RU2018117558A

RU2018117558A - Слитые иммуномодулирующие белки и способы их получения

Info

Publication number: RU2018117558A
Application number: RU2018117558A
Authority: RU
Inventors: Нагарадж ГОВИНДАППА; Мариа Мелина СОАРЕС; Кедарнат САСТРУ
Original assignee: Биокон Лтд.
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2014-03-10
Publication date: 2018-10-26
Also published as: AU2018202982B2; BR112015022733A2; CA2902830A1; PL2970512T3; CN105121474A; ES2704411T3; HK1217343A1; EP2970512A1; RU2698975C2; PT2970512T; WO2014164427A1; JP2016512508A; US9988456B2; US20160009807A1; AU2018202982A1; CA3081073C; EP2970512A4; CN105121474B9; NZ711445A; CA2902830C

Claims

1. Способ получения терапевтически активного слитого белка, содержащего группировку направленного взаимодействия с опухолью и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, противодействующую иммунной толерантности раковой клетки, где группировка направленного взаимодействия с опухолью представляет собой антитело, связывающееся с CTLA-4 (антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов), иммуномодулирующая группировка представляет собой TGFβRII или PD1, и где слитый белок получают осуществлением следующих стадий:

получение кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок для экспрессии в клетках CHO (клетки яичника китайского хомячка), где кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность модифицирована для увеличения содержания последовательностей CG, и где кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела, связывающегося с CTLA-4, и SEQ ID NO: 3 или 7 для иммуномодулирующей группировки TGFβRII или PD1, соответственно, где иммуномодулирующая группировка связана с антителом посредством аминокислотной последовательности, экспрессирующейся из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, и где нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 5 для тяжелой цепи антитела, связывающегося с CTLA-4, лишена нуклеотидов для экспрессии лизина на C-конце;

клонирование оптимизированной последовательности указанного слитого белка в клетках CHO, способных к транзиентной или стабильной экспрессии;

выращивание клеток CHO в среде в условиях, подходящих для выращивания и обеспечения клетке-хозяину возможности экспрессировать слитый белок; и

сбор секретированных слитых белков, возможно, для дальнейшей очистки.

2. Способ по п. 1, где иммуномодулирующая группировка связана через линкер с N- или C-концом тяжелой цепи антитела, N- или C-концом легкой цепи антитела либо как N-, так и C-концом обеих цепей.

3. Способ по п. 1, где кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности содержат SEQ ID NO: 5, 6, 3 и 4.

4. Способ по п. 1, где кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности содержат SEQ ID NO: 5, 6, 7 и 4.

5. Препарат для ослабления T-клеточной активации в раковых клетках, содержащий эффективное количество гомогенных терапевтически активных слитых белков, содержащих группировку направленного взаимодействия с опухолью и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, где группировка направленного взаимодействия с опухолью представляет собой антитело, связывающееся с CTLA-4 (антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов), и где слитые белки получены согласно п. 1, где слитый белок имеет кодон-оптимизированную нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок для экспрессии в клетках CHO (клетки яичника китайского хомячка), где кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность модифицирована для увеличения содержания последовательностей CG, и где кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела, связывающегося с CTLA-4, и SEQ ID NO: 3 или 7 для иммуномодулирующей группировки TGFβRII или PD1, соответственно, где иммуномодулирующая группировка связана с антителом посредством аминокислотной последовательности, экспрессирующейся из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, и где кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 5 для тяжелой цепи антитела, связывающегося с CTLA-4, лишена нуклеотидов для экспрессии лизина на C-конце тяжелой цепи антитела.

6. Нуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, содержащий группировку направленного взаимодействия с опухолью и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, где группировка направленного взаимодействия с опухолью представляет собой антитело, связывающееся с CTLA-4 (антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов), и где слитый белок получен согласно п. 1, где слитый белок имеет кодон-оптимизированную нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок для экспрессии в клетках CHO (клетки яичника китайского хомячка), где кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность модифицирована для увеличения содержания последовательностей CG, и где кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела, связывающегося с CTLA-4, и SEQ ID NO: 3 или 7 для иммуномодулирующей группировки TGFβRII или PD1, соответственно, где иммуномодулирующая группировка связана с антителом посредством аминокислотной последовательности, экспрессирующейся из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, и где нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 5 для тяжелой цепи антитела, связывающегося с CTLA-4, лишена нуклеотидов для экспрессии лизина на C-конце.

7. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 6.

8. Способ по п. 1, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 32 и одну из SEQ ID NO: 14, 33 или 35.

9. Способ по п. 1, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13 и одну из SEQ ID NO: 33 или 35.

10. Способ по п. 1, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34 и одну из SEQ ID NO: 14, 33 или 35.

11. Способ по п. 1, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13, 14, 10 и 11.

12. Способ по п. 1, где слитый белок содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13, 14, 10 и 12.