RU2455360C1

RU2455360C1 - CULTIVATED HYBRID CELL STRAIN OF MOUSE Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO HUMAN PROTEIN C, MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC TO HUMAN PROTEIN C AND IMMUNOSORBENT FOR HUMAN PROTEIN C SORPTION CONTAINING MONOCLONAL ANTIBODY

Info

Publication number: RU2455360C1
Application number: RU2011105309/10A
Authority: RU
Inventors: Сергей Владимирович Ковнир (RU); Сергей Владимирович Ковнир; Надежда Александровна Орлова (RU); Надежда Александровна Орлова; Иван Иванович Воробьев (RU); Иван Иванович Воробьев
Priority date: 2011-02-15
Filing date: 2011-02-15
Publication date: 2012-07-10

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: what is described is a hybrid cultured cell strain of the animals Mus museums Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 that is a produced of a monoclonal antibody specific to human protein C (to hPROC). The strain is deposited in the Russian Collection of Vertebrata Cell Culture of the Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences, No. 733(D). What is described is a monoclonal antibody prepared of the strain, specific to hPROC and showing the conformational properties. It binds hPROC in the presence of calcium ions and does not bind it in the presence of chelating agents. What is presented is an immunosorbent on the basis of said antibody.

EFFECT: applicability of the strain for preparing the MCA to hPROC, and producing on its basis an immune-affine sorbent for hPROC purification and concentration.

3 cl, 2 dwg, 3 tbl, 5 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к области биотехнологии и биофармацевтики, а именно к технологии получения моноклональных антител (МКА) методами клеточной гибридизации, точнее к методам получения МКА, специфичных к протеину С человека (hPROC), и создания на основе этих МКА иммуноаффинного сорбента для выделения, очистки и анализа протеина С человека из культуральной жидкости продуцентов рекомбинантного протеина С (rhPC) либо из природных источников (плазмы крови).The invention relates to the field of biotechnology and biopharmaceuticals, and in particular to a technology for producing monoclonal antibodies (MCAs) by cell hybridization methods, more specifically to methods for producing MCAs specific for human protein C (hPROC), and the creation of an immunoaffinity sorbent based on these MCAs for isolation, purification and analysis of human protein C from the culture fluid of the producers of recombinant protein C (rhPC) or from natural sources (blood plasma).

Предшествующий уровень техникиState of the art

Протеин С является витамин К-зависимым белком плазмы крови. Он входит в систему гемостаза и играет исключительно важную роль в регулировании свертывания крови. Протеин С синтезируется в виде неактивной молекулы предшественника, проходит многостадийный пост-трансляционный процессинг в клеточных компартментах и секретируется в виде интактной (зимогенной) формы. Активация белка С происходит в кровотоке при участии тромбомодулин-тромбинового комплекса. Активированный протеин С вместе с кофактором протеином S выполняет антикоагулянтную функцию. Механизм действия активированного протеина С и механизм активации зимогена в активную протеазу изложен в работе Esmon Т. Charles ("Protein-C: biochemistry, physiology, and clinical implications". Blood, 1984, Vol.62 (6), P.1155-8).Protein C is a vitamin K-dependent plasma protein. It is part of the hemostatic system and plays an extremely important role in regulating blood coagulation. Protein C is synthesized in the form of an inactive precursor molecule, undergoes multi-stage post-translational processing in cell compartments and is secreted in the form of an intact (zymogenic) form. Activation of protein C occurs in the bloodstream with the participation of the thrombomodulin-thrombin complex. Activated protein C, together with cofactor protein S, performs an anticoagulant function. The mechanism of action of activated protein C and the mechanism of activation of zymogen into an active protease is described in Esmon, T. Charles ("Protein-C: biochemistry, physiology, and clinical implications". Blood, 1984, Vol.62 (6), P.1155-8 )

Активация протеина С непосредственно осуществляется тромбином, последней сериновой протеазой каскада свертывания крови и опосредована связанным с мембраной эндотелиальных клеток гликопротеином тромбомодулин. Тромбомодулин образует прочный нековалентный комплекс состава 1:1 с тромбином и полностью меняет функциональные свойства тромбина. Свободный тромбин в нормальных условиях активирует тромбоциты, конвертирует фибриноген до фибрина и факторы свертывания крови V и VIII до активных формы Va и VIIIa. В то же время тромбин в комплексе с тромбомодулином теряет все вышеуказанные свойства, но эффективно активирует интактный протеин С при физиологических концентрациях ионов кальция.The activation of protein C is directly carried out by thrombin, the last serine protease of the blood coagulation cascade and is mediated by the thrombomodulin glycoprotein associated with the membrane of endothelial cells. Thrombomodulin forms a strong non-covalent complex of 1: 1 composition with thrombin and completely changes the functional properties of thrombin. Under normal conditions, free thrombin activates platelets, converts fibrinogen to fibrin and coagulation factors V and VIII to active forms Va and VIIIa. At the same time, thrombin in combination with thrombomodulin loses all of the above properties, but effectively activates intact protein C at physiological concentrations of calcium ions.

Активированный протеин С, в свою очередь, избирательно инактивирует активированные формы факторов свертываемости крови V и VIII, но не их исходные формы. Следует отметить, что основные события при запуске каскада свертывания крови происходят на поверхности клеток и требуют участия мембранно-связанных белков и фосфолипидов, в то время как факторы V и VIII свободно циркулируют в кровотоке и участвуют в петле положительной обратной связи при работе системы свертывания. При их активации тромбином они ускоряют активацию фактора Х и протромбина на 5 порядков и резко ускоряют генерацию тромбина в месте запуска каскада свертывания.Activated protein C, in turn, selectively inactivates the activated forms of coagulation factors V and VIII, but not their original forms. It should be noted that the main events at the start of the blood coagulation cascade occur on the cell surface and require the participation of membrane-bound proteins and phospholipids, while factors V and VIII circulate freely in the bloodstream and participate in the positive feedback loop during the operation of the coagulation system. When activated by thrombin, they accelerate the activation of factor X and prothrombin by 5 orders of magnitude and dramatically accelerate the generation of thrombin at the site of the coagulation cascade.

Таким образом, физиологическая роль активированного протеина С может быть описана как ограничение области запуска системы свертывания крови.Thus, the physiological role of activated protein C can be described as limiting the start area of the blood coagulation system.

Основным кофактором активированного протеина С является протеин S, другой витамин К - зависимый белок плазмы крови. Протеин S более чем в 10 раз усиливает вызываемую активированным протеином С деградацию факторов Va и VIIIa.The main cofactor of activated protein C is protein S, another vitamin K is a dependent plasma protein. Protein S more than 10 times enhances the degradation of factors Va and VIIIa caused by activated protein C.

Протеин С является важным терапевтическим агентом (ЕР 215549, ЕР 0191606) в качестве специфического антикоагулянта, имеющего потенциально более широкую область применения, чем традиционные антикоагулянты гепарин, варфарин (оксикумарин) или производные последнего. В отличие от традиционных антикоагулянтов активированный или интактный протеин С не воздействуют на систему свертывания крови до момента появления тромбина и не вызывают падения концентрации зимогенных белков системы свертывания. Вследствие этого антикоагулянтная терапия протеином С потенциально является более безопасной, поскольку не вызывает постоянного риска возникновения кровотечений. Экзогенный интактный протеин С также может использоваться для заместительной терапии при наследственном дефиците протеина С, вызывающего смерть в младенческом возрасте при гомозиготном дефиците и частые тромбоэмболические состояния при гетерозиготной форме дефицита.Protein C is an important therapeutic agent (EP 215549, EP 0191606) as a specific anticoagulant having a potentially wider scope than traditional anticoagulants heparin, warfarin (oxycoumarin) or derivatives of the latter. Unlike traditional anticoagulants, activated or intact protein C does not affect the blood coagulation system until the appearance of thrombin and does not cause a decrease in the concentration of zymogenic proteins of the coagulation system. As a result, protein C anticoagulant therapy is potentially safer because it does not cause a constant risk of bleeding. Exogenous intact protein C can also be used for replacement therapy with hereditary protein C deficiency, which causes death in infancy with homozygous deficiency and frequent thromboembolic conditions with a heterozygous form of deficiency.

Основной областью клинического применения активированного протеина С являются опасные для жизни тромботические состояния, в первую очередь синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром), возникающий, в том числе, при развитии острого сепсиса.The main area of clinical use of activated protein C is life-threatening thrombotic conditions, primarily disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC), which occurs, inter alia, in the development of acute sepsis.

