KR20060035624A

KR20060035624A - 인체 카텝신 ｇ에 대한 ｄｎａ-기반 앱타머들

Info

Publication number: KR20060035624A
Application number: KR1020057024363A
Authority: KR
Inventors: 만리오 팔룸보; 바바라 가토; 로돌포 페스카도르; 로베르토 포르타; 라우라 아이리스 페로
Original assignee: 젠티엄 에스피에이
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2004-06-18
Publication date: 2006-04-26
Also published as: RU2360000C2; WO2005003347A2; BRPI0412081A; RU2006102521A; IS8176A; CN1816625A; RS20050955A; US20080176814A1; US20060148745A1; EP2236609A3; ZA200510093B; NO20060429L; EP2236609A2; AU2004254014A1; JP2011078414A; MXPA05013800A; IL172407A0; US7838506B2; CA2528686A1; WO2005003347A3

Abstract

본 발명은 높은 수준의 특이성을 가지는 것을 특징으로 하고 염증성 질환들 및 응고 촉진 증상들의 치료 및 예방에서 효과적으로 사용될 수 있는 카텝신 G의 비-펩티드성 억제제들(non-peptidic inhibitors)의 파악에 관한 것이다. 본 발명에 따른 카텝신 G-억제 앱타머들은 적어도 60개의 뉴클레오티드들로 이루어진 사슬 길이를 가지며 실질적으로 효율적인 염기쌍 형성에 영향받지 않는 선형 DNA 또는 폴리뉴클레오티드 서열들로 구성된다.

앱타머, 카텝신 G, 호중구(neutrophil), 친화성 크로마토그래피

Description

인체 카텝신 Ｇ에 대한 ＤＮＡ-기반 앱타머들{DNA-BASED APTAMERS FOR HUMAN CATHEPSIN G}

카텝신 G(Cathepsin G)는 호중구들(neutrophils) 및 단핵구들(monocytes)의 아주르호성 과립들(azurophilic granules)에서 흔히 발견되는 세린계 단백질분해효소(serine protease)이다. 엘라스타제 및 프로테이나제 3과 함께, 카텝신 G는 키모트립신 과(chymotrypsin family)에 속하며 엘라스틴, 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌과 같은세포외 기질 단백질들을 분해하여 동물에서 광범위한 폐 조직 손상을 유발한다.

카텝신 G는 또한 혈액 응고에서 관여한다; 실제로, 백혈구에 의한 혈액 응고 개시의 대안적인 경로에 관여하며, 응고 인자 X 및 응고 인자 V를 활성화하여, 트롬빈 수용체를 분해하고 잠재적으로 변형시킬 수 있으며, 체외에서(in vitro) 혈소판들을 활성화시킬 수 있다. 카텝신 G는 또한 앤지오텐신(angiotensin) I 분자 내의 임의의 부위에서 일어나는 미세한 분해만으로 앤지오텐신 I을 앤지오텐신 II로 전환시킬 수 있다.

카텝신 G는 세균류 및 균류를 죽이는 것으로 알려져 있으나, 이와 같은 성질은 그 활성과 관련된 것이 아니고, 실제로는 카텝신 G의 분해로부터 유래된 펩티드류가 직접적인 항균성들을 보였다. 카텝신 G는 또한 괴사 조직들을 분해할 수 있으 며, 따라서 폐기종, 기관지염, 낭포성 섬유종 및 건선과 같은 일부 염증성 질병들과 관계된다.

카텝신 G의 효소 활성은 두 가지 유형의 단백질 프로테이나제 억제제들에 의해 조절된다: 소위, "카노니칼(canonical)" 억제제류 및 세린계 프로테아제 억제제류(serpins). 전자는 비교적 작은 단백질류(29-190개의 아미노산들)이고 강하게 결합되는 가역적 억제제들이다; 예로는 뮤커스 프로테이나제 억제제(Mucus proteinase inhibitor;MPI), 에글린(eglin) c 및 아프로티닌(aprotinin)이 있다. 세르핀류(Serpins)는 카텝신 G의 촉매 부위와 동족 단백질(cognate protein)들의 반응 부위 루프 간에 비-가수분해성 아실 결합(acyl bond)을 형성하기 때문에 그들과 비가역적인 복합체(complex)를 형성하는 보다 큰 단백질들(400-450개의 잔기들)이다. 세르핀류 중에서 1-안티키모트립신이 가장 중요하다: 이 과에 속하는 억제제들은 다른 키모트립신들에도 결합하여 그들을 억제하므로 특이적(selective)이지 않다. 또한, 체내에서 (in vivo) 그들의 안정성 및 분포는 그들의 펩티드 속성(peptidic nature)에 의해 영향을 받는다.

1,2,5-티아디아졸리딘-3-온 1,1-디옥시드 또는 1,3-디아제티틴-2,4-디온류를 포함하는 펩티도미메틱 지지체(pepetidomimetic scaffold)들로부터 출발하는 수 개의 합성 억제제들이 발견되었고 그들 중 일부(특히, 방향족 곁사슬들을 가지는 억제제들)는 카텝신 G에 대해 매우 특이적인 활성을 보였다. 그러나, 그들은 이 효소와 비-가역적인 아실 복합체들을 형성한다.

