RU2360000C2

RU2360000C2 - Аптамеры на основе днк для катепсина g человека

Info

Publication number: RU2360000C2
Application number: RU2006102521/13A
Authority: RU
Inventors: Манлио Палумбо (IT); Манлио ПАЛУМБО; Барбара ГАТТО (IT); Барбара ГАТТО; Родольфо ПЕСКАДОР (IT); Родольфо ПЕСКАДОР; Роберто ПОРТА (IT); Роберто ПОРТА; Лаура Ирис ФЕРРО (IT); Лаура Ирис Ферро
Original assignee: Джентиум Спа
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2004-06-18
Publication date: 2009-06-27
Also published as: IL172407A0; EP2236609A3; ZA200510093B; CN1816625A; MXPA05013800A; US7838506B2; RS20050955A; AU2004254014B2; EP1493810A1; BRPI0412081A; KR20060035624A; EP2236609A2; CA2528686A1; JP2011078414A; NO20060429L; IS8176A; RU2006102521A; EP1618196A2; US20080176814A1; US20060148745A1

Abstract

Изобретение относится к идентификации непептидных ингибиторов катепсина G. Данные вещества непосредственно ингибируют биологические функции белка-мишени. Катепсин G-ингибирующие аптамеры состоят из линейных ДНК-последовательностей или полинуклеотидных последовательностей, имеющих длину цепи по меньшей мере 60 нуклеотидов и не подвергаемых эффективному спариванию оснований. Предлагаемые аптамеры характеризуются высокой селективностью и могут быть использованы при лечении и профилактике воспалительных процессов и прокоагулянтных состояний. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

Description

Уровень техники

Катепсин G является сериновой протеазой, обычно обнаруживаемой в азурофильных гранулах нейтрофилов и моноцитов. Вместе с эластазой и протеиназой 3 он принадлежит к семейству химотрипсинов и расщепляет белки экстрацеллюлярного (внеклеточного) матрикса, такие как эластин, коллаген, фибронектин и ламинин, вызывая обширное повреждение ткани легких у животного.

Катепсин G играет также роль в свертывании крови; действительно, он участвует в альтернативном пути инициации коагуляции лейкоцитов и посредством активации фактора коагуляции Х и фактора V может расщеплять и потенциально модулировать рецептор тромбина, и он может активировать тромбоциты in vitro. Он способен также превращать ангиотензин I в ангиотензин II только минорным расщеплением, происходящим где-нибудь в другом месте в этой молекуле.

Было показано, что катепсин G убивает бактерии и грибы, но это свойство не связано с его активностью, на самом деле, пептиды, полученные при его расщеплении, обнаруживали прямые антимикробные действия. Он может также разрушать некротические ткани и, следовательно, связан с несколькими воспалительными заболеваниями, такими как эмфизема легких, бронхит, муковисцитоз и псориаз.

Ферментативная активность катепсина G регулируется двумя типами ингибиторов протеиназ белков: так называемыми «каноническими» ингибиторами и серпинами. Первые являются относительно малыми белками (29-190 аминокислот) и прочно связывающими обратимыми ингибиторами; среди них находятся ингибитор протеиназы Mucus (MPI), эглин С и апротинин. Серпины являются более крупными белками (400-450 остатков), которые образуют необратимый комплекс с их родственным белком вследствие образования негидролизуемой ацильной связи между каталитическим сайтом катепсина G и петлей их реактивного сайта. Среди серпинов наиболее важным является 1-антихимотрипсин: ингибиторы этого семейства не являются селективными, так как они способны связываться с другими химотрипсинами и ингибировать другие химотрипсины. Кроме того, их стабильность и распределение in vivo определяются их пептидной природой.

Были обнаружены несколько синтетических ингибиторов, прежде всего пептидомиметических скелетов молекул, содержащих 1,1-диоксид 1,2,5-тиадиазолидин-3-она или 1,3-диазетидин-2,4-дионы, и некоторые из них (в частности, имеющие ароматические боковые цепи) обнаруживали явную специфическую активность в отношении катепсина G. Однако они образуют необратимые ацильные комплексы с этим ферментом.

Недавно было показано, что как полноразмерная, так и расщепленная хромосомная ДНК способна связывать и ингибировать катепсин G in vitro и in vivo. ДНК-фрагмент 30 п.н. прочно связывает катепсин G при физиологических условиях, и он обнаруживал уменьшающийся порядок аффинности в отношении эластазы нейтрофилов человека при сравнении с протеиназой 3 в соответствии с их уменьшающимся катионным характером.

