RS66535B1

RS66535B1 - Bispecifična anti-bcma x anti-cd3 antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS66535B1
Application number: RS20250180A
Authority: RS
Inventors: Eric Smith; Kara Olson; Frank Delfino; David Dilillo; Jessica Kirshner; Olga Sineshchekova; Qian Zhang
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2025-03-31
Also published as: NL301335I2; MX2025005515A; PT3823664T; MA53168A; SG11202100252SA; HUS2500032I1; ES3010285T3; JP7586974B2; JP2021531005A; EP4516810A2; KR20210034032A; MD3823664T2; AU2019307928A1; US12258412B2; IL279974B1; EP3823664B1; BR112021000186A2; LTPA2025526I1; EP4516810A3; PH12021550031A1

Description

Opis pronalaska

OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na bispecifične molekule koji vezuju antigen (npr. bispecifična antitela), koji vezuju antigen sazrevanja B-ćelija (BCMA) i CD3, i postupke njihove upotrebe.

STANJE TEHNIKE

[0002] Antigen sazrevanja B-ćelija (BCMA), takođe poznat kao TNFRSF17, ili CD269, transmembranski je protein tipa III kome nedostaje signalni peptid i koji sadrži vanćelijski domen bogat cisteinom. BCMA, zajedno sa blisko srodnim proteinima, pospešuje preživlјavanje B-ćelija u različitim stadijumima razvoja. BCMA je eksprimiran isklјučivo u ćelijama B-ćelijske loze, posebno u interfolikularnom regionu germinalnog centra, kao i na plazmablastima i diferenciranim plazma ćelijama. BCMA se selektivno indukuje tokom diferencijacije plazma ćelija i neophodan je za optimalno preživlјavanje dugoživećih plazma ćelija u kosnoj srži. Kod multiplog mijeloma, BCMA je široko eksprimiran na malignim plazma ćelijama u povišenim nivoima, a ekspresija BCMA se povećava sa progresijom od normalnih ćelija ka aktivnom multiplom mijelomu. BCMA je takođe eksprimira u drugim B-ćelijskim malignitetima, uklјučujući Valdenstromovu makroglobulinemiju, Burkitov limfom i difuzni B-krupnoćelijski limfom. Tai i saradnici, Immunotherapy, 7(11):1187-1199, 2015.

[0003] CD3 je homodimerni ili heterodimerni antigen eksprimiran na T-ćelijama koji je udružen sa kompleksom T-ćelijskog receptora (TCR) i neophodan za aktivaciju T-ćelija. Funkcionalan CD3 se obrazuje dimernim udruživanjem dva od četiri različita lanca: epsilon, zeta, delta i gama. Dimerni aranžmani CD3 uklјučuju gama/epsilon, delta/epsilon i zeta/zeta. Pokazano je da antitela na CD3 grupišu CD3 na T-ćelijama, čime prouzrokuju aktivaciju T-ćelija na način koji je sličan angažovanju TCR od strane MHC molekula sa vezanim peptidima. Anti-CD3 antitela su stoga predložena u terapijske svrhe koje uklјučuju aktivaciju T-ćelija. Dodatno, bispecifična antitela koja su sposobna da vezuju CD3 i cilјni antigen, predložena su za terapijske upotrebe koje uklјučuje cilјano delovanje T-ćelijskih imunksih odgovora na tkiva i ćelije koji eksprimiraju cilјni antigen.

[0004] WO 2017/031104 opisuje anti-BCMA antitela, bispecifične molekule koji vezuju antigen, koji vezuju BCMA i CD3, i njihove upotrebe. WO 2014/047231 opisuje anti-CD3 antitela, bispecifične molekule koji vezuju antigen i vezuju CD3 i CD20, kao i njihove upotrebe. WO 2018/067331 opisuje bispecifična anti-MUC16-CD3 antitela i NTI-MUC16 konjugate lekova.

[0005] Molekuli koji vezuju antigen i ciljano deluju na BCMA, uklјučujući bispecifične molekule koji vezuju antigen, a koji vezuju i BCMA i CD3, bili bi korisni u terapijskim postavkama u kojima je poželјno specifično cilјano delovanje i ubijanje ćelija koje eksprimiraju BCMA posredovano T-ćelijama.

KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0006] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen, koji sadrži: (a) prvi domen koji vezuje antigen, koji specifično vezuje humani antigen sazrevanja B-ćelija (BCMA) i sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68, 70, 72 i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88; i (b) drugi domen koji vezuje antigen, koji specifično vezuje humani CD3 i sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 92, 94, 96, i LCDR1, LCDR2, LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88. U pojedinim slučajevima, izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži: (a) prvi domen koji vezuje antigen, koji sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82; i (b) drugi domen koji vezuje antigen, koji sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82.

[0007] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen, koji sadrži: (a) prvi domen koji vezuje antigen, koji specifično vezuje humani antigen sazrevanja B-ćelija (BCMA) koji sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68, 70, 72 i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88; i (b) drugi domen koji vezuje antigen, koji specifično vezuje humani CD3 i sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 100, 102, 104, i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88. U pojedinim slučajevima, izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži: (a) prvi domen koji vezuje antigen, koji sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82; i (b) drugi domen koji vezuje antigen, koji sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82.

[0008] Bilo koji od bispecifičnih molekula koji vezuju antigen o kojima je prethodno ili ovde diskutovano, može biti bispecifično antitelo. U pojedinim slučajevima, bispecifično antitelo sadrži konstantan region teškog lanca humanog IgG. U pojedinim slučajevima, konstantan region teškog lanca humanog IgG je IgG1 izotipa. U pojedinim slučajevima, konstantan region teškog lanca humanog IgG je IgG4 izotipa. U raznim primerima izvođenja, bispecifično antitelo sadrži himerni zglobni region koji smanjuje vezivanje Fcy receptora u odnosu na zglobni region divlјeg tipa istog izotipa.

[0009] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifičan molekul koji vezuje antigen (npr. bispecifično antitelo) pronalaska, i farmaceutski prihvatlјiv nosač ili razblaživač.

[0010] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira bispecifičan molekul koji vezuje antigen (npr. bispecifično antitelo) pronalaska.

[0011] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline pronalaska.

[0012] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži ekspresioni vektor pronalaska.

[0013] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovan bispecifičan molekul pronalaska koji vezuje antigen, ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska, za upotrebu u postupku inhibicije rasta tumora plazma ćelija kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu izolovanog bispecifičnog molekula koji vezuje antigen, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži bispecifičan molekul koji vezuje antigen. U pojedinim slučajevima, tumor plazma ćelija je multipli mijelom. U pojedinim slučajevima, postupak dalјe obuhvata davanje drugog terapijskog agensa, ili terapijskog režima. U pojedinim primerima izvođenja, drugi terapijski agens sadrži anti-tumorski agens (npr. hemoterapijske agense uklјučujući melfalan, vinkristin (Oncovin), ciklofosfamid (Cytoxan), etopozid (VP-16), doksorubicin (Adriamycin), lipozomalni doksorubicin (Doxil), obendamustin (Treanda) ili bilo koji drugi agens za koga je poznato da je efektivan u lečenju tumora plazma ćelija kod subjekta.). U pojedinim primerima izvođenja, drugi terapijski agens sadrži steroide. U pojedinim primerima izvođenja, drugi terapijski agens sadrži cilјane terapije uklјučujući talidomid, lenalidomid i bortezomib, što su terapije odobrene za lečenje novodijagnostikovanih pacijenata. Lenalidomid, pomalidomid, bortezomib, karfilzomib, panobinostat, iksazomib, elotuzumab i daratumumab su primeri drugih terapijskih agenasa efektivnih u lečenju rekurentnog mijeloma. U određenim primerima izvođenja, drugi terapijski agens je režim koji obuhvata radioterapiju ili transplantaciju matičnih ćelija. U određenim primerima izvođenja, drugi terapijski agens može biti imunomodulatorni agens. U određenim primerima izvođenja, drugi terapijski agens može biti inhibitor proteazoma, uklјučujući bortezomib (Velcade), karfilzomib (Kyprolis), iksazomib (Ninlaro). U određenim primerima izvođenja, drugi terapijski agens može biti inhibitor histon deacetilaze kao što je panobinostat (Farydak). U određenim primerima izvođenja, drugi terapijski agens može biti monoklonsko antitelo, konjugat leka i antitela, bispecifično antitelo konjugovano sa anti-tumorskim agensom, inhibitor kontrolne tačke ili njihove kombinacije.

[0014] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen pronalaska, ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska, za upotrebu u postupku lečenja pacijenta koji boluje od multiplog mijeloma, ili od drugog B-ćelijskog maligniteta koji eksprimira BCMA, pri čemu postupak obuhvata davanje izolovanog bispecifičnog molekula koji vezuje antigen ili farmaceutske kompozicije koja sadrži bispecifičan molekul koji vezuje antigen subjektu. U pojedinim slučajevima, B-ćelijski malignitet koji eksprimira BCMA izabran je iz grupe koju čine Valdenstromova makroglobulinemija, Burkitov limfom i difuzni B-krupnoćelijski limfom, ne-Hočkinov limfom, hronična limfocitna leukemija, fokalna leukemija, mantle ćelijski limfom, limfom marginalne zone, limfoplazmacitni limfom i Hočkinov limfom. U pojedinim slučajevima, postupak dalјe obuhvata davanje drugog terapijskog agensa. U pojedinim primerima izvođenja, drugi terapijski agens obuhvata anti-tumorski agens (hemoterapijski agens), DNK alkilatore, imunomodulatore, inhibitore proteazoma, inhibitore histon deacetilaze radioterapiju, transplantaciju matičnih ćelija, imunomodulator, monoklonsko antitelo koje interaguje sa antigenom eksprimiranim na povšini tumorske ćelije, monoklonsko antitelo drugačije od onih koja su ovde opisana, koje može interagovati sa različitim antigenom na površini plazma ćelije, bispecifično antitelo, koje ima jedan krak koji vezuje antigen na površini tumorske ćelije i drugi krak vezuje antigen na T-ćeliji, konjugat antitela i leka, bispecifično antitelo konjugovano sa anti-tumorskim agensom, inhibitor kontrolne tačke, na primer, onaj koji cilјano deluje na PD-1 ili CTLA-4, ili njihove kombinacije. U određenim primerima izvođenja, inhibitori kontrolnih tačaka mogu biti izabrani između inhibitora PD-1, kao što su pembrolizumab (Keytruda), nivolumab (Opdivo) ili cemiplimab (REGN2810). U određenim primerima izvođenja, inhibitori kontrolne tačke mogu biti izabrani između inhibitora PD-L1, kao što su atezolizumab (Tecentriq), avelumab (Bavencio) ili Durvalumab (Imfinzi)). U određenim primerima izvođenja, inhibitori kontrolne tačke mogu biti izabrani od inhibitora CTLA-4, kao što je ipilimumab (Yervoy). Druge kombinacije koje mogu biti upotrebljene zajedno sa antitelom pronalaska prethodno su opisane.

[0015] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen pronalaska, ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska, za upotrebu u postupku lečenja pacijenta koji boluje od tumora koji eksprimira BCMA, pri čemu postupak obuhvata davanje subjektu izolovanog bispecifičnog molekula koji vezuje antigen, ili farmaceutske kompozicije, u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen. U pojedinim slučajevima, anti-PD-1 antitelo ili fragment koji vezuje antigen je anti-PD-1 antitelo. U pojedinim primerima izvođenja, anti-PD-1 antitelo je cemiplimab (REGN2810). U raznim primerima izvođenja, kombinacija anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnog molekula koji vezuje antigen (npr. bispecifičnog antitela) i anti-PD-1 antitelo ili fragmenta koji vezuje antigen (npr. anti-PD-1 antitela) proizvodi sinergistički terapijski efekat u lečenju tumora koji eksprimiraju BCMA.

[0016] Ostali aspekti će postati očigledni iz pregleda detalјnog opisa koji sledi.

KRATAK OPIS SLIKA

[0017]

Slike 1 i 2 ilustruju profilaktičku inhibiciju tumora zavisnu od doze kod NCI-H929 tumorskih ćelija humanog multiplog mijeloma koje eksprimiraju BCMA in vivo, sa anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnim antitelima REGN5458 i REGN5459, tim redom. NCI-H929 ćelije eksprimiraju visoke nivoe BCMA.

Slike 3 i 4 ilustruju terapijsku inhibiciju tumora zavisnu od doze kod uspostavljenih NCI-H929 tumorskih ćelija humanog multiplog mijeloma koje eksprimiraju BCMA in vivo, sa anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnim antitelima REGN5458 i REGN5459, tim redom. NCI-H929 ćelije eksprimiraju visoke nivoe BCMA.

Slike 5 i 6 ilustruju profilaktičku inhibiciju tumora zavisnu od doze kod MOLP-8 tumorskih ćelija humanog multiplog mijeloma koje eksprimiraju BCMA in vivo, sa anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnim antitelima REGN5458 i REGN5459, tim redom. MOLP-8 ćelije eksprimiraju umerene nivoe BCMA.

Slika 7 ilustruje terapijsko smanjenje uspostavljenog opterećenja tumorom kod OPM-2 tumorskih ćelija humanog multiplog mijeloma koje eksprimiraju BCMA in vivo, sa anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnim antitelima REGN5458 i REGN5459, u odnosu na kontrole. OPM-2 ćelije eksprimiraju niske nivoe BCMA.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0018] Tehnički opis naveden u tekstu koji sledi može u pojedinim aspektima prevazilaziti obim patentnih zahteva. Elementi opisa koji ne pripadaju obimu patentnih zahteva obezbeđeni su samo informativno. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde upotrebljavaju imaju isto značenje koje se obično i podrazumeva od strane prosečno iskusnog stručnjaka iz oblasti tehnike kojoj ovaj pronazak pripada. Kao što se ovde upotrebljava, termin „oko”, kada se upotrebljava u odnosu na određenu navedenu numeričku vrednost, označava da vrednost može varirati od navedene vrednosti za ne više od 1%. Na primer, kako se ovde upotrebljava, izraz „oko 100” uklјučuje 99 i 101 i sve vrednosti između (npr.

99,1; 99,2; 99,3; 99,4 itd.).

Definicije

[0019] Izraz „CD3”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antigen koji je eksprimiran na T-ćelijama kao deo multimolekulskog T-ćelijskog receptora (TCR), koji se sastoji od homodimera ili heterodimera obrazovanog udruživanjem dva od četiri receptorska lanca: CD3-epsilon, CD3-delta, CD3-zeta i CD3-gama. Humani CD3-epsilon sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je kao što je navedeno u SEQ ID NO:116; humani CD3-delta sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je kao što je navedeno u SEQ ID NO:117; humani CD3-zeta sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je kao što je navedeno u SEQ ID NO: 118; i CD3-gama sadrži aminokiselinsku koja je kao što je navedeno u SEQ ID NO 119. Ovde je predviđeno da se sva pozivanja na proteine, polipeptide i proteinske fragmente odnose na humanu verziju odgovarajućeg proteina, polipeptida ili proteinskog fragmenta, ukoliko nije eksplicitno navedeno da su iz vrste koja je različita od čoveka. Prema tome, izraz „CD3” označava humani CD3 ukoliko nije navedeno da je iz vrste koja je različita od čoveka, npr. „mišji CD3”, „CD3 majmuna” itd.

[0020] Kao što se ovde upotrebljava, „antitelo koje vezuje CD3” ili „anti-CD3 antitelo” uklјučuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji specifično prepoznaju jednu CD3 subjedinicu (npr. epsilon, delta, gama ili zeta), kao i antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji specifično prepoznaju dimerni kompleks dve CD3 podjedinice (npr. gama/epsilon, delta/epsilon i zeta/zeta CD3 dimeri). Antitela i fragmenti koji vezuju antigen predmetnog pronalaska mogu vezivati solubilan CD3 i/ili CD3 eksprimiran na ćelijskoj površini. Solubilan CD3 uklјučuje prirodne CD3 proteine, kao i rekombinantne varijante CD3 proteina kao što su, npr. monomerni i dimerni CD3 konstrukti, kojima nedostaje transmembranski domen ili na drugi način nisu udruženi sa ćelijskom membranom.

[0021] Kao što se ovde upotrebljava, izraz „CD3 eksprimiran na površini ćelije” označava jedan ili više od CD3 protein(a) koji je/su eksprimiran(i) na površini ćelije in vitro ili in vivo, tako da je najmanje deo CD3 proteina izložen vanćelijskoj strani ćelijske membrane i dostupan delu antitela koji vezuje antigen. „CD3 eksprimiran na površini ćelije” uklјučuje CD3 proteine sadržane unutar konteksta funkcionalnog T-ćelijskog receptora u membrani ćelije. Izraz „CD3 eksprimiran na površini ćelije” uklјučuje CD3 protein eksprimiran kao deo homodimera ili heterodimera na površini ćelije (npr. gama/epsilon, delta/epsilon i zeta/zeta CD3 dimere). Izraz „CD3 eksprimiran na površini ćelije” takođe uklјučuje CD3 lanac (npr. CD3-epsilon, CD3-delta ili CD3-gama) koji je eksprimiran sam po sebi, bez drugih tipova CD3 lanaca, na površini ćelije. „CD3 eksprimiran na površini ćelije” može sadržavati ili se sastojati od CD3 proteina eksprimiranog na površini ćelije koja normalno eksprimira CD3 protein. Alternativno, „CD3 eksprimiran na površini ćelije” može sadržavati ili se sastojati od CD3 proteina eksprimiranog na površini ćelije koja normalno ne eksprimira humani CD3 na svojoj površini, ali je veštački izmenjena genetičkim inženjeringom da eksprimira CD3 na svojoj površini.

[0022] Izraz „BCMA”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antigen sazrevanja B-ćelija. BCMA (takođe poznat kao TNFRSF17 i CD269) je protein ćelijske površine eksprimiran na malignim plazma ćelijama, a koji ima centralnu ulogu u regulisanju sazrevanja i diferencijacije B-ćelija u plazma ćelije koje proizvode imunoglobuline. Aminokiselinska sekvenca humanog BCMA prikazana je u SEQ ID NO: 115, a takođe se može pronaći u GenBank bazi podataka pod pristupnim brojem NP_001183.2.

[0023] Kao što se ovde upotrebljava, „antitelo koje vezuje BCMA” ili „anti-BCMA antitelo” uklјučuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji specifično prepoznaju BCMA.

[0024] Termin „molekul koji vezuje antigen” uklјučuje antitela i fragmente antitela koji vezuju antigen, uklјučujući, npr. bispecifična antitela.

[0025] Termin „antitelo”, kako se ovde upotrebljava, označava bilo koji molekul ili molekulski kompleks koji vezuje antigen, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) i specifično se vezuje za ili interaguje sa određenim antigenom (npr. BCMA ili CD3). Termin „antitelo” uključuje imunoglobulinske molekule koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, koji su međusobno povezani disulfidnim vezama, kao i njihove multimere (npr. IgM). Termin „antitelo” takođe uklјučuje imunoglobulinske molekule koji se sastoje od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, koji su međusobno povezani disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde skraćeno kao HCVR ili VH) i konstantan region teškog lanca. Konstantan region teškog lanca obuhvata tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (ovde skraćeno kao LCVR ili VL) i konstantan region lakog lanca. Konstantan region lakog lanca obuhvata jedan domen (CL1). VHi VLregioni mogu biti dalje podeljeni na regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), a koji su ispresecani regionima koji su više evolutivno očuvani i označeni kao uokvirujući regioni (FR). Svaki VHi VLse sastoji od tri CDR i četiri FR, raspoređena od aminokraja ka karboksi-kraju po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U različitim primerima izvođenja pronalaska, FR anti-BCMA antitela ili anti-CD3 antitela (ili njihovog dela koji vezuje antigen) može biti identičan humanim germinativnim sekvencama, ili može biti prirodno ili veštački modifikovan. Aminokiselinska konsenzusna sekvenca može biti definisana na osnovu paralelne analize dva ili više CDR.

[0026] Termin „antitelo”, kako se ovde upotrebljava, takođe uklјučuje fragmente molekula antitela pune dužine koji vezuju antigen. Termini „deo koji vezuje antigen” antitela, „fragment koji vezuje antigen” antitela i slično, kako se ovde upotrebljavaju, uključuju bilo koji polipeptid ili glikoprotein koji se javlja u prirodi, može biti dobijen dejstvom enzima, sintetički je ili genetički modifikovan, a koji specifično vezuje antigen da bi se obrazovao kompleks. Fragmenti antitela koji vezuju antigen mogu biti izvedeni, npr. iz molekula antitela pune dužine upotrebom bilo kojih odgovarajućih standardnih tehnika kao što su proteolitička digestija ili tehnike rekombinantnog genetičkog inženjeringa koje uklјučuju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira varijabilne i opciono konstantne domene antitela. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz, npr. komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uklјučujući, npr. fagne biblioteke antitela), ili može biti sintetisana. DNK može biti sekvencirana i sa njom može biti hemijski manipulisano ili upotrebom tehnika molekularne biologije, na primer, tako da se jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena uvede u odgovarajuću konfiguraciju, ili da se uvedu kodoni, stvore cisteinski ostaci, ona modifikuje, insertuju ili delecijom uklone aminokiseline itd.

[0027] Neograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen uklјučuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab')2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) minimalne jedinice prepoznavanja koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji oponašaju hipervarijabilni region antitela (npr. izolovan region koji određuje komplementarnost (CDR) kao što je CDR3 peptida) ili krut FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi molekuli dobijeni genetičkim inženjeringom, kao što su antitela specifična za domen, jednodomenska antitela, antitela sa delecijom uklonjenim domenom, himerna antitela, antitela sa CDR graftom, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP) i varijabilni IgNAR domeni ajkule, takođe su obuhvaćeni izrazom „fragment koji vezuje antigen” koji se ovde upotrebljava.

[0028] Fragment antitela koji vezuje antigen obično će sadržavati najmanje jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili aminokiselinskog sastava, a generalno će sadržavati najmanje jedan CDR koji je susedan ili istog okvira čitanja kao jedna ili više uokvirujućih sekvenci. U fragmentima koji vezuju antigen sa VHdomenom koji je udružen sa VLdomenom, VHi VLdomeni mogu biti locirani jedan u odnosu na drugog po bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, varijabilni region može biti dimeran i sadržavati VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. Alternativno, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati monomerni VHili VLdomen.

[0029] Prema određenim aspektima, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati najmanje jedan varijabilni domen kovalentno povezan sa najmanje jednim konstantnim domenom. Neograničavajući primeri konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koje se mogu naći unutar fragmenta antitela koji vezuje antigen uklјučuju: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uklјučujući bilo koju od konfiguracija za primer koje su prethodno navedene, varijabilni i konstantni domeni mogu biti bilo direktno povezani jedan sa drugim ili mogu biti povezani potpunim ili delimičnim zglobnim regionom ili linkerskim regionom. Zglobni region se može sastojati od najmanje 2 (npr. 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina čiji je rezultat fleksibilna ili polufleksibilna veza između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u jednom polipeptidnom molekulu. Štaviše, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati homo-dimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) bilo koje od konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koje su prethodno navedene, kovaleno udruženih sa drugim i/ili sa jednim ili više monomernih VHili VLdomena (npr. disulfidnom(im) vezom(ama)).

[0030] Kao i kod molekula antitela pune dužine, fragmenti koji vezuju antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr. bispecifični). Multispecifičan fragment antitela koji vezuje antigen obično će sadržavati najmanje dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično veže za poseban antigen ili za različit epitop na istom antigenu. Bilo koji multispecifičan format antitela, uklјučujući formate bispecifičnih antitela za primer koji su ovde opisani, može biti prilagođen za upotrebu u kontekstu fragmenta antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska, upotrebom rutinskih tehnika koje su dostupne u stanju tehnike.

[0031] Antitela predmetnog pronalaska mogu funkcionisati putem citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC) ili citotoksičnosti posredovane ćelijama koja je zavisna od antitela (ADCC). „Citotoksičnost zavisna od komplementa” (CDC) odnosi se na lizu ćelija koje eksprimiraju antigen, sa antitelom pronalaska, u prisustvu komplementa. „Citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela” (ADCC) odnosi se na reakciju posredovanu ćelijama u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcR) (npr. prirodne ćelije ubice (NK), neutrofili i makrofagi) prepoznaju antitelo koje je vezano na cilјnoj ćeliji i na taj način dovode do lize cilјne ćelije. CDC i ADCC mogu biti izmerene upotrebom testova koji su dobro poznati i dostupni u stanju tehnike. (Pogledati npr. U.S. Patent No 5,500,362 i 5,821,337, i Clynes i saradnici (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). Konstantan region antitela je važan za sposobnost antitela da fiksira komplement i posreduje u citotoksičnosti koja je zavisna od ćelija. Prema tome, izotip antitela može biti izabran na osnovu toga da li je poželјno da antitelo posreduje u citotoksičnosti.

