CN105073985A - 具有磷脂酶a活性的多肽与对其进行编码的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有磷脂酶A活性的分离的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。

Description

具有磷脂酶A活性的多肽与对其进行编码的多核苷酸

对序列表的引用

本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有磷脂酶A活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。

相关技术说明

已从大量的有机体中分离出了磷脂酶，例如动物、植物、细菌、真菌。

来自黑曲霉的脂肪酶(UNIPROT：B8YIE6)具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列与本发明的磷脂酶具有70％的一致性。

具有A1活性的磷脂酶已经由诺维信A/S公司以LECITASEULTRA向公众开放(杨(Yang)等人，食品技术和生物技术(Food Technol.Biotechnol.)，44(1)101-104(2006))。

本领域已知磷脂酶的数个用途，例如将磷脂酶用于，例如植物油的酶法脱胶(杨(Yang)等人，见上文；US5,264,367，Metallgesellschaft，)；淀粉水解产物的处理(特别是来自小麦淀粉)以改善滤过率(EP219,269，CPC国际)；作为一种面包面团的添加剂以改善面团和面包的特性(US4,567,046，协和发酵(KyowaHakko))；并且用于制备具有特殊的乳化性能的溶血卵磷脂。

可以将磷脂酶应用于植物油的脱胶以提供具有适于消费的中性味道和浅色的精炼贮存稳定的植物油。脱胶过程包括去除磷脂化合物，该磷脂化合物又称磷脂类或来自富含三酸甘油脂的油级分的“胶”。

传统上，脱胶过程基于水萃取，用酸处理或腐蚀性处理，随后经过分离过程。由于磷脂类的乳化性，脱胶流程导致了油的损失，即，甘油三酯的损失。然而，酶法脱胶已经变得越来越普遍。酶法脱胶是在已经进行过了水脱胶的油上以及在粗油上进行。在食用油的水脱胶过程中，磷脂类的一部分被留在该油中。那部分用通用术语“非水化磷脂类”(NHP)来描述。在生产油的过程中，去除NHP含分是必不可少的(US5264367)。在酶法脱胶过程中，通过使用磷脂酶将NHP转化为溶于水的并且水可提取的组分。

针对植物油的工业脱胶应用最广泛的商业酶是来自诺维信A/S公司的磷脂酶LECITASEULTRA(杨(Yang)等人，见上文)。LECITASEULTRA具有相对高的热稳定性；然而，其最适合用于温度最高不超过55℃的脱胶过程。

一般通过使用酸性的和腐蚀性的化学品协助酶法脱胶。在初始脱胶步骤中，通过将金属与柠檬酸盐螯合，柠檬酸或磷酸的添加改善了磷脂的盐形式的水合性。在以下酶促反应中，pH经常需要被部分中和(典型地通过添加氢氧化钠)以适应所应用的酶的pH需要。当使用磷脂酶LECITASEULTRA时，针对此反应的最适pH为在5.0和5.5之间(参见申请表“植物油的精炼-改善脱胶产率(Refiningofvegetableoils-Improvingdegummingyield)”)。然而，在此pH范围内，在酶促反应期间所释放的钙和/或镁与用来控制反应条件的缓冲液或螯合酸结合，典型地导致盐形成并且导致因柠檬酸钙和柠檬酸镁的盐的沉淀的设备污染(US7,713,727)。如果酶促反应可以在较低pH下进行由此减少用于中和所使用的酸将是有利的。

对于提供具有改善性质的新颖磷脂酶是一直存在的需要的，例如在高温和/或低pH下提高活性。本发明涉及具有磷脂酶A活性的此类新颖的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。

发明概述

本发明人已经鉴定出了一种来自嗜热篮状菌(Talaromycesleycettanus)菌株CBS398.68的具有磷脂酶A活性的新型多肽。本发明的多肽示出了在高温下的高热稳定性和/或提高的活性。因为它允许在较高温度下进行工业过程，这是一种优点。在酶法脱胶中，较高的温度可以提高存在于油中的磷脂类的酶法脱胶的速度，有助于在磷脂类的酶法降解后的油相和水相的分离，和/或降低油的粘度-所有以上这些导致较短的加工时间以及油脂精炼设备的较高物料通过量。

此外，本发明的多肽在低pH下具有出乎意料高的活性，这是一种优点，即，在植物油的酶法脱胶中，其中pH调节的需要被降低，导致工艺设备的沉淀的较少的沉积并且因此节省了所减少使用的化学品连同降低了用于清洁的时间。

多肽对大多数磷脂具有活性，包括磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、和磷脂酰胆碱(PC)。

因此,本发明提供了具有磷脂酶A活性的新颖多肽和编码这些多肽的多核苷酸。

在第一方面，本发明涉及具有磷脂酶A活性的分离多肽，所述分离多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，该与多肽SEQIDNO:2的成熟多肽或SEQIDNO:3的多肽具有至少80％的序列一致性；(b)一种多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交；(c)一种多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或与其cDNA序列具有至少65％序列一致性；(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的的变体或SEQIDNO:3的多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；和(e)(a)、(b)、(c)、或(d)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶A活性。

在第二方面，本发明涉及分离的核酸，所述分离的核酸选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的成熟多肽或SEQIDNO:3的多肽；(b)一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中所述多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:2的成熟多肽或与SEQIDNO:3的多肽具有至少80％的一致性；(c)一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中该核苷酸序列包括SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列；(d)一种核苷酸序列，该核苷酸序列与根据(a)、(b)、或(c)的核苷酸序列具有至少80％的序列一致性；(e)一种核苷酸序列，该核苷酸序列在高严格条件下与根据(a)、(b)、(c)、或(d)的核苷酸序列的互补链杂交；(f)根据(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的核苷酸序列的子序列，具有至少100个核苷酸；(g)一种序列，该序列由于遗传密码的简并性而简并为一种序列，该序列如在(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、或(f)中任一项所定义的；和(h)根据(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的核苷酸序列的互补链。

在第三方面，本发明涉及一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括第二方面的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。

