NaOH ao ácido foram adicionados para neutralizar o ácido e preparar para o tratamento com enzima. A hidrólise enzimática foi com PLC de Bacillus thuringiensis (SEQ ID NO. 11) e PLC específica para PI de Pseudo-monas sp. (SEQ ID NO. 13) dosada a 200 ppm, a mistura tinha 2% de água. A mistura foi incubada por 2 horas a 60 °C. Ao final da hidrólise, o refino alcalino foi realizado por adição de NaOH, 1.707 ppm a 2.040 ppm com o uso de 8% de NaOH. A quantidade total de NaOH em cada amostra foi 2.700 ppm, que corresponde a 35% em excesso do FFA no óleo bruto (1,3%).

[00277] As amostras foram preparadas de acordo com a Tabela 12 abaixo. Os resultados são também dados nessa tabela.

Tabela 12: Condições de amostra e resultados

ID de Tratamento/Frasc 0	1	2	3	4	5	6	7	8
Ácido fosfórico em ppm 75%	750 ppm	1.500 ppm
ajuste de pH 8% de NaOH	2,0 equivalentes a ácido 25% de todo NaOH	3,0 equivalentes a ácido 37% de todo NaOH	1,33 equivalentes a ácido 33% de todo NaOH	2,0 equivalentes a ácido 49% de todo NaOH
Enzima e água	200 ppm de NS40140 e 2% de água
Cáustico 8% de NaOH	2.040 ppm de NaOH 75% de todo NaOH	1.707 ppm de NaOH 63% de todo NaOH	1.820 ppm de NaOH 67% de todo NaOH	1.372 ppm de NaOH 51 % de todo NaOH
Cáustico Total	2.700 ppm de NaOH

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Água Total	4,5%	5,5%	4,5%	5,5%	4,5%	5,5%	4,5%	5,5%
Resultados
% de FFA após ácido	1,4	1,4	1,5	1,4	1,8	1,7	1,8	1,8
% de FFA após enzima	0,67	0,61	0,63	0,67	0,72	0,69	0,57	0,65
% de Delta DG	-	(0,29)	(0,33)	(0,31)	(0,19)	(0,45)	0,99	0,97
% de FFA na amostra final	0,05	0,04	0,04	0,04	0,09	0,12	((0,27))	((0,29))
ppm de fósforo na amostra final	((14)	((16))	((23))	((22))	1,5	3,6	5,7	5,2
Estimativas de rendimento	96,4%	95,6%	94,7%	95,2%	95,7%	96,1%	96,9%	96,6%

[00278] * os valores entre parênteses duplos não são ideais; os valores entre parênteses únicos são aceitáveis embora bora do alvo; e os valores sem parênteses estão dentro do alvo.

[00279] Teor de fósforo. Estimativa de rendimento, teor de FFA e degomagem delta foram determinados conforme descrito acima.

[00280] Conforme pode ser visto na tabela 12, nas amostras em que quantidades similares de NaOH foram adicionadas após o tratamento ácido como neutralização (ajuste de pH), e na etapa de refino alcalino (Soda cáustica 8% de NaOH), (Consultar o ID de Frasco 7 e 8 na Tabela 12), o teor de FFA na amostra final está abaixo do ideal. Em contrapartida, nas amostras em que a etapa de refino alcalino envolveu adição de uma quantidade de NaOH correspondente a mais de 60% do NaOH total adicionado no processo, o teor de FFA foi aceitável.

[00281] Os experimentos mostram que a dosagem de ácido antes da hidrólise enzimática e após a hidrólise enzimática influenciam o rendimento.

Exemplo 14- Degomagem enzimática - escala industrial - acidificação entre processos [00282] O objetivo desse experimento foi levar os níveis de fósforo no óleo degomado até abaixo de 30 ppm, de preferência, abaixo de 10 ppm, enquanto, ao mesmo tempo, são atingidos níveis aceitáveis de FFA (isto é, níveis de 0,1% a 0,2%), com o uso de uma etapa de separação única.