[0032] U određenim primerima izvođenja pronalaska, anti-BCMA x anti-CD3 bispecifična antitela pronalaska su humana antitela. Predviđeno je da termin „humano antitelo”, kako se ovde upotrebljava, uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela mogu uklјučivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr. usled mutacija uvedenih nasumičnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-ovima, a posebno u CDR3. Ipak, nije previđeno da termin „humano antitelo”, kako se ovde upotrebljava, uklјučuje antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germintivnih sekvenci drugih vrsta sisara, kao što je to miš, i u vidu graftova uvedene u humane uokvirujuće sekvence.

[0033] Antitela pronalaska mogu, u pojedinim primerima izvođenja, biti rekombinantna humana antitela. Predviđeno je da termin „rekombinantno humano antitelo”, kako se ovde upotrebljava, uključuje sva humana antitela koja su pripremlјena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantim putem, kao što su antitela eksprimirana upotrebom rekombinantnog ekspresionog vektora koji je transfekcijom uveden u ćeliju domaćina (opisano dalјe u nastavku teksta), antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela (opisano dalјe u nastavku teksta), antitela izolovana od životinje (npr. miša) koja je transgena za humani imunoglobulinski gen (pogledati npr. Taylor i saradnici (1992) Nucl. Acids Res.

20:6287-6295) ili antitela pripremlјena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uklјučuje obradu sekvenci humanih imunoglobulinskih sekvenci i povezivanje sa drugim sekvencama DNK. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih germintivnih imunoglobulinskih sekvenci. U određenim primerima izvođenja, međutim, takva rekombinantna humana antitela se podvrgavaju in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi životinja transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatskoj mutagenezi) čime aminokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnih antitela predstavljaju sekvence koje, iako su izvedene iz i srodne humanun germinativnim VHi VLsekvencama, ne mogu postojati u prirodi unutar repertoara humanih germinativnih sekvenci za antitela in vivo.

[0034] Humana antitela mogu postojati u dva oblika udružena sa heterogenošću zglobnog regiona. U jednom obliku, imunoglobulinski molekul sadrži stabilan četvorolančani kontrukt od približno 150-160 kDa u kome se dimeri drže zajedno međulančanom disulfidnom vezom između teških lanca. U drugom obliku, dimeri nisu povezani preko međulančanih disulfidnih veza i obrazuje se molekul od oko 75-80 kDa sastavlјen od kovalentno kuplovanog lakog i teškog lanca (polu-antitelo). Ovakve oblike može biti izuzetno teško razdvojiti, čak i nakon afinitetnog prečišćavanja.

[0035] Učestalost pojavlјivanja drugog oblika kod različitih intaktnih IgG izotipova je posledica, bez posebnih ograničenja, strukturnih razlika povezanih sa zglobnim regionom izotipa antitela. Jedna aminokiselinska supstitucija u zglobnom regionu kod zglobnog regiona humanog IgG4 može značajno smanjiti pojavu drugog oblika (Angal i saradnici (1993) Molecular Immunology 30:105) do nivoa koji se obično uočavaju prilikom upotrebe zglobnog regiona humanog IgG1. Predmetni pronalazak obuhvata antitela koja imaju jednu ili više mutacija u zglobnom regionu, CH2 ili CH3 regionu, a koje, na primer, mogu biti poželjne u proizvodnji, da bi se pobolјšao prinos želјenog oblika antitela.

[0036] Antitela pronalaska su izolovana antitela. „Izolovano antitelo”, kako se ovde upotrebljava, označava antitelo koje je bilo identifikovano i izdvojeno i/ili razdvojeno od najmanje jedne komponente iz svog prirodnog okruženja. Na primer, za potrebe predmetnog pronalaska, antitelo koje je izdvojeno i/ili razdvojeno od najmanje jedne komponente iz organizma, ili iz tkiva ili ćelije u kojima antitelo prirodno postoji ili se prirodno proizvodi, predstavlja „izolovano antitelo”. Izolovano antitelo takođe uklјučuje antitelo in situ, unutar rekombinantne ćelije. Izolovana antitela su antitela koja su bila podvrgnuta najmanje jednom koraku prečišćavanja ili izolacije. Prema određenim primerima izvođenja, izolovano antitelo može biti suštinski oslobođeno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

[0037] Predmetni opis takođe uklјučuje jednokraka antitela koja vezuju BCMA. Kao što se ovde upotrebljava, „jednokrako antitelo” označava molekul koji vezuje antigen koji sadrži jedan teški lanac antitela i jedan laki lanac antitela. Jednokraka antitela mogu sadržavati bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su kao što je navedeno u Tabeli 1.

[0038] Anti-BCMA ili anti-BCMA x anti-CD3 antitela koja su ovde opisana mogu sadržavati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u uokvirujućim i/ili CDR regionima varijabilnih domena teških i lakih lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su antitela izvedena. Takve mutacije lako mogu biti utvrđene upoređivanjem aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane sa germinativnim sekvencama koje su dostupne iz, na primer, javnih baza podataka sekvenci antitela. Predmetni opis uklјučuje antitela, i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, pri čemu su jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više uokvirujućih i/ili CDR regiona mutirane u odgovarajući(e) ostatak(e) germinativne sekvence iz koje je antitelo izvedeno, ili u odgovarajući(e) ostatak(e) druge humane germinativne sekvence, ili konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom u odgovarajući(e) ostatak(e) germinativne sekvence (takve promene sekvence se ovde označavaju kao „germinativne mutacije"). Osoba sa prosečnim iskustvom iz oblasti tehnike, polazeći od sekvenci varijabilnih regiona teških i lakih lanaca koje su ovde opisane, lako može proizvesti brojna antitela i fragmente koji vezuju antigen i sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihovih kombinacija. Prema određenim aspektima, svi ostaci uokvirujućih i/ili CDR unutar VHi/ili VLdomena povratno su mutirani u ostatke koji se mogu naći u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je antitelo izvedeno. Prema drugim aspektima, samo određeni ostaci su povratno mutirani u originalnu germinativnu sekvencu, npr. samo mutirani ostaci koji se nalaze unutar prvih 8 aminokiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci koji se nalaze unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. Prema drugim aspektima, jedan ili više od ostataka uokvirujućeg regiona i/ili CDR mutirani su u odgovarajući ostatak(e) različite germinativne sekvence (tj. germinativne sekvenca koja se razlikuje od germinativne sekvence iz koje je antitelo prvobitno izvedeno). Štaviše, antitela predmetnog opisa mogu sadržavati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar uokvirujućih i/ili CDR regiona, npr. gde su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence, dok se određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence održavaju ili se mutiraju u odgovarajući ostatak druge germinativne sekvence. Jednom dobijena, antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija, lako mogu biti ispitani u pogledu jedne ili više željenih osobina, kao što su pobolјšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, pobolјšana ili pojačane antagonističke ili agonističke biološke osobine (što može biti slučaj), smanjena imunogenost itd. Antitela i fragmenti koji vezuju antigen dobijeni na ovaj opšti način obuhvaćeni su predmetnim opisom.

[0039] Predmetni opis takođe uklјučuje anti-BCMA ili anti-BCMA x anti-CD3 antitela koja sadrže varijante bilo koje od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane sa jednom ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, predmetni opis uklјučuje anti-BCMA ili anti-BCMA x anti-CD3 antitela koja imaju HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr. 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje itd. konzervativnih aminokiselinskih supstitucije u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde navedene u Tabelama 1 i 3, ili na anti-CD3 antitela koja su opisana u WO 2014/047231 ili WO 2017/053856.

[0040] Termin „epitop” se odnosi na antigensku determinantu koja stupa u interakciju sa specifičnim mestom vezivanja antigena u varijabilnom regionu molekula antitela poznatom kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Prema tome, različita antitela se mogu vezivati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop nastaje od aminokiselina postavljenih susedno u prostoru, a koje su iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji proizvode susedni aminokiselinski ostaci u polipeptidnom lancu. U određenim okolnostima, epitop može uključivati ostatke saharida, fosforil grupe ili sulfonil grupe na antigenu.

[0041] Termin „suštinska identičnost” ili „suštinski identičan”, kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, ukazuje da, kada je ista optimalno poravnata sa odgovarajućim nukleotidnim insercijama ili delecijama, sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost sekvenci od najmanje oko 95%, a poželјnije od najmanje oko 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, što se meri bilo kojim dobro poznatim algoritmom za identičnosti sekvenci, kao što su FASTA, BLAST ili Gap, kao što je objašnjeno u nastavku. Molekul nukleinske kiseline koji je suštinski identičan referentnom molekulu nukleinske kiseline može, u određenim slučajevima, kodirati polipeptid koji ima istu ili suštinski sličnu aminokiselinsku sekvencu kao polipeptid koga kodira referentni molekul nukleinske kiseline.

[0042] Kako se primenjuje na polipeptide, termin „značajna sličnost” ili „suštinski sličan” označava da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je slučaj pri upotrebi programa GAP ili BESTFIT koji koriste podrazumevane težine gapova, dele identičnost sekvenci od najmanje 95%, još poželјnije identičnost sekvenci od najmanje 98% ili 99%. Poželјno je i da se pozicije ostataka koji nisu identični razlikuju po tipu konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. „Konzervativna aminokiselinska supstitucija” je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupu) sa sličnim hemijskim osobinama (npr. naelektrisanjem ili hidrofobnošću). U principu, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće bitno promeniti funkcionalne osobine proteina. U slučajevima kada se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju jedna u odnosu na drugu po konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti sekvenci ili stepen sličnosti može biti podešen naviše da bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Načini za uvođenje ovakvih podešavanja su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Pogledati, npr. Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim osobinama uklјučuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) alifatično-hidroksilne bočne lance: serin i treonin; (3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; (4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin i triptofan; (5) bazne bočne lance: lizin, arginin i histidin; (6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat, i (7) bočne lance koji sadrže sumpor poput cisteina i metionina. Poželјne grupe konzervativnih aminokiselinskih supstitucija su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparaginglutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 matrici log-verovatnoće opisanoj u Gonnet i saradnici (1992) Science 256: 1443-1445. „Umereno konzervativna” zamena je bilo koja promena koja ima vrednost koja nije negativna u PAM250 matrici log-verovatnoće.

[0043] Sličnost sekvenci za polipeptide, koja se takođe označava kao identičnost sekvenci, obično se meri upotrebom softvera za analizu sekvenci. Softver za analizu proteina preklapa slične sekvence upotrebom mera sličnosti koje se dodeljuju različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uklјučujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su Gap i Bestfit, koji mogu biti upotrebljeni sa podrazumevanim parametrima, za određivanje homologije sekvence ili identičnosti sekvenci između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divlјeg tipa i njihovih muteina. Pogledati npr. GCG, verzije 6.1. Polipeptidne sekvence takođe mogu biti upoređivane upotrebom FASTA programa i podrazumevanih ili preporučenih parametara u GCG programu, verzije 6.1. FASTA (npr. FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnavanja i procenat identičnosti sekvenci regiona na osnovu najbolјeg preklapanja između sekvence koja se ispituje i sekvence koja se pretražuje (Pearson (2000) navedeno iznad). Drugi poželјan algoritam prilikom poređenja sekvence pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, i upotreba podrazumevanih parametara. Pogledati npr. Altschul i saradnici (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 i Altschul i saradnici (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.

Germinativne mutacije

[0044] Anti-CD3 antitela koja su ovde opisana sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u uokvirujućim regionima varijabilnih domena teških lanaca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su antitela bila izvedena.

[0045] Predmetni opis takođe uklјučuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, pri čemu su jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više od uokvirujućih regiona mutirane u odgovarajući(e) ostatak(e) germinativnih sekvenci iz koje je antitelo bilo izvedeno, ili u odgovarajući(e) ostatak(e) druge humane germinativne sekvence, ili konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom u odgovarajući(e) ostatak(e) germinativne sekvence (takve promene sekvence se ovde označavaju kao „germinativne mutacije"), a koje imaju slabo ili vezivanje za CD3 antigen koje se ne može detektovati.

[0046] Štaviše, antitela predmetnog opisa mogu sadržavati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar uokvirujućih regiona, npr. pri čemu su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence, dok se određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence održavaju ili mutiraju u odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom dobijena, antitela i fragmenti koji vezuju antigen i sadrže jednu ili više germinativnih mutacija mogu biti ispitani u kontekstu jedne ili više od poželjnih osobina kao što su pobolјšana specifičnost vezivanja, slab ili smanjen afinitet vezivanja, pobolјšane ili pojačane farmakokinetičke osobine, smanjena imunogenost itd. Antitela i fragmenti koji vezuju antigen i dobijeni su na ovaj opšti način, s obzirom na smernice predmetnog opisa, obuhvaćeni su stoga predmetnim opisom.

[0047] Navedeno takođe uključuje molekule koji vezuju antigen i sadrže domen koji vezuje antigen sa HCVR aminokiselinskom sekvencom koja je suštinski identična bilo kojoj od HCVR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, uz održavanje ili poboljšanje željenog slabog afiniteta za CD3 antigen. Termin „suštinska identičnost” ili „suštinski identičan”, kada se odnosi na aminokiselinsku sekvencu, označava da dve aminokiselinske sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je sa programima GAP ili BESTFIT uz upotrebu osnovnih podešavanja za težinu gapova, dele identičnost sekvenci od najmanje 95%, još poželјnije identičnost sekvenci od najmanje 98% ili 99%. Poželјno je i da se pozicije ostataka koji nisu identični razlikuju u vidu konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. U slučajevima kada se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju jedna u odnosu na drugu po konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti sekvenci ili stepen sličnosti može biti podešen naviše da bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Načini za uvođenje ovakvih podešavanja su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Pogledati, npr. Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331.

[0048] Sličnost sekvenci polipeptida, koja se takođe označava kao identičnost sekvenci, obično se meri upotrebom softvera za analizu sekvenci. Softver za analizu proteina preklapa slične sekvence upotrebom mera sličnosti koji su dodeljeni raznim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uklјučujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su Gap i Bestfit, koji mogu biti upotrebljeni sa podrazumevanim parametrima, za određivanje homologije sekvence ili identičnosti sekvenci između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divlјeg tipa i njihovih muteina. Pogledati npr. GCG, verzije 6.1.

Polipeptidne sekvence takođe mogu biti upoređivane upotrebom FASTA programa i podrazumevanih ili preporučenih parametara u GCG programu, verzije 6.1. FASTA (npr. FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnavanja i procenat identičnosti sekvenci regiona tipa najbolјeg preklapanja između sekvence koja se ispituje i sekvence koja se pretražuje (Pearson (2000) navedeno iznad). Drugi poželјan algoritam prilikom poređenja sekvenca pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, uz upotrebu podrazumevanih parametara. Pogledati npr. Altschul i saradnici (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 i Altschul i saradnici (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.

Osobine vezivanja antitela

[0049] Kao što se ovde upotrebljava, termin „vezivanje” u kontekstu vezivanja antitela, imunoglobulina, fragmenta koji vezuje antitelo ili proteina koji sadrži Fc za bilo koji od njih, npr. unapred određeni antigen, kao što je protein površine ćelije ili njegov fragment, obično se odnosi na interakciju ili asocijaciju između najmanje dva entiteta ili molekulske strukture, kao što je interakcija antitela i antigena.

[0050] Na primer, afinitet vezivanja obično odgovara KDvrednosti oko 10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, na primer oko 10<-9>M ili manje, što se određuje, na primer, tehnologijom rezonancije površinskog plazmona (SPR) u instrumentu BIAcore 3000 koji koristi antigen kao ligand i antitelo, Ig, fragment koji vezuje antitelo ili protein koji sadrži Fc kao analit (ili antiligand). Strategije vezivanja zasnovane na ćelijama, kao što su testovi vezivanja zasnovani na ćelijskom sortiranju aktiviranom fluorescencijom (FACS), takođe se rutinski upotrebljavaju, a FACS podaci dobro korelišu sa drugim postupcima, kao što su kompetitivno vezivanje radioliganda ili SPR (Benedict CA, J Immunol Methods.

1997, 201(2):223-31; Geuijen CA, i saradnici J Immunol Methods.2005, 302(1-2):68-77).

[0051] Shodno navedenom, antitelo ili protein koji vezuje antigen pronalaska vezuju se za unapred određeni antigen ili molekul ćelijske površine (receptor) uz afinitet koji odgovara KDvrednosti koja je najmanje deset puta niža u odnosu na afinitet vezivanja za nespecifičan antigen (npr. BSA, kazein). Prema predmetnom pronalasku, afinitet antitela kome odgovara KDvrednost koja je jednaka ili manja od deset puta niža u odnosu na afinitite za nespecifičan antigen, može se smatrati vezivanjem koje se ne može detektovati, međutim takvo antitelo može biti upareno sa drugim krakom koji vezuje antigen radi proizvodnje bispecifičnog antitela pronalaska.

[0052] Termin „KD” (M) odnosi se na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitela i antigena, ili ravnotežnu konstantu disocijacije antitela ili fragmenta koji vezuje antigen sa antigenom. Postoji obrnuta srazmera između KDi afiniteta vezivanja, zbog čega, što je manja KDvrednost, veći je, odnosno jači, afinitet. Prema tome, termini „veći afinitet” ili „jači afinitet” odnose se na veću sposobnost obrazovanja interakcije i stoga manju KDvrednost, i obrnuto, termini „niži afinitet” ili „slabiji afinitet” odnose se na nižu sposobnost obrazovanja interakcije i stoga veću KDvrednost. U pojedinim okolnostima, veći afinitet vezivanja (ili KD) određenog molekula (npr. antitela) sa njegovim molekulom koji mu je partner za interakciju (npr. sa antigenom X) u poređenju sa afinitetom vezivanja molekula (npr. antitela) sa drugim molekulom koji mu je partner za interakciju (npr. sa antigenom Y) može biti izražen kao odnos vezivanja određen delјenjem veće KDvrednosti (za niži ili slabiji afinitet) sa manjim KD(za veći ili jači afinitet), i na primer izražen kao 5 ili 10 puta veći afinitet vezivanja, u zavisnosti od slučaja.

[0053] Termin „kd” (sec -1 ili 1/s) odnosi se na konstantu brzine disocijacije određene interakcije antitela i antigena, ili na konstantu brzine disocijacije antitela ili fragmenta koji vezuje antitelo. Navedena vrednost se takođe označava kao koffvrednost.

[0054] Termin „ka"(M-1 x sec-1 ili 1/M) odnosi se na konstantu brzine asocijacije određene interakcije antitela i antigena, ili konstantu brzine asocijacije antitela ili fragmenta koji vezuje antitelo.

[0055] Termin „Ka” (M-1 ili 1/M) odnosi se na ravnotežnu konstantu asocijacije određene interakcije antitela i antigena, ili ravnotežnu konstantu asocijacije antitela ili fragmenta koji vezuje antitelo. Ravnotežna konstanta asocijacije se dobija delјenjem kasa kd.

[0056] Termin „EC50” ili „EC50” odnosi se na polovinu maksimalne efektivne koncentracije koja uklјučuje koncentraciju antitela koja indukuje odgovor na pola puta između osnovne i maksimalne vrednosti nakon određenog vremena izlaganja. EC50suštinski predstavlјa koncentraciju antitela sa kojom se uočava 50% njegovog maksimalnog efekta. U određenim primerima izvođenja, EC50vrednost je jednaka koncentraciji antitela pronalaska koja daje polovinu od maksimalnog vezivanja za ćelije koje eksprimiraju CD3 ili antigen povezan sa tumorom (npr. BCMA), što se utvrđuje npr. FACS testom vezivanja. Prema tome, smanjeno ili slabije vezivanje se uočava sa povećanim EC50, ili polovinom vrednosti maksimalne efektivne koncentracije.

[0057] U jednom primeru izvođenja, smanjeno vezivanje može biti definisano kao povećana EC50koncentracija antitela koja omogućava vezivanje za polovinu maksimalne količine cilјnih ćelija.

[0058] U drugom primeru izvođenja, EC50vrednost predstavlјa koncentraciju antitela pronalaska koje izaziva polovinu od maksimalnog uklanjanja ciljnih ćelija citotoksičnom aktivnošću T-ćelija. Prema tome, povećana citotoksična aktivnost (npr. ubijanje tumorskih ćelija posredovano T-ćelijama) uočava se sa smanjenim EC50, ili kao polovina od vrednosti maksimalne efektivne koncentracije.

Bispecifični molekuli koji vezuju antigen

[0059] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti monospecifična, bispecifična ili multispecifična. Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog cilјnog polipeptida ili mogu sadržavati domene koji vezuju antigen i biti specifična za više od jednog cilјnog polipeptida. Pogledati, npr. Tutt i saradnici, 1991, J. Immunol.147:60-69; Kufer i saradnici, 2004, Trends Biotechnol.22:238-244. Anti-BCMA x anti-CD3 bispecifična antitela predmetnog pronalaska mogu biti povezana ili istovremeno eksprimirana sa drugim funkcionalnim molekulom, npr. drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njegov fragment mogu biti funkcionalno povezani (npr. hemijskim kuplovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili na neki drugi način) sa jednim ili više drugih molekulskih entiteta, kao što su drugo antitelo ili fragment antitela, da bi se proizvelo bispecifično ili multispecifično antitelo sa drugom ili dodatnom specifičnošću vezivanja.

[0060] Ovde je predviđeno da upotreba izraza „anti-CD3 antitelo” ili „anti-BCMA antitelo” uključuje i monospecifična anti-CD3 ili anti-BCMA antitela, kao i bispecifična antitela koja sadrže krak koji vezuje CD3 i krak koji vezuje BCMA. Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifična antitela, kao što je definisano u patentnim zahtevima, gde se jedan krak imunoglobulina vezuje za humani CD3, a drugi krak imunoglobulina je specifičan za humani BCMA.

[0061] U određenim slučajevima, krak koji vezuje CD3 vezuje se za humani CD3 i indukuje aktivaciju humanih T-ćelija. U određenim slučajevima, krak koji vezuje CD3 slabo se vezuje za humani CD3 i indukuje aktivaciju humanih T-ćelija. U drugim slučajevima, krak koji vezuje CD3 slabo se vezuje za humani CD3 i indukuje ubijanje ćelija koje eksprimiraju antigen povezan sa tumorom u kontekstu bispecifičnog ili multispecifičnog antitela. U drugim slučajevima, krak koji vezuje CD3 vezuje se ili povezuje slabo sa humanim i CD3 cinomolgusa (majmuna), ali se interakcija vezivanja ne može detektovati upotrebom in vitro testova koji su poznati u stanju tehnike. Krak koji vezuju BCMA može sadržavati bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR aminokiselinskih sekvenci koji su kao što je ovde navedeno u Tabeli 1.

[0062] Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifične molekule koji vezuje antigen, kao što je definisano u patentnim zahtevima, koji specifično vezuju CD3 i BCMA. Takvi molekuli ovde mogu biti označeni npr. kao „anti-BCMA x anti-CD3” ili „anti-CD3/anti-BCMA”, ili „anti-CD3xBCMA” ili „CD3xBCMA” bispecifični molekuli, ili nekom drugom, slučnom terminologijom (npr. anti-BCMA/anti-CD3).

[0063] Termin „BCMA”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na humani BCMA protein ukoliko nije specifično navedeno da pripada vrsti koja je različita od čoveka (npr. „mišji BCMA”, „BCMA majmuna” itd.). Humani BCMA protein ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 115.

[0064] Prethodno navedeni bispecifični molekuli koji vezuju antigen i specifično vezuju CD3 i BCMA mogu sadržavati anti-CD3 molekul koji vezuje antigen i koji se vezuje za CD3 sa slabim afinitetom vezivanja, pošto je KDkoji se ispoljava veći od oko 40 nM, što se meri upotrebom in vitro testa afinitativnog vezivanja.

[0065] Kao što se ovde upotrebljava, izraz „molekul koji vezuje antigen” označava protein, polipeptid ili molekulski kompleks koji sadrži ili se sastoji od najmanje jednog regiona koji određuje komplementarnost (CDR) koji se samostalno, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih CDR-ova i/ili uokvirujućih regiona (FR), specifično vezuje za određeni antigen. Prema određenim aspektima, molekul koji vezuje antigen je antitelo ili fragment antitela, što su termini koji su ovde definisani na drugom mestu.

[0066] Kao što se ovde upotrebljava, izraz „bispecifičan molekul koji vezuje antigen” označava protein, polipeptid ili molekulski kompleks koji sadrži najmanje prvi domen koji vezuje antigen, i drugi domen koji vezuje antigen. Svaki domen koji vezuje antigen unutar bispecifičnog molekula koji vezuje antigen sadrži najmanje jedan CDR koji se samostalno, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih CDR i/ili FR, specifično vezuje za određeni antigen. U kontekstu predmetnog pronalaska, prvi domen koji vezuje antigen, specifično vezuje prvi antigen (BCMA), dok drugi domen koji vezuje antigen specifično vezuje drugi, različit antigen (CD3).

