CN114891560A - 植物油的脱胶和精制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物油的精制。本发明提供了使植物油中存在的磷脂水解并随后对该油进行化学精制的方法。
Description
本申请是申请日为2018年3月19日、申请号为2018800190977、发明名称为“植物油的脱胶和精制方法”的发明专利申请的分案申请。
序列表的引用
本申请包含处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及脱胶和精制植物油的方法。本发明还涉及具有磷脂酶A活性的多肽，具有磷脂酶C活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用这些多肽的方法。
背景技术
无论是用于人类消费还是作为油脂化学品或生物柴油生产中的原料，植物油都需要进行预处理以去除杂质，例如磷脂(“胶质”)和游离脂肪酸。预处理包括脱胶，精制(也称为“中和”，漂白和除臭)。
脱胶方法的目的是除去油中存在的可水合和不可水合的磷脂或胶质。传统上，脱胶方法基于水提取(“水脱胶”)的使用，该方法包括用水处理油并从甘油三酯油中分离可水合的磷脂或树胶。取决于油的来源，水脱胶可以与“酸脱胶”组合，其中用酸处理油，将不可水合的胶与甘油三酯油分离。
对已经水脱胶的油和粗制油进行酶促脱胶。在酶促脱胶方法中，磷脂在由具有磷脂酶活性的酶催化的反应中水解，从而转化成水溶性和水可提取的组分。
有两种一般类型的精制：“化学精制”(也称为“碱精制”)和“物理精制”。进行化学精制(其包括用碱溶液或其它精制溶液处理油)以降低游离脂肪酸含量，并且还除去其他杂质，例如磷脂、蛋白质和粘液物质和有色化合物。该方法通过将游离脂肪酸转化成高比重皂而导致游离脂肪酸大量减少，所述高比重皂通过离心除去，其中一些中性油损失。大多数磷脂和粘液物质仅以无水形式溶于油中，并且在与苛性碱或其它精制溶液水合后易于分离。碱精制后，将脂肪或油用水洗以除去残留的皂。
磷脂含量低的油(棕榈和椰子)可以进行物理精制(即蒸汽汽提)以除去游离脂肪酸。在物理精制中，粗制油或水脱胶的油中的游离脂肪酸通过蒸发除去，而不是在碱性精制方法中中和并作为皂除去。
尽管酶促脱胶最近变得更加普遍，但它从未被业界接受为与化学精制相结合的方法。令人担忧的是，生产过多的FFA会导致精制中皂形成的不希望的增加，或者酶技术在化学精制的pH条件下是不相容的：在化学精制中，第一阶段是酸螯合步骤，然后是碱性加成的高pH条件。因此，化学精制通常应用于粗制油，或如本文图2所示，应用于经过水脱胶和/或酸脱胶的油。本领域技术人员还将知道，在常规方法中，如果在施用一种或多种苛性碱或其他澄清剂之前未除去可水合和不可水合的胶质，则化学精制与相当大的产率损失相关。
尽管最近在油脱胶和精制方面取得了进展，但仍需要提供用于植物油的脱胶和精制的新颖简化方法，其中油损失最小化。本发明涉及这些新颖方法，具有磷脂酶A活性的新颖多肽，具有磷脂酶C活性的新颖多肽和编码这些多肽的多核苷酸。
发明内容
与先前认为的相反，发明人已经观察到，在精制含有磷脂的植物油时，当在以下情况时提供了相当大的优点：磷脂经历酶促水解，并且随后将油进行化学精制而不在水解和精制步骤之间分离胶相。特别地，与对粗制油或经过水脱胶的油进行化学精制相比，发明人观察到显著的产率增加。
因此，本发明在第一方面提供一种精制含有磷脂的植物油的方法，该方法包括通过使植物油与一种或多种磷脂降解酶接触使磷脂进行酶促水解，然后对植物油进行化学精制。
在第二方面，本发明涉及磷脂降解酶在植物油中水解磷脂的用途，其中植物油与磷脂降解酶接触，然后进行化学精制。
在第三方面，本发明提供精制的植物油或皂料，该植物油或皂料通过根据本发明的方法可获得或获得。
在第四方面，本发明涉及分离的或纯化的具有磷脂酶A活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：
a.与SEQ ID NO:3和5中任一个的成熟多肽具有至少75％序列同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，
b.与SEQ ID NO:4和6中任一所示的多肽具有至少75％序列同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽；
c.(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶A活性。
在第五方面，本发明提供了分离的或纯化的具有磷脂酶C活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：
i)与SEQ ID NO:19、21、23中任一个的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽，
ii)与SEQ ID NO:20、22、24中任一个所示多肽具有至少60％序列同一性的多肽：以及
iii)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶C活性。
在第六方面，本发明提供了包含根据本发明的多肽的组合物。
在第七方面，本发明提供了编码本发明的多肽的分离的或纯化的多核苷酸。
在第八方面，本发明涉及一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含本发明的多核苷酸，其中该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
在第九方面，本发明涉及一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
在第十方面，本发明提供了一种产生本发明多肽的方法，该方法包括在有利于产生该多肽的条件下培养以其野生型形式产生该多肽的细胞。
在第十一方面，本发明涉及产生具有磷脂酶A活性的多肽或具有磷脂酶C活性的多肽的方法，该方法包括在有助于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞。
附图说明
文本Lipr287是指Bacillus macauensis PLC：SEQ ID NO:9的成熟多肽
图1示出了不同的磷脂酶裂解磷脂的位置以及在磷脂上的四个主要官能团。
图2示出了植物油的处理方法，包括脱胶和精制。
图3显示了终末离心后的产率估计值。SEQ ID NO:9的成熟多肽，作为预处理用于碱性脱胶；70℃，1小时酶反应，总共3％水，总共1141ppm NaOH。
图4显示了Δ甘油二酯含量。SEQ ID NO:9的成熟多肽，作为预处理用于碱性脱胶；0℃，1小时酶反应，总共3％水，总共1141ppm NaOH。
图5显示了整体的磷脂。SEQ ID NO:9的成熟多肽，作为预处理用于碱性脱胶；70℃，1小时酶反应，总共3％水，总共1141ppm NaOH。
图6显示水解的磷脂(全部4个)。SEQ ID NO:9的成熟多肽，作为预处理用于碱性脱胶；70℃，1小时酶反应，总共3％水，1141ppm NaOH。
图7显示水解的PC+PE。SEQ ID NO:9的成熟多肽，作为预处理用于碱性脱胶；70℃，1小时酶反应，总共3％水，总共1141ppm NaOH。
图8显示了终末离心后的总磷含量。SEQ ID NO:9的成熟多肽，作为预处理用于碱性脱胶；70℃，1小时酶反应，总共3％水，总共1141ppm NaOH。
图9显示了终末离心后的总油量；650ppm Ca，总共2.5％，3000ppm NaOH，用于在70℃的碱处理。
图10显示了与空白相比的产量增益。650ppm Ca，总共2.5％水，3000ppm NaOH，用于在70℃下在低NHP油(15ppm P)中的碱处理。
图11显示碱处理前后的FFA含量；650ppm Ca，总共2.5％，3000ppm NaOH，用于在70℃的碱处理。
图12显示了Δ二甘油酯含量；650ppm Ca，总共2.5％，3000ppm NaOH，用于在70℃的碱处理。
具体实施方式
定义
碱：在本文中，“碱”可互换地指可溶于水并形成氢氧根离子的碱(例如NaOH、KOH、碳酸钠、Ca(OH)2和Mg(OH)2)以及碱在水里的溶液。
漂白：术语“漂白”是指除去产生颜色的物质和进一步纯化脂肪或油的方法。通常，在精制油之后完成漂白。
化学精制：在本申请中，术语“化学精制”与“碱性精制”和“碱精制”同义使用；该术语还涉及“苛性碱精制”和“苛性碱中和”。
粗制油：术语“粗制油”是指来自植物来源的压榨或提取的未精制和未加工的油，包括但不限于巴西莓油、杏仁油、巴巴苏油、黑加仑籽油、琉璃苣籽油、菜籽油、腰果油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、玉米油、棉籽油、海甘蓝油、亚麻籽油、葡萄籽油、榛子油、大麻籽油、麻风树油、荷荷芭油、亚麻仁油、澳洲坚果油、芒果仁油、白池花油、芥子油、牛脚油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、美洲山核桃油、松子油、开心果油、罂粟籽油、菜籽油、米糠油、红花油、油茶油、芝麻油、牛油树脂、大豆油、向日葵籽油、妥尔油、山茶油、胡桃油、经由遗传修饰生物体(GMO)或传统“育种”具有改变的脂肪酸成分的各种各样的“天然”油，例如高油酸油、低亚麻酸油或低饱和油(高油酸油菜油、低亚麻酸大豆油或、高硬脂酸向日葵油)。该术语还包括来自如上定义的来源的若干种压榨或提取的未精制和未加工的油的混合物。
除臭：“除臭”是一种真空蒸汽蒸馏方法，目的是去除在脂肪和油中产生不希望的味道、颜色和气味的痕量成分。通常，该过程在精制和漂白后完成。
分级：分级是通过熔点、溶解度或挥发性的差异来分离脂肪和油中的甘油三酯的过程。它最常用于分离在室温下为固体的脂肪，但也用于分离液体油中的甘油三酯。
胶质：在本发明的上下文中，“胶质(gum，gums)”或“胶质级分”是指富含磷脂的级分，其在脱胶过程中与大量植物油分离。“胶质”主要由磷脂组成，但也含有夹带的油，含有氮和糖以及膳食颗粒。
异源的：对于宿主细胞，术语“异源的”是指多肽或核酸不是天然存在于宿主细胞中。对于多肽或核酸，术语“异源的”是指控制序列(例如多肽或核酸的启动子或结构域)不与该多肽或核酸天然地相关联，即，控制序列是来自编码SEQ ID NO:1的多肽的基因以外的基因。
宿主细胞：术语“宿主细胞”是指其中引入了包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的任何微生物或植物细胞。引入方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、电穿孔、接合和转导。在一些实施例中，宿主细胞是分离的重组宿主细胞，其与至少一种其他组分(包括但不限于例如蛋白质、核酸、细胞等)部分或完全分离。
分离的：术语“分离的”是指多肽、核酸、细胞或其他特定材料或组分，其与天然发现的与其天然相关联的至少一种其他材料或组分(包括但不限于，例如，其他蛋白质，核酸，细胞等)分离。分离的多肽包括但不限于含有分泌的多肽的培养液。
溶血磷脂酶：“溶血磷脂酶”(EC 3.1.1.5)是能够水解2-溶血磷脂以释放脂肪酸的酶。
可以使用蛋黄L-α-溶血卵磷脂作为底物，用NEFA C测定试剂盒测量溶血磷脂酶活性(LLU)。将20μl样品与100μl 20mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)和100μl 1％L-α-溶血卵磷脂溶液混合，并在55℃孵育20分钟。20分钟后，将反应混合物转移至NEFA试剂盒中的在37℃预热的含有30μl溶液A的管中。在37℃孵育10分钟后，将NEFA试剂盒中的600μl溶液B加入到反应混合物中并在37℃下孵育10分钟。在分光光度计上在555nm处测量活性。一个单位的溶血磷脂酶活性(1LLU)定义为在55℃时可以使A550每分钟增加0.01的酶量。
成熟多肽：术语“成熟多肽”是指翻译和任何翻译后修饰(例如N-末端加工，C末-端截短，糖基化，磷酸化，和信号肽、前肽和前原肽的去除)之后的最终形式的多肽。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞以不同的方式加工多肽，且因此表达多核苷酸的一种宿主细胞当与表达相同多核苷酸的另一种宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，所述核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。
磷脂酶A活性：在本发明的背景中，术语“磷脂酶A活性”包括具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性(A1或A2，EC3.1.1.32或EC3.1.1.4)的酶，该活性即对磷脂例如卵磷脂的一个或两个羧酸酯键的水解活性。同时具有A1和A2活性的磷脂酶也被称为磷脂酶B。
出于本发明的目的，磷脂酶A活性优选地根据以下程序确定：
磷脂酶A活性(LEU)
在LEU测定中，磷脂酶A活性由在pH 8.0，40℃下水解卵磷脂的能力确定。在水解反应滞后，用NaOH来滴定，反应时间为2分钟。披露于WO 1998/26057中的来自尖孢镰孢菌(LIPOPAN F)具有1540LEU/mg酶蛋白的活性并且可以被作为标准使用。
平板测定
A)缓冲液是100mM HEPES和100mM柠檬酸盐的混合物，其中pH从pH 3.0调节至pH7.0。
B)通过在缓冲液(A)中混合和蒸煮5分钟然后冷却至约60℃制备2％琼脂糖(LitexHSA 1000)。
C)底物是L-α磷脂酰胆碱，95％来自大豆(Avanti 441601)，用Ultra Turrax在60℃下于水(MilliQ)中分散1分钟。