[00283] O método a seguir foi realizado em uma amostra de óleo bruto (180 kg). O óleo foi aquecido a 80 °C sob agitação suave de tanque (40% de

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76/79 velocidade do agitador). Então, um volume correspondente a 650 ppm de ácido cítrico puro (CA) foi adicionado. CA como uma solução a 30% (p/p). A mistura foi submetida a mistura por alto cisalhamento por 15 min com o uso de Sylversson HSM (o equipamento de fluxo passante é 1.000 Kgs/h) e, depois disso, a agitação mecânica por 15 min a 80 °C e a 70% da velocidade do agitador no reator. O pH foi ajustado, então, ajustado por adição de 6 mol equivalentes de NaOH. NaOH foi adicionado como uma solução a 8% (p/p).

[00284] A mistura foi submetida a mistura por alto cisalhamento por 15 min com o uso de Siversson HSM (o equipamento de fluxo passante é 1.000 Kgs/h) e, então, resfriada até 60 °C. 200 ppm de enzima (PLC de Bacillus thuringiensis (SEQ ID NO. 11) e PLC específica para PI de Pseudomonas sp. (SEQ ID NO. 13) foram adicionados. Permitiu-se que a reação enzimática ocorresse por 45 min. A mistura foi desativada por aquecimento do óleo até 80 °C no reator.

[00285] Ácido fosfórico foi adicionado (2,5 kg de ácido fosfórico/ton de óleo), e a mistura foi submetida a mistura por alto cisalhamento por 15 min. NaOH foi adicionado para neutralização com o uso de uma solução a 8%. Nanoneutralização foi realizada (70 bar) por cerca de 7 minutos, e o óleo coletado em um tanque pronto para alimentar a centrífuga GEA. Essa adição de ácido após a hidrólise enzimática, mas antes da etapa de refino alcalino, é denominada no presente documento acidifícação entre processos.

[00286] O procedimento acima resultou em aproximadamente 0,099% de FFA e 26 ppm de fósforo no óleo degomado resultante. Assim, pode-se concluir que a adição de ácido após o estágio enzimático e antes do estágio de neutralização final pode assegurar a redução completa em fósforo residual e FFA em óleos em que a quantidade de produto alcalino adicionado após o agente de quelação causa menos eficiência da etapa de neutralização alcalina pós-enzima.

Exemplo 15- Combinações de PLC

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77/79 [00287] O ensaio de degomagem foi executado conforme descrito acima (consultar o cabeçalho Ensaio de degomagem), com a modificação de que, após a hidrólise enzimática ser realizada, uma quantidade maior de produto alcalino é adicionada.

[00288] Várias combinações de enzimas foram testadas, conforme indicado na tabela abaixo.

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Tabela 13: Condição de amostra; pH 4 e 6 a 70 °C por 1 hora para reação enzimática e resultados

Frasco	Nome	Concentraçã o Enzimática	Condições ácidas / básicas para reação enzimática	Perda de matéria seca (%)	Ganho de rendimento (%)	Teor de Delta DG	PL Hidrolisado (%)
1	Branco	-	650 ppm de ácido cítrico ~pH 4	5,3	0,0	0,02	23
2	Branco	-	26
3	PLA ácido	30 ppm	3,8	1,5	0,02	47
4	54
5	PLC de Bacillus thuringiens is (SEQ ID NO. 11) e PLC específica para PI de Pseudomonas sp (SEQ ID NO. 13)	200 ppm	650 ppm de ácido cítrico + 1,5 equivalente NaOH ~pH 6	3,4	1,9	0,51	44
6	40
7 8	PLC de Bacillus macauensis (SEQ ID NO: 9) e PLC específica para PI de Pseudomonas sp (SEQ ID NO. 13)	200 ppm	2,3	3,0	1,00	68 76

[00289] Concluiu-se que o uso de degomagem enzimática em combinação com refino alcalino leva a um aumento no ganho de rendimento e perda de matéria seca diminuída. Embora todas as combinações de enzima testadas tenham resultado em um aumento, a combinação de PLC de Bacillus macauensis (SEQ ID NO: 9) e PLC específica para PI de Pseudo-monas sp. (SEQ ID NO. 13) levou ao maior aumento de rendimento, em combinação com a maior redução em perda de massa seca. Essa combinação também teve melhor desempenho em hidrólise de fosfolipídios (conforme medido após hidrólise, mas antes de tratamento alcalino) e em aumento de teor de diglicerídeo.