Активированный протеин С является маркером сепсиса, а его уровень и дефицит интактного протеина С коррелируют с тяжестью течения заболевания. Так, дефицит протеина С наблюдается более чем у 85% больных с тяжелым сепсисом. Также дефицит протеина С коррелирует с неблагоприятными клиническими исходами, такими как септический шок (тяжелый сепсис, сопровождающийся развитием артериальной гипотонии), ДВС-синдромом и полиогранной недостаточностью.Activated protein C is a marker of sepsis, and its level and deficiency of intact protein C correlate with the severity of the disease. Thus, protein C deficiency is observed in more than 85% of patients with severe sepsis. Also, protein C deficiency correlates with adverse clinical outcomes, such as septic shock (severe sepsis, accompanied by the development of arterial hypotension), DIC, and polyhedral insufficiency.

Поскольку концентрация протеина С в плазме крови довольно мала и его отделение от других витамин К-зависимых белков системы гемостаза представляется весьма затруднительным, наилучшим способом получения активированного протеина С для медицинского применения является биосинтез, активация и очистка рекомбинантного белка. Наличие у протеина С так называемого Gla-домена, то есть кластера близкорасположенных остатков гамма-карбоксилированной глютаминовой кислоты необходимо для проявления антикоагуляционных свойств белка. Это обусловлено конформационными изменениями, которые претерпевает Gla-домен при связывании ионов кальция, что в свою очередь делает возможным превращение зимогенной формы протеина С в активную сериновую протеазу (Church W.L. et al. Discrimination of normal and abnormal prothrombin and protein С in plasma using a calcium ion-inhibited monoclonal antibody to a common epitope on several vitamin K-dependent proteins. Blood, 1989, Vol.74 (7), P.2418-25). Такие конформационные изменения, механизм которых известен и технически контролируем, могут быть положены в основу технологических решений для выделения протеина С и его активации.Since the concentration of protein C in the blood plasma is quite low and its separation from other vitamin K-dependent proteins of the hemostatic system is very difficult, the best way to obtain activated protein C for medical use is the biosynthesis, activation and purification of the recombinant protein. The presence of the so-called Gla domain in protein C, i.e., a cluster of closely spaced gamma-carboxylated glutamic acid residues, is necessary for the manifestation of the anticoagulation properties of the protein. This is due to the conformational changes that the Gla domain undergoes during the binding of calcium ions, which in turn makes it possible to convert the zymogenic form of protein C into an active serine protease (Church WL et al. Discrimination of normal and abnormal prothrombin and protein C in plasma using a calcium ion-inhibited monoclonal antibody to a common epitope on several vitamin K-dependent proteins. Blood, 1989, Vol. 74 (7), P.2418-25). Such conformational changes, the mechanism of which is known and technically controlled, can form the basis of technological solutions for the isolation of protein C and its activation.

Одним из важных подходов определения, очистки и концентрирования природного протеина С и его рекомбинантных вариантов в биомедицинских приложениях является использование конформационно-специфических МКА, продуцируемых гибридомами.One of the important approaches to the determination, purification, and concentration of natural protein C and its recombinant variants in biomedical applications is the use of conformation-specific MCAs produced by hybridomas.

Известно применение моноклональных антител к протеину С, описанное в патенте компании Baxter AG (Us. Pat. №5549893; Johann Eibi et al;" Use of protein С in the treatment of purpura fulminans"; 1995) защищающего терапевтическое применение активированного и неактивированного протеина С природного происхождения.The use of monoclonal antibodies to protein C is described in the patent of Baxter AG (Us. Pat. No. 5549893; Johann Eibi et al; "Use of protein C in the treatment of purpura fulminans"; 1995) that protects the therapeutic use of activated and non-activated protein C natural origin.

Применение конформационно-зависимых антител для очистки и активации протеина С является объектом защиты в патенте компании Elli Lily & Со. (Us. Pat. №4981952; Betty Yan S.; "Method for the purification of vitamin K-dependent proteins" 1989). Техническое решение основано на серии последовательных раундов хроматографии с аффинным сорбентом на основе МКА, связывание которых с протеином С блокируется ионами кальция. Поскольку многие внеклеточные протеазы более активны в присутствии ионов кальция, наиболее предпочтительным решением являлось бы использование МКА, связывающих протеин С в присутствии ионов кальция, и не связывающих в присутствии хелатирующих агентов, т.е. при полном отсутствии ионов кальция в растворе. При проведении аффинной хроматографии с такими иммобилизованными МКА активность остаточных контаминирующих протеаз в растворе элюированного протеина С была бы минимальной и в меньшей степени приводила бы к распаду протеина С и его преждевременной активации. Известно применение конформационно-зависимых антител для анализа биологической активности и разделения модифицированных форм протеина С. Для таких целей могут быть использованы хелатор-зависимые антитела (Church W.L. et al. Discrimination of normal and abnormal prothrombin and protein С in plasma using a calcium ion-inhibited monoclonal antibody to a common epitope on several vitamin K-dependent proteins. Blood, 1989, Vol.74 (7), P.2418-25; Vincenot A. et al. Amino acids 225-235** of the protein С serine-protease domain are important for the interaction with the thrombin-thrombomodulin complex. FEBS Letters, 1995, Vol.367 (2), P.153-7) и кальций-зависимые антитела (Ohsawa k. et al. Purification of sufficiently gamma-carboxylated recombinant protein С and its derivatives. Calcium-dependent affinity shift in immunoaffinity and ion-exchange chromatography. J. Chromatography, 1992, Vol.597 (1-2), P.285-91; Stearns D.J, et al. The interaction of a Ca²⁺-dependent monoclonal antibody with the protein С activation peptide region. Evidence for obligatory Ca²⁺ binding to both antigen and antibody. J. Biol. Chem. 1988, Vol.263 (2), P.826-32; Nakamura S., Sakata Y. Immunoaffinity purification of protein С by using conformation-specific monoclonal antibodies to protein C-calcium ion complex. Biochim Biophys Acta. Biochim. Biophys. Acta. 1987, Vol.925 (2), P.85-93; Wakabayashi K. Conformation-specific monoclonal antibodies to the calcium-induced structure of protein C. J. Biol. Chem. 1986, Vol.261 (24), P.11097-105). Предположительно, все вышеуказанные антитела связываются с протеином С в области Gla-домена, при этом узнаваемый ими эпитоп либо включает координированный ион кальция, либо маскируется таким координированным ионом.The use of conformation-dependent antibodies for the purification and activation of protein C is protected by Elli Lily & Co. (Us. Pat. No. 4981952; Betty Yan S .; "Method for the purification of vitamin K-dependent proteins" 1989). The technical solution is based on a series of successive rounds of chromatography with an affinity sorbent based on MCA, the binding of which to protein C is blocked by calcium ions. Since many extracellular proteases are more active in the presence of calcium ions, the most preferred solution would be to use MCAs that bind protein C in the presence of calcium ions and do not bind in the presence of chelating agents, i.e. in the complete absence of calcium ions in solution. When performing affinity chromatography with such immobilized MCAs, the activity of residual contaminating proteases in a solution of eluted protein C would be minimal and to a lesser extent lead to the breakdown of protein C and its premature activation. The use of conformation-dependent antibodies for the analysis of biological activity and separation of modified forms of protein C is known. For such purposes, chelator-dependent antibodies (Church WL et al. Discrimination of normal and abnormal prothrombin and protein C in plasma using a calcium ion-forbidden monoclonal antibody to a common epitope on several vitamin K-dependent proteins. Blood, 1989, Vol. 74 (7), P.2418-25; Vincenot A. et al. Amino acids 225-235 ** of the protein C serine- protease domain are important for the interaction with the thrombin-thrombomodulin complex. FEBS Letters, 1995, Vol. 367 (2), P.153-7) and calcium-dependent antibodies (Ohsawa k. et al. Purification of sufficiently gamma-carboxylated recombinant protein C and its derivatives. Calcium-dependencies dent affinity shift in immunoaffinity and ion-exchange chromatography. J. Chromatography, 1992, Vol. 597 (1-2), P.285-91; Stearns DJ, et al. The interaction of a Ca ²⁺ -dependent monoclonal antibody with the protein C activation peptide region. Evidence for obligatory Ca ²⁺ binding to both antigen and antibody. J. Biol. Chem. 1988, Vol. 263 (2), P.826-32; Nakamura S., Sakata Y. Immunoaffinity purification of protein C by using conformation-specific monoclonal antibodies to protein C-calcium ion complex. Biochim Biophys Acta. Biochim. Biophys. Acta. 1987, Vol. 925 (2), P.85-93; Wakabayashi K. Conformation-specific monoclonal antibodies to the calcium-induced structure of protein CJ Biol. Chem. 1986, Vol. 261 (24), P.11097-105). Presumably, all of the above antibodies bind to protein C in the region of the Gla domain, while the epitope recognized by them either includes a coordinated calcium ion or is masked by such a coordinated ion.

