ES2288527T3 - Procedimiento para preparar urocinasa recombinante farmaceuticamente activa que comprende el uso de acido butirico o sus sales. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la preparación de una u-PA de cadena doble recombinante completamente desarrollada (tc-uPA) en medio de cultivo de una línea celular eucariota, que está transfectada con una secuencia de ADNc de precursor clonado, que comprende una incubación a una temperatura entre 33ºC y 35ºC de la línea celular mencionada en el medio de cultivo celular, en el que se han añadido ácido butírico o sus sales, durante un tiempo entre 48 y 200 horas, y en el que la eficacia de la transformación del precursor, es decir, u-PA de cadena simple (sc-uPA) en la uPA de cadena doble activa (tc-uPA) es superior al 95%.
Description
Procedimiento para preparar urocinasa
recombinante farmacéuticamente activa que comprende el uso de ácido
butírico o sus sales.
El campo técnico de la invención es la
preparación de proteínas recombinantes mediante manipulación
genética de células eucariotas.
Muchas enzimas u hormonas son fabricadas por la
célula como proenzimas o prohormonas inactivas y a continuación se
transforman in vivo en el sitio de "uso" o en el
"momento de uso" en las sustancias activas correspondientes.
Ejemplos de tales enzimas son algunas metaloproteasas de matriz,
como por ejemplo colagenasa I, plasminógeno, quimotripsinógeno,
tripsinógeno. Este mecanismo de "activación" también es
conocido en hormonas, como por ejemplo cromogranina, calcitonina,
etc.
La urocinasa (activador de plasminógeno tipo
urinario, u-PA) puede considerarse como un
ejemplo típico entre las moléculas producidas por la célula como
precursor. Esta enzima es una glucoproteína del plasma que
pertenece a la gran familia de las serinoproteasas. Su función
principal, entre una pluralidad de distintas funciones, consiste en
la activación fisiológica de plasminógeno en plasmina (Barlow, G.H,
Methods in Enzymology, 45: 239-244, (1976)). La
plasmina es una enzima proteolítica, a la que le corresponde un
papel clave en el proceso fibrinolítico, que lleva a la lisis de un
coágulo sanguíneo (Robbins, KC y Summaria, L. Methods in
Enzymology, 45: 257-273, (1976)).
En seres humanos, la u-PA
se expresa en distintos tejidos como pre-proenzima
(pre-prourocinasa) y a continuación se separa en la
sangre como prourocinasa en forma de cadena simple. Por tanto, esta
forma cimógena se abrevia frecuentemente con la expresión
sc-uPA (u-PA de cadena
simple). La sc-uPA tiene un peso molecular
aparente en SDS-PAGE de 50000-54000
Dalton y es catalíticamente inactiva.
En la sangre la plasmina lleva a cabo una
disociación proteolítica que transforma la proenzima
sc-uPA en un polipéptido de cadena doble
denominado tc-uPA, que es catalítica y
fisiológicamente activo.
La tc-uPA está compuesta
por una cadena A y una cadena B que están unidas entre sí por un
puente disulfuro. La cadena B aloja el sitio catalítico, así como
el sitio de N-glucosilación, localizado en
Asn^{302} (Bergwerff AA, van Oostrum J, Kamerling JP y
Vliegenthart JF, Eur. J. Biochemistry, 1995, 228:
1009-1019). Esta forma de uPA se denomina
uPA de cadena doble de alto peso molecular
(tc-uPA de APM). Otra disociación
proteolítica, realizada por plasmina en la cadena A de
tc-uPA de APM, conduce a la formación de una
molécula de urocinasa de cadena doble más corta que se llama
tc-uPA de BPM(uPA de cadena doble de
bajo peso molecular).
Distintos experimentos para la preparación de
tc-uPA mediante las tecnologías de ADN
recombinante confirman, por una parte, la importancia clínica de
esta molécula y, por otra parte, la necesidad de una manera de
proceder tal, principalmente necesitada por motivos de seguridad y
pureza.
En el documento EP154272 se describe la
preparación de sc-uPA glucosilada
recombinante obtenida mediante la introducción de la secuencia de
ADNc en células animales.
En el documento EP 303028 se describe la
preparación de sc-uPA glucosilada
recombinante obtenida mediante la introducción de la secuencia
genómica en células de mamíferos.
La preparación descrita en estas patentes se
refiere a urocinasa recombinante (sc-uPA) en
forma enzimáticamente inactiva.
En la preparación de la enzima activa
(tc-uPA) mediante ADN recombinante queda un
problema sin resolver, principalmente debido a su complejo
tratamiento extracelular posterior. De hecho, como se ha descrito
hasta la fecha, se han obtenido cantidades más pequeñas de
tc-uPA activa recombinante en algunos
sistemas eucariotas recombinantes. En estos sistemas eucariotas, el
producto es una mezcla de sc-uPA y
tc-uPA (Cheng D y col., Chinese Journal of
Biotechnology, 1994, 9: 151-159). Esto está
condicionado principalmente por la ineficacia de las etapas de
tratamiento que están implicadas en la activación de
sc-uPA. Este hecho provoca algunos problemas
en la purificación de ambas formas individuales.
Okabayashi K. y col., Cell Structure and
Function, 1989, 14: 579-586 también describen la
preparación recombinante de la enzima activa
(tc-uPA).
En caso contrario, el uso clínico de una mezcla
de uPA de APM y BPM ocasionaría los problemas de la precisa
reproducibilidad de la relación de los componentes relativos, que
además manifestaría distintas propiedades farmacológicas.
Por otro lado, la preparación de
sc-uPA recombinante conduce a otra estrategia
terapéutica que comprende la administración de
sc-uPA como tal, que a continuación se
transforma mediante la plasmina endógena en el torrente sanguíneo
en la enzima activa. En este caso, los problemas que surgen están
condicionados por la inseguridad de la dosificación debido a la
imprevisibilidad de la proporción de transformación in
vivo.
Sin embargo, las formas moleculares de
tc-uPA de APM y BPM siguen siendo en la
actualidad las únicas moléculas con importancia terapéutica
probada, basada en su uso satisfactorio durante varios años en el
tratamiento clínico en la lisis de coágulos sanguíneos.
Ambas moléculas, que en la actualidad pueden
obtenerse como productos farmacéuticos, no son recombinantes (para
una visión general véase: Scripp's thrombolytic report, PJB
Publications Ltd., (1993)). La forma de APM se prepara en la
actualidad mediante extracción de orina humana como se describe, por
ejemplo, en el documento DE3439980, mientras que la forma de BPM se
prepara de cultivos celulares de riñones fetales humanos en
presencia de suero, como se describe en el documento DT2551017. En
este caso, el suero no sólo proporciona factores de crecimiento a
las células, sino también plasmina para la transformación de
prourocinasa en la forma de BPM de tc-uPA.