[0067] U određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, bispecifičan molekul koji vezuje antigen je bispecifično antitelo. Svaki domen bispecifičnog antitela koji vezuje antigen sadrži varijabilni domen teškog lanca (HCVR) i varijabilni domen lakog lanca (LCVR). U kontekstu bispecifičnog molekula koji vezuje antigen i sadrži prvi i drugi domen koji vezuje antigen (npr. bispecifično antitelo), CDR-ovi prvog domena koji vezuje antigen, mogu biti označeni prefiksom „D1”, dok CDR-ovi drugog domena koji vezuje antigen mogu biti označeni prefiksom „D2”. Prema tome, CDR-ovi prvog domena koji vezuje antigen, mogu ovde biti označeni kao D1-HCDR1, D1-HCDR2 i D1-HCDR3; dok CDR-ovi drugog domena koji vezuje antigen, mogu ovde biti označeni kao D2-HCDR1, D2-HCDR2 i D2-HCDR3.

[0068] Prema određenim aspektima opisa za primer, izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen, sadrži prvi domen koji vezuje antigen koji sadrži: (a) tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) sadržana unutar varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66; i (b) tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) sadržana u varijabilnom regionu lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:82. U pronalasku, izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži HCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68, HCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70 i HCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72. U pronalasku, izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži LCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:84, LCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86 i LCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:88. U pojedinim slučajevima, prvi domen koji vezuje antigen sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82.

[0069] Prema određenim aspektima za primer opisa, izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži drugi domen koji vezuje antigen koji sadrži: (a) tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) sadržana u varijabilnom regionu teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90 ili SEQ ID NO: 98; i (b) tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) sadržana u varijabilnom regionu lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:82. U pronalasku, drugi domen koji vezuje antigen sadrži LCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:84, LCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86 i LCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:88. U pronalasku, drugi domen koji vezuje antigen sadrži: (a) HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 92, 94, 96; i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88; ili (b) HCDR1, HCDR2, HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 100, 102, 104; i LCDR1, LCDR2, LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88. U pojedinim slučajevima, drugi domen koji vezuje antigen sadrži: (a) HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82; ili (b) HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82.

[0070] U jednom primeru izvođenja, izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži: (a) prvi domen koji vezuje antigen koji sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68, 70, 72 i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinu sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88; i (b) drugi domen koji vezuje antigen koji sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 92, 94, 96, i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koje sadrže aminokiselinu sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88. U pojedinim slučajevima, izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži: (a) prvi domen koji vezuje antigen, koji sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82; i (b) drugi domen koji vezuje antigen, koji sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82.

[0071] U drugom primeru izvođenja, izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži: (a) prvi domen koji vezuje antigen koji sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68, 70, 72 i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinu sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88; i (b) drugi domen koji vezuje antigen i sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 100, 102, 104, i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koje sadrže aminokiseline sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88. U pojedinim slučajevima, izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži: (a) prvi domen koji vezuje antigen, koji sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82; i (b) drugi domen koji vezuje antigen, koji sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82.

[0072] Bispecifični molekuli koji vezuju antigen o kojima je prethodno ili ovde raspravljano, mogu biti bispecifična antitela. U pojedinim slučajevima, bispecifično antitelo obuhvata konstantan region teškog lanca humanog IgG. U pojedinim slučajevima, konstantan region teškog lanca humanog IgG je izotipa IgG1. U pojedinim slučajevima, konstantan region teškog lanca humanog IgG je izotipa IgG4. U raznim primerima izvođenja, bispecifično antitelo sadrži himerni zglob koji smanjuje vezivanje Fcy receptora u odnosu na zglobni region divlјeg tipa istog izotipa.

[0073] Prvi domen koji vezuje antigen i drugi domen koji vezuje antigen, mogu biti direktno ili indirektno povezani jedan sa drugim, da bi obrazovao bispecifičan molekul koji vezuje antigen premetnog pronalaska. Alternativno, svaki od prvog domena koji vezuje antigen i drugog domena koji vezuje antigen, može biti povezan sa zasebnim multimerizujućim domenom. Povezivanje jednog multimerizujućeg domena sa drugim multimerizujućim domenom olakšava asocijaciju između dva domena koji vezuju antigen, čime se obrazuje bispecifičan molekul koji vezuje antigen. Kao što se ovde upotrebljava, „multimerizujući domen” je bilo koji makromolekul, protein, polipeptid, peptid ili aminokiselina koji imaju sposobnost da se povežu sa drugim multimerizujućim domenom iste ili slične strukture ili konstitucije. Na primer, multimerizujući domen može biti polipeptid koji sadrži imunoglobulinski CH3 domen. Neograničavajući primer multimerizirajuće komponente je Fc deo imunoglobulina (koji sadrži CH2-CH3 domen), npr. Fc domen IgG-a izabran od izotipova IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, kao i bilo kog alotipa unutar svake grupe izotipova.

[0074] Bispecifični molekuli koji vezuju antigen predmetnog pronalaska obično će sadržavati dva multimerizujuća domena, npr. dva Fc domena od kojih je svaki pojedinačno deo posebnog teškog lanca antitela. Prvi i drugi multimerizujući domen mogu biti istog IgG izotipa kao što su, npr. IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. Alternativno, prvi i drugi multimerizujući domen mogu biti različitih IgG izotipova kao što su, npr. IgG1/lgG2, IgG1/lgG4, IgG2/IgG4 itd.

[0075] U određenim primerima izvođenja, multimerizujući domen je Fc fragment ili aminokiselinska sekvenca dužine od 1 do oko 200 aminokiselina koja sadrži najmanje jedan cisteinski ostatak. U drugim primerima izvođenja, multimerizujući domen je cisteinski ostatak, ili kratak peptid koji sadrži cistein. Drugi multimerizujući domeni obuhvataju peptide ili polipeptide koji sadrže ili se sastoje od leucinskog zatvarača, motiva heliks-petlja ili motiva namotaja.

[0076] Bilo koji format ili tehnologija bispecifičnog antitela može biti upotrebljen za pravlјenje bispecifičnih molekula koji vezuju antigen predmetnog pronalaska. Na primer, antitelo ili njegov fragment koji ima prvu specifičnost vezivanja antigena može biti funkcionalno povezan (npr. hemijskim kuplovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnim udruživanjem ili na neki drugi način) sa jednim ili sa više drugih molekulskih entiteta, kao što su to drugo antitelo ili fragment antitela koji ima drugu specifičnost vezivanja antigena, da bi se proizveo bispecifičan molekul koji vezuje antigen. Specifični bispecifični formati za primer, koji mogu biti upotrebljeni u kontekstu predmetnog pronalaska uklјučuju, bez ograničenja, npr. bispecifične formate zasnovane na scFv ili diatelima, fuzije IgGscFv, dualni varijabilni domen (DVD)-lg, Quadroma, “dugme-u-rupicu”, uobičajeni laki lanac (npr. uobičajeni laki lanac sa strukturom tipa “dugme-u-rupicu” itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED)telo, leucinski zatvarač, Duobody, IgG1/lgG2, Fab (DAF)-IgG sa dvostrukim dejstvom i Mav<2>bispecifične formate (pogledati, npr. Klein i saradnici 2012, mAbs 4:6, 1-11, i reference koje su tamo citirane radi pregleda prethodno navedenih formata).

[0077] U kontekstu bispecifičnih molekula koji vezuju antigen predmetnog pronalaska, multimerizujući domeni, npr. Fc domeni, mogu sadržavati jednu ili više aminokiselinskih promena (npr. insercije, delecije ili supstitucije) u poređenju sa prirodnom verzijom Fc domena divlјeg tipa. Na primer, pronalazak uklјučuje bispecifične molekule koji vezuje antigen, koji sadrže jednu ili više modifikacija u Fc domenu, a rezultat je modifikovan Fc domenu sa modifikovanom interakcijom vezivanja (npr. pojačanom ili smanjenom) između Fc i FcRn. U jednom primeru izvođenja, bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži modifikaciju u CH2 ili CH3 regionu, pri čemu modifikacija povećava afinitet Fc domena za FcRn u kiseloj sredini (npr. u endozomu gde je pH opsega od oko 5,5 do oko 6,0). Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija uklјučuju, npr. modifikaciju na poziciji 250 (npr. E ili Q); 250 i 428 (npr. L ili F); 252 (npr. L/Y/F/W ili T), 254 (npr. S ili T) i 256 (npr. S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na poziciji 428 i/ili 433 (npr. L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr. H/F ili Y); ili modifikaciju na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikaciju na poziciji 307 ili 308 (npr. 308F, V308F) i 434. U jednom primeru izvođenja, modifikacija obuhvata 428L (npr. M428L) i 434S (npr. N434S) modifikaciju; modifikaciju 428L, 259I (npr. V259I) i 308F (npr. V308F); modifikaciju 433K (npr. H433K) i modifikaciju 434 (npr.434Y); modifikaciju 252, 254 i 256 (npr.252Y, 254T, and 256E); modifikaciju 250Q i 428L (npr. T250Q and M428L); i modifikaciju 307 i/ili 308 (npr.308F ili 308P).

[0078] Predmetni pronalazak takođe uklјučuje bispecifične molekule koji vezuju antigen koji sadrže prvi CH3 domen i drugi Ig CH3 domen, pri čemu se prvi i drugi Ig CH3 domeni razlikuju jedan od drugog za najmanje jednu aminokiselinu, i pri čemu najmanje jedna aminokiselinska razlika smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za Protein A u poređenju sa bispecifičnim antitelom kome nedostaje razlika u aminokiselinama. U jednom primeru izvođenja, prvi Ig CH3 domen vezuje protein A, a drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili remeti vezivanje proteina A, kao što je modifikacija H95R (prema IMGT numeraciji egzona; H435R prema EU numeraciji). Drugi CH3 može dalјe sadržavati modifikaciju Y96F (iz IMGT; Y436F po EU). Pogledati, na primer, US Patent No.8,586,713. Dalјe modifikacije koje se mogu naći u drugom CH3 uklјučuju: D16E, L18M, N44S, K52N i V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I po EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N i V82I (IMGT; N384S, K392N i V422I po EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q i V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q i V422I po EU) u slučaju IgG4 antitela.

[0079] U određenim primerima izvođenja, Fc domen može biti himerni, iskombinovan od Fc sekvenci izvedenih iz više od jednog od imunoglobulinskih izotipova. Na primer, himerni Fc domen može sadržavati deo ili celokupnu CH2 sekvencu izvedenu iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 CH2 regiona, i deo ili celokupnu CH3 sekvencu izvedenu iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Himerni Fc domen takođe može sadržavati himerni zglobni region. Na primer, himerni zglobni region može sadržavati sekvencu „gornjeg zglobnog regiona”, izvedenu iz zglobnog regiona humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4, iskombinovanu sa sekvencom „donjeg zglobnog regiona”, izvedenom iz zglobnog regiona humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Poseban primer himernog Fc domena koji može biti uklјučen u bilo koji od molekula koji vezuju antigen koji su ovde navedeni obuhvata, od N- do C-kraja: [IgG4 CH1] - [IgG4 gornji zglobni region] - [IgG2 donji zglobni region] - [IgG4 CH2] - [IgG4 CH3]. Drugi primer himernog Fc domena koji može biti uklјučen u bilo koji od molekula koji vezuju antigen koji su ovde navedeni, obuhvata, od N- do C-kraja: [IgG1 CH1] - [IgG1 gornji zglobni region] - [IgG2 donji zglobni region] - [IgG4 CH2] - [IgG1 CH3]. Ovi i drugi primeri himernih Fc domena koji mogu biti uklјučeni u bilo koji od molekula koji vezuju antigen predmetnog pronalaska opisani su u US Publication 2014/0243504, objavljenoj 28. augusta 2014. Himerni Fc domeni koji imaju ove opšte strukturne aranžmane, i njihove varijante, mogu imati izmenjeno vezivanje Fc receptora, što zauzvrat utiče na funkciju Fc efektora.

Varijante sekvenci

[0080] Antitela i bispecifični molekuli koji vezuju antigen predmetnog opisa mogu sadržavati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u uokvirujućim regionima varijabilnih domena teških i lakih lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su pojedinačni domeni koji vezuju antigen izvedeni. Takve mutacije lako mogu biti utvrđene upoređivanjem aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane sa germinativnim sekvencama koje su dostupne iz, na primer, javnih baza podataka za sekvence antitela. Molekuli koji vezuju antigen predmetnog opisa mogu sadržavati domene koji vezuju antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od aminokiselinskih sekvenci za primer koje su ovde opisane, pri čemu su jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više uokvirujućih regiona mutirane u odgovarajući ostatak(e) germinativne sekvence iz koje je antitelo izvedeno, ili odgovarajući(e) ostatak(e) druge humane germinatvine sekvence, ili konzervativnim supstitucijama odgovarajućih ostatak(a) (takve promene sekvence se ovde zajednički označavju kao „germinativne mutacije"). Osoba sa uobičajenim iskustvom u oblasti tehnike, polazeći od ovde opisanih sekvenci varijabilnih regiona teških i lakih lanaca, može lako proizvesti brojna antitela i fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihovih kombinacija. Prema određenim aspektima, svi uokvirujući ostaci unutar VHi/ili VLdomena povratno su mutirani u ostatke pronađene u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je prvobitno izveden domen koji vezuje antigen. Prema drugim aspektima, samo određeni ostaci su povratno mutirani u originalnu germinativnu sekvencu, npr. samo mutirani ostaci koji se nalaze u prvih 8 aminokiselina FR1 ili u poslednjih 8 aminokiselina FR4. Prema drugim aspektima, jedan ili više ostataka uokvirujućeg(ih) region(a) mutirani su u odgovarajući ostatak(e) različite germinativne sekvence (tj. germinativnu sevencu koja je različita u odnosu na germinativnu sekvencu iz koje je domen koji vezuje antigen originalno izveden). Štaviše, domeni koji vezuju antigen mogu sadržavati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar uokvirujućih regiona, npr. pri čemu su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence dok se određeni drugi ostaci koji se razlikuju u odnosu na originalne germinativne sekvence održavaju ili su mutirani u odgovarajući ostatak druge germinativne sekvence. Jednom dobijeni, domeni koji vezuju antigen koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija lako mogu biti ispitani u pogledu jedne ili više želјenih osobina kao što su pobolјšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, pobolјšane ili pojačane antagonističke ili agonističke biološke osobine (u zavisnosti od slučaja), smanjena imunogenost itd. Bispecifični molekuli koji vezuju antigen i sadrže jedan ili više domena koji vezuje antigen, dobijeni na ovaj opšti način, obuhvaćeni su predmetnim opisom.

Antitela koja sadrže Fc varijante

[0081] U skladu sa određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, obezbeđeni su anti-BCMA x anti-CD3 bispecifični molekuli koji vezuje antigen, koji sadrže Fc domen koji sadrži jednu ili više mutacija koje pojačavaju ili značajno smanjuju vezivanje antitela za FcRn receptor, npr. pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH. Na primer, predmetni pronalazak uklјučuje antitela koja sadrže mutaciju u CH2 ili CH3 regionu Fc domena, pri čemu mutacija(e) povećava(ju) afinitet Fc domena za FcRn u kiseloj sredini (npr. u endozomu gde je pH opsega od oko 5,5 do oko 6,0). Takve mutacije mogu dovesti do povećanja poluživota antitela u serumu kada se daju životinji. Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija uklјučuju, npr. modifikaciju na poziciji 250 (npr. E ili Q); 250 i 428 (npr. L ili F); 252 (npr. L/Y/F/W ili T), 254 (npr. S ili T) i 256 (npr. S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na poziciji 428 i/ili 433 (npr. H/L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr. H/F ili Y); ili modifikaciju na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikaciju na poziciji 307 ili 308 (npr.308F, V308F) i 434. U jednom primeru izvođenja, modifikacija obuhvata modifikaciju 428L (npr. M428L) i 434S (npr. N434S); modifikaciju 428L, 259I (npr. V259I) i 308F (npr. V308F); modifikaciju 433K (npr. H433K) i 434 (npr.434Y); modifikaciju 252, 254 i 256 (npr. 252Y, 254T i 256E); modifikaciju 250Q i 428L (npr. T250Q i M428L); i modifikaciju 307 i/ili 308 (npr.308F ili 308P).

[0082] Na primer, predmetni pronalazak uklјučuje anti-BCMA x anti-CD3 bispecifične molekule koji vezuju antigen, koji sadrže Fc domen koji sadrži jedan ili više parova ili grupa mutacija izabranih iz grupe koju čine: 250Q i 248L (npr. T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr. M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr. M428L i N434S); i 433K i 434F (npr. H433K i N434F). Predviđene su sve moguće kombinacije prethodno navedenih mutacija Fc domena i drugih mutacija unutar varijabilnih domena antitela koje su ovde opisane.

Biološke karakteristike antitela i bispecifičnih molekula koji vezuju antigen

[0083] Predmetni opis uklјučuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji vezuju humani BCMA sa visokim afinitetom (npr. nanomolarne ili sub-nanomolarne KDvrednosti).

[0084] Prema određenim aspektima, predmetni opis uklјučuje antitela i fragmente antitela koji vezuju antigen i koji vezuju humani BCMA (npr. na 25°C) sa KDmanjom od oko 5 nM, što je izmereno rezonancijom površinskog plazmona, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je ovde definisano u Primeru 4. Prema određenim aspektima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen, vezuju BCMA sa KDmanjom od oko 20 nM, manjom od oko 10 nM, manjom od oko 8 nM, manjom od oko 7 nM, manjom od oko 6 nM, manjom od oko 5 nM, manjom od oko 4 nM, manjom od oko 3 nM, manjom od oko 2 nM, manjom od oko 1 nM, manjom od oko 800 pM, manjom od oko 700 pM, manjom od oko 500 pM, manjom od oko 400 pM, manjom od oko 300 pM, manjom od oko 200 pM, manjom od oko 100 pM, manjom od oko 50 pM ili manjom od oko 25 pM, što se meri rezonancijom površinskog plazmona, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je ovde definisano u Primeru 4, ili suštinski sličnog testa. Predmetni pronalazak uključuje bispecifične molekule koji vezuju antigen (npr. bispecifična antitela koja vezuju humani BCMA sa KDmanjom od oko 25 pM, koja vezuju BCMA majmuna sa KDmanjom od oko 170 pM, što se meri rezonancijom površinskog plazmona, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je ovde definisano u Primeru 4, ili suštinski sličnog testa.

[0085] Predmetni opis takođe uklјučuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji vezuju BCMA sa disocijativnim poluživotom (t1⁄2) većim od oko 10 minuta ili većim od oko 125 minuta, što se meri rezonancijom površinskog plazmona na 25°C, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je ovde definisano u Primeru 4, ili suštinski sličnog testa. Prema određenim aspektima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen predmetnog pronalaska vezuju BCMA sa t1⁄2 većim od oko 3 minuta, većim od oko 4 minuta, većim od oko 10 minuta, većim od oko 20 minuta, većim od oko 30 minuta, većim od oko 40 minuta, većim od oko 50 minuta, većim od oko 60 minuta, većim od oko 70 minuta, većim od oko 80 minuta, većim od oko 90 minuta, većim od oko 100 minuta, većim od oko 110 minuta ili većim od oko 120 minuta, što se meri rezonancijom površinskog plazmona na 25°C, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je ovde definisano u Primeru 4, ili suštinski sličnog testa. Predmetni pronalazak obuhvata bispecifične molekule koji vezuju antigen (npr. bispecifična antitela koja vezuju BCMA sa a većim od oko 10 minuta, što se meri rezonancijom površinskog plazmona na 25°C, npr. upotrebom formata analize koji je kao što je ovde definisano u Primeru 4, ili suštinski sličnog testa.

[0086] Predmetni opis takođe uklјučuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za humane ćelijske linije koje eksprimiraju endogeni BCMA (npr. NCI-H929, MOLP-8 ili OMP-2), što se utvrđuje FACS testom vezivanja kao što je navedeno u Primeru 6 ili suštinski sličnim testom.

[0087] Predmetni pronalazak takođe uklјučuje anti-BCMA x anti-CD3 bispecifične molekule koji vezuju antigen koji ispoljavaju jednu ili više karakteristika izabranih iz grupe koju čine: (a) inhibiranje rasta tumora kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenografte humanog multiplog mijeloma; (b) suzbijanje rasta tumora uspostavljenih tumora kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenografte humanog multiplog mijeloma (pogledati, npr. Primere 10-15) i (c) suzbijanje rasta tumora singenih ćelija melanoma i karcinoma debelog creva genetički izmenjenih tako da eksprimiraju humani BCMA kod imunokompetentnih miševa koji eksprimiraju humani CD3.

[0088] Predmetni opis uklјučuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji vezuju humani CD3 sa visokim afinitetom. Predmetni opis takođe uklјučuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen i vezuju humani CD3 sa srednjim ili niskim afinitetom, u zavisnosti od terapijskog konteksta i specifičnih osobina ciljnih molekula koje su poželјne. U pojedinim slučajevima, nizak afinitet uklјučuje antitela koja vezuju CD3 sa KDili EC50(npr. što se meri testom rezonancije površinskog plazmona) većim od 300 nM, većim od 500 nM ili većim od 1 µM. Predmetni opis takođe uklјučuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji vezuju humani CD3 bez merlјivog afiniteta. Na primer, u kontekstu bispecifičnog molekula koji vezuje antigen, gde jedan krak vezuje CD3, a drugi krak vezuje cilјni antigen (npr. BCMA), može biti poželјno da krak koji se vezuje za cilјni antigen, vezuje cilјni antigen sa visokim afinitetom, dok anti-CD3 krak vezuje CD3 samo sa umerenim ili niskim afinitetom ili bez afiniteta. Na ovaj način se može postići preferencijalno cilјano delovanje molekula koji vezuje antigen na ćelijama koje eksprimiraju cilјni antigen, uz izbegavanje opšteg/vezivanja CD3 van mesta ciljanog delovanja i posledičnih neželјenih sporednih efekata koji su sa time udruženi.

[0089] Predmetni opis uklјučuje bispecifične molekule koji vezuju antigen (npr. bispecifična antitela) koji su sposobni da se istovremeno vežu za humani CD3 i humani BCMA. Krak vezivanja koji interaguje sa ćelijama koje eksprimiraju CD3 može imati slabo ili nikakvo vezivanje, što se meri odgovarajućim in vitro testom vezivanja. Obim do koga se bispecifičan molekul koji vezuje antigen vezuje za ćelije koje eksprimiraju CD3 i/ili BCMA može biti procenjen sortiranjem ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS), kao što je ovde ilustrovano u Primerima 5 i 6.

[0090] Predmetni opis uklјučuje antitela, fragmente koji vezuju antigen i njihova bispecifična antitela koja vezuju humani CD3 i indukuju aktivaciju T-ćelija.

[0091] Predmetni opis uklјučuje anti-BCMA x anti-CD3 bispecifične molekule koji vezuje antigen, koji su sposobni da iscrpe ili smanje ćelije koje eksprimiraju tumorski antigen kod subjekta (pogledati, npr. Primere 8-16, ili suštinski sličan test). Na primer, u skladu sa određenim aspektima, obezbeđeni su anti-BCMA x anti-CD3 bispecifični molekuli koji vezuju antigen, pri čemu jedno ili višestruko davanje subjektu 0,04 mg/kg, 0,4 mg/kg ili 4 mg/kg bispecifičnog molekula koji vezuje antigen prouzrokuje smanjenje broja ćelija koje eksprimiraju BCMA kod subjekta (npr. rast tumora kod subjekta je suprimiran ili inhibiran).

Priprema domena koji vezuje antigen i konstruisanje bispecifičnih molekula

[0092] Domeni koji vezuje antigen, specifični za određene antigene, mogu biti pripremani bilo kojom tehnologijom za generisanje antitela koja je poznata u stanju tehnike. Jednom dobijena, dva različita domena koji vezuju antigen, specifična za dva različita antigena (npr. CD3 i BCMA), mogu biti na odgovarajući način raspoređena jedan u odnosu na drugog da bi se proizveo bispecifičan molekul koji vezuje antigen predmetnog pronalaska, upotrebom rutinskih postupaka. (Diskusija o formatima bispecifičnih antitela za primer koji mogu biti upotrebljeni za konstruisanje bispecifičnih molekula koji vezuju antigen predmetnog pronalaska obezbeđena je ovde na drugom mestu). U određenim primerima izvođenja, jedna ili više pojedinačnih komponenti (npr. teški i laki lanci) multispecifičnih molekula koji vezuju antigen pronalaska izvedeni su iz himernih, humanizovanih ili potpuno humanih antitela. Postupci za pravlјenje takvih antitela su dobro poznati u stanju tehnike. Na primer, jedan ili više teških i/ili lakih lanaca bispecifičnih molekula koji vezuju antigen može biti pripremljen upotrebom VELOCIMMUNE<™>tehnologije. Upotrebom VELOCIMMUNE<™>tehnologije (ili bilo koje druge tehnologije za generisanje humanih antitela), himerna antitela visokog afiniteta za određeni antigen (npr. CD3 ili BCMA) inicijalno se izoluju sa humanim varijabilnim regionom i mišjim konstantnim regionom. Antitela se zatim karakterišu i selektuju prema poželјnim karakteristikama, uklјučujući afinitet, selektivnost, epitop itd. Mišji konstantni regioni se zatim zamenjuju želјenim humanim konstantnim regionom, da bi se generisali potpuno humani teški i/ili laki lanci koji se mogu ugraditi u bispecifične molekule koji vezuju antigen.