최근에, 완전한 길이의 염색체 DNA 및 절단된 염색체 DNA 모두 체외 및 체내 에서 카텝신 G에 결합하여 이를 억제할 수 있다는 것이 입증되었다. 30 bp DNA 단편은 생리적 조건들에서 카텝신 G에 강하게 결합되고 프로테이나제 3에 비해 그 양이온성(cationic character)의 감소에 따라 사람 백혈구 엘라스타제(human neutrophil elastase)에 대한 친화도가 감소된다는 것을 보여주었다.

특히, 유럽 특허 EP-775745는 약 40 개의 뉴클레오티드들로 이루어진 사슬 길이(및 55개 미만의 뉴클레오티드들로 이루어진 사슬 길이)를 가지며 염증성 질환들(inflammatory occurrences) 및 응고촉진(procoagulant) 증상들의 치료 및 예방에 유용한 G-쌍 반복 단위들(G-pairs repeating units)을 포함하는 올리고뉴클레오티드 카텝신 G-억제 앱타머들을 개시한다.

본 연구는 주로 고도의 특이성(selectivity)을 특징으로 하고 따라서 전술된 증상들의 치료 및 예방 및 또한 유전성 질병들, 퇴행성 질환들, DNA 손상들, 종양 형성(neoplasia) 및/또는 피부 질환들의 치료 및 예방에 훨씬 효과적으로 사용될 수 있는 카텝신 G의 비-펩티드성(non-peptidic) 억제제들에 관한 것이다.

항체들처럼, DNA 분자들은 그들의 서열에 따라 다양한 3차 구조들을 가질 수 있다. 3차 구조들 중 일부는 대상(target)에 대한 결합에 관계될 수 있다. 본 연구에서, 본 발명자들은 카텝신 G에 대해 높은 친화도를 보이는 앱타머라고 불리는, ssDNA 또는 RNA 분자들을 선별하고 확인하기 위해 SELEX(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 방법을 적용하였다.

앱타머 기술은 올리고뉴클레오티드들의 랜덤 풀(pool)들의 막대한 구조적 다양성을 생성할 수 있는 능력과 선별된 서열들을 증폭시키는 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)의 위력을 결합한다. 본 기술은 올리고뉴클레오티드의 대규모 랜덤-서열 풀의 스크리닝을 포함하며 그들이 다수의 3차 구조를 형성할 수 있고, 그 중 일부는 대상 분자들에 대한 바람직한 결합 활성 또는 촉매 활성을 가질 수 있는 3차 구조를 형성할 수 있다는 사실에 기반한다.

억제가 선별에 의해 요구되는 것은 아니나, 다수의 경우들에서, 이 리간드들은 직접적으로 대상이 되는 단백질들의 생물학적 기능들을 억제한다. 이와 같은 경우들에서, 리간드들의 억제 기능들은 단백질들의 기능 부위와 그들의 결합 부위들 간의 중첩때문인 것으로 생각된다.

본 연구의 결과로 본 발명자들은 특히 높은 특이성을 가지는 카텝신 G-억제 앱타머들의 새로운 종류(class)를 정의하게 되었다.

본 발명의 신규한 카텝신 G-억제 앱타머들은 단일 사슬 또는 이중 사슬 선형 DNA 또는 폴리뉴클레오티드 서열들로서, 적어도 60개의 뉴클레오티드들, 바람직하게는 70개의 뉴클레오티드들의 사슬 길이(chaing length)를 가지며, 실질적으로 분자간(inter molecular) 및/또는 분자내(intra molecular) 염기쌍 형성(base pairing)에는 영향받지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 최선의 실시예에 따르면, DNA 서열들은 70÷120개의 뉴클레오티드들로 구성된 사슬 길이, 바람직하게는 70÷110개의 뉴클레오티드들로 구성된 사슬 길이, 훨씬 더 바람직하게는 80÷100개의 뉴클레오티드들로 구성된 사슬 길이를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 서열들은 단일 사슬 또는 이중 사슬일 수 있으나, 단일 사슬 서열들이 바람직하다. 본 발명에 따른 서열들은 또한 바람직하게는 약 25÷50% 몰 함량(molar content)의 구아닌, 바람직하게는 약 35÷45% 몰 함량의 구아닌 및/또는 약 1.0÷2.0의 AT/GC 몰비(molar ratio), 바람직하게는 약 1.2÷1.8의 AT/GC 몰비를 가지는 것을 특징으로 한다(본 발명에서, AG는 서열의 A 및 G 뉴클레오티드들의 총수를 의미하고 TC는 서열의 T 및 C 뉴클레오티드들의 총수를 의미함).

본 발명의 바람직한 실시예들은:

n이 35 내지 60, 바람직하게는 40 내지 50의 범위에 있는, (GT)_n 또는 (AC)_n 올리고폴리머류;

n이 70 내지 120, 바람직하게는 80 내지 100의 범위에 있는, (T)_n 또는 (G)_n 또는 (A)_n 또는 (C)_n 또는 (이노신)_n 오모폴리머류(omopolymers);이다.