Sin embargo, recientemente se han planteado dudas de seguridad
respecto a este producto, condicionadas por su procedencia de
células primarias ("The pink sheet", 1 de febrero de 1999,
página 6).
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de una uPA de cadena doble
recombinante (tc-uPA) completamente
desarrollada en medio de cultivo de una línea celular eucariota que
está transfectada con una secuencia de ADNc de precursor clonado,
que comprende una incubación a una temperatura entre 33ºC y 35ºC de
la línea celular mencionada en el medio de cultivo celular, en el
que se han añadido ácido butírico o sus sales, durante un tiempo
entre 48 y 200 horas, y en el que la eficacia de la transformación
del precursor, es decir, la uPA de cadena simple
(sc-uPA) en la uPA de cadena doble
(tc-uPA) activa es superior al 95%.
Por tanto, otro objetivo de la invención es un
procedimiento para la preparación, el aislamiento y la purificación
de tc-uPA de APM y BPM recombinante y los
productos derivados, correspondientemente las dos formas de
urocinasa completamente desarrollada, obtenidos según tales
procedimientos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de una uPA de cadena doble
recombinante (tc-uPA) completamente
desarrollada en medio de cultivo de células eucariotas genéticamente
modificadas.
La solicitante ha descubierto ahora de manera
sorprendente que si las células eucariotas genéticamente modificadas
se tratan durante un tiempo de por lo menos 24 horas con ácidos
alcanoicos o sus derivados o sales, que se añaden al medio de
cultivo celular, la transformación de una proteína precursora
recombinante en la forma completamente desarrollada correspondiente
es muy eficaz, y se acumula una proteína activa completamente
desarrollada en gran cantidad en el sobrenadante del cultivo
celular.
La transformación de una proteína precursora en
su forma completamente desarrollada es especialmente eficaz si el
tratamiento con ácidos alcanoicos o sus derivados o sales se combina
con una reducción de la temperatura del cultivo celular hasta
valores iguales o inferiores a 37ºC, preferiblemente en el intervalo
entre 30ºC y 36ºC, de la forma más preferida 34ºC, que indica un
efecto sinérgico.
La expresión células genéticamente manipuladas
se refiere a células que han sido transfectadas o transformadas con
ADN exógeno, preferiblemente ADNc, que codifica una proteína
precursora deseada. La secuencia de ADNc es el ácido nucleico que
codifica el precursor de urocinasa
(pre-pro-urocinasa o
prourocinasa).
La expresión proteína precursora se refiere a un
polipéptido que se prepara por separado o de otra forma por la
célula y que necesita otra disociación proteolítica o "tratamiento
posterior" para su activación o para su preparación en una forma
que está tan próxima como sea posible a la forma biológicamente
activa o natural. Otros ejemplos de tales proteínas precursoras,
que se han codificado mediante el ADN o la secuencia de ADNc
correspondiente, son los cimógenos, como por ejemplo tripsinógeno,
quimotripsinógeno, plasminógeno, proamilasa, prolipasa,
metaloproteasas de matriz, es decir, colagenasa I, factores que
pertenecen a la cascada del sistema complementario, y prohormonas,
como por ejemplo el factor de crecimiento de prohepatocitos
(pro-HGF), pre-proinsulina,
somatostatina, cromogranina-A, etc. La proteína
precursora de la presente invención es
pre-prourocinasa o prourocinasa, que es activa en
la forma de tc-uPA (urocinasa de cadena
doble). La urocinasa (uPA) es una serinoproteasa cuya
función principal in vivo es la activación de plasminógeno en
plasmina. En el ser humano, la uPA se expresa en distintos
tejidos como pre-proenzima y a continuación se
secreta en la sangre como prourocinasa, catalíticamente inactiva,
en forma de cadena simple (sc-uPA), que luego
se trata posteriormente mediante plasmina en uPA de cadena
doble (tc-uPA), catalíticamente activa. La
tc-uPA está compuesta por una cadena A y una
cadena B, en la que ésta última aloja el sitio catalítico y están
unidas entre sí por un puente disulfuro. La
tc-uPA activa está presente de manera natural
en la sangre y en la orina en dos formas distintas:
tc-uPA de APM y BPM, que se diferencian en la
cadena A, más corta en tc-uPA de
BPM.
BPM.
Hasta la fecha, los ácidos alcanoicos o sus
derivados o sales se han utilizado en el estado de la técnica para
mejorar el rendimiento de la preparación/secreción de las proteínas
recombinantes en sistemas de cultivo de mamíferos. Según la
presente invención, los ácidos alcanoicos o sus derivados o sales
actúan como "potenciadores del tratamiento posterior". Por lo
que se sabe, esta es la primera vez que los ácidos alcanoicos o sus
derivados o sales se usan como "potenciadores del tratamiento
posterior" de las proteínas precursoras definidas más
arriba.
Los ácidos alcanoicos o sus sales se seleccionan
de butirato, preferiblemente butirato de sodio o butirato de
magnesio.
Los ácidos alcanoicos se añaden al medio de
cultivo de células genéticamente modificadas en concentraciones de
0,01 y 500 mM. En el caso de células de mamíferos, el intervalo de
concentración preferido está entre 0,1 y 20 mM, los más preferidos
son 0,5-2,5 mM. Pero se reconoce que tales
concentraciones pueden variarse según la línea celular usada y
según otros factores, como por ejemplo la viabilidad del cultivo
celular durante o al final del tratamiento. Según una forma de
realización preferida, las células eucariotas son células de un
mamífero seleccionado de aquellos que normalmente se usan para la
preparación de proteínas recombinantes: células
HEK-293, CV-1, COS,
BSC-1, MDCK, A-431, BHK, CHO. Según
una forma de realización preferida, las células CHO son células
CHO-Messi (ECACC nº 93080520).
Otro fin de la presente invención es un
procedimiento para la preparación de tc-uPA
humana recombinante en células CHO, que comprende la adición de
ácido butírico o sales del mismo a un medio de cultivo sin suero,
en el que la línea celular CHO, genéticamente modificada con un
factor de expresión eucariota, que lleva el ADNc de
pre-prourocinasa, se mantiene durante un tiempo
entre 48 y 200 horas a una temperatura entre 33ºC y 35ºC, de la
forma más preferida 34ºC.
Otro fin de la presente invención es un
procedimiento para la transformación de prourocinasa
(sc-uPA) en urocinasa de cadena doble
(tc-uPA) mediante la adición de ácido
butírico o sales del mismo al medio de cultivo de células CHO y
fermentación del cultivo celular a temperaturas entre 33ºC y 35ºC y
durante un espacio de tiempo entre 48 y 200 horas.