Существует широкий спектр возможностей для дальнейшего усовершенствования существующих промышленных решений по очистке протеина С человека и его рекомбинантных вариантов. Возможность такой оптимизации обусловлена тем, что при отборе клонов гибридом, продуцирующих МКА, обладающих конформационно зависимыми свойствами можно комбинировать различные факторы, влияющие на конформацию целевого антигена. Среди таких факторов можно назвать использование хелатирующих и хаотропных агентов, буферных растворов для элюции антител с разной ионной силой и введение в раствор для связывания антител и антигена различных двухвалентных ионов металлов, с последующим масштабированием оптимальной методики до уровня промышленной хроматографии (Tharakan J.P. Effect of feed flow-rate, antigen concentration and antibody density on immunoaffinity purification of coagulation factor IX. J. Chromatography, 1990, Vol.522, P.153-62; Verlander W.H. et al. Technological challenges for large scale purification of protein C. Protein С and related anticoagulants. Ed. by Bruley D.F. and Drohan W.N., 1990, Vol.11, P.11-27). Кроме того, каждая белковая структура несет на своей поверхности определенное количество эпитопов, в том числе ассоциированных со структурными доменами. Как правило, чем выше молекулярный вес белка, тем больше эпитопов. Они имеют разную иммуногенность и в случае семейства витамин К-зависимых белков моноклональные антитела могут быть использованы не только для очистки целевого белка, но и для активации его зимогенной формы. Поэтому, чем больше панель гибридом, продуцирующих антитела к конформационно-лабильными эпитопам, тем больше инструментов для очистки изоформ целевого белка, исследования и модификации его свойств. Следовательно, получение новых гибридом всегда актуально.There is a wide range of opportunities for further improvement of existing industrial solutions for the purification of human protein C and its recombinant variants. The possibility of such optimization is due to the fact that, during the selection of clones of hybridomas producing MABs that have conformation-dependent properties, various factors affecting the conformation of the target antigen can be combined. Among these factors are the use of chelating and chaotropic agents, buffer solutions for elution of antibodies with different ionic strengths and the introduction of various divalent metal ions into the solution for binding antibodies and antigen, followed by scaling of the optimal technique to the level of industrial chromatography (Tharakan JP Effect of feed flow -rate, antigen concentration and antibody density on immunoaffinity purification of coagulation factor IX. J. Chromatography, 1990, Vol.522, P.153-62; Verlander WH et al. Technological challenges for large scale purification of protein C. Protein C and related anticoagulants. Ed. by Bruley DF and Drohan WN, 1990, Vol. 11, P.11-27). In addition, each protein structure carries on its surface a certain number of epitopes, including those associated with structural domains. As a rule, the higher the molecular weight of a protein, the more epitopes. They have different immunogenicity and, in the case of the vitamin K-dependent protein family, monoclonal antibodies can be used not only to purify the target protein, but also to activate its zymogenic form. Therefore, the larger the panel of hybridomas producing antibodies to conformationally labile epitopes, the more tools there are for cleaning the target protein isoforms, studying and modifying its properties. Therefore, obtaining new hybrid is always relevant.

Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание метода получения конформационно-зависимых высокоаффинных антител к протеину С человека, применимых для биофармацевтического производства, а именно для аффинной очистки рекомбинантного протеина С человека (rhPROC).The technical problem solved by the authors was the creation of a method for obtaining conformation-dependent high-affinity antibodies to human protein C, applicable for biopharmaceutical production, namely for the affinity purification of recombinant human protein C (rhPROC).

Технический результат достигался путем создания нового штамма гибридных культивируемых клеток Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3, секретирующих моноклональные антитела к протеину С человека и создания на их основе иммуносорбента для очистки рекомбинантного протеина С человека. Полученный штамм депонирован в Российской Коллекции Культур Клеток позвоночных Института Цитологии РАН за номером 733 (Д) от 16.03.2010.The technical result was achieved by creating a new strain of hybrid cultured cells Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3, secreting monoclonal antibodies to human protein C and creating an immunosorbent based on them for purification of recombinant human protein C. The resulting strain was deposited in the Russian Collection of Cultures of Vertebrate Cells of the Institute of Cytology RAS, number 733 (D) dated 03.16.2010.

Основным методическим подходом к созданию штаммов клеточных линий, продуцирующих моноклональные антитела, является клонирование гибридом. Гибридомы получают слиянием несекретирующих клеток миеломы и антител-продуцирующих В-лимфоцитов в присутствии полиэтиленгликоля. Клетки миеломы дефицитны по гипоксантин-гуанин фосфорибозил трансферазе (HGPRT) или тимидинкиназе (ТК). Таким образом, они не могут выжить при культивации в среде, содержащей добавку HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). В то же время любые не слитые В-лимфоциты селезенки сам по себе не стабильны в культуре более трех дней.The main methodological approach to creating strains of cell lines producing monoclonal antibodies is the cloning of hybridomas. Hybridomas are obtained by fusion of non-secreting myeloma cells and antibody-producing B lymphocytes in the presence of polyethylene glycol. Myeloma cells are deficient in hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT) or thymidine kinase (TC). Thus, they cannot survive cultivation in a medium containing an HAT supplement (hypoxanthine, aminopterin and thymidine). At the same time, any non-fused spleen B-lymphocytes per se are not stable in culture for more than three days.

Таким образом, гибридные клетки В-лимфоцитов и миеломы, содержащие генетическую информацию обоих родительских клеток, должны обладать стабильностью в селективной среде, содержащей HAT. Они могут культивироваться продолжительное время и продуцировать потенциально неограниченное количество антител.Thus, hybrid cells of B-lymphocytes and myelomas containing the genetic information of both parent cells must be stable in a selective medium containing HAT. They can be cultivated for a long time and produce a potentially unlimited amount of antibodies.

Супернатанты культуры гибридом анализируют на наличие целевых антител методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). Затем отобранные гибридомы клонируют для того, чтобы получить субклоны, продуцирующие моноклональные конформационно-зависимые антитела. Для этого в метод ИФА вносятся изменения, благодаря которым имитируются элюирующие условия хроматографической очистки, изменяющие аффинность антител в зависимости от конформации антигена (Pepper S.D. Selection antibodies for immunoaffinity chromatography // Methods in molecular biology ed. by Kenney A. and Fowell S., 1992, Vol.11, P.136-171). Отобранный продуцент моноклонального антитела может быть масштабирован in vivo в виде асцита мыши или in vitro в суспензионной культуре (Kohler J., Milstein С.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975, Vol.256 (5517), P.495-7).Hybridoma culture supernatants are analyzed for the presence of target antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Then, the selected hybridomas are cloned in order to obtain subclones producing monoclonal conformation-dependent antibodies. To do this, changes are made to the ELISA method, which simulate eluting chromatographic purification conditions that change the affinity of antibodies depending on the antigen conformation (Pepper SD Selection antibodies for immunoaffinity chromatography // Methods in molecular biology ed. By Kenney A. and Fowell S., 1992 Vol. 11, P.136-171). A selected producer of a monoclonal antibody can be scaled in vivo as mouse ascites or in vitro in suspension culture (Kohler J., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975, Vol. 256 (5517), P .495-7).

Термин «моноклональное антитело» означает антитело, искусственно получаемое из клеточного клона и поэтому содержащее только один тип иммуноглобулина.The term "monoclonal antibody" means an antibody artificially derived from a cell clone and therefore containing only one type of immunoglobulin.

Антитело, специфичное к белку "протеин С человека", означает молекулу, которая селективно, избирательно связывается с протеином С человека и образует стабильный комплекс. Стабильным комплексом является комплекс, в котором связывание между партнерами происходит на период времени, достаточный для того, чтобы произвести детектирование указанного комплекса. Термин "селективно связывается с протеином С человека" означает способность указанной молекулы предпочтительно связываться с протеином С человека в отличие от связывания с белками, не имеющими отношения к протеину С человека или связывания с небелковыми компонентами, присутствующими в образце. Антителом, которое предпочтительно связывается с протеином С человека, является антитело, которое связывается с протеином С человека, но не связывается в существенной степени с другими молекулами или компонентами, которые могут присутствовать в образце. Существенное связывание предполагает, например, связывание антитела, связывающегося с протеином С человека, с молекулой, не являющейся протеином С человека, с аффиностью или силой, достаточной для того, чтобы помешать способности антитела, связывающегося с протеином С человека.An antibody specific for the human protein C protein means a molecule that selectively binds selectively to human protein C to form a stable complex. A stable complex is a complex in which binding between partners occurs for a period of time sufficient to detect the specified complex. The term “selectively binds to human protein C” means the ability of said molecule to preferably bind to human protein C, as opposed to binding to proteins unrelated to human protein C or binding to non-protein components present in the sample. An antibody that preferably binds to human protein C is an antibody that binds to human protein C but does not substantially bind to other molecules or components that may be present in the sample. Significant binding involves, for example, binding of an antibody that binds to human protein C with a non-human protein C molecule with an affinity or strength sufficient to interfere with the ability of the antibody to bind to human protein C.