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79/79 [00290] Assim, a invenção em uma modalidade refere-se ao método de acordo com a invenção em que as ditas enzimas de degradação de fosfolipídio compreendem pelo menos PLC específica para PI de Pseudomonas sp. (SEQ ID NO. 13). As modalidades preferenciais referem-se aos casos em que as enzimas compreendem ou consistem em PLC específica para PI de Pseudomonas sp. (SEQ ID NO. 13) e PLC de Bacillus macauensis (polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 9).

[00291] A invenção descrita e reivindicada no presente documento não deve ser limitada no escopo pelos aspetos específicos revelados no presente documento, já que esses aspetos são concebidos como ilustrações de vários aspetos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes devem estar dentro do escopo da presente invenção. De fato, diversas modificações da invenção, adicionalmente àquelas mostradas e descritas no presente documento, serão tomadas evidentes aos versados na técnica a partir da descrição anterior. Essas modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexadas. No caso de conflito, a presente revelação, incluindo as definições, prevalecerá.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para refinar um óleo vegetal contendo fosfolipídios, caracterizado pelo fato de que compreende submeter os fosfolipídios a hidrólise enzimática colocando-se o óleo vegetal em contato com uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio sob condições que facilitam a hidrólise de fosfolipídios, submetendo, depois disso, o óleo vegetal a refino químico.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a hidrólise enzimática de fosfolipídios é realizada em um primeiro vaso de reação e o refino químico é realizado em um segundo vaso de reação, em que os dois vasos de reação são conectados de modo fluido e/ou são conectados de modo a permitir a passagem de líquido do primeiro para o segundo vaso de reação.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a hidrólise enzimática de fosfolipídios é realizada em um primeiro vaso de reação e o refino químico é realizado em um segundo vaso de reação, em que a conexão fluida entre os vasos de reação ou a passagem de líquido do primeiro para o segundo vaso de reação não é por meio de um dispositivo de separação, tal como uma centrífuga.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a hidrólise enzimática de fosfolipídios e o refino químico são realizados no mesmo vaso de reação.
5. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o refino químico é realizado imediatamente após a hidrólise enzimática; de preferência, em uma operação de processo contínuo.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a hidrólise enzimática é realizada em uma mistura de reação que compreende uma fase pesada e uma fase leve, e

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2/14 não há redução ou não há redução substancial do volume de fase pesada ou separação de gomas/fase pesada do óleo antes do dito refino químico.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende

i) Fornecer uma mistura de reação que compreende o dito óleo vegetal e uma ou mais enzimas que têm atividade de degradação de fosfolipídio, tal como uma mistura de reação conmo definida na reivindicação 2;

ii) Submeter a mistura de reação a condições que permitem a hidrólise enzimática de fosfolipídios no óleo, para fornecer uma mistura reagida do dito óleo vegetal; e iii) Submeter a mistura reagida do dito óleo vegetal a refino químico.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, uma etapa de acidificação, que é realizada após a hidrólise enzimática e antes do refino químico.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende submeter o óleo vegetal à degomagem aquosa antes de colocar o mesmo em contato com uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o óleo vegetal é selecionado dentre o grupo que consiste em óleo de açaí, óleo de amêndoa, óleo de babaçu, óleo de semente de groselha negra, óleo de semente de borragem, óleo de canola, óleo de caju, óleo de rícino, óleo de coco, óleo de coentro, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de crambe, óleo de semente de linho, óleo de semente de uva, óleo de avelã, óleo de semente de cânhamo, óleo de pinhão

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3/14 manso, óleo de jojoba, óleo de linhaça, óleo de noz macadâmia, óleo de caroço de manga, óleo de limnanto, óleo de mostarda, óleo de pé de boi, azeite de oliva, óleo de palma, óleo de caroço de palma, oleína de palma, óleo de amendoim, óleo de noz pecã, óleo de pinhão, óleo de pistache, óleo de semente de papoula, óleo de semente de colza, óleo de farelo de arroz, óleo de girassol, óleo de sasanqua, óleo de gergelim, manteiga de karité, óleo de soja, óleo de semente de girassol, resina líquida, óleo de tsubaki e óleo de noz.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o óleo vegetal é selecionado dentre o grupo que consiste em óleo de semente de colza, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de palma, óleo de coco, óleo de farelo de arroz e óleo de amendoim.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o óleo vegetal, que está em contato com uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio, é um óleo vegetal bruto.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende colocar o óleo vegetal em contato com um ou mais agentes de quelação com capacidade para formar complexos de íons de Ca e/ou Mg antes de colocar o mesmo em contato com a uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a partir de uma quantidade de óleo bruto, o dito processo fornece uma quantidade de óleo refinado, que é pelo menos 0,2% (p/p) mais alta que a quantidade de óleo refinado fornecido em um processo, em que a mesma quantidade do dito óleo bruto é submetida a refino químico sem hidrólise enzimática anterior de fosfolipídios presentes no dito óleo bruto.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6