Como ya se ha dicho más arriba para la forma
natural, en el caso de la urocinasa recombinante la expresión
tc-uPA también se refiere a la urocinasa
catalíticamente activa, que puede estar en forma de
tc-uPA de APM y BPM. La
tc-uPA de APM y BPM se diferencian en una
cadena A tratada de manera diferente y muestran actividades
funcionales muy similares. La tc-uPA de APM y
BPM pueden diferenciarse, por ejemplo para fines analíticos,
mediante un modelo electroforético diferente en una
SDS-PAGE no reductora: la
tc-uPA de APM migra hacia
50-54 KD, mientras que tc-uPA
de BPM, en las mismas condiciones, migra hacia 30-33
KD.
Otro fin de la presente invención es un
procedimiento para la preparación de tc-uPA
humana recombinante, que se obtiene mediante un procedimiento que
comprende las siguientes etapas:
- a)
- Cultivar células CHO genéticamente manipuladas, transfectadas con ADNc o el gen de la pre-proUC, en un medio de cultivo que comprende ácido butírico o sales del mismo en concentraciones entre 0,1 y 20 mM y una temperatura entre 33ºC y 35ºC, de la forma más preferida 34ºC;
- b)
- Continuar el cultivo mencionado durante un espacio de tiempo entre 48 y 200 horas, de la forma más preferida aproximadamente 120 horas (aproximadamente 5 días) y
- c)
- Obtener el sobrenadante del cultivo celular con el fin de aislar la tc-uPA recombinante humana mencionada.
Según una forma de realización preferida del
procedimiento de la invención, la línea celular genéticamente
manipulada es un transformante de CHO estable, de la forma más
preferida un transformante de CHO-Messi (ECACC nº
93080520), seleccionado basándose en la adquisición de un gen
marcador metabólico. El medio de cultivo es preferiblemente un
medio de cultivo sin suero, todavía más preferiblemente un medio
definido sin suero y sin proteínas, como por ejemplo los que pueden
obtenerse en el comercio. En una forma de realización preferida, el
medio de cultivo celular es CHOMaster®.
Como transformante o transfectante de CHO
estable se propone un clon de CHO, transfectado con un vector de
expresión que está integrado de manera estable en el genoma celular.
El vector de expresión eucariota se selecciona según los criterios
conocidos en el estado de la técnica: la presencia de un fuerte
promotor eucariota o viral, como por ejemplo
CMV-IE, un promotor tardío o temprano del virus
simio 40 (SV40), RSV para hacer avanzar la transcripción del ADN
exógeno; una señal de poliadenilación; amplificadores de la
transcripción y otras regiones regulatorias que se seleccionan
según los procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica.
Otras características de los vectores de expresión son: una
procedencia procariota de la replicación, un gen para la selección
en células eucariotas, como también en procariotas, como por ejemplo
el gen \beta-lactamasa o kanR, o neoR, o
tet-F o higromicina-R, como es bien
conocido para el experto.
Según una forma de realización preferida de la
invención, la selección de las células eucariotas se realiza
mediante la expresión del gen marcador metabólico:
Trp-sintasa (gen trpB) sobre células CHO auxotrófas
para Trp, o mediante histidinol-deshidrogenasa (gen
hisD) sobre células CHO auxotrófas para His.
Los clones estables se seleccionan
preferiblemente basándose en sus propiedades de crecimiento, el
nivel de productividad y su estabilidad en el cultivo.
El cultivo del clon de CHO seleccionado se
realiza habitualmente en el reactor biológico según los protocolos
bien conocidos en el estado de la técnica. Según una forma de
realización preferida, el cultivo se realiza completamente. La
concentración celular inicial preferida asciende a aproximadamente 3
x 10^{5} células vivas/ml y la capacidad de desarrollo celular
del inóculo es habitualmente superior al 95%, medida con el
procedimiento colorimétrico de exclusión con azul Trypan. La
relación de "volumen de inóculo/volumen de medio fresco" varía
habitualmente entre 1:1 y 1:5, también en función de la capacidad
total del reactor biológico y el crecimiento celular.
A una densidad celular entre 1 x 10^{6} y 4 x
10^{6} células/ml, que aparece habitualmente después de
3-5 días de crecimiento, las células se separan del
medio agotado, por ejemplo mediante centrifugación tangencial, y se
resuspenden en el mismo volumen original de medio fresco al que se
ha añadido ácido butírico o sus sales en una concentración final
entre 0,1 y 20 mM. El ácido butírico o sus sales se añaden en el
momento del inóculo de células o después. La adición de ácido
butírico o sus sales puede repetirse, dado el caso, durante el
crecimiento o la fermentación. Especialmente se prefiere la sal de
sodio o magnesio de butirato, que se añade en una concentración
preferida entre 0,5 mM y 2,5 mM, todavía más preferida entre 1 mM y
1,5 mM.
El efecto del ácido butírico sobre la
preparación de la proteína recombinantemente tratada posteriormente
aumenta más cuando la temperatura del cultivo celular se enfría
hasta un intervalo de temperatura entre 33ºC y 35ºC, de la forma
más preferida 34ºC \pm 0,5ºC. Los niveles de glucosa también se
comprueban durante la fermentación y preferiblemente se mantienen
por encima de 1 g/l. La fermentación completa durante la fase de
producción se realiza preferiblemente según los siguientes
parámetros:
Temperatura: 34º \pm 1ºC, preferiblemente 34º
\pm 0,5ºC
pH: 7,15 \pm 0,1
pO_{2}: 50% \pm 20%.
Según las condiciones de fermentación
preferidas, la mayor concentración de tc-uPA
se obtiene después de cultivo de 5 días después de la adición de
ácido butírico o sales del mismo. La preparación del producto
activo puede ir seguida de estudios funcionales o inmunológicos. La
preparación de tc-uPA se sigue, por ejemplo,
con un estudio cromógeno, como por ejemplo el estudio con
Pefachrome®. Alternativamente, la preparación de
tc-uPA activa o la desaparición de
sc-uPA puede seguirse mediante una
SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes y
reductoras, y concretamente por un modelo de migración
electroforético diferente: en realidad,
sc-uPA migra como un polipéptido de cadena
simple de \sim50-54 kD, mientras que
tc-uPA de APM se separa en la cadena A y en
la cadena B y migran hacia \sim20 kD o \sim33 kD.