D)将LECITASE ULTRA的纯化酶溶液和SEQ ID NO:2的成熟磷脂酶稀释至0.4mg/ml。
通过如下浇注平板：将5ml底物(C)和5ml琼脂糖(B)温和地混合进入直径为7cm的皮氏培养皿中并冷却至室温，然后通过真空冲压直径约3mm的孔。向每个孔中加入10微升稀释的酶(D)，然后用封口膜密封平板，并置于55℃的培养箱中48小时。将平板定期取出进行拍摄。
磷脂酶活性：在本发明的上下文中，术语“磷脂酶活性”是指甘油磷脂或基于甘油的磷脂的水解的催化作用。
促进磷脂水解的条件：选择将促进磷脂降解酶水解磷脂的条件在本领域技术人员的技能范围内，并且包括例如调节磷脂降解酶活性的pH和/或温度。
磷脂酶C活性：术语“磷脂酶C活性”或“PLC活性”涉及从磷脂中除去磷酸酯部分以产生1,2-二酰基甘油的酶活性(见图1)。大多数PLC酶属于水解酶和磷酸二酯酶家族并大体上分类为EC 3.1.4.3，E.C.3.1.4.11或EC 4.6.1.13。磷脂酶C活性可根据以下磷脂酶C测定中描述的程序确定：
磷脂酶C活性测定：将包含10微升100mM对硝基苯基磷酰胆碱(p-NPPC)在100mMBorax-HCl缓冲液(pH 7.5)中的溶液和90微升酶溶液的反应混合物在微量滴定板孔中在环境温度下混合。www然后将微量滴定板置于微量滴定板读数器中，通过测量410nm处的吸光度来定量释放的对硝基苯酚。在30分钟内以1分钟的间隔记录测量值。通过将来自西格玛公司(Sigma)的10微摩尔/ml对硝基苯酚储备溶液在Borax-HCl缓冲液中稀释来制备0.01微升/ml-1微升/ml对硝基苯酚的校准曲线。一个单元将在环境温度下释放1.0微摩尔/分钟的p-NPPC。
磷脂酶C特异性：术语“磷脂酶C特异性”涉及具有磷脂酶C活性的多肽，其中该活性对一种或多种磷脂是特异性的，四种最重要的磷脂曾经是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)(见图1)。磷脂酶C特异性可通过31P-NMR测定，如上文关于术语“磷脂酶活性”所述。
PC和PE特异性磷脂酶C：术语“PC和PE特异性磷脂酶C”和“具有针对磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的特异性的磷脂酶C”和“具有针对磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的活性的多肽”可互换使用。它们涉及对磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)有活性的多肽。除了PC和PE特异性，它还可能对磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)具有一些活性。优选地，当在酶的最佳pH和10mg/kg的酶剂量下使用实例1中的P-NMR测定时，PC和PE特异性的磷脂酶C从具有至少100ppm PC和100ppm PE的油或脂肪中去除至少30％PC和至少30％PE。更优选地，它去除40％、50％、60％、70％或80％，甚至更优选地，它去除90％并且最优选地它去除90％到100％之间的油或脂肪中的PC并且40％、50％、60％、70％或80％，甚至更优选地它去除90％并且最优选地它去除90％到100％之间的油或脂肪中的PE。
PI特异性磷脂酶C：术语“PI特异性磷脂酶C”、“磷脂酰肌醇磷脂酶C”和“具有针对磷脂酰肌醇(PI)的活性的多肽”可互换使用。它们涉及具有针对磷脂酰肌醇(PI)的活性的多肽，这意味着与对PI活性相对，它对磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)的活性较低。PI特异性的磷脂酶C酶可或属于分类为EC3.1.4.11的水解酶和磷酸二酯酶家族或属于分类为EC 4.6.1.13的脂肪酶家族。PI特异性的磷脂酶C活性可以根据实例5中描述的步骤来确定。优选地，当在酶的最佳pH和10mg/kg的酶剂量下使用实例1中的P-NMR测定时，PI特异性的磷脂酶C从具有至少50ppm PI的油或脂肪中去除至少30％PI。更优选地，它去除40％、50％、60％、70％或80％，甚至更优选地它去除90％并且最优选地它去除90％到100％之间的油或脂肪中的PI。
优选地，与它能去除的PC、PE或PA的量相比，PI特异性磷脂酶C至少多去除20％PI，与它能去除的PC、PE或PA的量相比，更优选地至少30％、40％，甚至更优选地至少50％并且最优选地至少多60％PI。
PC-、PE-、PA-和PI-特异性磷脂酶C：术语“PC、PE、PA和PI特异性磷脂酶C”和“具有针对磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)的活性的多肽”可以互换使用。它们涉及对磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)有活性的多肽。更优选地，当在酶的最佳pH和10mg/kg的酶剂量下使用实例1中的P-NMR测定时，PC、PE、PA、和PI特异性磷脂酶C从具有至少100ppm Pc、75ppm Pe、5ppm Pa和50ppmPI的油或脂肪中去除四种磷脂中每一种的至少30％。更优选地，它去除40％、50％、60％、70％或80％，甚至更优选地，它去除90％并且最优选地它去除90％到100％之间的油或脂肪中的PC并且40％、50％、60％、70％或80％，甚至更优选地它去除90％并且最优选地它去除90％到100％之间的油或脂肪中的PE。
纯化的:术语“纯化的”是指如基本上不含与其天然相关联的其他组分的核酸或多肽，这通过本领域熟知的分析技术(例如，在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经过密度梯度离心的培养基中，纯化的多肽或核酸可形成离散的条带)测定。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，以摩尔计的重量百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，对于所述分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
重组体：当用于提及主题细胞、核酸，蛋白质或载体时，术语“重组体”表示受试者已经从其天然状态经修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或与天然发现的相比，以不同水平表达或在不同条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列的差异在于一个或多个核苷酸和/或与异源序列(例如，表达载体中的异源启动子)可操作地连接。重组蛋白质与天然序列的差异可以在于一个或多个核苷酸和/或与异源序列融合。包含编码多肽的核酸的载体是重组载体。术语“重组体”与“遗传修饰的”和“转基因的”同义。
反应速率：出于本发明的目的，“反应速率”与“反应的速率”同义，并且根据IUPAC,Compendium of Chemical Terminology[化学术语汇编],第二版(“Gold Book[金皮书]”)(1997)定义：“反应的速率”。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使尼德尔程序报告最长同一性，必-须在命令行中指定非简化(nobrief)选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
皂料：在目前的情况下，“皂料”是指含有皂的级分，其在化学精制过程中与大量植物油分离。皂是通过精制化学品(例如碱)与植物油中存在的游离脂肪酸的反应形成。皂料的确切组成取决于获得它们的植物油来源；例如，棉籽皂料主要由水分和溶剂、脂肪酸、有机磷酸酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、甾醇、多元醇，碳水化合物和其他混杂组分构成。大多数这类有机化合物存在于其他植物油的皂料中。
化学计量的量：术语“化学计量的量”实际上是指化学计量所需量的量度；即以下情况下的最佳量：假设反应进行到完全，所有试剂都被消耗，试剂没有缺乏，并且试剂没有过量。
在本发明的上下文中，“化学计量的量”特别指加入反应混合物中的试剂(例如碱，例如NaOH)的摩尔数，其等于在所述反应混合物中该试剂在与之反应的化合物(例如游离脂肪酸和/或作为钙螯合剂添加的酸，例如柠檬酸)的摩尔数。
水脱胶：术语“水脱胶”是指一种方法，该方法包括用一定量的水处理粗制油以使油中存在的磷脂水合并使它们通过离心分离。
在第一方面，本发明提供一种精制含有磷脂的植物油的方法，该方法包括在促进磷脂水解的条件下使植物油与一种或多种磷脂降解酶接触，使磷脂进行酶促水解，然后对植物油进行化学精制。
在本发明的优选实施例中，在所述化学精制之前，没有或几乎没有酶促水解的反应产物与油的分离。因此，磷脂的酶促水解可以在第一反应容器中进行，化学精制可以在第二反应容器中进行，两个反应容器流体连接和/或连接以允许从第一反应容器到第二反应容器的液体通道。
在进一步优选的实施例中，磷脂的酶促水解和化学精制在同一容器中进行。也就是说，磷脂的酶促水解在反应容器中进行，化学精制在酶促水解后在同一反应容器中进行。这些实施例避免了将第一反应容器的内容物转移到第二反应容器的需要，因为两个反应都在同一个反应容器中进行。
在进一步的实施例中，化学精制与酶促水解同时或在酶促水解之后进行，优选在酶促水解之后进行。
本发明的方法可以作为分批方法或作为连续方法进行。因此，该方法可以适用于现有的方法设置，无论是分批操作还是工业中使用的典型连续方法。一个特定的实施例涉及根据本发明的方法，其中化学精制在酶促水解后立即进行；优选地，以连续方法操作进行。
还应理解，磷脂的酶促水解可在第一反应容器中进行，化学精制可在第二反应容器中进行，其中反应容器之间的流体连接或从第一反应容器到第二反应容器的液体通道不经由分离装置，例如离心机。
在一些实施例中，根据本发明的方法是一种方法，其中
-酶促水解在包含重相或水相和轻相或油相/疏水相的反应混合物中进行，并且
-在所述化学精制之前，没有减少或没有显著减少重相体积或将胶质/重相与油分离。
在常规的脱胶中，例如通过使用高剪切混合器混合两相，并且产生乳液。在乳液中，酶与磷脂反应产生水溶性反应产物。例如通过离心破坏乳液，将水溶性反应产物与油分离。根据本发明的方法优选不包括将含有水溶性反应产物的重相/水相或其部分与轻相、油相或疏水相分离的任何步骤。
优选地，酶促水解通过使所述植物油与一种或多种具有磷脂酶活性的酶接触来进行。
根据本发明的方法可以包括
i)提供包含所述植物油和一种或多种具有磷脂降解活性的酶的反应混合物，例如包含重相或水相和轻相或油相/疏水相的反应混合物；
ii)使该反应混合物经受允许酶促水解油中磷脂的条件，以提供所述植物油的经反应的混合物；以及
iii)使所述植物油的经反应的混合物经受化学精制。
根据本发明的方法可以进一步包括在将植物油与一种或多种磷脂降解酶接触之前对植物油进行水脱胶。
在进一步的实施例中，植物油选自由以下组成的组：巴西莓油、杏仁油、巴巴苏油、黑加仑籽油、琉璃苣籽油、菜籽油、腰果油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、玉米油、棉籽油、海甘蓝油、亚麻籽油、葡萄籽油、榛子油、大麻籽油、麻风树油、荷荷芭油、亚麻仁油、澳洲坚果油、芒果仁油、白池花油、芥子油、牛脚油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、美洲山核桃油、松子油、开心果油、罂粟籽油、菜籽油、米糠油、红花油、油茶油、芝麻油、牛油树脂、大豆油、向日葵籽油、妥尔油、山茶油和胡桃油。
在本发明的优选实施例中，植物油选自由以下组成的组：菜籽油、大豆油、向日葵籽油、棕榈油、椰子油、米糠油和花生油/落花生油。从商业角度来看，这些植物油被认为是重要的，因为它们是丰富的并且加工大量的植物油以满足消费者对极浅色食用油的偏好或用作生物燃料生产的原料。
在本发明的一些实施例中，与所述一种或多种磷脂降解酶接触的植物油是粗制植物油。
根据本发明的方法可以包括在使植物油与一种或多种磷脂降解酶接触之前使植物油与一种或多种能够络合Ca和/或Mg离子的螯合剂接触。合适的螯合剂可选自由柠檬酸、磷酸、乳酸和乙二胺四乙酸(EDTA)组成的组。
反应混合物可以具有pH，该pH可以为1.5-7。如技术人员将理解的，调节pH的要求取决于所用酶的要求和已添加的任何螯合剂的量。特别地，pH可以在3-7的范围内，例如3.5-6.6，在3-5的范围内，例如3.5-4.5，或在5-7的范围内，例如4.5-6.5。
在一个实施例中，通过添加碱来调节pH，例如通过添加NaOH、KOH、碳酸钠或其组合。在特定实施例中，用于中和预处理的酸的碱的当量的量为1.2至7当量，例如1.5至6，1.5至5当量；或者针对酸例如2至7，3至7或者例如3至7或3至5当量；更具体地，一种或多种磷脂降解酶包含SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.13或由其组成。
在根据本发明的方法中，反应混合物的水含量范围为0.5％-10％(w/w)，例如范围为1％-10％(w/w)，范围为1％-5％(w/w)，例如范围为0.5％-5％(w/w)，例如水含量为5％(w/w)或更低，例如水含量为4％或更低或如水含量为3％或更低。
植物油与一种或多种磷脂降解酶在范围为45℃-90℃(例如范围为50℃-90℃、60℃-90℃、60℃-80℃、65℃-75℃或例如65℃-75℃)的温度下接触。