В частности, ЕР-775745 описывает олигонуклеотидные катепсин G-ингибирующие аптамеры, имеющие длину цепи приблизительно 40 нуклеотидов (и во всяком случае, меньшую, чем 55 нуклеотидов) и содержащие повторяющиеся единицы G-пар, которые применимы в лечении и профилактике воспалительных заболеваний и прокоагулянтных состояний.

Описание изобретения

Данное изобретение в основном относится к идентификации непептидных ингибиторов катепсина G, которые характеризуются высокими уровнями селективности и которые, следовательно, могут быть более эффективно использованы в лечении и профилактике вышеупомянутых состояний, а также в лечении и профилактике генетических заболеваний, дегенеративных заболеваний, повреждений ДНК, неоплазии и/или кожных заболеваний.

Подобно антителам молекулы ДНК способны допускать различные трехмерные структуры в зависимости от их последовательности. Некоторые из них могут иметь значение для связывания с мишенью. В данном исследовании авторы использовали способ SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) (Систематическое развитие лигандов посредством экспоненциального обогащения) для отбора и идентификации молекул одноцепочечных молекул ДНК или РНК, называемых аптамерами, проявляющих высокую аффинность в отношении катепсина G.

Технология аптамеров объединяет генерирование огромного структурного разнообразия в случайных пулах олигонуклеотидов с мощностью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации отобранных последовательностей. Эта технология включает в себя скрининг большого пула со случайными последовательностями олигонуклеотидов и основана на том факте, что они допускают большое количество третичных структур, некоторые из которых могут обладать желаемой связывающей или каталитической активностью против молекул-мишеней.

Хотя ингибирование не является необходимым для этого отбора, во многих случаях эти лиганды непосредственно ингибируют биологические функции белков-мишеней. В этих случаях ингибиторные функции этих лигандов предположительно обусловлены перекрыванием их сайтов связывания с функциональным районом белков.

Результат исследования авторов привел их к определению нового класса катепсин G-ингибирующих аптамеров, обладающих особенно высокими уровнями селективности.

Новые катепсин G-ингибирующие аптамеры данного изобретения являются одно- или двухцепочечными линейными ДНК-последовательностями или полинуклеотидными последовательностями, характеризующимися тем, что они имеют длину цепи по меньшей мере 60 нуклеотидов, предпочтительно 70 нуклеотидов и по существу не подвергаются межмолекулярному и/или внутримолекулярному спариванию.

Согласно наилучшему варианту осуществления данного изобретения эти ДНК-последовательности могут иметь длину цепи 70-120 нуклеотидов, предпочтительно 70-110 нуклеотидов, даже более предпочтительно 80-100 нуклеотидов. Хотя последовательности данного изобретения могут быть одно- или двухцепочечными, предпочтительными являются одноцепочечные последовательности. Последовательности по данному изобретению характеризуются также предпочтительно тем, что они имеют молярное содержание гуанина приблизительно 25-50%, предпочтительно 35-45% и/или имеют молярное отношение AG/TC приблизительно 1,0-2,0, предпочтительно 1,2-1,8 (для целей данного изобретения AG обозначает общее число нуклеотидов A и G этой последовательности, тогда как ТС обозначает общее число нуклеотидов Т и С этой последовательности).

Предпочтительными вариантами осуществления данного изобретения являются:

олигомеры (GT)_n или (AC)_n, в которых n находится в диапазоне 35-60, предпочтительно 40-50;

гомополимеры (T)_n, или (G)_n, или (A)_n, или (С)_n, или (инозин)_n, в которых n находится в диапазоне 70-120, предпочтительно 80-100.

В терминах данного изобретения выражение «по существу не подвергаются межмолекулярному и/или внутримолекулярному спариванию» обозначает, что эти ДНК-последовательности или полинуклеотидные последовательности не подвергаются межмолекулярному и/или внутримолекулярному спариванию до степени, более высокой, чем 20%, предпочтительно, чем 10%, еще более предпочтительно, чем 5%, как при строгих, так и не при строгих условиях. Такой результат является прямым следствием их структуры, поскольку

они имеют молярное отношение AG/TC приблизительно 1,0-2,0; или

они являются олигомерами (GT)_n или (AC)_n, в которых n является более высоким, чем 30; или

они являются гомополимерами (T)_n, или (G)_n, или (A)_n, или (С)_n, или (инозин)_n, в которых n является более высоким, чем 60;

что de facto предотвращает любой тип гибридизации.