在第四方面，本发明涉及一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括第二方面的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列。

在第四方面，本发明涉及一种产生第一方面的多肽的方法，该方法包括：(a)培养细胞，该细胞处于其野生型形式，在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；以及(b)回收该多肽。

在第六方面，本发明涉及一种产生具有磷脂酶A活性的多肽的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养第四方面的宿主细胞；以及(b)回收该多肽。

在第七方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包括(a)第一方面的多肽或通过第五或第六方面中任一项所述的方法可获得的一种多肽；以及(b)可任选地一种另外的酶。

在第八方面，本发明涉及第一方面的多肽或任何第七方面的组合物在水解磷脂中的用途。

在第九方面，本发明涉及一种方法，该方法用于降低食用油中的含磷组分的含量，该方法包括将所述的油与任何第一方面所述的多肽的水溶液接触，该水溶液乳化于该油中直至该油的磷含量降低，并且然后将水相与该处理过的油分开。

附图简要说明

图1说明了当不同的磷脂酶裂解一种磷脂的情况。

图2说明了磷脂与磷脂酶A2的反应以形成一种溶血磷脂和一种游离R2脂肪酸，该溶血磷脂在甘油骨架中的位置C2处具有羟基基团。一种与磷脂酶A1的类似的反应将裂解用R1标记的脂肪酸，以形成一种游离R1脂肪酸和一种溶血磷脂，该溶血磷脂在甘油骨架中的位置C1处具有羟基基团。

图3显示了在卵磷脂(PC)板上从pH3至pH7的LicitaseUltra和SEQIDNO:2的磷脂酶的活性。孵育时间为90分钟、150分钟、4小时、7小时、23小时、29小时和48小时。黑圈表示活性，圈越大活性越高。

定义

磷脂酶A活性：在本发明的上下文中，术语“磷脂酶A活性”包括具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶(A1或A2、EC3.1.1.32或EC3.1.1.4)，即，针对磷脂例如卵磷脂中的一个或二个羧酸酯键的水解活性。具有A1和A2二者活性的磷脂酶还称作磷脂酶B。

出于本发明的目的，根据材料与方法(Materialandmethods)章节中所描述的程序确定磷脂酶A活性。在一方面，本发明的这些多肽具有SEQIDNO:2的成熟多肽的和/或SEQIDNO:3的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的磷脂酶A活性。

除了具有磷脂酶A活性之外，本发明的多肽还可以具有脂肪酶活性。

磷脂酶C活性：磷脂酶C(E.C.3.1.4.11)去除了磷脂例如卵磷脂中的磷酸酯部分，以生产1,2甘油二酯和磷酸酯。

磷脂酶D活性：磷脂酶D(E.C.3.1.4.4)作用于磷脂例如卵磷脂，并且产生1,2-甘油磷酸二酯和碱基团。

脂酶活性：术语“脂酶活性”在此定义为解脂活性，该解脂活性水解三丁酸甘油酯、油酸甘油酯、pNP-丁酸酯和pNP-棕榈酸酯(甘油三酯脂肪酶EC3.1.1.3)中的羧酸酯键。

热稳定性：在本发明的上下文中，使用实例1中所描述的方法，通过差示扫描量热法(DSC)确定“热稳定性”。在一方面，本发明的多肽具有一个变性温度，该变性温度比LECITASEULTRA，即，在SEQIDNO:5中所示的多肽的变性温度至少高5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃或甚至17℃。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

催化结构域：术语“催化结构域”意指一种酶的含有该酶的催化机构的区域。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

粗油：术语“粗油”是指(还称非脱胶的油)来自以下各项的一种压榨的或提取的油或其混合物，例如，蔬菜来源的包括但不限于：阿莎伊油(acaioil)、杏仁油、棕榈仁油、黑醋栗籽油(blackcurrentseedoil)、琉璃苣籽油、卡罗拉(CanolaOil)油、腰果油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、玉米油、棉籽油、海甘蓝油、亚麻籽油、葡萄籽油、榛子油、线麻油、麻疯果油、霍霍巴油、亚麻籽油、澳洲坚果油、芒果仁油、白芒花籽油、芥子油、牛脚油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、胡桃油、松子油、阿月浑子油、罂粟籽油、菜籽油、米糠油、红花油、山茶花油、麻油、牛油果油、大豆油、葵花籽油、妥尔油、山茶油、核桃油，各种“天然”油经过基因修饰生物(GMO)或传统“裹面包屑”来改变脂肪酸组成，例如高油酸的、低油酸的、或低饱和的油(高油酸的菜籽油、低亚麻油酸的大豆油或高硬脂葵花油)。

经过脱胶的油：术语“经过脱胶的油”是指一种油，该油在从油中去除非能水合的磷脂、能水合的磷脂、和卵磷脂(统称为“胶”)之后获得，以产生一种脱胶油或脂肪产品，该脱胶油或脂肪产品可以用于食品生产和/或非食品的应用，例如生物柴油。在某些实施例中，脱胶油具有少于约200ppm磷、少于约150ppm磷、少于约100ppm磷、少于约50ppm磷、少于约40ppm磷、少于约30ppm磷、少于约20ppm磷、少于约15ppm磷、少于约10ppm磷、少于约7ppm磷、少于约5ppm磷、少于约3ppm磷或少于约1ppm磷的磷脂含量。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种多肽的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

片段：术语“片段”意指使一个或多个(例如，若干个)氨基酸从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺少的多肽，其中该片段具有磷脂酶A活性。根据本发明的片段具有的大小为大于大约160(例如SEQIDNO:3的氨基酸117-277)，优选的是大于200个氨基酸残基，优选大于210个氨基酸残基，更优选大于220个氨基酸残基，更优选大于230个氨基酸残基，更优选大于240个氨基酸残基，更优选大于250个氨基酸残基，更优选大于260个氨基酸残基(例如，SEQIDNO:3的氨基酸18至277或氨基酸1至259)，更优选大于270个氨基酸残基(例如，SEQIDNO:3的氨基酸8至277或氨基酸1至270)，并且最优选大于275个氨基酸残基。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