본 발명의 용어들 내에서, "실질적으로 분자간 및/또는 분자내 염기쌍 형성에 영향받지 않는(substantially not subjected to inter and/or intra molecular base pairing)"이라는 표현은 DNA 또는 폴리뉴클레오티드 서열들이 엄격한(stringent) 조건들 및 엄격하지 않는 조건들 모두에서 20%를 초과, 바람직하게는 10%를 초과, 훨씬 더 바람직하게는 5%를 초과하는 정도까지 분자간 및/또는 분자내 염기쌍 형성을 수행하지 않는다는 것을 의미한다. 그와 같은 결과는 그들의 구조에 따른 직접적인 귀결이며, 이는:

1.0÷2.0의 AT/GC 몰비를 가지며; 또는

n이 30을 초과하는 (GT)_n 또는 (AT)_n 올리고폴리머류이고; 또는

n이 60을 초과하는 (T)_n 또는 (G)_n 또는 (A)_n 또는 (C)_n 또는 (이노신)_n 오모폴리머류(omopolymers);라는 사실이 사실상 혼성화(hybridization)를 방지하기 때문이다.

다음의 검토로부터 명확해지겠지만, 본 발명에 따른 앱타머들은 특이적으로(selectively) 및 효과적으로 카텝신 G를 억제하고, 결과적으로, 그들은 염증성 질환들, 응고촉진 증상들, 유전성 질환들, 퇴행성 질환들, DNA 손상들, 종양 형성 및/또는 피부 질환들의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 사용될 수 있고, 따라서, 이것이 본 발명의 목적이다. 본 발명의 추가적인 목적은 또한 본 발명의 카텝신 G-억제 앱타머들과 통상적인 부형제들 및/또는 보조약들을 포함하는 약학적 조성물로 표현될 수 있다. 본 발명의 다른 목적들은 서열 목록에기록된 것들(즉, SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:18)로부터 선택된 카텝신 G-억제 앱타머들에 의해 표현될 수 있다.

실험 섹션

재료

카텝신 G는 유로파 바이오프로덕츠(Europa Bioproducts) 또는 칼바이오켑( Calbiochem)으로부터 구입하였다. 모든 올리고뉴클레오티드들은 유로겐텍 벨 에스에이(Eurogentec Bel SA)(벨기에)로부터 구입하여 사용 전에 PAGE에 의해 정제하였 다. PAGE에 의해 이미 정제된, 일부 올리고뉴클레오티드들은 깁코 비알엘 커스텀 프라이머스(Gibco BRL Custom Primers)로부터 구했다. Taq 폴리머라제는 파마시아 애머샴 바이오텍(Pharmacia Amersham Biotech)으로부터 구입하고 dNTP류는 베링거 만하임(Boehringer Mannheim)으로부터 소디움 염의 형태로 구입하였다. T4-폴리뉴클레오티드 키나아제, 리가아제, 및 제한 효소들은 깁코 라이프 테크놀러지스(Gibco Life Technologies)로부터 구입하였다. 플라스미드 miniprep 정제를 위해 Qiagen 키트들을 사용하였고, 서열결정은 T7 Sequenase(파마시어 애머샴 바이오텍) 및 [감마-³³P]dATP(넨 라이프 사이언시즈(Nen Life Sciences))를 사용하여 수행하였다.

ssDNA 라이브러리

합성된 랜덤 풀은 96개의 염기로 구성된 길이이고, 분자의 중심 부분에는 증폭, 클로닝 및 서열결정을 위한 2개의 일정한 부위들이 그 양끝에 위치하는(flanked) 램덤화된 부위가 있다; 그 서열은 5'-CGTACGGAATTCGCTAGC(N)₆₀ GGATCCGAGCTCCACGTG-3'이다.

밑줄친 서열들은 각각 EcoRI 및 BamHI 효소들의 제한 부위들(restriction sites)을 표시한다.

풀은 5'-CGTACGGAATTCGCTAGC-3'의 서열을 가지는 프라이머(primer) II-업, 및 ssDNA를 얻기 위해 스트렙타비딘 컬럼에 결합되도록 5' 말단에 비오틴을 결합시킨(biotinylated) 5'Biot-CACGTCGAGCTCGGATCC-3'의 서열을 가지는 프라이머 III-다 운을 이용하여 PCR을 통해 증폭시켰다.

선별(Selection) 프로토콜

출발 랜덤 풀은 ³²P로 방사성 표지시키고, 고온에서 이중 나선을 풀어주고(denature), 생리적 조건들에 가까운 배양(incubation) 버퍼(버퍼IB: 30 mM Tris HCl pH7.5, 150 mM NaCI, 5 mM KCl 및 5 mM MgCl₂)에서 카텝신 G와 함께 배양하였다.

얼음에서 90분간 배양하고 그 후, 버퍼 IB로 팽창시키고 평형 상태에 도달한 Sepharose SP(애머샴 파마시아 바이오텍)로 충진된 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 미니-컬럼에 시료(sample)를 적용하였다. ssDNA/단백질 용액을 4℃에서 수지와 함께 30분간 배양시켰다. 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드 분자들은 버퍼 IB로 세정하여 제거하고, 잔류한, 보다 특이적인 올리고뉴클레오티드 분자들은 고 이온 강도(high ionic force)의 용리 버퍼(버퍼 EB: 0.8 M NaCl, 50 mM Tris pH 7.8)를 이용하여 컬럼으로부터 용리시켰다.