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4/14 a 14, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação tem um pH que está na faixa de 1,5 a 12, tal como na faixa de 1,5 a 7.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 15, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação tem um teor de água na faixa de 0,5 a 10% (p/p), tal como na faixa de 1 a 10% (p/p), na faixa de 1 a 5% (p/p) ou tal como na faixa de 0,5 a 5% (p/p).
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o óleo vegetal é colocado em contato com uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio a uma temperatura que está na faixa de 45 a 90°C.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita hidrólise enzimática dos fosfolipídios tem uma duração de 6 horas ou menos, tal como 4 horas ou menos, tal como uma duração de 0,5 a 6 horas ou 0,5 a 4 horas, ou tal como duração de 5 minutos a 4 horas, tal como 5 minutos a 2 horas, 5 minutos a 1 hora ou tal como 5 a 30 minutos.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais enzimas que têm atividade de degradação de fosfolipídio são dosadas em uma quantidade total correspondente a 0,1 a 30 mg de proteína enzimática.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o óleo vegetal é colocado em contato com uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio sob condições de modo que o número de moléculas de fosfolipídio intactas seja reduzido em 30 a 100% durante a hidrólise enzimática.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o óleo vegetal é colocado em contato com uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio sob condições de modo que a reação enzimática resulte em uma redução de pelo

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5/14 menos 10% no teor de PC+PE+PI+PA no óleo, tal como pelo menos 25%, ou pelo menos uma redução de 40% no teor de PC+PE+PI+PA no óleo.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o óleo vegetal, quando foi submetido a refino químico, contém fosfolipídios em quantidades correspondentes a 20 ppm de fósforo ou menos.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o óleo vegetal e a dita uma ou mais enzimas que têm atividade de degradação de fosfolipídio são incubadas por 0,1 a 6 horas sob um conjunto de condições que compreendem

a) Uma temperatura na faixa de 45 a 90 °C;

b) Um pH na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 12,0

c) Agitação ou mistura, tal como por mistura por cisalhamento, mistura por alto cisalhamento, mistura por cavitação ou ultrassom.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o refino químico compreende fornecer uma mistura por adição do óleo vegetal com álcali, tal como uma mistura por adição da mistura reagida do dito óleo vegetal como definido na reivindicação 4, com álcali.
25. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o álcali é dosado em quantidades que são maiores do que quantidades estequiométricas em relação às quantidades de ácidos graxos livres presentes no óleo.
26. Método de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a quantidade de álcali adicionado no refino químico constitui pelo menos 60% da quantidade total de álcali adicionado no método.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que o álcali é selecionado dentre NaOH,

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KOH, carbonato de sódio e combinações dos mesmos.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de que a mistura por adição do dito óleo vegetal e do dito álcali é incubada de 1 minuto a 8 horas, tal como de 1 minuto a 5 horas, de 1 minuto a 2 horas, de 5 minutos a 8 horas, de 5 minutos a 5 horas, de 5 minutos a 2 horas, de 10 minutos a 5 horas, de 10 minutos a 2 horas, de 20 minutos a 5 horas ou de 20 minutos a 2 horas.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o refino químico compreende separar gomas e/ou borra do óleo.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 29, caracterizado pelo fato de que compreende transferir a mistura por adição de óleo vegetal e um produto químico, tal como a mistura por adição da mistura reagida do dito óleo vegetal e um produto químico, a um separador, de preferência um separador por centrifugação ou um assentador horizontal.
31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende

