JP3751144B2

JP3751144B2 - 新規システインプロテアーゼ

Info

Publication number: JP3751144B2
Application number: JP04297398A
Authority: JP
Inventors: 英治一島; 兆宏川端
Original assignee: T Hasegawa Co Ltd
Current assignee: T Hasegawa Co Ltd
Priority date: 1998-02-10
Filing date: 1998-02-10
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2018-02-10
Also published as: JPH11225756A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、塩基性タン白質、例えば、プロタミン、ヒストン等を選択的に分解する基質特異性を有し、アルギニンに富んだ低分子のペプチドを容易に製造することができ、例えば、生理活性ペプチドとしての利用の如き医薬品分野、飲食品分野、その他のプロテアーゼ利用分野において有用なシステインプロテアーゼ及びその製法に関し、更に詳しくは、マダラ（鱈科）白子由来の新規なシステインプロテアーゼ及びその製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から市販されているプロテアーゼは、例えば、プロタミン等の塩基性タン白質を分解することは困難であり、塩基性タン白質の分解方法としては塩酸を添加して加水分解することが行われている。しかし、この塩酸分解では、最終生産物に塩素化合物が混入する危険性があるうえ、アミノ酸単位にまで分解されてしまうため、分解産物は生理活性を失うという欠点がある。
【０００３】
一方、塩基性タン白質によく作用するプロテアーゼとしては、例えば、細菌から単離されたサーモリシン（thermolysin）（EC 3.4.24.27)[Adv.Enzymol.41,179(1974)]、カビからのペニシロリシン（penicillolysin）[Agric.Biol.Chem.55,2191(1991)]が知られているが、これらの酵素はいずれも金属酵素であり、本発明の酵素とは本質的に異なる。また、魚の筋肉中より単離されたカテプシンB,L,H[Comp.Biochem.Physiol.96B,No.2,247(1990)及びComp.Biochem.Physiol.96B,No.4,733(1990)]が知られているが、本発明の酵素とは基質特異性が異なり、収量が少なく、工業的な実用性は乏しい。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記した如き従来の技術におけるプロテアーゼを用いた方法では、塩基性タン白質を効率よく分解して、飲食品、医薬品等に有用な生理活性に優れた低分子のペプチドを得ることは困難である。そこで、安全性の要求される食品工業及び医薬品分野で利用できる生理活性ペプチドを安全かつ効率よく得ることができる、新規な塩基性タン白質分解酵素の開発が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、食品とされる天然素材からの塩基性タン白質をよく分解する酵素のスクリーニングにつき鋭意研究を重ねた結果、鮭、鱒、鰊、鱈、鮪、鰹等の魚類の白子に強い分解活性があることを見出し、それから塩基性タン白質に作用する酵素を単離、精製し、その酵素的性質を解明し[Comp.Biochem.Physiol.117B,No.3,445(1997)及び、Biosci.Biotech.Biochem.,61,1405(1997)]、先に、鮭の白子から得られた新規なシステインプロテアーゼに関する特許出願を行なった（特願平８−２５５２８１号）。引き続きマダラの白子について研究を重ねた結果、今回、鮭の白子から得られた新規なシステインプロテアーゼと作用は類似するが、分子量、至適温度等が異なる明らかに別異で新規なシステインプロテアーゼを見出し本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明により得られる酵素は、新規なエンド型システインプロテアーゼであり、塩基性タン白質であるプロタミン、ヒストン等を選択的に分解する基質特性を有する。
【０００７】
しかして、該酵素を用いることにより、プロタミン等の塩基性タン白質からアルギニンに富んだ生理活性ペプチドを容易に得ることができるほか、該酵素は、アンギオテンシンIのＣ末端His-Leuを切断し、アンギオテンシンIIに変換するアンギオテンシン変換酵素の作用も持つため、医薬品への応用が期待される。しかも、原料であるマダラの白子は、食用とされているもので安全であり、また、安価に入手できるため製造コストも低く、食品工業への応用に最適である。
【０００８】
以下、本発明の酵素の製法、理化学的性質等について更に詳しく説明する。
【０００９】
本発明により提供されるエンド型システインプロテアーゼはマダラの白子から採取することができ、生鮮品，冷凍品及び塩蔵品のいずれも利用することができる。
【００１０】
これらマダラの白子からエンド型システインプロテアーゼを分離採取する方法としては，例えば，白子を磨砕処理した後，磨砕物１重量部に対して、通常約１〜約１０重量部、好ましくは約３〜約８重量部の水もしくはｐＨ約５〜７の緩衝液を加えて撹拌抽出し，好ましくは抽出液を再度ｐＨ約５〜６に調整した後、得られる抽出水層部を遠心分離し、脂肪を分離除去し，更にこの水層部をケイソウ土，セルロースなどの濾過助剤を用いて濾過し，清澄な粗酵素液を得る方法を例示することができる。
【００１１】
得られる粗酵素液は，場合により、凍結濃縮，減圧濃縮，限外濾過などの適当な濃縮手段を用いて、該酵素の活性低下をきたさない温度，例えば，約４０℃以下の温度で濃縮することにより粗酵素濃縮物とすることができる。
【００１２】
さらに、該濃縮液は、硫酸アンモニウム塩析、陰イオン交換樹脂、例えばＲｅｓｏｕｒｃｅＱ、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシアバイテク社製）など、あるいはアフィニテイカラム、例えば、ＡｒｇｉｎｉｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ファルマシアバイテク社製）などで分離・溶出し、この溶出液について、例えば、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（ファルマシアバイテク社製）などのゲル濾過カラムを用いて活性画分を分取し、単一成分として分離精製することができる。
【００１３】
本発明のマダラ白子由来の新規なシステインプロテアーゼは、先に出願した鮭白子由来の新規なシステインプロテアーゼと同様、ペプチド及びタンパク質の一次構造におけるＬｙｓ−Ａｒｇ及びＡｒｇ−Ａｒｇ配列を認識して、該配列のＣ末端側を切断する基質特異性を有するエンド型システインプロテアーゼであり、これまで知られていた塩基性タン白質に作用するプロテアーゼとは全く異なる新規な酵素である。
【００１４】
以下、本発明のシステインプロテアーゼの酵素学的性質について説明する。
【００１５】
(１) 酵素作用：
本酵素はｐＨ３乃至６．０の弱酸性下でペプチド及びタンパク質の一次構造におけるＬｙｓ−Ａｒｇ及びＡｒｇ−Ａｒｇ配列を認識して、該配列のＣ末端側を切断する。
【００１６】
（２）基質特異性
本発明のシステインプロテアーゼの低分子合成基質に対する基質特異性を下記表１に示す。
【００１７】
【表１】

