KR100194284B1 - 한국산 지네로 부터 분리한 신규한 플라스미노젠 활성화단백질의 cDNA - Google Patents

Abstract

본 발명은 한국산 지네(Scolopendra subepinipes mutilans)로 부터 분리한 신규한 플라스미노젠 활성화 단백질(plasminogen activator)의 cDNA에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 834bp의 개방해독틀로 이루어진 한국산 지네 유래의 플라스민젠 활성화 단백질의 cDNA 및 그로 부터 번역되는 성숙단백질의 분자량이 약 25±1kDa인 플라스미노젠 활성화 단백질에 관한 것이다. 상기 플라스미노젠 활성화 단백질의 cDNA로 부터 번역되는 아미노산 서열 분석을 통해, 이 단백질이 전형적인 세린계 단백질 가수분해효소이며, tPA(tissue-type plasminogen activator) 또는 유로키나제 등과 같은 플라스미노젠 활성화 단백질들과 상당한 상동성(homology)을 갖고 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 제공되는 S-PA-Ⅱ cDNA는 재조합 대장균, 효모, 베큘로바이러스/곤충세포 및 동물세포에서 확립된 발현 시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 다량 생산된 S-PA-Ⅱ는 신규한 혈전치료제의 제조에 응용될 수 있다.

Description

한국산 지네로 부터 분리한 신규한 플라스미노젠 활성화 단백질 cDNA

본 발명은 한국산 지네(Scolopendra subepinipes mutilans)로 부터 분리한 신규한 플라스미노젠 활성화 단백질(plasminogen activator)의 cDNA에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 834bp의 개방해독틀로 이루어진 한국산 지네 유래의 플라스미노젠 활성화 단백질의 cDNA 및 그로 부터 번역되는 성숙단백질(mature protein)의 분자량이 약 25±1kDa인 플라스미노젠 활성화 단백질에 관한 것이다.

혈액내의 지혈 및 혈전용해계의 평형 상태가 복합적인 원인들에 의하여 균형을 잃었을 때, 혈관내에 혈전이 축적되고 그로 인하여 성인의 대표적인 사망 원인인 심근경색, 뇌일혈 및 폐색전증 등의 심혈관계 질환이 유발된다. 그리하여, 이러한 질환들을 예방 및 치료하기 위하여, 혈전의 축적을 방지하는 헤파린(heparin)류의 항응고제가 사용되어 왔으나, 이들은 이미 형성된 혈전을 용해시키지 않는다는 문제점이 있었다. 따라서, 혈전증 치료를 위한 또 다른 접근방법으로 피브린 용해계(fibrinolytic system)를 활성화시키는 플라스미노젠 활성화 단백질을 사용하여 혈액응고를 용해시키는 방법이 제시되었다.

한편, 피브린 용해계는 전효소(proenzymc)인 플라스미노젠이 플라스미노젠 활성화 단백질에 의해 플라스민으로 전환되고, 다시 이 플라스민은 피브린을 용해성 피브린 분해산물(fibrin degradation product)로 만드는 일련의 체계이다. 그러나, 플라스민은 비교적 기질 특이성이 적은 단백질 분해효소로서, 지혈에 필수적인 단백질(피브리노젠, 응고인자 Ⅴ 및 Ⅶ)과 세포외 기질(extracellular matrix)의 중요성분이 되는 단백질(피브로넥틴, 라미닌)을 분해시킬 수 있다. 더구나, 플라스민은 간질막(interstitial membrane)과 기저막(basement membrane)에 있는 콜라젠을 분해시킬 수 있는 비활성(inactive) 조직 콜라게나제(tissua collagenase)를 활성화시킨다. 이와 같이 플라스민의 용해능이 다양하므로, 혈전증 치료를 위해서는 피브린이 응고된 부위에만 한정적으로 플라스미노젠 활성을 나타내도록 함으로써, 혈전용해 치료시 플라스미네미아(plasminemia)를 야기시키지 않게 되어 출혈성 합병증이 일어나는 횟수 및 병이 악화되는 것을 아울러 방지할 수 있다.

