RS65441B1 - Antitela za neutralizaciju poliomavirusa - Google Patents

Antitela za neutralizaciju poliomavirusa

Info

Publication number
RS65441B1
RS65441B1 RS20240355A RSP20240355A RS65441B1 RS 65441 B1 RS65441 B1 RS 65441B1 RS 20240355 A RS20240355 A RS 20240355A RS P20240355 A RSP20240355 A RS P20240355A RS 65441 B1 RS65441 B1 RS 65441B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
antibody
antibodies
variable region
chain variable
Prior art date
Application number
RS20240355A
Other languages
English (en)
Inventor
Johanna Abend
Zorica Dragic
Adam Lloyd Feire
Mark Knapp
Steven Kovacs
Elisabetta Traggiai
Lichun Wang
Yongqiang Wang
Danqing Wu
Qilong Wu
Fangmin Xu
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of RS65441B1 publication Critical patent/RS65441B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—DNA viruses
    • C07K16/084—Papillomaviridae (F); Polyomaviridae (F), e.g. SV40, BK virus or JC virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovo otkrivanje je usmereno na anti-VP1 antitela, fragmente antitela, i njihove upotrebe za smanjenje verovatnoće ili lečenja infekcije poliomavirusom.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Od humanih poliomavirusa, prvo dva identifikovana su bili BK virus (BKV) i JC virus (JCV). Ova dva poliomavirusa su izolovana kod imunosupresivnih pacijenata i objavljeni su u istom izdanju Lancet-a 1971. godine (Gardner et al., Lancet 19711: 1253-1527, i Padgett et al., Lancet 19711:1257-1260). Poliomavirusi su ikosaedrični, neumotani, dvostruko razgranati DNK virusi. Njihova veličina je 40-45 nm po prečniku i obuhvataju 88% proteina i 12% DNK.
[0003] BKV genom je kružni dvostruko razgranati DNK od približno 5 Kb dužine i sadrži tri glavne podele: rano-kodirajući region, kasno-kodirajući region, i nekodirajući kontrolni region. Rano-kodirajući region kodira za tri regulatorna proteina (antigen velikog tumora [TAg], antigen malog tumora [tAg], i skraćeni antigen tumora [truncTAg]), koji su prvo virusni proteini eksprimirani u novozaraženoj ćeliji i odgovorni su za olakšavanje replkacije virusne DNK i uspostavljanje povoljnog ćelijskog okruženja. Kasno-kodirajući region kodira tri strukturna proteina (VP1, VP2, i VP3) koji čine virusni kapsid, kao i agnoprotein, čija uloga nije najbolje definisana tokom replikacije virusa. Nekodirajući kontrolni region sadrži poreklo replikacije kao i rane i kasne promotere koji upravljaju ekspresijom virusnih genskih proizvoda.
[0004] BKV je detektovan u mnogo različitih tipova ćelija uključujući epitelske ćelije bubrega, bešike, i uretera (uobičajena mesta istrajnosti), nepčano tkivo, i limfocite (predložena mesta primarne infekcije i diseminacija) (Chatterjee et al., J. Med. Virol.2000; 60:353-362, Goudsmit et al., J. Med. Virol.1982; 10:91-99, Heritage et al., J. Med. Virol.1981; 8:143-150, Shinohara et al., J. Med. Virol.1993; 41(4):301-305). Primarni ćelijski površinski receptori za BKV su gangliosidi GT1b, GD1b, i GD3, pri čemu svi oni imaju terminalnu α2,8-vezanu sijalinsku kiselinu i prilično su svepristuni, čime se omogućava infekcija raznih ćelijskih tipova (Neu et al., PLos Patholog.2013; 9(10):e1003714 i e1003688, videti
takođe, O'Hara et al., Virus Res.2014; 189:208-285). Neumotani ikosaedrični virion BKV je sastavljen od tri različita virusna proteina: 360 kopija glavnog virusnog kapsidnog proteina VP1 raspoređenog u 72 pentamere i 72 kopije kombinovane sa manjim virusnim kapsidnim proteinima VP2 i VP3, sa jednim VP2 ili VP3 molekulom povezanim sa svakim VP1 pentamerom. Samo VP1 je izložen virionskoj površini na ulazu i svaki pentamer ima pet vezujućih mesta niskog afiniteta za gangliosidni receptor. Vezivanje VP1 pentamera za gangliosidne receptore na ćelijskoj površini inicira internalizaciju endocitnim putem koji je posredovan kaveolama, nakon čega sledi prenos virusa na endoplazmatski retikulum i konačno do jezgra (Tsai and Qian, J. Virol 2010;84(19):9840-9852).
[0005] Infekcija humanim poliomavirusom BK (BKV) je suštinski sveprisutna, sa procenama u opsegu između 80 i 90% globalno zaražene populacije (Knowles W.A., Adv. Exp. Med. Biol.2006;577:19-45). Primarna infekcija se najčešće javlja tokom detinjstva (tj., pre 10. godine) i dovodi ili do blage, sespecifične, samoograničavajuće bolesti ili ne dovodi uopšte do simptoma. Uporna infekcija je utvrđena u epitelskim ćelijama bubrežnih tubula, uretera, i bešike, i imuni sistem je efikasno kontroliše. Prolazno asimptomatsko izlučivanje virusa u urinu imunokompetentnih odraslih se javlja sporadično, ali ne dovodi do bolesti ili posledica. Ipak, kompromitovana imuna funkcija, naročito sa imunosupresijom nakon transplatacije renalne ili hematopoietične matične ćelije, može da dovede do nekontrolisane BKV replikacije i na kraju do nefropatije povezane sa BKV (BKVAN) ili hemoragijskog cistitisa (HC), bolne bolesti bešike. Ne postoje efikasne antivirusne terapije protiv BKV i trenutni standard brige je redukcija imunosupresije, koja povećava rizik od akutnog odbacivanja. Čak i sa trenutnim, agresivnijim pristupima praćenju i sprečavanju, do 10% primalaca bubrežnih transplantata će razviti BKVAN, a 15-30% tih pacijenata će iskusiti gubitak kalema usled BKVAN. Među onima koji su podvrgnuti smanjenju imunosupresivnog režima nakon detekcije BKV viremije, do 30% će za rezultat imati epizodu akutnog odbacivanja.
[0006] Mada je BKV prvi put opisan 1971. godine (supra), sve do devedesetih godina nefropatija povezana sa BK (BKVAN) nije bila prijavljena u literaturi kao uzrok povrede kod transplanta bubrega (Purighalla et al., Am. J. Kidney Dis.1995; 26:671-673 and Randhawa et al., Transplantation 1999;
67:103-109). U ranom upravljanju BKVAN, pozitivan test na BK je imao ozbiljne posledice, sa više od 50% pacijenata koji su imali disfunkciju kalema i gubitak kalema (Hirsch et al., New Engl. J. Med.2002;
347:488-496). Ponovna virusna aktivacija BK može da počne nakon transplantacije, i primećena je oko 30%-50% pacijenata do 3 meseca nakon transplantacije (Bressollette-Bodin et al., Am J. Transplant. 2005; 5(8):1926-1933 and Brennan et al., Am. J. Transplant.2004;4(12):2132-2134). Bk virusna reaktivacije prvo može da se primeti kroz virus i virusnu DNK u urinu, zatim u plazmi i konačno u bubregu. (Brennan et al., Am. J. Transplant.2005;5(3):582-594 i Hirsch et al., N Eng. J. Med.