【００１８】
＊ＭＣＡは４−メチルクマリル−７−アミド基、Ｂｚはベンゾイル基、Ｚはベンジルオキシカルボニル基、Ｓｕｃはサクシニル基、そしてＢｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニル基をそれぞれ表わす。
【００１９】
＊＊合成基質ベンジルオキシカルボニル−アルギニル−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（以下、Z-Arg-Arg-MCAと表記することがある）に対する活性を100％とした場合の相対活性（％）。ｐＨ６及び３０℃にて測定。
【００２０】
酵素反応には、活性化剤であるシステイン塩酸塩(2mM)を添加した。
【００２１】
表１の結果から明らかな如く、本発明の酵素は、カテプシンＢ、Ｌがよく分解するArg-MCAやBz-Arg-MCAをほとんど分解しないが、Lys-Arg及びArg-Arg配列をよく認識して、該配列のＣ末端側を切断する基質特異性を有する。
【００２２】
また、本発明の酵素のように、Lys-Arg及びArg-Arg配列を認識し切断する特異性は、生体内のプロセシングに関与する酵素として認められているが、今まで見出されてきた酵素はすべて活性中心がセリンであるプロテアーゼ群である。この点からも本発明の酵素が生体内プロセシングの作用をもつ新規なシステインプロテアーゼであると言える。
【００２３】
(３) 作用至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
本発明のシステインプロテアーゼを基質Z-Arg-Arg-MCAに作用させた場合のｐＨと酵素活性との関係を図１に示す。図１から明らかなように、本発明のシステインプロテアーゼの至適ｐＨは６である。また、各種ｐＨの酢酸緩衝液（３０℃）中での本発明の酵素の残存活性をプロットした図２から明らかなように、本発明の酵素の安定ｐＨ範囲はｐＨ約３〜ｐＨ約６の範囲である。
【００２４】
（４）作用至適温度及び熱安定性
本酵素の作用至適温度及び熱安定性について測定した結果を図３及び図４に示す。反応はZ-Arg-Arg-MCAを基質とし、ｐＨ６の酢酸緩衝液（2mM システイン塩酸塩)中にて行った。至適温度は２０〜８０℃における５分間の活性を測定することにより、また、熱安定性は上記の緩衝液にて希釈した酵素液をそれぞれの温度に１０分及び３０分インキュベートした後、３０℃にて活性を測定することにより決定した。
【００２５】
その結果、本酵素の作用適温の範囲は４０℃〜６０℃であり、至適温度は６０℃であり、３０℃以下あるいは７０℃以上の温度においてその活性は５０％以下であった。
【００２６】
(５) ｐＨ、温度などによる失活の条件
ｐＨ８以上において３０分、または５０℃、３０分間の加熱でほぼ完全に失活する。
【００２７】
(６) 活性化剤及び阻害剤に対する影響
本発明の酵素を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で各種活性化剤及び阻害剤とともに３０℃で３０分間前インキュベートしたものを用いて、合成基質Z-Arg-Arg-MCAに作用させたときの残存活性の変化を調べた。その結果を下記表２に示す。
【００２８】
【表２】