分离的：术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，基于SignalP版本3的程序(尼尔森(Nielsen)等，1997，蛋白质工程(ProteinEngineering)10:1-6)，该成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸20至296。SEQIDNO:2的氨基酸1至19被预测为信号肽。该成熟多肽还被示为SEQIDNO:3中氨基酸1至277。使用应用生物系统公司Procise蛋白质序列系统分析在米曲霉(Aspergillusoryzae)中所表达的多肽的N-末端序列。其显示了如下N-末端序列：

35kDa带,具有对应于SEQIDNO:2的残基28-34的N-末端DVSSSVL

25kDa带，具有对应于SEQIDNO:2的残基117-123的N-末端EADLDFP

25kDa带，具有对应于SEQIDNO:2的残基120-126的N-末端LDFPLTD

本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C末端和/或N末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C末端和/或N末端氨基酸)。在一个方面，成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸28到296。在另一个方面，成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸117至296或SEQIDNO:2的氨基酸120至296。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有磷脂酶A活性的成熟多肽的一种多核苷酸。在一个方面,成熟多肽编码序列是SEQIDNO:1的核苷酸1至1284，或其cDNA序列。在一方面，cDNA序列包括SEQIDNO:1的核苷酸101至182、核苷酸258至423、核苷酸485至821、和核苷酸879至1184，或由其组成。在一方面，cDNA序列包括SEQIDNO:4的核苷酸1至891，或由其组成。在一方面，该cDNA是SEQIDNO:4的核苷酸58至891。SEQIDNO:4核苷酸1至57编码信号肽。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链-或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包括一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指一种配置，其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指导编码序列的表达。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的脱氧核糖核酸核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

严格条件：非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及或者35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。非常高严格 条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列或其cDNA序列的5’端和/或3’端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有磷脂酶A活性的一个片段。

变体：术语“变体”意指具有磷脂酶A活性的、在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的一个多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸替换不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。

发明详细说明

具有磷脂酶A活性的多肽

在一个实施例中，本发明涉及分离的多肽,这些分离的多肽与SEQIDNO:2的成熟多肽或与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些多肽具有磷脂酶A活性。在一方面，这些多肽与SEQIDNO:2的成熟多肽或与SEQIDNO:3的多肽相差不超过10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在一个优选的实施例中,磷脂酶A活性是SEQIDNO:3的多肽的磷脂酶A活性的至少70％。

本发明的多肽优选地包括SEQIDNO:2的氨基酸序列、SEQIDNO:3的氨基酸序列、或其等位变体，或由其组成；或者是其具有磷脂酶A活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQIDNO:2的成熟多肽或SEQIDNO:3的多肽，或由其组成。

在一个优选的实施例中，当在70℃下使用2小时的情况下，本发明的多肽能够比LecitaseUltra更有效地降低粗油中的磷酸酯含量。优选地，本发明的多肽能够将磷酸酯含量降低到少于50ppm磷、优选地少于约40ppm磷、更优选地少于约30ppm磷、更优选地少于约20ppm磷、更优选地少于约15ppm磷、更优选地少于约10ppm磷、更优选地少于约7ppm磷、甚至更优选地少于约5ppm磷、甚至更优选地少于约3ppm磷或最优选地少于约1ppm磷。

在另一个实施例中，本发明多肽的最优pH范围是在1.5至约7.0之间，优选的是2.5至6，优选的是3.0至5.5，优选的是从3.5至5.0并且最优选的是从3.0至4.5。

在另一个实施例中，本发明多肽的是耐热的。优选地，当如在实例1中所描述的通过差示扫描量热法确定时，热变性温度是65℃以上，更优选的是70℃以上，甚至更优选的是75℃以上，并且更优选的是80℃以上。在另一个实施例中，本发明的多肽在pH4和pH5下是同样热稳定的，例如，DSC值变化小于5℃，更优选的是小于4℃，甚至更优选的是小于3℃并且最优选的是小于2℃。

在另一个实施例中，本发明涉及一种具有磷脂酶A活性的分离的多肽，该分离的多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆，实验室手册(MolecularCloning,ALaboratoryManual)，第二版，冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约)。

SEQIDNO:1的多核苷酸或其子序列，连同SEQIDNO:2的多肽，或SEQIDNO:3的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定并克隆来自不同属或种的株系的、编码具有磷脂酶A活性的多肽的DNA。具体而言，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如，长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、或至少800个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有磷脂酶A活性的多肽的DNA，对从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQIDNO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交指示多核苷酸在非常低至非常高严格条件下与一种标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQIDNO:1；(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列；(iii)；(iv)其全长互补体；或(v)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下该核酸探针杂交的分子。

在一方面，该核酸探针是SEQIDNO:1的核苷酸1至100、核苷酸1至200、核苷酸1至250、或核苷酸1至300。在另一个方面中，该核酸探针是编码SEQIDNO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。在另一个方面中，该核酸探针是SEQIDNO:1。

在另一个实施例中，本发明涉及一种具有磷脂酶A活性的分离的多肽，该分离的多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或与其cDNA序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。

在另一个实施例中，本发明涉及SEQIDNO:2的成熟多肽的变体或SEQIDNO:3的多肽的变体，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入。在一个实施例中，引入SEQIDNO:2的成熟多肽或SEQIDNO:3的多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(H.Neurath)和R.L.希尔(R.L.Hill)，1979，在蛋白质(TheProteins)，学术出版社，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的磷脂酶A活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂质(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德沃斯(deVos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂质(J.Mol.Biol.)224:899-904；罗达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需氨基酸。

在SEQIDNO:2的氨基酸1至296的序列中的必需氨基酸位于位置H172、D228、和H285。在一个优选的实施例中，这些位置保留在本发明的多肽中。

可以进行单个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入并且使用已知的诱变、重组、和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如由里德哈-奥尔森(Reidhaar-Olson)和索尔(Sauer)，1988，科学(Science)，241:53-57；鲍威(Bowie)和索尔(Sauer)，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，86:2152-2156；WO95/17413或WO95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，罗曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)和区域定向诱变(德比舍尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(NatureBiotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