Способность антитела к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методами ELISA и равновесного диализа. Методы определения аффинности и силы связывания хорошо известны специалисту в данной области техники и подробно описаны, например, Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).The ability of an antibody to bind to an antigen can be determined by one of skill in the art using methods including, but not limited to, ELISA and equilibrium dialysis. Methods for determining affinity and binding strength are well known to those skilled in the art and are described in detail, for example, by Janeway et al. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).

Методика иммунизации. Штамм гибридомы получают путем иммунизации мышей линии Balb/c рекомбинантным активированным протеином С человека в течение 49 суток. На третьи сутки после последней бустер-инъекции проводят гибридизацию спленоцитов иммунизированных мышей (1,2×10 клеток) с клетками мышиной миеломы Sp2/0-Ag14 (3×10⁷ клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль с молекулярным весом 1450 (Sigma, Германия). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.Immunization Technique. The hybridoma strain is obtained by immunizing Balb / c mice with recombinant activated human protein C for 49 days. On the third day after the last booster injection, splenocytes of immunized mice (1.2 × 10 cells) are hybridized with Sp2 / 0-Ag14 mouse myeloma cells (3 × 10 ⁷ cells). Polyethylene glycol with a molecular weight of 1450 (Sigma, Germany) was used as a fusion agent. After hybridization, selection, screening, cloning, and cryopreservation of the hybridoma are performed.

Морфологическая характеристика гибридомы Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3Morphological characteristics of the Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3 hybridoma

Культура гибридных клеток состоит из слабо прикрепленных к подложке округлых клеток с размером с исходную миеломную клетку.The hybrid cell culture consists of rounded cells loosely attached to the substrate with the size of the original myeloma cell.

Культуральные свойства. Культивирование штамма гибридомы Sp2/0Agl4-SpBcG/APC-15/A3 ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 8 мкг/мл тилозина. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в вентилируемых пластиковых флаконах с адгезионной поверхностью площадью 25 см² и рабочим объемом среды 5-10 мл. Пассирование клеток гибридомы проводят 3 раза в неделю с кратностью разведения 1:4-1:6. Посевная концентрация клеток составляет 3×10⁵ 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 1,2×10 на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 12 последовательных пассажах in vitro.Cultural properties. The cultivation of the hybridoma strain Sp2 / 0Agl4-SpBcG / APC-15 / A3 is carried out at a temperature of 37 ° C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. The cultivation medium is RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 8 μg / ml tylosin. Cells are cultured as a stationary suspension in ventilated plastic bottles with an adhesive surface of 25 cm ² and a working volume of 5-10 ml of medium. Passage of hybridoma cells is carried out 3 times a week with a dilution ratio of 1: 4-1: 6. The inoculum concentration of cells is 3 × 10 ⁵ 1 ml of medium. The maximum concentration of hybrid cells during cultivation is 1.2 × 10 per 1 ml of medium. The hybrid clone does not lose the ability to synthesize antibodies in 12 consecutive passages in vitro.

Культивирование гибридомы в организме животного. Вид животного - инбредные мыши линии BALB/c. Доза клеток при прививке составляет 2×10⁶ клеток/0,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора на одну мышь при первичном введении. За 1 сутки до введения клеток гибридомы мышам внутрибрюшинно вводят 1 мл неполного адъюванта Фрейнда. Иммуноасцитическая жидкость образуется на 12-16 сутки в объеме 3-5 мл. Количественное определение иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой, производят методом непрямого иммуно ферментного анализа (ИФА).The cultivation of hybridomas in the body of the animal. Animal species - inbred mice of the BALB / c line. The dose of cells during vaccination is 2 × 10 ⁶ cells / 0.5 ml of phosphate-buffered saline per mouse in the initial administration. 1 day before the introduction of hybridoma cells, mice were intraperitoneally injected with 1 ml of Freund's incomplete adjuvant. Immunoascitic fluid is formed on days 12-16 in the volume of 3-5 ml. Quantification of the immunoglobulin produced by the hybridoma is carried out by indirect immuno-enzyme analysis (ELISA).

Характеристика полезного продукта. Гибридома Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 продуцирует специфичные моноклональные антитела к протеину С человека, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:90000, в иммуноасцитической жидкости (ИАЖ) 1:200 000. Моноклональные антитела из КЖ и ИАЖ выделяют с помощью осаждения сульфатом аммония с последующей аффинной хроматографией на белок А или G сефарозе. Гомогенность выделенных антител проверяется с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Принадлежность к классу иммуноглобулинов G определяется по иммуноферментному анализу класс-специфическими антивидовыми антителами.The characteristic of a useful product. The Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3 hybridoma produces specific monoclonal antibodies to human protein C, the titer of which is 1: 90,000 in culture fluid (QOL), and 1: 200,000 in immunostatic fluid (QL). Monoclonal antibodies from QL and IAG is isolated by precipitation with ammonium sulfate followed by affinity chromatography on protein A or G sepharose. The homogeneity of the isolated antibodies is checked by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate. Belonging to the class of immunoglobulins G is determined by enzyme-linked immunosorbent assay with class-specific antispecies antibodies.

Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл при времени культивирования 72 ч и посевной концентрации гибридомы 0,3 млн кл/мл; в асцитической жидкости - 1-4 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 12 последовательных пассажей и воспроизводится при прививании в виде асцитных опухолей на мышах.Strain productivity. The production of MCA in the cultivation medium is 20-50 μg / ml with a cultivation time of 72 hours and a seed hybridoma concentration of 0.3 million cells / ml; in ascitic fluid - 1-4 mg / ml. The production of MCA in the culture fluid is maintained for 12 consecutive passages and is reproduced by inoculation in the form of ascites tumors in mice.

Контаминация штамма. Контаминанты гибридной линии, включая бактерии и грибы, методом прямого посева на питательные среды LB и Сабуро-Эммонса не обнаружены; микоплазма по ПЦР и флуоресцентному анализу не обнаружена; вирусы - нет данных.Strain contamination. Hybrid line contaminants, including bacteria and fungi, were not detected by direct culture on LB and Saburo-Emmons culture media; Mycoplasma by PCR and fluorescence analysis was not detected; viruses - no data.

Криоконсервация производится аликвотами ресуспендированных клеток по 3×10⁶кл./мл. Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды, содержащей эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%. Режим криоконсервации и отогрева. Гибридные клетки вносят в криоампулы, помещают в контейнер с теплоносителем изопенталом и помещают в низкотемпературный холодильник для охлаждения со скоростью 1°С/мин до достижения температуры - 70°С и затем поиещают в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре +37°С. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 80-90%.Cryopreservation is performed by aliquots of resuspended cells at 3 × 10 ⁶ cells / ml. Ampoules contain 1.0 ml of cryoprotective medium containing fetal calf serum - 90%, dimethyl sulfoxide - 10%. Cryopreservation and heating mode. Hybrid cells are introduced into cryo-ampoules, placed in an isopental coolant container and placed in a low-temperature refrigerator for cooling at a rate of 1 ° C / min until a temperature of 70 ° C is reached and then poured into liquid nitrogen. Defrosting is carried out quickly in a water bath at a temperature of + 37 ° C. The viability of restored hybridomas after cryopreservation is 80-90%.

Иммуносорбент. Для получения иммуносорбента в качестве носителя используют твердофазные носители, в том числе различные гранулированные сорбенты, например агарозу, содержащую ковалентно связанные с ней лиганды. Для иммобилизации очищенного МКА Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 использовали сорбент с амино-реактивными привитыми группами N-гидроксисукцинимида NHS-activated Sepharose 4 FF (GE LifeSciences, США). Показана возможность использования заявляемых МКА в качестве лиганда для получения иммуносорбента для сорбции протеина С.Immunosorbent. To obtain an immunosorbent, solid-phase carriers are used as a carrier, including various granular sorbents, for example, agarose containing ligands covalently bound to it. To immobilize purified MCA Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3, a sorbent with amino-reactive grafted groups of N-hydroxysuccinimide NHS-activated Sepharose 4 FF (GE LifeSciences, USA) was used. The possibility of using the inventive MCAs as a ligand to obtain an immunosorbent for sorption of protein C. was shown.