2002;347(7):488-496). Oko 80% pacijenata sa transplantatom bubrega imaju BK virus u urinu (BK virurija) i 5-10% ovih pacijenata napreduje do BKVAN (Binet et al., Transplantation 1999; 67(6):918-922 i Bressollette-Bodin et al., Am J. Transplant.2005; 5(8):1926-1933). BKV dejstvuje na renalne tubularne epitelske ćelije koje uzrokuju nekrozu i litičnu destrukciju sa ogoljevanjem bazalne membrane, koja omogućava da se tubularna tečnost akumulira u intersticijumu, što dovodi do intesticijalne fibroze i tubularne atrofije (Nickeleit et al., J. Am. Soc. Neprol.1999; 10(5):1080-1089) koje sve utiču na stanje transplantata. Kod pacijenata može da se javi pogoršanje funkcije bubrega, tubularnoge-intersticijalnog nefritisa i uretične stenoze (Gamer et al., Lancet 1971; 1(7712):1253-1257 i Hirsch Am. J. Transplant 2002; 2(1)25-30).
[0007] BKV takođe može da uzrokuje pneumonitis, retinitis i meningoencefalitis kod imunokompromitovanih domaćina (Reploeg et al., Clin. Infect. Dis.2001;33(2):191-202). BKV bolest se kod primalaca transplantata matičnih ćelija hematopoeze (HSCT) obično manifestuje kao hemoragijski cistitis (HC), koji može da varira po ozbiljnosti. Virurija (ali ne viremija) i bolna hematurija su povezane sa kliničkom predstavom HC. Trenutni standard nege je po prirodi suportivan, koji uključuje prevashodno prisilnu hidrataciju /dijurezu i mere za upravljanje bolom. Najozbiljniji slučajevi zahtevaju transfuziju krvi, evakuaciju ugruška, i mogu da dovedu do smrti u nekim slučajevima. HC bilo kog uzroka (npr. lek, zračenje, virusni) je relativno uobičajena među primaocima HSCT ali se HC povezana sa BKV javlja kod približno 10-12% pacijenata obično tokom 6 meseci nakon transplatacije. Postoje druge virusne etiologije HC, sa adenovirusom koji je uobičajeniji uzrok HC među pedijatrijskim HSCT primaocima u odnosu na odrasle HSCT primaoce. BK virus je takođe primećen kod drugih imunokompormitovanih stanja kao što je sistemski eritemski lupus, drugi transplantati čvrstih organa i kod pacijenata sa HIV/AIDS (Jiang et al., Virol.2009; 384:266-273).
[0008] U ovom trenutku, lečenje BK nefropatije povezane sa transplantacijom organa je smanjenje imunosupresije u pokušaju sprečavanja disfunkcije i gubitka kalema (Wiseman et al., Am. J. Kidney Dis.
2009; 54(1): 131-142 i Hirsch et al., Transplantation 2005; 79(1): 1277-1286). Ne postoje fiksni klinički režimi za smanjenje, budući da smanjenje imunosupresije može biti od pomoći u sprečavanju napredovanja od viremije do opsežnog oštećenja povezanog sa kliničkom nefropatijom, ali ovo takođe povećava rizik od akutnog odbacivanja organa (Brennan et al., Am. J. Transplant 2005; 5(3):582-594). Lekari su prijavili upotrebu terapeutskih sredstava kao što su cidofovir, leflunomide ili kvinoloni u kombinaciji sa smanjenjem imunosupresivnih agenasa, međutim se u ovim prijavama došlo do zaključka da je ovaj pristup neefikasan, sa dodatkom opterećenja upravljanja dodatnim neželjenim efektima (Randhawa and Brennan Am. J. Transplant 2006; 6(9):2000-2005). Kao takav, postoji neispunjena i korisna potreba u ovoj oblasti za terapijama koje neutrališu poliomaviruse kao što je BK i koje mogu da se koriste kod imunokompromitovanog domaćina.
[0009] JC virus je takođe poliomavirus koji je takođe izuzetno raširen u populaciji (80%), mada se JC virus generalno kasnije stiče u odnosu na BK virus (Padgett et al., J. Infect. Dis.1973;127(4):467-470 i Sabath et al., J. Infect. Dis.2002; 186 Suppl.2:5180-5186). Nakon početne infekcije, JC virus uspostavlja latentnost u limfoidnim organima i bubrezima i kada se ponovo aktivira, napada centralni nervni sistem preko zaraženih B-limfocita. Kada je jednom u CNS-u, JC virus uzrokuje progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju (PML), koja predstavlja progresivan demijelnizujući poremećaj centralnog nervnog sistema. PML je najčešće prisutna kao oportunistička infekcija kod pacijenata sa HIV/AIDS i takođe je prijavljena kod imunosupresivnih pacijenata (Angstrom et al., Brain 1958; 81(1):93-111 i Garcia-Suarez et al., Am. J. Hematol.2005; 80(4):271-281). PML pacijenti sa konfuzijom, promenama mentalnog statusa, ataksijom hoda, fokalnim neurološkim nedostacima kao što su pareza hemi pareza, pareza ekstremiteta i promene vida (Richardson E.P., N. Eng. J. Med.1961; 265:815-823). Prognoza pacijenata sa PML je loša, a naročito loša kod pacijenata sa HIV/AIDS (Antinori et al., J. Neurovirol.2003;9 suppl.1:47-53). Ovo dalje naglašava neispunjenu i korisnu potrebu u oblasti za terapije koje neutrališu poliomaviruse kao što je JC.
[0010] WO2014/102399 i Parmjeet et al., J Gen Virol.200990(3):634 do 639 opisuju antitela koja prepoznaju i JCV i VP1 BKV, ali ne otkrivaju mogućnost ovih antitela da neutrališu infekciju serotipovima I-IV BK i JCV.
KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA
[0011] Ovo otkrivanje je usmereno na antitelo, pri čemu pomenuto antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata: varijabilni region teškog lanca koji obuhvata (a) HCDR1 (CDR-region za određivanje komplementarnosti) iz SEQ ID NO: 6, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:7, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:8 i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:16, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:17, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:18
[0012] Antitelo pri čemu pomenuto antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
(i) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 12, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO: 22;
(ii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 32, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO: 42;
(iii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 52, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO: 62;
(iv) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 72, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO: 82;
(v) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:92, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:102;
(vi) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:112, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:122;
[0013] Antitelo koje zadržava najmanje 95, 96, 97, 98 ili 99% identiteta ili u varijabilnom lakom ili varijabilnom teškom regionu.
[0014] Antitelo pri čemu to antitelo je monoklonalno antitelo, himerno antitelo, humanizovano antitelo, jednolančano antitelo(scFv) ili fragment antitela.
[0015] Antitelo prema bilo kom od prethodnih načina ostvarivanja pri čemu antitelo ili njegov fragment ima smanjenu glikosilaciju ili je bez glikosilacije ili je hipofukosilisan.