具有磷脂酶A活性多肽的来源

本发明的具有磷脂酶A活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面中，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

该多肽可以是一种真菌多肽。例如，该多肽可以是酵母多肽，例如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)多肽；或丝状真菌多肽，例如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑燕属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、丛赤壳属(Nectria)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、某真菌属(Poitrasia)、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。

在另一方面，该多肽是卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉斯酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁费酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酶母(Saccharomycesnorbensis)、或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多肽。

在另一方面，该多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢菌(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟枝孢镰刀菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰刀菌(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicolagrisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉菌(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、无色梭孢壳(Thielaviaachromatica)、成层梭孢壳菌(Thielaviaalbomyces)、白毛梭孢壳(Thielaviaalbopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、粪梭孢壳(Thielaviafimeti)、小孢梭孢壳(Thielaviamicrospora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielaviaperuviana)、毛梭孢壳(Thielaviasetosa)、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、土生梭孢壳(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)、或绿色木霉(Trichodermaviride)多肽。

在另一方面，该多肽是一种从丛赤壳属(Nectriasp.)中获得的多肽，例如，米红丛赤壳菌(Nectriacinnabarina)、猩红丛赤壳菌(Nectriacoccinea)、鲜红丛赤壳菌(Nectriaditissima)、多孢囊霉丛赤壳菌(Nectriadiversispora)、Nectriaeustromatica、叶生丛赤壳菌(Nectriafoliicola)、类杆菌丛赤壳菌(Nectriafragilis)、富克尔丛赤壳菌(Nectriafuckeliana)、仁果干癌丛赤壳菌(Nectriagalligena)、红球丛赤壳菌(Nectriahaematococca)、球壳丛赤壳菌(Nectriaepisphaeria)、辛夷丛赤壳菌(Nectriamagnoliae)、Nectriamammoideavar.rubi、Nectriamauritiicola、水球丛赤壳菌(Nectriapeziza)、假毛丛赤壳菌(Nectriapseudotrichia)、红花丛赤壳菌(Nectriapunicea)、根赤壳属丛赤壳菌(Nectriaradicicola)和Nectriaramulariae中的任一种。

将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfectandimperfectstates)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures，CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook(萨姆布鲁克)等人，1989，同上)。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如在此所述。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:AGuidetoMethodsandApplication)，学术出版社(AcademicPress)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以由指端丛赤壳属菌株或相关有机体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因或种变体。

编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“实质上类似”于该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、或其cDNA序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的核苷酸取代，或通过引入可以产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(ProteinExpressionandPurification)2:95-107。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。

该控制序列还可以是一个前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导序列可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.CellularBiol.)15:5983-5990中得以描述。

控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5’-末端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯(Romanos)等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。

该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还可能希望地是添加调控序列，这些调控序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调控系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调控序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

用于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或该载体中通过同源或非同源重组而整合到该基因组中的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(NucleicAcidsRes.)15:9163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO00/24883披露的方法完成。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点；ARS1；ARS4；ARS1与CEN3的组合；及ARS4与CEN6的组合。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。优选地，该多核苷酸是异源的，意指在该宿主细胞中它并不是自然存在的。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(AinsworthandBisby’sDictionaryofTheFungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CABInternational)，大学出版社(UniversityPress)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(BiologyandActivitiesofYeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9)，1980)中所描述来定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyceslactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于EP238023、约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(AcademicPress,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且(b)回收该多肽。在一个优选方面，该细胞是曲霉属细胞。在一个更优选的方面，该细胞是米曲霉或黑曲霉细胞。本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该多肽。

这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，蛋白质纯化(ProteinPurification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCHPublishers)，纽约，1989)。

在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。

组合物

本发明还涉及组合物，这些组合物包括具有另外组分的本发明的磷脂酶A多肽。

组合物可以包括本发明的磷脂酶A多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。

本发明还涉及组合物，这些组合物包括本发明的磷脂酶A与一种或多种另外磷脂酶活性的混合物，该另外的磷脂酶活性选自PLA1、PLA2、PLC和PLD。

.可替代地，该组合物可以包括另外的酶，如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。例如可以通过属于以下属的微生物来产生另外的一种或多种酶：曲霉属，例如棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉菌、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，例如杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，例如特异腐质霉或柔毛腐质霉；或者木霉属，例如哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。该多肽可以根据本领域已知的方法稳定化。

可以将本发明的磷脂酶和包含这些的组合物与选自下组的组分一起配制，该组由以下各项组成：缓冲剂、无机盐、溶剂、惰性固体和其混合物。适合的缓冲系统，例如，在pH2至10下，是由在0,01M和1M之间的浓度的盐或有机酸、氨基酸、磷酸盐、胺或氨的水溶液制成。优选地，使用0,1至0,2M的pH4至8的柠檬酸、乙酸、甘氨酸的碱金属盐和/或三(羟甲基}和氨的盐酸化物。优选地，将磷脂酶溶解于缓冲水溶液，例如甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、等。包含柠檬酸盐的缓冲液被发现非常适合，特别是柠檬酸钠缓冲液，优选的是在中性pH下。