Según una forma de realización preferida, el
sobrenadante de cultivo celular agotado (es decir, el medio de
cultivo en el que han crecido las células) que contiene
tc-uPA se recupera habitualmente después de
cultivo de 3-8 días, habitualmente en el quinto
día, cuando el equilibrio entre el nivel de proteína recombinante y
la capacidad de desarrollo celular (esta última se mantiene
preferiblemente por encima del 70%) es óptimo. Alternativamente, el
sobrenadante agotado se recupera cuando está ausente
sc-uPA, medida con SDS-PAGE,
y como máximo se transforma en tc-uPA, en el
que para tc-uPA se espera una mezcla de
tc-uPA de APM y BPM. El espacio de tiempo
óptimo para la obtención de tc-uPA
completamente desarrollada está habitualmente entre 48 y 200 horas,
con un tiempo preferido de 120 horas para el cultivo en presencia de
ácido butírico o sales del mismo, que habitualmente se corresponde
con un nivel de producción de tc-uPA de
aproximadamente 4000 UI/ml.
Según las formas de realización de la invención
descritas, la transformación de las formas precursoras
(pre-prouPA, pro-uPA,
sc-uPA) en la tc-uPA
catalíticamente activa se caracteriza por una eficacia de más del
95%, determinada mediante análisis de SDS-PAGE en
condiciones reductoras. Aproximadamente el 80% de la cantidad total
de la tc-uPA producida está en la forma de
APM, y el 20% restante está en la forma de BPM.
En una de sus otras formas de realización, la
invención se refiere a un procedimiento para preparar
tc-uPA de APM y BPM recombinante
catalíticamente activa que resulta de la transformación eficaz de la
sc-uPA o pro-uPA o prourocinasa
catalíticamente inactiva, realizado directamente en el medio de
cultivo agotado y caracterizado por una proporción de
transformación del precursor en la proteína completamente
desarrollada de más del 95%.
Las formas moleculares de
tc-uPA de APM y tc-uPA
de BPM recombinantes pueden aislarse con un procedimiento
cromatográfico caracterizado por el uso del sobrenadante del cultivo
celular obtenido en la etapa c) del procedimiento de preparación de
tc-uPA.
La tc-uPA de BPM puede
separarse de la tc-uPA de APM con un
procedimiento que comprende una cromatografía de intercambio iónico
y preferiblemente según las siguientes etapas adicionales: d)
acidificar el sobrenadante del cultivo celular con un ácido débil
hasta un pH entre 5,0 y 5,8 con la adición facultativa de un
detergente no iónico y filtración, e) poner en contacto el
sobrenadante con una columna de cromatografía de intercambio iónico
a un pH entre 5,5 y 6,5, f) liberar la tc-uPA
de BPM mediante la adición de una disolución tampón con un valor de
pH entre 5,5 y 6,5, que comprende además un ion monovalente en una
concentración entre 200 y 300 mM, como por ejemplo NaCl 250 mM en
un tampón fosfato, g) liberar la tc-uPA de
APM mediante la adición de una disolución tampón a valores de pH
entre 5,5 y 6,5, que comprende además iones monovalentes en una
concentración de por lo menos 400 mM, como por ejemplo un tampón
fosfato con NaCl 500 mM. Durante la cromatografía también se
realizaron lavados intermedios con tampones y/o disoluciones que son
muy conocidas en el estado de la técnica para deshacerse de todos
los componentes que no se relacionan específicamente con
tc-uPA de APM y BPM.
Es posible otra purificación de
tc-uPA de APM y BPM recombinante hasta el
grado de pureza terapéutica. Esta purificación, en la que se usan
las formas liberadas en las etapas g) y f) del procedimiento de
separación, comprende una cromatografía de afinidad en una columna
de benzamidina. Esta última hace posible el procedimiento de
purificación para desprenderse de trazas de
sc-uPA eventualmente presentes.
La cromatografía en benzamidina se realiza
habitualmente según los procedimientos bien conocidos en el estado
de la técnica. La tc-uPA de APM se purifica
mediante cromatografía en benzamidina, sometiéndose el eluato
obtenido en la etapa g) a las siguientes etapas: g1) poner en
contacto el eluato que contiene tc-uPA de
APM con una columna de benzamidina a valores de pH entre 6,2 y 6,8;
g'') liberar la tc-uPA de APM con una
disolución tampón a valores de pH entre 3,8 y 4,2, que además
comprende acetato de sodio en concentraciones en el intervalo entre
50 y 150 mM, NaCl en concentraciones en el intervalo de 300 a 500
mM; g''') y dado el caso poner en contacto la
tc-uPA de APM liberada con una columna de
filtración en gel y liberar la tc-uPA de APM
con un tampón fosfato o acetato con bajo contenido de sal, como por
ejemplo un tampón fosfato de sodio 5 mM a valores de pH entre 4 y
7.
La tc-uPA de BPM se
purifica mediante cromatografía en benzamidina, sometiéndose el
eluato obtenido en la etapa f) a las siguientes etapas: f') poner
en contacto el eluato que contiene tc-uPA de
BPM con una columna de benzamidina a valores de pH entre 6 y 8;
f'') liberar la tc-uPA de BPM con una
disolución tampón a valores de pH entre 3,8 y 4,2, que además
comprende acetato de sodio en concentraciones en el intervalo entre
50 y 150 mM, NaCl en concentraciones en el intervalo de 300 a 500
mM; f''') y dado el caso poner en contacto la
tc-uPA de BPM liberada con una columna de
filtración en gel y liberar la tc-uPA de BPM
con una disolución tampón a valores de pH entre 4 y 7, como por
ejemplo un tampón fosfato o acetato sódico 5 mM.
Los productos que pueden obtenerse mediante la
combinación de los procedimientos de preparación (etapas a a c),
separación (etapas d a g) y purificación (etapas g' a g''' y f' a
f''') se caracterizan porque el sobrenadante, obtenido del medio de
cultivo celular agotado en la etapa c) del procedimiento de
preparación, es tc-uPA recombinante. La
tc-uPA recombinante está en la forma
molecular de APM anteriormente definida y se obtiene en un grado de
pureza de más del 90%, y/o la tc-uPA está en
la forma de BPM anteriormente definida y se obtiene en un grado de
pureza de más del 90%, determinado mediante electroforesis analítica
de SDS-PAGE.
La tc-uPA recombinante
purificada (APM y/o BPM) está en la forma activa, como esto se
confirma mediante estudios funcionales y bioquímicos, y tiene un
grado de pureza terapéutico conforme con la Farmacopea europea. Por
tanto, no se necesita ningún otro procedimiento de tratamiento y/o
purificación, a diferencia de pro-uPA o
sc-uPA recombinante, preparado mediante las
tecnologías de ADN recombinante que pertenecen al estado de la
técnica. La forma molecular se confirma mediante datos estructurales
que se obtuvieron mediante espectroscopía de masas y análisis de N
terminal mediante degradación de Edman.
Como se determina mediante estudios funcionales,
como por ejemplo el estudio de la lisis de coágulos sanguíneos, la
determinación de las constantes de Michaelis-Menten,
determinación de enlaces del inhibidor I del activador del
plasminógeno (PAI-1), los productos recombinantes,
preparados según la presente invención, pueden diferenciarse
funcionalmente de la tc-uPA extraída porque
sus actividades en los estudios son completamente comparables a las
del producto natural extraído.