Как будет очевидно из следующего обсуждения, аптамеры в соответствии с данным изобретением действительно селективно и эффективно ингибируют катепсин G, и, следовательно, они могут быть использованы в приготовлении лекарственного средства для лечения и профилактики воспалительных заболеваний, прокоагулянтных состояний, генетических заболеваний, дегенеративных заболеваний, повреждений ДНК, неоплазии и/или кожных заболеваний, которое представляет собой, следовательно, предмет данного изобретения. Другой предмет данного изобретения представлен также фармацевтической композицией, содержащей катепсин G-ингибирующие аптамеры данного изобретения вместе с обычными эксципиентами и/или адъювантами. Другие предметы данного изобретения могут быть представлены катепсин G-ингибирующими аптамерами, выбранными из катепсин G-ингибирующих аптамеров, представленных в списке последовательностей (т.е. SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:18).

Экспериментальный раздел

Материалы

Катепсин G покупали в фирмах Europa Bioproducts или Calbiochem. Все олигонуклеотиды получали из Eurogentec Bel SA (Belgium) и очищали электрофорезом в ПААГ перед использованием. Некоторые олигонуклеотиды, уже очищенные электрофорезом в ПААГ, получали из Gibco BRL Custom Primers. Полимераза Taq была получена из Pharmacia Amersham Biotech, тогда как dNTP получали в виде натриевой соли из Boehringer Mannheim. Т4-полинуклеотидкиназа, лигаза и рестрикционные ферменты были получены из Gibco Life Technologies. Для минипреп-очистки использовали наборы Qiagen, а секвенирование выполняли с использованием секвеназы Т7 (Pharmacia Amersham Biotech) и [гамма-³³Р]dATP (Nen Life Sciences).

Библиотека одноцепочечных ДНК (ssDNA)

Синтезированный случайным образом пул имеет длину 96 оснований, центральная часть этой молекулы имеет рандомизированный район, который фланкирован двумя константными районами для амплификации, клонирования и секвенирования: его последовательность представляет собой 5'-CGTACGGAATTCGCTAGC(N)₆₀ GGATCCGAGCTCCACGTG-3'. Неподчеркнутые последовательности относятся к сайтам рестрикции для ферментов EcoRI и BamHI соответственно.

Этот пул амплифицировали ПЦР с использованием прямого праймера II-up с последовательностью 5'-CGTACGGAATTCGCTAGC-3' и обратного праймера III-down 5'-Biot-CACGTCGAGCTCGGATCC-3', который биотинилирован на 5'-конце для связывания со стрептавидиновой колонкой для получения одноцепочечной ДНК.

Протокол отбора

Исходный случайный пул радиоактивно метили ³²Р, денатурировали при высокой температуре и инкубировали с катепсином G в буфере для инкубирования (буфере IB: 30 мМ Трис-HCl рН 7,5, 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl и 5 мМ MgCl₂), который является близким физиологическим условиям.

Инкубирование проводили в течение 90 минут на льду, затем эту пробу наносили на мини-колонку аффинной хроматографии, наполненную Сефарозой SP (Amersham Pharmacia Biotech), подвергнутой набуханию и уравновешенной в буфере IB. Раствор ssDNA/белок инкубировали с этой смолой в течение 30 минут при 4°С. Несвязавшиеся олигонуклеотидные молекулы вымывали буфером IB, тогда как оставшиеся, более селективные олигонуклеотидные молекулы элюировали из колонки буфером для элюции с высокой ионной силой (буфером ЕВ: 0,8 М NaCl и 50 мМ Трис рН 7,8).

Объемы промывок модифицировали во время отбора для увеличения строгости, также как и концентрацию ДНК, которая вдвое превышала концентрацию белка в первом цикле, но прогрессирующим образом уменьшалась.

Фракции считали (т.е. определяли их радиоактивность) и выход этого цикла отбора выражали в виде процента общей радиоактивности. Проходящую через колонку часть и первые две промывки EB собирали и амплифицировали.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразную цепную реакцию выполняли с использованием полимеразы Taq при концентрации 0,3-0,5 единиц/50 мкл в буфере, указанном изготовителем. Число циклов корректировали после каждого отдельного отбора.