선별 과정 동안, 제 1 사이클에서 단백질 농도의 2배이나, 점진적으로 감소되는 DNA 농도 및 엄격함(stringency)을 증가시키기 위해 세척액의 용량들(washing volume)을 변경하였다.

분류들(fractions)을 측정(count)하고 Selex 사이클의 수율을 총 방사능 대비 백분율로 표시하였다. 컬럼 통과액(flow through) 및 최초의 2개의 EB 분류들을 회수하여 증폭시켰다.

중합효소 연쇄 반응( PCR )

중합효소 연쇄 반응은 제조자가 표시한 버퍼 50㎕ 당 0.3-0.5u의 Taq 폴리머라제 농도에서 수행하였다. 사이클의 수는 선정 대상에 따라 조절하였다.

클로닝을 위해 플라스미드 벡터에 삽입하기 전에, 블런트 말단들(blunt ends)을 얻기 위해서 DNA에 대해 폴리싱 반응(polishing reaction)을 수행했다: 규정된(normal) PCR 반응의 분취량(aliquot)을 제안된 버퍼 1㎕ 당 2.5u/Pfu Turbo 폴리머라제(스트라타진)와 함께 72℃에서 30분간 배양하였다.

ssDNA 의 생성

증폭된 dsDNA로부터 ssDNA를 얻기 위해, 본 발명자들은 알칼리 변성(denaturation) 프로토콜을 이용하였다. 비오틴이 결합된 다운-II 프라이머를 이용하여 증폭시키고 스트렙타비딘 Sepharose(피어스)로 충진된 크로마토그래피 컬럼에 결합시켰다. 30분의 배양 후에, 결합되지 않는 dsDNA를 버퍼 NaCl 50 mM, Tris/HCl 100 mM, EDTA 10 mM(SBB-스트렙타비딘 결합 버퍼)로 세척해 제거하고 잔류된 dsDNA를 변성시키고 0.15 N NaOH로 세척하였다. 그 후, 선별 사이클들을 위해 세척된 DNA를 침전시켜 회수하였다.

클로닝 및 서열결정(sequencing)

증폭된 dsDNA 및 벡터 pUC19(애머샴-파마시아 바이오텍)을 2.5 유닛의 EcoRI으로 처리하고 플라스미드만 블런트 말단들을 생성하는 SmaI으로 처리하였다.

침전시킨 후에, 3 pmol의 dsDNA 및 0.6 pmol의 pUCl9을 제안된 버퍼에서 T4 리가아제와 반응시켰다.

그 후, 플라스미드를 E. coli 펄(E.coli pulser)(바이오래드)를 이용한 전기천공법(electroporation)에 의해 E. coli 반응능(competent) 세포들(SURE 스트레인 스트라타진)에 접종시키고 암피실린, X-Gal 및 IPTG(블루/화이트 스크리닝용)의 존재 하에 고형의 LB 배지에서 평탄 배양하였다(plated). 50개의 백색 콜로니들을 찍어서(pick) 각각 액상 LB 배양액에서 배양하여 채취하였다. 플라스미드들을 알칼리 용해(alkaline lysis)로 정제하고 그 양은 매번 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의해 테스트하였다.

앱타머들의 서열은 [감마-³³P]dATPT로 표지하고 두 개의 상이한 프라이머들, EleA457: 5'-ACG-CCA-AGC-TTG-CAT-3'(센스) 및 Ele S: 5'-GGG-TTT-TCC-CAG-TCA-CGA-3'(안티센스)을 이용한, 생거 방법(Sanger's method)에 의해 결정하였다.

Kd 및 Ki 의 결정

올리고뉴클레오티드들의 친화도는 선별에서 수행했던 바와 같은 친화성 크로마토그래피에 의해 결정하였다. 각 올리고뉴클레오티드의 상이한 분취량들을 얼음에서 카텝신 G 15 ㎍과 배양하였다. 그 후, 그 용액을 선별을 위해 사용하였던 미니-크로마토그래피 컬럼에 적용하고 15 부피부(volumes)의 버퍼 IB로 세척하였다. 1시간 배양 후에, 6 부피부의 버퍼 EB로 세척하였다. 동일한 부피의 분류들을 회수하고 측정하였다.

표면 플라즈몬 공명( SPR ) 실험들

HBS EP 버퍼, pH 7.40(비아코어)에 용해된 인체 호중구들(neutrophils)로부 터 얻은 카텝신 G를 비아코어가 제안하는 절차에 따라, 비아코어 아민 커플링 키트를 이용하여, CM 5 리서치급 센서 칩 플로우 셀의 표면 상에 고정하였다. 카텝신 G를 제외한 모든 시약들을 사용하여 블랭크 플로우 셀을 준비하였다. 플로우 셀의 표면 상에 고정된 카텝신 G의 양은 5178.91±129.63 RU였다.