종래의 급성 심근경색 환자를 위하여 사용되는 임상목적의 혈전용해제로서는 다음의 4종류가 시판되고 있다:스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), 애니졸화된(anisoylated) 플라스미노젠 스트렙토키나제 활성 복합체(APSAC) 및 조직형 플라스미노젠 활성화 단백질(tissue-type plasminogen activator:tPA).

이 중에서 스트렙토키나제, 유로키나제 및 APSAC는 피브린이 붙어있는 플라스미노젠 뿐만 아니라, 순환하고 있는 플라스미노젠을 활성화시켜, 전신출혈의 합병증을 수반하는 것으로 보고되고 있다. 또한, tPA는 피브린 표면의 플라스미노젠을 우선적으로 활성화시키나, 혈액내 반감기가 극히 짧아 혈전용해를 위해서는 다량의 tPA가 필요하고, 다량의 tPA 투여는 전술한 약제들과 마찬가지로 출혈을 유발시킬 수 있다는 문제점을 가지고 있었다.

따라서, 혈전에 대한 특이성이 개선되고, 혈액내에내서의 반감기가 더욱 연장된 새로운 치료제를 개발하고자, 종래 플라스미노젠 활성화 단백질을 변형시키거나, 새로운 원천으로 부터 더욱 효율적인 플라스미노젠 활성화 단백질을 색출하고자 하는 노력이 전세계적으로 있어 왔다.

그 결과, 자연계에 존재하는 생물, 예를 들면 흡혈박쥐 또는 뱀독으로 부터 각각 DSPA-α(참조:Gardell S.J. et al., J. Biol. Chem., 264:17947-17952(1989)) 또는 TSVPA(참조:Zhang et al., J. Biol. Chem., 270:10246-10255(1955))라는 플라스미노젠 활성화 단백질이 분리 정제되었고, 나아가 그들 유전자의 염기서열까지 규명되어 새로운 혈전증 치료제로서의 응용 가능성이 모색되어지고 있다.

이와 같은 차원에서, 본 발명자들은 고래로 부터 중풍 및 신경통 등의 한방치료에 널리 사용되어온 지네(Scolopendra subepinipes mutilans)로 부터 약 25±1kDa의 플라스미노젠 활성화 단백질(이하, 'S-PA-Ⅱ'라 함)을 분리 정제하였고, 이 단백질은 플라스미노젠과 피브린이 동시에 존재하는 경우에만 선택적으로 플라스미노젠 활성화 반응을 나타내고, 또한 다량을 투여하더라도 부작용이 없어 신규한 혈전증 치료제로서의 응용 가능성이 있을 것으로 예상되었다.

이에, 본 발명자들은 상기 S-PA-Ⅱ 단백질의 아미노 말단 서열의 일부를 결정하고, 이를 토대로 지네의 cDNA 라이브러리를 구축하였으며, 그로 부터 S-PA-Ⅱ cDNA를 색출한 다음, 그의 염기서열을 결정한 결과, 신규의 플라스미노젠 활성화 단백질의 유전자임을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 한국산 지네(Scolopendra subepinipes mutilans)로 부터 분리한 신규한 S-PA-Ⅱ cDNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 S-PA-Ⅱ cDNA의 염기서열로 부터 번역되는 아미노산 서열을 가지는 S-PA-Ⅱ를 제공하는 것이다.

제1도는 지네의 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, 각종 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)시킴으로써 증폭되는 부분을 나타내는 모식도이다.

제2도는 T3와 IQW 프라이머 쌍을 아용하여 PCR 반응시킨 결과를 나타내는 2% 아가로스-겔 전기영동 사진이다.