本发明的组合物可以包括固定到一个固相支持体的本发明的磷脂酶。用于本发明的固相支持体包括凝胶。凝胶的一些实例包括琼脂糖、明胶、戊二醛、壳聚糖处理的戊二醛、白蛋白戊二醛、壳聚糖黄原胶、toyopearl凝胶(聚合物凝胶)、海藻酸盐、海藻酸盐多赖氨酸、卡拉胶、琼脂糖、乙醛酰基琼脂糖、磁性的琼脂糖、右旋糖酐琼脂糖、多(氨甲酰基磺酸)水凝胶、BSA-PEG水凝胶、磷酸化聚乙烯醇(PVA)、一乙基化的-N-氨乙基(MANA)、氨基、或其任何组合。用于本发明的另一种固相支持体是树脂或聚合物。树脂或聚合物的一些实例包括纤维素、丙烯酰胺、尼龙、人造丝、聚酯、阴离子交换树脂、AMBERLITE^TMXAD-7、AMBERLITE^TMXAD-8、AMBERLITE^TMIRA-94、AMBERLITE^TMIRC-50、聚乙烯基、聚丙烯酸物、聚甲基丙烯酸酯、或其任何组合。用于本发明的另一种类型的固相支持体是陶瓷。一些实例包括非多孔陶瓷、多孔陶瓷、Si02、Ah03。用于本发明的另一种类型的固相支持体是玻璃。一些实例包括非多孔玻璃、多孔玻璃、氨基丙基玻璃或其任何组合。可以使用的另一种类型的固相支持体是微电极。一个实例是聚乙亚胺涂层的磁铁矿。石墨颗粒可以被用作固相支持体。被用来实践本发明的其他示例性固相支持体包括硅藻土产品和硅酸盐。一些实例包括 硅藻土和SILASORB^TM、和CELKA合成的硅酸钙和硅酸镁。

用于固定酶的方法的一些实例包括，例如，静电液滴发生、电化学的手段、通过吸附、通过共价加合、通过交联、通过化学反应或化学过程、通过包囊、通过截留、通过藻酸钙、或通过聚(2-羟甲基甲基丙烯酸酯)。类似的方法被描述于酶学方法(MethodsinEnzymology)，固定化酶和细胞(ImmobilizedEnzymesandCells)，C部分，1987，学术出版社(AcademicPress)，由S.P.克罗维克(Colowick)和N.0.卡普兰(Kaplan)编辑，第136卷；和固定化酶和细胞(ImmobilizationofEnzymesandCells)，1997，胡马纳出版社(HumanaPress)，由G.F.比克斯塔夫(Bickerstaff)编辑，系列：生物技术方法(MethodsinBiotechnology)，由J.M.沃克(Walker)编辑。

用途

本发明的磷脂酶可以应用于从一种油中去除磷脂的过程中，例如，一种植物油、动物油或脂肪、牛脂、或动物脂。可以使用本发明的磷脂酶的应用包括i)油的脱胶，例如，植物油、或食用植物油，在一种过程中，该过程包括在来自水脱胶的胶级分中水解磷脂以释放被截留的甘油三酯油，ii)在一种过程中，该过程包括水解磷脂以获得改善的磷脂乳化剂，具体地而言其中所述磷脂是卵磷脂，iii)在一种过程中，该过程用于改善碳水化合物来源的水溶液或浆料的可滤性，该碳水化合物来源包含磷脂，iv)在一种过程中，该过程用于生产动物饲料产品，v)在一种过程中，该过程用于生产生物燃料，例如，生物柴油，vi)在一种过程中，该过程用于生产洗涤剂产品，和/或vii)在一种过程中，该过程用于制作烘焙产品，该过程包括添加磷脂酶至面团中，并且烘焙面团以制作烘焙产品。

脱胶：本发明的磷脂酶可以用来脱胶油，例如动物油或脂肪、牛脂、动物脂或植物油，即，在减少食用油的磷脂含量的过程中。参见，例如，WO2007/103005和US2008/0182322。此类过程可以用来纯化任何包含磷脂的食用油，例如，植物油例如大豆油、菜子油、或葵花油或任何在粗油定义下所提及的其他油。

本发明的一方面是一种方法，该方法通过磷脂酶处理减少食用油的含磷组分的含量，该方法包括在足以使酶与磷脂反应以形成游离脂肪酸和溶血磷脂产物的条件下，将所述油与本发明的多肽的水溶液接触。将溶血磷脂溶解于水相，导致油中的磷含量的减少。游离脂肪酸将留在油中。在磷脂酶处理后，将水相从所处理的油中分离。在油中磷脂通常作为以百万分率的“磷含量”进行测量。表1阐述了存在于主要的油料作物中的磷脂典型的量，以及各种官能团占存在于该油中的磷脂的百分比的分布。

表1：对于常见的油籽的典型的水平和磷脂的分布

	豆油	卡罗拉(Canola Oil)油	葵花油
				磷(ppm)	400-1500	200-900	300-700
PC％	12-46	25-40	29-52
				PE％	8-34	15-25	17-26
PA％	17-26	10-20	15-30
				PI％	2-15	2-25	11-22

磷脂酶处理可以直接在粗油中或在去除黏液(粘质)(例如，通过湿法精炼)后进行。在一个优选的实施例中，该油选自粗油，经过水脱胶的油，经过酸脱胶的油和腐蚀性精制油。

在湿法精炼之后，在用磷脂酶处理的起初，该油典型地包含50-250ppm的作为磷脂的磷。在本发明的一个优选实施例中，该处理降低了磷值，优选的是至20ppm以下，例如在15ppm以下，例如在11ppm以下，例如至10ppm以下、9ppm以下、8ppm以下、7ppm以下、6ppm以下甚至5ppm以下。

通过分散磷脂酶的水溶液进行磷脂酶处理，优选的是以平均直径低于10微米的液滴。水的量优选的是以相对于油的重量计的0.5％-5％。可任选地添加乳化剂。可以使用机械搅拌以保持乳液。搅拌可以用高剪切混合器以高于1400cm/s的叶尖速率完成。

在某些实施例中，一种适合的油脱胶的方法包括a)将酸的水溶液与油混合以获得具有约1至4的pH的酸性混合物，b)将碱与酸性混合混合以获得具有约6-9的pH的反应混合物，并且c)将反应混合物用本发明的酶进行脱胶以获得脱胶的油。在某些实施例中，在步骤a)和/或b)中的混合产生了一种乳液，该乳液包括平均液滴大小在约15微米至约45微米之间的水相。在某些实施例中，在步骤a)和/或b)中的混合产生了一种乳液，该乳液包括按体积计至少60％的水相，液滴大小在约15微米至约45微米之间，其中水相的百分比是基于水相的总体积。被本领域技术人员视为适合的任何酸可以用于在此所提供的方法中。在某些实施例中，酸选自下组，该组由以下各项组成：磷酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、丁二酸、和其混合物。被本领域技术人员视为适合的任何酸可以用于在此所提供的方法中。在某些实施例中，碱选自下组，该组由以下各项组成：氢氧化钠、氢氧化钾、硅酸钠、碳酸钠、碳酸钙、和其组合。