磷脂的酶促水解可具有6小时或更短的持续时间，例如4小时或更短的持续时间，例如0.5-6小时的持续时间，或0.5-4小时的持续时间，或例如5分钟-4小时的持续时间，例如5分钟至2小时的持续时间，5分钟至1小时的持续时间或例如5-30分钟的持续时间。
具有磷脂降解活性的一种或多种酶可以以相当于0.1mg-30mg酶蛋白的总量给予。
在根据本发明的方法中，植物油优选在一定条件下与一种或多种磷脂降解酶接触，这些条件使得在酶促水解期间整体磷脂分子的数量减少30％-100％，例如减少30％-90％、30％-80％、30％-70％或例如减少30％-60％。整体磷脂分子的百分比可以通过磷脂酰胆碱(PC)+磷脂酰乙醇胺(PE)+磷脂酰肌醇(PI)+磷脂酸(PA)(PC+PE+PI+PA)相对于反应前油中PC+PE+PI+PA的含量在反应后存在的百分比来确定。磷脂的含量可通过31P-NMR分析或液相色谱-质谱(LC-MS)确定。在一些实施例中，植物油在一定条件下与一种或多种磷脂降解酶接触，这些条件使得酶反应导致油中PC+PE+PI+PA含量降低至少10％，例如至少25％，或油中PC+PE+PI+PA含量降低至少40％。应理解，本发明方法提供的增加产率的益处将提供不需要完全或接近完全水解磷脂；甚至油中存在的磷脂的部分水解也将改善油的产率和化学精制后皂相的分离容易性。
当根据本发明的方法进行化学精制时，植物油优选含有相当于20ppm磷或更少的磷脂，例如15ppm或更少，例如10ppm或更少，或者例如5ppm或更少。优选地，磷脂的量根据AOCS官方方法Ca 20-99(2009)、通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)的油中磷分析、AOCS的官方方法和推荐实践(AOCS出版社,香槟市IL(Champaign IL))来确定。关于如何确定油中磷含量的进一步指导在以下中提供：Z.Benzo等人:Determination ofphosphorus in edible oils by inductively coupled plasma-Atomic emissionspectrometry and oil-in-water emulsion of sample introduction[电感耦合等离子体原子发射光谱法和样品引入的水包油乳液法测定食用油中的磷]，Journal of theAmerican Oil Chemists'Society[美国石油化学家协会杂志],2000年九月,第77卷,第9期,第997-1000页。
在本发明进一步优选的实施例中，植物油和所述一种或多种具有磷脂降解活性的酶在一组条件下孵育0.1-6小时，例如0.25-6小时，或例如0.5-6小时，该组条件包括
a)温度范围为45℃-90℃或例如范围为60℃-80℃；
b)pH范围为约1.5至约12.0，例如范围为1.5至7.0，范围为pH 4-7，范围为3-6，范围为6-9，或者范围为pH 7-12。
c)搅拌或混合，例如通过剪切混合、高剪切混合、空化混合或超声波。
在本发明的优选实施例中，化学精制在酶促水解之后进行。在进一步优选的实施例中，化学精制在酶促水解后立即进行，没有中间分离步骤。如上所述，化学精制步骤可以在与进行酶促水解的同一反应容器中进行。
当根据本发明进行时的化学精制可以包括提供植物油与碱的掺和物，例如如上定义的所述植物油的经反应的混合物与碱的掺和物。
碱优选以相对于油中存在的游离脂肪酸的量大于化学计量的量给予。如本领域技术人员将理解的，在该方法中给予的碱的量优选大于足以中和游离脂肪酸和任何螯合剂(例如柠檬酸、乳酸或磷酸)的量。
特别地，碱可以选自NaOH、KOH、碳酸钠及其组合。
发明人已经出人意料地发现，用于中和任何酸预处理的碱的量与化学精制中给予的碱的量之间的关系可以对最终样品中的磷减少和FFA酸含量具有有益的影响(参见实例12)。因此，本发明的具体实施例涉及根据本发明的方法，其中在化学精制中添加的碱的量构成该方法中添加的碱的总量(即，在酸预处理后添加碱(以在酶水解之前调节pH)，连同针对化学精制添加的碱)的至少60％；优选地，在碱性精制步骤中添加的碱的量的范围为60％-90％，例如60％-85％，60％-80％，60％-78％，或例如62％-76％。
或者，本发明可以描述为其中在酸预处理之后在pH调节步骤中添加的碱(例如NaOH)的量构成碱的总量(即，在酸预处理后添加碱(以在酶水解之前调节pH)，连同针对化学精制添加的碱)的至多40％；优选地，在pH调节步骤中添加的碱的所述量的范围为10％-40％，例如15％-40％，20％-40％，例如40％-22％，或例如24％-48％。
在根据本发明的方法中，所述植物油和所述碱的掺和物优选孵育从1分钟至8小时、例如从1分钟至5小时、从1分钟至2小时、从5分钟至8小时、从5分钟至5小时、从5分钟至2小时、从10分钟至5小时、从10分钟至2小时、从20分钟至5小时或从20分钟至2小时。
发明人出人意料地表明，引入在酶促水解之后和化学精制之前进行的进一步酸化步骤可以减少脱胶后最终样品中的磷量(参见实例14)。因此，一些实施例涉及根据本发明的方法，该方法进一步包括在酶促水解之后和化学精制之前进行的酸化步骤。
本发明的具体实施例涉及以下情况：用于中和预处理的酸的碱当量的量的范围为0.5至7当量、例如0.5至6当量、0.5至5当量、或例如1.2至7当量、例如1.5至6当量、1.5至5当量；或者针对酸例如2至7、3至7或例如3至7或3至5当量，并且该方法包括如所述的进一步酸化步骤。
在包含进一步酸化步骤的本发明的具体实施例中，一种或多种磷脂降解酶包含SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.13或由其组成。
根据本发明进行的化学精制优选包括从油中分离胶质和/或皂料。
因此，本发明的方法可以包括将植物油和化学品的掺和物(例如所述植物油的经反应的混合物和化学品的掺和物)转移到分离器，优选离心分离器或水平沉降器。
在工业中，化学精制通常使用所谓的“长混合”或“短混合”方法或其变体进行。在“长混合方法”中，在相对较低的温度(例如20℃-40℃)下将相对大量过量的苛性碱混入油中，在搅拌下引入的保持时间为3-6分钟，然后通过将油/皂混合物加热至60℃-80℃来破坏油/皂混合物。然后将混合物加入分离器中(例如离心分离器)，将离开离心机的油流进行加热、水洗和干燥(例如在真空喷雾干燥器中)。在“短混合方法”中，向油中加入相对小量过量的碱，然后将混合物几乎立即加入分离器中(例如离心分离器)，水洗并干燥。
在两种方法中，随后可以将油漂白以除去有色化合物并除臭以除去挥发性气味和味道化合物。
因此，在特定实施例中，根据本发明的方法包括
i)将植物油或如上所述的经反应的混合物与碱在20℃-90℃，例如20℃-80℃，例如20℃-40℃的温度下混合，碱的量大于化学计量的量，
ii)将植物油和碱的掺和物或经反应的混合物和碱的掺和物在20℃-80℃，例如20℃-40℃的温度下在搅拌下孵育2-15分钟；
iii)将掺和物的温度升至55℃-95℃，例如升至55℃-85℃；以及
iv)当温度达到55℃-95℃，例如55℃-85℃时，将掺和物馈入分离器以将胶质和/或皂料与油分离。
在本发明的可替代的实施例中，该方法包括
i)将植物油或如上定义的经反应的混合物与碱混合，碱的量大于化学计量的量。
ii)将植物油、酸和碱的掺和物或经反应的混合物、酸和碱的掺和物馈入分离器中以将胶质和/或皂料与油分离。
例如，在以下中公开了用于苛性碱精制的“短混合”和“长混合”方法：A.J.Dijkstra:Degumming,Refining,Washing and Drying Fats and Oils；inProceedings of the World Conference on Oilseed Technology and Utilization[脱胶、精制、洗涤和干燥脂肪和油；在世界油籽技术和利用会议论文集中](1992),Budapest,Hungary；T.H.Applewhite(编辑)；第138-151页；以及Lipid Handbook[脂质手册],第三版；F.D.Gunstone,J.L.Harwood,A.J.Dijkstra(编辑),CRC出版社,泰勒弗朗西斯集团(Taylor&Francis Group),碎音大道6000(6000Broken Sound Parkway)NW,300号(Suite300),波卡拉顿(Boca Raton),FL 33487-2742,泰勒弗朗西斯集团
2007；参见第3章:Production and refining of oils and fats[生产和精制脂肪],A.J.Dijkstra和J.C.Segers:长混合方法在193页描述，短混合方法在第195页描述:
使用纳米中和方法使用加压设备的苛性碱精制在www.nanoneutralization.com上公开。
所述一种或多种具有磷脂降解活性的酶可包括具有磷脂酶A活性的酶、具有磷脂酶C活性的酶、溶血磷脂酶或其混合物。
若干类型的磷脂酶是已知的，根据在磷脂分子中攻击的键的位置它们的特异性不同。磷脂酶A1(PLA1)除去1-位置的脂肪酸产生游离脂肪酸和1-溶血-2-酰基磷脂。磷脂酶A2(PLA2)除去2-位置的脂肪酸产生游离脂肪酸和1-酰基-2-溶血磷脂。术语磷脂酶B(PLB)被用于具有A1活性和A2活性两者的磷脂酶。磷脂酶C(PLC)除去磷酸盐部分产生1,2-二酰基甘油和磷酸酯。磷脂酶D(PLD)产生1,2-二酰基甘油磷酸盐和碱性基团(见图1)。
有关酶促脱胶的综述参见迪杰斯特拉(Dijkstra)2010，欧洲脂质科学与技术杂志(Eur.J.Lipid Sci.Technol.)112，1178。磷脂酶A和/或磷脂酶C在脱胶中的使用例如被描述于克劳森(Clausen)2001，欧洲脂质科学与技术杂志，103 333-340，WO2003/089620和WO2008/094847。磷脂酶A的解决方案产生溶血磷脂和游离脂肪酸，导致油损失。另一方面，磷脂酶C具有产生甘油二酯(图2)的优点，该甘油二酯将保留在油中，因此将减少损失。在植物油中有四种主要的磷脂：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)。磷脂酶C酶对这些磷脂具有不同的特异性。可商购的磷脂酶C是对PC和PE具有特异性的范恩尼姆(Verenium)/DSM的Purifine(迪杰斯特拉(Dijkstra)，第101届AOCS年会，2010年10月)。WO07/059927描述了用于脱胶的热稳定的芽孢杆菌(Bacillus)PLC。WO 2012/062817描述了对所有四种磷脂具有特异性的真菌PLC。
为了本发明的目的，优选具有磷脂酶降解活性的一种或多种酶包括PLC：除了发明人观察到的产率增加之外，通过PLC水解磷脂不会导致游离脂肪酸的形成也是相关的。通常，期望在植物油加工过程中使游离脂肪酸的产生最小化。
在本发明的上下文中，已经观察到，与使用PLC相比，当使用PLA在化学精制之前水解磷脂时，产率增加通常更低。然而，使用PLA也可以实现根据本发明方法的其它益处，其包括在所得皂料中含有更低水平的磷脂和更低的皂料黏度。在本发明的某些实施例中，溶血磷脂酶可以是优选的，因为它将乳化的溶血磷脂转化为非乳化化合物。
关于本发明的方法，一种或多种磷脂降解酶可具有以下一种或多种性质：
i)解离温度(Td)的范围为50℃-95℃，例如60℃-95℃、70℃-95℃、例如范围为70℃-90℃；
ii)最佳pH的范围为pH 3-12，例如范围为pH 4-7，或例如范围为3-6的pH，例如3.5-6或4-6，或例如范围为5-9的pH，例如6-9或6-8，或例如范围为7-12的pH，例如8-12或8-10。
优选地，一种或多种磷脂降解酶对植物油(其中添加了一种或多种能够络合Ca和/或Mg离子的螯合剂)中的磷脂具有反应速率，所述反应速率是一种或多种磷脂降解酶对其中未添加一种或多种螯合剂的所述植物油中的磷脂的反应速率的至少30％、例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或例如至少90％。如上所述，合适的螯合剂可选自由柠檬酸、磷酸、乳酸和EDTA组成的组。在这些实施例中，植物油优选是粗制大豆油，并且螯合剂优选是柠檬酸(以相当于500ppm-1000ppm的量添加，例如650ppm)。
一种或多种磷脂降解酶可特别选自由以下组成的组：
a.具有针对磷脂酰肌醇(PI)的特异性的磷脂酶C，
b.具有针对磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的特异性的磷脂酶C，优选Bacillus macauensis PLC，SEQ ID NO.9
c.具有针对磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)的特异性的磷脂酶C，
d.磷脂酶A和磷脂酶C(例如a)或b)中定义的磷脂酶C)的组合，
e.磷脂酶A和溶血磷脂酶的组合。
f.磷脂酶A，
g.a)和b)的组合
或其组合。
在本发明的具体实施例中，磷脂酶A选自由以下组成的组：
a.与SEQ ID NO:1、4和7中任一个的成熟多肽具有至少60％序列同一性，例如至少75％序列同一性、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的多肽
b.与SEQ ID NO:2、5和8中任一所示的多肽具有至少60％序列同一性，例如至少75％序列同一性、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；
c.(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶A活性。