[0016] Kompozicija koja obuhvata brojna antitela ili antigen-vezujuće fragmente prema bilo kom od prethodnih načina ostvarivanja, pri čemu najmanje 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5% ili više antitela u kompoziciji imaju ostatak α2,3 -vezane sijalinske kiseline.
[0017] Kompozicija koja obuhvata brojna antitela ili antigen-vezujuće fragmente prema bilo kom od prethodnih načina ostvarivanja, pri čemu ni jedno antitelo ne obuhvata GlcNAc koji se deli na dva dela.
[0018] Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od prethodnih načina ostvarivanja za upotrebu kao lek.
[0019] Antitelo ili njegov fragment ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu u neutralizaciji infekcije BK virusom ili JC virusom.
[0020] Antitelo ili njegov fragment, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu u lečenju ili smanjenju verovatnoće od: nefropatije, BKVAN, hemoragijskog cistitisa (HC), progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML), neuronopatije granularnih ćelija (GCN), intersticijalne bolesti bubrega, ureteralne stenoze, vaskulitisa, kolitisa, retinitisa, meningitisa, i zapaljenskog sindroma imunološke rekonstitucije (IRIS).
[0021] Upotreba antitela ili njegovog fragmenta, koje se daje u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensom.
[0022] Upotreba antitela ili njegovog fragmenta pri čemu terapeutski agens predstavlja imunosupresivni agens.
[0023] Upotreba antitela ili njegovog fragmenta pri čemu je taj imunosupresivni agens inhibitor monofosfat dehidrogenaze, inhibitor purinske sinteze, kalcineurinski inhibitor ili TOR inhibitor.
[0024] Nukelinska kiselina koja kodira antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih načina ostvarivanja.
[0025] Vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu.
[0026] Ćelija domaćina koja obuhvata vektor.
[0027] Postupak za proizvodnju antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina i obnavljanje antitela iz kulture.
[0028] Dijagnostički reagens koji obuhvata antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji je obeležen.
[0029] Dijagnostički reagens pri čemu to obeležje je izabrano iz grupe koju čine radioaktivna etiketa, fluorofor, hromofor, agens za snimanje, i metalni jon.
[0030] Bilo kakva pozivanja na postupke lečenja u stavovima u nastavku ovog opisa bi trebalo da se tumače kao pozivanja na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje humanog ili životinjskog tela terapijom ili za ovu dijagnozu.
Definicije
[0031] Osim ukoliko nije drugačije navedeno, sledeći pojmovi i fraze kako se ovde koriste, su predviđeni da imaju sledeća značenja:
Pojam "antitelo" kako se ovde koristi se odnosi na polipeptid iz porodice imunoglobulina koji može da se vezuje za odgovarajući antigen nekovalentno, reverzibilno, i na konkretan način. Na primer, IgG antitelo koje se prirodno javlja je tetramer koji obuhvata najmanje dva teška regiona koji obuhvataju: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:216, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:217, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:218;
(xii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:226, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:227, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:228; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:236, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:237, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:238;
(xiii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:246, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:247, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:248; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:256, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:257, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:258;
(xiv) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:266, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:267, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:268; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO: 276, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:277, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:278;
(xv) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:286, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:287, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:288; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:296, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:297, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:298;
(xvi) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:306, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:307, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:308; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:314, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:315, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:316;
(xvii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:322, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:323, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:324; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:332, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:333, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:334;
(xviii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:342, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:343, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:344; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:349, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:350, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:351;
(xix) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:356, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:357, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:358; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:363, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:364, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:365;
(xx) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:370, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:371, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:372; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:377, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:378, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:379;
(xxi) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:384, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:385, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:386; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:391, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:392, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:393;
(xxii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:398, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:399, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:400; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:405, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:406, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:407;
(xxiii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:412, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:413, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:414; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:419, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:420, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO: 421;
(xxiv) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:426, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:427, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:428; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:433, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:434, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:435;
(xxv) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:440, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:441, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:442; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:447, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:448, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:449;
(xxvi) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:454, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:455, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:456; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:461, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:462, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:463;
(xxvii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:468, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:469, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:470; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:475, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:476, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:477;
(xxviii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:482, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:483, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:484; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:489, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:490, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:491.
[0032] Antitelo, pri čemu pomenuto antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata: (i) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata (a) HCDR1 (CDR-region za određivanje komplementarnosti) iz SEQ ID NO: 508, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:509, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:510 i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:511, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:512, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:513;
(ii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:514, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:515, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:516; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:517, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:518, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:519;
(iii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:520, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:521, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:522; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:523, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:524, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:525;
(iv) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:526, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:527, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:528; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:529, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:530, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:531;
(v) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:532, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:533, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:534; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:535, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:536, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:537;
(vi) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:538, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:539, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:540; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:541, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:542, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:543.
[0033] Antitelo pri čemu najmanje jedna aminokiselina unutar CDR je supstituisana odgovarajućim ostatkom odgovarajućeg CDR drugog anti-VP1 antitela iz tabele 2.
[0034] Antitelo pri čemu su jedna ili dve aminokiseline unutar CDR modifikovane, brisane ili supstituisane.
[0035] Antitelo koje zadržava najmanje 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identiteta ili u varijabilnom regionu teškog lanca ili vraijabilnom regionu lakog lanca.
[0036] Antitelo koje obuhvata modifikacije iz tabele 3.
[0037] Antitelo pri čemu to antitelo je monoklonalno antitelo, himerno antitelo, humanizovano antitelo, humano konstruisano antitelo, humano antitelo, jednolančano antitelo(scFv) ili fragment antitela.
[0038] Antitelo pri čemu pomenuto antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
(i) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 12, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO: 22;
(ii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 32, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO: 42;
(iii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 52, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO: 62;
(iv) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 72, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO: 82;
(v) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:92, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:102;
(vi) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:112, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:122;
(vii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 132, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:142;
(viii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 152, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:162;
(ix) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:172, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:182;
(x) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 192, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:202;
(xi) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:212, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:222;
(xii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:232, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:242;
(xiii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:252, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:262;
(xiv) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:272, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:282;
(xv) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:292, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:302;
(xvi) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:312, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:320;
(xvii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:328, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:338;
(xviii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:348, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:355;
(xix) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:362, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:369;
(xx) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:376, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:383;
(xxi) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:390, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:397;
(xxii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:404, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:411;
(xxiii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:418, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:425;
(xxiv) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:432, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:439;
(xxv) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 446, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:453;
(xxvi) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:460, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:467;
(xxvii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:474, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:481; ili
(xxviii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:488, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:495.
[0039] Antitelo koje zadržava najmanje 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identiteta ili u varijabilnom lakom ili varijabilnom teškom regionu.
[0040] Antitelo pri čemu jedna, dve, tri, četiri ili pet, ali manje od 10 aminokiselina unutar varijabilnog lakog ili varijabilnog teškog regiona su modifikovane, brisane ili supstituisane.
[0041] Antitelo pri čemu to antitelo je monoklonalno antitelo, himerno antitelo, humanizovano antitelo, humano konstruisano antitelo, humano antitelo, jednolančano antitelo(scFv) ili fragment antitela.
[0042] Antitelo prema bilo kom od prethodnih načina ostvarivanja pri čemu antitelo ili njegov fragment ima smanjenu glikosilaciju ili je bez glikosilacije ili je hipofukosilisan.