[0093] Genetički modifikovane životinje mogu biti upotrebljene za pravlјenje humanih bispecifičnih molekula koji vezuju antigen. Na primer, može biti upotrebljen genetički modifikovan miš koji nije sposoban da preuredi i eksprimira varijabilnu sekvencu mišjeg imunoglobulinskog lakog lanca, pri čemu miš eksprimira samo jedan ili dva varijabilna domena humanog lakog lanca koji su kodirani humanim imunoglobulinskim sekvencama koje su operativno povezane sa mišjim konstantnim genom kapa u okviru endogenog kapa lokusa miša. Takvi genetički modifikovani miševi mogu biti upotrebljeni za proizvodnju potpuno humanih bispecifičnih molekula koji vezuje antigen, koji sadrže dva različita teška lanca koji se udružuju sa identičnim lakim lancem koji sadrži varijabilni domen izveden iz jednog od dva različita segmenta humanog gena za varijabilni region lakog lanca. (pogledati npr. US 2011/0195454). Potpuno humano se odnosi na antitelo, ili fragment koji vezuje antigen ili njegov imunoglobulinski domen, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kodiranu sa DNK izvedenom iz humane sekvence preko cele dužine svakog polipeptida antitela ili fragmenta koji vezuje antigen ili njegovog imunoglobulinskog domena. U pojedinim slučajevima, potpuno humana sekvenca je izvedena iz proteina koji je endogen za čoveka. U drugim slučajevima, potpuno humana proteinska ili proteinska sekvenca sadrži himernu sekvencu u kojoj je svaka komponentna sekvence izvedena iz humane sekvence. Iako nije povezano ni sa jednom teorijom, himerni proteini ili himerne sekvence se u principu dizajniraju tako da se svede na minimum stvarenje imunogenih epitopa u spojevima sekvenci koje su komponente, npr. u poređenju sa bilo kojim humanim imunoglobulinskim regionima ili domenima divljeg tipa.

Terapijska formulacija i davanje

[0094] Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže molekule koji vezuju antigen predmetnog pronalaska. Farmaceutske kompozicije pronalaska su formulisane sa pogodnim nosačima, ekscipijensima i drugim agensima koji obezbeđuju pobolјšani prenos, isporuku, toleranciju i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija može se naći u formularu poznatom svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije uklјučuju, na primer, prahove, paste, masti, želee, voskove, ulјa, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je LIPOFECTIN<™>, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije tipa ulje-u-vodi i voda-u-ulјu, emulzije uglјenog voska (polietilen glikoli različite molekulske težine), polučvrste gelove i polučvrste mešavine koji sadrže uglјeni vosak. Pogledati takođe Powell i saradnici „Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0095] Doza molekula koji vezuje antigen koja se daje pacijentu može varirati u zavisnosti od starosti i veličine pacijenta, cilјne bolesti, stanja, načina primene i sličnog. Poželјna doza se obično izračunava prema telesnoj težini ili površini tela. Kada se bispecifičan molekul koji vezuje antigen predmetnog pronalaska upotrebljava u terapijske svrhe kod odraslog pacijenta, može biti korisno da se bispecifičan molekul koji vezuje antigen predmetnog pronalaska primeni intravenski, normalno u jednoj dozi od oko 0,01 do oko 20 mg /kg telesne težine, poželјnije oko 0,02 do oko 7, oko 0,03 do oko 5, ili oko 0,05 do oko 3 mg/kg telesne težine. U zavisnosti od ozbiljnosti stanja, učestalost i trajanje lečenja mogu biti podešavani. Efektivne doze i rasporedi za davanje bispecifičnog molekula koji vezuje antigen mogu biti utvrđeni empirijski; na primer, progresija kod pacijenta se može pratiti periodičnom procenom i doza se prilagođavati u skladu sa time. Štaviše, skaliranje doza između vrsta može biti urađena upotrebom dobro poznatih postupaka iz oblasti tehnike (npr. Mordenti i saradnici, 1991, Pharmaceut. Res.8:1351).

[0096] Poznati su različiti sistemi isporuke i oni mogu biti upotrebljeni za davanje farmaceutske kompozicije pronalaska, npr. inkapsulacija u lipozome, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da eksprimiraju mutiran viruse, endocitoza posredovana receptorima (pogledati, npr. Wu i saradnici, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Postupci uvođenja uklјučuju, ali nisu ograničene na, intradermalni, intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, subkutani, intranazalni, epiduralnim i oralni put primene. Kompozicija može biti data bilo kojim konvencionalnim načinom davanja, na primer infuzijom ili bolus injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili mukokutane obloge (npr. oralnu sluzokožu, rektalnu i sluzokožu itd.), a može se primeniti i zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Davanje može biti sistemsko ili lokalno.

[0097] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti isporučena subkutano ili intravenski sa standardnom iglom i špricem. Pored toga, u pogledu subkutane isporuke, uređaj za isporuku tipa olovke (pen) lako je primenljiv u isporuci farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Takav uređaj za isporuku tipa olovke može biti za višekratnu ili jednokratnu upotrebu. Uređaj za isporuku tipa olovke za višekratnu upotrebu, generalno koristi zamenlјivu patronu koja sadrži farmaceutsku kompoziciju. Jednom kada se celokupna farmaceutska kompozicija unutar patrone primeni i patrona je prazna, prazna patrona se može lako odbaciti i zameniti novom patronom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Uređaj za isporuku tipa olovke se tada može ponovo koristiti. U uređaju za isporuku tipa olovke za jednokratnu upotrebu ne postoji zamenlјiva patrona. Umesto toga, uređaj za isporuku tipa olovke za jednokratnu upotrebu dolazi unapred napunjen farmaceutskom kompozicijom koja se nalazi u rezervoaru unutar uređaja. Kada se farmaceutska kompozicija isprazni iz rezervoara, ceo uređaj se odbacuje.

[0098] Brojni uređaji za isporuku olovke i autoinjektori za višekratnu upotrebu imaju primenu u subkutanoj isporuci farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Primeri uklјučuju, ali nisu ograničeni na AUTOPEN<™>(Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Švajcarska), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II and III (Novo Nordisk, Copenhagen, Danska), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Danska), BD™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ i OPTICLIK™ (Sanofi-ventis, Frankfurt, Nemačka), da navedemo samo nekoliko. Primeri uređaja za isporuku tipa olovke za jednokratnu upotrebu koji imaju primenu u subkutanoj isporuci farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska uklјučuju, ali nisu ograničeni na, SOLOSTAR™ pen (sanof-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) i KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ autoinjektor (Amgen, ThousandOaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Nemačka), EPIPEN (Dey, L.P.) i HUMIRA™ Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL), da navedemo samo nekoliko.

[0099] U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija može biti isporučena putem sistema za kontrolisano oslobađanje. U jednom primeru izvođenja, može biti upotrebljavana pumpa (pogledati Langer, navedeno iznad; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:201). U drugom izvođenju, mogu biti upotrebljeni polimerni materijali; pogledati, Medical Applications of Controlled Release, Langer i Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. U još jednom primeru izvođenja, sistem sa kontrolisanim oslobađanjem može biti postavlјen u blizini ciljnog mesta delovanja, što zahteva samo delić sistemske doze (pogledati, npr. Goodson, 1984, u Medical Applications of Controlled Release, navedeno iznad, vol.2, pp.

115-138). Drugi sistemi kontrolisanog oslobađanja se razmatraju u revijskom članku Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

[0100] Preparati za injeciranje mogu uključivati dozne oblika za intravenska, subkutana, intrakutana i intramuskularna injeciranja, infuziju u kapima itd. Ovakvi preparati za injeciranje moraju biti pripremlјeni postupcima koji su javno poznati. Na primer, preparati za injeciranje mogu biti pripremani, npr.

rastvaranjem, resuspendovanjem ili emulgovanjem antitela ili njihovih soli koje su prethodno opisane u sterilnom vodenom medijumu ili ulјanom medijumu koji se uobičajeno koristi za injekcije. Kao vodeni medijum za injeciranje, postoje, na primer, fiziološki rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i drugi pomoćni agensi itd., koji mogu biti upotrebljeni u kombinaciji sa odgovarajućim agensom za solubilizaciju kao što je alkohol (npr. etanol), polialkohol (npr. propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr. polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulјa)] itd. Kao ulјani medijum koriste se npr. susamovo ulјe, sojino ulјe itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa agensom za solubilizaciju kao što je benzil benzoat, benzil alkohol itd. Ovako pripremlјenim injekcijama poželjno se ispunjava odgovarajuća ampula.

[0101] Prednost je da se prethodno opisane farmaceutske kompozicije za oralnu ili parenteralnu upotrebu pripremaju u vidu doznih oblika koji su jedinične doze i da se na taj način uklopi odgovarajuća doza aktivnih sastojaka. Takvi dozni oblici u jediničnoj dozi obuhvataju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije itd. Količina prethodno navedenog antitela koja je sadržana generalno iznosi oko 5 do oko 500 mg po doznom obliku u jediničnoj dozi; posebno u obliku injekcije, poželјno je da prethodno navedeno antitelo bude sadržaja od oko 5 do oko 100 mg i od oko 10 do oko 250 mg za druge dozne oblike.

Terapeutska upotreba molekula koji vezuju antigen

[0102] U predmetnom pronalasku, terapijska kompozicija koja sadrži bispecifičan molekul koji vezuje antigen, pronalaska koji specifično vezuje CD3 i BCMA, obezbeđena je za upotrebu u postupku lečenja multiplog mijeloma, drugog B-ćelijskog maligniteta koji eksprimira BCMA ili tumora koji eksprimira BCMA. Terapijska kompozicija sadrži farmaceutski prihvatlјiv nosač ili razblaživač. Kao što se ovde upotrebljava, izraz „subjekat kome je to potrebno” označava humanu ili životinju različitu od čoveka koja ispoljava jedan ili više simptoma ili indicija kancera (npr. subjekt koji eksprimira tumor ili pati od bilo kog od kacera koji je naveden u nastavku teksta), ili koji bi na drugi način imao koristi od inhibicije ili smanjenja aktivnosti BCMA ili deplecije BCMA+ ćelija (npr. ćelija multiplog mijeloma).

[0103] Bispecifični molekuli koji vezuju antigen pronalaska (i terapijske kompozicije koje ih sadrže) su korisni, između ostalog, za lečenje bilo koje bolesti ili poremećaja kod kojih bi stimulacija, aktivacija i/ili cilјano delovanje na imunski odgovor bili od koristi. Preciznije, anti-BCMA x anti-CD3 bispecifični molekuli koji vezuju antigen predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje, prevenciju i/ili ublažavanje bilo koje bolesti ili poremećaja koji su povezani ili posredovani ekspresijom ili aktivnošću BCMA ili proliferacijom BCMA+ ćelije. Mehanizam delovanja kojim se postižu terapijski postupci uklјučuje ubijanje ćelija koje eksprimiraju BCMA u prisustvu efektorskih ćelija, na primer, sa CDC, apoptozom, ADCC, fagocitozom, ili kombinacijom dva ili više od ovih mehanizama. Ćelije koje eksprimiraju BCMA i koje se mogu inhibirati ili ubiti upotrebom bispecifičnih molekula koji vezuju antigen pronalaska uklјučuju, na primer, ćelije multiplog mijeloma.

[0104] Molekuli koji vezuju antigen predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa ekspresijom BCMA uklјučujući, npr. kancer, uklјučujući multipli mijelom ili druge kancere B-ćelija ili plazma ćelija, kao što su Valdenstromova makroglobulinemija, Burkitov limfom, i difuzni B-krupnoćelijski limfom, ne-Hočkinov limfom, hronična limfocitna leukemija, folikularni limfom, mantl ćelijski limfom, limfom marginalne zone, limfoplazmacitni limfom i Hočkinov limfom. Prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, anti-BCMA x anti-CD3 bispecifična antitela su korisna za lečenje pacijenata obolelih od multiplog mijeloma. Prema drugim srodnim primerima izvođenja pronalaska, anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičan molekul koji vezuje antigen pronalaska daje se pacijentu koji boluje od multiplog mijeloma. Analitički/dijagnostički postupci poznati u stanju tehnike, kao što je skeniranje tumora itd., mogu biti upotrebljeni da bi se utvrdilo da li pacijent ima multipli mijelom ili drugi kancer B-ćelijske loze.

[0105] Predmetni pronalazak takođe uklјučuje bispecifične molekule koji vezuju antigen za lečenje rezidualnog kancera kod subjekta. Kao što se ovde upotrebljava, termin „rezidualni kancer” označava postojanje ili postojanost jedne ili više kancerskih ćelija kod subjekta nakon tretmana sa anti-kancer terapijom.

[0106] Prema određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifične molekule koji vezuju antigen pronalaska za upotrebu u postupku lečenja multiplog mijeloma, koji obuhvata davanja jednog ili više bispecifičnih molekula koji vezuju antigen subjektu nakon što je utvrđeno da subjekat ima multipli mijelom. Na primer, predmetni pronalazak uklјučuje anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičan molekul pronalaska koji vezuje antigen za upotrebu u lečenju multiplog mijeloma, pri čemu se molekul koji vezuje za antigen daje 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 1 nedelјu, 2 nedelјe, 3 nedelјe ili 4 nedelјe, 2 meseca, 4 meseca, 6 meseci, 8 meseci, 1 godinu ili više nakon što je subjekt primio drugu imunoterapiju ili hemoterapiju.

Kombinovane terapije i formulacije

[0107] Farmaceutska kompozicija pronalaska može biti primenjena subjektu u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapijskih agenasa. Primeri dodatnih terapijskih agenasa koji se mogu kombinovati sa ili davati u kombinaciji sa molekulom koji vezuje antigen predmetnog pronalaska uklјučuju, npr. anti-tumorski agens (npr. hemoterapijske agense uklјučujući melfalan, vinkristin (Oncovin), ciklofosfamid (Cytoxan), etopozid (VP-16), doksorubicin (Adriamycin), lipozomalni doksorubicin (Doxil), obendamustin (Treanda) ili bilo koje druge za koje je poznato da su efektivni u lečenju tumora plazma ćelija kod subjekta.). U pojedinim primerima izvođenja, drugi terapijski agens sadrži steroide. U pojedinim primerima izvođenja, drugi terapijski agens obuhvata cilјane terapije uklјučujući talidomid, lenalidomid i bortezomib, što su terapije odobrene za lečenje novodijagnostikovanih pacijenata. Lenalidomid, pomalidomid, bortezomib, karfilzomib, panobinostat, iksazomib, elotuzumab i daratumumab su primeri drugog terapijskog sredstva efektivnog za lečenje rekurentnog mijeloma. U određenim primerima izvođenja, drugi terapijski agens je režim koji obuhvata radioterapiju ili transplantaciju matičnih ćelija. U određenim primerima izvođenja, drugi terapijski agens može biti imunomodulatorni agens. U određenim primerima izvođenja, drugi terapijski agens može biti inhibitor proteazoma, uklјučujući bortezomib (Velcade), karfilzomib (Kyprolis), iksazomib (Ninlaro). U određenim primerima izvođenja, drugi terapijski agens može biti inhibitor histon deacetilaze kao što je panobinostat (Farydak). U određenim primerima izvođenja, drugi terapijski agens može biti monoklonsko antitelo, konjugat leka i antitela, bispecifično antitelo konjugovano sa antitumorskim agensom, inhibitor kontrolne tačke ili njihove kombinacije. Drugi agensi koji mogu imati blagotvorno delovanje nakon davanja u kombinaciji sa molekulima koji vezuju antigen pronalaska uklјučuju inhibitore citokina, uklјučujući inhibitore citokina tipa malih molekula i antitela koja se vezuju za citokine kao što su IL-1, IL-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 ili za njihove odgovarajuće receptore. Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska (npr. farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-BCMA x anti-CD3 bispecifične molekule koji vezuju antigen) mogu takođe biti davane kao deo terapijskog režima koji sadrži jednu ili više terapijskih kombinacija izabranih od monoklonskog antitela različitog od onih koja su ovde opisana, a koje mogu intereagovati sa različitim antigenima na površini plazma ćelija, bispecifičnog antitela, koje ima jedan krak koji vezuje antigen na površini tumorske ćelije i drugi krak koji vezuje antigen na T-ćeliji, konjugat antitela i leka, bispecifično antitelo konjugovano sa antitumorskim agensom, inhibitor kontrolne tačke, na primer, onaj koji cilјano deluje na PD-1 ili CTLA-4, ili njihove kombinacije. U određenim primerima izvođenja, inhibitori kontrolnih tačaka mogu biti izabrani između inhibitora PD-1, kao što su pembrolizumab (Keytruda), nivolumab (Opdivo) ili cemiplimab (REGN2810). U određenim primerima izvođenja, inhibitori kontrolnih tačaka mogu biti izabrani od inhibitora PD-L1, kao što su atezolizumab (Tecentriq), avelumab (Bavencio) ili Durvalumab (Imfinzi)). U određenim primerima izvođenja, inhibitori kontrolne tačke mogu biti izabrani između inhibitora CTLA-4, kao što je ipilimumab (Yervoy). Druge kombinacije koje mogu biti upotrebljene zajedno sa antitelom pronalaska su prethodno opisane.

[0108] Predmetni pronalazak takođe uklјučuje terapijske kombinacije koje sadrže bilo koji od molekula koji vezuju antigen pronalaska i inhibitor jednog ili više od VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvIII, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-α, PDGFR-β, FOLH1 (PSMA), PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, uroplakina ili bilo koji od prethodno navedenih citokina, pri čemu je inhibitor aptamer, antisens molekul, ribozim, siRNA, peptitelo, nanotelo ili fragment antitela (npr. Fab fragment; F(ab')2fragment; Fd fragment; Fv fragment; scFv; dAb fragment; ili drugi molekuli konstruisani genetičkim inženjeringom, kao što su diatela, triatela, tetratela, minitela i minimalne jedinice prepoznavanja). Molekuli koji vezuju antigen pronalaska takođe mogu biti davani i/ili ko-formulisani u kombinaciji sa antivirusnim lekovima, antibioticima, analgeticima, kortikosteroidima i/ili NSAID. Molekuli koji vezuju antigen pronalaska takođe mogu davani kao deo režima lečenja koji takođe uklјučuje tretman zračenjem i/ili konvencionalnu hemoterapiju.

[0109] Dodatna terapijski aktivna(e) komponenta(e) može biti davana neposredno pre, istovremeno sa, ili ubrzo nakon davanja molekula koji vezuje antigen predmetnog pronalaska; (za potrebe predmetnog opisa, takvi režimi davanja se smatraju davanjem molekula koji vezuje antigen „u kombinaciji sa” dodatnom terapijski aktivnom komponentom).

[0110] Predmetni pronalazak uklјučuje farmaceutske kompozicije u kojima je molekul koji vezuje antigen predmetnog pronalaska ko-formulisan sa jednom ili više dodatnih terapijski aktivnih komponenti kao što je ovde opisano negde drugde.

Režimi davanja

[0111] Prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, višestruke doze molekula koji vezuje antigen (bispecifičnog molekula koji vezuje antigen i specifično vezuje BCMA i CD3, kao što je definisano u patentnim zahtevima) mogu biti davane subjektu tokom definisanog vremenskog perioda. Postupci prema ovom aspektu pronalaska obuhvataju sekvencijalno davanje subjektu višestrukih doza molekula koji vezuje antigen pronalaska. Kao što se ovde upotrebljava, „sekvencionalno davanje” označava da se svaka doza molekula koji vezuje antigen daje subjektu u različitom trenutku, npr. na različite dane razdvojene unapred određenim intervalom (npr. u vidu sata, dana, nedelјa ili meseci). Predmetni pronalazak uključuje postupke koje obuhvataju sekvencijalno davanje pacijentu jedne inicijalne doze molekula koji vezuje antigen, nakon čega sledi jedna ili više sekundarnih doza molekula koji vezuje antigen, i opciono je praćeno jednom ili sa više tercijalnih doza molekula koji vezuje antigen.

[0112] Termini „početna doza”, „sekundarne doze” i „tercijarne doze” odnose se na vremensku sekvencu davanja molekula koji vezuje antigen pronalaska. Prema tome, „početna doza” je doza koja se daje na početku režima lečenja (označena i kao „osnovna doza"); „sekundarne doze” su doze koje se daju nakon početne doze; a „tercijarne doze” su doze koje se daju nakon sekundarnih doza. Inicijalne, sekundarne i tercijarne doze mogu sadržavati istu količinu molekula koji vezuje antigen, ali generalno se mogu razlikovati jedna u odnosu na drugu od druge u smislu učestalosti primene. U određenim primerima izvođenja, međutim, količina molekula koji vezuje antigen sadržana u početnim, sekundarnim i/ili tercijalnim dozama varira jedna od druge (npr. podesiti gore ili dole prema potrebi) tokom lečenja. U određenim primerima izvođenja, dve ili više (npr.2, 3, 4 ili 5) doza daju se na početku režima lečenja kao „udarne doze”, nakon kojih slede doze koje se daju po osnovi ređe učestalosti (npr. „doze održavanja“).

[0113] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, svaka sekundarna i/ili tercijarna doza se daje 1 do 26 (npr. 1, 11⁄2, 2, 21⁄2, 3, 31⁄2, 4, 41⁄2, 5, 51⁄2, 6, 61⁄2, 7, 71⁄2, 8, 81⁄2, 9, 91⁄2, 10, 101⁄2, 11, 111⁄2, 12, 121⁄2, 13, 131⁄2, 14, 141⁄2, 15, 151⁄2, 16, 161⁄2, 17, 171⁄2, 18, 181⁄2, 19, 191⁄2, 20, 201⁄2, 21, 211⁄2, 22, 221⁄2, 23, 231⁄2, 24, 241⁄2, 25, 251⁄2, 26, 261⁄2, ili više) nedelјa nakon neposredno prethodne doze. Fraza „neposredna prethodna doza”, kako se ovde upotrebljava, označava, u nizu višestrukih primena, dozu molekula koji vezuje antigen koji se daje pacijentu pre davanja prve sledeće doze u nizu bez intervenišućih doza.

[0114] Postupci prema ovom aspektu pronalaska mogu obuhvatati davanje pacijentu bilo kog broja sekundarnih i/ili tercijalnih doza molekula koji vezuje antigen (npr. anti-BCMA antitela ili bispecifičnog molekula koji vezuje antigen i specifično vezuje BCMA i CD3). Na primer, u određenim primerima izvođenja, pacijentu se daje samo jedna sekundarna doza. U drugim primerima izvođenja, dve ili više (npr.

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) sekundarne doze se daju pacijentu. Slično navedenom, u određenim primerima izvođenja, pacijentu se daje samo jedna tercijarna doza. U drugim primerima izvođenja, pacijentu se daje dve ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) tercijarnih doza se daju pacijentu.

[0115] U primerima izvođenja koje uklјučuju višestruke sekundarne doze, svaka sekundarna doza može biti data istom učestalošću kao i druge sekundarne doze. Na primer, svaka sekundarna doza se može biti data pacijentu 1 do 2 nedelјe nakon neposredno prethodne doze. Slično navedenom, u primerima izvođenja koje uklјučuju više tercijarnih doza, svaka tercijarna doza se može primeniti istom učestalošću kao i druge tercijarne doze. Na primer, svaka tercijarna doza se može primeniti kod pacijenta 2 do 4 nedelјe nakon doze neposredno prethodne doze. Alternativno, učestalost na kojoj se sekundarne i/ili tercijarne doze daju pacijentu može varirati tokom režima lečenja. Učestalost davanja takođe može biti prilagođena tokom lečenja od strane ordinirajućeg lekara u zavisnosti od potreba svakog pojedinačnog pacijenta nakon kliničkog pregleda.

Dijagnostičke upotrebe antitela

[0116] Anti-BCMA antitela predmetnog opisa takođe mogu biti upotrebljena za detektovanje i/ili merenje BCMA, ili ćelija koje eksprimiraju BCMA u uzorku, npr. u dijagnostičke svrhe. Na primer, anti-BCMA antitelo, ili njegov fragment, mogu biti upotrebljeni za dijagnozu stanja ili bolesti koju karakteriše aberantna ekspresija (npr. prekomerna ekspresija, nedovolјna ekspresija, nedostatak ekspresije itd.) BCMA. Dijagnostički testovi za BCMA za primer mogu obuhvatiti, npr. dovođenje uzorka koji je dobijen iz pacijenta u kontakt sa anti-BCMA antitelom pronalaska, pri čemu je anti-BCMA antitelo obeleženo obeleživačem ili reporterskim molekulom koji se može detektovati. Alternativno, neobeleženo anti-BCMA antitelo može biti upotrebljeno u dijagnostičkoj primeni u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je i samo obeleženo tako da se može detektovati. Obeležavanje koje se može detektovati ili reporterski molekul može biti radioizotop, kao npr.<3>H,<14>C,<32>P,<35>S, ili<125>I; fluorescentni ili hemiluminiscentni ostaci kao što su fluorescein izotiocijanat ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, betagalaktozidaza, peroksidaza rena ili luciferaza. Druge dijagnostičke upotrebe anti-BCMA antitela pronalaska za primer uklјučuju<89>Zr-obeležena, kao što je npr<89>antitelo obeleženo Zr-desferioksaminom u svrhu neinvazivne identifikacije i praćenja tumorskih ćelija kod subjekta (npr. pozitronska emisiona tomografija (PET) snimanje). (Pogledati npr. Tavare, R. i saradnici Cancer Res.2016 Jan 1;76(1):73-82; i Azad, BB. i saradnici, Oncotarget.2016. 15. mart;7(11):12344-58.) Specifični testovi za primer, koji mogu biti upotrebeljeni za detektovanje ili merenje BCMA u uzorku uklјučuju enzimski imunosorbentni test (ELISA), radioimunoesej (RIA) i sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS).