Перед встраиванием в плазмидный вектор для клонирования эту ДНК подвергали реакции шлифовки для получения тупых концов: аликвоту обычной ПЦР-реакции инкубировали с 2,5 единиц/мкл Pfu Turbo Polymerase (Stratagene) в рекомендуемом буфере при 72°С в течение 30 минут.

Генерирование ssDNA

Для получения одноцепочечной ДНК (ssDNA) из амплифицированной двухцепочечной ДНК (dsDNA) авторы изобретения использовали протокол щелочной денатурации. Эту ДНК амплифицировали с использованием биотинилированного праймера Down-II и связывали с хроматографической колонкой, наполненной стрептавидин-сефарозой (Pierce). После 30 минут инкубации несвязанную dsDNA вымывали буфером, содержащим 50 мМ NaCl, 100 мМ Трис/HCl, 10 мМ ЭДТА (SBB - стрептавидинсвязывающим буфером), тогда как остальную dsDNA денатурировали и промывали 0,15 н. NaOH. Затем ее осаждали и собирали для циклов отбора.

Клонирование и секвенирование

Как амплифицированную dsDNA, так и вектор pUC19 (Amersham Pharmacia Biotech) обрабатывали 2,5 единиц EcoRI, тогда как только плазмиду обрабатывали SmaI, которая дает тупые концы.

После осаждения 3 пмоль dsDNA и 0,6 пмоль pUC19 реагировали с Т4-лигазой в рекомендуемом буфере.

Затем эту плазмиду инокулировали в компетентные клетки E.coli (штамм SURE Stratagene) способом электропорации с использованием устройства импульсной подачи для E.coli (Biorad) и клетки высевали в твердую LB-среду в присутствии ампициллина, X-Gal и IPTG (для скрининга синей/белой окраски). 50 белых различных колоний выскребали, выращивали и собирали раздельно в жидком бульоне LB (Луриа-Бертани). Плазмиды очищали посредством щелочного лизиса и их качество каждый раз испытывали электрофорезом в агарозном геле.

Последовательность аптамеров определяли по способу Сэнгера, с мечением [гамма-³³Р]dATP и использованием двух различных праймеров EleA457: 5'-ACG-CCA-AGC-TTG-CAT-3' (смыслового) и Ele S: 5'-GGG-TTT-TCC-CAG-TCA-CGA-3' (антисмыслового).

Определение Kd и Ki

Аффинность олигонуклеотидов определяли аффинной хроматографией, как и в случае отбора. Различные аликвоты каждого олигонуклеотида предварительно инкубировали с 15 мкг катепсина G на льду. Затем этот раствор наносили на мини-хроматографическую колонку, используемую для отбора, и промывали 15 объемами буфера IB. После одного часа инкубации ее промывали шестью объемами буфера ЕВ. Фракции тех же самых объемов собирали и считали (определяли радиоактивность).

Эксперименты с использованием резонанса поверхностных плазмонов

Катепсин G, из нейтрофилов человека, растворенный в HBS EP-буфере, рН 7,40 (Biacore), иммобилизовали на поверхности проточной ячейки, являющейся сенсорным чипом категории исследований СМ 5, в соответствии с процедурой, предлагаемой Biocore, и с использованием набора Biocore для связывания амина. Контрольную проточную ячейку получали с использованием всех вышеуказанных реагентов, кроме катепсина G. Количество катепсина G, иммобилизованного на поверхности проточной ячейки, было 5178,91 ± 129,63 RU (относительных единиц).

Аптамеры [поли GT (длина цепи: 20, 30, 40, 60, 80 и 100) и поли АС (длина цепи: 20, 40 и 80)] растворяли в 30 мМ Трис-HCl-буфере, рН 7,50, 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl и 5 мМ MgCl₂ и инжектировали на поверхность катепсина G или на контрольную поверхность. Проводили три серии экспериментов. Первую при концентрации 500 мкг/л для всех аптамеров, вторую при концентрации 6595 мкг/л для всех аптамеров и третью при концентрациях в диапазоне 15,6-8000 нМ в соответствии с испытуемым аптамером. Все вышеуказанные эксперименты проводили при 25°С с использованием в качестве рабочего буфера HBS EP-буфера Biacore, рН 7,40. Поверхность катепсина G регенерировали двумя инжекциями 2 М NaCl. Контрольную сенсограмму вычитали из сенсограммы каждой пробы и оценивали реакцию связывания. Реакции связывания, генерированные в третьей серии экспериментов, строили в виде графика как функцию Log-концентрации (нМ) для получения кривых концентрация-эффект для нахождения относительных активностей аптамеров в связывании катепсина G из нейтрофилов человека.