앱타머들[폴리 GT (사슬 길이: 20, 30, 40, 60, 80 및 100) 및 폴리 AC (사슬 길이: 20, 40 및 80, ]을 30 mM Tris-HCl 버퍼, pH 7.50, 150 mM NaCl, 5 mM KCI, 및 5 mM MgCl₂에 용해시키고 카텝신 G 표면 또는 블랭크 표명 상에 주입시켰다. 3차의 실험들을 수행하였다. 제 1차는 모든 앱타머들에 대해 500 nM, 제 2차는 모든 앱타머들에 대해 6595 ㎍/L, 및 제 3차는 테스트되는 앱타머에 따라 15.6 nM 내지 8000 nM 범위의 농도들에서 수행하였다. 전술된 모든 실험들은 비아코어 HBS EP 버퍼, pH 7.40을 러닝 버퍼(running buffer)로 하여 25℃에서 수행하였다. 카텝신 G 표면은 2 M NaCl의 2회 주입에 의해 재생시켰다. 블랭크 센소그램(seonsogram)을 각 시료의 센소그램으로부터 차감하고 결합 반응치(binding response)를 평가하였다. 제 3차의 실험들에서 생성된 결합 반응치들을 로그 농도(Log concentration)의 함수로서 표시하여 농도-효과 곡선들을 얻고 앱타머들이 인체 호중구들로부터의 카텝신 G를 결함하는 상대적 강도들을 파악하였다.

결과들

앱타머들의 선별 및 확인

본 발명자들은 PCR 반응을 위해 보존되는 서열 및 다음의 클로닝 단계를 위 한 제한 부위들을 가진 두 개의 부위들을 양끝에 갖는 60개의 뉴클레오티드들로 구성되는 랜덤화된 부위를 가지는 DNA 풀에서 출발하여 카텝신 G용 앱타머들을 선별하였다(전술 참조).

본 발명자들은 수지에 단백질을 결합시키는, 친화성 크로마토그래피를 선별 방법으로 선택하였다. 생리적 조건들에서 양 전하를 띠게 되는 카텝신 G(이론적인 등전점 11)는 이온 결합 수지에 강하게 결합될 수 있는 반면, DNA 분자들의 수지에 대한 비특이적 결합은 크게 감소되기 때문에, 이 방법이 가장 용이한 프로토콜로 판단되었다. 실제로, 단백질을 인식하는 DNA 분자들만이 컬럼 상에 남고, 결합되지 않는 물질은 세척되어 제거된다. 본 발명자들은 결합 버퍼에 5 mM의 포타슘 클로라이드 및 마그네슘 클로라이드를 포함시켜 버퍼의 이온 강도를 증가시키고 올리고뉴클레오티드 폴딩(folding)을 안정화시켜 표지된 ssDNA와 단백질 간 결합 과정이 보다 특이적(selective)일 수 있게 하였다.

고 이온 강도의 버퍼(버퍼 EB)를 사용하여, 결합된 단백질과 함께 선별된 분자들은 효율적으로 컬럼으로부터 분리하고, 방사성을 측정하였다. 다음 사이클에 사용하기 위해 최초의 두 개의 분류들 및 컬럼 통과액(flow-through)을 회수하여 PCR로 증폭하고 단일 사슬 분자들로 만들었다(상세한 사항은 방법 섹션 참조).

본 발명자들은 선별을 위해 9회의 사이클을 수행하였다: 4회의 사이클 수행후, 수율의 상당한 증가를 관찰했으나, 3회에 걸쳐 풀 친화도의 추가적인 증가가 관찰되지 않고 최종 수율 42%에 도달했을 때, SELEX를 종료하였다(표 1). 선별의 엄격성(stringency)은 세척의 횟수 및 부피들을 증가시켜서 높였다. 5회 및 7회 사 이클 후, 수지에 대한 앱타머들의 비특이적 결합을 방지하기 위해서 전치컬럼 사이클들(precolumn cycle)을 수행하였다: 이전 사이클에서 나온 풀을 단백질 없이 컬럼에 적용하였다: 그 컬럼으로부터 용리된 최초의 분류들을 증폭하여 다음 사이클에서 사용하였다.

서열 분석

선별된 분자들을 실험 섹션에서 기술한 바대로 E. coli 세포들에서 클로닝하고 그 서열을 결정하였다. 본 발명자들은 50개의 클론들로부터 19개의 상이한 서열들을 발견했다. 본 발명자들은 두 개의 서열 정렬 프로그램들(sequence alignment programs), Clustal W 및 FastA-align를 사용하여, 반복되는 컨센서스 모티프(repeated consensus motif)를 탐색했으나, 분자 다양성(diversity)이 너무 높아서 서열이 결정된 분자들의 서브셋트들 내에서 조차도 양호한 정렬을 생성할 수 없었다. 추가적인 분석은 14개의 서열들에서 GT 모티브들이 명확하게 반복된다는 것을 보여주었다. 또한, 이 분자들에 대한 보다 세부적인 관찰은 그들이 적절한 정도까지 분자간 또는 분자내 염기쌍 형성을 수행하지 않으며, G 쿼테트(quartet)와 같은 보다 복잡한 3차 구조들을 형성하지도 않는다는 것을 보여주었다. 선별은 결과적으로 전하-전하간 상호작용 때문에 양전하를 띠고 있는 단백질(positive protein)에 강하게 결합할 수 있는, 불특정 구조의, 선형 및 유연한 분자들을 얻게 하는 것으로 보여졌다. 이 가설을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 선별된 앱타머들 중 하나인 60개의 염기들로 구성된 CG51과 올리고 GT 또는 올리고 AC 구조들과 같은 비-결합성(non-pairing) 서열들을 가지는 다른 올리고뉴클레오티드들의 친화도를 비교하였다. 최후의 선별 사이클로부터 얻어지는 올리고뉴클레오티드들의 서열들은 아래와 같이 보고된다; 각 서열은 상이한 번호들로 표시된다(CG51 및 CG43은 동일함).