제3도는 T3와 IQW 프라이머 쌍을 이용하여 증폭한 PCR 반응산물인 약 200bp cDNA 절편의 염기서열 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.

제4도는 플라스미드 pSPA의 유전자 지도를 나타낸다.

제5도는 S-PA-Ⅱ cDNA의 염기서열 결정에 사용된 내부 프라이머들의 해당위치와 서열결정 과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.

제6도는 S-PA-Ⅱ 전체 cDNA의 염기서열 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

한국산 지네(Scolopendra subepinipes mutilans)로 부터 S-PA-Ⅱ를 정제하기 위하여, 한국산 지네의 분말을 트리스 완충용액에 용해시키고, DEAE-세파로즈 Fast Flow 컬럼 크로마토그래피하였다. 활성분획을 모아 C₈역상 컬럼에 주입하고, 0 내지 50%(v/v) 아세토니트릴의 직선농도 구배로 S-PA-Ⅱ를 용출시켰다. 이어, S-PA-Ⅱ 함유분획을 일련의 과정으로 세파크릴 S-100, Mono Q 및 슈퍼로즈 12 컬럼 크로마토그래피하였다.

상기의 정제과정을 통해 S-PA-Ⅱ는 한국산 지네로 부터 순수하게 정제되었고, 그의 분자량은 약 25±1kDa으로 확인되었다. 아울러, 본 발명의 S-PA-Ⅱ는 피브린 존재하에서만 농도 의존적으로 플라스미노젠을 활성화시켜 피브린을 용해시킴을 확인하였고, 다량을 투여하더라도 부작용이 없음을 확인하였다.

이러한 특성을 가지는 S-PA-Ⅱ는 신규한 혈전증 치료제로서 충분히 사용될 가능성이 있으므로, S-PA-Ⅱ cDNA를 클로닝하고자 하였다. 이를 위하여, 우선 한국산 지네로 부터 mRNA를 정제하고, 역전사효소를 사용하여 그로 부터 이중나선의 cDNA를 합성하였다. 전기 cDNA를 λZAP 벡터의 EcoRⅠ과 XhoⅠ 제한효소 인식부위에 삽입하고, 시험관내 패키징(in vitro packaging)시킨 다음, 대장균 XL1-Blue MRF' 균주에 감염시켜 지네의 cDNA 라이브러리를 제조하였다.

상기 지네의 cDNA 라이브러리로 부터 S-PA-Ⅱ cDNA를 선별하기 위하여, 프로브를 다음과 같이 제조하였다:상기에서 정제한 S-PA-Ⅱ의 N-말단 아미노산 서열을 결정하고, 8번째 아미노산 Glu에서 부터 16번째 아미노산 Ile까지의 서열에서 역방향으로 유추되는 26-머(mer)의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 또한, 세린계 단백질 분해효소(serine protease)의 활성부위에 공통적으로 보존되어 있는 아미노산 서열로 부터 역방향으로 유추되는 18-머의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 상기에서 합성한 두가지 올리고뉴클레오티드와 람다 ZAP 벡터용 T7 및 T3 프라이머를 PCR 증폭을 위한 프라이머로 사용하고, 상기에서 제조한 지네 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 'PCR'이라 함)시켰다. 그 결과, T3와 26-머(mer)의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응시킨 반응산물에서 약 200bp의 DNA 절편이 증폭되었는데, 그의 염기서열 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 결정한 결과, cDNA 절편 200bp 중에서 160bp cDNA 절편은 S-PA-Ⅱ의 N-말단 아미노산 염기서열과 정확히 일치하는 부분을 포함하고 있어, 그를 프로브로 이용하고자 하였다.

S-PA-Ⅱ 전체 cDNA를 클로닝하기 위하여, 상기에서 제조한 지네 cDNA 라이브러리를 대장균 XL1-Blue MRF' 균주에 감염시켜 플라크를 형성시킨 다음, 나이론막에 옮기고 방사성 동위윈소로 표지된 상기의 약 160bp cDNA 절편으로 플라크 혼성화시켰다. 그런 다음, 나일론막을 세척하고, -70℃에서 자동방사선 사진을 찍어 양성 클론을 확인하였다.