Результаты

Отбор и идентификация аптамеров

Авторы изобретения проводили отбор на катепсин G сначала из ДНК-пула с рандомизированным районом из 60 нуклеотидов, фланкированным двумя районами с консервативной последовательностью для ПЦР-реакции и сайтами рестрикции для последующей стадии клонирования (см. выше).

Авторы изобретения выбрали в качестве способа отбора аффинную хроматографию с использованием связывания этого белка со смолой. Этот способ является, по-видимому, самым легким, так как катепсин G, который является положительно заряженным при физиологических условиях (теоретическая изоэлектрическая точка 11) может прочно связываться с ионообменной смолой, тогда как неспецифическое связывание молекул ДНК со смолой в значительной степени уменьшается. Фактически только молекулы ДНК, которые узнают этот белок, остаются на колонке, в то время как несвязанный материал вымывается. Авторы изобретения пытались сделать процесс связывания между меченой ssDNA и белком более селективным посредством включения 5 мМ хлорида калия и магния в буфер для связывания, увеличивая таким образом ионную силу в этом буфере и стабилизируя укладку олигонуклеотидов.

Затем отобранные молекулы эффективно удаляли из колонки вместе со связанным белком, с использованием буфера высокой ионной силы (буфера ЕВ) и затем оценивали радиоактивность. Затем собирали первые две фракции и проходящую через колонку фракцию, амплифицировали при помощи ПЦР и уменьшали до одноцепочечных молекул для использования в следующем цикле (в отношении подробностей см. раздел способов).

Авторы изобретения выполняли девять циклов отбора: после четырех циклов наблюдали значительное увеличение выхода, но SELEX заканчивали, когда не наблюдали дополнительного увеличения аффинности пула на протяжении трех раундов, с получением конечного выхода 42% (таблица). Строгость отбора увеличивали изменением количества и объемов промывок. После циклов 5 и 7 выполняли предколоночные циклы во избежание неспецифического связывания аптамеров со смолой; пул, полученный из предварительного цикла, наносили в колонку без белка; затем первые фракции, элюированные из этой колонки, амплифицировали и использовали для следующего цикла.

Таблица Схема циклов SELEX
Количество циклов	Белок, мкг	Объем колонки, мкг	Фракция промывок	Выход цикла, %
1	100	2000	8×1000 мкм	0,4
2	50	500	8×500 мкм	0,7
3	50	400	8×600 мкм	1,6
4	50	400	8×500 мкм	38
5	40	1000	9×1000 мкм	22
Предколоночный цикл		1000	10×250 мкм
6	33	1000	20×250 мкм	22
7	30	500	23×500 мкм	21
Предколоночный цикл		300	10×200 мкм
8	30	500	22×500 мкм	31
9	30	500	25×500 мкм	42

Анализ последовательности

Отобранные молекулы клонировали в клетках E.coli, как описано в экспериментальном разделе, и секвенировали. Авторы обнаружили 19 различных последовательностей из 50 клонов. Авторы использовали две программы сопоставления последовательностей, Clustal W и FastA-align, проводящие поиск на повторяемый консенсусный мотив, но разнообразие молекул было слишком высоким, чтобы получать хорошее сопоставление, даже в подсериях секвенированных молекул. Дополнительный анализ показал, что GT-мотивы явно повторяются в 14 последовательностях. Кроме того, более внимательное рассмотрение этих молекул показало, что они не склонны подвергаться ни межмолекулярному, ни внутримолекулярному спариванию до допускаемой степени, и они не могут образовывать сложные трехмерные структуры, подобные G-квартетам. По-видимому, этот отбор привел к неструктурированным, линейным и гибким молекулам, которые могут прочно связываться с положительно заряженным белком вследствие взаимодействия зарядов. Для подтверждения этой гипотезы авторы изобретения сравнивали аффинность одного из выбранных аптамеров, 60-мера CG51, с другими олигонуклеотидами, имеющими неспаривающиеся последовательности, такими как структуры олиго GT или АС. Последовательности олигонуклеотидов, происходящих из последнего цикла отбора, сообщены здесь ниже; каждая из них маркирована отличающимся номером (CG51 и CG43 являются одинаковыми).

