RU2455360C1 - ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИ Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧНОЕ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, И ИММУНОСОРБЕНТ ДЛЯ СОРБЦИИ ПРОТЕИНА C ЧЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО - Google Patents
ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИ Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧНОЕ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, И ИММУНОСОРБЕНТ ДЛЯ СОРБЦИИ ПРОТЕИНА C ЧЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО Download PDFInfo
- Publication number
- RU2455360C1 RU2455360C1 RU2011105309/10A RU2011105309A RU2455360C1 RU 2455360 C1 RU2455360 C1 RU 2455360C1 RU 2011105309/10 A RU2011105309/10 A RU 2011105309/10A RU 2011105309 A RU2011105309 A RU 2011105309A RU 2455360 C1 RU2455360 C1 RU 2455360C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- human protein
- monoclonal antibody
- antibodies
- spbcg
- Prior art date
Links
- 101500025568 Homo sapiens Saposin-D Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 229940100689 human protein c Drugs 0.000 title claims abstract description 35
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 title claims description 5
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 title description 7
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 6
- 101000658081 Mus musculus U2 small nuclear ribonucleoprotein auxiliary factor 35 kDa subunit-related protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 12
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 61
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 55
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 55
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 55
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 17
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 16
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 6
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 108091005605 Vitamin K-dependent proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 201000005660 Protein C Deficiency Diseases 0.000 description 3
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 3
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 3
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 3
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 3
- 229930194936 Tylosin Natural products 0.000 description 3
- 239000004182 Tylosin Substances 0.000 description 3
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 208000013746 hereditary thrombophilia due to congenital protein C deficiency Diseases 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N tylosin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@H]1N(C)C)O)O[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)CC(=O)O[C@@H]([C@H](/C=C(\C)/C=C/C(=O)[C@H](C)C[C@@H]1CC=O)CO[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](C)O1)OC)CC)[C@H]1C[C@@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N 0.000 description 3
- 229960004059 tylosin Drugs 0.000 description 3
- 235000019375 tylosin Nutrition 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 2
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 2
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 2
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 2
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002826 coolant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 201000005380 purpura fulminans Diseases 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003245 working effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Описан штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/А3 - продуцент моноклонального антитела, специфичного к протеину С человека (к hPROC). Штамм депонирован в Российской коллекции Культур Клеток позвоночных Института Цитологии РАН под номером 733(Д). Описано моноклональное антитело, полученное из штамма, специфичное к hPROC и обладающее конформационно зависимыми свойствами. Оно связывает hPROC в присутствии ионов кальция и не связывает его в присутствии хелатирующих агентов. Предложен иммуносорбент на основе указанного антитела. Изобретение может быть использовано для получения МКА к hPROC и создания на его основе иммуноаффинного сорбента для очистки и концентрирования hPROC. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 5 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и биофармацевтики, а именно к технологии получения моноклональных антител (МКА) методами клеточной гибридизации, точнее к методам получения МКА, специфичных к протеину С человека (hPROC), и создания на основе этих МКА иммуноаффинного сорбента для выделения, очистки и анализа протеина С человека из культуральной жидкости продуцентов рекомбинантного протеина С (rhPC) либо из природных источников (плазмы крови).
Предшествующий уровень техники
Протеин С является витамин К-зависимым белком плазмы крови. Он входит в систему гемостаза и играет исключительно важную роль в регулировании свертывания крови. Протеин С синтезируется в виде неактивной молекулы предшественника, проходит многостадийный пост-трансляционный процессинг в клеточных компартментах и секретируется в виде интактной (зимогенной) формы. Активация белка С происходит в кровотоке при участии тромбомодулин-тромбинового комплекса. Активированный протеин С вместе с кофактором протеином S выполняет антикоагулянтную функцию. Механизм действия активированного протеина С и механизм активации зимогена в активную протеазу изложен в работе Esmon Т. Charles ("Protein-C: biochemistry, physiology, and clinical implications". Blood, 1984, Vol.62 (6), P.1155-8).
Активация протеина С непосредственно осуществляется тромбином, последней сериновой протеазой каскада свертывания крови и опосредована связанным с мембраной эндотелиальных клеток гликопротеином тромбомодулин. Тромбомодулин образует прочный нековалентный комплекс состава 1:1 с тромбином и полностью меняет функциональные свойства тромбина. Свободный тромбин в нормальных условиях активирует тромбоциты, конвертирует фибриноген до фибрина и факторы свертывания крови V и VIII до активных формы Va и VIIIa. В то же время тромбин в комплексе с тромбомодулином теряет все вышеуказанные свойства, но эффективно активирует интактный протеин С при физиологических концентрациях ионов кальция.
Активированный протеин С, в свою очередь, избирательно инактивирует активированные формы факторов свертываемости крови V и VIII, но не их исходные формы. Следует отметить, что основные события при запуске каскада свертывания крови происходят на поверхности клеток и требуют участия мембранно-связанных белков и фосфолипидов, в то время как факторы V и VIII свободно циркулируют в кровотоке и участвуют в петле положительной обратной связи при работе системы свертывания. При их активации тромбином они ускоряют активацию фактора Х и протромбина на 5 порядков и резко ускоряют генерацию тромбина в месте запуска каскада свертывания.
Таким образом, физиологическая роль активированного протеина С может быть описана как ограничение области запуска системы свертывания крови.