[0043] Kompozicija koja obuhvata brojna antitela ili antigen-vezujuće fragmente prema bilo kom od prethodnih načina ostvarivanja, pri čemu najmanje 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5% ili više antitela u kompoziciji imaju ostatak α2,3 -vezane sijalinske kiseline, i pri čemu pomenuto antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:(i) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata (a) HCDR1 (CDR-region za određivanje komplementarnosti) iz SEQ ID NO: 6, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:7, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:8 i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:16, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:17, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:18;
(ii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:26, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:27, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:28; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:36, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:37, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:38;
(iii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:46, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:47, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:48; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:56, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:57, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:58;
(iv) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:66, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:67, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:68; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:76, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:77, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:78;
(v) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:86, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:87, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:88; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:96, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:97, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:98;
(vi) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO: 106, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO: 107, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO: 108; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:116, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:117, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:118;
(vii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO: 126, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO: 127, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO: 128; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:136, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:137, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:138;
(viii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:146, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:147, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:148; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:156, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:157, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:158;
(ix) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO: 166, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO: 167, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO: 168; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:176, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:177, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO: 178;
(x) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO: 186, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:187, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:188; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:196, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:197, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:198;
(xi) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:206, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:207, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:208; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:216, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:217, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:218;
(xii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:226, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:227, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:228; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:236, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:237, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:238;
(xiii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:246, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:247, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:248; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:256, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:257, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:258;
(xiv) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:266, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:267, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:268; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO: 276, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:277, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:278;
(xv) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:286, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:287, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:288; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:296, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:297, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:298;
(xvi) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:306, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:307, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:308; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:314, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:315, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:316;
(xvii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:322, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:323, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:324; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:332, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:333, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:334;
(xviii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:342, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:343, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:344; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:349, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:350, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:351;
(xix) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:356, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:357, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:358; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:363, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:364, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:365;
(xx) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:370, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:371, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:372; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:377, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:378, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:379;
(xxi) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:384, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:385, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:386; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:391, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:392, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:393;
(xxii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:398, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:399, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:400; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:405, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:406, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:407;
(xxiii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:412, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:413, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:414; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:419, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:420, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO: 421;
(xxiv) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:426, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:427, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:428; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:433, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:434, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:435;
(xxv) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:440, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:441, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:442; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:447, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:448, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:449;
(xxvi) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:454, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:455, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:456; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:461, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:462, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:463;
(xxvii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:468, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:469, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:470; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:475, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:476, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:477;
(xxviii) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: (a) HCDR1 iz SEQ ID NO:482, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:483, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:484; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:489, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:490, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:491.
[0044] Kompozicija koja obuhvata brojna antitela ili antigen-vezujuće fragmente prema bilo kom od prethodnih načina ostvarivanja, pri čemu ni jedno antitelo ne obuhvata GlcNAc koji se deli na dva dela.
[0045] Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo ili njegov fragment, prema bilo kom od prethodnih načina ostvarivanja pri čemu je kompozicija pripremljena kao liofilizat.
[0046] Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od prethodnih načina ostvarivanja i farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednom načinu ostvarivanja, nosač je pufer histidina. U jednom načinu ostvarivanja, farmaceutska kompozicija obuhvata šećer (npr., saharozu).
[0047] Postupak neutralizovanja infekcije BK virusom ili JC virusom koja obuhvata davanje injekcijom ili infuzijom pacijentu kojem je to potrebno efektivne količine antitela ili farmaceutske kompozicije. Taj postupak u kojem antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment neutrališe serotip I BKV i serotip I BKV I. U drugom načinu ostvarivanja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment neutrališe serotip I BKV i serotip I BKV II. U drugom načinu ostvarivanja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment neutrališe serotip I BKV i serotip IV BKV. U drugom načinu ostvarivanja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment neutrališe serotip I BKV i serotip III BKV. U drugom načinu ostvarivanja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment neutrališe serotip I BKV i serotip IV BKV. U drugom načinu ostvarivanja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment neutrališe serotip I BKV i JCV. U konkretnom načinu ostvarivanja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment neutrališe serotipe I, II, III i IV BKV. Dalje, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment neutrališe serotipe I, II, III i IV BKV i JCV. U poželjnom načinu ostvarivanja, anti-VP1 antitela koja se neutrališu infekcijom sva četiri serotipa BKV (I-IV), ta anti-VP1 antitela konkretno obuhvataju P8D11, modifikacije P8D11, i EBB-C1975-B5.
[0048] Postupak lečenja ili smanjenja verovatnoće od poremećaja povezanog sa BK virusom ili JC virusom, koji obuhvata davanje injekcijom ili infuzijom pacijentu kojem je potrebna efektivna količina antitela ili farmaceutske kompozicije, i pri čemu je taj poremećaj: nefropatija, BKVAN, hemoragijski cistitis (HC), progresivna multifokalna leukoencefalopatija (PML), neuronopatija granularnih ćelija (GCN), intersticijalna bolest bubrega, ureteralna stenoza, vaskulitis, kolitis, retinitis, meningitis, i zapaljenski sindrom imunološke rekonstitucije (IRIS).
[0049] Postupak pri čemu se antitelo ili kompozicija rekonstituiše pre injekcije ili infuzije.
[0050] Postupak pri čemu se antitelo ili farmaceutska kompozicija daje u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensom.
[0051] Postupak pri čemu terapeutski agens predstavlja imunosupresivni agens.
[0052] Postupak pri čemu imunosupresivni agens je inhibitor monofosfat dehidrogenaze, inhibitor purinske sinteze, kalcineurinski inhibitor ili mTOR inhibitor.
[0053] Postupak pri je imunosupresivni agens mikofenolat mofetil (MMF), mikofenolat natrijum, azatioprin, takrolimus, sirolimus ili ciklosporin.
[0054] Postupak pri čemu terapeutski agens predstavlja dodatno anti-VP1 antitelo.
[0055] Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od prethodnih načina ostvarivanja za upotrebu kao lek.
[0056] Antitelo ili njegov fragment ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu u neutralizaciji infekcije BK virusom ili JC virusom.
[0057] Antitelo ili njegov fragment, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu u lečenju ili smanjenju verovatnoće od: nefropatije, BKVAN, hemoragijskog cistitisa (HC), progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML), neuronopatije granularnih ćelija (GCN), intersticijalne bolesti bubrega, ureteralne stenoze, vaskulitisa, kolitisa, retinitisa, meningitisa, i zapaljenskog sindroma imunološke rekonstitucije (IRIS).
[0058] Upotreba antitela ili njegovog fragmenta, koje se daje u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensom.
[0059] Upotreba antitela ili njegovog fragmenta pri čemu terapeutski agens predstavlja imunosupresivni agens.
[0060] Upotreba antitela ili njegovog fragmenta pri čemu je taj imunosupresivni agens inhibitor monofosfat dehidrogenaze, inhibitor purinske sinteze, kalcineurinski inhibitor ili mTOR inhibitor.
[0061] Upotreba antitela ili njegovog fragmenta, pri čemu je imunosupresivni agens: mikofenolat mofetil (MMF), mikofenolat natrijum, azatioprin, takrolimus, sirolimus ili ciklosporin.
[0062] Nukelinska kiselina koja kodira antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih načina ostvarivanja.