Полезным продуктом является гибридома и продуцируемые ей моноклональные антитела, относящиеся к классу IgG иммуноглобулинов мыши, специфичные к протеину С человека, а также иммуносорбент для сорбции протеина С человека. Особенности полученных моноклональных антител (МКА) и результаты их практического применения изобретения приведены на следующих фигурах.A useful product is a hybridoma and monoclonal antibodies produced by it, belonging to the IgG class of mouse immunoglobulins specific for human protein C, as well as an immunosorbent for sorption of human protein C. Features of the obtained monoclonal antibodies (MCAs) and the results of their practical application of the invention are shown in the following figures.

Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings

На Фигуре 1 показан критерий отбора поликлональных пулов гибридом, соотношение с верхним 5% процентилем. Ось Х - оптическая плотность OD при длине волны λ=450 нм, ось Y - количество колоний с активностью в интервале d=0.010D. Заполненный точками столбик - верхний 5% процентиль (n=17), заштрихованный столбик - критерий отбора по уровню сигнала (OD450>0.1, n=48).The Figure 1 shows the selection criterion for polyclonal pools of hybridomas, the ratio with the upper 5% percentile. The X axis is the optical density OD at a wavelength of λ = 450 nm, the Y axis is the number of colonies with activity in the range d = 0.010D. The bar filled with dots is the upper 5% percentile (n = 17), the hatched bar is the criterion for selection by signal level (OD450> 0.1, n = 48).

На Фигуре 2 показано определение rhPC твердофазном ИФАс использованием МКА гибридомы Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3.Figure 2 shows the determination of rhPC by solid phase ELISA using a Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3 mAb hybridoma.

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting examples of the invention.

Пример 1. Получение гибридомыExample 1. Obtaining a hybridoma

ИммунизацияImmunization

Мышей линии BALB/c возраста 8-10 недель в количестве 8 штук иммунизируют рекомбинантным активированным протеином С человека (rhPC, лекарственное средство дротрекогин альфа) по схеме:8 to 10 week old BALB / c mice are immunized with 8 recombinant human activated protein C (rhPC, drug drotrekogin alpha) according to the scheme:

- внутрибрюшинное введение мышам 200 мкг rhPC в полном адъюванте Фрейнда;- intraperitoneal administration to mice of 200 μg rhPC in complete Freund's adjuvant;

- через 21 сутки повторное введение мышам 500 мкг rhPC в неполном адъюванте Фрейнда;- after 21 days, re-introduction to mice of 500 μg rhPC in incomplete Freund's adjuvant;

- через 35 суток внутривенная инъекция мышам 500 мкг rhPC в неполном адъюванте Фрейнда;- after 35 days, intravenous injection in mice of 500 μg rhPC in incomplete Freund's adjuvant;

- через 42 суток отбор образцов крови из орбитального синуса, определение животных с наилучшим титром антител к протеину С в сыворотке по ИФА;- after 42 days, blood sampling from the orbital sinus, determination of animals with the best titer of antibodies to protein C in serum by ELISA;

- выбранным животным еще через 7 суток производится бустерная внутривенная инъекция 200 мкг rhPC в физиологическом растворе;- after 7 days, the selected animals are given an intravenous booster injection of 200 μg rhPC in physiological saline;

- через 7 суток содержания бустированных мышей производится повторный отбор образцов крови из орбитального синуса на ИФА. Производится финальное бустирование животного с максимальным титром антител к rhPC: внутривенная инъекция 200 мкг rhPC в физиологическом растворе.- after 7 days of keeping boosted mice, re-sampling of blood from the orbital sinus for ELISA is performed. Final boosting of the animal is performed with the maximum titer of antibodies to rhPC: intravenous injection of 200 μg rhPC in physiological saline.

Гибридизация.Hybridization.

Через 3 суток после последней внутривенной инъекции извлекают селезенку мыши и проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1.2×10 клеток) с клетками мышиной миеломы Sp2/0-Agl4 (3×10⁷ клеток) в присутствии 1 мл 50% раствора полиэтиленгликоля (Sigma, США) с молекулярным весом 1450 в течение 1 минуты. Затем в течение 15 минут последовательными двойными разведениями доводят объем до 16 мл, добавляя по каплям безсывороточную среду RPMI-1640. Разведенную гибридизационную суспензию инкубируют 1 час при 37°С в 150 мл полной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки.3 days after the last intravenous injection, the mouse spleen is removed and splenocytes of immune mice (1.2 × 10 cells) are hybridized with Sp2 / 0-Agl4 mouse myeloma cells (3 × 10 ⁷ cells) in the presence of 1 ml of a 50% solution of polyethylene glycol (Sigma, USA ) with a molecular weight of 1450 for 1 minute. Then, the volume is adjusted to 16 ml in successive double dilutions by adding dropwise serum-free RPMI-1640 medium. The diluted hybridization suspension is incubated for 1 hour at 37 ° C in 150 ml of complete RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum.

Селекция.Selection.

После инкубации клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной в среде с добавкой HAT (10 мМ гипоксантина, 40 мкМ аминоптерина, 1,6 мМ тимидина). Через 14 суток из среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде A-DMEM/F-12 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 8 мкг/мл тилозина.After incubation, cells were plated on 96-well plates on a layer of peritoneal macrophages taken from BALB / c mice. Selection of hybrid cells is carried out on a selective medium supplemented with HAT (10 mM hypoxanthine, 40 μM aminopterin, 1.6 mM thymidine). After 14 days, aminopterin is removed from the medium. Subsequently, cultivation is carried out on A-DMEM / F-12 medium with 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 8 μg / ml tylosin.

Оценка продуктивности первичных пулов.Primary Pool Productivity Assessment.

Для отбора положительных первичных пулов, продуцирующих МКА, используют твердофазный ИФА.For the selection of positive primary pools producing ICA, solid-phase ELISA is used.

Для проведения ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 100 нг rhPC, разведенного в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР; состав - 1,7 мМ КН₂РО₄, 5,2 мМ Na₂HPO₄, 150 мМ NaCl, pH 7,4) в объеме 100 мкл и затем выдерживают при температуре 6°С в течение 16 ч. Лунки планшета трижды отмывают ФБР, дополнительно содержащим 0,05% Твин-20 (ФБР-Тв). Вносят в лунки по 300 мкл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в ФБР (1% БСА) и инкубируют при температуре 37°С в течение 60 мин. Три раза промывают лунки ФБР-Тв и вносят супернатант культуральной жидкости в объеме 100 мкл, при необходимости делая разведения в 1% БСА. Планшет инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды промывают раствором ФБР-Тв и добавляют по 100 мкл раствора конъюгата антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена (Sigma, США) в рабочем разведении 1/3500. Планшет инкубируют при температуре 37°С в течение 60 минут, затем 5 раз промывают лунки раствором ФБР-Тв. Положительную реакцию оценивают по развитию голубого окрашивания при добавлении хромогенного раствора субстрата ТМБ (состав - 4 мкл 30% Н₂О₂, 4 мг 3,3',5,5-тетраметилбензидина на 100 мл 0,1 М натрий нитратного буфера pH 5,0). Реакцию останавливают добавлением в лунки по 100 мкл 5% Н₃РO₄. Измеряют оптическую плотность OD при длине волны λ=450 нм. Строят калибровочный график OD450=f(lnC) в диапазоне линейной чувствительности, и определяют титр антител. Для определения зависимости связывания антител от присутствия ионов кальция проводят два параллельных определения титра, используя вместо ФБР растворы 2 мМ СаСl₂ в буферизованном растворе Трис (ТБР; состав - 20 мМ Трис - НСl; 150 мМ NaCl, рН 7,5) и 2 мМ ЭДТА-Na в буферизованном растворе ТБР.For ELISA, 100 ng rhPC diluted in phosphate-buffered saline (PBS; 1.7 mM KH ₂ PO ₄ , 5.2 mM Na ₂ HPO ₄ , 150 are added to the wells of a 96-well polystyrene plate for enzyme-linked immunosorbent assay) mM NaCl, pH 7.4) in a volume of 100 μl and then kept at a temperature of 6 ° C for 16 hours. Wells of the plate are washed three times with PBS, additionally containing 0.05% Tween-20 (PBS-Tw). 300 μl of 1% solution of bovine serum albumin in PBS (1% BSA) is added to the wells and incubated at 37 ° C for 60 minutes. Wash wells FBI-Tv three times and add supernatant of culture fluid in a volume of 100 μl, if necessary, make dilutions in 1% BSA. The plate is incubated at a temperature of 37 ° C for 1 hour. After this, the wells of the tablet are washed three times with FBI-Tw solution and 100 μl of a solution of conjugate of antibodies against mouse immunoglobulins with horseradish peroxidase (Sigma, USA) in working dilution 1/3500 are added. The plate is incubated at 37 ° C for 60 minutes, then the wells are washed 5 times with FBI-Tw solution. A positive reaction is assessed by the development of blue staining with the addition of a chromogenic TMB substrate solution (composition - 4 μl 30% H ₂ O ₂ , 4 mg 3.3 ', 5.5-tetramethylbenzidine per 100 ml 0.1 M sodium nitrate buffer pH 5, 0). The reaction is stopped by adding 100 μl of 5% H ₃ PO ₄ to the wells. The optical density OD is measured at a wavelength of λ = 450 nm. A calibration graph is constructed OD450 = f (lnC) in the linear sensitivity range, and the antibody titer is determined. To determine the dependence of antibody binding on the presence of calcium ions, two parallel titer determinations are carried out using instead of PBS, solutions of 2 mM CaCl ₂ in a Tris buffered solution (TBR; composition - 20 mM Tris - Hcl; 150 mM NaCl, pH 7.5) and 2 mM EDTA-Na in a buffered solution of TBR.