[0117] Uzorci koji mogu biti upotrebljeni u BCMA dijagnostičkim testovima uklјučuju bilo koji uzorak tkiva ili tečnosti koji može biti dobijen iz pacijenta i koji sadrži količine BCMA proteina, ili njegovog fragmenta koje se mogu detektovati pod normalnim ili patološkim uslovima. U principu, nivoi BCMA u određenom uzorku dobijenom iz zdravog pacijenta (npr. pacijenta koji nije pogođen bolešću ili stanjem povezanim sa abnormalnim nivoima ili aktivnošću BCMA) biće izmeren da bi se inicijalno utvrdio osnovni ili standardni nivo BCMA. Ovaj osnovni nivo BCMA se zatim može upoređivati sa nivoima BCMA izmerenim u uzorcima dobijenim od pojedinaca za koje se sumnja da imaju bolest ili stanje povezano sa BCMA (npr. tumor koji sadrži ćelije koje eksprimiraju BCMA).

PRIMERI

[0118] Primeri koji slede ilustruju, ali ne ograničavaju obim patentnih zahteva. Mogu obuhvatati detalјe o konstruktima koji ne pripadaju obimu patentnih zahteva; takvi detalјi su obezbeđeni samo informativno. Uloženi su napori da se osigura tačnost u pogledu brojeva koji su upotrebljavani (npr. količina, temperatura itd.), ali pojedine eksperimentalne greške i odstupanja bi trebale biti uzete u obzir. Ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su delovi po težini, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.

Primer 1: Generisanje anti-BCMA antitela

[0119] Anti-BCMA antitela su dobijana imunizacijom genetički modifikovanog miša sa humanim BCMA antigenom (npr. hBCMA, SEQ ID NO: 115) ili imunizacijom miša konstruisanog genetičkim inženjeringom koji je sadržavao DNK koja kodira varijabilne regione imunoglobulinskih teških i kapa lakih lanaca sa humanim BCMA antigenom.

[0120] Nakon imunizacije, splenociti su prikuplјani iz svakog miša i ili su (1) fuzionisani sa mišjim mijelomskim ćelijama da bi se očuvala njihova vijabilnost i obrazovale hibridoma ćelije, nakon čega je skrinovana njihova specifičnost za BCMA, ili su (2) podvrgavane B-ćelijskom sortiranju (kao što je opisano u US 2007/0280945A1) upotrebom fragmenta humanog BCMA kao reagensa za sortiranje koji vezuje i identifikuje reaktivna antitela (B-ćelije pozitivne na antigen).

[0121] Himerna antitela na BCMA su prvobitno izolovana sa humanim varijabilnim regionom i mišjim konstantnim regionom. Antitela su okarakterisana i selektovana prema poželјnim karakteristikama, uklјučujući afinitet, selektivnost itd. Ukoliko je bilo potrebno, mišji konstantni regioni bili su zamenjeni želјenim humanim konstantnim regionom, na primer divlјeg tipa ili sa modifikovanim konstantnim regionima IgG1 ili IgG4, da bi se generisalo u potpunosti humano anti-BCMA antitelo. Dok selektovan konstantan region može varirati u zavisnosti od specifične upotrebe, karakteristike vezivanja antigena sa visokim afinitetom i specifičnosti za ciljni molekul određene su varijabilnim regionom.

[0122] Aminokiselinske i sekvence nukleinskih kiselina varijablnih regiona teških i lakih lanaca anti-BCMA antitela: Tabela 1 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona i CDR teških i lakih lanaca selektovanih anti-BCMA antitela pronalaska. Odgovarajući identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina su navedeni u Tabeli 2.

Tabela 1: Identifikatori aminokiselinskih sekvenci

Tabela 2: Identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina

Primer 2: Generisanje anti-CD3 antitela

[0123] Anti-CD3 antitela su generisana kao što je opisano u WO 2017/053856. Dva takva anti-CD3 antitela bila su selektovana iz proizvodnje bispecifičnih anti-BCMA x anti-CD3 antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom. Tabela 3 navodi identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona i CDR teških i lakih lanaca selektovanih anti-CD3 antitela. Odgovarajući identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina su navedeni u Tabeli 4. Druga anti-CD3 antitela za upotrebu u pripremanju bispecifičnih antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se naći u npr. WO 2014/047231.

Tabela 3: Identifikatori aminokiselinskih sekvenci

Tabela 4: Identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina

Primer 3: Generisanje bispecifičnih antitela koja vezuju BCMA i CD3

[0124] Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifične molekule koji vezuju antigen, koji vezuju CD3 i BCMA; takvi bispecifični molekuli koji vezuju antigen ovde se takođe označavaju kao „anti-BCMA x anti-CD3 ili anti-CD3xBCMA ili anti-BCMA x anti-CD3 bispecifični molekuli.” Anti-BCMA deo anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnog molekula je koristan za cilјano delovanje na tumorske ćelije koje eksprimiraju BCMA (takođe poznat kao CD269), a anti-CD3 deo bispecifičnog molekula je koristan za aktiviranje T-ćelija. Istovremeno vezivanje BCMA za tumorsku ćeliju i CD3 za T-ćeliju olakšava usmereno ubijanje (ćelijsku lizu) cilјne tumorske ćelije od strane aktivirane T-ćelije.

[0125] Bispecifična antitela koja sadrže specifičan anti-BCMA domen za vezivanje i specifičan anti-CD3 domen za vezivanje, konstruisana su upotrebom standardnih metodologija, pri čemu svaki od anti-BCMA domena koji vezuje antigen i anti-CD3 domena koji vezuje antigen sadrži različite, jasno razdvojene HCVR, uparene sa uobičajenim LCVR. U bispecifičnim antitelima koja su navedena kao primeri, molekuli su konstruisani korišćenjem teškog lanca iz anti-CD3 antitela, teškog lanca iz anti-BCMA antitela i uobičajenog lakog lanca iz anti-CD3 antitela (10082). U drugim slučajevima, bispecifična antitela mogu biti konstruisana korišćenjem teškog lanca iz anti-CD3 antitela, teškog lanca iz anti-BCMA antitela i lakog lanca antitela za koga je poznato da je promiskuitetan ili da se efektivno uparuje sa raznovrsnim kracima teških lanaca.

Tabela 5: Sažetak sastavnih delova anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnih antitela

[0126] Tabela 6 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci za bispecifična anti-BCMA x anti-CD3 antitela koja su ovde prikazana kao primeri.

Tabela 6: Aminokiselinske sekvence anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnih antitela

Primer 4: Afiniteti vezivanja izvedeni iz rezonancije površinskog plazmona i kinetičke konstante anti-BCMA antitela i anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnih antitela

[0127] Ravnotežne konstante disocijacije (KDvrednosti) vezivanja hBCMA.mmh (SEQ ID NO: 106) za prečišćena anti-BCMA mAt i anti-BCMA x anti-CD3 bispecifična mAt određivane su upotrebom biosenzora za rezonanciju površinskog plazmona u realnom vremenu, upotrebom Biacore 4000 instrumenta. Površina CM5 Biacore senzora bila je derivatizovana aminskim kuplovanjem sa monoklonskim mišjim anti-humanim Fc antitelom (GE, # BR-1008-39) da bi se uhvatila prečišćena anti-BCMA mAt i anti-BCMA x anti-CD3 bispecifična mAt. Sve Biacore studije vezivanja bile su izvođene u puferu sastavlјenom od 0,01 M HEPES pH 7,4; 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfaktanta P20 (HBS-ET pufer za protok). Za monomerne afinitete, različite koncentracije vanćelijskog domena humanog BCMA eksprimiranog sa myc-mycheksahistidinskim tagom na C-kraju (humani BCMA-MMH; SEQ ID NO: 106) ili BCMA majmuna eksprimiranog sa myc-myc-heksahistidinskim tagom na C-kraju (BCMA-MMH majmuna; SEQ ID NO: 110) pripremani su u HBS-ET puferu za protok (opsega od 90 do 1,11 nM, 3-struka razblaženja). Za dimerne afinitete, pripremane su različite koncentracije vanćelijskog domena humanog BCMA eksprimiranog sa mFc tagom na C-kraju (humani BCMA-MFC; SEQ ID NO: 108), BCMA majmuna eksprimiranog sa mFc tagom na C-kraju (BCMA-MFC majmuna; SEQ ID NO: 112) pripremlјenih u HBS-ET puferu za protok (opsega od 30 do 0,37 nM, 3-struka razblaženja) ili 30 nM BCMA eksprimiranog sa mFc tagom na C-kraju (mišji BCMA-MFC; SEQ ID NO: 114). Uzorci antigena su zatim injecirani preko površina na koje su bila uhvaćena anti-BCMA i anti-BCMA x anti-CD3 bispecifična mAt pri brzini protoka od 30 uL/min. Povezivanje antitela i reagensa je praćeno tokom 5 minuta, dok je disocijacija u HBS-ET puferu za protok praćena tokom 10 minuta. Svi eksperimenti kinetike vezivanja su izvođeni na 25°C. Konstante brzine kinetičke asocijacije (ka) i disocijacije (kd) određivane su uklapanjem senzorgrama u realnom vremenu u model vezivanja 1:1 upotrebom softvera za uklapanje krivih, Scrubber 2.0c. Ravnotežne konstante disocijacije vezivanja (KD) i disocijativni poluživot (t1⁄2) izračunavani su iz kontanti kinetičkih stopa kao:

[0128] Kao što je prikazano u Tabeli 7, na 25°C, sva anti-BCMA antitela pronalaska su se vezivala za humani BCMA-MMH sa KDvrednostima opsega od 1,06nM do 3,56nM. Kao što je prikazano u Tabeli 8, na 25°C, sva anti-BCMA antitela pronalaska su se vezivala za humani BCMA-MFC sa KDvrednostima opsega od 22.3pM do 103pM. Kao što je prikazano u Tabeli 9, na 25°C, dva anti-BCMA antitela pronalaska vezivala su se za BCMA-MMH majmuna sa KDvrednostima opsega od 38,8 nM do 49,92 nM. Kao što je prikazano u Tabeli 10, na 25°C, četiri anti-BCMA antitela pronalaska vezivala su se za BCMA-MFC majmuna sa KDvrednostima opsega od 148pM do 14,7nM. Kao što je prikazano u Tabeli 11, na 25°C, četiri anti-BCMA antitela pronalaska vezivala su se za mišji BCMA-MFC sa KDvrednostima opsega od 677 pM do 18,8 nM.

Tabela 7: Parametri kinetika vezivanja anti-BCMA monoklonskih antitela koja se vezuju za humani BCMA-MMH na 25°C

Tabela 8: Parametri kinetika vezivanja anti-BCMA monoklonskih antitela koja se vezuju za humani BCMA-MFC na 25°C

Tabela 9: Parametri kinetika vezivanja anti-BCMA monoklonskih antitela koja se vezuju za BCMA-MMH majmuna na 25°C

Tabela 10: Parametri kinetika vezivanja anti-BCMA monoklonskih antitela koja se vezuju za BCMA-MFC majmuna na 25°C

Tabela 11: Parametri kinetika vezivanja anti-BCMA monoklonskih antitela koja se vezuju za mišji

BCMA-MFC na 25°C

Primer 5: FACS vezivanje anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnih antitela za ćelije koje exprimiraju humani i CD3 cinomolgus majmuna

[0129] Protočna citometrijska analiza je korišćena za određivanje vezivanja BCMAxCD3 bispecifičnih antitela za humani i CD3 cinomolgus majmuna (Jurkat ćelije, Jurkat ćelije sa mfCD3 kontruktom, primarne humane CD8+ i CD8+ T-ćelije cinomolgus majmuna). Ukratko, 1e05 ćelije/bunariću je inkubirano u prisustvu FACS rastvora za ispiranje sa reagensom za blokiranje (PBS+1% profiltriranog FBS+5% mišjeg seruma) i serijskim razblaženjem BCMAxCD3 i kontrolnih antitela tokom 30 minuta na ledu. Nakon inkubacije, ćelije su dva puta isprane hladnim FACS rastvorom za ispiranje (PBS 1% profiltriranog FBS) i vezano antitelo je detektovano inkubacijom sa anti-humanim sekundarnim antitelom konjugovanim sa Alexa647 na ledu, tokom dodatnih 30 minuta. Kao kontrola su upotrebljavani bunarići koji nisu sadržavali antitelo ili su sadržavali samo sekundarno antitelo. Za detekciju majmunskih i humanih T-ćelija, koktel humanih i unakrsno reaktivnih antitela cinomolgus majmuna na CD4, CD8 i CD16 dodat je anti-humanom sekundarnom. Nakon inkubacije, ćelije su isprane, resuspendovane u 200 µL hladnog PBS-a koji je sadržavao 1% profiltriranog FBS, pa su analizirane protočnom citometrijom na BD FACS Canto II. Ćelije su gejtovane sa FSC-H i FSC-A da bi se selektovali singletni događaji, nakon čega su usledila bočna i rasipanja unapred da bi se selektovali događaji uživo. Za T-ćelije majmuna, izvršeno je dodatno gejtovanje sa CD8+/CD16- ćelijama.

[0130] EC50 vrednosti za FACS vezivanje su izračunavani upotrebom 4-parametarske nelinearne regresione analize u softveru Prism.

[0131] Jurkat ćelije su humana T-ćelijska limfoblasna ćelijska linija koja eksprimira CD3. REGN5458 se vezivao za humani CD3 na Jurkat ćelijama i primarnim humanim CD8+ T-ćelijama sa medijanom EC50 od 1,50×10<-8>M i 3,20×10<-8>M, tim redom. Vezivanje REGN5459 za humani CD3 je bilo slabije, sa medijanom EC50 od 5,58×10<-7>M kod Jurkat ćelija i 4,71×10<-6>kod primarnih humanih CD8+ T-ćelija. Koristeći CRISPR/Cas9 tehnologiju, Jurkat ćelijska linija je izmenjena genetičkim inženjeringom tako da eksprimira CD3ε i CD3δ lance cinomolgus majmuna umesto humanih verzija. Medijana EC50 vezivanja REGN5458 za mfCD3 kod genetički izmenjene Jurkat ćelijske linije iznosila je 1,51×10<-8>M, dok je kod primarnih CD8+ T-ćelija cinomolgus majmuna bila 4,66×10<-8>M. REGN5459 se nije vezao za ćelije koje eksprimiraju mfCD3.

[0132] Vezivanje za bilo koju ćelijsku liniju nije uočeno za izotipsko antitelo, označeno kao mAb15260, kao negativnu kontrolu.

Tabela 12: Vezivanje za ćelije koje eksprimiraju CD3: Medijana EC50

Primer 6: FACS test vezivanja za procenu kapaciteta vezivanja antigena za površinu ćelije

[0133] Sposobnost anti-BCMA x CD3 antitela, mAb25442D, da se veže za površinu ćelija multiplog mijeloma pozitivnog na BCMA (NCI-H929, MM.1S, OPM-2 i RPMI-8226), limfoma pozitivnog na BCMA (Raji i Daudi) i ćelija negativnih na BCMA (HEK293) određivana je protočnom citometrijom. Ćelije su prikuplјene iz flaskova upotrebom pufera za disocijaciju ćelija (Millipore, Cat# S-004-C), nakon čega su zasejavane u pufer za bojenje (PBS, bez kalcijuma i magnezijuma (Irving 9240) 2% FBS (ATCC 30-2020) u gustini od 500.000 ćelija po bunariću, u ploču sa 96 mesta V oblika dna. Ćelije su bojene tokom 30 minuta na 4°C sa dvostrukim serijskim razblaženjima anti-BCMA x CD3 antitela konjugovanog sa Alexa647 (mAb25442D-A647) ili izotipske kontrole konjugovane sa Alexa647 koja je bila sa istim krakom vezivanja za CD3 koji je bio uparen sa irelevantnim krakom za ciljano delovanje na tumor (Izotip-A647). Ćelije su isprane dva puta sa puferom za bojenje, nakon čega su obeležene sa LIVE/DEAD<™>Fixable Green kompletom za bojenje mrtvih ćelija (Invitrogen, L34970) prema uputstvima proizvođača, da bi se jasno razlikovale žive i mrtve ćelije. Ćelije su dalje ispirane i fiksirane tokom 25 minuta na 4°C, upotrebom 50% rastvora BD Cytofix (BD, kat. br.554655) razblaženog u PBS-u. Uzorci su potom propušteni kroz Accuri C6 protočni citometar (BD Biosciences) i analizirani u Flowjo 10.2 (Tree Star). Nakon postavljanja gejtova za žive ćelije i pojedinačne ćelije, određen je srednji intenzitet fluorescencije (MFI) i MFI vrednosti su ucrtane u GraphPad Prism upotrebom četvoro-parametarske logističke jednačine i krive odgovora od 10 tačaka, da bi se izračunali EC50. Nulti uslov za svaku krivu doze i odgovora je takođe uklјučivan u analizu kao nastavak dvostrukog serijskog razblaženja i predstavlјen je kao najniža doza. Odnos signala i šuma (S/N) određivan je uzimanjem odnosa MFI za mAb25442D-A647 prema MFI za izotipsku kontrolu-A647. (Tabela 13). S/N za mAb25442D-A647 bio je opsega od 2 do 470, a EC50vrednosti su bile opsega od 27 do 83 nM. Vezivanje za HEK293 ćelije koje se moglo detektovati nije bilo uočeno.

Tabela 13: Vezivanje za ćelije

Primer 7: Aktivacija T-ćelija putem bispecifičnih anti-BCMA x anti-CD3 antitela u prisustvu ćelija koje eksprimiraju BCMA

[0134] Aktivnost anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnih antitela je ispitivana u Jurkat/NFATLuc reporterskom biološkom testu upotrebom nekoliko ćelijskih linija sa različitim nivoima površinske ekspresije BCMA. Jurkat ćelije su bile genetički izmenjene tako da eksprimiraju NFAT-luciferazni reporter (Jurkat/NFATLuc.3C7), a 50.000 Jurkat reporterskih ćelija je iskombinovano sa 50.000 BCMA pozitivnih (Daudi, MM1-S, NCI-H929, OPM-2, RPMI-8226, MOLP-8 ili Raji) ili ćelija negativnih na BCMA (HEK293) u belim Thermo Nunclon delta pločama sa 96 mesta (Thermo Scientific, kat. br.136102) u 50 ul medijuma za analizu (RPMI medijum sa 10% FBS i 1% P/S/G). Trostruka serijska razblaženja BCMA x CD3 bispecifičnih antitela (mAb25441D ili mAb25442D), ili bivalentnog anti-BCMA antitela (mAb21581), odmah su dodavana u 50 uL pufera za analizu. Ploče su lagano treskane i inkubirane na 37°C, u inkubatoru sa 5% CO2, tokom 4-6 sati. Aktivnost NFAT-Luciferaze je određivana upotrebom One-Glo reagensa kompanije Promega (kat. br. E6130) i Envision čitača ploča kompanije Perkin Elmer. Vrednosti RLU su unošene u grafik upotrebom GraphPad Prism programa i četvoroparametarske logističke jednačine uz upotrebu krive odgovora sa 12 tačaka, da bi se izračunale EC50vrednosti. Uslovi bez tretmana antitelom za svaku krivu doze i odgovora takođe su bili uključeni u analizu kao nastavak trostrukog serijskog razblaženja i predstavlјani su kao najniža doza. Odnos signala i šuma (S:N) utvrđivan je uzimanjem odnosa najvišeg RLU na krivoj prema najnižem.

[0135] Jurkat/NFATLuc ćelije su se aktivirale se mAb25441D u prisustvu ćelija koje eksprimiraju BCMA sa EC50 opsega od 0,61 nM do 2,1 nM i S:N opsega od 8 do 123. mAb25442D je aktivirao Jurkat/NFATLuc ćelije u prisustvu ćelija koje eksprimiraju BCMA sa EC50 opsega od 2,6 nM do 11 nM i S:N opsega od 7 do 120. BCMA x CD3 bispecifično mAb25441D sa krakom vezivanja za CD3 sa visokim afinitetom bilo je dosledno potentnije od mAb25442D sa krakom koji se vezuje za CD3 sa nižim afinitetom; dok je S:N bio sličan za dve bispecifičnosti. Nijedno antitelo nije aktiviralo Jurkat/NFATLuc ćelije u prisustvu HEK293 ćelija, a kontrolna bispecifična antitela nisu značajno povećala aktivnost Jurkat reportera ni sa jednom od ispitivanih ćelijskih linija. Rezultati su prikazani ispod, u Tabelama 14A i 14B.

Tabela 14A: Aktivacija T-ćelija

Tabela 14B: Aktivacija T-ćelija

Primer 8: Test citotoksičnosti zasnovan na FACS analizi za procenu ubijanja posredovanog T-ćelijama za ćelije multiplog mijeloma koje eksprimiraju BCMA u prisustvu anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnih antitela

[0136] Kapacitet vezivanja antitela (ABC) komercijalno dostupnog anti-humanog BCMA antitela (klon 19F2) određivan je na panelu ćelijskih linija multiplog mijeloma upotrebom Quantum Simply ćelijskog antihumanog IgG kompleta, praćenjem uputstva proizvođača (Bangs Laboratories).

[0137] Ukratko, ćelijske linije multiplog mijeloma (MM) (H929, MM1S, U266, MOLP8 i RPMI8226) i zrnca Quantum Simply ćelijskog kompleta inkubirani su tokom 30 minuta na 4°C uz titraciju anti-hBCMA-19F2 antitela konjugovanog sa APC. Nakon inkubacije, ćelije i zrnca su isprani tri puta, nakon čega su resuspendovani u 200 µL hladnog PBS-a koji je sadržavao 1% profiltriranog FBS i analizirani su protočnom citometrijom. Upotrebom QuickCal® matrice (Bangs Labs), ABC nivoa zasićenja anti-BCMA 19F2 za svaku ćelijsku liniju je interpolisan iz standardne krive generisane na osnovu intenziteta kanala za populacije zrnaca pri zasićenju.