在一个优选的实施例中，磷脂酶处理可以在约1.5至约7.0范围内的pH下进行，优选的是2.5至6，优选的是3.0至5.5，优选的是从3.5至5.0，并且最优选的是从3.0至4.5。该pH是在乳液中或在油和水溶液之间的中间相中进行测量的。适合的温度一般是30℃-80℃(特别的是30℃-70℃、40℃-60℃，例如，50℃-55℃)。在优选的实施例中，油的温度是在55℃和80℃之间，更优选的是在60℃和75℃之间并且最优选的是在65℃和70℃之间。

反应时间典型地是1-12小时(例如，1-6小时、或1-3小时，最优选地反应时间是在1.5和4小时之间，甚至更优选地在1.5和2小时之间)。适合的酶的剂量通常是0.1-10mg/升(例如，0.5-5/升)。可以分批进行磷脂酶处理，例如在搅拌的罐中；或它可以是连续的，例如一系列的搅拌罐反应器。磷脂酶处理可以随后进行水相和油相的分离。该分离可以通过常规手段进行，例如，离心。当使用液态脂肪时，该水相将包含磷脂酶，并且该酶可以被重复使用以改善过程的经济性。

除了本发明的磷脂酶以外，一种另外的酶可以应用于以上概述的脱胶过程。在一个优选的实施例中，该另外的酶是一种具有磷脂酶A1、A2、B和/或C活性的多肽。一种具有磷脂酶A1活性的适合的多肽可以是从诺维信A/S公司可获得的LECITASEULTRA。一种具有磷脂酶C活性的适合的多肽可以是，例如，从DSM可获得的酶PURIFINE或在WO2012/062817和PCT/CN2013/089106中所描述的PLC’s。

磷脂乳化剂：本发明的磷脂酶可以用于磷脂的部分水解，优选的是卵磷脂，以获得改善的磷脂乳化剂。本申请进一步描述于乌尔曼工业化学百科全书(Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry)(出版社：VCH魏因海姆(Weinheim)(1996))，日本专利2794574，和JP-B6-087751。

过滤：可以通过将碳水化合物来源用磷脂酶进行处理，使本发明的磷脂酶用来改善碳水化合物来源的水溶液或浆料的可滤性。这特别适用于包含淀粉水解产物的浆料的溶液，特别是小麦淀粉水解产物，因为这往往很难过滤并且往往给出浑浊的滤液。该处理可以类似于EP219,269(CPC国际)来完成。

动物饲料：本发明的磷脂酶可以用于一种用于生产动物饲料的过程中，该过程包括将磷脂酶与包括至少一种磷脂的饲料物质混合。该过程可以类似于EP743017来完成。

生物柴油：当在相同过程中实现脱胶的时候，本发明的磷脂酶可以与一种或多种脂解酶结合使用，以将脂肪和油转化为脂肪酸烷基酯。例如此种过程被描述于US8,012,724中。

洗涤剂：可在洗涤剂组合物中添加本发明的磷脂酶，并且因此该磷脂酶被用作洗涤剂组合物的组分。

该洗涤剂组合物可以例如配制成手洗或机洗洗衣添加剂组合物，其中包括适用于污染织物的预处理的洗衣添加剂组合物以及加入了漂洗剂的织物软化剂组合物，或配制成用于在一般家用硬表面清洁操作中使用的洗涤剂组合物，或配制成用于手洗或机洗餐具操作的洗涤剂组合物。

烘焙：本发明的磷脂酶可以用来生产面团和来自面团的烘焙产品，连同可以用来生产烘焙组合物和烘焙添加剂。

一般面团包括小麦粗粉或小麦粉和/或其他类型的粉、面粉或淀粉，例如玉米粉、玉米淀粉、黑麦粗粉、黑麦粉、燕麦粉、燕麦粗粉、大豆粉、高粱粗粉、高粱粉、马铃薯粗粉、马铃薯粉或马铃薯淀粉。

该面团可以是鲜的、冷冻的或半烘焙的。

该面团通常是发酵过的面团或将要经历发酵的面团。可以通过不同方式发酵该面团，例如，通过添加化学膨发剂，例如，碳酸氢钠，或通过添加酵素(发酵面团)，但是优选的是通过添加适合的酵母培养物来发酵面团，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(面包酵母)的培养物，例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)的可商购的菌株。

该面团还可以包括其它传统面团成分，例如，蛋白质，例如奶粉、面筋、和大豆；蛋(全蛋，蛋黄或蛋白)；氧化剂例如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二酰胺(ADA)或过硫酸铵；氨基酸例如L-半胱氨酸；糖；盐例如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙。

该面团可以包括脂肪(甘油三酸酯)例如成粒的脂肪或起酥油，但是本发明特别适用于一种面团，其中添加按重量计少于1％的脂肪，并且特别适用于一种没有添加脂肪所制作的面团中。

该面团可以进一步包括一种乳化剂例如单-或二甘油酯、单-或二甘油酯的二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的聚甘油酯、单甘油酯的乳酸酯、单甘油酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、或溶血卵磷脂。

该面团可以用于由面团制备的任何种类的烘焙产品，软的或脆的特性的，白色的、浅色的或深色的类型。实例是面包(特别是白色的，全麦面粉的或黑麦面包)，典型地以面包条或卷的形式，法国长棍类型的面包，皮塔饼、玉米饼、饼、薄煎饼、饼干、薄饼、曲奇饼、派皮、薄脆饼干、馒头、披萨以及类似物。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。

材料与方法

解脂活性(LU)