在本发明的进一步具体实施例中，磷脂酶A选自下组：市可商购的PLA(包括PLA
10L,
Novo,
Ultra and
LowP，其均可从诺维信公司(Novozymes A/S)获得)和GumZymeTM(其从DSM获得)、
油(其可从杜邦公司获得)和
PL-XTRA和
mpl(其可从AB酶公司(AB Enzymes)获得)。
优选地，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:1的成熟多肽的和/或SEQ ID NO:3的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的磷脂酶A活性。
在根据本发明的具体实施例中，所述一种或多种磷脂降解酶之一是SEQ ID NO:1、4和7中任一个的成熟多肽的变体，或者是SEQ ID NO:2、5和8中任一所示的多肽的变体，所述变体包含在一个或多个位置处的取代、缺失和/或插入。
特别地，所述变体可以包含在不超过20个位置(例如不超过19、18、17、16、15、14、13、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置)处的取代、缺失和/或插入。
在其他实施例中，所述一种或多种磷脂降解酶之一包含SEQ ID NO:2、5和8中任一所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
在根据本发明的方法中，所述磷脂酶C可以选自由以下组成的组：
a.与SEQ ID NO:9(Bacillus macauensis PLC)、11(苏云金芽孢杆菌PLC)、13(假单胞菌属物种PI特异性PLC)、15(埃默森青霉菌(P.emersonii)PLC)、17(锥毛壳属(Kionochaeta)PLC)、19(玛丽安丛赤壳菌(N.mariannaeae)PLC)、22(Rasamsonia PLC)、25(旋毛线虫(T.Spiralis)PLC)、28(哈茨木霉(T.harzianum)PLC)中任一个的成熟多肽具有至少60％序列同一性，例如至少75％序列同一性、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽，
b.与SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、23、26、29中任一所示的多肽具有至少60％序列同一性，例如至少75％序列同一性、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；以及
c.(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶C活性。
特别地，所述一种或多种磷脂降解酶之一可以是SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、22、25和28中任一个的成熟多肽的变体，或者是SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、23、26和29中任一所示的多肽的变体，所述变体包含在一个或多个位置处的取代、缺失和/或插入。
在其他实施例中，所述一种或多种磷脂降解酶之一包含SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、23、26和29中任一所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
在本发明的其他具体实施例中，磷脂酶C选自下组：可商购的PLC，包括可从DSM获得的
和可从诺维信公司(Novozymes A/S)获得的
Boost。
一个优选的实施例涉及其中所述至少一种磷脂降解酶包含SEQ ID NO.9(Bacillus macauensis PLC)或由其组成。
进一步优选的实施例涉及其中所述至少一种磷脂降解酶包含以下或由以下组成：具有针对磷脂酰肌醇(PI)的特异性的磷脂酶C，以及具有针对磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的特异性的磷脂酶C，优选Bacillus macauensis PLC，SEQ ID NO.9。
溶血磷脂酶可以选自下组：可商购的溶血磷脂酶，包括FinizymTM，其可从诺维信公司(Novozymes)获得。
本发明的方法还可包括漂白、除臭和分级步骤。
通常的漂白方法是通过在吸附材料上吸附产生颜色的物质。酸活化的漂白土或黏土(有时称为膨润土)是最广泛使用的吸附材料。该物质主要由水合硅酸铝组成。无水硅胶和活性炭也在有限程度上用作漂白吸附剂。
脂肪和油的除臭是使用蒸汽从脂肪或油中除去相对挥发性的组分。这是可行的，因为在赋予脂肪和油以及甘油三酯的味道、颜色和气味的物质之间的挥发性存在巨大差异。在真空下进行除臭以促进挥发性物质的去除，避免脂肪的过度水解，并最有效地使用蒸汽。在植物油的情况下，在除臭后足够的生育酚保留在成品油中以提供稳定性。
除臭对大多数脂肪或油的脂肪酸组成没有任何显著影响。取决于被除臭的油的不饱和度，可以通过异构化形成少量的反式脂肪酸。
在室温下为固体的脂肪通常含有许多单独的甘油三酯的混合物，所有甘油三酯都具有不同的熔点。这些组分可以通过分级方法彼此分离。
分级的结果是产生两种组分，称为级分，它们的物理性质通常彼此显著不同。可以将级分再次分级(“双”分级)以产生另外的级分，其将具有独特的物理性质。该方法最初开发用于对动物脂肪例如牛脂分级。
有两种类型的分级技术：干法和湿法。干法分级是指不使用溶剂来帮助分离脂肪组分的方法。首先将脂肪熔化，然后缓慢冷却以产生大的高熔点脂肪晶体。将悬浮在液体油中的晶体浆液转移到高压压滤机中，挤出液体(油酸甘油酯)级分，并将硬(硬脂酸甘油酯)脂肪保留在过滤器上。该方法广泛应用于棕榈油和棕榈仁油，从单一天然来源生成若干种独特的产品，无需化学处理。以这种方式生产的级分可以混合在一起或与液体植物油混合，以制备用于许多食品应用的广泛各种的功能性产品。
本发明的第二方面提供磷脂降解酶在植物油中水解磷脂的用途，其中植物油与磷脂降解酶接触，然后进行化学精制。
当使用根据本发明的磷脂降解酶时，优选
-所述磷脂的酶促水解在包含重相或水相和轻相或油相/疏水相的反应混合物中进行，并且
-在所述化学精制之前，没有减少或没有显著减少重相体积或将胶质/重相与油分离。
在第三方面，本发明提供精制植物油、分离的胶质级分或皂料，其通过本发明第一方面中定义的方法可获得或获得。在特定实施例中，根据本发明的油含有0.1％(w/w)，例如0.2％(w/w)或更多，或例如0.3％(w/w)或更多的甘油二酯量。皂料可具有较低的黏度，并且可以具有低于来自常规化学精制过程的皂料的磷脂含量。
在第四方面，本发明提供了分离的或纯化的具有磷脂酶A活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：
a.与SEQ ID NO:4和7中任一个的成熟多肽具有至少75％序列同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，
b.与SEQ ID NO:5和8中任一所示的多肽具有至少75％序列同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽；
c.(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶A活性。
在某些实施例中，该多肽是SEQ ID NO:4和7中任一个的成熟多肽的变体，或者可以是SEQ ID NO:5和8中任一所示的多肽的变体，所述变体包含在一个或多个位置处的取代、缺失和/或插入。特别地，所述变体可以包含在不超过20个位置(例如不超过19、18、17、16、15、14、13、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置)处的取代、缺失和/或插入。
特别地，多肽可包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
在第五方面，本发明提供了分离的或纯化的具有磷脂酶C活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：
a.与SEQ ID NO:22、25和28中任一个的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽，
b.与SEQ ID NO:23、26和29中任一个所示多肽具有至少60％序列同一性的多肽；以及
c.(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶C活性。
本发明的一些实施例中，该多肽是SEQ ID NO:22、25和28中任一个的成熟多肽的变体，或者是SEQ ID NO:23、26和29中任一所示的多肽的变体，所述变体包含在一个或多个位置处的取代、缺失和/或插入。特别地，所述变体可以包含在不超过20个位置(例如不超过19、18、17、16、15、14、13、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个位置)处的取代、缺失和/或插入。
多肽可包含SEQ ID NO:23、26或29所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
在第六方面，本发明包括含有如上所述的根据本发明第四或第五方面的多肽的组合物。
在第七方面，本发明提供了分离的或纯化的多核苷酸，其编码如上所述的根据本发明的第四或第五方面的多肽。
编码SEQ ID NO:4或5中所示多肽的多核苷酸的序列示于SEQ ID NO:3中。编码SEQID NO:7或8中所示多肽的多核苷酸的序列示于SEQ ID NO:6中。
编码SEQ ID NO:22或23中所示多肽的多核苷酸的序列示于SEQ ID NO:21中。编码SEQ ID NO:25或26中所示多肽的多核苷酸的序列示于SEQ ID NO:24中。编码SEQ ID NO:28或29中所示多肽的多核苷酸的序列示于SEQ ID NO:27中。
在第八方面，本发明提供了核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如本发明第七方面所提供的多核苷酸，其中该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。
在第九方面，本发明提供了重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如本发明第七方面所提供的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
特别地，本发明涉及宿主细胞，其中多肽对重组宿主细胞是异源的。
重组宿主细胞可以是一种重组宿主细胞，其中一个或多个控制序列中的至少一个与编码多肽的多核苷酸异源。
在第十方面，本发明提供了一种产生根据本发明第四或第五方面的多肽的方法，该方法包括在有利于产生该多肽的条件下培养以其野生型形式产生该多肽的细胞。
该方法可以进一步包括回收多肽的步骤。
本发明的第十一方面涉及产生具有磷脂酶A活性的多肽或具有磷脂酶C活性的多肽的方法，该方法包括在有助于产生该多肽的条件下培养根据本发明第九方面的重组宿主细胞。
该方法可以进一步包括回收多肽的步骤。
实例
实例1：
酶：Bacillus macauensis PLC：SEQ ID NO:9的成熟多肽
油：粗制大豆油。各磷脂组分的含量通过来自这些组分的磷(P)的量以ppm P测量。
| PC | PI | PE | PA |
| 433ppm P | 231ppm P | 327ppm P | 90ppm P |
酶反应和碱精制测定
在模拟工业规模条件的酶反应测定中测试酶的性能。
最初通过添加650ppm柠檬酸对粗制大豆油(75g)进行酸预处理。在测试样品中，通过添加1.5当量NaOH将pH升至～6；对照样品(空白；无酶)，pH值保持在～4。将样品在超声波浴(BRANSON 5800)中混合5分钟，并在70℃下在旋转器中孵育15分钟。酶反应是在低含水系统中(基于总油量的2％的水)在100ml离心管(圆柱形的、圆锥形底部)进行。将样品超声处理5分钟，然后在旋转器中在70℃的加热箱中在20rpm搅拌下孵育1小时。酶反应后，通过以下程序向溶液中加入大量碱：
i)向油中加入1141ppm NaOH；
ii)将反应器管手动摇动10秒并且在超声波浴中5分钟；
iii)将反应在70℃，20rpm下放置0.5小时；
iv)反应后，将10mL样品在热旋转离心机中以700g在85℃下离心5分钟(克勒仪器公司(Koehler Instruments)，K600X2油离心机)。
样品和条件：
表1
表1：样品条件；对于酶促反应，pH 4和pH 6在70℃下1小时
通过胶质体积的产率估计值：
使用ASTM D91离心管中的玻璃管刻度通过目测读取胶质体积，然后使用胶质体积计算油产率。
在计算油产率时考虑了胶质的干物质含量，以达到精确性目的：胶质体积在酶处理的样品和空白样品中可具有相同的值，但干物质含量显著不同。因此，使用以下等式计算相对含油量：
油：脱胶前粗制油的初始体积(mL)
胶质：测量的胶质体积(mL)
干物质：胶质中的干物质含量(％)
产率：产率是回收油体积的估计值(％)
甘油二酯含量：
根据AOCS官方方法Cd 11d-96中描述的原理，通过与荷电气溶胶检测器(ChargedAerosol Detector)(Corona Veo)偶联的高效液相色谱(HPLC)测定甘油二酯含量。使用DIONEX设备和Kinetex 2.6u HILIC 100A，150x4.6mm，菲罗门(Phenomenex)柱。