전술된 서열들은 서열 목록에서 다음과 같은 일치를 보인다:

CG1 = SEQ ID NO: 1, CG3 = SEQ ID NO: 2, CG11 = SEQ ID NO: 3, CG16 =

SEQ ID NO: 4, CG20 = SEQ ID NO: 5, CG25 = SEQ ID NO: 6, CG28 = SEQ ID

NO: 7, CG32 = SEQ ID NO: 8, CG39 = SEQ ID NO: 9, CG43 (및 CG51) = SEQ

ID NO: 10, CG48 = SEQ ID NO:11, CG49 = SEQ ID NO: 12, CG2 = SEQ ID

NO: 13, CG31 = SEQ ID NO: 14, CG23 = SEQ ID NO: 15, CG34 = SEQ ID NO:

16, CG45 = SEQ ID NO: 17, CG40= SEQ ID NO: 18.

선별된 분자들 및 관련 서열들의 카텝신 G에 대한 친화도

본 발명자들은 선별 방법과 유사하게 친화성 크로마토그래피에 의해 카텝신 G에 결합하는 올리고뉴클레오티드를 평가하였다. 앱타머 CG51의 친화도는 전술된 바와 같이, 와트슨-크릭 염기쌍들에 의해 결정되는 임의의 구조 또는 G 쿼탯 형성으로 폴딩(folding)될 수 없는 동일한 길이의 AC 올리고뉴클레오티드 및 GT 올리고뉴클레오티드들과 먼저 비교하였다. cmpCG51이라 불리는, CG51의 상보적 서열을 대조군으로서 포함시켰다. 또한, 올리고뉴클레오티드 길이가 단백질 결합에 중요한 인자인지 여부를 입증하기 위해서, 60개의 뉴클레오티드로 구성된 것보다 긴 AC 올리고뉴클레오티드 및 GT 올리고뉴클레오티드 및 60개의 뉴클레오티드로 구성된 것 보다 짧은 AC 올리고뉴클레오티드 및 GT 올리고뉴클레오티드의 친화도를 측정하였다.

SELEX의 고수율로부터 예상되는 바와 같이, 선별된 CG51은 카텝신 G에 대해 높은 친화도(Kd 0.9 nM)를 보였다. 또한, 그 Kd는 동일한 길이의 AC 올리고뉴클레오티드 및 GT 올리고뉴클레오티드(각각 0.8 nM의 Kd 및 1 nM의 Kd) 및 cmpCG51 (Kd 0.6 nM)과 비교되었다 (도 1). 이 데이터들은 본 발명자들의 부정형의 유연한 분자들에 의한 강한 결합에 관한 가설이 옳았다는 것을 보여준다.

각각 120머(120mer) 및 80머인, (AC)₆₀와 (GT)₄₀과 같은 60머보다 긴 분자들은 1.2 nM의 친화도를 보였다. 반면에, 보다 짧은 분자들인 (GT)₂₀ 및 (GT)₁₀은 각각 1.5 nM 및 2 nM의 Kd를 가졌고, 이는 선별된 올리고뉴클레오티드들의 길이가 효율적인 결합을 부여하는 데 있어서 중요하다는 것을 암시했다.

또한 올리고뉴클레오티드 구조가 카텝신 결합에 중요한 지 여부를 입증하기 위해 대조군으로서 트롭빈에 대하여 선별된, 앱타머 THR을 포함하였다. 이 앱타머는 안정한 G 쿼탯들을 형성하는 것으로 알려져 있다. 이 경우 발견된 낮은 Kd(4 nM)은 이 유형의 구조는 효과적인 인식 모티프(recognition motif)를 나타낼 것 같지 않다는 것을 보여준다.

흥미롭게도, 단일 사슬이 보다 많은 수의 전하를 띤 기들을 가지고 있긴 하나, 이중 사슬의 CG51은 단일 사슬보다 낮은 친화도를 보였다. 실제로, 이중 사슬 올리고뉴클레오티드는 더 크고 경직되어, 단백질을 알맞게 결합할 수 없다.

표면 플라즈마 공명( SPR ) 실험들

일련의 1차 실험들(각 앱타머의 농도 500nm)에서 생성된 데이터는 GT 앱타머들의 경우에, 사슬 길이를 60 이상으로 증가시키면 결합력의 증가를 가져오나, 이와 같은 증가는 30-60범위에서의 증가보다 덜 급격하다는 제 1 증거를 제공하였다. 결합은 20-30 범위에서 약하다. AC 앱타머들의 경우, 그 결합은 GT 앱타머들의 경우보다 덜 두드러졌다. SPR 공명은 분석물 (이 경우, 앱타머)의 표면 질량 농도(surface mass concentration)의 변화와 관련되며, 따라서 표면(이 경우, 카텝신 G로 구성됨) 상의 결합부위들의 수에 대하여 분석물의 분자량에 의존한다. 외견상의 앱타머 결합(apparent aptatmer binding)이 앱타머 중량에 의존적이지 않고 앱타머의 구조적 특징에만 의존한다는 의혹을 제거하기 위해, 일련의 2차 실험들을 동일한 질량 농도에서 수행하였다(각 앱타머의 농도 6595 ㎍/L). 그 결과들은 일련의 1차 실험들에서 얻은 결과들과 동일하였다 (간결함을 위해 데이터를 표시하지 않음).