Вышеуказанные последовательности имеют следующую аналогию в списке последовательностей: CG1 = SEQ ID NO:1, CG3 = SEQ ID NO:2, CG11 = SEQ ID NO:3, CG16 = SEQ ID NO:4, CG20 = SEQ ID NO:5, CG25 = SEQ ID NO:6, CG28 = SEQ ID NO:7, CG32 = SEQ ID NO:8, CG39 = SEQ ID NO:9, CG43 (и CG51) = SEQ ID NO:10, CG48 = SEQ ID NO:11, CG49 = SEQ ID NO:12, CG2 = SEQ ID NO:13, CG31 = SEQ ID NO:14, CG23 = SEQ ID NO:15, CG34 = SEQ ID NO:16, CG45 = SEQ ID NO:17, CG40 = SEQ ID NO:18.

Аффинность выбранных молекул и родственные последовательности относительно катепсина G

Авторы данного изобретения оценивали связывание этих олигонуклеотидов с катепсином G аффинной хроматографией аналогично способу отбора. Аффинность аптамера CG51 сначала сравнивали с АС- и GT-олигонуклеотидами той же самой длины, которая, как упоминалось, явно не способна укладываться в любую структуру, характеризующуюся образованием пар оснований Уотсона-Крика или G-квартетов. Комплементарную последовательность CG51, названную cmpCG51, включали в качестве контроля. Кроме того, для демонстрации, являлась ли длина олигонуклеотида важным фактором в связывании с этим белком, измеряли аффинность АС- и GT-олигонуклеотидов, более длинных и более коротких, чем 60 нуклеотидов.

Как и ожидалось на основании высокого выхода SELEX, выбранный CG51 обнаруживал высокую аффинность в отношении катепсина G (Kd 0,9 нМ). Кроме того, его Kd была сравнима с Kd АС- и GT-олигонуклеотидов той же самой длины (Kd 0,8 нМ и 1 нМ соответственно) и cmpCG51 (Kd 0,6 нМ) (фиг. 1). Эти данные указывают на то, что гипотеза авторов данного изобретения о плотном связывании неструктурированными и гибкими молекулами была правильной.

Молекулы, более длинные, чем подобные 60-мерам (АС)₆₀ и (GT)₆₀, которые являются соответственно 120-мером и 80-мером, обнаруживали аффинность 1,2 нМ. С другой стороны, более короткие (GT)₃₀ и (GT)₁₀, которые являются более короткими молекулами, имеют Kd 1,5 нМ и 2 нМ соответственно, что предполагает, что длина выбранных олигонуклеотидов важна для обеспечения эффективного связывания.

Аптамер THR, который был отобран в отношении тромбина, также был включен в качестве контроля для подтверждения, важна ли структура олигонуклеотида для связывания катепсина. Известно, что этот аптамер образует стабильные квартеты G. Низкая Kd (4 нМ), обнаруженная в этом случае, показывает, что этот тип структуры вряд ли представляет эффективный мотив узнавания.

Интересно, что двухцепочечный CG51 обнаруживал аффинность, более низкую, чем одноцепочечный, даже если последний несет большее число заряженных групп. Действительно, двухцепочечный олигонуклеотид является более громоздким и негибким и, следовательно, неспособным к оптимальному связыванию этого белка.

Эксперименты с использованием резонанса поверхностных плазмонов (SPR)

Результаты, полученные в первой серии экспериментов (каждый аптамер при 500 нМ), давали первое доказательство того, что, например, в случае GT-аптамеров увеличение длины цепи выше 60 нуклеотидов приводит к увеличению связывания, но это увеличение является менее крутым, чем увеличение в диапазоне 30-60. Связывание является слабым в диапазоне 20-30. В случае АС-аптамеров их связывание является менее выраженным, чем связывание GT-аптамеров. SPR-реакция связана с изменением поверхностной концентрации по массе аналита (в данном случае аптамера), и, следовательно, она зависит от молекулярной массы аналита относительно количества сайтов связывания на этой поверхности (полученной из катепсина G в данном случае). Для устранения сомнения, что видимое связывание аптамера зависело не от массы аптамера, а именно от структурных признаков аптамера, вторую серию экспериментов проводили при одной и той же концентрации по массе (каждый аптамер при 6595 мкг/л). Результаты были такими же, как и результаты, полученные в первой серии экспериментов (данные не приведены для краткости). На фигуре 2 суммированы кривые Log-концентрация-эффект GT- и АС-аптамеров. На этой фигуре приведены реакции только каждого аптамера со ссылкой на диапазон концентраций, на протяжении которого получали линейную регрессию. GT 100 является наиболее эффективным аптамером, и его эффективность была произвольно принята за единицу (относительный стандарт). GT 80 имеет относительную эффективность приблизительно 0,32, GT 60 приблизительно 0,144, АС 80 приблизительно 0,017, GT 40 приблизительно 0,016, АС 40 приблизительно 0,0047 и GT 30 приблизительно 0,0020. GT 20 и АС 20 не оценивали вследствие их низкого связывания. Аптамеры могут быть грубо подразделены на три семейства (фиг. 2); первое семейство: GT 100, GT 80 и GT 60;