Основным кофактором активированного протеина С является протеин S, другой витамин К - зависимый белок плазмы крови. Протеин S более чем в 10 раз усиливает вызываемую активированным протеином С деградацию факторов Va и VIIIa.
Протеин С является важным терапевтическим агентом (ЕР 215549, ЕР 0191606) в качестве специфического антикоагулянта, имеющего потенциально более широкую область применения, чем традиционные антикоагулянты гепарин, варфарин (оксикумарин) или производные последнего. В отличие от традиционных антикоагулянтов активированный или интактный протеин С не воздействуют на систему свертывания крови до момента появления тромбина и не вызывают падения концентрации зимогенных белков системы свертывания. Вследствие этого антикоагулянтная терапия протеином С потенциально является более безопасной, поскольку не вызывает постоянного риска возникновения кровотечений. Экзогенный интактный протеин С также может использоваться для заместительной терапии при наследственном дефиците протеина С, вызывающего смерть в младенческом возрасте при гомозиготном дефиците и частые тромбоэмболические состояния при гетерозиготной форме дефицита.
Основной областью клинического применения активированного протеина С являются опасные для жизни тромботические состояния, в первую очередь синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром), возникающий, в том числе, при развитии острого сепсиса.
Активированный протеин С является маркером сепсиса, а его уровень и дефицит интактного протеина С коррелируют с тяжестью течения заболевания. Так, дефицит протеина С наблюдается более чем у 85% больных с тяжелым сепсисом. Также дефицит протеина С коррелирует с неблагоприятными клиническими исходами, такими как септический шок (тяжелый сепсис, сопровождающийся развитием артериальной гипотонии), ДВС-синдромом и полиогранной недостаточностью.
Поскольку концентрация протеина С в плазме крови довольно мала и его отделение от других витамин К-зависимых белков системы гемостаза представляется весьма затруднительным, наилучшим способом получения активированного протеина С для медицинского применения является биосинтез, активация и очистка рекомбинантного белка. Наличие у протеина С так называемого Gla-домена, то есть кластера близкорасположенных остатков гамма-карбоксилированной глютаминовой кислоты необходимо для проявления антикоагуляционных свойств белка. Это обусловлено конформационными изменениями, которые претерпевает Gla-домен при связывании ионов кальция, что в свою очередь делает возможным превращение зимогенной формы протеина С в активную сериновую протеазу (Church W.L. et al. Discrimination of normal and abnormal prothrombin and protein С in plasma using a calcium ion-inhibited monoclonal antibody to a common epitope on several vitamin K-dependent proteins. Blood, 1989, Vol.74 (7), P.2418-25). Такие конформационные изменения, механизм которых известен и технически контролируем, могут быть положены в основу технологических решений для выделения протеина С и его активации.
Одним из важных подходов определения, очистки и концентрирования природного протеина С и его рекомбинантных вариантов в биомедицинских приложениях является использование конформационно-специфических МКА, продуцируемых гибридомами.
Известно применение моноклональных антител к протеину С, описанное в патенте компании Baxter AG (Us. Pat. №5549893; Johann Eibi et al;" Use of protein С in the treatment of purpura fulminans"; 1995) защищающего терапевтическое применение активированного и неактивированного протеина С природного происхождения.
Применение конформационно-зависимых антител для очистки и активации протеина С является объектом защиты в патенте компании Elli Lily & Со. (Us. Pat. №4981952; Betty Yan S.; "Method for the purification of vitamin K-dependent proteins" 1989). Техническое решение основано на серии последовательных раундов хроматографии с аффинным сорбентом на основе МКА, связывание которых с протеином С блокируется ионами кальция. Поскольку многие внеклеточные протеазы более активны в присутствии ионов кальция, наиболее предпочтительным решением являлось бы использование МКА, связывающих протеин С в присутствии ионов кальция, и не связывающих в присутствии хелатирующих агентов, т.е. при полном отсутствии ионов кальция в растворе. При проведении аффинной хроматографии с такими иммобилизованными МКА активность остаточных контаминирующих протеаз в растворе элюированного протеина С была бы минимальной и в меньшей степени приводила бы к распаду протеина С и его преждевременной активации. Известно применение конформационно-зависимых антител для анализа биологической активности и разделения модифицированных форм протеина С. Для таких целей могут быть использованы хелатор-зависимые антитела (Church W.L. et al. Discrimination of normal and abnormal prothrombin and protein С in plasma using a calcium ion-inhibited monoclonal antibody to a common epitope on several vitamin K-dependent proteins. Blood, 1989, Vol.74 (7), P.2418-25; Vincenot A. et al. Amino acids 225-235** of the protein С serine-protease domain are important for the interaction with the thrombin-thrombomodulin complex. FEBS Letters, 1995, Vol.367 (2), P.153-7) и кальций-зависимые антитела (Ohsawa k. et al. Purification of sufficiently gamma-carboxylated recombinant protein С and its derivatives. Calcium-dependent affinity shift in immunoaffinity and ion-exchange chromatography. J. Chromatography, 1992, Vol.597 (1-2), P.285-91; Stearns D.J, et al. The interaction of a Ca2+-dependent monoclonal antibody with the protein С activation peptide region. Evidence for obligatory Ca2+ binding to both antigen and antibody. J. Biol. Chem. 1988, Vol.263 (2), P.826-32; Nakamura S., Sakata Y. Immunoaffinity purification of protein С by using conformation-specific monoclonal antibodies to protein C-calcium ion complex. Biochim Biophys Acta. Biochim. Biophys. Acta. 1987, Vol.925 (2), P.85-93; Wakabayashi K. Conformation-specific monoclonal antibodies to the calcium-induced structure of protein C. J. Biol. Chem. 1986, Vol.261 (24), P.11097-105). Предположительно, все вышеуказанные антитела связываются с протеином С в области Gla-домена, при этом узнаваемый ими эпитоп либо включает координированный ион кальция, либо маскируется таким координированным ионом.