磷脂的定量
使用以下程序通过31P NMR定量测定油中的磷脂：向该油样品中添加0.500mL内标(IS)溶液，接着添加0.5mL CDCl3和0.5mL Cs-EDTA缓冲液。将该样品震荡5分钟，并然后离心(台式离心机，5分钟，13,400rpm)以获得相分离。将较低相转移至NMR管。使用128次扫描、5秒延迟时间运行P-NMR。整合所有信号分配(大约ppm)：1.5(PA)、-0.1(PE)、-0.6(PI)、-0.8(PC)。各种类的浓度计算为“ppm P”，即，每kg油样品中的mg元素磷。因此，ppm P＝I/I(IS)*n(IS)*M(P)/m(油)。将残留磷脂含量计算为酶处理的样品相比于空白对照的比率。内标溶液是2mg/mL甲醇中的磷酸三苯酯。Cs-EDTA缓冲液如下制备：将EDTA(17.55g)分散在水(约20mL)中。使用50％w/w CsOH将pH调节至7.5。以此给出澄清溶液。添加水至100mL以给出浓度0.6M EDTA。
总磷：
通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测量总磷，精确度约为±1ppm P。
结果：
通过胶质水平和胶质的干物质含量来测量产率。碱脱胶前使用B.macauensis PLC时有明显且显著的益处。对于两种酶浓度而言，产率相同。估计的增加比空白多1.4％油。结果如图3所示。
随时间测量二甘油酯含量以跟踪PLC的酶活性。如所预期的，空白没有二甘油酯含量增加。与空白和粗制油相比，B.macauensis PLC具有显著增加的的二甘油酯含量，DG增加1.08％-1.33％。两种酶剂量具有或多或少相同的二甘油酯含量增加。
观察到在碱阶段后二甘油酯水平的小幅增加。在碱阶段可能形成的0.1％至0.2％的额外二甘油酯并不是惊人地高。结果如图4所示。
测量整体磷脂以跟踪磷脂的转化。B.macauensis PLC在1小时的反应时间后转化了所有四种磷脂中的66％。B.macauensis PLC特异于PC和PE，并且对于这两种磷脂种类，水解达到92％。结果显示在图5、6和7中。
结论：
该试验证实了通过B.macauensis PLC处理获得的高产率增加(1.4％)。B.macauensis PLC的2mg酶蛋白/kg剂量和4mg酶蛋白/kg剂量之间没有显著差异。剂量2mgEP/kg油似乎足够或甚至可能是高剂量。仅1小时的酶促反应时间使PC和PE高水解(92％)。观察到完全脱胶；油中残留的磷量足够低
实例2：
酶：雷塞氏篮状菌(T.leycettanus)PLA；SEQ ID NO:1的成熟多肽
Bacillus macauensis PLC：SEQ ID NO:9的成熟多肽
油：粗制大豆油；如实例1中所公开的
酶反应和碱精制
按照实例1中所述的方法，在酶反应试验中测试酶的性能。最初通过添加650ppm柠檬酸对粗制大豆油(75g)进行酸预处理。在用于测试Bacillus macauensis PLC的样品中，通过添加1.5当量NaOH将pH升至～6；在对照样品(空白；无酶)和用于测试雷塞氏篮状菌PLA的样品中，pH保持在～4。
酶反应后，按照实例1中描述的程序添加碱。
表2：样品和条件
表2：样品条件；对于酶促反应，pH 4和pH 6在70℃下2小时
如实例1中所述测定通过胶体积和甘油二酯含量的产率估计值。
根据AOCS Ca 5a-40官方方法测定游离脂肪酸的含量。简而言之，将已知质量的油溶解在2-丙醇中，并添加作为指示剂的酚酞。然后通过用NaOH溶液滴定中和游离脂肪酸直至出现第一个浅色不变粉红色。
结果：
通过胶质水平和胶质的干物质含量来测量产率。用于碱脱胶之前，使用30ppm雷塞氏篮状菌PLA或2mg EP/kg油的B.macauensis PLC时，有明显且显著的益处。对于雷塞氏篮状菌PLA，增加为0.3％，对于B.macauensis PLC，为0.8％。结果显示在图9和10中。
离心后胶质相本身非常异质，并且形成坚硬的白色晶体。在使用氢氧化钠(NaOH)再次溶解胶质期间，手动摇动和超声波浴几乎是不可能的。适当的混合可以导致酶处理的更高产率。
随时间测量FFA含量以跟踪PLA的酶活性。结果如图11所示。
随时间测量二甘油酯含量以跟踪PLC的酶活性。结果如图12所示。正如所料，雷塞氏篮状菌PLA和空白没有增加二甘油酯含量。与空白相比，B macauensis PLC具有显著的二甘油酯含量。对于B.macauensis PLC，存在很高的DG含量标准差。原因可能是所用的酶管必须解冻并冷冻若干次。
实例3：栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)PLA和密粘褶菌(Gloeophyllumtrabeum)PLA；通过P-NMR测定确定水解活性和底物特异性。
来源
栗疫病菌PLA从来自瑞典的供体NN008388栗疫病菌克隆；1994。
密粘褶菌PLA从来自俄罗斯的供体NN050212密粘褶菌克隆；1997。
水解活性和底物特异性
概念
通过将磷脂酶与粗制植物油和水性缓冲液的10:1混合物一起孵育来进行测定。酶浓度为10mg/kg(mg EP/kg油)。该混合物在50℃下剧烈振摇孵育2h。然后通过31P NMR分析反应混合物，并定量剩余(未水解，整体)磷脂的量。结果是酶的水解活性和底物特异性的量度。
测定程序
在100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0、5.5和7.0)中，将纯化的酶稀释至0.09mg/mL。在2mL艾本德(Eppendorf)管中，通过将25uL稀释的酶添加至250uL粗制植物油中开始该测定并且将该混合物在恒温振荡器(thermoshaker)中在50℃下孵育2h。使用的油是粗制大豆油，含有大量的PA、PE、PI和PC(各100-200ppm P)。
NMR分析
然后向该油样品中添加0.500mL内标(IS)溶液，接着添加0.5mL CDCl3和0.5mLCs-EDTA缓冲液。将该样品震荡5分钟，并然后离心(台式离心机，5分钟，13,400rpm)以获得相分离。将较低相转移至NMR管。使用128次扫描、5秒延迟时间运行31P NMR。整合所有信号分配(大约ppm)：1.5(PA)、-0.1(PE)、-0.6(PI)、-0.8(PC)。各种类的浓度计算为“ppm P”，即，每kg油样品中的mg元素磷。因此，ppm P＝I/I(IS)*n(IS)*M(P)/m(油)。IS溶液是在MeOH中的2mg/mL磷酸三苯酯。Cs-EDTA缓冲液如下制备：将EDTA(5.85g)分散在水(约50mL)中。使用50％w/w CsOH将pH调节至7.5。以此给出澄清溶液。添加水至100mL以给出浓度0.2M EDTA。
结果
下表14和15中的结果显示两种酶对所有四种磷脂都有活性，并且两者都相比于pH5.5和pH 7.0更优选pH 4。
表14.与密粘褶菌PLA孵育的大豆油的磷脂含量(ppm P)。
| 油 | pH 4 | pH 5.5 | pH 7 | |
| PA | 120 | 0 | 112 | 120 |
| PE | 120 | 0 | 112 | 112 |
| PI | 79 | 0 | 87 | 79 |
| PC | 132 | 0 | 141 | 141 |
表15.与栗疫病菌PLA孵育的大豆油的磷脂含量(ppm P)。
| 油 | pH 4 | pH 5.5 | pH 7 | |
| PA | 116 | 41 | 112 | 112 |
| PE | 107 | 12 | 12 | 112 |
| PI | 83 | 45 | 79 | 83 |
| PC | 136 | 29 | 132 | 136 |
实例16：哈茨木霉PLC；克隆，表达，发酵和纯化
使用土壤用快速DNA分离试剂盒(Fast DNA Spin for Soil Kit)(目录号6560-200，来自MP生物医疗公司(MP Biochemicals))，依照供应商的方案从菌株NN051266哈茨木霉提取基因组DNA。
通过PCR从基因组DNA扩增D23CR9、P33XXG基因(SEQ ID NO.27)。PCR由以下构成：菌株的1μl基因组DNA；2.5μl的克隆引物正向(SEQ ID NO:52和53)(10pmol/μl)、2.5μl的克隆引物反向(SEQ ID NO:54和55)(10pmol/μl)、25μl的iProof HF主混合物(iProof HFMaster Mix)(BioRad目录号172-5310)和19μl PCR级水。
使用热循环仪进行扩增反应，该热循环仪被编程为：在98℃2分钟；随后是30个循环，每个循环为98℃持续10秒和60℃持续10秒；随后在72℃持续5分钟的一个循环。
P8_43-F 5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCCCAGCTCGACGC-3’
P8_43-F 5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCCCAGCTCGACGC-3’
P8_43-R 5’AGATCTCGAGAAGCTTAAGCCTTGGCTTTCAACTCATTAGCC 3’
P7_30-R 5’AGATCTCGAGAAGCTTAAGCCTTGGCTTTCAACTCATTGGC 3’
NN051266哈茨木霉的来源国是中国(2008年)。
使用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶电泳上观察4μl PCR产物。根据制造商的说明书，使用
PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(GE医疗集团(GE Healthcare)，希勒勒
丹麦)纯化剩余PCR产物。根据制造商的说明书，使用IN-FUSIONTM Dry-DownPCR克隆试剂盒(BD生物科学公司(BD Biosciences)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加利福尼亚州，美国)，将对应于NN051266哈茨木霉PLC基因D23CR9的纯化的PCR产物克隆入表达载体pDAu109(WO 2005/042735)，该表达载体之前用Bam HI和Hind III线性化。
将1μl体积的未稀释的连接混合物用来转化BD Phusion-Blue(科隆达公司(Clontech))。在含有100μg的氨苄青霉素每ml的LB琼脂板上选择1个菌落并在补充有100μg的氨苄青霉素每ml的2ml LB培养基中培养过夜。根据制造商的说明书，使用Jetquick质粒小量制备旋转试剂盒(Jetquick Plasmid Miniprep Spin Kit)(Genomed有限公司(Genomed GmbH)，洛纳
德国)纯化质粒DNA。在异源表达之前，通过桑格测序验证NN051266哈茨木霉PLC基因D23CR9序列。选择一个命名为P8_43(含有基因SEQ ID NO:27)的质粒用于在米曲霉MT3568宿主细胞中异源表达PLC基因。
米曲霉MT3568菌株用于异源表达D23CR9、P33XXG基因。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO 2002/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因来恢复pyrG营养缺陷型。米曲霉MT3568的原生质体是根据WO95/002043制备的。
将100μl的米曲霉MT3568原生质体与具有克隆的D23CR9基因的1μg-2μg曲霉属表达载体和250μl的60％PEG 4000(艾普利公司(Applichem)，达姆施塔特，德国)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2以及10mM Tris-HCl(pH 7.5)混合并轻轻混合。在37℃下孵育30min后，添加4ml的顶层琼脂(温度40℃)，并且将原生质体涂布到COVE板上用于选择。在37℃下孵育4-7天后，将四个转化体的孢子接种到96深孔板中的0.5ml的DAP-4C-01培养基中。在30℃下培养4-5天后，通过SDS-PAGE分析培养液，以鉴定从NN051266哈茨木霉产生最大量的重组磷脂酶C的转化体。
将具有NN051266哈茨木霉PLC基因D23CR9的最好的转化体的孢子涂布于含有0.01％
X-100的COVE板上，以便分离单个菌落。在保存克隆之前重复涂布一次。
用于纯化的发酵
将如上所述构建的米曲霉转化体在振荡平台恒温箱中的于30℃下孵育的500ml有凹槽的摇瓶中的150ml DAP-4C-01培养基中在150RPM旋转下发酵5天并且进一步用于如下所述的测定。
实例4：螺旋毛柬霉(Trichurus spiralis)PLC；克隆，表达和发酵：
使用土壤用快速DNA分离试剂盒(Fast DNA Spin for Soil Kit)(目录号6560-200，来自MP生物医疗公司(MP Biochemicals))，依照供应商的方案从菌株NN009739螺旋毛柬霉提取基因组DNA。
通过PCR从基因组DNA扩增D23YRT、P34CUT基因(SEQ ID NO.26)。PCR由以下构成：菌株的1μl基因组DNA；2.5μl的克隆引物正向(P7_37-F)(10pmol/μl)、2.5μl的克隆引物反向(P7_37-R)(10pmol/μl)、25μl的iProof HF主混合物(iProof HF Master Mix)(BioRad目录号172-5310)和19μl PCR级水。