脂解活性(脂肪酶活性)可用三丁精作为底物进行测定。该方法是基于酶对三丁精的水解作用，并以在水解期间保持pH恒定的碱消耗量作为时间的函数。

一个脂肪酶单位(LU)定义为标准条件下(即，在30℃；pH7.0；以0.1％w/v阿拉伯胶(GumArabic)为乳化剂及0.16M三丁酸甘油酯作为底物)，每分钟释放1微摩尔可滴定的丁酸的酶量。一个KLU是1000LU。

磷脂酶A活性(LEU)

在LEU测定中，磷脂酶A活性是从在pH8.0，40℃下水解卵磷脂的能力中所确定的。水解反应可以继之以用NaOH滴定持续2分钟的反应时间。在WO1998/26057中所披露的来自尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)(LIPOPANF)的磷脂酶具有1540LEU/mg酶蛋白的活性并且可以被用作标准。

平板测定

A)缓冲液是100mMHEPES和100mM柠檬酸盐的混合物，具有从pH3.0至pH7.0所调节的pH。

B)2％琼脂糖(LitexHSA1000)是通过以下制备：在缓冲液(A)中混合并且蒸煮5分钟，随后冷却至大约60℃。

C)底物是L-α磷脂酰胆碱，95％来自在60℃下用UltraTurrax分散于水(MilliQ)中持续1分钟的大豆(Avanti441601)。

D)将LECITASEULTRA的经过纯化的酶溶液和SEQIDNO:2的成熟磷脂酶稀释至0.4mg/ml。

通过将5ml底物(C)和5ml琼脂糖(B)的混合物轻轻地混入具有7cm直径的培养皿中进行铸制板，并且在由真空穿孔具有大约3mm直径的孔洞之前将其冷却至室温。在板由封口膜密封之前将十个微升稀释的酶(D)添加至每个孔中，并且置于培养箱中在55℃下，持续48小时。将板定期取出摄影。

N-末端测序程序

使用应用生物系统公司(AppliedBiosystems)蛋白质序列测定系统进行N-末端测序分析。将样品在预浇铸4％-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶(生命科技公司(LifeTechnologies))上进行纯化。根据制造商的说明，运行该凝胶，并且印记至PVDF膜上(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))。针对N-末端氨基酸测序，将主蛋白带切出并且置于蛋白质序列测定系统的印迹盒中。根据制造商的说明，针对PVDF膜样品(脉冲液体PVDF)使用方法运行文件进行N-末端测序。可以通过将色谱图中的峰的保留时间与标准色谱图中的PTH氨基酸的保留时间进行比较，从对应于氨基酸残基1至7的7张色谱图中推断N-末端氨基酸序列。

酶

酶制剂包括本发明的磷脂酶的经过纯化的酶蛋白(TLPLA)，该酶蛋白是SEQIDNO:2的成熟多肽，例如SEQIDNO:2的氨基酸20至296或28至296。

一种可从诺维信公司(Novozymes)获得的商业制剂LECITASEULTRA。LECITASEULTRA包括一种蛋白质工程化的微生物多肽，该多肽具有甘油三酯脂肪酶和磷脂酶A二者活性。该多肽具有SEQIDNO:5中所示的氨基酸序列。

实例1酶的表征

使用一台VP-毛细管差示扫描量热仪(微量热公司(MicroCalInc.)，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)通过差示扫描热量测定(DSC)测定本发明的磷脂酶的热稳定性。在200K/hr的恒定的程序化加热速率下，加热在缓冲液(50mM乙酸钠在pH4.0或pH5.0下)中的酶溶液(大约0.5mg/ml)后获得的热分析图(Cp对T)中，将热变性温度Td(℃)获取为变性峰(主要的吸热峰)的顶端。

将样品溶液和参考溶液(大约0.2ml)从10℃下的储存条件装载到量热仪中(参考：不具有酶的缓冲液)，并且在20℃下热预平衡20分钟，随后从20℃至100℃进行DSC扫描。按照82℃在pH4.0下和按照81℃在pH5.0下，以大约+/-1℃的精确度测定变性温度。

当在米曲霉(Aspergillusoryzae)中表达时，使用以上所描述的程序，SEQIDNO:2的多肽被识别为具有如下N-末端序列：

35kDa带，具有对应于SEQIDNO:2的残基28-34的N-末端DVSSSVL

25kDa带，具有对应于SEQIDNO:2的残基117-123的N-末端EADLDFP

25kDa带，具有对应于SEQIDNO:2的残基120-126的N-末端LDFPLTD

基于以上所描述的平板鉴定，本发明的磷脂酶在3和5之间的如下pH范围内显示出了活性。针对于比较，LecitaseUltra在pH3和4下显示出了较弱的活性(参见图3)。

实例2：脱胶

由于应用于商业酶法脱胶中的磷脂酶的热稳定性，该过程通常在不超过55℃的温度下进行。然而，本发明的磷脂酶是非常热稳定的，这允许脱胶过程在较高温度下进行。在本实例中，使用本发明的磷脂酶或现有技术磷脂酶LECITASEULTRA，在70℃的温度下，将大豆油进行脱胶。

将该油起初用正磷酸(85％溶液)进行处理，以将不溶性盐转化为更能水合的形式并且获得了适用于酶的pH。将该酸以基于油量的0.05％(100％纯正磷酸)的相等的量来使用。

^*通过从该油中萃取水溶酸，随后进行水相的pH的测量来测定油中的pH。为了改善pH测量的稳定性，通过添加1％w/wKCl来增加水相的离子强度。

将LECITASEULTRA以业内建议的量30mg配制的酶产品/kg油＝30ppm进行给予，并且本发明的磷脂酶以等于34mg酶产品/kg油＝34ppm，67mg酶产品/kg油＝67ppm，224mg酶产品/kg油＝224ppm和537mg酶产品/kg油＝537ppm的量进行给予。