상기의 양성 플라크를 생체내 절단(in vivo excision)하여, 람다파아지 상태에서 플라스미드인 pBluescript SK(-)로 전환시켰다. 그 결과, S-PA-Ⅱ pBluescript SK(-)의 EcoRⅠ과 XhoⅠ 제한효소 인식부위 사이에서 번역개시부위를 EcoRⅠ쪽에 두고서 삽입되어 있었다.

상기에서 클로닝된 S-PA-Ⅱ 전체 cDNA의 염기서열 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 결정한 결과, S-PA-Ⅱ cDNA는 277개 아미노산을 암호화하는 834bp의 개방해독틀(open reading frame)을 포함하는 전체 942bp의 염기서열로 구성되어 있으며, 성숙된(mature) S-PA-Ⅱ의 N-말단은 34번째 아미노산 Ile에서 시작되어 그의 이론적인 단백질 분자량은 약 26kDa이고, 전형적인 세린계 단백질 가수분해효소의 한 종류임을 확인하였다.

본 발명에서 제공되는 S-PA-Ⅱ cDNA는 재조합 대장균, 효모, 베큘로 바이러스/곤충세포 및 동물세포에서 확립된 발현 시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 다량 생산된 S-PA-Ⅱ는 신규한 혈전치료제의 제조에 응용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

[한국산 지네로 부터 S-PA-Ⅱ의 정제 및 그의 특성]

대한민국 충북 괴산 지역에서 채집된 한국산 지네(Scolopendra subepinipes mutilans)의 분말 50g을 0.1M Tris-HCl(pH 7.5)에 용해시키고, 5,000×g에서 30분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 이어, 침전물을 50mM Tris-HCl(pH 7.5)로 6시간 동안 교반하면서 세척하고, 이를 상등액과 합쳐 총부피가 1000ml가 되도록 하였다. 그런 다음, 20mM Tris-HCl(pH 7.5, 평형용 완충용액)로 평형이 유지된 DEAE-세파로즈 Fast Flow 컬럼(50×200mm, Pharmacia, Sweden)에 주입하고, 평형용 완충용액과 0.2M 염화나트륨이 첨가된 평형용 완충용액으로 각각 세척하였다. 이어, 0.2M 내지 1.0M NaCl의 직선농도 구배로 S-PA-Ⅱ를 용출시켰다.

전기 S-PA-Ⅱ를 함유한 분획들을 모아 농축시키고, 평형용 완충용액으로 평형이 유지되어 있는 C₈역상 컬럼(26×260mm)에 주입하여 전기 완충용액으로 세척한 다음, 0 내지 50%(v/v) 아세토니트릴의 직선농도 구배로 S-PA-Ⅱ를 용출시켰다. S-PA-Ⅱ를 함유한 분획들을 모아 농축시키고, 0.1M NaCl을 포함한 평형용 완충용액으로 이미 평형이 유지된 세파크릴 S-100 컬럼(26×950mm)에 주입하였다. S-PA-Ⅱ를 함유한 분획들을 모아 농축하고, 평형이 유지된 Mono Q 컬럼(5×50mm, FPLC system, Pharmacia, Sweden)에 주입한 다음, 평형용 완충용액으로 세척하고, 0 내지 1M NaCl의 직선농도 구배로 용출시켰다. S-PA-Ⅱ를 함유한 분획들을 모아 1ml로 농축한 다음, 0.1M NaCl를 함유한 평형용 완충용액으로 평형이 유지된 슈퍼로스 12 컬럼(10×300mm)에 주입하고 동일한 완충용액으로 용출시켰다.