使用热循环仪进行扩增反应，该热循环仪被编程为：在98℃2分钟；随后是30个循环，每个循环为98℃持续10秒和60℃持续10秒；随后在72℃持续5分钟的一个循环。
P7_37-F 5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCATCTCACTCGCGTCGC-3’
P7_37-R 5’AGATCTCGAGAAGCTTAGATTAGGAGTCTCTTGTTCTCCTCGACC 3’
NN009739螺旋毛柬霉的来源国是丹麦(1996年)。
使用TAE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶电泳上观察4μl PCR产物。根据制造商的说明书，使用
PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(GE医疗集团(GE Healthcare)，希勒勒
丹麦)纯化剩余PCR产物。根据制造商的说明书，使用IN-FUSIONTM Dry-DownPCR克隆试剂盒(BD生物科学公司(BD Biosciences)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加利福尼亚州，美国)，将对应于NN009739螺旋毛柬霉PLC基因D23YRT的纯化的PCR产物克隆入表达载体pDAu109(WO 2005042735)，该表达载体之前用Bam HI和Hind III线性化。
将1μl体积的未稀释的连接混合物用来转化BD Phusion-Blue(科隆达公司(Clontech))。在含有100μg的氨苄青霉素每ml的LB琼脂板上选择1个菌落并在补充有100μg的氨苄青霉素每ml的2ml LB培养基中培养过夜。根据制造商的说明书，使用Jetquick质粒小量制备旋转试剂盒(Jetquick Plasmid Miniprep Spin Kit)(Genomed有限公司(Genomed GmbH)，洛纳
德国)纯化质粒DNA。在异源表达之前，通过桑格测序验证NN009739螺旋毛柬霉PLC基因D23YRT序列。选择一个命名为P7_37(含有基因SEQ ID NO:14)的质粒用于在米曲霉MT3568宿主细胞中异源表达PLC基因。
米曲霉MT3568菌株用于异源表达D23YRT、P34CUT。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO 2002/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因来恢复pyrG营养缺陷型。米曲霉MT3568的原生质体是根据WO 95/002043制备的。
将100μl的米曲霉MT3568原生质体与具有克隆的D23YRT基因的1μg-2μg曲霉属表达载体和250μl的60％PEG 4000(艾普利公司(Applichem)，达姆施塔特，德国)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2以及10mM Tris-HCl(pH 7.5)混合并轻轻混合。在37℃下孵育30min后，添加4ml的顶层琼脂(温度40℃)，并且将原生质体涂布到COVE板上用于选择。在37℃下孵育4-7天后，将四个转化体的孢子接种到96深孔板中的0.5ml的DAP-4C-01培养基中。在30℃下培养4-5天后，通过SDS-PAGE分析培养液，以鉴定从NN009739螺旋毛柬霉产生最大量的重组磷脂酶C的转化体，并且还在测定中分析培养液用于确认活性。
将最好的转化体的孢子涂布于包含0.01％
X-100的COVE板上，以便分离单个菌落。在保存克隆之前重复涂布一次。
用于纯化的发酵
将如上所述构建的米曲霉转化体在振荡平台恒温箱中的于30℃下孵育的500ml有凹槽的摇瓶中的150ml DAP-4C-01培养基中在150RPM旋转下发酵5天并且进一步用于如下所述的测定。
使用的培养基
LB板由10g的细菌用胰蛋白胨(Bacto-Tryptone)、5g的酵母提取物、10g的氯化钠、15g的细菌用琼脂(Bacto-agar)及补足至1升的去离子水构成。
LB培养基由10g的细菌用胰蛋白胨、5g的酵母提取物、和10g的氯化钠及补足至1升的去离子水构成。
DAP-4C-1
11g MgSO4，7H2O
1g KH2PO4
2g C6H8O7，H2O
20 g右旋糖
10 g麦芽糖
5,2g K3PO4，H2O
0,5g酵母提取物
0,5ml KU6痕量金属溶液(AMG)(MSA-SUB-FS-0042)
混合直至完全溶解
添加1ml Dowfax 63N10
用Milli-Q-水将体积调整至1000ml
CaCO3 tabl.á0,5g(添加1tabl./200ml)
在接种之前，向每个摇瓶á150ml添加3,5ml磷酸氢二铵(NH4)2HPO4 50％，和5,0ml20％乳酸。
KU6痕量金属溶液(AMG)(MSA-SUB-FS-0042)
6,8g ZnCl2
2,5g CuSO4.5H2O
0,13g无水氯化镍
13,9g FeSO4.7H2O
8,45g MnSO4.H2O
3g C6H8O7.H2O
离子交换水至1000ml
COVE蔗糖板由342g的蔗糖、20g的琼脂粉、20ml的COVE盐溶液及补足至1升的去离子水构成。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(BacteriologicalAnalytical Manual[细菌学分析手册]，第8版，修订A，1998)。将该培养基冷却至60℃并且添加10mM乙酰胺、Triton X-100(50μl/500ml)。
COVE盐溶液由26g的MgSO4·7H2O、26g的KCL、26g的KH2PO4、50ml的COVE痕量金属溶液、以及补足至1升的去离子水构成。
COVE痕量金属溶液由0.04g的Na2B4O7·10H2O、0.4g的CuSO4·5H2O、1.2g的FeSO4·7H2O、0.7g的MnSO4·H2O、0.8g的Na2MoO4·2H2O、10g的ZnSO4·7H2O、以及补足至1升的去离子水构成。
实例5：Rasamsonia eburnean PLC；克隆和表达
通过常规技术从指示的菌株克隆磷脂酶编码基因并插入质粒pCaHj505(WO 2013/029496实例1：克隆和表达)。
通过常规技术从指示的菌株克隆磷脂酶编码基因并插入质粒pCaHj505(WO 2013/029496)。表达了具有天然分泌信号的基因，该天然分泌信号具有如下氨基酸序列：MRAFLITALASLATAAGA(SEQ ID NO:22的氨基酸残基1至18)。
在米曲霉中表达
选择一个具有正确的重组基因序列的克隆并且将对应的质粒整合进米曲霉MT3568宿主细胞基因组中。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO 02/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因来恢复pyrG营养缺陷型。
由曲霉转化体产生的磷脂酶的水解活性使用卵磷脂/琼脂糖平板(在测定部分描述的平板测定)进行研究。将来自不同转化体的20μL等分试样的培养液或缓冲液(阴性对照)分配到直径为3mm的冲孔中并且在37℃下孵育1小时。随后检查这些平板中的孔周围存在或不存在对应于磷脂酶活性的暗紫色区。
选择含有整合的表达构建体的重组米曲霉克隆，并且将它在摇瓶中的2400ml YPM培养基(10g酵母提取物、20g细菌蛋白胨、20g麦芽糖和去离子水调至1000ml)中在80rpm搅拌、30℃温度下持续3天。通过使用0.2μm过滤装置过滤收获培养肉汤。过滤的发酵培养液用于酶表征。表达了具有天然分泌信号的基因，该天然分泌信号具有如下氨基酸序列：MRAFLITALASLATAAGA(SEQ ID NO:22的氨基酸残基1至18)。
纯化
首先用(NH4)2SO4沉淀培养上清液，然后用pH 6.5的20mm Bis-Tris透析。然后将样品应用于用pH 6.5的20mm Bis-Tris平衡的Q琼脂糖凝胶快流(Sepharose Fast Flow)(GE医疗集团)的色谱柱。NaCl浓度梯度增加从零到0.35M NaCl(15CV(柱体积))，然后到0.5MNaCl(3CV)，最后到1M NaCl(2CV)。通过SDS-PAGE检查通过柱的级分和样品(流穿级分)。基于SDS图，收集来自编号18至编号43的级分并添加(NH4)2SO4至终浓度为1.2M。
将合并的级分加载到用20mm Bis-Tris(其中添加了1.2M(NH4)2SO4)在pH 6.5下平衡的苯基琼脂糖凝胶6快流(Phenyl Sepharose 6Fast Flow)(GE医疗集团)柱中。施加从1.2M至零的(NH4)2SO4浓度梯度降低。收集洗脱级分和流穿级分并通过卵磷脂板在pH 5.5下测试PLC活性。通过SDS-PAGE检查具有PLC活性的级分。从编号1到编号18的洗脱级分和流穿级分均具有良好的PLC活性和纯度，被作为目标蛋白质。
N-和C-末端处理
N-末端测序：
使用应用生物系统公司(Applied Biosystems)
蛋白质测序系统进行N-端测序分析。在
预制4％-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶(生命技术公司(LifeTechnologies))上纯化这些样品。根据制造商的说明书跑胶并且印迹至
PVDF膜(应用生物系统公司)上。对于N-端氨基酸测序，切下主蛋白带并且放置在
蛋白质测序系统的印迹盒中。根据制造商的说明书，使用运行用于PVDF膜样品(脉冲液体PVDF)的文件的方法，来进行N-端测序。通过比较色谱图中的峰值的保留时间与标准品色谱图中PTH-氨基酸的保留时间，从对应于氨基酸残基1至7的7个色谱图推导N-端氨基酸序列。
通过质谱(MS/MS)测序鉴定蛋白质：
通过对来自凝胶内消化的胰蛋白酶消化肽段的串联质谱法(MS/MS)分析，来进行蛋白鉴定。首先将样品用DTT还原并且用碘乙酰胺进行烷基化。然后将还原的并且烷基化的样品施加至SDS凝胶电泳。
根据制造商的说明书跑胶并且染色(
预制4％-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶(生命技术公司)。切下主蛋白带并且将胶块用测序级胰蛋白酶(罗氏公司(Roche))消化过夜。在消化后，提取产生的胰蛋白酶消化肽段并且在Orbitrap LTQ XL质谱仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))上进行分析，其中测量肽质量和肽片段质量。为了蛋白鉴定，通过质量搜索程序Mascot(矩阵科学公司(Matrix science))将实验获得的质量与储存在数据库中的蛋白的理论肽质量和理论肽片段质量进行比较。
分子量的确定：
使用MAXIS II电喷雾质谱仪(布鲁克-达尔托尼克公司(Bruker Daltonik GmbH)，不来梅港市(Bremen)，DE)进行整体分子量分析。将样品在MQ水中稀释至1mg/ml。将稀释的样品应用于Aeris Widepore C4柱(菲罗门)。将样品洗涤并从运行乙腈线性梯度的柱洗脱，并通过Ultimate 3000LC系统(Dionex)以300ml/min的流速引入电喷雾源。用DataAnalysis版本4.2(Bruker Daltonik GmbH)，不来梅港市(Bremen)，DE)进行数据分析。通过原始数据的解卷积计算样品的分子量，其范围为20,000Da至80.000Da。
底物特异性
纯化的PLC酶的P-NMR测定
概念
通过将PLC与粗制植物油和水性柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)的10:1混合物一起孵育来进行测定。酶浓度为30mg/kg(mg EP/kg油)。该混合物在50℃下剧烈振摇孵育2h。然后通过31P NMR分析该反应混合物。这包括一个水提取的步骤，在其中通过PLC释放的磷种类被从油相中去除。因此，只有亲脂的磷种类(即，未反应的磷脂)被检测到。
酶：
SEQ ID NO:22(Rasamsonia PLC)、SEQ ID NO:25(螺旋毛柬霉PLC)和SEQ ID NO:28(哈茨木霉PLC)的成熟多肽，
测定程序
在100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)中，将纯化的酶稀释至0.27mg/mL。在2mL艾本德(Eppendorf)管中，通过将25uL稀释的酶添加至250uL粗制植物油中开始该测定并且将该混合物在恒温振荡器(thermoshaker)中在50℃下孵育2h。使用的油是粗制大豆油，含有大量的PA、PE、PI和PC(各100-200ppm P)。
NMR分析
然后向该油样品中添加0.500mL内标(IS)溶液，接着添加0.5mL CDCl3和0.5mLCs-EDTA缓冲液。将该样品震荡5分钟，并然后离心(台式离心机，5分钟，13,400rpm)以获得相分离。将较低相转移至NMR管。使用128次扫描、5秒延迟时间运行P-NMR。整合所有信号分配(大约ppm)：1.5(PA)、-0.1(PE)、-0.6(PI)、-0.8(PC)。各种类的浓度计算为“ppm P”，即，每kg油样品中的mg元素磷。因此，ppm P＝I/I(IS)*n(IS)*M(P)/m(油)。将残留磷脂含量计算为酶处理的样品相比于空白对照的比率。内标溶液是2mg/mL甲醇中的磷酸三苯酯。Cs-EDTA缓冲液如下制备：将EDTA(5.85g)分散在水(约50mL)中。使用50％w/w CsOH将pH调节至7.5。以此给出澄清溶液。添加水至100mL以给出浓度0.2M EDTA。
结果