Además, derivan de manera ventajosa de células
CHO, que tienen una seguridad muy probada con respecto a la
preparación de proteínas recombinantes.
Las tc-uPA de APM y BPM
recombinantes purificadas según la presente invención pueden usarse
como potentes agentes fibrinolíticos para el tratamiento de
trombosis y para cualquier otro tipo de acontecimiento patológico
en el que sea necesario extirpar farmacológicamente un coágulo del
plasma. Su uso está confirmado por el buen uso clínico probado de
las formas extraídas naturales correspondientes.
Las tc-uPA de APM/BPM
recombinantes, que pueden obtenerse según el procedimiento según la
invención, pueden usarse para el tratamiento de acontecimientos
tromboembólicos que requieren la extirpación farmacológica de
coágulos, como por ejemplo oclusiones arteriales periféricas,
exposición del catéter, embolia pulmonar, trombosis venosa profunda
o para el tratamiento de infarto cardiaco.
La presente invención se describe en su mejor
forma de realización mediante los siguientes ejemplos
experimentales.
\newpage
Figura
1
Se muestra la SDS-PAGE reductora
de tc-uPA purificada obtenida después de la
adición de butirato 1,2 mM al medio de cultivo celular y
fermentación de 5 días.
En condiciones reductoras, la
tc-uPA se desdobla en la cadena A (20 KD) y
la cadena B (33 KD) y la sc-uPA se desplaza
hasta aproximadamente 55 KD. Banda 1: urocinasa purificada de un
cultivo de CHO recombinante crecido en ausencia de butirato de Na;
banda 2: urocinasa purificada de un cultivo de CHO recombinante
crecido durante cinco días en presencia de butirato de Na 1,2 mM.
Las condiciones de crecimiento se describen en el texto. Banda 3:
patrón de peso molecular.
Figura
2
La figura muestra los espectros de los análisis
de espectroscopía de masas de tc-uPA
recombinante y extraída (APM y BPM) de las formas nativa
(glucosilada; los dos espectros de arriba) y la desglucosilada (los
dos espectros de abajo).
Figura
3
El experimento se realizó mediante la adición de
0,5 ml de plasma humano a 100 \mul de urocinasa (1000 U/ml) y se
incubó a 42ºC durante 5 minutos. Se añadieron 100 \mul de trombina
(20 U/ml) a la mezcla y la absorción se midió a 660 nm durante 20
minutos a 42ºC.
Las zonas sombreadas de izquierda a derecha a
"tiempo 0 segundos" y a "tiempo 425 segundos" muestran A)
urocinasa recombinante; B) urocinasa extraída; C) plasma sin la
adición de trombina (ningún control de la formación de coágulo
sanguíneo); D) plasma con trombina, pero sin la adición de urocinasa
(control de la formación positiva de coágulos sanguíneos).
A tiempo 425 segundos se observa una lisis
completa cuando en el coágulo sanguíneo está presente urocinasa
recombinante o extraída.
Se muestra que la urocinasa recombinante y la
extraída (tc-uPA de APM) tienen el mismo
tiempo para la lisis de coágulos sanguíneos.
Ejemplo
1
La secuencia de ADNc que codifica la
pre-prourocinasa humana (correspondientemente la SEQ
ID D00244 en el banco de genes) se sintetizó a partir de ARNm de
una línea celular de riñones humanos (CAKI-1) según
los procedimientos que son bien conocidos en el estado de la
técnica, descritos, por ejemplo, en Molecular Cloning: A laboratory
Manual, Sambrook y col., Cold Spring Harbor Laboratory press,
(1989).
Resumiendo, el ADNc se sintetizó según las
indicaciones del fabricante mediante la reacción de la transcriptasa
inversa AMV (Böhringer-Mannheim) en presencia de la
mezcla de ARNm, oligo dT18 (Böhringer-Mannheim) y
una mezcla de cuatro desoxinucleótidos (dATP, dGTP, dCTP,
dTTP).
La mezcla de las moléculas de ADNc se amplificó
específicamente mediante PCR con los siguientes cebadores en 5' y
3':
Oligo 1 (5'):
^{5'}TAGCGCCGGTACCTCGCCACCATGAGA^{3'}
Oligo 2 (3'):
^{5'}TGGAGATGACTCTAGAGCAAAATGACAACCA^{3'}
Se obtuvo la secuencia de ADNc de 1296
nucleótidos de longitud que codifica la secuencia
pre-pro-UC humana y se clonó en un
vector de expresión integrante derivado de pBR322 que presenta las
siguientes características:
- -
- la secuencia pre-pro-UC humana, bajo el control del promotor previo del virus SV40 (Benoist C. & Chambon P. 1981, Nature 290:304-310),
- -
- el marcador de selección de TrpB para la selección metabólica en las células CHO-Messi (Hartman, SC Mulligan, RC (1988). Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU, 85: 8047-51),
- -
- resistencia a ampicilina (gen bla) como un marcador de resistencia antibiótica en E. coli.
- -
- la procedencia de la replicación de E. coli para la amplificación en E. coli.
El vector de expresión recombinante obtenido
finalmente se denominó pTZA9.
La línea celular CHO usada para la preparación
de tc-uPA recombinante fue la línea celular
CHO-Messi (ECACC, Porton Down, Salisbury, Reino
Unido, nº de registro 93080520).
Esta línea celular puede crecer en suspensión en
medio CHOMaster® químicamente definido (Ferruccio Messi Cell
Culture Technologies, Zürich, Suiza) sin la adición de suero o un
componente proteínico. El tiempo para la duplicación de esta línea
celular en un medio tal (medio completo y de elección) es de
aproximadamente 24 horas.
La transfección de las células
CHO-Messi con pTZA9 se realizó según el
procedimiento descrito en Felgner y col., (1987). Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU, 84: 7413-7417, en el que se
tuvieron en cuenta las recomendaciones del fabricante del reactivo
de transfección. Resumidamente, 1 \mug del vector de expresión
pTZA9 de ADN (de una disolución de 100 \mug/ml) se mezcló con 30
\mul de Lipofectin® (GIBCO BRL, Life Technologies) en
aproximadamente 500 \mul de células CHO-Messi de
crecimiento exponencial (aproximadamente 1 x 10^{6} células). La
mezcla de transfección se mantuvo 30 minutos a temperatura ambiente
antes de que se añadiera el medio CHOMaster® complementado con 25,1
mg/l de triptófano y se incubó durante toda la noche a 37ºC.