【００２９】
＊コントロールは活性化剤、阻害剤を添加しないときの酵素活性で、表中の活性はこのコントロールを１００としたときの相対活性で示す。
【００３０】
＊＊各略記号の意味は次ぎのとおりである。
【００３１】

ＺＰＣＫ：ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニルクロロメタンこの結果より、本発明の酵素は、システイン塩酸塩、ＤＴＴ及び２−メルカプトエタノールにより活性は著しく増加することがわかる。このことから、本発明の酵素の活性中心には−ＳＨ基が関与していることが考えられる。また、Ｅ−６４、Ｎ−エチルマレイミド、ＰＣＭＢ、ヨード酢酸アミド、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ＺＰＣＫ、ロイペプチンにより完全に阻害されることから、本発明の酵素の活性中心はシステイン残基であると判断される。また、金属プロテアーゼの特異的阻害剤であるオルトーフェナンスロリンにより完全に阻害されることから、鮭白子由来のシステインプロテアーゼ（以下、ミルトパインと略称することがある）と類似の活性中心構造をもつことが予想される。
【００３２】
(７）力価測定法及び力価表示
力価の測定は，基質ペプチジル−４−メチル−クマリル−７−アミド（peptidyl-MCA）の加水分解により生成する蛍光性の７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の量を蛍光光度計にて定量することによって行った。すなわち、酵素液２０μｌと、２ｍＭのシステイン塩酸塩を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を混合し、３０℃，２０分間予熱の後，これにジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した１０ｍＭのZ-Arg-Arg-MCAもしくはBoc-Leu-Arg-Arg-MCAもしくはBoc-Leu-Lys-Arg-MCAもしくはBoc-Gln-Arg-Arg-MCAを５μｌ加え、すばやく混合し一定時間の蛍光の増加を測定する方法にて行った。また、本酵素のカイネティクパラメーターＫｍ及びＶｍａｘは、Ｈａｎｅｓ−ＷｏｏｌｆＰｌｏｔを用いて測定した。
【００３３】
蛍光は、Ｆ−２０００型蛍光光度計（日立製）により、３６０ｎｍの励起光を用いて、４４０ｎｍで測定する。この際、反応液の液温が３０℃になるようにセル槽の温度をコントロールする。
【００３４】
酵素単位は，上記の条件で１秒間に１モルの７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）を生成することのできる酵素量を１酵素単位：１カタール（１ｋａｔ）として算定し，酵素活性（kat／mｌ）として表わす。また、Ｈａｎｅｓ−ＷｏｏｌｆＰｌｏｔをとることにより、Ｋｍ：Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ定数及びＶｍａｘ（最大速度）を求める。さらに、Ｅ−６４を用いた活性部位滴定法にて測定した本酵素の酵素濃度（０．１２７μＭ）と酵素の反応速度との関係よりκcat（モル速度）を求める。本発明の酵素のＫｍ値、κcat、及びκcat／Ｋｍを下記表３に示す。
【００３５】
【表３】