상기의 정제과정을 통해 수득한 S-PA-Ⅱ의 최종 활성분획을 SDS-PAGE 전기영동하여, 전기 S-PA-Ⅱ는 순수하게 정제되었음을 확인하였다. 또한, 그의 분자량은 약 25±1kDa으로 결정되었다.

아울러, 대한민국 특허공개 제95-18448호에 기재된 방법으로, 상기에서 정제된 S-PA-Ⅱ는 플라스미노젠이 있어야 피브린 플레이트에서 용해현상을 나타내고, 피브린 응고괴에 흡착하며, 또한 피브린 용해 실험방법인 국제 혈전용해 검사법(international clot-lysis assay)을 통하여 피브린 존재하에서만 농도 의존적으로 플라스미노젠을 활성화시켜 피브린을 용해시킴을 확인하였다. 또한, S-PA-Ⅱ의 급성독성을 측정한 결과, LD₅₀값은 약 20mg/kg으로서 다량을 투여하더라도 부작용이 없음을 확인하였다.

[실시예 2]

[한국산 지네의 cDNA 라이브러리 제조]

한국산 지네 10개체(약 30g)를 4M 구아니딘 이소티오시아네이트(guanidine isothiocyanate) 완충용액(참조:Chomenzynsky et al., Analytical Biochem., 162:156-159(1987))에서 파쇄한 다음, 페놀과 클로로포름 추출을 4 내지 5회 반복실시하여, 지네 유래의 단백질과 색소성분을 제거하였다. 이어, 이물질이 제거된 상등액에 2M 소듐아세테이트와 이소프로판올을 가하고, 15,000rpm으로 원심분리하여 지네의 총세포 RNA를 침전시켰다. 침전물을 75% 에탄올로 세척하고, 0.1% DEPC(diethylpyrocarbonate)가 포함된 멸균 증류수에 용해시킨 다음, 260 내지 280nm에서의 흡광도 측정과 포름알데히드 겔 전기영동(참조:Sambrook et al., Molecular cloning 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)으로 RNA를 정량 및 정성 분석하였다.

상기에서 추출한 지네의 총세포 RNA로 부터 올리고(dT) 셀룰로스 컬럼(Poly-A Quick^TM, Stratagene, USA)을 사용하여 지네의 mRNA를 정제하였다. 정제된 5μg의 mRNA를 주형으로 하고, XhoⅠ 링커-올리고(dT) 프라이머와 역전사효소 M-MuLV(reverse transcriptase M-MuLV)를 사용하는 λZAP cDNA 합성키트(Stratagene, USA)를 이용하여, 1차 cDNA 가닥을 합성하였다. 이때 사용되는 dNTP중 dCTP는 5-메틸 dCTP(5-methyl dCTP)를 사용하여 1차 cDNA를 메틸화하였다.

전기에서 합성된 1차 cDNA 가닥으로 부터 RNase H와 DNA 중합효소를 이용하여 이중나선의 cDNA를 합성하고, cDNA 양쪽 말단에 EcoRⅠ 어댑터(adaptor)를 부착하였다. 이어, XhoⅠ 제한효소를 처리하고 세파크릴 S400 컬럼으로 크기별로 분획하여, 고분자량의 cDNA 분획만을 모아 에탄올 침전시켰다.

이렇게 하여 제조된 cDNA는 5'-말단에 EcoRⅠ 제한효소 인식부위를 가지고, 3'-말단에는 XhoⅠ 제한효소의 어댑터 서열을 갖고 있는데, 전기 cDNA를 λZAP 벡터의 EcoRⅠ과 XhoⅠ 제한효소 인식부위에 삽입하였다. 이어, 시험관내 패키징(In vitro packaging, GigaPackⅡ, Stratagene, USA) 반응을 시키고, 이를 대장균 XL1-Blue MRF' 균주{(mcrA183(mcrCB-hsdSMR-mrr)173[F-proAB lacⅠ^qZ M15 Tn10(Tet^r)] endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac}에 감염시킨 다음, 재조합 람다 파아지에 의한 플라크를 형성시켰다. 형성된 플라크수를 환산하여 지네 유래의 cDNA를 갖는 람다 파아지의 역가를 측정한 결과, 총 1×10⁶pfu에 달하는 cDNA 라이브러리를 완성하였다. 또한, 이 초기(primary) cDNA 라이브러리를 다시 숙주세포에 감염시켜 2×10¹²pfu로 플라크를 증폭시켰다.