Слияние выделенной первичной культуры спленоцитов выбранного животного с максимальным титром антител к протеину С и клеток миеломы Sp2/0-Ag14 было произведено через 3 дня после последней бустерной инъекции. Последующее культивирование гибридом в течение 8 дней на среде HAT привело к образованию 350 отдельных лунок, содержащих пулы иммортализованных клеток.The fusion of the selected primary splenocyte culture of the selected animal with a maximum titer of antibodies to protein C and Sp2 / 0-Ag14 myeloma cells was made 3 days after the last booster injection. Subsequent cultivation of the hybridomas for 8 days on HAT medium resulted in the formation of 350 individual wells containing pools of immortalized cells.

По результатам прямого ИФА супернатантов полученных пулов гибридом часть результатов которого представлена на фигуре 1, было получено обычное бимодальное распределение титра антител. Максимальный сигнал в ИФА составил OD₄₅₀=3,304, 6 образцов имели сигнал OD₄₅₀>2,0, верхний 5% процентиль покрывает диапазон активности OD₄₅₀=3,304-0,150. Для масштабирования было отобрано 48 колоний (лунок) с сигналом ИФА ОD₄₅₀>0.100.According to the results of direct ELISA of the supernatants of the obtained hybrid pools, part of the results of which are presented in Figure 1, the usual bimodal distribution of antibody titer was obtained. The maximum signal in ELISA was OD ₄₅₀ = 3.304, 6 samples had a signal OD ₄₅₀ > 2.0, the top 5% percentile covers the range of activity OD ₄₅₀ = 3.304-0.150. For scaling, 48 colonies (wells) with an ELISA signal OD ₄₅₀ > 0.100 were selected.

Отобранные для масштабирования 48 поликлональных пулов в течение следующих 10 дней были масштабированы до культивационного объема 5 мл. Масштабированные до объема 5 мл культуры были оттестированы на секрецию кальций-зависимых антител в двух последовательных ИФА с интервалом между отбором супернатантов 48 часов. Результаты представлены в Таблице 1.The 48 polyclonal pools selected for scaling over the next 10 days were scaled to a cultivation volume of 5 ml. Scaled to a volume of 5 ml of culture were tested for the secretion of calcium-dependent antibodies in two consecutive ELISA with an interval between selection of supernatants of 48 hours. The results are presented in Table 1.

Для дальнейшего клонирования были отобраны 4 масштабированные лунки с максимальным сигналом на ИФА. При этом во всех четырех лунках наблюдалось присутствие смеси кальций-зависимых и кальций-независимых антител - сигнал при проведении ИФА в присутствии ЭДТА уменьшался на 12-61%. Это указывает на наличие в пулах клеток существенной доли гибридом, продуцирующих кальций-зависимые антитела и существенно меньшей доли (или полного отсутствия) гибридом, продуцирующих антитела, блокирующиеся ионами кальциями.For further cloning, 4 scaled wells were selected with the maximum signal on ELISA. In all four wells, a mixture of calcium-dependent and calcium-independent antibodies was observed — the signal during ELISA in the presence of EDTA decreased by 12-61%. This indicates the presence in the cell pools of a significant proportion of hybridomas that produce calcium-dependent antibodies and a significantly smaller proportion (or complete absence) of hybridomas that produce antibodies blocked by calcium ions.

Пример 2. Клонирование и селекция гибридом, секретирующих кальций-зависимые моноклональные антителаExample 2. Cloning and selection of hybridomas secreting calcium-dependent monoclonal antibodies

КлонированиеCloning

Клонирование гибридных клеток проводят методом серийных разведений по обоим осям 96-луночных планшетов на слое перитонеальных макрофагов в количестве около 1×10⁴ клеток на лунку. Расчетное разведение гибридом - 1 клонобразующая клетка на лунку в длинных диагоналях планшетов достигается при посевной дозе 8 тыс. клеток в 200 мкл в стартовой лунке. Культивирование клонов гибридомы ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 8 мкг/мл тилозина. Клоны гибридомы криоконсервируют на среде замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%. Криодепонированные клоны гибридомы хранят в жидком азоте.Cloning of hybrid cells is carried out by serial dilution on both axes of 96-well plates on a layer of peritoneal macrophages in an amount of about 1 × 10 ⁴ cells per well. Estimated dilution of hybridomas - 1 clone-forming cell per well in long plate diagonals is achieved with a sowing dose of 8 thousand cells in 200 μl in the starting well. Hybridoma clones are cultured at a temperature of 37 ° C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. The cultivation medium is RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 8 μg / ml tylosin. Hybridoma clones are cryopreserved on a freezing medium consisting of fetal calf serum - 90%, dimethyl sulfoxide - 10%. Cryodeponed hybridoma clones are stored in liquid nitrogen.

Скрининг клонов.Clone screening.

Выбранные по методике, описанной в примере 1, клеточные пулы с максимальной активностью были клонированы в предельных разведениях в пяти 96-луночных планшетов каждый. Через 8 дней было обнаружено 23 лунки, содержащие одиночные круглые колонии клеток. Колонии были пересажены в лунки 24-луночного планшета в культивационном объеме 1 мл.Selected according to the method described in example 1, the cell pools with maximum activity were cloned at the maximum dilutions in five 96-well plates each. After 8 days, 23 wells containing single circular cell colonies were detected. Colonies were transplanted into the wells of a 24-well plate in a cultivation volume of 1 ml.

Через 15 дней после начала клонирования при прямом ИФА тестировании супернатантов было обнаружено 2 клона, секретирующих кальций-зависимые антитела к протеину С человека (сигнал при ИФА с 2 мМ Са²⁺ OD₄₅₀=2,41 и OD₄₅₀=1,7; отношение сигнала при ИФА с 2 мМ EDTA к сигналу в ИФА с 2 мМ Са²⁺ 2,2% и 19,2%), а также 2 клона, продуцирующих либо смесь антител, либо антитела с частичной кальций-зависимостью (сигнал в ИФА с 2 мМ Са²⁺ OD₄₅₀=0,58 и OD₄₅₀=0,41; отношение сигнала 27,6% и 27%). Данные иммуноферментного анализа клонов приведены в таблице 2.15 days after the start of cloning, direct ELISA testing of supernatants revealed 2 clones secreting calcium-dependent antibodies to human protein C (signal for ELISA with 2 mM Ca ²⁺ OD ₄₅₀ = 2.41 and OD ₄₅₀ = 1.7; ratio the signal in ELISA with 2 mm EDTA to the signal in ELISA with 2 mm Ca ²⁺ 2.2% and 19.2%), as well as 2 clones producing either a mixture of antibodies or antibodies with partial calcium dependence (signal in ELISA with 2 mM Ca ²⁺ OD ₄₅₀ = 0.58 and OD ₄₅₀ = 0.41; signal ratio 27.6% and 27%). Enzyme immunoassay data for clones are shown in table 2.

Отобранные моноклоны были масштабированы до объема 5 мл, криодепонированны и повторно клонированы для разделения возможных олигоклональных колоний методом серийных разведениий в пять 96-луночных планшетов каждый.The selected monoclones were scaled to a volume of 5 ml, cryodeponed and re-cloned to separate possible oligoclonal colonies by serial dilution in five 96-well plates each.