i) Misturar por adição o óleo vegetal ou a mistura reagida como definida na reivindicação 6, com álcali a uma temperatura de 20 a 90 °C, por exemplo, 20 a 80 °C, tal como 20 a 40 °C, em que as quantidades de álcali são maiores que as quantidades estequiométricas, ii) Incubar a mistura por adição de óleo vegetal e álcali ou a mistura por adição de mistura reagida e álcali a uma temperatura de 20 a 80 °C, tal como de 20 a 40 °C, por 2 a 15 minutos com agitação;

iii) Aumentar a temperatura da mistura por adição até 55 a 95 °C, tal como até 55 a 85 °C; e iv) Quando uma temperatura de 55 a 95 °C, tal como 55 a 85 °C, tiver sido atingida, alimentar a mistura por adição a um separador para

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7/14 separar gomas e/ou borra do óleo.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende

i) misturar por adição o óleo vegetal e ácido ou a mistura reagida e ácido com álcali, em que as quantidades de álcali são maiores que quantidades estequiométricas.

ii) alimentar a mistura por adição de óleo vegetal, ácido e álcali ou a mistura por adição de mistura reagida, ácido e álcali a um separador para separar gomas e/ou borra do óleo.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a hidrólise enzimática de fosfolipídios e o refino químico são realizados em um sistema que compreende uma unidade de dosagem de enzima, um dispositivo de mistura, uma seção de retenção, tal como tanque ou tubo, que é montado em uma linha de reação ou linha de produção de uma fábrica de refino de óleo vegetal, tal como a montante ou imediatamente a montante do equipamento para refino químico.
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais enzimas que têm atividade de degradação de fosfolipídio têm atividade de fosfolipase.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais enzimas que têm atividade de degradação de fosfolipídio compreendem uma enzima que tem atividade de fosfolipase A, uma enzima que tem atividade de fosfolipase C, uma liso-fosfolipase ou uma mistura das mesmas.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio têm uma ou mais das seguintes propriedades:

i) uma temperatura de dissociação (Td) na faixa de 50 a 95 °C,

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8/14 por exemplo, 60 a 95 °C, 70 a 95 °C, tal como na faixa de 70 a 90 °C;

ii) um pH ideal na faixa de pH 4 a 7 de pH 3 a 12, tal como na faixa de pH 3 a 6, por exemplo, 3,5 a 6 ou 4 a 6, ou tal como um pH na faixa de 5 a 9, por exemplo, 6 a 9 ou 6 a 8, ou tal como na faixa de pH 7 a 12, por exemplo, 8 a 12 ou 8 a 10;

iii) uma taxa de reação em relação a fosfolipídios em um óleo vegetal ao qual um ou mais agentes de quelação com capacidade para formar complexo de íons de Ca e/ou Mg foram adicionados, em que a dita taxa de reação é pelo menos 40% da taxa de reação da uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio em relação aos fosfolipídios no dito óleo vegetal ao qual nenhum agente de quelação foi adicionado.
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio são selecionadas dentre o grupo que consiste em:

a. Uma fosfolipase C que tem especificidade para Fosfatidilinositol (PI),

b. Uma fosfolipase C que tem especificidade para fosfatidil colina (PC) e fosfatidil etanolamina (PE).

c. Uma fosfolipase C que tem especificidade para fosfatidil colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA) e fosfatidilinositol (PI),

d. Uma combinação de uma fosfolipase A e uma fosfolipase C, tal como uma fosfolipase C em conformidade com a) ou b),

e. Uma combinação de uma fosfolipase A e uma lisofosfolipase,

f. Uma fosfolipase A,

g. uma combinação de a) e b)

h. e/ou combinações dos mesmos.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado

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9/14 pelo fato de que a dita fosfolipase A é selecionada dentre o grupo que consiste em:

a. Um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência, tal como pelo menos 75% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQIDNOs: l,4e7.

b. Um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência, tal como pelo menos 75% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 5 e 8;

c. Um fragmento do polipeptídeo de (a) ou (b) que tem atividade de fosfolipase A.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que uma dentre a dita uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio é uma variante ou é uma variante do polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4 e 7 ou é uma variante do polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 5 e 8 que compreende uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção em uma ou mais posições.
40. Método de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que uma dentre a dita uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio compreende, consiste essencialmente ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 5 e 8.
41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