[실시예 3]

[S-PA-Ⅱ의 부분 cDNA 제조]

실시예 1에서 정제한 S-PA-Ⅱ의 N-말단 아미노산 서열을 결정한 결과, 하기와 같았다:

이 아미노산 서열중 8번째 아미노산 Glu에서 부터 16번째 아미노산 Ile까지의 서열에서 역방향으로 유추되는 26-머의 올리고뉴클레오티드 즉, 5'-AT YTG CCA IGG RAA YTC ICC NGG YTC-3' (이하, 편의상 'IQW'라 함)를 합성하였다.

또한, 세린계 단백질 분해효소의 활성부위에 공통적으로 보존되어 있는 아미노산 서열로 부터 역방향으로 유추되는 18-머의 올리고뉴클레오티드 즉, 5'-GGI CCN NCC NGA RTC NCC-3'(이하, 편의상 'SerR'이라 함)를 합성하였다. 상기의 올리고뉴클레오티드 서열에서, Y는 T 또는 C; R은 G 또는 A; I는 이노신; 및, N은 G, A, T 또는 C를 각각 나타낸다.

람다 ZAP 벡터용 T7 프라이머(5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA-3') 및 T3 프라이머(5'-ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA-3')와 상기에서 합성한 두가지 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하고, 지네 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR 반응시켰다. 이때, PCR 반응은 10⁶pfu/μl의 지네 cDNA 라이브러리 용액 1μl를 전처리 없이 주형으로 사용하고, 1.5mM MgCl₂농도하의 0.2mM dNTP, 100pmol의 프라이머들 및 2.5unit의 Taq DNA 중합효소를 사용하며, Robocycler 40(Stratagene, USA)을 이용하여 수행하였다. 반응주기는 변성(denaturation, 94℃에서 1분), 결합(annealing, 42 내지 56℃의 결합 온도구배(temperature gradient)에서 결정된 각 프라이머에 대한 최적의 결합온도에서 1분), 연장(extension, 72℃에서 1분)을 모두 총 30회 진행시키도록 하였다. 제1도는 상기와 같은 PCR 반응에 의한 지네 cDNA의 증폭부분을 나타내는 모식도이다.

T3와 IQW 프라이머 쌍을 이용하고, 결합온도를 달리하면서 PCR 반응시킨 반응산물을 2% 아가로스-겔 전기영동한 결과, 약 200bp의 DNA 절편이 증폭되었음을 알 수 있었다(참조:제2도). 제2도에서, λBstEⅡ는 λDNA를 BstEⅡ으로 절단한 것, pBR322 MspI는 pBR322를 MspI으로 절단한 것을 각각 나타내는 DNA 크기마커이다.

전기 약 200bp의 cDNA 절편을 겔로 부터 분리하여, 그의 염기서열을 결정하고, 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 알아보았다(참조:제3도). 제3도에서 보듯이, cDNA 절편 200bp 중에서 람다파아지 벡터의 염기서열인 T3 프라이머 결합부위로부터 EcoRⅠ 제한효소까지의 약 40bp를 제외한 나머지 160bp cDNA 절편은 S-PA-Ⅱ의 N-말단 아미노산 염기서열과 정확히 일치하는 부분을 포함하고 있어, 하기 실시예의 S-PA-Ⅱ의 전체 cDNA 클로닝에 프로브로 이용될 수 있음을 확인하였다.