Существует широкий спектр возможностей для дальнейшего усовершенствования существующих промышленных решений по очистке протеина С человека и его рекомбинантных вариантов. Возможность такой оптимизации обусловлена тем, что при отборе клонов гибридом, продуцирующих МКА, обладающих конформационно зависимыми свойствами можно комбинировать различные факторы, влияющие на конформацию целевого антигена. Среди таких факторов можно назвать использование хелатирующих и хаотропных агентов, буферных растворов для элюции антител с разной ионной силой и введение в раствор для связывания антител и антигена различных двухвалентных ионов металлов, с последующим масштабированием оптимальной методики до уровня промышленной хроматографии (Tharakan J.P. Effect of feed flow-rate, antigen concentration and antibody density on immunoaffinity purification of coagulation factor IX. J. Chromatography, 1990, Vol.522, P.153-62; Verlander W.H. et al. Technological challenges for large scale purification of protein C. Protein С and related anticoagulants. Ed. by Bruley D.F. and Drohan W.N., 1990, Vol.11, P.11-27). Кроме того, каждая белковая структура несет на своей поверхности определенное количество эпитопов, в том числе ассоциированных со структурными доменами. Как правило, чем выше молекулярный вес белка, тем больше эпитопов. Они имеют разную иммуногенность и в случае семейства витамин К-зависимых белков моноклональные антитела могут быть использованы не только для очистки целевого белка, но и для активации его зимогенной формы. Поэтому, чем больше панель гибридом, продуцирующих антитела к конформационно-лабильными эпитопам, тем больше инструментов для очистки изоформ целевого белка, исследования и модификации его свойств. Следовательно, получение новых гибридом всегда актуально.
Подробное описание настоящего изобретения
Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание метода получения конформационно-зависимых высокоаффинных антител к протеину С человека, применимых для биофармацевтического производства, а именно для аффинной очистки рекомбинантного протеина С человека (rhPROC).
Технический результат достигался путем создания нового штамма гибридных культивируемых клеток Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3, секретирующих моноклональные антитела к протеину С человека и создания на их основе иммуносорбента для очистки рекомбинантного протеина С человека. Полученный штамм депонирован в Российской Коллекции Культур Клеток позвоночных Института Цитологии РАН за номером 733 (Д) от 16.03.2010.
Основным методическим подходом к созданию штаммов клеточных линий, продуцирующих моноклональные антитела, является клонирование гибридом. Гибридомы получают слиянием несекретирующих клеток миеломы и антител-продуцирующих В-лимфоцитов в присутствии полиэтиленгликоля. Клетки миеломы дефицитны по гипоксантин-гуанин фосфорибозил трансферазе (HGPRT) или тимидинкиназе (ТК). Таким образом, они не могут выжить при культивации в среде, содержащей добавку HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). В то же время любые не слитые В-лимфоциты селезенки сам по себе не стабильны в культуре более трех дней.
Таким образом, гибридные клетки В-лимфоцитов и миеломы, содержащие генетическую информацию обоих родительских клеток, должны обладать стабильностью в селективной среде, содержащей HAT. Они могут культивироваться продолжительное время и продуцировать потенциально неограниченное количество антител.
Супернатанты культуры гибридом анализируют на наличие целевых антител методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). Затем отобранные гибридомы клонируют для того, чтобы получить субклоны, продуцирующие моноклональные конформационно-зависимые антитела. Для этого в метод ИФА вносятся изменения, благодаря которым имитируются элюирующие условия хроматографической очистки, изменяющие аффинность антител в зависимости от конформации антигена (Pepper S.D. Selection antibodies for immunoaffinity chromatography // Methods in molecular biology ed. by Kenney A. and Fowell S., 1992, Vol.11, P.136-171). Отобранный продуцент моноклонального антитела может быть масштабирован in vivo в виде асцита мыши или in vitro в суспензионной культуре (Kohler J., Milstein С.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975, Vol.256 (5517), P.495-7).
Термин «моноклональное антитело» означает антитело, искусственно получаемое из клеточного клона и поэтому содержащее только один тип иммуноглобулина.
Антитело, специфичное к белку "протеин С человека", означает молекулу, которая селективно, избирательно связывается с протеином С человека и образует стабильный комплекс. Стабильным комплексом является комплекс, в котором связывание между партнерами происходит на период времени, достаточный для того, чтобы произвести детектирование указанного комплекса. Термин "селективно связывается с протеином С человека" означает способность указанной молекулы предпочтительно связываться с протеином С человека в отличие от связывания с белками, не имеющими отношения к протеину С человека или связывания с небелковыми компонентами, присутствующими в образце. Антителом, которое предпочтительно связывается с протеином С человека, является антитело, которое связывается с протеином С человека, но не связывается в существенной степени с другими молекулами или компонентами, которые могут присутствовать в образце. Существенное связывание предполагает, например, связывание антитела, связывающегося с протеином С человека, с молекулой, не являющейся протеином С человека, с аффиностью или силой, достаточной для того, чтобы помешать способности антитела, связывающегося с протеином С человека.