La línea celular CHO-Messi es
auxótrofa para triptófano y, por tanto, necesita totalmente este
aminoácido para el crecimiento. Después de la transfección de las
células CHO-Messi con el vector de expresión de
pre-prourocinasa, que también lleva el gen
triptófano-sintasa, las células
CHO-Messi se benefician de su capacidad adquirida
para producir triptófano y ahora logran crecer en un medio
químicamente definido en ausencia de triptófano después de la
adición de serina e indol.
Las células transfectadas estables se obtuvieron
después de la dilución limitante en medio CHOMaster® selectivo (sin
triptófano) mediante la adición de serina (0,02 g/l) e indol (0,35
g/l).
La selección de los clones productores de
urocinasa se produjo mediante la dilución de la mezcla de
transfección con medio CHOMaster® selectivo en pocillos de
microtitulación. Otro sistema que se usó para obtener los clones
por separado seleccionados que producen urocinasa consistió en
diluir en la relación 1:10 una suspensión celular de
aproximadamente 10^{3} células/ml con una disolución altamente
viscosa de 0,2 g/l de Methocel en medio CHOMaster® selectivo
mediante la adición de suero bovino fetal dializado al 4%. La mezcla
viscosa se colocó en una placa de agrupación de 24 pocillos y
después de 2 semanas los clones por separado se fijaron con una
punta de pipeta estéril y se inició un nuevo cultivo en
suspensión.
La siguiente estrategia de cultivo se aplicó
para la preparación del inóculo en el reactor biológico. Un cultivo
celular, fijado en pocillos de microtitulación, se repartió
adicionalmente en la relación 1:3 con medio CHOMaster® selectivo en
pocillos mayores (placa de agrupación de 24 pocillos y placa de
agrupación de 6 pocillos) y a continuación en recipientes T de 25
cm^{2} y 75 cm^{2}, cuando la densidad celular alcanzó
aproximadamente 4-5 x 10^{5} células/ml.
Manteniendo constante la relación de la división
(1:3) y la densidad celular a la que tuvo lugar la división en los
recipientes T, los cultivos se transfirieron en suspensión a frascos
de 2 l con agitación centrífuga (Integra Bioscience, Suiza) y
durante este procedimiento de crecimiento se usó un volumen de
trabajo de 1 l.
Ejemplo
2
En primer lugar se determinaron a escala de
laboratorio las condiciones óptimas con respecto a la concentración
de butirato y la temperatura. Los experimentos preliminares con el
fin de optimizar la concentración de butirato de Na se realizaron
en un cultivo de 1 l de la línea celular CHO recombinante (1 x
10^{6} células/ml) para alcanzar la mejor producción de
tc-uPA (APM y BPM) y la mayor capacidad de
desarrollo celular después de 5 días de cultivo en los frascos con
agitación centrífuga.
En la tabla 1 se indican la capacidad de
desarrollo celular y el rendimiento de uPA después de cultivo
de 5 días en cultivo en frasco de 1 l con agitación centrífuga a
37ºC y a distintas concentraciones de butirato de Na. La actividad
de uPA se siguió mediante un estudio cromógeno con uso de
Pefachrome® UK (54-46) (Pentapharm, LTD, Basilea,
Suiza) como sustrato cromógeno según las indicaciones del
fabricante; la capacidad de desarrollo celular se siguió cada día y
se determinó microscópicamente según el procedimiento de exclusión
de color con azul Trypan, como se describe en Doyle y col. A,
Griffiths, JB y Newell, DG (Eds.) (1994), en "Cell & Tissue
Culture: Laboratory Procedures". John Wiley & Sons. Nueva
York.
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\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la tabla 1, la concentración
de butirato de Na más efectiva con respecto al rendimiento de
uPA es 1,2 mM después de cultivo de 5 días en un frasco de 1
l con agitación centrífuga a 37ºC. A esta concentración, la
capacidad de desarrollo celular todavía es razonablemente alta
(76%), incluso en comparación con el control (92%). Una capacidad
de desarrollo celular mayor impide una contaminación demasiado
extensa del sobrenadante con cuerpos extraños celulares y con
proteínas que están relacionadas con el huésped y reduce la
cantidad de sustancias extrañas que deben eliminarse durante el
procedimiento de purificación.
Se realizó una segunda serie de experimentos en
butirato 1,2 mM en una fermentación de 5 días para determinar la
temperatura óptima en un cultivo de 2 l (1,5-2 x
10^{6} células/ml) de la línea celular CHO recombinante en un
reactor biológico.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la tabla 2 se muestra que 34ºC es la
temperatura que hace posible una alta velocidad de productividad de
uPA, junto con una alta capacidad de desarrollo celular.
Curiosamente, cuando el mismo experimento se realizó a 32ºC se
alcanzó una actividad de 3961 U/ml sólo después de 12 días con una
capacidad de desarrollo celular más pequeña (63%).
Se desea mucho la reducción del tiempo de
cultivo debido a motivos económicos, como también para mantener la
integridad de la proteína. En realidad se desea evitar una larga
exposición del producto recombinante a distintas enzimas
proteolíticas y glucolíticas que se derivan de células lisadas.
De los datos mostrados en la tabla 2 parece que
la reducción de la temperatura de cultivo hasta 34ºC, junto con la
adición de butirato de Na (1,2 mM) al medio de cultivo, provoca un
efecto sinérgico que resulta en un mejor rendimiento de uPA
activa.
De estos datos puede concluirse que el
tratamiento con butirato de Na 1,2 mM a una temperatura de 34ºC son
condiciones óptimas para la preparación de
tc-uPA activa y la capacidad de desarrollo
celular, en especial a una carga de cultivo de 5 días.
\newpage
Ejemplo
3
El inóculo de células se realizó en un reactor
biológico de 2,4 l (Infors HT, modelo Labforce, Bottmingen, Suiza)
mediante división de un cultivo celular de crecimiento exponencial.
La relación "volumen de inóculo/volumen de medio fresco" se
eligió entre 1:1 y 1:5 según la capacidad total del reactor
biológico y las condiciones del cultivo. Se eligió un volumen de
trabajo de 2 l y una densidad celular final del inóculo de 3 x
10^{5} células/ml.
El cultivo usado para el inóculo primario tenía
una capacidad de desarrollo celular de no menos del 95%. Durante el
crecimiento en el reactor biológico se controló el cultivo en
suspensión con respecto a la concentración de glucosa, que nunca se
mantuvo por debajo de 1 g/l en medio agotado.
Se fijaron los siguientes parámetros de
fermentación para el cultivo:
Temperatura: 37º \pm 0,5ºC,
pH: 7,15 \pm 0,1
pO_{2}: 50% \pm 20%
Cuando la densidad celular alcanzó valores de
aproximadamente 2 x 10^{6} células vivas/ml, las células se
eliminaron por separación del medio agotado mediante filtración
tangencial (o centrifugación). A continuación, las células se
volvieron a suspender en el reactor biológico en el mismo volumen
original de medio fresco CHOMaster® con adición de butirato de
sodio para obtener una concentración final de 1,2 mM.