【００３６】
(８) 精製方法
本発明のシステインプロテアーゼは、前記した如くマダラの白子を脱脂後、水または緩衝液を用いて抽出された粗酵素液を限外濾過等により濃縮し、この濃縮液を前記したような硫酸アンモニウムによる塩析、陰イオン交換樹脂やゲル濾過カラムを用いることで活性画分を単一成分に分離精製する。例えば、粗酵素濃縮物に２０％飽和量の硫酸アンモニウムを添加溶解後遠心分離し、その上澄液にさらに７０％飽和量の硫酸アンモニウムを添加溶解後遠心分離し沈殿を得る。この沈殿を透析後、陰イオン交換樹脂であるＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシアバイテク社製）を用いて活性画分を分画する。次に、この活性画分をＳｕｐｅｒｏｓｅ１２１０／３０（ファルマシアバイテク社製）を用いてゲル濾過し、活性画分を分離した後、その活性画分をＡｒｇｉｎｉｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ファルマシアバイテク社製）を用いてアフィニティークロマトグラフィーし、活性画分を分画する。更に、その活性画分をＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（ファルマシアバイテク社製）を用いて単一成分に精製する。
【００３７】
このようにして分画精製したシステインプロテアーゼ活性を示す画分をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにて電気泳動した結果を図５に示す。図５からも明らかな如く、本酵素画分は未変性の状態では均一のタン白質であることが確認される。精製方法の具体例は後記実施例１〜５に示すとおりである。
【００３８】
（９）分子量
本発明の酵素の未変性状態での分子量は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２によるゲル濾過での保持時間より推定を行ったところ、約５４，０００であった。また、変性後の相対分子量を非連続のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Nature 227,680,1970)により求めたところ、図６に示した如く約７２，０００であった。
【００３９】
（１０）等電点
等電点電気泳動により等電点を測定したところ本発明の酵素の等電点は図７で明らかな如く、５．２２であった。
【００４０】
以上の如く、本発明の酵素は作用至適ｐＨが６、安定ｐＨ範囲がｐＨ３〜６であり、カテプシンＢにやや近い性質も示すが、Bz-Arg-MCAを分解しない点や、Z-Phe-Arg-MCAよりもZ-Arg-Arg-MCAをはるかによく分解する点などカテプシンＢとは明確に異なる特異性を有し、前記したように、鮭白子のミルトパインと類似の性質を示す。さらに、カテプシンＢの分子量（ゲル濾過）は２５，０００（ヒト由来）あるいは２９，０００（サケ筋肉由来）であり、本発明の酵素の７２，０００よりかなり小さく、鮭白子のミルトパインの分子量（２２，３００）とも大きく異なることが確認された。
【００４１】
以上の理由により、本発明の酵素は従来既知のプロテアーゼとは別異の新規なシステインプロテアーゼであると考えられる。
【００４２】
以下、実施例により本発明について更に具体的に説明する。
【００４３】
【実施例】
実施例１
２５℃の軟水４．５ｋｇに生のマダラの白子（北海道産）１．５ｋｇを添加し、ｐＨを６．０に調整後ミキサー等でホモジナイズした。この液を遠心分離（５０００Ｇ×２０分間）し、上層の水溶液５．３５ｋｇを得た。更に、この水溶液をケイソウ土濾過し、抽出液５．３０ｋｇを得た。この抽出液のｐＨ６．０におけるカルボベンゾキシ−アルギニル−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）を基質とする酵素活性を測定した結果、６５ｎｋａｔ／ｍｌであった（以下、この抽出液を「タラ白子システインプロテアーゼ１」と称する）。
【００４４】
実施例２
実施例１で得られたタラ白子システインプロテアーゼ１の５．３０ｋｇに硫酸アンモニウム６０４ｇを徐々に加え、かき混ぜて溶解させた後、４℃で１５時間静置した。次いで、遠心分離により沈殿を除き分離液５．７４ｋｇを得た。この分離液に硫酸アンモニウム１８７０ｇを加えて溶解し、４℃で１５時間静置後遠心分離を行い、析出沈殿物１２．３ｇを得た。この沈殿物をｐＨ６．０の酢酸緩衝液４０ｍｌに溶解し、得られた溶液を透析チューブ（ＵｎｉｏｎＣａｒｂｉｄｅｃｏｒｐ．社製）を用いて同じ緩衝液で透析処理して脱塩を行った。その結果、酵素液６２．０ｇを得た。この酵素液のｐＨ６．０におけるＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質とする酵素活性を測定した結果、５．３２μｋａｔ／ｍｌであった（以下、この抽出液を「タラ白子システインプロテアーゼ２」と称する）。
【００４５】
実施例３
実施例２で得られたタラ白子システインプロテアーゼ２の１．０ｇをｐＨ６．０の酢酸緩衝液にて平衡化した直径１．６ｃｍ×１０ｃｍのＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシアバイテク社製）に供し、同緩衝液で塩化ナトリウム濃度が０〜１．０Ｍまでのグラジエント溶出を行い、本発明の酵素活性をもつ画分８ｍｌを得た。この分画物の活性は７０８ｎｋａｔ／ｍｌ；１３９５ｋａｔ／ｋｇであった。（以下、この抽出液を「タラ白子システインプロテアーゼ３」と称する）。
【００４６】
実施例４
実施例３で得られたタラ白子システインプロテアーゼ３の５０ｍｌを限外濾過膜（ウルトラフリー１５：日本ミリポア社製）にて１０倍に濃縮したものを０．５ｍｌづつ、ｐＨ６.０の酢酸緩衝液（含２００ｍＭ塩化ナトリウム）にて平衡化した直径１．０ｃｍ×３０ｃｍのＳｕｐｅｒｏｓｅ１２（ファルマシアバイテク社製）に供し、同緩衝液にて溶出を行い、本発明の酵素活性をもつ画分７ｍｌを得た。この分画物の活性は６８４ｎｋａｔ／ｍｌ；３７５０ｋａｔ／ｋｇであった（以下、この抽出液を「タラ白子システインプロテアーゼ４」と称する）。
【００４７】
実施例５
実施例４で得られたタラ白子システインプロテアーゼ４を限外濾過膜（ウルトラフリーＣＬプラス：日本ミリポア社製）にて５倍に濃縮したものを、ｐＨ６．０の酢酸緩衝液にて平衡化した直径０．６４ｃｍ×３ｃｍのＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（ファルマシアバイテク社製）に供し、同緩衝液で塩化ナトリウム濃度０〜１．０Ｍまでグラジエントを行い、本酵素活性をもつ画分５ｍｌを得た。この分画物の活性は、３９２ｎｋａｔ／ｍｌ；２１００ｋａｔ／ｋｇであった（以下、この抽出液を「タラ白子システインプロテアーゼ５」と称する）。
【００４８】
このタラ白子システインプロテアーゼ５の酵素的性質は前記のとおりである。
【００４９】
【発明の効果】
本発明によれば、他のプロテアーゼでは分解しにくかった塩基性タン白質をよく分解し、安全性の要求される食品や医薬品分野等で有用な生理活性ペプチドの製造等に応用可能なエンド型システインプロテアーゼを、安価に入手できる魚類のマダラの白子から得ることができる。また、本発明の酵素はプレホルモン変換酵素の作用も持つため、今後の医薬品への応用が考えられる重要な酵素である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素の至適ｐＨ範囲の測定結果を示すグラフである。
【図２】本発明の酵素の安定ｐＨ範囲の測定結果を示すグラフである。
【図３】本発明の酵素の至適温度範囲の測定結果を示すグラフである。
【図４】本発明の酵素の安定温度範囲の測定結果を示すグラフである。
【図５】本発明の酵素のポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）図である。
【図６】本発明の酵素のＳＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）図である。
【図７】本発明の酵素の等電点を求めた等電点電気泳動の測定結果である。