[0063] Vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu.
[0064] Ćelija domaćina koja obuhvata vektor.
[0065] Postupak za proizvodnju antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina i obnavljanje antitela iz kulture.
[0066] Dijagnostički reagens koji obuhvata antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji je obeležen.
[0067] Dijagnostički reagens pri čemu to obeležje je izabrano iz grupe koju čine radioaktivna etiketa, fluorofor, hromofor, agens za snimanje, i metalni jon.
Definicije
[0068] Ukoliko nije navedeno drugačije, sledeći pojmovi i fraze kako se ovde koriste su predviđeni da imaju sledeća značenja:
[0069] Pojam "antitelo" kako se ovde koristi se odnosi na polipeptid iz porodice imunoglobulina koji može da se vezuje za odgovarajući antigen nekovalentno, reverzibilno, i na specifičan način. Na primer, IgG antitelo koje se prirodno javlja je tetramer koji obuhvata najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana dislufidnim vezama. Svaki teški lanac obuhvata varijabilni region teškog lanca (ovde skraćen kao VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca obuhvata tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac obuhvata varijabilni region lakog lanca (ovde skraćen kao VL) i konstantni region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca obuhvata jedan domen, CL. VH i VL regioni dodatno mogu biti podeljeni u regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju regioni za određivanje komplementarnosti (CDR), isprekidani sa regionima koji su više konzervirani, koji se nazivaju okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR i četiri FR raspoređena od amino-terminusa do karboksiterminusa prema sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji stupa u interakciju sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući razne ćelije imunološkog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog komponentnog sistema.
[0070] Pojam "antitelo" uključuje, ali bez ograničenja na, monoklonalna antitela, humana antitela, humanizovana antitela, kamelidna antitela, himerna antitela, i anti-idiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr., anti-Id antitela do antitela ovog otkrivanja). Antitela mogu biti od bilo kog izotipa/klase (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), ili podklase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2).
[0071] "Domeni za određivanje komplementarnosti " ili "regioni za određivanje komplementarnosti ("CDR") se naizmenično odnose na hipervarijabilne regione VL i VH. CDR predstavljaju ciljano proteinvezujuće mesto antitela lanca koje sadrži specifičnost za takav ciljani protein. Postoje tri CDR (CDR1-3, numerički označeni sekvencijalno od N-terminusa) u svakom humanom VL ili VH, čime se konstituiše oko 15-20% varijabilnih domena. CDR mogu biti označeni njihovim regionom i redom. Na primer, i "VHCDR1" ili "HCDR1" se odnose na prvi CDR varijabilnog regiona teškog lanca. CDR su strukturno komplementarni sa epitopom ciljanog proteina i samim tim su direktno odgovorni za specifičnost vezivanja. Preostali delovi VL ili VH, takozvani okvirni regioni, ispoljavaju manju varijaciju u aminokiselinskoj sekvenci (Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000).
[0072] Položaji CDR i okvirni regioni mogu da se odrede pomoću raznih dobro poznatih definicija u tehnici, npr., Kabat, Chothia, i AbM (videti, npr., Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)). Definicije mesta za kombinovanje antigena su takođe opisane u sledećim: Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); i Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); i Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); i Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996). ). U kombinovanoj šemi numerisanja po Kabatu i Chothia, u nekim načinima ostvarivanja, CDR odgovaraju aminokiselinskim ostacima koji su deo Kabat CDR, Chothia CDR, ili oba. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, CDR odgovaraju aminokiselinskim ostacima 26-35 (HC CDR1), 50-65 (HC CDR2), i 95-102 (HC CDR3) u VH, npr., VH kod sisara, npr., humani VH; i aminokiselinski ostaci 24-34 (LC CDR1), 50-56 (LC CDR2), i 89-97 (LC CDR3) u VL, npr., VL kod sisara, npr., humanog VL.
[0073] I laki i teški lanci su podeljeni na regione strukturne i funkcionalne homologije. Pojmovi "konstantni" i "varijabilni" se koriste funkcionalno. U ovom smislu, smatraće se da varijabilni domeni delova i lakog (VL) i teškog (VH) lanca određuju prepoznavanje angitena i specifičnost. Suprotno tome, konstantni domeni lakog lanca (CL) i teškog lanca (CH1, CH2 ili CH3) obezbeđuju važna biološka svojstva kao što je izlučivanje, transplacentarna pokretljivost, vezivanje Fc receptora, vezivanje komplementa, i njima slična. Po konvenciji, numerisanje domena konstantnog regiona raste kako postaju udaljeniji od mesta vezivanja antigena ili amino-terminusa antitela. N-terminus je varijabilni region, a C-terminus je konstantni region; CH3 i CL domeni zapravo obuhvataju karboksi-terminalne domene teškog i lakog lanca, tim redom.
[0074] Pojam "antigen-vezujući fragment," kako se ovde koristi, se odnosi na jedan ili više delova antitela koji zadržvaju mogućnost specifične interakcije sa (npr., vezivanjem, sternim ometanjem, stabilizovanjem/destabilizovanjem, prostornom distribucijom) epitopom antigena. Primeri vezujućih fragmenata uključuju, ali bez ograničenja na, jednolančane Fv (scFv), disulfidno-vezane Fv (sdFv), Fab fragmente, F(ab') fragmente, monovalentan fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; F(ab)2 fragment, bivalentni fragment koji obuhvata dva Fab fragmenta vezana disulfidnim mostom na zglobnom regionu; Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka jednog antitela; dAb fragment (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), koji se sastoji od VH domena; i izolovani region za određivanje komplementarnosti (CDR), ili drugi fragmenti antitela koji se vezuju za epitop.
[0075] Dodatno, iako ta dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodiraju odvojeni geni, mogu da se spoje, pomoću rekombinantnih postupaka, sintetičkim veznikom koji im omogućava da budu napravljeni kao lanac od jednog proteina u kojem se VL i VH regioni sparuju kako bi se obrazovali monovalentni molekuli (poznati kao pojedinačan lanac Fv ("scFv"); videti, npr., Bird et al., Science 242:423-426, 1988; i Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci.85:5879-5883, 1988). Takva jednolančana antitela su takođe predviđena da budu obuhvaćena pojmom "antigen-vezujući fragment." Ovi antigen-vezujući fragmenti se dobijaju konvencionalnim tehnikama poznatim stručnjacima iz oblasti, a fragmenti se ispituju radi korisnosti na isti način kao i intaktna antitela.
[0076] Antigen-vezujući fragmenti takođe mogu biti inkorporisani u antitela pojedinačnog domena, maksitela, minitela, nanotela, intratela, dijatela, trijatela, tetratela, v-NAR i bis-scFv (videti,
npr., Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Antigen-vezujući fragmenti mogu biti nakalemljeni u rešetke na bazi polipeptida kao što je fibronektin tipa III (Fn3) (videti U.S. patentna prijava br.6,703,199, koji opisuje monotela polipeptida fibronektin).
[0077] Antigen-vezujući fragmenti mogu da budu inkorporisani u molekule pojedinačnog lanca koji obuhvataju par tandemskih Fv segmenata (VH-CH1-VH-CH1) koji, zajedno sa komplementarnim polipeptidima lakog lanca, obrazuju par antigen-vezujućih regiona (Zapata et al., Protein Eng.8:1057-1062, 1995; i U.S. patentna prijava br.5,641,870).