Способность антитела к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методами ELISA и равновесного диализа. Методы определения аффинности и силы связывания хорошо известны специалисту в данной области техники и подробно описаны, например, Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).
Методика иммунизации. Штамм гибридомы получают путем иммунизации мышей линии Balb/c рекомбинантным активированным протеином С человека в течение 49 суток. На третьи сутки после последней бустер-инъекции проводят гибридизацию спленоцитов иммунизированных мышей (1,2×10 клеток) с клетками мышиной миеломы Sp2/0-Ag14 (3×107 клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль с молекулярным весом 1450 (Sigma, Германия). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.
Морфологическая характеристика гибридомы Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3
Культура гибридных клеток состоит из слабо прикрепленных к подложке округлых клеток с размером с исходную миеломную клетку.
Культуральные свойства. Культивирование штамма гибридомы Sp2/0Agl4-SpBcG/APC-15/A3 ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 8 мкг/мл тилозина. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в вентилируемых пластиковых флаконах с адгезионной поверхностью площадью 25 см2 и рабочим объемом среды 5-10 мл. Пассирование клеток гибридомы проводят 3 раза в неделю с кратностью разведения 1:4-1:6. Посевная концентрация клеток составляет 3×105 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 1,2×10 на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 12 последовательных пассажах in vitro.
Культивирование гибридомы в организме животного. Вид животного - инбредные мыши линии BALB/c. Доза клеток при прививке составляет 2×106 клеток/0,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора на одну мышь при первичном введении. За 1 сутки до введения клеток гибридомы мышам внутрибрюшинно вводят 1 мл неполного адъюванта Фрейнда. Иммуноасцитическая жидкость образуется на 12-16 сутки в объеме 3-5 мл. Количественное определение иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой, производят методом непрямого иммуно ферментного анализа (ИФА).
Характеристика полезного продукта. Гибридома Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 продуцирует специфичные моноклональные антитела к протеину С человека, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:90000, в иммуноасцитической жидкости (ИАЖ) 1:200 000. Моноклональные антитела из КЖ и ИАЖ выделяют с помощью осаждения сульфатом аммония с последующей аффинной хроматографией на белок А или G сефарозе. Гомогенность выделенных антител проверяется с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Принадлежность к классу иммуноглобулинов G определяется по иммуноферментному анализу класс-специфическими антивидовыми антителами.
Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл при времени культивирования 72 ч и посевной концентрации гибридомы 0,3 млн кл/мл; в асцитической жидкости - 1-4 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 12 последовательных пассажей и воспроизводится при прививании в виде асцитных опухолей на мышах.
Контаминация штамма. Контаминанты гибридной линии, включая бактерии и грибы, методом прямого посева на питательные среды LB и Сабуро-Эммонса не обнаружены; микоплазма по ПЦР и флуоресцентному анализу не обнаружена; вирусы - нет данных.
Криоконсервация производится аликвотами ресуспендированных клеток по 3×106 кл./мл. Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды, содержащей эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%. Режим криоконсервации и отогрева. Гибридные клетки вносят в криоампулы, помещают в контейнер с теплоносителем изопенталом и помещают в низкотемпературный холодильник для охлаждения со скоростью 1°С/мин до достижения температуры - 70°С и затем поиещают в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре +37°С. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 80-90%.
Иммуносорбент. Для получения иммуносорбента в качестве носителя используют твердофазные носители, в том числе различные гранулированные сорбенты, например агарозу, содержащую ковалентно связанные с ней лиганды. Для иммобилизации очищенного МКА Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 использовали сорбент с амино-реактивными привитыми группами N-гидроксисукцинимида NHS-activated Sepharose 4 FF (GE LifeSciences, США). Показана возможность использования заявляемых МКА в качестве лиганда для получения иммуносорбента для сорбции протеина С.
Полезным продуктом является гибридома и продуцируемые ей моноклональные антитела, относящиеся к классу IgG иммуноглобулинов мыши, специфичные к протеину С человека, а также иммуносорбент для сорбции протеина С человека. Особенности полученных моноклональных антител (МКА) и результаты их практического применения изобретения приведены на следующих фигурах.
Краткое описание рисунков
На Фигуре 1 показан критерий отбора поликлональных пулов гибридом, соотношение с верхним 5% процентилем. Ось Х - оптическая плотность OD при длине волны λ=450 нм, ось Y - количество колоний с активностью в интервале d=0.010D. Заполненный точками столбик - верхний 5% процентиль (n=17), заштрихованный столбик - критерий отбора по уровню сигнала (OD450>0.1, n=48).
На Фигуре 2 показано определение rhPC твердофазном ИФАс использованием МКА гибридомы Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3.
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение примеры.