Claims

ペプチド及びタンパク質中の一次構造におけるＬｙｓ−Ａｒｇ及びＡｒｇ−Ａｒｇ配列をよく認識して、該配列のＣ末端側を切断する基質特異性を有し、分子量が約７２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）であり、等電点が５．２２であることを特徴とするエンド型システインプロテアーゼ。
次の理化学的性質
（１）酵素作用
弱酸性下で特に塩基性タンパク質もしくはペプチドをよく加水分解する
（２）基質特異性
ペプチド及びタンパク質の一次構造におけるＬｙｓ−Ａｒｇ及びＡｒｇ−Ａｒｇ配列をよく認識して、該配列のＣ末端側を切断する基質特異性を有する
（３）至適ｐＨ：ｐＨ６（基質としてＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いて測定、ここでＺはベンジルオキシカルボニル基であり、ＭＣＡは４−メチルクマリル−７−アミド基である）
（４）安定ｐＨ範囲：ｐＨ３〜６のｐＨ域で安定である（基質としてＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いて測定）
（５）作用適温の範囲：４０〜６０℃
（６）ｐＨ８以上において３０分または５０℃、３０分でほぼ完全に失活する
（７）阻害、活性化及び安定化
ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、システイン塩酸塩により活性化され、Ｎ−［Ｎ−（Ｌ−３−トランス−カルボキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−ロイシル］−アグマチン、Ｎ−エチルマレイミド、パラクロローマーキュリー安息香酸、ヨード酢酸アミド、オルトーフェナンスロリン、Ｎ^α−トシル−Ｌ−リジル−クロロメチルケトン、Ｎ−トシル−フェニルアラニルクロロメタン、ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニルクロロメタン、ロイペプチンにより完全に阻害される
（８）分子量：約７２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）、約５４，０００（ゲル濾過による）
（９）等電点：５．２（等電点電気泳動により）
を有する請求項１記載のエンド型システインプロテアーゼ。