下表2显示了残留的磷脂含量百分比(0是完全水解，100是不水解)。
表2
DCS-温度谱
通过差示扫描量热法确定Td。
使用VP-毛细管差示扫描量热仪(微量热公司(MicroCal Inc.)，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)通过差示扫描量热法(DSC)确定Harzianum(U49A3)的热稳定性。在200K/小时的恒定的程序化加热速率下，在加热缓冲液(50mM乙酸盐缓冲液，pH5.0)中的酶溶液(大约0.5mg/ml)后获得的热分析图(Cp对比T)中，热变性温度Td(℃)取自变性峰(主要的吸热峰)的顶端。
将样品溶液和参比溶液(大约0.2ml)从10℃下的储存条件下装载到量热仪中(参比溶液：不具有酶的缓冲液)，并且在20℃下热预平衡20分钟，随后从20℃至100℃进行DSC扫描。以约+/-1℃的精确度确定变性温度。在这些条件下所获得的U49A3的Td为79℃。
使用VP-毛细管差示扫描量热仪(微量热公司(MicroCal Inc.)，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)通过差示扫描量热法(DSC)确定螺旋毛柬霉(U4G2D)的热稳定性。在200K/小时的恒定的程序化加热速率下，在加热缓冲液(50mM乙酸盐缓冲液，pH 5.5)中的酶溶液(大约0.5mg/ml)后获得的热分析图(Cp对T)中，热变性温度Td(℃)取自变性峰(主要的吸热峰)的顶端。
将样品溶液和参比溶液(大约0.2ml)从10℃下的储存条件下装载到量热仪中(参比溶液：不具有酶的缓冲液)，并且在20℃下热预平衡20分钟，随后从20℃至100℃进行DSC扫描。以约+/-1℃的精确度确定变性温度。在这些条件下所获得的U4G2D的Td为67℃。
使用VP-毛细管差示扫描量热仪(微量热公司(MicroCal Inc.)，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)通过差示扫描量热法(DSC)确定Rasamsonia(U4BCJ)的热稳定性。在200K/小时的恒定的程序化加热速率下，在加热缓冲液(50mM乙酸盐缓冲液，pH 5.5)中的酶溶液(大约0.5mg/ml)后获得的热分析图(Cp对T)中，热变性温度Td(℃)取自变性峰(主要的吸热峰)的顶端。
将样品溶液和参比溶液(大约0.2ml)从10℃下的储存条件下装载到量热仪中(参比溶液：不具有酶的缓冲液)，并且在20℃下热预平衡20分钟，随后从20℃至100℃进行DSC扫描。以约+/-1℃的精确度确定变性温度。在这些条件下所获得的U4BCJ的Td为82℃。
脱胶性能
在脱胶测定中检测了本发明、Rasamsonia、哈茨木霉、螺旋毛柬霉的磷脂酶C的性能，该脱胶测定模仿工业规模脱胶。该测定在下面的脱胶测定段落中描述的脱胶程序之后测量油相中的以下参数中的一个或两个。
a)甘油二酯含量，根据AOCS官方方法Cd 11d-96中描述的原理，通过与荷电气溶胶检测器(Charged Aerosol Detector)(Corona Veo)偶联的高效液相色谱(HPLC)。使用DIONEX设备和Lichrocart Si-60，5μm，Lichrosphere 250-4mm，默克(MERCK)柱。
b)通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测量总磷和其他金属如Ca、Mg、Zn，精确度约为±1ppm P。
脱胶测定
首先，对粗制大豆油(75g)进行酸/碱预处理，以促进不溶性磷脂盐转化成多种可水合的形式，并确保适合于酶的环境。通过酸添加酸(正磷酸(75％溶液)或柠檬酸(50％溶液))进行酸/碱预处理。基于油量以等于0.065％或0.09％(100％纯正磷酸/100％纯柠檬酸)的量施加酸并在超声浴(BRANSON 5800)中混合5分钟并在旋转器中孵育15分钟。然后用针对纯正磷酸(即用于预处理的酸)的当量(0.45-5)施加的1M NaOH进行碱中和并在超声浴中混合5分钟。酶反应是在低含水系统中(基于总油量的3％的水)在100ml离心管(圆柱形的、圆锥形底部)进行。将样品超声处理5min，接着在加热柜中在选定的温度(从60℃至70℃)下孵育，以20rpm搅拌持续选定的孵育时间(从1至24小时)。为了将混合物分离成油相和重水/胶相，将样品在700g、85℃离心5分钟(克勒仪器公司(Koehler Instruments)，K600X2油离心机)。
实验中使用的粗制大豆油中的磷、钙、镁和锌组成示于表3中。
表3：粗制油的金属成分通过ICP-OES测量(mg/kg油)
下面的实例6-11描述了使用脱胶测定获得的结果。
实例6：在60℃哈茨木霉U4AVG与玛丽安丛赤壳菌U4DB1相比较(58,6同一性)
在60℃下在脱胶测定中应用哈茨木霉(U4AVG)(SEQ ID NO:28的成熟多肽)(与玛丽安丛赤壳菌(U4DB1)(SEQ ID NO:19的成熟多肽)相比)，酶剂量为10mg酶蛋白/kg油(应用油1)。测量酶促脱胶2小时、5小时和24小时后的甘油二酯含量(用0.065％柠檬酸/1.5当量NaOH预处理油)，并且通过ICP测量孵育2小时、5小时和24小时后的总磷含量。结果(双重测定的平均值)和标准偏差(STDEV)列于表4A和4B中。
表4A和4B
与通过玛丽安丛赤壳菌PLC(U4DB1)的甘油二酯形成相比，用哈茨木霉(U4AVG)在60℃下脱胶导致优异的甘油二酯形成。在测试条件下(60℃，24小时)，哈茨木霉可转化高达78％的磷脂。转化率计算是基于这样的假定：通过ICP测量的743ppm磷总量等于1.86wt％磷脂(平均PL Mw～772g/mol、Mw P～31g/mol)(等于可获得的最大1.49％DG的增加(磷脂分子的80％))。
实例7：哈茨木霉(U4AVG)在60℃下的剂量应答研究
在60℃下在脱胶测定中以各种酶剂量(1x-2x-5x-10x mg酶蛋白/kg油(应用油2))应用哈茨木霉(U4AVG)(SEQ ID NO:28的成熟多肽)。测量酶促脱胶1、2、和4小时后的甘油二酯含量(用0.09％磷酸/1.5当量的NaOH预处理油)。结果列于表5。
表5：甘油二酯增加
在60℃下用哈茨木霉(U4AVG)脱胶显示以测试的间隔(1-10X mg EP/kg油)在增加的酶剂量处甘油二酯的形成增加。在测试的条件下(60℃，4小时，10mg EP/kg油)转化高达86％的磷脂。转化率计算是基于这样的假定：通过ICP测量的615ppm磷总量等于1.54wt％磷脂(平均PL Mw～772g/mol、Mw P～31g/mol)(等于可获得的最大1.23％DG的增加(磷脂分子的80％))。
实例8：与埃默森青霉菌(U4DB4)和锥毛壳属PLC(U1A3F)相比，在60℃下应用磷酸进行油预处理的Rasamsonia(U3GPC)性能
在60℃下在脱胶测定中应用Rasamsonia(U3GPC)(SEQ ID NO:22的成熟多肽)(与锥毛壳属PLC(U1A3F)(SEQ ID NO:17的成熟多肽)和埃默森青霉菌(U1DW6)(SEQ ID NO:15的成熟多肽)进行比较)，酶剂量为30mg酶蛋白/kg油(应用油3)。测量酶促脱胶2小时、4小时、6小时和24小时后的甘油二酯含量(用0.09％磷酸(PA)/+/-1.5当量NaOH预处理油)，并且通过ICP测量孵育2小时和24小时后的总磷含量。结果列于表6。
表6：甘油二酯增加(％w/w)
在60℃下用Rasamsonia进行脱胶显示，与Kion PLC相比，在最初的6小时内(应用相同的油预处理)的加速的甘油二酯形成，并且在没有添加任何苛性碱(NAOH)的情况下与测试的埃默森青霉菌几乎具有相同的性能。Rasamsonia在测试条件下(60℃，24小时，30mgEP/kg油，0.09％磷酸+1.5当量NaOH)导致高达66％的磷脂转化。转化率计算是基于这样的假定：通过ICP测量的631ppm磷总量等于1.58wt％磷脂(平均PL Mw～772g/mol、Mw P～31g/mol)(等于可获得的最大1.26％DG的增加(磷脂分子的80％))。
实例9：在进行和不进行油预处理(使用柠檬酸进行油预处理(70℃)和(60℃))的情况下，在60℃和70℃下的Rasamsonia(U4BCJ)性能
在60℃和70℃在脱胶测定中应用Rasamsonia(U4BCJ)(SEQ ID NO:22的成熟多肽)，酶剂量为10mg酶蛋白/kg油(应用油4/油5)，并与埃默森青霉菌PLC(SEQ ID NO:15的成熟多肽)进行比较。测量酶促脱胶2小时、5小时和24小时后的甘油二酯含量。结果列于表7A和7B中。
表7A和7B
用Rasamsonia进行脱胶显示随着时间的推移甘油二酯的形成增加，并且在60℃下以及在70℃下在用柠檬酸和苛性碱预处理的油中以及在没有任何油预处理情况下显示良好性能。没有油预处理情况下在70℃，24小时，10mg EP/kg油，650ppm CA+0.4当量NaOH以及60℃，24小时，10mg EP/kg油，获得磷脂完全转化(～96％-100％)。转化率计算是基于这样的假定：通过ICP测量的465-479ppm磷总量等于～1.2wt％磷脂(平均PL Mw～772g/mol、MwP～31g/mol)(等于可获得的最大～0.96％DG的增加(磷脂分子的80％))。
实例10：在60℃与玛丽安丛赤壳菌(U4DB1)相比的螺旋毛柬霉(U4G2D)性能
在60℃下在脱胶测定中应用螺旋毛柬霉(U4G2D)(SEQ ID NO:25的成熟多肽)(与玛丽安丛赤壳菌(U4DB1)(SEQ ID NO:19的成熟多肽)相比)，酶剂量为10mg酶蛋白/kg油(应用粗制油5)。测量酶促脱胶2小时、5小时和24小时后的甘油二酯含量(用0.065％柠檬酸和1.5当量NaOH预处理油)，并且通过ICP测量孵育5小时和24小时后的总磷含量。结果(双重测定的平均值)列于表8中。
表8
螺旋毛柬霉在测试的反应条件下表现良好，并且与玛丽安丛赤壳菌(其在24小时后显示出最高的DG形成)相比，在2小时和5小时后显示出更快的甘油二酯形成。螺旋毛柬霉在测试条件下(60℃，24小时，10mg EP/kg油，0.065％磷酸+1.5当量NaOH)导致高达53％的磷脂转化。转化率计算是基于这样的假定：通过ICP测量的622ppm磷总量等于1.56wt％磷脂(平均PL Mw～772g/mol、Mw P～31g/mol)(等于可获得的最大1.24％DG的增加(磷脂分子的80％))。
实例11：在60℃下与玛丽安丛赤壳菌、锥毛壳属物种PLC和埃默森青霉菌PLC比较，哈茨木霉、Rasamsonia和螺旋毛柬霉PLC的性能
脱胶
在60℃下在脱胶测定中应用哈茨木霉、Rasamsonia和螺旋毛柬霉(分别为SEQ IDNO:28、22和25的成熟多肽)(与在黑曲霉或米曲霉中表达的锥毛壳属物种PLC(SEQ ID NO:17的成熟多肽)、玛丽安丛赤壳菌和埃默森青霉菌PLC(分别为SEQ ID NO:19和15的成熟多肽)进行比较)，酶剂量为10mg酶蛋白/kg油(应用粗制油8)。在分别用埃默森青霉菌PLC和所有其他酶脱胶之前，将油用0.065％柠檬酸和0.4摩尔当量或1.5摩尔当量的NaOH预处理。通过HPLC测量酶促脱胶2小时、5小时和24小时后的甘油二酯含量，并通过ICP测量孵育5小时和24小时后的总磷含量。结果列于表9。
表9
在给定的反应条件下(60℃，10mg EP/kg油，0.065％柠檬酸+1.5当量NaOH)用哈茨木霉PLC脱胶导致与其他PLC酶相比更快的甘油二酯增加和磷减少。通过哈茨木霉PLC还在24小时后达到最高的甘油二酯含量(1.12％w/w)，相当于约97％的磷脂转化率。转化率计算是基于这样的假定：通过ICP测量的574ppm磷总量等于1.44wt％磷脂(平均PL Mw～772g/mol、Mw P～31g/mol)(等于可获得的最大1.15％DG的增加(磷脂分子的80％))。
通过LCMS/MS对磷脂的定量分析
耦合到三重四极质谱仪(LC/MS/MS)或耦合到四极质谱仪渡越时间(LC/TOF/MS)的液相色谱用于定量个别磷脂种类：磷脂酰胆碱(PC)；磷脂酰肌醇(PI)；磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酸(PA)。该测定的灵敏度对于PC、PE及PI(ppm)达到低于1mg磷/kg油，并且对于PA低于10mg磷/kg。将油样品溶于氯仿中。然后将萃取液用以下设置在LC-TOF-MS(或在LC-MS/MS上，如果需要更低的检测极限)上分析：
LC-设置
洗脱液A： 50％乙腈、50％水、0.15％甲酸
洗脱液B： 100％异丙酸、0.15％甲酸
运行时间： 26.9min
流量： 0.50mL/min
柱温： 50℃
自动进样器温度： 15℃-25℃
注射体积： 1μL
柱子类型材料： 带电表面杂交，长度：50mm，尺寸：1.7μm，ID：2.1mm MS-设置
数据使用MassLynx版本4.1软件处理。在下述实例中该方法只是叫做LCMS。
孵育2小时、5小时和24小时后的油的磷脂组成示于表10中。可以看出PLC酶在孵育高达24小时后降低了所有四种磷脂的含量。使用哈茨木霉PLC进行脱胶导致PA、PE和PC最快地减少。
实例12-NaOH中和影响产率
如上所述进行实验(参见标题脱胶)。具体地，柠檬酸的剂量为650ppm，酶的剂量为200ppm。所有样品中使用的酶是苏云金芽孢杆菌PLC(SEQ ID NO.11)和假单胞菌属物种PI特异性PLC(SEQ ID NO.13)的组合。用于中和预处理的CA的NaOH的当量变化，参见下表11。在预处理中将所用的NaOH增加至酸的3-5当量提高产率并减少干物质损失。这在菜籽油和大豆油中都观察到。因此，确保PLC反应中的正确pH增加DG的形成。
样品如下表11中所示。
表11.