[0138] Ubijanje cilјnih ćelija koje eksprimiraju BCMA sa mirujućim humanim ili T-ćelijama cinomolgus majmuna utvrđivano je protočnom citometrijom. Ukratko, humane ili mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) cinomolgus majmuna zasejavane su u obogaćen RPMI (za humane) ili X-Vivo (za cyno) medijum, u gustini od 1×10<6>ćelija/mL, nakon čega su ćelije inkubirane preko noći na 37°C, da bi se obogatili limfociti putem uklanjanja adherentnih makrofaga, dendritičnih ćelija i pojedinih monocita. Sledećeg dana, cilјne ćelije koje eksprimiraju BCMA su obeležavane sa 1 uM Violet CellTrace reagensom, nakon čega su koinkubirane sa PBMC iz kojih su bile uklonjene adherentne ćelije (odnos efektorska/cilјna ćelija od 4:1) i serijskim razblaživanjem BCMAxCD3 bispecifičnih ili kontrolnih antitela na 37°C. Nakon 48-72 sata, ćelije su uklanjane iz ploča za ćelijsku kulturu, pa su bojene koktelom antitela za fenotipizaciju i bojom za vijabilnost živih/mrtvih ćelija i analizirane su upotrebom FACS. Da bi se kvantifikovao broj živih cilјnih ćelija prisutnih u bunarićima, po 20 μl CountBright absolute zrnaca za brojanje dodavano je u bunariće neposredno pre snimanja. Za procenu specifičnosti ubijanja, ćelije su gejtovane u odnosu na populaciju obeleženu sa Violet ćelijskim obeleživačem za praćenje. Procenat preživlјavanja cilјnih ćelija izračunavan je na sledeći način: Preživljavanje ciljnih ćelija = (R1/R2)*100, gde je R1= apsolutan broj živih cilјnih ćelija u prisustvu efektorskih ćelija i antitela, a R2= samo broj živih cilјnih ćelija (kultivisanih bez efektorskih ćelija ili ispitivanog antitela). ;[0139] Humane CD8+ T-ćelije su gejtovane kao CD45+/CD14-/CD4-/CD8+. CD8+ T-ćelije cinomolgus majmuna su gejtovane kao CD45+/CD20-/CD14-/CD4-/CD8+ T-ćelijska aktivacija je prijavljena u vidu procenta CD25+ ili CD69+ T-ćelija u odnosu na ukupan broj CD8+ T-ćelija. ;;[0140] Vrednosti EC50 za preživlјavanje cilјnih ćelija i aktivaciju T-ćelija su izračunavane upotrebom 4-parametarske nelinearne regresione analize u softveru Prism. ;;[0141] Anti-BCMA x anti-CD3 bispecifična antitela su ispitivana u pogledu njihove sposobnosti da aktiviraju mirujuće humane i T-ćelije cinomolgus majmuna da ubiju panel ćelija koje eksprimiraju BCMA sa različitim površinskim nivoima BCMA. Sa mirujućim humanim T-ćelijama kao efektorskim ćelijama, REGN5458 je posredovao u ubijanju 5 različitih BCMA ćelijskih linija sa EC50vrednostima opsega od 7,07×10<-10>M do 3,45×10<-11>M. REGN5459 je pokazao ubijanje istih 5 ćelijskih linija sa vrednostima EC50 opsega od 1,66×10<-9>M do 1,06×10<-10>M. EC50 za aktivaciju T-ćelija, merene porastom CD25 na CD8+ T-ćelijama, bile su slične EC50 vrednostima ubijanja. Umerena aktivacija T-ćelija je uočena u prisustvu CD3 izotipskog kontrolnog mAb17664D sa 1 krakom, ali samo kod U266 ćelijske linije. U slučaju ispitivanih izotipskih kontrola, citotoksičnost nije uočena. ;;[0142] Ubijanje od strane T-ćelija cinomolgus majmuna posredovano sa BCMAxCD3 je ispitivano samo na MM ćelijskoj liniji H929. EC50za citotoksičnost posredovanu sa REGN5458 i REGN5459 iznosili su 2,34×10<-11>i 6,92×10<-11>, tim redom. Nije uočena citotoksičnost ili aktivacija T-ćelija za izotipsko kontrolno antitelo mAb15260, niti sa humanim niti sa efektorskim ćelijama cinomolgus majmuna. Rezultati su prikazani ispod, u Tabelama 15A, 15B i 16. ;;Tabela 15A: Medijana EC50, humane efektorske ćelije ;; ;;; Tabela 15B: Medijana EC50, humane efektorske ćelije ;;; ;;; Tabela 16: Medijana EC50, efektorske ćelije cinomolgus majmuna ; ;;; Primer 9: FACS test citotoksičnosti za procenu ubijanja primarnih blast ćelija multiplog mijeloma posredovano autolognim T-ćelijama u prisustvu anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnih antitela ;[0143] Da bi se ispratilo specifično ubijanje ćelija multiplog mijeloma protočnom citometrijom, mononuklearne ćelije kosne srži (BMMC) pacijenata sa multiplim mijelomom su zasejavane na humane stromalne ćelije (HS5) i ostavljane da miruju preko noći na 37C. Odvojeno, mononuklearne ćelije periferne krvi iz istih pacijenta (PBMC) odmrzavane su i gajene u kulturi u obogaćenom RPMI medijumu u gustini od ×10<6>ćelija/mL, preko noći na 37°C, da bi se obogatili limfociti uklanjanjem adherentnih ćelija. Sledećeg dana, BMMC su ko-inkubirane sa naivnim PBMC iz kojih su bile uklonjene adherentne ćelije gajenjem na stromalnim ćelijama (HS5), nakon čega su dodata serijska razblaženja od 10 puta BCMAxCD3 bispecifičnog antitela ili CD3 izotipske kontrole sa 1 krakom (početna koncentracija 66,7nM) na 37°C. Ćelije su nakon 3, 4 ili 7 dana uklanjane sa ploča za ćelijsku kulturu i analizirane su upotrebom FACS. Za procenu specifičnosti ubijanja, ćelije multiplog mijeloma su gejtovane kao pojedinačne, žive, CD90 negativne (da bi se isklјučile stromalne ćelije), CD2 negativne, CD56 pozitivne. CD45 je bio nizak u ćelijama multiplog mijeloma u većini uzoraka, osim MM455. Procenat živih cilјnih ćelija je beležen, da bi se izračunalo prilagođeno preživlјavanje na sledeći način: Prilagođeno preživlјavanje = (R1/R2)*100, gde je R1= % živih cilјnih ćelija u prisustvu antitela, i R2 = % živih cilјnih ćelija u odsustvu ispitivanog antitela.

[0144] T-ćelije su gejtovane kao CD2 pozitivne, CD56 negativne i bilo CD4 ili CD8 pozitivne. Aktivacija T-ćelija je beležena kao procenat CD25+ CD4 ili CD8 T-ćelija u odnosu na ukupne CD4 ili CD8 T-ćelije.

[0145] Bispecifična antitela BCMAxCD3 su ispitivana u pogledu njihove sposobnosti da preusmere ubijanje primarnih blast ćelija multiplog mijeloma od strane autolognih donorskih PBMC. Maksimalna citotoksičnost posredovana sa BCMAxCD3 za primarne blast ćelije MM bila je opsega od 52-96%, sa EC50 opsega od 9,89×10<-11>M do 3,67×10<-9>M za REGN5458 i 4,96×10<-10>M do 7,94×10<-8>M za REGN5459. Aktivacija T-ćelija je merena procenom porasta ekspresije CD25 na CD8+ T-ćelijama. EC50 aktivacije T-ćelija bio je opsega od 3,23×10<-9>do 1,69×10<-1>°. Umerena citotoksičnost i aktivacija T-ćelija uočeni su za CD3 izotipsku kontrolu sa 1 krakom (bez vezivanja za ciljni molekul). Rezultati su prikazani ispod, u Tabelama 17A i 17B.

Tabela 17A: % lize MM

Tabela 17B: EC50 lize MM i aktivacija T-ćelija

Primer 10: Anti-BCMA x Anti-CD3 bispecifična antitela sprečavaju rast tumora koji eksprimiraju BCMA (NCI-H929) in vivo u ksenogenom tumorskom modelu

[0146] Da bi se utvrdila in vivo efikasnost BCMAxCD3 bispecifičnih antitela (At), sprovedena je studija sa ksenogenim tumorima. Imunodeficijentnim NOD.Cg-Prkdc<scid>II2rg<tm1wjl>/SzJ (NSG) miševima subkutano je implantirana smeša 10×10<6>NCI-H929 ćelija multiplog mijeloma koje eksprimiraju BCMA i 0,5×10<6>humanih mononuklearnih ćelije periferne krvi (PBMC) koje su bile izolovane iz normalnog donora. Miševima (n=7 po grupi) odmah su dati i PBS kao kontrola sa nosačem, irelevantno anti-FelD1 bivalentno izotipsko kontrolno At (REGN2759), kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (mAb17664D), BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At ili BCMAxCD3 (G20; REGN5459) bispecifično At u dozi od 4 mg/kg. Miševima su nadalje davana At dva puta nedeljno, tokom ukupno tri nedelјe, a rast tumora je procenjivan tokom 40 dana. Dok su BCMA<+>tumori rasli na sličan način kod miševa tretiranih sa nosačem, izotipskom kontrolom i kontrolom koja se vezuje za CD3, oba BCMAxCD3 At koja su ispitivana, sprečila su rast tumora in vivo.

[0147] Implantacija i merenje singenih tumora: NSG miševima subkutano je implantirana smeša 10 × 10<6>NCI-H929 ćelija multiplog mijeloma koje eksprimiraju BCMA i 0,5×10<6>PBMC dobijenih iz normalnog donora. Miševima (n=7 po grupi) odmah su dati PBS kao kontrola sa nosačem, irelevantno anti-FelD1 bivalentno izotipsko kontrolno At (REGN2759), kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (mAb17664D), BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At ili BCMAxCD3 (G20; REGN5459) bispecifično At u dozi od 4 mg/kg. Miševima su nadalje davana At dva puta nedeljno, tokom ukupno tri nedelјe. Rast tumora je meren kaliperom dva puta nedelјno tokom trajanja eksperimenta. Miševi su žrtvovani 40 dana nakon implantacije tumora.

[0148] Izračunavanje rasta i inhibicije singenog tumora: Za određivanje zapremine tumora kaliperom za spoljašnju upotrebu, određivani su najveći uzdužni prečnik (dužina u mm) i najveći poprečni prečnik (širina u mm). Zapremine tumora zasnovane na merenju kaliperom, izračunavane su po formuli: Zapremina (mm<3>) = (dužina x širina<2>)/2.

[0149] Bispecifična BCMAxCD3 At su sprečila rast BCMA<+>NCI-H929 tumori in vivo u modelu ksenogenog tumora. Rezultati su prikazani ispod, u Tabeli 18.

Tabela 18: Prosečna veličina tumora u raznim vremenskim tačkama

Primer 11: Anti-BCMA x Anti-CD3 bispecifična antitela sprečavaju rast tumora koji eksprimiraju BCMA (NCI-H929) na način koji je zavisan od doze u ksenogenom in vivo tumorskom modelu

[0150] Da bi se utvrdila in vivo efikasnost anti-BCMA x anti-CD3 bispecifičnih antitela (At), sprovedena je studija sa ksenogenim tumorima. Imunodeficijentnim NOD.Cg-Prkdc<scid>II2rg<tm1wjl>/SzJ (NSG) miševima subkutano je implantirana smeša 10×10<6>NCI-H929 ćelija humanog multiplog mijeloma koje eksprimiraju BCMA i 0,5×10<6>humanih mononuklearnih ćelije periferne krvi (PBMC) koje su bile izolovane iz zdravog, normalnog donora. Miševima (n=7 po grupi) odmah su dati i PBS kao kontrola sa nosačem, kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G; mAb17664D) u dozi od 4 mg/kg, kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G20; REGN4460) u dozi od 4 mg/kg, BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At u dozama od bilo 4 mg/kg, 0,4 mg/kg ili 0,04 mg/kg, ili BCMAxCD3 (G20; REGN5459) bispecifično At u dozama od bilo 4 mg/kg, 0,4 mg/kg ili 0,04 mg/kg. Miševima su ova At davana dva puta nedelјno, u ukupno sedam doza, a rast tumora je procenjenivan tokom 60 dana. Dok su BCMA<+>NCI-H929 tumori rasli na sličan način kod miševa tretiranih sa nosačem i kod miševa tretiranih kontrolnim At koje vezuje CD3, oba anti-BCMA x anti-CD3 At koja su ispitivana, sprečila su rast tumora in vivo na način koji je bio zavisan od doze.

[0151] Implantacija i merenje ksenogenih tumora: NSG miševima subkutano je implantirana smeša 10 × 10<6>NCI-H929 ćelija multiplog mijeloma koje eksprimiraju BCMA i 0,5×10<6>PBMC dobijenih iz normalnog, zdravog donora. Miševima (n=7 po grupi) odmah su dati i PBS kao kontrola sa nosačem, kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G; mAb17664D), kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G20; REGN4460), BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At, ili BCMAxCD3 (G20; REGN5459) bispecifično At. mAb17664D i REGN4460 su davani u dozi od 4 mg/kg, dok su REGN5458 i REGN5459 davani u dozama od bilo 4 mg/kg, 0,4 mg/kg ili 0,04 mg/kg. Miševima su ova At davana dva puta nedelјno, u ukupno sedam doza. Rast tumora je meren kaliperom dva puta nedelјno tokom trajanja eksperimenta.

[0152] Izračunavanje rasta i inhibicije ksenogenog tumora: Za određivanje zapremine tumora kaliperom za spoljašnju upotrebu, određivani su najveći uzdužni prečnik (dužina u mm) i najveći poprečni prečnik (širina u mm). Zapremine tumora zasnovane na merenjima kaliperom, izračunavane su po formuli: Zapremina (mm<3>) = (dužina x širina<2>)/2.

[0153] Bispecifična BCMAxCD3 At su sprečila rast BCMA<+>NCI-H929 tumori na način koji je zavisan od doze u ovom ksenogenom in vivo tumorskom modelu. Rezultati su prikazani ispod, u Tabeli 19, i ilustrovani na Slikama 1 i 2.

Tabela 19: Prosečna veličina tumora u raznim vremenskim tačkama

Primer 12: Anti-BCMA × Anti-CD3 bispecifična antitela smanjuju veličinu i sprečavaju rast uspostavljenih tumora koji eksprimiraju BCMA (NCI-H929) na način koji je zavisan od doze u ksenogenom in vivo tumorskom modelu

[0154] Da bi se utvrdila in vivo efikasnost anti-BCMA × anti-CD3 bispecifičnih antitela (At), sprovedena je studija sa ksenogenim tumorima. Imunodeficijentnim NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1wjl>/SzJ (NSG) miševima subkutano je implantirana smeša 10×10<6>NCI-H929 tumorskih ćelija humanog multiplog mijeloma koje eksprimiraju BCMA i 0,5×10<6>humanih mononuklearnih ćelije periferne krvi (PBMC) koje su bile izolovane iz normalnog, zdravog donora. Tumori su ostavlјeni da rastu i uspostave se tokom 5 dana, dok nisu dostigli veličinu od približno 70 mm<3>. Petog dana, miševima (n=7-8 po grupi) su zatim dati i PBS kao kontrola sa nosačem, kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G; mAb17664D) u dozi od 4 mg/kg, kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G20; REGN4460) u dozi od 4 mg/kg, BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At u dozama od bilo 4 mg/kg, 0,4 mg/kg ili 0,04 mg/kg, ili BCMAxCD3 (G20; REGN5459) bispecifično At u dozama od bilo 4 mg/kg, 0,4 mg/kg ili 0,04 mg/kg. Miševima su ova At davana dva puta nedeljno u ukupno sedam doza, a rast tumora je procenjivan tokom 55 dana. Dok su BCMA<+>NCI-H929 tumori rasli na sličan način kod miševa tretiranih sa nosačem i kontrolnim At koje vezuje CD3, oba BCMAxCD3 At koja su ispitivana smanjila su uspostavljene tumore i sprečila rast tumora in vivo na način koji je zavisan od doze.

[0155] Implantacija i merenje ksenogenih tumora: NSG miševima subkutano je implantirana smeša 10 × 10<6>NCI-H929 ćelija multiplog mijeloma koje eksprimiraju BCMA i 0,5×10<6>PBMC dobijenih iz normalnog, zdravog donora. Tumori su ostavlјeni da rastu i uspostave se tokom 5 dana, dok nisu dostigli veličinu od približno 70 mm<3>. Petog dana, miševima (n=7-8 po grupi) zatim su dati i PBS kao kontrola sa nosačem, kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G; mAb17664D), kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G20; REGN4460), BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At, ili BCMAxCD3 (G20; REGN5459) bispecifično At. mAb17664D i REGN4460 su davani u dozi od 4 mg/kg, dok su REGN5458 i REGN5459 davani u dozama od bilo 4 mg/kg, 0,4 mg/kg ili 0,04 mg/kg. Miševima su ova At davana dva puta nedelјno, u ukupno sedam doza. Rast tumora je meren kaliperom dva puta nedelјno tokom trajanja eksperimenta.

[0156] Izračunavanje rasta i inhibicije ksenogenog tumora: Za određivanje zapremine tumora kaliperom za spoljašnju upotrebu, određivani su najveći uzdužni prečnik (dužina u mm) i najveći poprečni prečnik (širina u mm). Zapremine tumora zasnovane na merenju kaliperom, izračunavane su po formuli: Zapremina (mm<3>) = (dužina × širina<2>)/2.

[0157] Anti-BCMA × anti-CD3 bispecifična antitela smanjila su veličinu i sprečila rast uspostavlјenog BCMA<+>NCI-H929 tumora na način koji je zavisan od doze u ovom ksenogenom in vivo tumorskom modelu. Rezultati su prikazani ispod, u Tabeli 20, i ilustrovani su na Slikama 3 i 4.

Tabela 20: Prosečna veličina tumora u raznim vremenskim tačkama

Primer 13: Anti-BCMA × anti-CD3 bispecifična antitela sprečavaju rast tumora koji eksprimiraju BCMA (MOLP-8) na način koji je zavisan od doze u ksenogenom in vivo tumorskom modelu

[0158] Da bi se utvrdila in vivo efikasnost anti-BCMA × anti-CD3 bispecifičnih antitela (At), sprovedena je studija sa ksenogenim tumorima. Imunodeficijentnim NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1wjl>/SzJ (NSG) miševima subkutano je implantirana smeša 5×10<6>MOLP-8 tumorskih ćelija humanog multiplog mijeloma i 1×10<6>humanih mononuklearnih ćelije periferne krvi (PBMC) koje su bile izolovane iz normalnog, zdravog donora. Miševima (n=7 po grupi) odmah su zatim dati i PBS kao kontrola sa nosačem, kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G; mAb17664D) u dozi od 4 mg/kg, kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G20; REGN4460 ) u dozi od 4 mg/kg, BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At u dozama od bilo 4 mg/kg, 0,4 mg/kg ili 0,04 mg/kg, ili BCMAxCD3 (G20; REGN5459) bispecifično At u dozama od bilo 4 mg/kg, 0,4 mg/kg ili 0,04 mg/kg. Miševima su ova At davana dva puta nedeljno u ukupno sedam doza, a rast tumora je procenjivan tokom 56 dana. Dok su BCMA<+>MOLP-8 tumori rasli na sličan način kod miševa koji su tretiranih sa nosačem i kontrolnim At koje vezuje CD3, oba BCMAxCD3 At koja su ispitivana sprečila su rast tumora in vivo na način koji je zavisan od doze.

[0159] Implantacija i merenje ksenogenih tumora: NSG miševima subkutano je implantirana smeša 5 × 10<6>MOLP-8 ćelija multiplog mijeloma koje eksprimiraju BCMA i 1×10<6>PBMC dobijenih iz normalnog, zdravog donora. Miševima (n=7 po grupi) odmah su dati i PBS kao kontrola sa nosačem, kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G; mAb17664D), kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G20; REGN4460), BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At, ili BCMAxCD3 (G20; REGN5459) bispecifično At. mAb17664D i REGN4460 su davani u dozi od 4 mg/kg, dok su REGN5458 i REGN5459 davani u dozama od bilo 4 mg/kg, 0,4 mg/kg ili 0,04 mg/kg. Miševima su ova At davana dva puta nedelјno, u ukupno sedam doza. Rast tumora je meren kaliperom dva puta nedelјno tokom trajanja eksperimenta.

[0160] Izračunavanje rasta i inhibicije ksenogenog tumora: Za određivanje zapremine tumora kaliperom za spoljašnju upotrebu, određivani su najveći uzdužni prečnik (dužina u mm) i najveći poprečni prečnik (širina u mm). Zapremine tumora zasnovane na merenju kaliperom, izračunavane su po formuli: Zapremina (mm<3>) = (dužina × širina<2>)/2.

[0161] Anti-BCMA × anti-CD3 bispecifična antitela sprečila su rast BCMA<+>MOLP-8 tumora na način koji je zavisan od doze u ovom ksenogenom in vivo tumorskom modelu. Rezultati su prikazani ispod, u Tabeli 21, i ilustrovani su na Slikama 5 i 6.

Tabela 21: Prosečna veličina tumora u raznim vremenskim tačkama

Primer 14: Anti-BCMA × anti-CD3 bispecifična antitela odlažu rast tumora koji eksprimiraju BCMA (MOLP-8) u ksenografnom in vivo tumorskom modelu

[0162] Da bi se utvrdila in vivo efikasnost anti-BCMA × anti-CD3 bispecifičnih antitela (At), sprovedena je studija sa ksenogenim tumorima. Dana -11, imunodeficijentnim NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1wjl>/SzJ (NSG) miševima intraperitonealno je injecirano 4 × 10<6>humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) iz normalnog, zdravog donora. Dana 0, miševima intravenski je injecirano 2×10<6>BCMA<+>MOLP-8 tumorskih ćelija humanog multiplog mijeloma koje su bile konstruisane tako da takođe eksprimiraju luciferazu svica (MOLP-8-luciferazne ćelije). Miševima (n=5 po grupi) odmah zatim su dati i kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G; mAb17664D) u dozi od 4 mg/kg ili BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At u dozi od 4 mg/kg. Miševima su ova At davana još dva puta, 3. i 7. dana, u ukupno tri doze. Rast tumora je procenjivan tokom 48 dana, merenjem bioluminiscencije tumora (BLI) u anesteziranim životinjama Kao pozitivnoj kontroli, grupi miševa (n=5) date su samo MOLP-8-luciferazne ćelije, ali ne i PBMC ili antitelo. Da bi se izmerili pozadinski nivoi BLI, grupa miševa (n=5) nije bila tretirana i nije primala tumore, PBMC ili antitela. Dok su BCMA<+>MOLP-8-luciferazni tumori progresivno rasli kod miševa koji su bili tretirani kontrolnim At koje vezuje CD3, tretman sa BCMAxCD3 At tipa REGN5458 je odložio rast tumora in vivo.

[0163] Implantacija i merenje ksenogenih tumora: Na dan -11, imunodeficijentnim NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1wjl>/SzJ (NSG) miševima intraperitonealno je injecirano 5 × 10<6>humani PBMC iz normalnog, zdravog donora. Dana 0, miševima intravenski je injecirano 2×10<6>BCMA<+>MOLP-8-luciferaznih ćelija. Miševima (n=5 po grupi) odmah zatim su dati i kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G; mAb17664D) u dozi od 4 mg/kg ili BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At u dozi od 4 mg/kg. Miševima su ova At davana još dva puta, 3. i 7. dana, u ukupno tri doze. Rast tumora je procenjivan tokom 48 dana, merenjem tumorskog BLI u anesteziranim životinjama Kao pozitivnoj kontroli, grupi miševa (n=5) date su samo MOLP-8-luciferazne ćelije, ali ne i PBMC ili antitelo. Da bi se izmerili pozadinski nivoi BLI, grupa miševa (n=5) nije bila tretirana i nije primala tumore, PBMC ili antitela.

[0164] Merenje rasta ksenogenog tumora: BLI snimanje je upotrebljavano za merenje opterećenja tumorom. Miševima je IP injecirano 150 mg/kg luciferaznog supstrata D-luciferina koji je bio resuspendovan u PBS-u. Pet minuta nakon ovog injeciranja, snimanje BLI miševa vršeno je pod izofluranskom anestezijom upotrebom Xenogen IVIS sistema. Snimanje slika je obavlјano sa vidnim polјem podešenim na D, visinom subjekta od 1,5 cm i srednjim nivoom bininga sa automatskim vremenom ekspozicije koje je odredio softver Living Image. BLI signali su i ekstrahovani upotrebom softvera Living Image: regioni od interesa su opcrtavani oko svake tumorske mase i intenzitet fotona je zabeležen kao p/s/cm2/sr.

[0165] Anti-BCMA × anti-CD3 bispecifično antitelo REGN5458 odložilo je rast BCMA<+>MOLP-8-luciferaznih tumora u ovom ksenogenom tumorskom modelu in vivo. Rezultati su prikazani ispod, u Tabeli 22.

Tabela 22: Prosečna veličina tumora (prema radijanciji) u raznim vremenskim tačkama

Primer 15: Anti-BCMA × Anti-CD3 bispecifična antitela smanjuju opterećenje tumorom (OPM-2) na nivo pozadine in vivo

[0166] Da bi se utvrdila in vivo efikasnost anti-BCMA × anti-CD3 bispecifičnih antitela (At), sprovedena je studija sa ksenogenim tumorima. Dana 0, imunodeficijentnim NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1wjl>/SzJ (NSG) miševima intravenski je injecirano 2×10<6>BCMA<+>OPM-2 tumorskih ćelija humanog multiplog mijeloma koje su bile konstruisane tako da takođe eksprimiraju luciferazu svica (OPM-2-luciferazne ćelije). Desetog dana, miševima je intraperitonealno injecirano 4 × 10<6>humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) iz normalnog, zdravog donora. Dana 21, miševima (n=5 po grupi) su dati kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G; mAb17664D) u dozi od 0,4 mg/kg, BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At u dozi od 0,4 mg/kg ili BCMAxCD3 (G20; REGN5459) bispecifično At u dozi od 0,4 mg/kg. Miševima su ova At davana još dva puta, 25. i 28. dana, u ukupno tri doze. Rast tumora je procenjivan do 61. Dana, merenjem bioluminiscencije tumora (BLI) u anesteziranim životinjama. Kao pozitivnoj kontroli, grupi miševa (n=5) date su samo OPM-2-luciferazne ćelije, ali ne i PBMC ili antitelo. Da bi se izmerili nivoi BLI u pozadini, grupa miševa (n=5) nije bila tretirana i nije primala tumore, PBMC ili antitela. Dok su BCMA<+>OPM-2-luciferazni tumori progresivno rasli kod miševa koji su tretirani kontrolnim antitelom koje vezuje CD3, tretman sa BCMAxCD3 At, i REGN5458 i REGN5459, smanjio je opterećenje tumorom na nivo pozadine kod većine životinja.