La temperatura del cultivo se redujo hasta 34º
\pm 0,5ºC y los otros parámetros de fermentación se mantuvieron,
como se fijaron previamente, del siguiente modo:
Temperatura: 34º \pm 0,5ºC,
pH: 7,15 \pm 0,1
pO_{2}: 50% \pm 20%
La preparación de la u-PA
activa (tc-uPA de APM y BPM) se controló
mediante una prueba cromógena en un sustrato específico,
Pefachrome® UK. Se observó un aumento progresivo de la actividad
hasta valores máximos de 7000 UI/ml, alcanzados 4-5
días después de la fermentación. En este momento, las células se
cosecharon y a continuación se eliminaron y el medio de cultivo
agotado que contiene tc-uPA se sometió a una
purificación.
En la tabla 3 se muestra el nivel de preparación
medio basado en cuatro fermentaciones independientes:
En el reactor biológico se observó una reducción
paulatina de la capacidad de desarrollo celular desde el primer
hasta el quinto día de cultivo después de la adición de butirato de
sodio. El valor mínimo de la capacidad de desarrollo celular en
butirato 1,2 mM se observó en el quinto día de cultivo y no era
significativamente inferior al 70% y por tanto todavía es
relativamente alta. A estos valores se espera liberación limitada de
enzimas de degradación lisosomales en el medio de crecimiento.
Como se muestra en la tabla 3, el dramático
aumento de la expresión de tc-uPA aparece
principalmente durante el procedimiento de preparación, como se ha
descrito, durante los 2/3 últimos días de la fermentación después
de la adición de butirato de sodio. La resistencia de la mayor parte
de la urocinasa separada en el medio agotado es óptima cuando se
limita a 2/3 días a una temperatura de 34ºC. Esta combinación de
parámetros reduce la exposición de la proteína en comparación con
la actividad de degradación de las enzimas proteolíticas y
glucolíticas y hace posible una buena calidad de la proteína
recombinante que va a purificarse. En la figura 1 se muestran los
productos que se obtuvieron después de una fermentación en ausencia
o en presencia de butirato 1,2 mM, a una temperatura de 34ºC. En
las últimas condiciones puede reconocerse la transformación completa
de sc-uPA en tc-uPA,
cuando se compara con un cultivo en el que no se había añadido
butirato de Na.
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Ejemplo
4
El sobrenadante del cultivo crecido en el
reactor biológico, obtenido como se describe en el ejemplo 3, se
acidificó mediante la adición de CH_{3}COOH hasta un pH de 5,5 y
se liberó de cuerpos extraños celulares mediante filtración en un
filtro de 0,45 \mum. Se añadió 0,01% de Tween-80 y
el sobrenadante se aplicó sobre una columna de cromatografía de
intercambio iónico (SP Sepharose Big Beads,
Amersham-Pharmacia) que previamente se había
equilibrado con una disolución tampón fosfato de sodio 20 mM de pH
6,0. La columna era de 10 cm de altura y tenía un diámetro de 2,6
cm. La velocidad de flujo durante la aplicación y el lavado ascendió
a 10 ml/min y durante la elución a 2 ml/min.
Después de la aplicación, la columna se lavó en
primer lugar con 3 volúmenes de disolución tampón de pH 6, fosfato
de sodio 20 mM, NaCl 150 mM, para eliminar las impurezas no unidas
con urocinasa, y a continuación con otros 3 volúmenes de disolución
tampón de pH 6,0, fosfato de sodio 20 mM, NaCl 250 mM, para eluir
principalmente tc-uPA de BPM. Por último se
almacenó congelada para una purificación posterior.
La elución de tc-uPA de
APM se realizó dejando correr a través de la columna de
intercambio iónico una disolución tampón de pH 6,0, fosfato de
sodio 20 mM, cloruro sódico 500 mM.
El eluato obtenido, que contiene urocinasa
(tc-uPA de APM) se llevó a pH 6,5 mediante la
adición de NaOH 1 N. A continuación se aplicó sobre una columna de
afinidad de benzamidina Sepharose 6B que previamente se había
equilibrado con por lo menos 2 volúmenes de una disolución tampón de
pH 6,5, fosfato de sodio 20 mM, NaCl 400 mM.
La columna era de 10 cm de altura y tenía un
diámetro de 2,6 cm. La velocidad de flujo durante la aplicación, el
lavado y la elución ascendió a 2,5 ml/min.
A continuación, la columna se lavó con 2
volúmenes de una disolución tampón de pH 6,5, fosfato de sodio 20
mM, NaCl 400 mM, y finalmente se eluyó con 2,5 volúmenes de
disolución tampón de pH 4,0, acetato de sodio 100 mM, NaCl 400
mM.
La columna de benzamidina hizo posible
deshacerse de las impurezas no unidas con urocinasa, como también de
cantidades indetectables de sc-uPA, si es
que pudieran estar presentes en la aplicación.
Las fracciones que contienen
tc-uPA de APM se identificaron cuando
pertenecieron a un pico relativamente homogéneo y claro en el
cromatograma y se vaciaron juntas.
El vaciado conjunto obtenido se aplicó sobre una
columna de filtración en gel (separación basada en la exclusión del
tamaño molecular). La columna de filtración en gel tenía una altura
de 30 cm y un diámetro de 2,6 cm y se equilibró previamente con una
disolución tampón de pH 4,9 de fosfato de sodio 5 mM. La velocidad
de flujo aplicada ascendió a aproximadamente 3 ml/min.
Así, la urocinasa tc-uPA de
APM se eluyó en su forma pura, realizándose la elución con una
disolución tampón de pH 4,9 de fosfato de sodio 5 mM, como se
muestra en la figura 1 (banda 2).
La urocinasa se preparó finalmente para llevarse
a un tampón que es adecuado para una liofilización definitiva.
La(s) fracción(fracciones) que se
correspondió (correspondieron) con tc-uPA de
BPM, recogida(s) en el lavado de la columna de
intercambio iónico con disolución tampón de pH 6,0, fosfato de sodio
20 mM, NaCl 250 mM, se vaciaron juntas y a continuación se
purificaron mediante una columna de cromatografía de afinidad de
benzamidina. Antes de aplicarse sobre esta columna, el vaciado
conjunto se llevó a pH 6,5 ó 7,0 mediante la adición de NaOH 1 N, y
la columna se equilibró previamente con por lo menos 2 volúmenes de
una disolución tampón de pH 6,5, fosfato de sodio 20 mM, NaCl 400
mM. Después de la aplicación, la columna se lavó con 2 volúmenes de
disolución tampón de pH 6,5, fosfato de sodio 20 mM, NaCl 400 mM, y
finalmente se eluyó con 2,5 volúmenes de disolución tampón de pH
4,0, acetato de sodio 100 mM, NaCl 400 mM. Las fracciones que
contienen tc-uPA de BPM se identificaron
cuando pertenecieron a un pico relativamente homogéneo y claro en el
cromatograma y se vaciaron juntas.