도 2에, GT 앱타머들 및 AC 앱타머들의 로그 농도(Log concentration)-효과 곡선들을 요약하였다. 이 도면에서, 선형 회귀가 얻어지는 농도 범위를 지칭하는, 각 앱타머의 반응치들이 보고된다. GT 100이 가장 강력한 앱타머이며 GT 100에 임의적으로 1의 강도(potency)(상대적 기준)를 부여하였다. GT 80은 약 0.32의 상대적 강도를 가지며, GT 60은 약 0.144, AC 80은 약 0.017, GT 40은 약 0.016, AC 40은 약 0.0047 및 GT 30은 약 0.0020의 상대적 강도를 가진다. GT 20 및 AC 20은 결합력이 약하기 때문에 평가할 수 없었다. 대략적으로, 앱타머들은 3개의 과 (family)로 분류될 수 있다(도. 2); 제 1과: GT 100, GT 80 및 GT 60; 제 2과: AC 80, GT 40, AC 40 및 GT 30; 제 3과: AC 20 및 GT 20.

도 3에, 폴리T 앱타머들의 로그 농도-효과 곡선들이 요약되었다. 알 수 있는 바와 같이, 폴리T100 및 폴리T80, 즉, 각각 (T)₁₀₀ 및 (T)₈₀ 서열을 가지는 앱타머들이 폴리T60보다 훨씬 강하다.

검토

4회의 선별 사이클만 수행한 후, 단백질에 결합된 분자들의 백분율의 막대한 증가가 관찰되었고 42%의 수율에 해당하는 9차 사이클에서, 풀이 더 이상 증가(enrich)되게 할 수 없었다. 그러나, 선별된 앱타머들의 서열 분석은 그들 간에 반복되는 공통된 컨센서스 모티프의 증거를 보여주지 않았다. 보다 상세히 관찰하여, 이 분자들의 다수은 GT/C가 부족하며, 따라서, 염기쌍 형성을 수행하여 G 쿼탯들로 폴딩될 것 같지 않다는 것을 발견하였다. 아마도, 음전하를 띠고 유연성 있는, 단일 사슬의 DNA 분자들은 이 양전하를 띠는 단백질에 가장 잘 결합될 것이다. SELEX 버퍼에서 상당량의 소디움 클로라이드 및 마그네슘 클로라이드의 존재 하에, 타겟과 단백질 간 결합은 여전히 주로 전하간 상호작용에 의해 주도될 수 있다.

특이한 "컨센서스" 근거의 가설을 확인하기 위해, 선별된 앱타머들 중 하나인 CG51의 친화도를 수개의 AC 올리고뉴클레오티드 및 GT 올리고뉴클레오티드들과 비교하였다. 본 발명자들은 CG51은 카텝신 G에 대한 상당히 높은 친화도를 가지며 나노몰 범위에 있는 Kd를 가진다는 사실을 입증하였고, 이는 선별을 통해 효율적인 결합제들(binders)의 풀을 효과적으로 얻었다는 것을 보여준다. CG51과 동일한 길이( 및 전반적인 구조적 특징들)를 가지는 (AC)₃₀, (GT)₃₀ 및 cmpCG51의 해리 상수들(dissociation constants)은 유사했으며, 반면에 보다 짧은 길이의 분자들은 보다 낮은 친화도를 보였다. 이중 사슬 CG51은 카텝신 G에 대해 보다 낮은 친화도를 보였다: 이는 평균 길이 30 bp를 가지는 염색체 DNA가 이 단백질에 결합할 수 있다는 것이 입증되었다는 것을 고려할 때 매우 흥미롭다.

본 발명자들은 적어도 60, 바람직하게는 70-80을 초과하는 길이의 선형의 유연한 단일 사슬 DNA가 염색체 DNA 단편보다 카텝신 G를 결합하는 데 더 효과적이고 또한 보다 짧은 길이의 DNA 사슬들보다도 더 효과적이라는 것을 입증하였다.