[0167] Implantacija i merenje ksenogenih tumora: Dana 0, imunodeficijentnim NOD.Cg-PrkdC<scid>Il2rg<tm1wjl>/SzJ (NSG) miševima intravenski je injecirano 2×10<6>BCMA<+>OPM-2 tumorskih ćelija humanog multiplog mijeloma koje su bile konstruisane tako da takođe eksprimiraju luciferazu svica (OPM-2-luciferazne ćelije). Desetog dana, miševima je intraperitonealno injecirano 4×10<6>humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) iz normalnog, zdravog donora. Dana 21, miševima (n=5 po grupi) su dati i kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G; mAb17664D) u dozi od 0,4 mg/kg, BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At u dozi od 0,4 mg/kg ili BCMAxCD3 (G20; REGN5459) bispecifično At u dozi od 0,4 mg/kg. Miševima su ova At davana još dva puta, 25. i 28. dana, u ukupno tri doze. Rast tumora je procenjivan do 61. Dana, merenjem bioluminiscencije tumora (BLI) u anesteziranim životinjama. Kao pozitivnoj kontroli, grupi miševa (n=5) su date samo OPM-2-luciferazne ćelije, ali ne i PBMC ili antitela. Da bi se izmerili nivoi BLI pozadine, grupa miševa (n=5) nije bila tretirana i nije primala tumore, PBMC ili antitela.

[0168] Merenje ksenogenog rasta tumora: BLI snimanje je upotrebljavano za merenje opterećenja tumorom. Miševima je IP injecirano 150 mg/kg luciferaznog supstrata D-luciferina koji je bio resuspendovan u PBS-u. Pet minuta nakon ovog injeciranja, snimanje BLI miševa vršeno je pod izofluranskom anestezijom upotrebom Xenogen IVIS sistema. Snimanje slika je obavlјano sa vidnim polјem podešenim na D, visinom subjekta od 1,5 cm i srednjim nivoom bininga sa automatskim vremenom ekspozicije koje je odredio softver Living Image. BLI signali su i ekstrahovani upotrebom softvera Living Image: regioni od interesa su opcrtavani oko svake tumorske mase i intenzitet fotona je zabeležen kao p/s/cm2/sr.

[0169] Dok su BCMA<+>OPM-2-luciferazni tumori progresivno rasli kod miševa koji su bili tretirani kontrolom koja vezuje CD3, tretman sa BCMAxCD3 At, i REGN5458 i REGN5459, smanjio je opterećenje tumorom na nivo pozadine kod većine životinja. Rezultati su prikazani ispod, u Tabeli 23, i ilustrovani su na Slici 7.

Tabela 23: Prosečna veličina tumora (prema radijanciji) u raznim vremenskim tačkama

Primer 16: BCMA×CD3 bispecifična antitela suzbijaju rast singenih tumora in vivo na način koji je zavisan od doze

[0170] Da bi se utvrdila in vivo efikasnost anti-BCMA × anti-CD3 bispecifičnih antitela (At), sprovedena je studija singenih tumora kod miševa koji eksprimiraju humani CD3. C57BL/6 miševima koji eksprimiraju humani CD3deg umesto mišjeg CD3deg (CD3-humanizovani miševi) subkutano je implantirano bilo 0,5×10<6>B16 ćelija melanoma koje su bile genetički izmenjene tako da eksprimiraju humani BCMA pune dužine (B16/BCMA ćelije) ili 1×10<6>MC38 ćelija karcinoma debelog creva koje su bile genetički izmenjene tako da eksprimiraju humani BCMA pune dužine (MC38/BCMA). Miševima (n=7 po grupi) odmah zatim su dati i kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G; mAb17664D) u dozi od 0,4 mg/kg ili BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At u dozama od bilo 0,4 mg/kg ili 0,04 mg/kg. Miševima su ova At davana još dva puta, 4. i 7. dana, u ukupno tri doze, a rast tumora je procenjivan tokom eksperimenta. Dok su B16/BCMA tumori i MC38/BCMA tumori rasli kod miševa koji su bili tretirani kontrolnom koja vezuje CD3, BCMAxCD3 REGN5458 je bio u stanju da potisne rast obe tumorske linije na način koji je bio zavisan od doze.

[0171] Implantacija i merenje singenih tumora: C57BL/6 miševima koji eksprimiraju humani CD3deg umesto mišjeg CD3deg (CD3-humanizovani miševi) subkutano je implantirano bilo 0,5×10<6>B16F10 ćelija melanoma koje su genetićki bile izmenjene tako da eksprimiraju humani BCMA pune dužine (B16/BCMA ćelije) ili 1×10<6>MC38 ćelije karcinoma debelog creva koje su genetićki bile izmenjene tako da eksprimiraju humani BCMA pune dužine (MC38/BCMA). Miševima (n=7 po grupi) odmah zatim su dati i kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G; mAb17664D) u dozi od 0,4 mg/kg ili BCMAxCD3 (G; REGN5458) bispecifično At u dozama od bilo 0,4 mg/kg ili 0,04 mg/kg. Miševima su ova At davana još dva puta, 4. i 7. Dana, u ukupno tri doze, a rast tumora je procenjivan tokom eksperimenta.

[0172] Izračunavanje rasta i inhibicije singenog tumora: Za određivanje zapremine tumora kaliperom za spoljašnju upotrebu, određivani su najveći uzdužni prečnik (dužina u mm) i najveći poprečni prečnik (širina u mm). Zapremine tumora zasnovane na merenju kaliperom, izračunavane su po formuli: Zapremina (mm<3>) = (dužina × širina<2>)/2.

[0173] Dok su B16/BCMA tumori i MC38/BCMA tumori rasli kod miševa koji su bili tretirani kontrolom koja vezuje CD3, BCMAxCD3 REGN5458 je bio u stanju da potisne rast obe tumorske linije na način koji je bio zavisan od doze. Rezultati su prikazani ispod, u Tabeli 24.

Tabela 24: Prosečna veličina tumora u raznim vremenskim tačkama

Primer 17: Mapiranje epitopa REGN5458 vezivanja za BCMA izmenom vodonik-deuterijum

[0174] Mapiranje epitopa H/D izmenom sa masenom spektrometrijom (HDX-MS) rađeno je da bi se odredili aminokiselinski ostaci BCMA (rekombinantnog humanog BCMA, aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 115) koji interaguju sa REGN5458 (BCMA × CD3 bispecifično antitelo). Opšti opis postupka H/D izmene naveden je u npr. Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; i Engen i Smit (2001) Anal. Chem.

73:256A-265A.

[0175] HDX-MS eksperimenti su izvođeni na integrisanoj HDX/MS platformi, koja se sastojala od HDX PAL sistema za obeležavanje deuterijumom i zaustavljanje reakcije kompanije Leaptec, Acquity M-Class sistema (za upravljanje pomoćnim rastvaračima) za digestiju i nanošenje uzoraka kompanije Waters, Acquity M-Class sistema (µBinary za upravljanje rastvaračima) za analitički gradijent kompanije Waters i Q Exactive HF masenog spektrometra za merenja mase peptida kompanije Thermo.

[0176] Rastvor za obeležavanje je pripreman kao PBS pufer u D2O na pD 7,0 (10 mM fosfatni pufer, 140 mM NaCl i 3 mM KCI, ekvivalentno pH 7,4 na 25°C). Za obeležavanje deuterijumom, 10 µL hBCMA.hFc (REGN2746, 54,5 µM; SEQ ID NO: 120 ili hBCMA.hFc prethodno pomešanog sa REGN5458 u molarnom odnosu od 1:2 (Ag-At kompleks) inkubirano je na 20°C sa 90 µL D2O rastvorom za obeležavanje tokom raznih vremenskih tačaka u duplikatima (npr. kontrola bez deuterijum = 0 sekundi; obeležavanje deuterijumom 5 minuta i 10 minuta). Reakcija deuterizacije je zaustavljana dodavanjem 100 µL prethodno ohlađenog pufera za zaustavljanje reakcije (0,5 M TCEP-HCl, 8 M urea i 1% mravlјe kiseline) u svaki uzorak tokom inkubacije na 20 °C od 5 minuta. Uzorak nakon zaustavljanja reakcije zatim je injeciran na HDX sistem za upravljanje kompanije Waters radi digesije pepsinom/proteazom XIII u realnom vremenu. Peptidi dobijeni digestijom su razdvajani C8 kolonom (1,0 mm × 50 mm, NovaBioassays) sa gradijentom od 10%-32% B (mobilna faza A: 0,5% mravlјe kiseline u vodi, mobilna faza B: 0,1% mravlјe kiseline kiselina u acetonitrilu) od 13 minuta. Eluirani peptidi su analizirani QExactive HF masenom spektrometrijom u LC-MS/MS ili LC-MS režimu rada.

[0177] LC-MS/MS podaci BCMA uzorka koji nije bio deuterizovan, poređeni su sa bazom koja je uključivala BCMA i njegovu nasumičnu sekvencu, upotrebom Byonic pretraživača (Protein Metrics). Parametri pretrage (u ELN) su postavlјani kao podrazumevani upotrebom nespecifične enzimske digestije i humane glikozilacije kao uobičajene promenlјive modifikacije. Lista identifikovanih peptida je zatim uvođena u HDX Workbench softver (verzija 3.3) da bi se izračunalo preuzimanje deuterijuma za svaki peptid detektovan LC-MS postupkom iz svih deuterizovanih uzoraka. Za dati peptid, centroidna masa (intenzitet - prosečna ponderisana masa) u svakoj vremenskoj tački upotrebljavana je za izračunavanje preuzimanja deuterijuma (D) i procenta preuzimanja deuterijuma (%D):

[0178] Ukupno 8 peptida iz hBCMA.hFc je identifikovano i iz hBCMA.hFc samog i hBCMA.hFc u kompleksu sa uzorcima REGN5458, što predstavlјa 100% pokrivenost sekvence hBCMA. Prosečna standardna devijacija (SD) svih peptida je procenjena na 1,4% (detalјna izračunavanja su definisana u ELN i Paskalima, BD i saradnici (2012) Journal of the American Society for Mass Spectrometry 23(9):1512-1521). Prema tome, svaki peptid koji je ispoljio diferencijalni procenat vrednosti D-preuzimanja iznad 4,2% (3-struk u odnosu na prosečan SD) definisan je kao značajno zaštićen. Za hBCMA.hFc, peptidi koji odgovaraju aminokiselinskim sekvencama 1-43 SEQ ID NO: 106 (MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNA; SEQ ID NO: 121) bili su značajno zaštićeni sa REGN5458. Zaštita ovih ostataka sa REGN5458 je potvrđivana upotrebom hBCMA.mmH (REGN2744, aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 106).

Tabela 25: Selektovani BCMA.hFc peptidi sa značajnom zaštitom nakon vezivanja za REGN5458

Primer 18: FACS test vezivanja BCMAxCD3 bispecifičnih antitela i dodatnih BCMA antitela za ćelijske linije multiplih mijeloma nakon inkubacije preko noći sa anti-BCMA antitelima

[0179] Protočna citometrijska analiza je korišćena za određivanje uticaja inkubacije preko noći ćelijskih linija multiplog mijeloma sa anti-BCMA antitelima na nivo površinskog BCMA. MM ćelijske linije (H929, Molp8, U266 i MM1.S) bile su isprane dva puta i kultivisane na 37°C u R10 medijumu (RPMI+10% FBS+pen/strep/glut) koji je sadržavao 66,7 ili 667 nM anti-BCMA antitela, DAPT (inhibitor gama-sekretaze) ili samo medijum. Nakon 18 sati, bunariči su ispirani hladnim FACS puferom za ispiranje (PBS+1% profiltriranog FBS) i resuspendovani su u 667 nM istog anti-BCMA antitela u hladnom puferu za bojenje (Miltenyi 130-091-221) tokom 30 minuta na ledu. Nakon inkubacije, ćelije su dva puta isprane hladnim FACS puferom za ispiranje (PBS 1% profiltriranog FBS) i vezano antitelo je detektovano inkubiranjem sa odgovarajućim anti-humanim sekundarnim antitelom (anti-hlgG ili anti-HIS) na ledu tokom dodatnih 30-45 minuta. Nakon inkubacije, ćelije su ispirane, resuspendovane u 200 µL hladnog PBS-a koji je sadržavao 1% profiltriranog FBS i analizirane su protočnom citometrijom na BD FACS Canto II. Stepen porasta u obojenosti je izračunavan delјenjem MFI obojenih ćelija koje su prethodno inkubirane preko noći u BCMA At ili DAPT sa MFI obojenih ćelija koje su inkubirane preko noći samo u medijumu.

[0180] BCMA se brzo cepa sa površine ćelija dejstvom enzima gama-sekretaze. Inkubacija preko noći sa inhibitorima gama-sekretaze, kao što je DAPT, sprečava cepanje BCMA što dovodi do povećanja nivoa BCMA na ćelijskoj površini. Tabele 26-29 prikazuju stepen porasta u medijani intenziteta fluorescencije (MFI) BCMA na ćelijama inkubiranim preko noći u anti-BCMA antitelima ili DAPT u poređenju sa ćelijama inkubiranim samo u medijumu. Uočili samo da je inkubacija preko noći sa DAPT povećala nivoe BCMA koji su detektovani sa anti-BCMA antitelima (BCMAxCD3 bispecifično R5458, parentalno BCMA antitelo mAb15281 i druga domaća BCMA antitela) na H929, Molp8, U266 i MM.32, i to za 2,3-4 puta, 2,4-8,6 puta, 5,3-9,0 puta i 11,9 fold, tim redom.

[0181] Potrebno je napomenuti i da smo uočili da je inkubacija MM ćelijskih linija preko noći sa 66,7 ili 667 nM REGN5458 ili parentalnim bivalentnim anti-BCMA antitelom mAb21581 na sličan način rezultovala povećanim nivoima površinskog BCMA koje je detektovao FACS analizom, što ukazuje da vezivanje anti-BCMA antitela sprečava cepanje BCMA sa gama-sekretazom. Povećanja površinskog BCMA izazvana antitelom razlikovala su se u zavisnosti od ćelijske linije, sa većim stepenom povećanja na Molp8 i MM1S ćelijama u poređenju sa H929 ili U266. Fenomen nije bio ograničen na REGN5458, pošto je uočen i sa drugim domaćim BCMA antitelima.

Tabela 26: Stepen MFI promene kod ćelija inkubiranih samo u medijumu (NCI-H929)

Tabela 27: Stepen MFI promene kod ćelija inkubiranih samo u medijumu (Molp8)

Tabela 28: Stepen MFI promene kod ćelija inkubiranih samo u medijumu (U266)

Tabela 29: Stepen MFI promene kod ćelija inkubiranih samo u medijumu (MM1S)

Primer 19: Autologno ubijanje humanih i plazma ćelija cinomolgus majmuna posredovano T-ćelijama u prisustvu BCMAxCD3 bispecifičnih antitela

[0182] Specifično ubijanje obogaćenih CD138<+>humanih ili plazma ćelija cinomolgus majmuna sa nestimulisanim autolognim T-ćelijama je procenjivano protočnom citometrijom. Aspirati kosne srži i krvi čoveka ili cinomolgus majmuna bili su obezbeđeni u roku od 24 sata od uzorkovanja. CD138<+>plazma ćelije su obogaćivane iz kosne srži pozitivnom selekcijom, upotrebom EasySep humanog CD138<+>kompleta za pozitivnu selekciju, prema uputstvima proizvođača. PBMC iz pune krvi izolovane su razdvajanjem po gustini. PBMC su obeležavane sa 1 µM Vibrant CFDA-SE fluorescentne boje za praćenje. Nakon označavanja, 1×10<4>obogaćenih CD138<+>plazma ćelije zasejavano je u ploče sa 96 mesta okruglog dna u E:T odnosu od 10:1 sa Vibrant CFDA-SE obeleženim PBMC i serijskim razblaženjima REGN5458, kontrolnih bsAt koja vezuju CD3, ili kontrolnim mAt koja vezuju BCMA tokom 72 sata na 37°C, u kompletnom medijumu. Na kraju kultivisanja, preživele CD138<+>plazma ćelije su analizirane protočnom citometrijom, korišćenjem LIVE/DEAD boje za fiksiranje i markera ćelijske površine koji su specifični za plazma ćelije. Procenat vijabilnosti je normalizovan na kontrolne uslove (plazma ćelije samo u prisustvu PBMC). Aktivacija T-ćelija je procenjivana protočnom citometrijom. Aktivacija je prikazana kao procenat CD2<+>/CD4<+>ili CD2<+>/CD8<+>/CD16<->T-ćelija koje eksprimiraju CD25. Procenat aktivacije T-ćelija je normalizovan u odnosu na kontrolno stanje (plazma ćelije samo u prisustvu PBMC).

[0183] In vitro studijama je procenjivan efekat REGN5458 ili negativnih kontrola (kontrolna mAt koja vezuju BCMA ili kontrolna bsAb koja vezuju CD3) na aktivaciju primarnih humanih ili T-ćelija cinomolgus majmuna i citotoksičnost autolognih plazma ćelija. EC50vrednosti za citotoksičnost i procenat aktivacije T-ćelija za svakog donora su sumirane u Tabeli 30.

[0184] REGN5458 posredovana citotoksičnost primarnih humanih plazma ćelija iz donora 1 i 2 u prisustvu autolognih T-ćelija bila je zavisna od koncentracije, sa EC50vrednostima od 42,8 pM i 191 pM, tim redom, a rezultat je bio maksimalan procenat citotoksičnosti od 91% i 89%, tim redom. Paralelno, REGN5458 je posredovao u aktivaciji T-ćelija u prisustvu humanih plazma ćelija iz donora 1 i 2 na način zavisan od koncentracije sa EC50vrednostima od 214pM i 860pM za aktivaciju CD8<+>T-ćelija, tim redom, dok je maksimalan procenat aktivacije CD8<+>T-ćelija iznosio 2% i 36%, tim redom. Citotoksičnost plazma ćelija kod oba donora i povećana aktivacija CD8<+>T-ćelija samo kod donora 2 uočene su pri nanomolarnim koncentracijama kontrole koja vezuje CD3. Nije uočen efekat na citotoksičnost ili aktivaciju T-ćelija kod kontrole koja se vezuje za BCMA u bilo kojoj od ispitivanih koncentracija, ni kod jednog od donora.

[0185] REGN5458 je posredovao citotoksičnost primarnih cinomolgus plazma ćelija kod oba donora na način zavisan od koncentracije; EC50od 1,31 nM je izračunat za donora 1, međutim, EC50nije bilo moguće odrediti za donora 2. Kod oba donora, rezultat tretmana sa REGN5458 je bio povećana citotoksičnost plazma ćelija (maksimalni procenat citotoksičnosti od 94% i 91% za donore 1 i 2, tim redom). Paralelno, REGN5458 je posredovao u aktivaciji T-ćelija u prisustvu plazma ćelija cinomolgus majmuna kod donora 1 i 2 na način zavisan od koncentracije, sa EC50vrednostima od 28,1 nM i 18,1 nM za aktivaciju CD4<+>T-ćelija i 22,4 nM i 76,7 nM za aktivaciju CD8<+>T-ćelija, tim redom. Dobijeni maksimalni procenat aktivacije T-ćelija bio je 9% i 16% za CD4<+>T-ćelija i 12% i 17% za CD8<+>T-ćelije, za donore 1 i 2, tim redom.

[0186] Nije uočeno ubijanje cilјnih ćelija sa kontrolom koja vezuje BCMA pri bilo kojoj koncentraciji koja je ispitivana i niti u jednoj od ispitivanih ćelijskih linija. Određeno ubijanje cilјnih ćelija i aktivacija T-ćelija u prisustvu plazma ćelija iz donora 2 uočeno je sa kontrolom koja vezuje CD3 u nanomolarnim koncentracijama.

Tabela 30: EC50vrednosti za citotoksičnost i procenat aktivacije T-ćelija za svakog donora

Primer 20: Anti-BCMA × anti-CD3 bispecifična antitela deluju sinergistički sa anti-PD-1 antitelima da bi se pojačala anti-tumorska efikasnost in vivo

[0187] Da bi se utvrdilo da li BCMAxCD3 bispecifična antitela (At) sinergistički deluju sa blokadom PD-1, da bi se obezbedila superiorna anti-tumorska efikasnost in vivo, sprovedena je studija singenog tumora kod miševa koji eksprimiraju humani CD3. Rezultati pokazuju da kombinovanje REGN5458 sa blokiranjem PD-1 obezbeđuje superiornu anti-tumorsku efikasnost u odnosu bilo na REGN5458 ili blokiranje PD-1 samostalno.

[0188] Implantacija i merenje singenih tumora: C57BL/6 miševima koji eksprimiraju humani CD3deg umesto mišjeg CD3deg (CD3-humanizovani miševi) subkutano je implantirano 1×10<6>MC38 ćelija karcinoma debelog creva koje su bile genetički izmenjene tako da eksprimiraju humani BCMA pune dužine (MC38/BCMA). Tumori su ostavlјeni da se uspostave tokom 3 dana, kada su miševima (n= 6 ili 7 po grupi) dati i kontrolno bispecifično At koje vezuje CD3 (G; H4sH17664D) u dozi od 0,4 mg/kg ili BCMAxCD3 ( G REGN5458) bispecifično At u dozama od bilo 0,04 mg/kg ili 0,24 mg/kg; zajedno sa bilo surogat anti-mišjim PD-1 antitelom (klon RPM1-14) u dozi od 4 mg/kg ili izotipskim kontrolnim At (klon 2A3) u dozi od 4 mg/kg. Specifične grupe tretmana su prikazane ispod, u Tabeli 31.

Tabela 31: Grupe za tretiranje

[0189] Miševima su ova At davana još dva puta, 7. i 11. dana, u ukupno tri doze, a rast tumora je procenjivan tokom eksperimenta.

[0190] Izračunavanje rasta i inhibicije singenog tumora: Za određivanje zapremine tumora kaliperom za spoljašnju upotrebu, određivani su najveći uzdužni prečnik (dužina u mm) i najveći poprečni prečnik (širina u mm). Zapremine tumora zasnovane na merenju kaliperom, izračunavane su po formuli: Zapremina (mm<3>) = (dužina × širina<2>)/2.

[0191] Rezultati pokazuju da kombinovanje REGN5458 sa blokiranjem PD-1 obezbeđuje superiornu antitumorsku efikasnost u odnosu bilo na REGN5458 ili blokiranje PD-1 samostalno. Preciznije, rezultati pokazuju da je 24. dana (poslednjeg dana kada su prikuplјeni podaci za sve grupe tretmana) kombinacija BCMAxCD3 bispecifičnog antitela i anti-PD-1 antitela proizvela statistički značajan sinergistički terapijski efekat u inhibiciji rasta tumora (Tabela 32, BCMAxCD3 od 0,04 mg/kg i anti-PD-1 od 4 mg/kg). Upotrebom dvofaktorskog ANOVA testa 24. dana, p<0,0001 je bio između (i) REGN5458 (0,04 mg/kg) izotipska kontrola i kombinacije REGN5458 (0,04 mg/kg) anti-PD-1 antitelo (Grupe 3 prema Grupi 4), (ii) REGN5458 (0,24 mg/kg) izotipska kontrola i kombinacije REGN5458 (0,24 mg/kg) anti-PD-1 antitelo (Grupe 5 prema Grupi 6), (iii) anti-PD-1 i kombinacije REGN5458 (0,04 mg/kg) anti-PD-1 antitelo (Grupe 2 prema Grupi 6). Upotrebom dvofaktorskog ANOVA testa 24. dana, p=0,0005 je bio između anti-PD-1 i kombinacije REGN5458 (0,04 mg/kg) anti-PD-1 antitelo (Grupe 2 prema Grupi 4). Rezultat povećanja doze BCMAxCD3 bispecifičnog antitela (0,24 mg/kg) u kombinaciji sa blokiranjem PD-1 bila je inhibicija tumora koja je bila uporediva sa istom za nižu dozu bispecifičnog antitela sa blokiranjem PD-1 u ovom eksperimentu. Pokazana sinergija sa nižom dozom bispecifičnog antitela je korisna, pošto upotreba niže doze smanjuje rizik od bilo kakvih neželјenih sporednih efekata. Slično navedenom, kombinacija BCMAxCD3 bispecifičnog antitela i anti-PD-1 antitela pokazala je sinergistički terapijski efekat pri obe doze bispecifičnog antitela (0,04 mg/kg i 0,24 mg/kg) u broju miševa bez tumora na kraju eksperiment (28. dan), kao što je prikazano u Tabeli 33.

Tabela 32: Prosečna veličina tumora u raznim vremenskim tačkama

Tabela 33: Miševi bez tumora na kraju eksperimenta

Primer 21: Anti-BCMA × Anti-CD3 bispecifična antitela deluju sinergistički sa anti-PD-1 antitelima kako bi pobolјšali efikasnost protiv tumora In Vivo

[0192] Slični rezultati su dobijeni u drugom eksperimentu, identičnom onom koji je prethodno razmatran u Primeru 20, osim što je broj miševa po grupi = 10, a viša doza BCMAxCD3 REGN5458 je iznosila 0,4 mg/kg. Specifične grupe tretmana za drugi eksperiment su prikazane ispod, u Tabeli 34.