[0078] Pojam "monoklonalno antitelo" ili " kompozicija monoklonalnog antitela" kako se ovde koristi se odnosi na polipeptide, uključujući antitela i antigen-vezujuće fragmente koji suštinski imaju identičnu aminokiselinsku sekvencu ili su izvedeni iz istog genetskog izvora. Ovaj pojam takođe uključuje preparate molekula antitela pojedinačne molekulske kompozicije. Kompozicija monoklonalnog antitela ispoljava specifičnost pojedinačnog vezivanja i afinitet za određeni epitop.
[0079] Pojam "humano antitelo," kako se ovde koristi, uključuje antitela varijabilnih regiona u kojima su i okvirni i CDR regioni izvedeni iz sekvenci humanog porekla. Dodatno, ako antitelo sadrži konstantni region, konstantni region koji je takođe izveden iz takvih humanih sekvenci, npr., sekvenci humane nasledne linije, ili mutiranih verzija sekvenci humane nasledne linije ili antitela koje sadrži koncenzusne okvirne sekvence izvedene iz analize humanih okvirnih sekvenci, na primer, kao što je opisano u Knappik et al., J. Mol. Biol.296:57-86, 2000).
[0080] Humana antitela ovog otkrivanja mogu da uključuju aminokiselinske ostatke koje ne kodiraju humane sekvence (npr., mutacije uvedene nasumičnom mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo, ili konzervativnom supstitucijom za pospešivanje stabilnosti ili proizvodnje).
[0081] Pojam "prepoznaju" kako se ovde koristi se odnosi na antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje i stupa u interakciju (npr., vezuje) sa svojim epitopom, bilo da je taj epitop pravolinijski ili konformacioni. Pojam "epitop" se odnosi na mesto na antigenu za koje se antitelo ili antigen-vezujući fragment ovog otkrivanja konkretno vezuje. Epitopi mogu biti obrazovani i od susednih ili nesusednih aminokiselina koje postavlja tercijarno savijanje proteina. Epitopi koje obrazuju susedne aminokiseline se obično zadržavaju pri izlaganju denaturisanim rastvaračima, dok se epitopi koje obrazuje tercijarno savijanje obično gube pri lečenju denaturisanim rastvaračima. Epitop obično uključuje najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Postupci određivanja prostorne konformacije epitopa uključuju tehnike u ovoj oblasti, na primer, kristalografija x-zracima i 2-dimenzionalna nuklearna magnetna rezonanca (videti, npr., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, G. E. Morris, Ed. (1996)). "Paratop" je deo antitela koji prepoznaje epitop antigena.
[0082] Fraza "specifično vezuje" ili "selektivno vezuje," kada se koristi u kontekstu opisivanja interakcije između antigena (npr., proteina) i antitela, fragmenta antitela, vezujućeg agensa izvedenog iz antitela, se odnosi na reakciju vezivanja koja određuje prisustvo antigena u heterogenoj populaciji proteina i drugih bioloških sredstava, npr., u biološkom uzorku, npr., krvi, serumu, plazmi ili uzorku tkiva. Samim tim, u određenim naznačenim uslovima imunoeseja, antitela ili vezujući agensi sa određenom specifičnošću vezivanja se vezuju za određeni antigena najmanje dva puta u odnosu na pozadinu i suštinski se ne vezuju u značajnoj količini za druge antigene prisutne u uzorku. U jednom aspektu, u naznačenim uslovima imunoeseja, antitelo ili vezujući agens sa određenom specifičnošću vezivanja se vezuje za određeni antigen najmanje deset (10) puta u odnosu na pozadinu i suštinski se ne vezuju u značajnoj meri za druge antigene prisutne u uzorku. Specifično vezivanje za antitelo ili vezujući agens u takvim uslovima može da zahteva antitelo ili agens koji je izabran zbog svoje specifičnosti za određeni protein. Po želji ili kako je prigodno, ovaj izbor može da se postigne oduzimanjem antitela koja unakrsno reaguju sa molekulima drugih vrsta (npr., miša ili pacova) ili drugih podtipova. Alternativno, u nekim aspektima, antitela ili fragmenti antitela su izabrani da unakrsno reaguju sa određenim željenim molekulima.
[0083] Pojam "afinitet" kako se ovde koristi se odnosi na jačinu interakcije između antitela i antigena na pojedinačnim antigenskim mestima. U okviru svakog antigenskom mesta, varijabilni region antitela "krak" stupa u interakciju putem slabih nekovalentnih sila sa antigenom na brojnim mestima; što više interakcija, to je afinitet jači.
[0084] Pojam "izolovano antitelo" se odnosi na antitelo koje suštinski ne sadrži druga antitela sa različitim antigenskim specifičnostima. Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za jedan antigen može, međutim da unakrsno reaguje sa drugim antigenima. Štaviše, izolovano antitelo suštinski može da ne sadrži drugi ćelijski materijal i/ili hemikalije.
[0085] Pojam "sekvenca odgovarajuće nasledne linije" se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu ili podsekvencu humanog varijabilnog regiona koja deli identitet najviše određene aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskom sekvencom ili podsekvencom referentnog varijabilnog regiona u poređenju sa svim drugim poznatim aminokiselinskim sekvencama varijabilnog regiona koje kodiraju sekvence varijabilnog regiona imunoglobulina humane nasledne linije. Sekvenca odgovarajuće nasledne linije takođe može da se odnosi na aminokiselinsku sekvencu ili podsekvencu humanog varijabilnog regiona sa najvišim identitetom aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskom sekvencom ili podsekvencom referentnog varijabilnog regiona u poređenju sa svim drugim procenjenim aminokiselinskim sekvencama varijabilnog regiona. Sekvenca odgovarajuće nasledne linije može biti samo okvirni region, samo regioni za određivanje komplementarnosti, okvirni i regioni za određivanje komplementarnosti, varijabilni segment (kao što je prethodno definisano), ili druge kombinacije sekvenci ili podsekvenci koje obuhvataju varijabilni region. Identitet sekvence može da se odredi pomoću ovde opisanih postupaka, na primer, poravnavanjem dve sekvence pomoću BLAST, ALIGN, ili pomoću drugog algoritma poravnavanja poznatog u tehnici. Sekvenca aminokiseline ili nukleinske kiseline odgovarajuće humane nasledne linije može da ima najmanje oko 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence sa referentnom aminokiselinskom sekvenceom ili sekvencom nukleinske kiseline varijabilnog regiona.
[0086] Razni imunoesejski formati mogu da se koriste kako bi se izabrala antitela specifično imunoreaktivna sa određenim proteinom. Na primer, imunoeseji ELISA-e čvrste faze se rutinski koriste kako bi se izabrala antitela specifično imunoreaktivna sa proteinom (videti, npr., Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998), za opis imunoesejskih formata i uslova koji mogu da se koriste kako bi se odredila specifična imunoreaktivnost). Obično specifična ili selektivna reakcija vezivanja će proizvesti signal najmanje dva puta u odnosu na pozadinski signal i još uobičajenije najmanje 10 do 100 puta u odnosu na pozadinu.