El vaciado conjunto obtenido se aplicó sobre una
columna de filtración en gel (separación basada en la exclusión del
tamaño molecular) con una altura de 30 cm y un diámetro de 2,6 cm,
que se equilibró previamente con disolución tampón de pH 4,9 de
fosfato de sodio 5 mM. La velocidad de flujo aplicada ascendió a
aproximadamente 3 ml/min.
Así, la urocinasa tc-uPA de
APM se eluyó en su forma pura, realizándose la elución con una
disolución tampón de pH 4,9 de fosfato de sodio 5 mM, y se preparó
finalmente para llevarse a un tampón que es adecuado para una
liofilización definitiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La caracterización de la
tc-uPA de APM recombinante se realizó en
estudios comparativos con tc-uPA de APM
extraída que puede obtenerse en el comercio (Ukidan®, Serono)
mediante espectroscopía de masas y estudios funcionales.
Los datos de espectroscopía de masas, cuya
exactitud puede variar en el intervalo de +/- 50 Da a +/-100 Da,
confirman que la masa molecular se correspondió con la que era de
esperar después del correcto tratamiento de la proteína precursora
(sc-uPA) y, en especial, como se muestra en
la figura 2, que
- la tc-uPA de APM
recombinante, preparada según el procedimiento de la invención, y la
extraída, que puede obtenerse en el comercio, tenían masas
moleculares muy similares de 48267 Da o 48565 Da;
- si se desglucosilan, ambas formas también
tenían masas moleculares muy similares de 46382 (recombinante) y
46313 Da (extraída);
- de manera similar, los análisis de la
tc-uPA de BPM recombinante, preparada según
el procedimiento de la invención, y la extraída, mostraron masas
muy próximas en la forma glucosilada (33249 Da o 33189 Da) y no
glucosilada (31029 ó 30969).
Además, el análisis de espectroscopia de masas
de MALDI-MS mostró que las moléculas purificadas
están sumamente intactas (>95%), con otras palabras se confirmó
que los productos de degradación referidos a uPA están
presentes en cantidad irrelevante, y que por tanto los
procedimientos de purificación elegidos no perjudican la integridad
de la molécula recombinante.
El tratamiento correcto en el N terminal se
confirmó mediante la degradación de Edman de
tc-uPA de APM purificada. Como se esperaba,
la secuencia terminal en NH_{2} de la cadena B se determinó
como
-IIGGEF-,
mientras que la secuencia terminal en NH_{2}
de la cadena A era
-SNELHQ-
como se esperaba.
Estos datos mostraron que la disociación
proteolítica aparece exactamente y específicamente en el enlace
Lys^{158}-Ile^{159}, y que Lys^{158} se
elimina correctamente del resto de la molécula. Además, el análisis
de la distribución de péptidos confirmó la existencia de extremos
de NH_{2} y C correctos en las cadenas A y B de la
tc-uPA de APM recombinante.
Los glucanos se analizaron en
tc-uPA recombinante purificada mediante
espectroscopía de masas y electroforesis de carbohidratos asistida
por fluorescencia (FACE). Ambos procedimientos dieron a conocer una
glucosilación estable: los N-glicanos recombinantes
derivados de urocinasa están compuestos por dos, tres y cuatro
cadenas complejas de tipo sensor adaptadas al núcleo con un grado
de sialilación del 80-90%. El sitio de mutación
para la glucosilación se determinó mediante espectroscopía de masas
y se confirmó que la glucosilación en Asn^{302} apareció en
tc-uPA.
\newpage
La actividad biológica de
tc-uPA de APM recombinante también se
determinó mediante medición:
- \bullet
- Análisis de K_{d} del enlace de urocinasa al receptor natural (véase la tabla 4);
- \bullet
- Análisis de la actividad inhibidora estequiométrica del inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-1), que es el inhibidor natural de urocinasa;
- \bullet
- Análisis de la cinética de la inhibición mediante PAI-1 (véase la tabla 4);
- \bullet
- Estudio del parámetro enzimático Km en el sustrato cromógeno (véase la tabla 4);
- \bullet
- Estudio de la cinética de activación del plasminógeno;
- \bullet
- Capacidad de lisis de coágulos sanguíneos (figura 3);
- \bullet
- Degradación de fibrina.
Los datos mostrados en la tabla 4 muestran la
identidad esencialmente funcional de tc-uPA
de APM recombinante, preparada según el procedimiento de la
invención, y de tc-uPA de APM extraída que
puede obtenerse en el comercio. En especial se muestra que los dos
productos tienen:
- (a)
- Constantes de velocidad similares (k_{1}) para la formación de complejos con PAI-1, medidas según Chmielweska y col. Biochem. J. 1988, 251:327-332,
- (b)
- Constantes de Michaelis-Menten similares (Km) para el sustrato de urocinasa, medidas según Briggs, GE y Haldane JBS, Biochem. J. 1925, 29:338-339 y Lijnen, HR y col. Eur. J, Biochem. 1994, 224:567-574, y
- (c)
- Constantes de afinidad similares para el receptor de urocinasa (Kd), medidas según: Cubellis, M.V. y col., J. Biol. Chem., 1986, 261:15819-15822
Claims (8)
1. Procedimiento para la preparación de una
u-PA de cadena doble recombinante
completamente desarrollada (tc-uPA) en medio
de cultivo de una línea celular eucariota, que está transfectada con
una secuencia de ADNc de precursor clonado, que comprende una
incubación a una temperatura entre 33ºC y 35ºC de la línea celular
mencionada en el medio de cultivo celular, en el que se han añadido
ácido butírico o sus sales, durante un tiempo entre 48 y 200 horas,
y en el que la eficacia de la transformación del precursor, es
decir, u-PA de cadena simple
(sc-uPA) en la uPA de cadena doble
activa (tc-uPA) es superior al 95%.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la secuencia de ADNc mencionada codifica
un precursor de proteína.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la secuencia de ADNc del precursor
mencionado codifica pre-prourocinasa humana.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la uPA de cadena doble es de
APM.
5. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la uPA de cadena doble es de
BPM.
6. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las sales de ácido butírico mencionadas
se seleccionan de butirato de sodio y butirato de magnesio.
7. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la línea celular eucariota mencionada es
una línea celular de un mamífero, seleccionada de
HEK-293, CV-1, COS,
BSC-1, MDCK, A-431, CHO, BHK,
CHO-Messi.
8. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el medio de cultivo celular mencionado
es sin suero.
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