Tabela 34: Grupe za tretiranje

[0193] Rezultati pokazuju da kombinovanje REGN5458 sa blokiranjem PD-1 obezbeđuje superiornu antitumorsku efikasnost u odnosu bilo na REGN5458 ili blokiranje PD-1 samostalno. Preciznije, rezultati pokazuju da je 21. dana (poslednjeg dana za koji su prikuplјani podaci za sve grupe tretmana) kombinacija BCMAxCD3 bispecifičnog antitela i anti-PD-1 antitela proizvela sinergistički terapijski efekat u inhibiciji rasta tumora (Tabela 35, BCMAxCD3 od 0,04 mg/kg i anti-PD-1 od 4 mg/kg). Upotrebom dvofaktorskog ANOVA testa 21. dana, p<0,0001 je bio između (i) REGN5458 (0,04 mg/kg) izotipska kontrola i kombinacije REGN5458 (0,04 mg/kg) anti-PD-1 antitelo (Grupe 3 prema Grupi 4), (ii) anti-PD-1 i kombinacija REGN5458 (0,04 mg/kg) anti-PD-1 antitelo (Grupa 2 prema Grupi 4), (iii) anti-PD-1 i kombinacija REGN5458 (0,4 mg/kg) anti-PD-1 antitelo (Grupe 2 prema Grupi 6). Kao što je prethodno razmatrano u Primeru 20, rezultat povećanja doze BCMAxCD3 bispecifičnog antitela (0,4 mg/kg) u kombinaciji sa blokiranjem PD-1 blokadom bila je inhibicija tumora koja je bila uporediva sa istom za nižu dozu bispecifičnog antitela kombinovanu sa blokiranjem PD-1 u ovom eksperimentu. Pokazana sinergija sa nižom dozom bispecifičnog antitela je korisna, pošto upotreba niže doze smanjuje rizik od bilo kakvih neželјenih sporednih efekata. Slično navedenom, kombinacija BCMAxCD3 bispecifičnog antitela i anti-PD-1 antitela je pokazala sinergistički terapijski efekat pri obe doze bispecifičnog antitela (0,04 mg/kg i 0,4 mg/kg) u broju miševa bez tumora na kraju eksperiment (25. dan), kao što je prikazano u Tabeli 36.

Tabela 35: Prosečna veličina tumora u raznim vremenskim tačkama

Tabela 36: Miševi bez tumora na kraju eksperimenta

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

<120> Bispecific Anti-BCMA X Anti-CD3

Antibodies and Uses Thereof

<130> 10452WO01

<150> 62/700,596

<151> 2018-07-19

<150> 62/750,968

<151> 2018-10-26

<150> 62/793,645

<151> 2019-01-17

<160> 125

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 366

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 1

caggtgcagc tggtggagtc ggggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acctatggca ttcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atattacatg atggaagtag taactactat 180 gcagagtccg tgaagggccg attcatcatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctctat attactgtac gaaaaggtat 300 tcagaagcag ctggcccaaa ttggttcgac ccctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366

<210> 2

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu G 79lu Trp Val

35 40 45

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Lys Arg Tyr Ser Glu Ala Ala Gly Pro Asn Trp Phe Asp Pro Trp 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 3

ggattcacct tcagtaccta tggc 24

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly

1 5

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 5

atattacatg atggaagtag taac 24

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic 80

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 7

acgaaaaggt attcagaagc agctggccca aattggttcg acccc 45

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 8

Thr Lys Arg Tyr Ser Glu Ala Ala Gly Pro Asn Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 9

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 9

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtcg gggaattagc agctggttag cctggtatca gcagaagcca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatccatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg ctacttacta ttgtcaacag gctatcagtt tcccattcac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa a 321

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 10 81

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

His Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ile Ser Phe Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 11

cggggaatta gcagctgg 18

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 12

Arg Gly Ile Ser Ser Trp

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 13

gctgcatcc 9

<210> 14

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence 82

Ala Ala Ser

1

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 15

caacaggcta tcagtttccc attcact 27

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 16

Gln Gln Ala Ile Ser Phe Pro Phe Thr

1 5

<210> 17

<211> 360

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 17

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgtca tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gactggagtg ggtctcagct attattggta gtggtggtag cacatattac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaagagcc 300 ggggataact ggaactggtt cgacccctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

<210> 18

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

83

<220>

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Arg Ala Gly Asp Asn Trp Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 19

ggattcacct ttagcagcta tgtc 24

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 20

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Val

1 5

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 21 84 attattggta gtggtggtag caca 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 22

Ile Ile Gly Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 23

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 23

gcgaaaagag ccggggataa ctggaactgg ttcgacccc 39

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 24

Ala Lys Arg Ala Gly Asp Asn Trp Asn Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 25

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 25

gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctttaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcggaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tggggcggat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaaaagtg tcccattcac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa a 321

85

<210> 26

<223> synthetic

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Lys Ser Val Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 27

cagggtatta gcagctgg 18

<210> 28

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 28

Gln Gly Ile Ser Ser Trp

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> 86 <223> synthetic

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 30

Ala Ala Ser

1

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 31

caacaggcta aaagtgtccc attcact 27

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 32

Gln Gln Ala Lys Ser Val Pro Phe Thr

1 5

<210> 33

<211> 351

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 33

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt atcagttgga atagtggtaa catgggatat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgcc 8a7agaa ctccctgttc 240 ctgcaaatgc acagtttgag agctgaggac acggcctttt attactgtgc aaaagtccgt 300 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Asn Met Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80

Leu Gln Met His Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Val Arg Leu Thr Ala Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 35

ggattcacct ttgatgatta tgcc 24

<210> 36

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 36

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 37 88

<211> 24

<223> synthetic

<400> 37

atcagttgga atagtggtaa catg 24 <210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 38

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Asn Met

1 5

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 39

gcaaaagtcc gtctaactgc ctttgacttt 30 <210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 40

Ala Lys Val Arg Leu Thr Ala Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 41

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

89

<400> 41

aggttcactg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaggattttg taatttacta ctgtcaacag agtttcagta ccccgtatac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210> 42

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Gly Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Thr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 43

cagagcattg gcaactat 18

<210> 44

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 44

Gln Ser Ile Gly Asn Tyr

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 45

actgcatcc 9 <210> 46

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 46

Thr Ala Ser

1

<210> 47

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 47

caacagagtt tcagtacccc gtatact 27 <210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 48

Gln Gln Ser Phe Ser Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 49

<211> 354

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

91

<220>

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tcagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagttcta gtggtagttc cataaagtac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gagagaggga 300 gggaactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354

<210> 50

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ile Lys Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 51

ggattcacct tcagtgacta ctac 24

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220> 92

<223> synthetic

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 53

attagttcta gtggtagttc cata 24 <210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 54

Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ile

1 5

<210> 55

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 55

gcgagagagg gagggaacta cggtatggac gtc 33 <210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 56

Ala Arg Glu Gly Gly Asn Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

93

<210> 57

<223> synthetic

<400> 57

gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattaac aactggttag tctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcaaccagct tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtgggtc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tccctcccac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210> 58

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 58

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Trp

20 25 30

Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 59

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 59

cagggtatta acaactgg 18

<210> 60

<211> 6

<212> PRT 94

<213> Artificial Sequence

Gln Gly Ile Asn Asn Trp

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 61

gctgcaacc 9 <210> 62

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 62

Ala Ala Thr

1

<210> 63

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 63

caacaggcta acagtttccc tcccact 27 <210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 64

Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro Thr 95 1 5

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 65

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aacttttgga tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac atgaaccaag atggaagtga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagag ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcgg 300 gaatattgta ttagtaccag ctgctatgat gactttgact actggggcca gggaaccctg 360 gtcaccgtct cctca 375

<210> 66

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 66

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Met Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Glu Tyr Cys Ile Ser Thr Ser Cys Tyr Asp Asp Phe

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 67

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

96

<400> 67

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 68

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Trp

1 5

<210> 69

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 69

atgaaccaag atggaagtga gaaa 24

<210> 70

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 70

Met Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys

1 5

<210> 71

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 71

gcgagagatc gggaatattg tattagtacc agctgctatg atgactttga ctac 54

<210> 72

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence 97

Ala Arg Asp Arg Glu Tyr Cys Ile Ser Thr Ser Cys Tyr Asp Asp Phe 1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 73

<211> 324

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 73

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcatagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324

<210> 74

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 74

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 75

<211> 18

<212> DNA 98

<213> Artificial Sequence

cagagcatta gcagctat 18 <210> 76

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 76

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 77

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 77

gctgcatcc 9

<210> 78

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 78

Ala Ala Ser

1

<210> 79

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 79

caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 99 30 <213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 80

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr

1 5 10

<210> 81

<211> 324

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 81

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324

<210> 82

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 82

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

100

<210> 83

<223> synthetic

<400> 83

cagagcatta gcagctat 18 <210> 84

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 84

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 85

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 85

gctgcatcc 9 <210> 86

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 86

Ala Ala Ser

1

<210> 87

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic 101 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 88

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr

1 5 10

<210> 89

<211> 372

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 89

gaagtacagc ttgtagaatc cggcggagga ctggtacaac ctggaagaag tcttagactg 60 agttgcgcag ctagtgggtt tacattcgac gattacagca tgcattgggt gaggcaagct 120 cctggtaaag gattggaatg ggttagcggg atatcatgga actcaggaag caagggatac 180 gccgacagcg tgaaaggccg atttacaata tctagggaca acgcaaaaaa ctctctctac 240 cttcaaatga actctcttag ggcagaagac acagcattgt attattgcgc aaaatacggc 300 agtggttatg gcaagtttta tcattatgga ctggacgtgt ggggacaagg gacaacagtg 360 acagtgagta gc 372

<210> 90

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 90

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Lys Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 102

Ala Lys Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Lys Phe Tyr His Tyr Gly Leu Asp <211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 91

gggtttacat tcgacgatta cagc 24

<210> 92

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 92

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ser

1 5

<210> 93

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 93

atatcatgga actcaggaag caag 24

<210> 94

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 94

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Lys

1 5

<210> 95 103 <211> 51

<223> synthetic

<400> 95

gcaaaatacg gcagtggtta tggcaagttt tatcattatg gactggacgt g 51

<210> 96

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 96

Ala Lys Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Lys Phe Tyr His Tyr Gly Leu Asp

1 5 10 15

Val

<210> 97

<211> 372

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 97

gaagtacagc ttgtagaatc cggcggagga ctggtacaac ctggaagaag tcttagactg 60 agttgcgcag ctagtgggtt tacattcgac gattacagca tgcattgggt gaggcaagct 120 cctggtaaag gattggaatg ggttagcggg atatcatgga actcaggaag catcggatac 180 gccgacagcg tgaaaggccg atttacaata tctagggaca acgcaaaaaa ctctctctac 240 cttcaaatga actctcttag ggcagaagac acagcattgt attattgcgc aaaatacggc 300 agtggttatg gcaagtttta ttattatgga atggacgtgt ggggacaagg gacaacagtg 360 acagtgagta gc 372

<210> 98

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 98

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 104

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Lys Phe Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 99

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 99

gggtttacat tcgacgatta cagc 24

<210> 100

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 100

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ser

1 5

<210> 101

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 101

atatcatgga actcaggaag catc 24

<210> 102

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220> 105

<223> synthetic

<210> 103

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 103

gcaaaatacg gcagtggtta tggcaagttt tattattatg gaatggacgt g 51

<210> 104

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 104

Ala Lys Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Lys Phe Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

1 5 10 15

Val

<210> 105

<211> 249

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hBCMA ecto.mmh

<400> 105

atgttgcaga tggctgggca gtgctcccaa aatgaatatt ttgacagttt gttgcatgct 60 tgcatacctt gtcaacttcg atgttcttct aatactcctc ctctaacatg tcagcgttat 120 tgtaatgcaa gtgtgaccaa ttcagtgaaa ggaacgaatg cggaacaaaa actcatctca 180 gaagaggatc tgggtggaga acaaaaactc atctcagaag aggatctgca ccatcaccat 240 caccattga 249

<210> 106

<211> 82

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hBCMA ecto.mmh 106

Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr

20 25 30

Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser

35 40 45

Val Lys Gly Thr Asn Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

50 55 60

Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His

65 70 75 80

His His

<210> 107

<211> 864

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hBCMA ecto.mFc

<400> 107

atgttgcaga tggctgggca gtgctcccaa aatgaatatt ttgacagttt gttgcatgct 60 tgcatacctt gtcaacttcg atgttcttct aatactcctc ctctaacatg tcagcgttat 120 tgtaatgcaa gtgtgaccaa ttcagtgaaa ggaacgaatg cggagcccag agggcccaca 180 atcaagccct gtcctccatg caaatgccca gcacctaacc tcttgggtgg accatccgtc 240 ttcatcttcc ctccaaagat caaggatgta ctcatgatct ccctgagccc catagtcaca 300 tgtgtggtgg tggatgtgag cgaggatgac ccagatgtcc agatcagctg gtttgtgaac 360 aacgtggaag tacacacagc tcagacacaa acccatagag aggattacaa cagtactctc 420 cgggtggtca gtgccctccc catccagcac caggactgga tgagtggcaa ggagttcaaa 480 tgcaaggtca acaacaaaga cctcccagcg cccatcgaga gaaccatctc aaaacccaaa 540 gggtcagtaa gagctccaca ggtatatgtc ttgcctccac cagaagaaga gatgactaag 600 aaacaggtca ctctgacctg catggtcaca gacttcatgc ctgaagacat ttacgtggag 660 tggaccaaca acgggaaaac agagctaaac tacaagaaca ctgaaccagt cctggactct 720 gatggttctt acttcatgta cagcaagctg agagtggaaa agaagaactg ggtggaaaga 780 aatagctact cctgttcagt ggtccacgag ggtctgcaca atcaccacac gactaagagc 840 ttctcccgga ctccgggtaa atga 864

<210> 108

<211> 287

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hBCMA ecto.mFc

<400> 108

Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser

1 5 10 15

Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr

20 25 30

Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser V 1a0l7 Thr Asn Ser

35 40 45

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser

85 90 95

Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp

100 105 110

Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln

115 120 125

Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser 130 135 140

Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys

145 150 155 160

Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile

165 170 175

Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro

180 185 190

Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met 195 200 205

Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn 210 215 220

Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser 225 230 235 240

Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn 245 250 255

Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu

260 265 270

His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

275 280 285

<210> 109

<211> 246

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mfBCMA ecto.mmh

<400> 109

atgttgcaga tggctcggca gtgctcccaa aatgaatatt ttgacagttt gttgcatgat 60 tgcaaacctt gtcaacttcg atgttctagt actcctcctc taacatgtca gcgttattgc 120 aatgcaagta tgaccaattc agtgaaagga atgaatgcgg aacaaaaact catctcagaa 180 gaggatctgg gtggagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgcacca tcaccatcac 240 cattga 246

<210> 110

<211> 81

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mfBCMA ecto.mmh 108

Leu Leu His Asp Cys Lys Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Thr Pro

20 25 30

Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Met Thr Asn Ser Val

35 40 45

Lys Gly Met Asn Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly

50 55 60

Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His

65 70 75 80

His

<210> 111

<211> 861

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mfBCMA ecto.mFc

<400> 111

atgttgcaga tggctcggca gtgctcccaa aatgaatatt ttgacagttt gttgcatgat 60 tgcaaacctt gtcaacttcg atgttctagt actcctcctc taacatgtca gcgttattgc 120 aatgcaagta tgaccaattc agtgaaagga atgaatgcgg agcccagagg gcccacaatc 180 aagccctgtc ctccatgcaa atgcccagca cctaacctct tgggtggacc atccgtcttc 240 atcttccctc caaagatcaa ggatgtactc atgatctccc tgagccccat agtcacatgt 300 gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca gatgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac 360 gtggaagtac acacagctca gacacaaacc catagagagg attacaacag tactctccgg 420 gtggtcagtg ccctccccat ccagcaccag gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc 480 aaggtcaaca acaaagacct cccagcgccc atcgagagaa ccatctcaaa acccaaaggg 540 tcagtaagag ctccacaggt atatgtcttg cctccaccag aagaagagat gactaagaaa 600 caggtcactc tgacctgcat ggtcacagac ttcatgcctg aagacattta cgtggagtgg 660 accaacaacg ggaaaacaga gctaaactac aagaacactg aaccagtcct ggactctgat 720 ggttcttact tcatgtacag caagctgaga gtggaaaaga agaactgggt ggaaagaaat 780 agctactcct gttcagtggt ccacgagggt ctgcacaatc accacacgac taagagcttc 840 tcccggactc cgggtaaatg a 861

<210> 112

<211> 286

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mfBCMA ecto.mFc

<400> 112

Met Leu Gln Met Ala Arg Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser

1 5 10 15

Leu Leu His Asp Cys Lys Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Thr Pro

20 25 30

Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Met T 1h09r Asn Ser Val

35 40 45

Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro

85 90 95

Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val

100 105 110

Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

115 120 125

Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala

130 135 140

Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys

145 150 155 160

Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser

165 170 175

Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro

180 185 190

Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val

195 200 205

Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly

210 215 220

Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp 225 230 235 240

Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp

245 250 255

Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His

260 265 270

Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

275 280 285

<210> 113

<211> 849

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mouse BCMA ecto domain with mouse Fc

<400> 113

atggcgcaac agtgtttcca cagtgaatat tttgacagtc tgctgcatgc ttgcaaaccg 60 tgtcacttgc gatgttccaa ccctcctgca acctgtcagc cttactgtga tccaagcgtg 120 accagttcag tgaaagggac gtacacggag cccagagggc ccacaatcaa gccctgtcct 180 ccatgcaaat gcccagcacc taacctcttg ggtggaccat ccgtcttcat cttccctcca 240 aagatcaagg atgtactcat gatctccctg agccccatag tcacatgtgt ggtggtggat 300 gtgagcgagg atgacccaga tgtccagatc agctggtttg tgaacaacgt ggaagtacac 360 acagctcaga cacaaaccca tagagaggat tacaacagta ctctccgggt ggtcagtgcc 420 ctccccatcc agcaccagga ctggatgagt ggcaaggagt tcaaatgcaa ggtcaacaac 480 aaagacctcc cagcgcccat cgagagaacc atctcaaaac ccaaagggtc agtaagagct 540 ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagaa gaagagatga ctaagaaaca ggtcactctg 600 acctgcatgg tcacagactt catgcctgaa gacatttacg tggagtggac caacaacggg 660 aaaacagagc taaactacaa gaacactgaa ccagtcctgg actctgatgg ttcttacttc 720 atgtacagca agctgagagt ggaaaagaag aactgggtgg aaa 1g10aaatag ctactcctgt 780 tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac cacacgacta agagcttctc ccggactccg 840 <212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mouse BCMA ecto domain with mouse Fc

<400> 114

Met Ala Gln Gln Cys Phe His Ser Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His 1 5 10 15

Ala Cys Lys Pro Cys His Leu Arg Cys Ser Asn Pro Pro Ala Thr Cys 20 25 30

Gln Pro Tyr Cys Asp Pro Ser Val Thr Ser Ser Val Lys Gly Thr Tyr 35 40 45

Thr Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys 50 55 60

Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 65 70 75 80

Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 100 105 110

Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 115 120 125

Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 130 135 140

His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 145 150 155 160

Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 165 170 175

Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu 180 185 190

Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met 195 200 205

Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 210 215 220

Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 225 230 235 240

Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 245 250 255

Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 260 265 270

Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

275 280

<210> 115

<211> 184

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

111

<220>

Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15

Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 30

Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser 35 40 45

Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu 50 55 60

Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile 65 70 75 80

Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu 85 90 95

Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu 100 105 110

Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys 115 120 125

Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe 130 135 140

Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys 145 150 155 160

Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu 165 170 175

Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg

180

<210> 116

<211> 207

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human CD3 Epsilon Protein (>NP_000724.1 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain precursor

<400> 116

Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp 65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr 85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu 100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu M 1e12t Asp Val Met 115 120 125

Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 165 170 175

Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 180 185 190

Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 200 205

<210> 117

<211> 171

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human CD3 Delta Protein (>NP_000723.1 T-cell surface glycoprotein CD3 delta chain isoform A

precursor

<400> 117

Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu 1 5 10 15

Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg 20 25 30

Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val 35 40 45

Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile 50 55 60

Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys 65 70 75 80

Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys 85 90 95

Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val 100 105 110

Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His 115 120 125

Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg 130 135 140

Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr 145 150 155 160

Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys

165 170

<210> 118

<211> 164

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human CD3 Zeta Protein (>NP_932170.1 T- 1c1e3ll surface glycoprotein CD3 zeta chain isoform 1

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu 1 5 10 15

Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys 20 25 30

Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala 35 40 45

Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 50 55 60

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 65 70 75 80

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 85 90 95

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 100 105 110

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 115 120 125

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 130 135 140

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 145 150 155 160

Leu Pro Pro Arg

<210> 119

<211> 182

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human CD3 Gamma Protein (>NP_000064.1 T-cell surface glycoprotein CD3 gamma chain precursor

<400> 119

Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu 1 5 10 15

Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys 20 25 30

Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala 35 40 45

Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe 50 55 60

Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp 65 70 75 80

Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro 85 90 95

Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala 100 105 110

Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val 115 120 125

Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly 1 V14al Arg Gln 130 135 140

Asn Gln Leu Arg Arg Asn

180

<210> 120

<211> 281

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human BCMA ecto.hFc Protein

<400> 120

Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15

Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 30

Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser 35 40 45

Val Lys Gly Thr Asn Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 60

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 65 70 75 80

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 85 90 95

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 100 105 110

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 115 120 125

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 130 135 140

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 145 150 155 160

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 165 170 175

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 180 185 190

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 195 200 205

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 210 215 220

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 225 230 235 240

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 245 250 255

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 260 265 270

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Peptides 1-43 of human BCMA

<400> 121

Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15

Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 30

Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala

35 40

<210> 122

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 21587N VH

<400> 122

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Tyr 20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Ala Thr Ser Arg Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80

Thr Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Phe Ala Glu Tyr Cys Gly Gly Asn Ile Cys Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 123

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 21587N VL (Non-germline Cys in CDR3)

<400> 123

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu 11 S6er Pro Gly 1 5 10 15

Met Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Cys Gly Gly Ser Pro 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 124

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 21589N VH

<400> 124

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Gly Ser Thr Thr Thr Thr Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Thr Val Tyr Asp Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105 110

Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 125

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 21589N VL

<400> 125

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 117

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln 85 90 95

Arg Ile Glu Phe Pro Ser Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 100 105 110

Ile Lys

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen, koji sadrži:

(a) prvi domen koji vezuje antigen, koji specifično vezuje humani antigen sazrevanja B-ćelija (BCMA) koji sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68, 70, 72 i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88; i

(b) drugi domen koji vezuje antigen, koji specifično vezuje humani CD3 koji sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 92, 94, 96, i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88.

2. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen, koji sadrži:

(b) drugi domen koji vezuje antigen, koji specifično vezuje humani CD3 i sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 100, 102, 104 i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88.

3. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 1, gde:

(a) prvi domen koji vezuje antigen sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82; i

(b) drugi domen koji vezuje antigen sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82.

4. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 2, gde:

(b) drugi domen koji vezuje antigen sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82.

5. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, koji je bispecifično antitelo.

6. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 5, pri čemu:

(a) bispecifično antitelo sadrži konstantan region teškog lanca humanog IgG izotipa IgG1 ili IgG4; i/ili (b) bispecifično antitelo sadrži himerni zglobni region koji smanjuje vezivanje za Fcy receptor u odnosu na zglobni region divlјeg tipa istog izotipa.

7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifičan molekul koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, i farmaceutski prihvatlјiv nosač ili razblaživač.

8. Molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira bispecifičan molekul koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6.

9. Ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 8.

10. Ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 9.

11. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 7, za upotrebu u postupku inhibicije rasta tumora plazma ćelija kod subjekta.

12. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 7, za upotrebu u postupku lečenja multiplog mijeloma, ili drugog B-ćelijskog maligniteta koji eksprimira BCMA.

13. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je B-ćelijski malignitet koji eksprimira BCMA izabran iz grupe koju čine Valdenstromova makroglobulinemija, Burkitov limfom, difuzni B-krupnoćelijski limfom, ne-Hočkinov limfom, hronična limfocitna leukemija, folikularni limfom, mantle ćelijski limfom, limfom marginalne zone, limfoplazmacitni limfom i Hočkinov limfom.

14. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, 12 ili patentnom zahtevu 13, pri čemu se izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen ili farmaceutska kompozicija daju u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom ili terapijom.

15. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, pri čemu drugi terapijski agens ili terapija obuhvataju hemoterapijski lek, DNK alkilatore, imunomodulatore, inhibitore proteazoma, inhibitore histon deacetilaze, radioterapiju, transplantaciju matičnih ćelija, različita bispecifična antitela koja interaguju sa različitim antigenima površine tumorskih ćelija ili antigenima T-ćelija ili imunskih ćelija, konjugat leka i antitela, bispecifično antitelo konjugovano sa anti-tumorskim agensom, inhibitor PD-1, PD-L1 ili CTLA-4 kontrolnih tačaka ili njihove kombinacije .

16. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 7, za upotrebu u postupku lečenja tumora koji eksprimira BCMA, pri čemu se izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen, ili farmaceutska kompozicija, daju subjektu u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen.

17. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, pri čemu anti-PD-1 antitelo ili fragment koji vezuje antigen je anti-PD-1 antitelo.

18. Izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, pri čemu je anti-PD-1 antitelo cemiplimab (REGN2810).