<110> Gentium Spa <120> DNA-based aptamers for human cathepsin G <130> PA10462IT <150> EP 03425428.4 <151> 2003-06-30 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> unidentified <400> 1 gggtggcccc ctagtcgcgc actggaagcg gtagtgtcgt gagattcgta tctggggtat 60 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> unidentified <400> 2 caacgagtca gggcgtgatt ggtgaagatg tgtggtttgg ccagaaaggg cgatggtgga 60 60 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> unidentified <400> 3 agagctgaga cggacatgct gcccatggag actgttcgag agggtgagcg ggagtggg 58 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> unidentified <400> 4 acccctaggt cagcacgtag tgtagggcga tgtgttcatg gcgggaatgt gagttgtggg 60 60 <210> 5 <211> 59 <212> DNA <213> unidentified <400> 5 gggcggctcg cgttgtggaa cattcgtggt gccaatgcgt accagggatt gcctcctgt 59 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> unidentified <400> 6 gggcgattgg cgaatgcaag ggtaaggttg ggcgattgat gtgcacgtag cgcagagcat 60 60 <210> 7 <211> 55 <212> DNA <213> unidentified <400> 7 ggaacgtggt aggtgtgtct gctgtgtgtg gctcgggcag gttgtcaggg tgttt 55 <210> 8 <211> 59 <212> DNA <213> unidentified <400> 8 gggcataggg cgtcgtagcc tgaaggtgtg attcgtgcgt tagatggggg gcagtctgc 59 <210> 9 <211> 59 <212> DNA <213> unidentified <400> 9 cggtggagag gtcgcaatga cacggttgac gataggcccc ttgctaacat cggttggtg 59 <210> 10 <211> 60 <212> DNA <213> unidentified <400> 10 caacgtgtga tatgtgggta tacgcttggg tgttacgctg agcacagagg gtattcgtgt 60 60 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> unidentified <400> 11 agsgggcagc agcacaccac acatgtacgt gggggattgc attgtgtact tagacggtat 60 60 <210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> unidentified <400> 12 ggcctgggtg atgtactatg tatgcgtcgt ggtggctggt aaagggggtc tgctatgggt 60 60 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> unidentified <400> 13 ccacggacgc tgtgagcggc caacggatgg gaatcacgat ctggcccgaa ccacataccg 60 60 <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> unidentified <400> 14 tcacactagg gcacttgcta agtagctatg taactcgatc atacttatta ggcttg 56 <210> 15 <211> 60 <212> DNA <213> unidentified <400> 15 aatcgatgga cacttcaacg caacttgaca tggcggtacg tggactcttg tggcgacagt 60 60 <210> 16 <211> 60 <212> DNA <213> unidentified <400> 16 aacccgtgtg ataaggatat ggtgacttcg tggcacagcg tcgacggact gcccattcca 60 60 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> unidentified <400> 17 ggcgggcggt atgggctgca ggatatgcag gggcgcagag gacagtctgg ccatgtacta 60 60 <210> 18 <211> 59 <212> DNA <213> unidentified <400> 18 ggcagggacg ttcccaggaa tgcggcacag gcagacagct cccgacgagt accagggtg 59

Claims

적어도 60개의 뉴클레오티드들의 사슬 길이(chaing length)를 가지며 20% 미만의 정도까지 분자간 및/또는 분자내 염기쌍 형성을 수행하는 선형 DNA 또는 폴리뉴클레오티드 서열들로 구성되는 카텝신-G 억제 앱타머들로서, 상기 서열은:

1.0÷2.0의 AG/TC 몰비를 가지며; 또는

n이 30을 초과하는 (GT)_n 또는 (AC)_n 올리고폴리머류이고; 또는

n이 60을 초과하는 (T)_n 또는 (G)_n 또는 (A)_n 또는 (C)_n 또는 (이노신)_n 오모폴리머류(omopolymers);인 것을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 1항에 있어서,

60÷120개의 뉴클레오티드들의 사슬 길이를 가지는 것을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 2항에 있어서,

70÷110개의 뉴클레오티드들의 사슬 길이를 가지는 것을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 3항에 있어서,

80÷100개의 뉴클레오티드들의 사슬 길이를 가지는 것을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 1항 내지 제 4항에 있어서,

단일 사슬 서열(sigle stranded sequence)들인 사실을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 1항 내지 제 5항에 있어서,

1.2÷1.8의 AG/TC 몰비를 가지는 것을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 1항 내지 제 6항에 있어서,

25÷50%의 구아닌 몰 함량을 가지는 것을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 7항에 있어서,

35÷45%의 구아닌 몰 함량을 가지는 것을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 1항 내지 제 8항에 있어서,

n이 30 내지 60인 (GT)_n 또는 (AC)_n 올리고폴리머류인 것을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 9항에 있어서,

n이 35 내지 60, 바람직하게는 40 내지 50인 범위에 있는, (GT)_n 또는 (AC)_n 올리고폴리머류인 것을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 1항 내지 제 8항에 있어서,

n이 60 내지 120인 범위에 있는 (T)_n 또는 (G)_n 또는 (A)_n 또는 (C)_n 또는(이노신)_n 오모폴리머류(omopolymers)인 것을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 11항에 있어서,

n이 70 내지 120, 바람직하게는 80 내지 100인 범위에 있는 (T)_n 또는 (G)_n 또는 (A)_n 또는 (C)_n 또는(이노신)_n 오모폴리머류인 것을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 12항에 있어서,

10% 미만의 정도까지 분자간 및/또는 분자내 염기쌍 형성을 수행하는 것을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 13항에 있어서,

5% 미만의 정도까지 분자간 및/또는 분자내 염기쌍 형성을 수행하는 것을 특징으로 하는, 카텝신 G-억제 앱타머들.
제 1항 내지 제 14항에 따른 카텝신 G-억제 앱타머들의 염증성 질환들(inflammatory occurrences), 응고촉진 증상들(procoagulant conditions), 유전성 질환들, 퇴행성 질환들, DNA 손상들, 종양 형성(neoplasia) 및/또는 피부 질환들의 치료 및 예방을 위한 약물의 제조에서의 용도.
통상적인 부형제들 및/또는 보조약제들과 함께 제 1항 내지 제 14항에 따른 적어도 하나의 카텝신 G-억제 앱타머를 포함하는 약학적 조성물.