[실시예 4]

[S-PA-Ⅱ의 전체 cDNA 클로닝]

실시예 2에서 제조한 지네 cDNA 라이브러리를 대장균 XL1-Blue MRF' 균주에 감염시켜, NZY 아가로스 평판배지(직경 10mm)당 약 5 내지 7×10³의 플라크를 형성시킨 다음, 양전하의 나이론막(Hybond N+membrane; Amersham, USA)에 옮기고, 0.5N NaOH, 1.5M NaCl에서 각각 1분간 변성, 0.5M Tris·Cl(pH 7.5), 1.5M NaCl에서 각각 1분간 중화(neutralization)시켜, 80℃에서 건조시켰다. 이어, 방사성 동위윈소로 표지된 실시예 3에서 제조한 약 160bp cDNA 절편으로, 플라크 혼성화시켰다(참조:Sambrook et al., Molecular Cloning 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). 그런 다음, 나일론막을 상온에서 2X SSC/0.1% SDS, 42℃에서 1X SSC/0.1% SDS, 68℃에서 0.1X SSC/0.1% SDS로 순서대로 세척하고, -70℃에서 자동방사선 사진을 찍어 1차 양성 클론을 선별하였으며, 2차 검색을 통하여 2개의 양성 클론을 최종적으로 선별하였다.

상기의 양성 플라크를 λZAPⅡ 클로닝 시스템(Stratagene, USA)이 제공하는 ExAssist^TM헬퍼(helper) 파아지와 대장균 균주 SOLR{e14^-(mcrA)(mcrCB-hsdSMR-mrr)171sbcC recB[F^-proAB lacI^qZ M15 endA1 Tn10(Tet^r)] recJ uvrC relAlumuC::Tn5(Kan^r)gyrA96 thi-1^R}을 이용하여 생체내 절단(in vivo excision)하여, 람다파아지 상태에서 플라스미드인 pBluescript SK(-)로 전환시켰다. 그 결과, S-PA-Ⅱ는 pBluescript SK(-)의 EcoRⅠ과 XhoⅠ 제한효소 인식부위 사이에서 번역개시부위를 EcoRⅠ쪽에 두고서 삽입되어 있었는데, 이 플라스미드를 pSPA(3.8kbp)라 명명하였다(참조:제4도).

[실시예 5]

[S-PA-Ⅱ 전체 cDNA의 염기서열 결정]

상기 실시예 4에서 클로닝된 S-PA-Ⅱ 전체 cDNA의 염기서열을 결정하기 위하여, 우선 5'-말단 부위는 T3 프라이머로, 3'-말단 부위는 T7 프라이머를 사용하여 디데옥시 연쇄종결법(참조:Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74:5463-5467(1977))으로 Sequenase 2.0(Amersham, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 이렇게 결정한 일부 염기서열을 이용하여 설계한 내부 프라이머(internal primer)들과 제한효소 분석으로 확인한 BamHI 절편 0.45kbp의 서브클론을 이용하여, S-PA-Ⅱ 전체 cDNA의 염기서열을 결정하였다. 제5도는 S-PA-Ⅱ cDNA의 염기서열 결정에 사용된 N, H, S 및 C 내부 프라이머들의 해당위치와 서열 결정과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.