*如上所述测量干物质损失和ΔDG
因此，在优选的实施例中，本发明涉及根据本发明的方法，其中NaOH处理相对于预处理酸至少3.0当量，例如3.0至6.0，例如3至5.5，3至5.0，3至4.5或3至4.0当量。
实例13-减少残留磷和FFA含量-
如实例12中所示，增加的NaOH可以增加通过ΔDG含量测量的产率，并且同时减少干物质损失。
脱胶以与上述相同的方式进行(参见标题脱胶)，其中具有以下修改。
油是粗制菜籽油。酸预处理是通过在70℃下添加750ppm或1500ppm磷酸持续15分钟。添加相对于酸1.33当量、2.0当量或3.0当量的NaOH以中和酸并准备用于酶处理。酶水解用苏云金芽孢杆菌PLC(SEQ ID NO.11)和假单胞菌属物种PI特异性PLC(SEQ ID NO.13)(剂量为200ppm)，混合物为2％水。将混合物在60℃下孵育2小时。在水解结束时，通过添加1707ppm-2040ppm NaOH(使用8％NaOH)进行碱精制。每个样品中NaOH的总量为2700ppm，这相当于比粗制油中FFA(1.3％)过量35％。
根据下表12制备样品。结果也在该表中给出。
表12：样品条件和结果
*双括号中的值不是最佳的；尽管偏离目标，但单括号中的值是可以接受的；没有括号的值在目标范围内。
磷含量。如上所述测定产率估计值、FFA含量和Δ脱胶。
从表12中可以看出，在酸处理后作为中和(pH调节)和在碱精制步骤(苛性8％NaOH)中加入相似量的NaOH的样品中(参见表12中的烧瓶ID 7和8)，最终样品中的FFA含量是次优的。相反，在碱精制步骤需要添加相当于该方法中添加的总NaOH的60％以上的NaOH的样品中，FFA含量是可接受的。
实验表明，酶水解前和酶水解后酸的剂量影响产率。
实例14-酶促脱胶-工业规模-过程间酸化
该实验的目的是使用单一分离步骤使脱胶的油中的磷含量降至低于30ppm，优选低于10ppm，同时达到可接受的FFA水平(即，0.1％-0.2％的水平)。
对粗制油样品(180kg)进行以下方法。在温和搅拌罐(40％搅拌器速度)下将油加热至80℃。然后添加相当于650ppm纯柠檬酸(CA)的体积。CA作为30％(w/w)溶液。使用Sylversson HSM(流过设备为1000Kgs/h)对混合物进行高剪切混合15分钟，然后在80℃和在安装在反应器中的70％搅拌器速度下机械搅拌15分钟。调节pH，然后通过添加6mol当量NaOH调节pH。添加作为8％(w/w)溶液的NaOH。
使用Siversson HSM(流过设备为1000Kgs/h)对混合物进行高剪切混合15分钟，然后冷却降至60℃。添加200ppm酶(苏云金芽孢杆菌PLC(SEQ ID NO.11))和假单胞菌属物种PI特异性PLC(SEQ ID NO.13)。使酶促反应进行45分钟。通过在反应器中将油加热至80℃使混合物失活。
添加磷酸(2.5kg磷酸/吨油)，并且对混合物进行高剪切混合15分钟。添加NaOH(使用8％溶液)以进行中和。进行纳米中和(70巴)约7分钟，并将油收集在罐中以备进料GEA离心机。在酶促水解后但在碱精制步骤之前添加酸在本文中称为过程间酸化
上述程序在所得的脱胶的油中产生约0.099％FFA和26ppm磷。因此可以得出结论，在酶阶段之后和最终中和阶段之前添加酸可以确保在螯合阶段之后添加的碱的量导致酶后碱中和步骤效率较低的情况下油的残留磷和FFA的最大减少。
实例15-PLC组合
如上所述进行脱胶测定(参见标题脱胶测定)，其中修改为在进行酶水解后添加更高量的碱。
测试了各种酶组合，如下表所示。
表13：样品条件；对于酶促反应，pH 4和pH 6在70℃下进行1小时，和结果
我们得出结论，酶促脱胶与碱精制相结合使用可以提高产率增加，并且减少干物质损失。虽然所有测试的酶组合导致增加，但是Bacillus macauensis PLC(SEQ ID NO:9)和假单胞菌属物种PI特异性PLC(SEQ ID NO.13)导致产率增加最大，同时干物质损失减少最多。该组合在磷脂水解(在水解后但在碱处理之前测量)和甘油二酯含量增加方面也表现最佳。
因此，在一个实施例中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述磷脂降解酶至少包含假单胞菌属物种PI特异性PLC(SEQ ID NO.13)。优选的实施例涉及其中酶包含假单胞菌属物种PI特异性PLC(SEQ ID NO.13)和Bacillus macauensis PLC(SEQ ID NO:9的成熟多肽)或由其组成。
本文描述和要求保护的本发明不限于本文公开的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。
Claims (62)
1.一种精制含有磷脂的植物油的方法，该方法包括通过在促进磷脂水解的条件下使该植物油与一种或多种磷脂降解酶接触，使磷脂进行酶促水解，然后对该植物油进行化学精制。
2.根据权利要求1所述的方法，其中磷脂的该酶促水解在第一反应容器中进行，并且该化学精制在第二反应容器中进行，这两个反应容器流体连接和/或连接以允许从该第一反应容器到该第二反应容器的液体通道。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中磷脂的该酶促水解在第一反应容器中进行，并且该化学精制在第二反应容器中进行，其中这些反应容器之间的流体连接或从该第一反应容器到该第二反应容器的液体通道不经由分离装置，例如离心机。
4.根据权利要求1所述的方法，其中磷脂的该酶促水解和该化学精制在同一反应容器中进行。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中该酶促水解后立即进行该化学精制；优选地，以连续方法操作进行。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中
-该酶促水解在包含重相和轻相的反应混合物中进行，以及
-在所述化学精制之前，没有减少或没有显著减少重相体积或将胶质/重相与油分离。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法包括：
i)提供包含所述植物油和一种或多种具有磷脂降解活性的酶的反应混合物，例如权利要求2定义的反应混合物；
ii)使该反应混合物经受允许酶促水解油中磷脂的条件，以提供所述植物油的经反应的混合物；以及
iii)使所述植物油的经反应的混合物经受化学精制。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法还包括酸化步骤，其在酶促水解之后和化学精制之前进行。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法包括：在将该植物油与一种或多种磷脂降解酶接触之前对该植物油进行水脱胶。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该植物油选自由以下组成的组：巴西莓油、杏仁油、巴巴苏油、黑加仑籽油、琉璃苣籽油、菜籽油、腰果油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、玉米油、棉籽油、海甘蓝油、亚麻籽油、葡萄籽油、榛子油、大麻籽油、麻风树油、荷荷芭油、亚麻仁油、澳洲坚果油、芒果仁油、白池花油、芥子油、牛脚油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油/落花生油、美洲山核桃油、松子油、开心果油、罂粟籽油、菜籽油、米糠油、红花油、油茶油、芝麻油、牛油树脂、大豆油、向日葵籽油、妥尔油、山茶油和胡桃油。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该植物油选自由以下组成的组：菜籽油、大豆油、向日葵籽油、棕榈油、椰子油、米糠油和花生油/落花生油。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与所述一种或多种磷脂降解酶接触的植物油是粗制植物油。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法包括：在使该植物油与该一种或多种磷脂降解酶接触之前使该植物油与一种或多种能够络合Ca和/或Mg离子的螯合剂接触。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法从一定量的粗制油提供一定量的精制油，该精制油的量比在其中相同量的所述粗制油经受化学精制而不事先酶促水解存在于所述粗制油中的磷脂的方法中提供的精制油的量高至少0.2％(w/w)。
15.根据权利要求6-14中任一项所述的方法，其中该反应混合物的pH的范围为1.5-12，例如范围为1.5-7。
16.根据权利要求6-15中任一项所述的方法，其中该反应混合物的水含量的范围为0.5％-10％(w/w)，例如范围为1％-10％(w/w)，范围为1％-5％(w/w)或例如范围为0.5％-5％(w/w)。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该植物油与该一种或多种磷脂降解酶在范围为45℃-90℃的温度下接触。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中磷脂的所述酶促水解具有6小时或更短的持续时间，例如4小时或更短的持续时间，例如0.5-6小时的持续时间，或0.5-4小时的持续时间，或例如5分钟-4小时的持续时间，例如5分钟至2小时的持续时间，5分钟至1小时的持续时间或例如5-30分钟的持续时间。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种具有磷脂降解活性的酶以相当于0.1mg-30mg酶蛋白的总量给予。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该植物油在使得在该酶促水解过程中整体磷脂分子的数量减少30％-100％的条件下与一种或多种磷脂降解酶接触。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该植物油在如下条件下与一种或多种磷脂降解酶接触，这些条件使得酶反应导致该油中PC+PE+PI+PA含量降低至少10％，例如至少25％，或该油中PC+PE+PI+PA含量降低至少40％。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该植物油在当已经经受化学精制时含有相当于20ppm磷或更少磷的量的磷脂。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该植物油和所述一种或多种具有磷脂降解活性的酶在一组条件下孵育0.1-6小时，该组条件包括
a)温度范围为45℃-90℃；
b)pH范围为约1.5至约12.0
c)搅拌或混合，例如通过剪切混合、高剪切混合、空化混合或超声波进行。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该化学精制包括提供该植物油与碱的掺和物，例如权利要求4中定义的所述植物油的经反应的混合物与碱的掺和物。
25.根据权利要求22所述的方法，其中碱以相对于该油中存在的游离脂肪酸的量大于化学计量的量给予。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中在该化学精制中添加的碱量至少占该方法中添加的碱总量的60％。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中该碱选自NaOH、KOH、碳酸钠及其组合。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中将所述植物油和所述碱的掺和物孵育从1分钟至8小时、例如从1分钟至5小时、从1分钟至2小时、从5分钟至8小时、从5分钟至5小时、从5分钟至2小时、从10分钟至5小时、从10分钟至2小时、从20分钟至5小时或从20分钟至2小时。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该化学精制包括将胶质和/或皂料与油分离。
30.根据权利要求24-29中任一项所述的方法，该方法包括将植物油和化学品的掺和物，例如所述植物油的经反应的混合物和化学品的掺和物转移到分离器，优选离心分离器或水平沉降器。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法包括：
i)将该植物油或权利要求6中定义的经反应的混合物与碱在20℃-90℃，例如20℃-80℃，例如20℃-40℃的温度下混合，碱的量大于化学计量的量，
ii)将植物油和碱的掺和物或经反应的混合物和碱的掺和物在20℃-80℃，例如20℃-40℃的温度下在搅拌下孵育2-15分钟；
iii)将该掺和物的温度升至55℃-95℃，例如升至55℃-85℃；以及
iv)当温度达到55℃-95℃，例如55℃-85℃时，将该掺和物馈入分离器以将胶质和/或皂料与油分离。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，该方法包括：
i)将该植物油和酸或该经反应的混合物和酸与碱混合，碱的量大于化学计量的量，
ii)将植物油、酸和碱的掺和物或经反应的混合物、酸和碱的掺和物馈入分离器中以将胶质和/或皂料与油分离。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中磷脂的该酶促水解和该化学精制在系统中进行，该系统包括酶给予单元；混合装置；保持部分，例如罐或管，该保持部分安装在植物油精制厂的反应管线或生产线中，例如在化学精制设备的上游或紧邻其上游；根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种具有磷脂降解活性的酶具有磷脂酶活性。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种具有磷脂降解活性的酶包括具有磷脂酶A活性的酶、具有磷脂酶C活性的酶、溶血磷脂酶或其混合物。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种磷脂降解酶具有以下一种或多种性质：
i)解离温度(Td)的范围为50℃-95℃，例如60℃-95℃、70℃-95℃、例如范围为70℃-90℃；
ii)最佳pH的范围为pH 4-7或pH 3-12，例如范围为pH 3-6，例如3.5-6或4-6，或例如pH的范围5-9，例如6-9或6-8，或例如范围为pH 7-12，例如8-12或8-10；
iii)对其中添加了一种或多种能够络合Ca和/或Mg离子的螯合剂的植物油中的磷脂的反应速率，所述反应速率是该一种或多种磷脂降解酶对其中未添加一种或多种螯合剂的所述植物油中的磷脂的反应速率的至少40％。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种磷脂降解酶选自由以下组成的组：
a.具有针对磷脂酰肌醇(PI)的特异性的磷脂酶C，
b.具有针对磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的特异性的磷脂酶C，
c.具有针对磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)的特异性的磷脂酶C，
d.磷脂酶A和磷脂酶C的组合，该磷脂酶C是例如a)或b)中定义的磷脂酶C，
e.磷脂酶A和溶血磷脂酶的组合，
f.磷脂酶A，
g.a)和b)的组合
h.和/或其组合。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述磷脂酶A选自由以下组成的组：
a.与SEQ ID NO:1、4和7中任一个的成熟多肽具有至少60％序列同一性，例如至少75％序列同一性、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的多肽；
b.与SEQ ID NO:2、5和8中任一所示的多肽具有至少60％序列同一性，例如至少75％序列同一性、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；
c.(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶A活性。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述一种或多种磷脂降解酶之一是变体或是SEQID NO:1、4和7中任一个的成熟多肽的变体，或者是SEQ ID NO:2、5和8中任一所示的多肽的变体，所述变体包含在一个或多个位置处的取代、缺失和/或插入。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述一种或多种磷脂降解酶之一包含SEQID NO:2、5和8中任一所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述磷脂酶C选自由以下组成的组：
a.与SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、22、25、28中任一个的成熟多肽具有至少60％序列同一性，例如至少75％序列同一性、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽，
b.与SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、23、26、29中任一所示的多肽具有至少60％序列同一性，例如至少75％序列同一性、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；以及
c.(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶C活性。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述一种或多种磷脂降解酶之一是SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、22、25和28中任一个的成熟多肽的变体，或者是SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、23、26和29中任一所示的多肽的变体，所述变体包含在一个或多个位置处的取代、缺失和/或插入。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述一种或多种磷脂降解酶之一包含以下，基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、23、26和29中任一所示的序列或其组合。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种磷脂降解酶之一具有磷脂酶C活性，并且选自由以下组成的组：
i)与SEQ ID NO:9的成熟多肽或SEQ ID NO:10中所示的多肽具有至少60％序列同一性，例如至少75％序列同一性、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽，
ii)i)中定义的多肽的变体，该变体包含在一个或多个位置处的取代、缺失和/或插入，
iii)多肽，该多肽包含SEQ ID NO:8中所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
44.磷脂降解酶在植物油中水解磷脂的用途，其中该植物油与该磷脂降解酶接触，并且然后进行化学精制。
45.根据权利要求44所述的用途，其中
-所述磷脂的酶促水解在包含重相或水相和轻相或油相/疏水相的反应混合物中进行，并且
-在所述化学精制之前，没有减少或没有显著减少重相体积或将胶质/重相与油分离。
46.一种精制的植物油或皂料，该精制的植物油或皂料通过权利要求1-43中任一项所定义的方法可获得或获得。
47.一种分离的或纯化的具有磷脂酶A活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：
a.与SEQ ID NO:3和5中任一个的成熟多肽具有至少75％序列同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，
b.与SEQ ID NO:4和6中任一所示的多肽具有至少75％序列同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽；
c.(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶A活性。
48.根据权利要求47所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:1、3和6中任一个的成熟多肽的变体，或者是SEQ ID NO:4和6中任一所示的多肽的变体，所述变体包含在一个或多个位置处的取代、缺失和/或插入。
49.根据权利要求47所述的多肽，该多肽包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
50.一种分离的或纯化的具有磷脂酶C活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：
i)与SEQ ID NO:22、25、28中任一个的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽，
ii)与SEQ ID NO:23、26、29中任一所示的多肽具有至少60％序列同一性的多肽，以及
iii)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶C活性。
51.根据权利要求50所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:22、25和28中任一个的成熟多肽的变体，或者是SEQ ID NO:23、26和29中任一所示的多肽的变体，所述变体包含在一个或多个位置处的取代、缺失和/或插入。
52.根据权利要求50所述的多肽，该多肽包含SEQ ID NO:23、26或29所示的序列，基本上由其组成或由其组成。
53.一种组合物，该组合物包含权利要求47-52中任一项所述的多肽。
54.一种分离的或纯化的多核苷酸，该多核苷酸编码权利要求47-52中任一项所述的多肽。
55.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含权利要求54所述的多核苷酸，其中该多核苷酸优选可操作地连接至指导在表达宿主内产生该多肽的一个或多个控制序列。
56.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列的权利要求54所述的多核苷酸，或包含权利要求55所述的核酸构建体或表达载体。
57.根据权利要求56所述的重组宿主细胞，其中该多肽对该重组宿主细胞是异源的。
58.根据权利要求56或57所述的重组宿主细胞，其中该一个或多个控制序列中的至少一个与编码该多肽的多核苷酸异源。
59.一种产生权利要求47-52中任一项所述的多肽的方法，该方法包括在有助于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽。
60.根据权利要求59所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
61.一种产生具有磷脂酶A活性的多肽或具有磷脂酶C活性的多肽的方法，该方法包括在有助于产生该多肽的条件下培养权利要求56-58中任一项所述的重组宿主细胞。
62.根据权利要求61所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。
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