RU2003125917A

RU2003125917A - Способ получения фармацевтически активных рекомбинантных белков

Info

Publication number: RU2003125917A
Application number: RU2003125917/15A
Authority: RU
Inventors: Акилле АРИНИ (CH); Акилле АРИНИ; Раффаэлла КОППОЛЕККИЯ (CH); Раффаэлла КОППОЛЕККИЯ; Франческа Паола ПАГАНИ (IT); Франческа Паола ПАГАНИ; Детлев ХЕРБСТ (CH); Детлев ХЕРБСТ; Антонио ТОНЬИНИ (CH); Антонио ТОНЬИНИ
Original assignee: Сербиос-Фарма С.А. (Ch); Сербиос-Фарма С.А.
Priority date: 2001-03-16
Filing date: 2003-08-22
Publication date: 2005-02-27
Also published as: RU2259212C2; ZA200202136B; EP1245681A2; AU772144B2; ATE364088T1; DE60220469T2; CA2376131A1; US20030040095A1; ES2288527T3; AU2460702A; EP1245681B1; DE60220469D1; RU2227745C2; EP1245681A3

Claims

1. Способ получения рекомбинантного дц-уАП, включающий в себя следующие стадии:

a) культивирование подвергнутых генетическим манипуляциям клеток СНО, стабильно трансфицированных кДНК пре-проурокиназы, в среде для культивирования, содержащей алкановые кислоты или их производные, или их соли при температуре от 30 до 37°С;

b) продолжение указанного культивирования клеток в течение по меньше мере 24 ч;

c) получение надосадка культуры клеток.

2. Способ по п.1, где указанный период времени на стадии b) составляет от 72 до 150 ч.

3. Способ по п.1, где жизнеспособность клеток указанной культуры клеток СНО на стадии b) составляет, по меньшей мере, 70%.

4. Способ по п.1, где указанная температура составляет от 33 до 35°С.

5. Способ по п.1, где указанное производное алкановой кислоты выбрано из масляной кислоты, бутирата натрия, пропионата натрия, бутирата магния, трибутирина, фенилбутирата, в концентрации, составляющей от 0,1 до 20 мМ.

6. Способ по п.5, где указанными клетками СНО являются клетки CHO-Messi.

7. Способ по п.6, где на стадии а) указанная среда для культивирования представляет собой среду культивирования, не содержащую сыворотки.

8. Способ выделения рекомбинантного дц-уАП ВММ и/или НММ из истощенной среды культивирования клеток СНО, подвергнутых генной инженерии, характерной особенностью которого является использование надосадка культуры клеток, полученного по п.6.

9. Способ по п.8, где указанное выделение включает в себя ионообменную хроматографию.

10. Способ по п.9 для отделения рекомбинантного дц-уАП ВММ от дц-уАП НММ, кроме того, включающий в себя стадии:

d) подкисление надосадка культуры клеток слабой кислотой до значений рН в пределах от 5,0 до 5,8, необязательно с добавлением неионного детергента;

e) контактирование подкисленного надосадка с колонкой для ионообменной хроматографии при значениях рН в пределах от 5,5 до 6,5;

f) высвобождение дц-уАП НММ добавлением буферного раствора со значением рН в пределах от 5,5 до 6,5, содержащего моновалентный ион в концентрации от 200 до 300 мМ:

g) высвобождение дц-уАП ВММ добавлением буферного раствора со значением рН 6-7,5, содержащего моновалентные ионы в концентрации, по меньшей мере, равной 400 мМ.

11. Способ по п.10, где подкисленный надосадок на стадии d) дополнительно фильтруют.

12. Способ по п.10, где указанное выделение, кроме того, включает в себя хроматографию на бензамидине.

13. Способ по п.12 для очистки рекомбинантного дц-уАП ВММ, включающий в себя стадии:

g’) контактирование буферного раствора со стадии g), содержащего выделенный дц-уАП ВММ, с бензамидиновой колонкой при значениях рН в пределах от 6,2 до 6,8;

g’’) высвобождение дц-уАП ВММ буферным раствором при значении рН в пределах от 3,8 до 4,2, кроме того, содержащим моновалентные ионы в концентрации от 300 до 500 мМ;

g’’’) необязательно дальнейшее контактирование выделенного дц-уАП ВММ с колонкой для гель-фильтрации, и высвобождение дц-уАП ВММ буферным раствором с низким содержанием солей при значениях рН в пределах от 4 до 7.

14. Способ по п.12 для очистки рекомбинантного дц-уАП НММ, кроме того, включающий в себя дополнительные стадии:

f’) контактирование раствора, содержащего выделенный дц-уАП НММ, полученного на стадии f), с бензамидиновой колонкой при значениях рН в пределах от 6 до 8;

f’’) высвобождение дц-уАП НММ буферным раствором со значениями рН от 3,8 до 4,2, кроме того, содержащего моновалентные ионы в концентрации в пределах от 300 до 500 мМ;

f’’’) кроме того, необязательно контактирование выделенного дц-уАП НММ с колонкой для гель-фильтрации и высвобождение дц-уАП НММ буферным раствором с низким содержанием солей при значениях рН в пределах от 4 до 7.

15. Рекомбинантный дц-уАП, получаемый способом по п.1.

16. Рекомбинантный дц-уАП, получаемый способом по п.7.

17. Рекомбинантный продукт дц-уАП ВММ и НММ, получаемый способом по п.10.

18. Рекомбинантный продукт дц-уАП ВММ и НММ, получаемый способом по п.12.

19. Рекомбинантный очищенный дц-уАП ВММ, получаемый способом по п.13.

20. Рекомбинантный очищенный дц-уАП НММ, получаемый способом по п.14.

21. Способ лечения тромбоэмболических нарушений, при котором используют рекомбинантный дц-уАП ВММ по п.19.

22. Способ лечения тромбоэмболических нарушений, при котором используют рекомбинантный дц-уАП НММ по п.20.

23. Способ по п.21, где указанные нарушения выбраны из: окклюзии периферических артерий (PAOD), клиренса катетера, эмболии сосудов легких, тромбоза глубоких вен.

24. Способ по п.22, где указанные нарушения выбраны из: окклюзии периферических артерий (PAOD), клиренса катетера, эмболии сосудов легких, тромбоза глубоких вен.

25. Способ лечения инфаркта миокарда, при котором используют дц-уАП ВММ по п.19.

26. Способ лечения инфаркта миокарда, при котором используют дц-уАП НММ по п.20.

27. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного средства рекомбинантный дц-уАП ВММ по п.19.

28. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного средства рекомбинантный дц-уАП НММ по п.20.