[0087] Pojam "ravnotežna konstanta disocijacije (KD, M)" se odnosi na konstantu brzine disocijacije (kd, vreme-1) podeljenu konstantom brzine asocijacije (ka, vreme-1, M-1). Ravnotežne konstante disocijacije mogu da se izmere bilo kojim postupkom poznatim u stanju tehnike. Antitela ovog otkrivanja će generalno imati ravnotežnu konstantu disocijacije manju od oko 10<-7>ili 10<-8>M, na primer, manju od oko 10<-9>M ili 10<-10>M, u nekim aspektima, manju od oko 10<-11>M, 10<-12>M ili 10<-13>M.
[0088] Pojam "biološka raspoloživost" se odnosi na sistemsku dostupnost (tj., nivoe u krvi/plazmi) date količine leka koja se daje pacijentu. Biološka raspoloživost je apsolutni pojam koji označava merenje i vremena (brzine) i ukupne količine (opsega) leka koji dolazi u opštu cirkulaciju iz primenjenog doznog oblika.
[0089] Kako se ovde koristi, fraza "koji se suštinski sastoji od" se odnosi na rodove ili vrste aktivnih farmaceutskih agenasa koji su uključeni u postupak ili kompoziciju, kao i bilo kojih ekscipijenasa neaktivnih za predviđenu svrhu postupaka ili kompozicija. U nekim aspektima, fraza "koji se suštinski sastoji od" izričito isključuje uključivanje jednog ili više aktivnih agenasa pored anti-VP1 antitela ovog otkrivanja. U nekim aspektima, fraza "koji se suštinski sastoji od" izričito isključuje uključenje jednog ili više dodatnih aktivnih agenasa pored anti-VP1 antitela ovog otkrivanja i drugog agensa koji se daje u isto vreme.
[0090] Pojam "aminokiselina" se odnosi na koje se prirodno javljaju, sintetičke, i neprirodne aminokiseline, kao i aminokiselinske analoge i aminokiselinske mimetike koji funkcionišu slično kao I aminokiseline koje se prirodno javljaju. Aminokiseline koje se prirodno javljaju su one koje kodiraju genetski kod, kao i one aminokiseline koje su kasnije modifikovane, npr., hidroksiprolin, γkarboksiglutamat, i O-fosfoserin. Aminokiselinski analozi se odnose na jedinjenja koja imaju istu baznu hemijsku strukturu kao i aminokiseline koje se prirodno javljaju, tj., α-ugljenik koji se vezuje za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu, i R grupu, npr., homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi su modifikovali R grupe (npr., norleucin) ili modifikovane peptidne srži, ali su zadržali istu baznu hemijsku strukturu kao aminokiselina koja se prirodno javlja. Aminokiselinski mimetici se odnose na hemijska jedinjenja koja imaju strukturu koja je različita od opšte hemijske strukture aminokiselina, ali koja funkcioniše slično kao aminokiselina koja se prirodno javlja.
[0091] Pojam "konzervativno modifikovana varijanta" se primenjuje i na aminokiselinske sekvence i na sekvence nukleinske kiseline. U smislu određenih sekvenci nukleinske kiseline, konzervativno modifikovane varijante se odnose na one nukleinske kiseline koje kodiraju identične ili suštinski identične aminokiselinske sekvence, ili gde nukleinska kiselina ne kodira aminokiselinsku sekvencu, u suštinski identične sekvence. Zbog degeneracije genetskog koda, veliki broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina kodira bilo koji dati protein. Na primer, kodoni GCA, GCC, GCG i GCU svi kodiraju aminokiselinski alanin. Samim tim, na svakom položaju gde je alanin naznačen kodonom, taj kodon može bizi izmenjen u bilo koji od odgovarajućih opisanih kodona bez promene kodiranog polipeptida. Takve varijacije nukleinskih kiselina su "tihe varijacije," koje predstavljaju jednu vrstu konzervativno modifikovanih varijacija. Svaka ovde data sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid takođe opisuje svaku moguću tihu varijaciju nukleinske kiseline. Jedan stručnjak će prepoznati da svaki kodon u nukelinskoj kiselini (osim AUG, koji obično predstavlja kodon za metionin, i TGG, koji je obično samo kodon za triptofan) može biti modifikovan tako da obezbedi funkcionalno identičan molekul. Shodno tome, svaka tiha varijacija nukleinske kiseline koja kodira polipeptid je implicitna u svakoj opisanoj sekvenci.
[0092] Za polipeptidne sekvence, "konzervativno modifikovane varijante" uključuju pojedinačne supstitucije, brisanja ili dodavanja polipeptidnoj sekvenci što dovodi do supstitucije aminokiseline hemijski sličnom aminokiselinom. Tabele konzervativnih supstitucija koje obezbeđuju funkcionalnost sličnu aminokiselinama su dobro poznate u tehnici. Takve konzervativno modifikovane varijante su dodatne i ne isključuju polimorfne varijante, homologe međuvrsta, i alele. Sledećih osam grupa sadrži aminokiseline koje su konzervativne supstitucije za jednu drugu: 1) Alanin (A), Glicin (G); 2) Aspartinska kiselina (D), Glutaminska kiselina (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lizin (K); 5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); 6) Fenilalanin (F), Tirosin (Y), Triptofan (W); 7) Serin (S), Treonin (T); i 8) Cistein (C), Metionin (M) (videti, npr., Creighton, Proteins (1984)). U nekim aspektima, pojam "modifikacije konzervativnih sekvenci" se koristi da bi se označile aminokiselinske modifikacije koje ne utiču značajno ili ne menjaju karakteristike vezivanja antitela koje sadrži aminokiselinsku sekvencu.
[0093] Pojam "optimizovano" kako se ovde koristi se odnosi na nukleotidnu sekvencu koja je izmenjena kako bi kodirala aminokiselinsku sekvencu pomoću kodona koji su poželjni u proizvodnji ćelija ili organizama, generalno eukariotske ćelije, na primer, ćelije kvasca, Pichia ćelija, gljivična ćelija, Trichoderma ćelija, ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili humana ćelija. Optimizovana nukleotidna sekvenca je konstruisana tako da u potpunosti ili što je više moguće aminokiselinsku sekvencu koju originalno kodira polazna nukleotidna sekvenca, koja je takođe poznata kao "matična" sekvenca.
[0094] Pojmovi "procentualno identičan" ili "procentualni identitet," u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptidnih sekvenci, se odnosi na meru u kojoj su dve ili više sekvenci ili po sekvenci iste. Dve sekvence su "identične" ako imaju istu sekvencu aminokiselina ili nukleotida u regionu koji se poredi. Dve sekvence su "suštinski identične" ako dve sekvence imaju naznačen procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida koji su isti (tj., 60% identiteta, opciono 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% identiteta u naznačenom regionu, ili, kada nije naznačeno, u celoj sekvenci), u poređenju sa poravnatom korespondencijom u prozoru za poređenje, ili označenim regionom kao što je mereno pomoću jednog od sledećih algoritama za poređenje sekvenci ručnim poravnanjem i vizuelnim pregledom. Opciono, identitet postoji u regionu koji je dugačak najmanje oko 30 nukleotida (ili 10 aminokiselina), ili poželjnije u regionu koji u dužini ima 100 do 500 ili 1000 ili više nukleotida (ili 20, 50, 200 ili više aminokiselina).