Пример 1. Получение гибридомы
Иммунизация
Мышей линии BALB/c возраста 8-10 недель в количестве 8 штук иммунизируют рекомбинантным активированным протеином С человека (rhPC, лекарственное средство дротрекогин альфа) по схеме:
- внутрибрюшинное введение мышам 200 мкг rhPC в полном адъюванте Фрейнда;
- через 21 сутки повторное введение мышам 500 мкг rhPC в неполном адъюванте Фрейнда;
- через 35 суток внутривенная инъекция мышам 500 мкг rhPC в неполном адъюванте Фрейнда;
- через 42 суток отбор образцов крови из орбитального синуса, определение животных с наилучшим титром антител к протеину С в сыворотке по ИФА;
- выбранным животным еще через 7 суток производится бустерная внутривенная инъекция 200 мкг rhPC в физиологическом растворе;
- через 7 суток содержания бустированных мышей производится повторный отбор образцов крови из орбитального синуса на ИФА. Производится финальное бустирование животного с максимальным титром антител к rhPC: внутривенная инъекция 200 мкг rhPC в физиологическом растворе.
Гибридизация.
Через 3 суток после последней внутривенной инъекции извлекают селезенку мыши и проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1.2×10 клеток) с клетками мышиной миеломы Sp2/0-Agl4 (3×107 клеток) в присутствии 1 мл 50% раствора полиэтиленгликоля (Sigma, США) с молекулярным весом 1450 в течение 1 минуты. Затем в течение 15 минут последовательными двойными разведениями доводят объем до 16 мл, добавляя по каплям безсывороточную среду RPMI-1640. Разведенную гибридизационную суспензию инкубируют 1 час при 37°С в 150 мл полной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
Селекция.
После инкубации клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной в среде с добавкой HAT (10 мМ гипоксантина, 40 мкМ аминоптерина, 1,6 мМ тимидина). Через 14 суток из среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде A-DMEM/F-12 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 8 мкг/мл тилозина.
Оценка продуктивности первичных пулов.
Для отбора положительных первичных пулов, продуцирующих МКА, используют твердофазный ИФА.
Для проведения ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 100 нг rhPC, разведенного в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР; состав - 1,7 мМ КН2РО4, 5,2 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl, pH 7,4) в объеме 100 мкл и затем выдерживают при температуре 6°С в течение 16 ч. Лунки планшета трижды отмывают ФБР, дополнительно содержащим 0,05% Твин-20 (ФБР-Тв). Вносят в лунки по 300 мкл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в ФБР (1% БСА) и инкубируют при температуре 37°С в течение 60 мин. Три раза промывают лунки ФБР-Тв и вносят супернатант культуральной жидкости в объеме 100 мкл, при необходимости делая разведения в 1% БСА. Планшет инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды промывают раствором ФБР-Тв и добавляют по 100 мкл раствора конъюгата антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена (Sigma, США) в рабочем разведении 1/3500. Планшет инкубируют при температуре 37°С в течение 60 минут, затем 5 раз промывают лунки раствором ФБР-Тв. Положительную реакцию оценивают по развитию голубого окрашивания при добавлении хромогенного раствора субстрата ТМБ (состав - 4 мкл 30% Н2О2, 4 мг 3,3',5,5-тетраметилбензидина на 100 мл 0,1 М натрий нитратного буфера pH 5,0). Реакцию останавливают добавлением в лунки по 100 мкл 5% Н3РO4. Измеряют оптическую плотность OD при длине волны λ=450 нм. Строят калибровочный график OD450=f(lnC) в диапазоне линейной чувствительности, и определяют титр антител. Для определения зависимости связывания антител от присутствия ионов кальция проводят два параллельных определения титра, используя вместо ФБР растворы 2 мМ СаСl2 в буферизованном растворе Трис (ТБР; состав - 20 мМ Трис - НСl; 150 мМ NaCl, рН 7,5) и 2 мМ ЭДТА-Na в буферизованном растворе ТБР.
Слияние выделенной первичной культуры спленоцитов выбранного животного с максимальным титром антител к протеину С и клеток миеломы Sp2/0-Ag14 было произведено через 3 дня после последней бустерной инъекции. Последующее культивирование гибридом в течение 8 дней на среде HAT привело к образованию 350 отдельных лунок, содержащих пулы иммортализованных клеток.
По результатам прямого ИФА супернатантов полученных пулов гибридом часть результатов которого представлена на фигуре 1, было получено обычное бимодальное распределение титра антител. Максимальный сигнал в ИФА составил OD450=3,304, 6 образцов имели сигнал OD450>2,0, верхний 5% процентиль покрывает диапазон активности OD450=3,304-0,150. Для масштабирования было отобрано 48 колоний (лунок) с сигналом ИФА ОD450>0.100.
Отобранные для масштабирования 48 поликлональных пулов в течение следующих 10 дней были масштабированы до культивационного объема 5 мл. Масштабированные до объема 5 мл культуры были оттестированы на секрецию кальций-зависимых антител в двух последовательных ИФА с интервалом между отбором супернатантов 48 часов. Результаты представлены в Таблице 1.
Для дальнейшего клонирования были отобраны 4 масштабированные лунки с максимальным сигналом на ИФА. При этом во всех четырех лунках наблюдалось присутствие смеси кальций-зависимых и кальций-независимых антител - сигнал при проведении ИФА в присутствии ЭДТА уменьшался на 12-61%. Это указывает на наличие в пулах клеток существенной доли гибридом, продуцирующих кальций-зависимые антитела и существенно меньшей доли (или полного отсутствия) гибридом, продуцирующих антитела, блокирующиеся ионами кальциями.