상기와 같이 결정된 S-PA-Ⅱ 전체 cDNA의 염기서열 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열은 제6도에 나타내었다. 또한, 그의 염기서열을 DNASIS와 PROSIS(Hitachi, Japan) 소프트웨어로 분석한 결과, S-PA-Ⅱ cDNA는 277개 아미노산을 암호화하는 834bp의 개방해독틀을 포함하는 전체 942bp의 염기서열로 구성되어 있으며, 성숙된 S-PA-Ⅱ의 N-말단은 34번째 아미노산 Ile에서 시작됨을 알 수 있었다. 성숙된 S-PA-Ⅱ의 이론적인 단백질 분자량은 약 26kDa이며, 이는 정제된 S-PA-Ⅱ의 SDS-PAGE상에서 확인된 분자량(25±1kDa)과 일치하는 수치임을 알 수 있었다. 아울러, S-PA-Ⅱ의 His78, Asp126 및 Ser218 잔기들은 세린계 단백질 분해효소에 공통적으로 존재하는 3가지 활성관련 아미노산(catalytic triad) 간의 간격(His와 Asp간 약 50개 아미노산, Asp와 Ser간 약 100개 아미노산) 관계를 그대로 유지하고 있어, 전형적인 세린계 단백질 수분해효소의 한 종류임을 확인하였다.

한편, 상기에서 결정한 S-PA-Ⅱ의 아미노산 서열을 공지의 플라스미노젠 활성화 단백질들의 촉매 도메인의 아미노산 서열과 비교한 결과, 인간 유래의 tPA와 61%, 인간 유래의 유로키나제와 63%, 흡혈박쥐 유래의 DSPA와 61%의 아미노산 상동성을 나타냄을 확인하였다. 인간 유래의 플라스미노젠 활성화 단백질들인 tPA와 유로키나제간의 아미노산 상동성이 67%인 것에 비추어 본다면, 상기의 비율은 다른 종(species) 유래임을 감안할 때 높은 상동성이 있음을 알 수 있었다. 또한, 플라스미노젠 활성화 단백질들에서 특징적으로 확인된 C-말단부위의 트립토판-이소루이신-아르기닌(W-I-R) 서열이 S-PA-Ⅱ에서도 확인되었다. 그러나, S-PA-Ⅱ에서는 tPA나 유로키나제 등에서 확인된 PAI1(plasminogen activator inhibitor 1)의 결하부위인 양전하를 띠는 아미노산 서열(K/R-H-R-R)이 존재하지 않으므로, S-PA-Ⅱ의 생체내 투여시에 PAI1에 의한 효소활성 저해현상은 일어나지 않을 것으로 예상된다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 한국산 지네로 부터 분리한 S-PA-Ⅱ cDNA 및 그로 부터 번역되는 아미노산 서열을 가지는 S-PA-Ⅱ를 제공한다. 본 발명의 S-PA-Ⅱ cDNA는 834bp의 개방해독틀로 구성되어 있고, 그로 부터 번역되는 성숙 S-PA-Ⅱ는 244개 아미노산으로 구성된 분자량 약 25kDa의 단백질이다. 본 발명에서 제공되는 S-PA-Ⅱ cDNA는 재조합 대장균, 효모, 베큘로바이러스/곤충세포 및 동풀세포에서 확립된 발현 시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 다량 생산된 S-PA-Ⅱ는 신규한 혈전치료제의 제조에 응용될 수 있다.

Claims (4)

1. 한국산 지네(Scolopendra subepinipes mutilans)의 cDNA 라이브러리로 부터 분리한 하기와 같은 염기서열을 가지는 플라스미노젠 활성화 단백질(plasminogen activator) S-PA-Ⅱ의 cDNA 유전자:
2. 제1항의 플라스미노젠 활성화 단백질 S-PA-Ⅱ의 cDNA로 부터 번역되는 하기와 같은 아미노산 서열을 가지는 플라스미노젠 활성화 단백질 S-PA-Ⅱ:
3. 제1항의 플라스미노젠 활성화 단백질 S-PA-Ⅱ의 cDNA를 포함하는 재조합 플라스미드.
4. 제1항에 있어서, 하기와 같은 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 한국산 지네의 cDNA 라이브러리로 부터 선별되는 것을 특징으로 하는 S-PA-Ⅱ의 cDNA 유전자:

   상기식에서, Y는 T 또는 C; R은 G 또는 A; I는 이노신; 및, N은 G, A, T 또는 C를 나타낸다.