将在500ml蓝色盖子摇瓶中的250g粗大豆油的等分试样在具有以200rpm的磁力搅拌的水浴中加热至70℃。向每个摇瓶中施用87微升的85％的磷酸溶液，并且通过Ultra-Turrax将该混合物在12.000rpm下高剪切混合10sec。此后将该混合物在70℃下并且在200rpm下孵育15min。将酶溶液和MilliQ-水施加至7.5ml的总加水量(3％的油)。通过Ultra-Turrax将该混合物在12.000rpm下高剪切混合10sec，并且在200rpm下，伴随着搅拌在70℃下孵育2小时。在酶反应后，通过微波将产物混合物加热至100℃以上以使酶失活并且促进胶分离。通过以2000g离心5min实现油和湿胶的分离。

在已脱胶油中的游离脂肪酸(FFA)的产率通过滴定来量化。通过ICP-OES测定已脱胶油中的磷的含量。结果示于下表中。

当相比于LecitaseUltra时，在pH～4下，在70℃下，用本发明的磷脂酶获得了最大FFA产率增加和最大磷含量降低。

实例3通过磷脂降低所测量的磷脂酶水解

在低水环境中，在50℃和在70℃下，并且在pH4.0和5.5下，针对于水解磷脂磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、和磷脂酰胆碱(PC)的能力，测定本发明的磷脂酶和LECITASEULTRA的磷脂酶。测试底物从大豆油中生产，该大豆油被掺入磷脂PA、PE、PI和PC。底物包括50mg磷脂/1mL油。在热摇床中，在所希望的温度(50℃和70℃)下，将250微升的样品用本发明的磷脂酶进行孵育2h。将磷脂酶作为10微升的水溶液进行施用，该水溶液包括与100mg/kg油相等的量的经过纯化的酶蛋白。除了酶反应，空白反应也进行孵育，其中，该酶溶液用水的添加来代替。

通过³¹PNMR分析样品。基于NMR分析的原理为在将磷脂转化为溶血磷脂之后磷脂的³¹P化学移位发生了改变。然后通过整合将未转化的磷脂进行量化。数据以残余磷脂相对于空白反应的％呈现。

两种酶对磷脂PA、PE、PI和PC都具有良好的活性。用本发明的磷脂酶实现最大磷含量降低，该磷脂酶在50℃并且在pH5.5下，将磷含量降低至检出限以下。在70℃和pH4.0下，本发明的磷脂酶相对于LECITASEULTRA显示出了令人惊讶的高活性。

Claims (19)

1.一种具有磷脂酶A活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)一种多肽，该多肽与SEQIDNO:2的成熟多肽或SEQIDNO:3的多肽具有至少80％的序列一致性；

(b)一种多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交；

(c)一种多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或与其cDNA序列具有至少65％序列一致性；

(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的或SEQIDNO:3的多肽的一种变体，该变体在在一个或多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；和

(e)(a)、(b)、(c)、或(d)的多肽的一个片段，该片段具有磷脂酶A活性。

2.如权利要求1所述的多肽，其中该成熟多肽对应于SEQIDNO:2的氨基酸28至296或氨基酸117至296。

3.如权利要求1或2所述的多肽，该多肽与SEQIDNO:2的成熟多肽或SEQIDNO:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。

4.如权利要求1至3中任一项所述的多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或与其cDNA序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。

5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，该多肽包括SEQIDNO:2或SEQIDNO:2的成熟多肽、或SEQIDNO:2的氨基酸28至296、或SEQIDNO:2的氨基酸117至296或SEQIDNO:3的多肽，或者由其组成。

6.一种分离的多核苷酸，包括：

(a)一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的成熟多肽或SEQIDNO:2的氨基酸28至296，或SEQIDNO:2的氨基酸117至296或SEQIDNO:3的多肽；

(b)一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中所述多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDNO:2的成熟多肽或与SEQIDNO:3的多肽具有至少80％的一致性；

(c)一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中该核苷酸序列包括SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列；

(d)一种核苷酸序列，该核苷酸序列与根据(a)、(b)、或(c)的核苷酸序列具有至少80％的序列一致性；

(e)一种核苷酸序列，该核苷酸序列在高严格条件下与根据(a)、(b)、(c)、或(d)的核苷酸序列的互补链杂交；

(f)根据(a)、(b)、(c)、(d)、或(e)的核苷酸序列的子序列，具有至少100个核苷酸；

(g)一种序列，该序列由于遗传密码简并性而简并为一种根据在(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、或(f)中任一项所定义的序列；或

(h)根据(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的核苷酸序列的互补链。

7.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求6所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。

8.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求6所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。

9.一种产生如权利要求1-5中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下，培养一种细胞，该细胞在处于其野生型形式下产生该多肽；并且

(b)回收该多肽。

10.一种产生具有磷脂酶A活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下，培养如权利要求8所述的宿主细胞；并且

(b)回收该多肽。

11.一种组合物，包括，

a)如权利要求1-5中任一项所述的多肽或通过如权利要求9或10中任一项所述的方法可获得的一种多肽；和，

b)可任选地一种另外的酶。

12.如权利要求11所述的组合物，其中该另外的酶是一种选自下组的酶，该组由以下各项组成：磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、和磷脂酶C。

13.如权利要求1-5中任一项所述的多肽或如权利要求11或12中任一项所述的组合物在水解磷脂过程中的用途。

14.如权利要求1-5中任一项所述的多肽或如权利要求11或12中任一项所述的组合物在生产烘焙组合物或烘焙添加剂中或在生产面团或来自面团的烘焙产品中的用途。

15.如权利要求1-5中任一项所述的多肽或如权利要求11或12中任一项所述的组合物在降低食用油磷脂含量过程中的用途。

16.一种方法，该方法使用磷脂酶处理来降低食用油中的含磷组分的含量，该方法包括将所述油与如权利要求1-5中任一项所述的多肽的水溶液接触，直至该油的磷含量降低，并且然后将水相与该处理过的油分开。

17.根据权利要求16所述的方法，其中该油选自粗油、经过水脱胶的油和经过酸脱胶的油。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其中该油的温度在60℃和75℃之间。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中该磷脂酶处理是在3.0至5.5之间的pH下进行的。