Пример 2. Клонирование и селекция гибридом, секретирующих кальций-зависимые моноклональные антитела
Клонирование
Клонирование гибридных клеток проводят методом серийных разведений по обоим осям 96-луночных планшетов на слое перитонеальных макрофагов в количестве около 1×104 клеток на лунку. Расчетное разведение гибридом - 1 клонобразующая клетка на лунку в длинных диагоналях планшетов достигается при посевной дозе 8 тыс. клеток в 200 мкл в стартовой лунке. Культивирование клонов гибридомы ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 8 мкг/мл тилозина. Клоны гибридомы криоконсервируют на среде замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%. Криодепонированные клоны гибридомы хранят в жидком азоте.
Скрининг клонов.
Выбранные по методике, описанной в примере 1, клеточные пулы с максимальной активностью были клонированы в предельных разведениях в пяти 96-луночных планшетов каждый. Через 8 дней было обнаружено 23 лунки, содержащие одиночные круглые колонии клеток. Колонии были пересажены в лунки 24-луночного планшета в культивационном объеме 1 мл.
Через 15 дней после начала клонирования при прямом ИФА тестировании супернатантов было обнаружено 2 клона, секретирующих кальций-зависимые антитела к протеину С человека (сигнал при ИФА с 2 мМ Са2+ OD450=2,41 и OD450=1,7; отношение сигнала при ИФА с 2 мМ EDTA к сигналу в ИФА с 2 мМ Са2+ 2,2% и 19,2%), а также 2 клона, продуцирующих либо смесь антител, либо антитела с частичной кальций-зависимостью (сигнал в ИФА с 2 мМ Са2+ OD450=0,58 и OD450=0,41; отношение сигнала 27,6% и 27%). Данные иммуноферментного анализа клонов приведены в таблице 2.
Отобранные моноклоны были масштабированы до объема 5 мл, криодепонированны и повторно клонированы для разделения возможных олигоклональных колоний методом серийных разведениий в пять 96-луночных планшетов каждый.
Через 8 дней после второго клонирования было обнаружено суммарно 12 лунок с единичными округлыми колониями, содержащими моноклоны второго поколения. Моноклоны были масштабированы до культиационного объема 10 мл, при этом 7 клонов из 12 сохранили жизнеспособность.
Через 24 дня после второго клонирования было проведено прямое ИФА тестирование. Был обнаружен 1 клон второй генерации, продуцирующий с высоким титром кальций-зависимые антитела (сигнал OD450=1.739; отношение сигналов 4,9%). Остальные жизнеспособные клоны секретировали кальций-независимые антитела к протеину С человека (сигнал OD450=2,165-1,571, отношение сигналов>88%). Данные иммуноферментного анализа представлены в таблице 3.
Масштабированные клоны гибридом второй генерации были криодепонированы, выживаемость после разморозки составила не менее 60%.
Пример 3. Чувствительность отобранных МКА в твердофазном иммуноферментном анализе.
Для проведения твердофазного ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 100 мкл раствора рекомбинантного протеина С в ФБР с содержанием протеина С от 128 нг до 0,5 нг на лунку. Раствор инкубируют в лунках при температуре 4°С в течение 16 часов. Последующие стадии анализа проводят аналогично стадиям, описанным для скрининга гибридных клонов. Моноклональные антитела вносят в лунки в концентрации 100 нг/мл. Отрицательный контроль - сыворотка интактной мыши в разведении 1/1000.
В непрямом твердофазном ИФА моноклональные антитела гибридомы Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/А3 специфически взаимодействуют с протеином С и определяют до 16 нг белка в анализируемом образце (фигура 2).
Пример 4. Подтверждение специфичности целевых МКА иммуноблотингом протеина С человека.
Для проверки специфичности МКА гибридомы Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 к протеину С человека проводят электрофорез по Лэммли в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в течение 2 часов при 180 В, 20 мА в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Источником антигена является 300-кратный концентрат бессывороточной культуральной среды, кондиционированной в течение 4 суток на клеточной линии DG-CID-PROC-1- продуценте протеина С человека, положительный контроль - очищенный активированный протеин С, отрицательный контроль - 300-кратный концентрат бессывороточной культуральной среды кондиционированной клеточной линией СНО DG 44 (родительской для линии DG-CID-PROC-1, не содержащей трансгенов). Образцы кондиционированной среды наносят в количестве 10 мкг общего белка на дорожку, положительный контроль - 100 нг белка на дорожку. Каждый из образцов наносят в две дорожки, на правой и на левой половинах геля, в центральную дорожку наносят предокрашенный маркер молекулярных масс. После окончания электрофоретического разделения белки переносят из ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Extra (GE LifeSciences, США) в течение 2 часов при силе тока 70 мА при помощи аппарата для полусухого переноса. После завершения переноса мембрану блокируют в 1% растворе БСА в трис-буферизованном растворе (ТБР, состав: 20 мМ трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl) в течение 1 ч при комнатной температуре. Для промывок мембран и разведения растворов антител используют ТБР, дополнительно содержащий 0,5% Твин 20 (ТБР-Тв). Разрезают мембрану на 2 половины посередине центральной дорожки, содержащей полосы белков из предокрашенного маркера. Каждую половину инкубируют течение 1 часа при температуре 37°С в растворе МКА гибридомы Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 с концентрацией 1 мкг/мл или в растворе поликлональных антител Н00005624-В01 (AbNova, Германия) в рекомендуемом производителем антител разведении. После трехкратной промывки раствором ТБР-Тв мембраны объединяют и инкубируют с раствором антивидовых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma, США), разведение 1/5000. После этого мембраны 5 раз промывают раствором ТБР-Тв и наносят раствор люминисцентного субстрата (2,5 мМ кумаровой кислоты, 1,2% диметилсульфоксида, 1,25 мМ люминола, 0,1М Трис - НСl, рН 8.5), заворачивают в полиэтиленовую пленку и делают отпечатки на фотопленке для рентгенографии с выдержками в диапазоне от 1 до 20 минут.