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10/14 anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita fosfolipase C é selecionada dentre o grupo que consiste em:

a. um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência, tal como pelo menos 75% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 22, 25, 28,

b. um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência, tal como pelo menos 75% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 23, 26, 29; e

c. um fragmento do polipeptídeo de (a) ou (b) que tem atividade de fosfolipase C.
42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que uma dentre a dita uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipidio é uma variante do polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 22, 25 e 28 ou é uma variante do polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 23, 26 e 29, que compreende uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção em uma ou mais posições.
43. Método de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizado pelo fato de que uma dentre a dita uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipidio compreende, consiste essencialmente ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16,

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18, 20, 23, 26 e 29 ou combinações das mesmas.
44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que uma dentre a dita uma ou mais enzimas de degradação de fosfolipídio tem atividade de fosfolipase C e é selecionada dentre o grupo que consiste em:

i) Um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência, tal como pelo menos 75% de identidade de sequência, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 9 ou com o polipeptídeo apresentado na SEQ ID NO: 10.

ii) Uma variante do polipeptídeo definido em i) que compreende uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção em uma ou mais posições, iii) Um polipeptídeo que compreende, consiste essencialmente ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 8.
45. Uso de uma enzima de degradação de fosfolipídio para hidrolisar fosfolipídios em um óleo vegetal, caracterizado pelo fato de que o óleo vegetal é colocado em contato com a enzima de degradação de fosfolipídio e, depois disso, submetido a refino químico.
46. Uso de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a hidrólise enzimática dos ditos fosfolipídios é realizada em uma mistura de reação que compreende uma fase pesada ou uma fase aquosa e uma fase leve ou uma fase oleosa/fase hidrofóbica e não há redução ou não há redução substancial do volume de fase pesada ou separação de gomas/fase pesada do óleo antes do dito refino químico.

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47. Óleo vegetal refinado ou borra, caracterizada pelo fato de que é obtenível ou é obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 44.
48. Polipeptídeo isolado ou purificado, caracterizado pelo fato de que tem atividade de fosfolipase A selecionado dentre o grupo que consiste em:

a. Um polipeptídeo que tem pelo menos 75% de identidade de sequência, tal como pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 3 e 5,

b. Um polipeptídeo que tem pelo menos 75% de identidade de sequência, tal como pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 e 6;

c. Um fragmento do polipeptídeo de (a) ou (b) que tem atividade de fosfolipase A.
49. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que é uma variante do polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3 e 6 ou é uma variante do polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 e 6 que compreende uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção em uma ou mais posições.
50. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que compreende, consiste essencialmente ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 4 ou na SEQ ID NO: 6.
51. Polipeptídeo isolado ou purificado, caracterizado pelo fato

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13/14 de que tem atividade de fosfolipase C selecionado dentre o grupo que consiste em:

i) Um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22, 25, 28, ii) Um polipeptídeo que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 23, 26, 29: e iii) Um fragmento do polipeptídeo de (a) ou (b) que tem atividade de fosfolipase C.
52. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que é uma variante do polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22, 25 e 28 ou é uma variante do polipeptídeo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 23, 26 e 29 que compreende uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção em uma ou mais posições.
53. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que compreende, consiste essencialmente ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 23, 26 ou 29.
54. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 48 a 53.
55. Polinucleotídeo isolado ou purificado, caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 48 a 53.
56. Construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 55, em que o polinucleotídeo é, de preferência, ligado de maneira funcional a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

Petição 870190107125, de 22/10/2019, pág. 19/20

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57. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 55, ligado de maneira funcional a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo ou compreende o construto de ácido nucleico ou vetor de expressão como definida na reivindicação 56.
58. Célula hospedeira recombinante de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é heterólogo à célula hospedeira recombinante.
59. Célula hospedeira recombinante de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma dentre a uma ou mais sequências de controle é heteróloga ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.
60. Método para produzir o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 48 a 53, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula, que em sua forma do tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições apropriadas à produção do polipeptídeo.
61. Método de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, recuperar o polipeptídeo.
62. Método para produzir um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase A ou um polipeptídeo que tem atividade de fosfolipase C, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 57 a 59, sob condições apropriadas à produção do polipeptídeo.
63. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, recuperar o polipeptídeo.