второе семейство: АС 80, GT 40, АС 40 и GT 30; третье семейство: АС 20 и GT 20.

На фигуре 3 суммированы кривые Log-концентрация-эффект полиТ-аптамеров. Как можно видеть, полиТ100 и полиТ80, т.е. аптамеры, имеющие последовательность

(Т)₁₀₀ и (Т)₈₀ соответственно, являются гораздо более сильными, чем полиТ60.

Обсуждение

Только после четырех циклов отбора наблюдали огромное увеличение процента молекул, связанных с рассматриваемым белком, и в девятом цикле, соответствующем выходу 42%, было невозможно дополнительное обогащение этого пула. Однако анализ последовательности отобранных аптамеров не обнаруживал доказательства общего консенсусного мотива, повторяемого среди них. При более близком рассмотрении было обнаружено, что большое количество этих молекул были GT/С-недостаточными, следовательно, едва ли способными подвергаться спариванию и укладке в G-квартеты. Возможно, одноцепочечные ДНК-молекулы, отрицательно заряженные и гибкие, связываются с этим положительно заряженным белком наилучшим образом. Даже в присутствии значительных количеств хлорида натрия и магния в SELEX-буфере связывание между мишенью и этим белком могло бы все еще в основном управляться взаимодействиями зарядов.

Для подтверждения гипотезы специфического “консенсусного” логического обоснования аффинность одного из отобранных аптамеров, CG51, сравнивали с несколькими АС- и GT-олигонуклеотидами. Авторы данного изобретения подтвердили тот факт, что CG51 имеет удивительно высокую аффинность в отношении катепсина G с Kd в наномолярном диапазоне, что свидетельствует о том, что данный отбор эффективно привел к пулу эффективных связывающих молекул рассматриваемого белка. Константы диссоциации (АС)₃₀, (GT)₃₀ и cmpCG51, которые имеют такую же длину (и общие структурные характеристики), что и CG51, были сравнимыми, в то время как более короткие молекулы обнаруживали более низкую аффинность. Двухцепочечный CG51 обнаруживал более низкую аффинность в отношении катепсина G: это является очень интересным с учетом того, что было доказано, что хромосомная ДНК со средней длиной 30 п.н. способна связывать этот белок.

Авторы данного изобретения продемонстрировали, что линейная и гибкая одноцепочечная цепь ДНК с длиной по меньшей мере 60, предпочтительно более, чем 70-80, является более эффективной в связывании катепсина G, чем хромосомная копия, а также более эффективной, чем более короткие цепи ДНК.

Claims

1. Катепсин G-ингибирующие аптамеры, состоящие из линейных ДНК-последовательностей, имеющих длину цепи по меньшей мере 60 нуклеотидов, причем указанные последовательности являются олигополимерами (GT)_n, в которых n составляет по меньшей мере 30.

2. Катепсин G-ингибирующие аптамеры по п.1, характеризующиеся тем, что они имеют длину цепи 60-120 нуклеотидов.

3. Катепсин G-ингибирующие аптамеры по п.2, характеризующиеся тем, что они имеют длину цепи 70-110 нуклеотидов.

4. Катепсин G-ингибирующие аптамеры по п.3, характеризующиеся тем, что они имеют длину цепи 80-100 нуклеотидов.

5. Катепсин G-ингибирующие аптамеры по любому из пп.1-4, характеризующиеся тем, что они являются одноцепочечными последовательностями.

6. Катепсин G-ингибирующие аптамеры по любому из пп.1-4, характеризующиеся тем, что n находится в диапазоне 30-60.

7. Катепсин G-ингибирующие аптамеры по п.6, характеризующиеся тем, что n находится в диапазоне 35-60, предпочтительно в диапазоне 40-50.