Через 8 дней после второго клонирования было обнаружено суммарно 12 лунок с единичными округлыми колониями, содержащими моноклоны второго поколения. Моноклоны были масштабированы до культиационного объема 10 мл, при этом 7 клонов из 12 сохранили жизнеспособность.Eight days after the second cloning, a total of 12 wells with single rounded colonies containing monoclones of the second generation were detected. Monoclones were scaled to a cultivation volume of 10 ml, while 7 of 12 clones remained viable.

Через 24 дня после второго клонирования было проведено прямое ИФА тестирование. Был обнаружен 1 клон второй генерации, продуцирующий с высоким титром кальций-зависимые антитела (сигнал OD₄₅₀=1.739; отношение сигналов 4,9%). Остальные жизнеспособные клоны секретировали кальций-независимые антитела к протеину С человека (сигнал OD₄₅₀=2,165-1,571, отношение сигналов>88%). Данные иммуноферментного анализа представлены в таблице 3.24 days after the second cloning, direct ELISA testing was performed. 1 clone of the second generation was found producing high titer calcium-dependent antibodies (signal OD ₄₅₀ = 1.739; signal ratio 4.9%). The remaining viable clones secreted calcium-independent antibodies to human protein C (signal OD ₄₅₀ = 2,165-1,571, signal ratio> 88%). Enzyme immunoassay data are presented in table 3.

Масштабированные клоны гибридом второй генерации были криодепонированы, выживаемость после разморозки составила не менее 60%.Scaled clones of the second generation hybridomas were cryodeponed; survival after defrosting was at least 60%.

Пример 3. Чувствительность отобранных МКА в твердофазном иммуноферментном анализе.Example 3. The sensitivity of the selected MAB in enzyme-linked immunosorbent assay.

Для проведения твердофазного ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 100 мкл раствора рекомбинантного протеина С в ФБР с содержанием протеина С от 128 нг до 0,5 нг на лунку. Раствор инкубируют в лунках при температуре 4°С в течение 16 часов. Последующие стадии анализа проводят аналогично стадиям, описанным для скрининга гибридных клонов. Моноклональные антитела вносят в лунки в концентрации 100 нг/мл. Отрицательный контроль - сыворотка интактной мыши в разведении 1/1000.To conduct a solid-phase ELISA, 100 μl of a recombinant protein C solution in PBS with a protein C content of 128 ng to 0.5 ng per well is added to the wells of a 96-well polystyrene immunoassay plate. The solution was incubated in wells at 4 ° C. for 16 hours. The subsequent steps of the analysis are carried out similarly to the steps described for screening hybrid clones. Monoclonal antibodies are added to the wells at a concentration of 100 ng / ml. Negative control - 1/1000 dilution of intact mouse serum.

В непрямом твердофазном ИФА моноклональные антитела гибридомы Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/А3 специфически взаимодействуют с протеином С и определяют до 16 нг белка в анализируемом образце (фигура 2).In indirect solid-phase ELISA, monoclonal antibodies of the Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3 hybridoma specifically interact with protein C and determine up to 16 ng of protein in the analyzed sample (figure 2).

Пример 4. Подтверждение специфичности целевых МКА иммуноблотингом протеина С человека.Example 4. Confirmation of the specificity of the target MCA by immunoblotting of protein C person.

Для проверки специфичности МКА гибридомы Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 к протеину С человека проводят электрофорез по Лэммли в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в течение 2 часов при 180 В, 20 мА в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Источником антигена является 300-кратный концентрат бессывороточной культуральной среды, кондиционированной в течение 4 суток на клеточной линии DG-CID-PROC-1- продуценте протеина С человека, положительный контроль - очищенный активированный протеин С, отрицательный контроль - 300-кратный концентрат бессывороточной культуральной среды кондиционированной клеточной линией СНО DG 44 (родительской для линии DG-CID-PROC-1, не содержащей трансгенов). Образцы кондиционированной среды наносят в количестве 10 мкг общего белка на дорожку, положительный контроль - 100 нг белка на дорожку. Каждый из образцов наносят в две дорожки, на правой и на левой половинах геля, в центральную дорожку наносят предокрашенный маркер молекулярных масс. После окончания электрофоретического разделения белки переносят из ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Extra (GE LifeSciences, США) в течение 2 часов при силе тока 70 мА при помощи аппарата для полусухого переноса. После завершения переноса мембрану блокируют в 1% растворе БСА в трис-буферизованном растворе (ТБР, состав: 20 мМ трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl) в течение 1 ч при комнатной температуре. Для промывок мембран и разведения растворов антител используют ТБР, дополнительно содержащий 0,5% Твин 20 (ТБР-Тв). Разрезают мембрану на 2 половины посередине центральной дорожки, содержащей полосы белков из предокрашенного маркера. Каждую половину инкубируют течение 1 часа при температуре 37°С в растворе МКА гибридомы Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 с концентрацией 1 мкг/мл или в растворе поликлональных антител Н00005624-В01 (AbNova, Германия) в рекомендуемом производителем антител разведении. После трехкратной промывки раствором ТБР-Тв мембраны объединяют и инкубируют с раствором антивидовых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma, США), разведение 1/5000. После этого мембраны 5 раз промывают раствором ТБР-Тв и наносят раствор люминисцентного субстрата (2,5 мМ кумаровой кислоты, 1,2% диметилсульфоксида, 1,25 мМ люминола, 0,1М Трис - НСl, рН 8.5), заворачивают в полиэтиленовую пленку и делают отпечатки на фотопленке для рентгенографии с выдержками в диапазоне от 1 до 20 минут.To test the specificity of the MCA of the Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3 hybridoma to human protein C, Laemmli electrophoresis was performed on 10% polyacrylamide gel (PAG) for 2 hours at 180 V, 20 mA under reducing and non-reducing conditions. The antigen source is a 300-fold concentrate of serum-free culture medium, conditioned for 4 days on a cell line of DG-CID-PROC-1-producer of human protein C, a positive control is purified activated protein C, a negative control is a 300-fold concentrate of serum-free culture medium conditioned cell line CHO DG 44 (parent for the DG-CID-PROC-1 line that does not contain transgenes). Samples of the conditioned medium were applied in an amount of 10 μg of total protein per lane, positive control - 100 ng of protein per lane. Each of the samples is applied in two tracks, on the right and left halves of the gel, a pre-painted molecular weight marker is applied to the central track. After electrophoretic separation is complete, proteins are transferred from PAG to the Hybond-C Extra nitrocellulose membrane (GE LifeSciences, USA) for 2 hours at a current strength of 70 mA using a semi-dry transfer apparatus. After the transfer is complete, the membrane is blocked in a 1% BSA solution in a Tris-buffered solution (TBR, composition: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) for 1 h at room temperature. For washing the membranes and diluting the solutions of antibodies using TBR, additionally containing 0.5% Tween 20 (TBR-TV). The membrane is cut into 2 halves in the middle of the central track containing protein bands from the pre-stained marker. Each half is incubated for 1 hour at 37 ° C in a solution of Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3 hybridoma MCA with a concentration of 1 μg / ml or in a solution of polyclonal antibodies H00005624-B01 (AbNova, Germany) in a dilution recommended by the manufacturer of antibodies . After washing with the TBR-TB solution three times, the membranes are combined and incubated with a solution of antispecies antibodies conjugated to horseradish peroxidase (Sigma, USA), 1/5000 dilution. After this, the membranes are washed 5 times with a TBR-TB solution and a solution of a luminescent substrate (2.5 mM coumaric acid, 1.2% dimethyl sulfoxide, 1.25 mM luminol, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5) is applied, wrapped in a plastic film and make prints on a film for radiography with shutter speeds in the range from 1 to 20 minutes.

Было установлено, что МКА, продуцируемые гибридомой Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/А3 дают одну полосу взаимодействия с очищенным активированным протеином С, одну полосу взаимодействия с интактным рекомбинантным протеином С в составе кондиционированной культуральной среды и не дают полос взаимодействия с белками контрольной кондиционированной культуральной смеси. Положение и относительная яркость полос сходны для исследуемых МКА и контрольных поликлональных антител к протеину С.It was found that MCAs produced by the Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3 hybridoma produce one interaction band with purified activated protein C, one interaction band with intact recombinant protein C in the conditioned culture medium and do not give interaction bands with control proteins conditioned culture mixture. The position and relative brightness of the bands are similar for the studied MCAs and control polyclonal antibodies to protein C.

Моноклональные антитела штамма гибридомы Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 специфичны к протеину С человека.Monoclonal antibodies of the Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3 hybridoma strain are specific for human protein C.