Было установлено, что МКА, продуцируемые гибридомой Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/А3 дают одну полосу взаимодействия с очищенным активированным протеином С, одну полосу взаимодействия с интактным рекомбинантным протеином С в составе кондиционированной культуральной среды и не дают полос взаимодействия с белками контрольной кондиционированной культуральной смеси. Положение и относительная яркость полос сходны для исследуемых МКА и контрольных поликлональных антител к протеину С.
Моноклональные антитела штамма гибридомы Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 специфичны к протеину С человека.
Пример 5. Получение иммуносорбента на основе МКА 15/А3 и определение его основных свойств
Для исследуемого МКА Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 проводили отделение глобулиновой фракции, аффинную хроматографическую очистку при помощи протеин G-сефарозы и обессоливание диализом. Для этого культуральную жидкость (72 ч культивирования) смешивали с насыщенным раствором сульфата аммония до 50% насыщения. Суспензию перемешивали и выдерживали 2 ч при температуре 4°С, а затем центрифугировали при 14500 м-1 в течение 20 мин. Удаляли супернатант, осадок растворяли в ФБР, 1/8 начального объема, отделяли осадок денатурированных белков повторным центрифугированием. Полученный супернатант повторно осаждали сульфатом аммония при насыщении 50%, осаждение-растворение повторяли дважды.
Хроматографическую очистку проводили при помощи колонки объемом 1 мл HiTrap Protein G (GE LifeSciences, США) по протоколу производителя. Для удаления аминосодержащих соединений нейтрализованный Трис-основанием элюат с колонки концентрировали при помощи ультрафильтрации в центрифужных пробирках Vivaspin 10 кДа (Сарториус Стедим, Германия) до объема 750 мкл, концентрат диализовали против ФБР на мембране с отсечением по седиментационной массе 7000 Да в течение 24 ч при температуре 4°С. Был получен препарат очищенного МКА с концентрацией белка в растворе 310 мкг/мл, объем образца 750 мкл. Степень концентрирования относительно исходной среды составила 400х.
Для иммобилизации очищенного МКА Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 использовали сорбент с амино-реактивными привитыми группами N-гидроксисукцинимида NHS-activated Sepharose 4 FF (GE LifeSciences, США), процедуру иммобилизации проводили по протоколу производителя сорбента, используя соотношение 200 мкг белка на 1 мл сорбента. Доля иммобилизованных антител после инкубации раствора антител с сорбентом в течение 4 ч при комнатной температуре составила более 90% по данным измерения концентрации белка в растворе. Сорбент упаковывали в хроматографическую колонку объемом 1 мл и проводили инактивацию остаточных N-гидроксисукцинимидных групп пропусканием раствора 0,1 М Трис-НСl рН 8,0 в течение 10 мин. Проводили элюцию нековалентно адсорбированных антител последовательными промывками растворами 0,1 М ацетата натрия, 0,5 M NaCl, pH 4 и 0,1 М этаноламина, рН 8,5. Колонку промывали 20% этанолом до полного удаления солей и хранили при температуре +4°С.
Для определения рабочих свойств полученного иммуносорбента проводили адсорбцию рекомбинантного протеина С из нефракционированной кондиционированной среды и последующую элюцию. Для этого к 10 мл кондиционированной культуральной среды, содержащей около 2 мкг/мл рекомбинантного протеина С по данным ИФА, добавляли СаСl2 до конечной концентрации 20 мМ. Колонку с иммуносорбентом уравновешивали раствором 20 мМ Трис-НСl рН 7,5, 150 мМ NaCl, 20 мМ CaCl2. Наносили на колонку 10 мл подготовленной среды на скорости 0,1 мл/мин (время контакта - 10 мин), фракцию проскока собирали. Концентрация протеина С в проскоке составила менее 0,1 мкг/мл по данным ИФА. После нанесения образца колонку промывали 20 мл раствора 20 мМ Трис-НСl рН 7,5, 1 М NaCl, 20 мМ CaCl2 на скорости 1 мл/мин и проводили элюцию протеина С раствором 20 мМ Трис-НСl рН 7,5, 20 мМ Na-ЭДТА, 0,1% Твин-80. Было собрано 2,2 мл раствора элюированного белка, содержащего суммарно 12 мкг протеина С по данным ИФА. Таким образом, емкость полученного сорбента составила не менее 50 мкг целевого белка на 1 мг иммобилизованных антител, при этом чистота целевого белка после элюции составляла более 90% по данным денситометрии ДСН-ПААГ, при исходной доле целевого белка менее 2% от общего белка, измеренного по Брэдфорд.
Эти свойства клонального штамма Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3, а также взаимодействие его МКА с протеином С человека свидетельствует о возможности использования заявляемых МКА в качестве лиганда для получения иммуносорбента.
Claims (3)
1. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину С человека, связывающих антиген в присутствии ионов кальция и не связывающих в присутствии хелатирующих агентов, депонированный в Российской Коллекции Культур Клеток позвоночных Института Цитологии РАН, регистрационный номер №733 (Д).