Пример 5. Получение иммуносорбента на основе МКА 15/А3 и определение его основных свойствExample 5. Obtaining immunosorbent based on MCA 15 / A3 and determination of its main properties

Для исследуемого МКА Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 проводили отделение глобулиновой фракции, аффинную хроматографическую очистку при помощи протеин G-сефарозы и обессоливание диализом. Для этого культуральную жидкость (72 ч культивирования) смешивали с насыщенным раствором сульфата аммония до 50% насыщения. Суспензию перемешивали и выдерживали 2 ч при температуре 4°С, а затем центрифугировали при 14500 м^-1 в течение 20 мин. Удаляли супернатант, осадок растворяли в ФБР, 1/8 начального объема, отделяли осадок денатурированных белков повторным центрифугированием. Полученный супернатант повторно осаждали сульфатом аммония при насыщении 50%, осаждение-растворение повторяли дважды.For the studied MCA Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3, the globulin fraction was separated, affinity chromatographic purification using protein G-sepharose and desalination by dialysis were performed. For this, the culture fluid (72 h of cultivation) was mixed with a saturated solution of ammonium sulfate to 50% saturation. The suspension was stirred and kept for 2 hours at 4 ° C, and then centrifuged at 14500 m ^-1 for 20 minutes. The supernatant was removed, the precipitate was dissolved in PBS, 1/8 of the initial volume, the denatured protein precipitate was separated by repeated centrifugation. The resulting supernatant was re-precipitated with ammonium sulfate at a saturation of 50%, precipitation-dissolution was repeated twice.

Хроматографическую очистку проводили при помощи колонки объемом 1 мл HiTrap Protein G (GE LifeSciences, США) по протоколу производителя. Для удаления аминосодержащих соединений нейтрализованный Трис-основанием элюат с колонки концентрировали при помощи ультрафильтрации в центрифужных пробирках Vivaspin 10 кДа (Сарториус Стедим, Германия) до объема 750 мкл, концентрат диализовали против ФБР на мембране с отсечением по седиментационной массе 7000 Да в течение 24 ч при температуре 4°С. Был получен препарат очищенного МКА с концентрацией белка в растворе 310 мкг/мл, объем образца 750 мкл. Степень концентрирования относительно исходной среды составила 400х.Chromatographic purification was performed using a 1 ml HiTrap Protein G column (GE LifeSciences, USA) according to the manufacturer's protocol. To remove amine-containing compounds, the Tris-base-neutralized eluate from the column was concentrated by ultrafiltration in 10 kDa Vivaspin centrifuge tubes (Sartorius Stedim, Germany) to a volume of 750 μl, the concentrate was dialyzed against the FBI on a membrane with a sedimentation cut-off of 7000 Da for 24 hours at temperature 4 ° С. A preparation of purified MCA was obtained with a protein concentration of 310 μg / ml in solution, and a sample volume of 750 μl. The degree of concentration relative to the starting medium was 400x.

Для иммобилизации очищенного МКА Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3 использовали сорбент с амино-реактивными привитыми группами N-гидроксисукцинимида NHS-activated Sepharose 4 FF (GE LifeSciences, США), процедуру иммобилизации проводили по протоколу производителя сорбента, используя соотношение 200 мкг белка на 1 мл сорбента. Доля иммобилизованных антител после инкубации раствора антител с сорбентом в течение 4 ч при комнатной температуре составила более 90% по данным измерения концентрации белка в растворе. Сорбент упаковывали в хроматографическую колонку объемом 1 мл и проводили инактивацию остаточных N-гидроксисукцинимидных групп пропусканием раствора 0,1 М Трис-НСl рН 8,0 в течение 10 мин. Проводили элюцию нековалентно адсорбированных антител последовательными промывками растворами 0,1 М ацетата натрия, 0,5 M NaCl, pH 4 и 0,1 М этаноламина, рН 8,5. Колонку промывали 20% этанолом до полного удаления солей и хранили при температуре +4°С.To immobilize purified MCA Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3, a sorbent with amino-reactive grafted groups of N-hydroxysuccinimide NHS-activated Sepharose 4 FF (GE LifeSciences, USA) was used; the immobilization procedure was carried out according to the protocol of the sorbent manufacturer using a ratio of 200 μg of protein per 1 ml of sorbent. The fraction of immobilized antibodies after incubation of the antibody solution with the sorbent for 4 hours at room temperature was more than 90% according to the measurement of protein concentration in the solution. The sorbent was packed in a 1 ml chromatographic column and the residual N-hydroxysuccinimide groups were inactivated by passing a solution of 0.1 M Tris-Hcl pH 8.0 for 10 min. Non-covalently adsorbed antibodies were eluted by successive washing with solutions of 0.1 M sodium acetate, 0.5 M NaCl, pH 4 and 0.1 M ethanolamine, pH 8.5. The column was washed with 20% ethanol until the salts were completely removed and stored at + 4 ° C.

Для определения рабочих свойств полученного иммуносорбента проводили адсорбцию рекомбинантного протеина С из нефракционированной кондиционированной среды и последующую элюцию. Для этого к 10 мл кондиционированной культуральной среды, содержащей около 2 мкг/мл рекомбинантного протеина С по данным ИФА, добавляли СаСl₂ до конечной концентрации 20 мМ. Колонку с иммуносорбентом уравновешивали раствором 20 мМ Трис-НСl рН 7,5, 150 мМ NaCl, 20 мМ CaCl₂. Наносили на колонку 10 мл подготовленной среды на скорости 0,1 мл/мин (время контакта - 10 мин), фракцию проскока собирали. Концентрация протеина С в проскоке составила менее 0,1 мкг/мл по данным ИФА. После нанесения образца колонку промывали 20 мл раствора 20 мМ Трис-НСl рН 7,5, 1 М NaCl, 20 мМ CaCl₂ на скорости 1 мл/мин и проводили элюцию протеина С раствором 20 мМ Трис-НСl рН 7,5, 20 мМ Na-ЭДТА, 0,1% Твин-80. Было собрано 2,2 мл раствора элюированного белка, содержащего суммарно 12 мкг протеина С по данным ИФА. Таким образом, емкость полученного сорбента составила не менее 50 мкг целевого белка на 1 мг иммобилизованных антител, при этом чистота целевого белка после элюции составляла более 90% по данным денситометрии ДСН-ПААГ, при исходной доле целевого белка менее 2% от общего белка, измеренного по Брэдфорд.To determine the working properties of the obtained immunosorbent, adsorption of recombinant protein C from unfractionated conditioned medium and subsequent elution were performed. To do this, to 10 ml of conditioned culture medium containing about 2 μg / ml of recombinant protein C according to ELISA, CaCl _{2 was} added to a final concentration of 20 mm. The immunosorbent column was equilibrated with a solution of 20 mM Tris-Hcl pH 7.5, 150 mM NaCl, 20 mM CaCl ₂ . Put on the column 10 ml of the prepared medium at a speed of 0.1 ml / min (contact time - 10 min), the breakthrough fraction was collected. The concentration of protein C in the breakthrough was less than 0.1 μg / ml according to ELISA. After applying the sample, the column was washed with 20 ml of a solution of 20 mM Tris-Hcl pH 7.5, 1 M NaCl, 20 mM CaCl ₂ at a speed of 1 ml / min, and protein C was eluted with a solution of 20 mM Tris-Hcl pH 7.5, 20 mM Na-EDTA, 0.1% Tween-80. 2.2 ml of a solution of eluted protein was collected, containing a total of 12 μg of protein C according to ELISA. Thus, the capacity of the obtained sorbent was at least 50 μg of the target protein per 1 mg of immobilized antibodies, while the purity of the target protein after elution was more than 90% according to SDS-PAGE densitometry, with the initial fraction of the target protein less than 2% of the total protein measured by Bradford.

Эти свойства клонального штамма Sp2/0Ag14-SpBcG/APC-15/A3, а также взаимодействие его МКА с протеином С человека свидетельствует о возможности использования заявляемых МКА в качестве лиганда для получения иммуносорбента.These properties of the clonal strain Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3, as well as the interaction of its MCA with human protein C, indicate the possibility of using the inventive MCA as a ligand to obtain an immunosorbent.

Claims

1. The strain of hybrid cultured animal cells Mus musculus Sp2 / 0Ag14-SpBcG / APC-15 / A3 - producer of monoclonal antibodies specific for human protein C that binds antigen in the presence of calcium ions and does not bind in the presence of chelating agents, deposited in the Russian Culture Collection Vertebrate cells of the Institute of Cytology RAS, registration number No. 733 (D).

2. A monoclonal antibody specific for human protein C binding an antigen in the presence of calcium ions and not binding it in the presence of chelating agents, obtained by culturing the strain according to claim 1 in a nutrient medium and isolating it from the culture fluid.

3. An immunosorbent for sorption of human protein C, containing the monoclonal antibody covalently linked to it according to claim 2.