2. Моноклональное антитело, специфичное к протеину С человека, связывающее антиген в присутствии ионов кальция и не связывающее его в присутствии хелатирующих агентов, полученное путем культивирования в питательной среде штамма по п.1 и выделения его из культуральной жидкости.
3. Иммуносорбент для сорбции протеина С человека, содержащий ковалентно связанное с ним моноклональное антитело по п.2.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011105309/10A RU2455360C1 (ru) | 2011-02-15 | 2011-02-15 | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИ Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧНОЕ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, И ИММУНОСОРБЕНТ ДЛЯ СОРБЦИИ ПРОТЕИНА C ЧЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011105309/10A RU2455360C1 (ru) | 2011-02-15 | 2011-02-15 | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИ Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧНОЕ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, И ИММУНОСОРБЕНТ ДЛЯ СОРБЦИИ ПРОТЕИНА C ЧЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2455360C1 true RU2455360C1 (ru) | 2012-07-10 |
Family
ID=46848554
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011105309/10A RU2455360C1 (ru) | 2011-02-15 | 2011-02-15 | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИ Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧНОЕ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, И ИММУНОСОРБЕНТ ДЛЯ СОРБЦИИ ПРОТЕИНА C ЧЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2455360C1 (ru) |
-
2011
- 2011-02-15 RU RU2011105309/10A patent/RU2455360C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WAKABAYASHI et al. "Conformation-specific monoclonal antibodies to the Calcium-induced structure of protein C", The Journal of biological chemistry, 1986, vol.261, nо.24, с.11097-1105. Протеин С (АМАХ ACCUCOLOR Protein С), номер по каталогу: CRS 101 А, АМАХ ACCUCOLOR Protein С, "TRINITY BIOTECH", Перевод на русский язык ЗАО "Аналитика", М., 2006, [Найдено 05.12.2011 г.], Найдено из Интepнeтa: www.analytica.ru/instructions/koagulology/…/CRS101A-protein-C.pdf. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5288612A (en) | Assay methods for detecting serum proteases, particularly activated protein C | |
| US4696895A (en) | Monoclonal anti-protein C antibody, its preparation and use thereof | |
| JP5903381B2 (ja) | 抗ｆｄｐモノクローナル抗体、それを用いたｆｄｐ測定用試薬及び試薬キット、並びにｆｄｐ測定方法 | |
| JP2559537B2 (ja) | プロテインｃに対するモノクローナル抗体 | |
| JPH0636741B2 (ja) | ヒト・プロテインｃの分離方法 | |
| JP5984670B2 (ja) | Ｆｄｐ測定用試薬及び試薬キット、並びに測定方法 | |
| EP0162078A1 (en) | Method for isolating a protein from a mixture containing said protein and a conformation specific antibody useful therein. | |
| JPH0753758B2 (ja) | ヒト結腸線維芽細胞由来組織プラスミノ−ゲン活性化因子に対するモノクロ−ナル抗体及びその用途 | |
| RU2455360C1 (ru) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЫШИ Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧНОЕ К ПРОТЕИНУ C ЧЕЛОВЕКА, И ИММУНОСОРБЕНТ ДЛЯ СОРБЦИИ ПРОТЕИНА C ЧЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО | |
| JPS63500564A (ja) | モノクロ−ナル抗体 | |
| US20190161756A1 (en) | Anti-Immunoglobulin G Aptamers and Uses Thereof | |
| NO171169B (no) | Monoklonale antistoffer eller fragmenter derav, spesifikke for alfa2-plasmininhibitor | |
| KR100207351B1 (ko) | 항 인체 플라스민-알파2-플라스민 억제물질 복합체 항체, 하이브리도마 및 면역학적 측정방법 | |
| EP0287028B1 (en) | Method of separating activated human protein c | |
| RU2445365C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, специфичных к протеину с человека (варианты) | |
| CN107118277B (zh) | 一种单克隆抗体 | |
| FI86255C (fi) | Monoklonal antiurokinase-antikropp, den innehaollande matris och biokemiska testpackningar, i vilka den anvaendes. | |
| US5688919A (en) | Process for the purification of factor XIII, monoclonal antibodies against factor XIIIA, the preparation and use thereof | |
| KR100583537B1 (ko) | 활성화된 응고 인자 ｖｉｉ에 특이적인 모노클로날 항체 및 이의 용도 | |
| US6258938B1 (en) | Method for the purification and isolation of blood clotting proteins using conformation specific antibodies | |
| RU2584582C1 (ru) | Моноклональное антитело сс3-4 к конформационному эпитопу с3 человека, штамм гибридной днк мыши рккк(п)764д - продуцент моноклонального антитела сс3-4 | |
| RU2429008C1 (ru) | СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIIа ЧЕЛОВЕКА | |
| SU1514769A1 (ru) | ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ: КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ΜΙΙ5 МиЗОТ ПК-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОМУ АКТИВАТОРУ ПЛАЗМИНОГЕНА УРОКИНАЗНО | |
| JPH0235099A (ja) | プラスミノーゲンアクティベーターインヒビターに対するモノクローナル抗体 | |
| JPS61181964A (ja) | 人正常細胞由来の組織型プラスミノーゲンアクチベーターに対するモノクロナル抗体を用いる免疫学的測定試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20120723 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140216 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20150310 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170216 |