[0095] Radi poređenja sekvenci, obično se jedna sekvenca ponaša kao referentna sekvenca, sa kojom se ispitivana sekvenca poredi. Prilikom korišćenja algoritma za poređenje sekvenci, u kompjuter se unose ispitivane i referentne sekvence, označavaju se koordinate podsekvenci, po potrebi, i označavaju se parametri programa za algoritam sekvenci. Mogu se koristiti uobičajeni parametri za program, ili mogu biti naznačeni alternativni parametri. Algoritam za poređenje sekvenci zatim izračunava identitete sekvenci u procentima za ispitivane sekvence u odnosu na referentnu sekvencu, na osnovu programskih parametara.
[0096] "Prozor za poređenje", kako se ovde koristi, uključuje pozivanje na segment bilo kog broja susednog položaja izabranog iz grupe koju čine od 20 do 600, obično oko 50 do oko 200, još više uobičajeno oko 100 do oko 150 u kojem sekvenca može da se poredi sa referentnom sekvencom istog broja susednog položaja nakon što su dve sekvence optimalno poravnate. Postupci poravnanja sekvenci radi poređenja su dobro poznati u tehnici. Optimalno poravnanje sekvenci radi poređenja može da se izvede, npr., algoritmom lokalne homologije Smith and Waterman, Adv. Appl. Math.2:482c (1970), algoritmom za poravnanje homologije Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.48:443 (1970), istraživanjem postupka sličnosti od Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), kompjuterizovanim primenama ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ili ručnim poravnanjem i vizualnim pregledom (videti, npr., Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2003).
[0097] Dva primera algoritama koji su pogodni za određivanje procentualnog identiteta sekvence i sličnosti sekvence su BLAST i BLAST 2.0 algoritmi, koji su opisani u Altschul et al., Nuc. Acids Res.
25:3389-3402, 1977; i Altschul et al., J. Mol. Biol.215:403-410, 1990, tim redom. Softver za izvođenje BLAST analiza je javno dostupan putem Nacionalnog centra za biotehnološke informacije. Ovaj algoritam uključuje prvo identifikovanje parova sekvenci sa visokim bodovanjem (HSP) identifikovanjem kratkih W reči dužine u željenoj sekvenci, koja ili odgovara ili ispunjava neki pozitivno vrednovan rezultat donje granice T kada je poravnat sa rečju iste dužine u sekvenci baze podataka. T se odnosi na susednu donju granicu rezultata reči (Altschul et al., supra). Ovi početni pogoci susedne reči deluju kao seme za pokretanje pretraga kako bi se pronašli duži HSP koji ih sadrže. Pogoci reči su produžene u oba pravca duž svake sekvence koliko god kumulativno poravnanje može da se poveća. Kumulativni rezultati se izračunavaju, pomoću, za nukleotidne sekvence, parametara M (nagradni rezultat za par odgovarajućih ostataka; uvek > 0) i N (kazneni rezultat za pogrešno sparene ostatke; uvek < 0). Za aminokiselinske sekvence, koristi se matrica bodovanja za izračunavanje kumulativnog rezultata. Produžetak pogodaka reči u svakom pravcu se zaustavlja kada: kumulativni rezultat poravnanja padne za količinu X od svoje najveće postignute vrednosti; kumulativni rezultat ide na nulu ili ispod, zbog nakupljanja jednog ili više negativnih bodovnih poravnanja ostataka; ili je dostignut kraj bilo koje sekvence. Parametri BLAST algoritma W, T, i X određuju osetljivost i brzinu poravnanja. BLASTN program (za nukleotidne sekvence) koristi kao početnu dužinu reči (W) 11, očekivanje (E) ili 10, M=5, N=-4 i poređenje obe grane. Za aminokiselinske sekvence, BLASTP program koristi kao početne dužinu reči od 3, i očekivanje (E) od 10, i BLOSUM62 matrica bodovanja (videti Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) poravnanja (B) 50, očekivanje (E) 10, M=5, N=-4, i poređenje obe grane.
[0098] BLAST algoritam takođe izvodi statističku analizu sličnosti između dve sekvence
(videti, npr., Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Jedna mera sličnosti koju obezbeđuje BLAST algoritam je najmanja verovatnoća zbira (P(N)), koja obezbeđuje oznaku verovatnoće za koju će se par između nukleotida ili aminokiselinskih sekvenci slučajno javiti. Na primer, smatra se da je nukelinska kiselina slična referentnoj sekvenci ako je najmanja verovatnoća zbira u poređenju ispitivane nukleinske kiseline sa referentnom nukleinskom kiselinom manja od oko 0,2, poželjnije manja od oko 0,01, i najpoželjnije manja od oko 0,001.
[0099] Procentualni identitet između dve aminokiselinske sekvence takođe može da se odredi pomoću algoritma E. Meyers i W. Miller, (Comput. Appl. Biosci.4:11-17, 1988) koji je inkorporisan u ALIGN program (verzija 2.0), pomoću tabele PAM120 masenih ostataka, penala za prazninu dužine od 12 i penala praznine od 4. Pored toga, procentualni identitet između dve aminokiselinske sekvence može da se odredi pomoću Needleman i Wunsch, (J. Mol. Biol.48:444-453, 1970), algoritma koji je inkorporisan u GAP program u GCG paketu softvera (koji je dostupan od Univerziteta južne Floride), korišćenjem ili BLOSUM 62 matrice ili PAM250 matrice, i mase praznine od 16, 14, 12, 10, 8, 6, ili 4 i mase dužine od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6.
[0100] Pored prethodno zabeleženog procenta identiteta sekvence, drugi pokazatelj da dve sekvence nukleinske kiseline ili polipeptida su suštinski identične je ta da polipeptid kojeg kodira prva nukleinska kiselina je imunološki unakrsno reaktivan sa antitelima koja se gaje nasuprot polipeptidu koji kodira druga nukleinska kiselina, kao što je opisano u nastavku. Samim tim, polipeptid je obično suštinski identičan drugom polipeptidu, na primer, tamo gde e ta dva peptida razlikuju samo konzervativnim supstitucijama. Drugi pokazatelj je da su te dve sekvence nukleinske sekvence suštinski identične je da dva molekula ili njihovi komplementi međusobno hibridizuju pod strogim uslovima, kao što je opisano u nastavku. Još jedan pokazatelj da su dve sekvence nukleinske kiseline suštinski identične je da se isti primeri mogu koristiti za umnožavanje sekvence.
[0101] Pojam "nukelinska kiselina" se ovde koristi naizmenično sa pojmom "polinukleotid" i odnosi se na deokisribonukleotide ili ribonukleotide i njihove polimere ili u jedno- ili dvostruko razgranatom obliku. Pojam obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate nukleotidne analoge ili modifikovane ostatke srži ili veze, koji su sintetički, koji se prirodno javljaju, i koji se ne javljaju prirodno, koji imaju slična svojstva vezivanja kao referentna nukleinska kiselina, i koji se metabolizuju na sličan način kao referentni nukleotidi. Primeri takvih analoga uključuju, bez ograničenja, fosforotioate, metil fosfonate, hiralnno-metilne fosfonate, 2-O-metilne ribonukleotide, peptidno-nukleinske kiseline (PNA).
[0102] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, određena sekvenca nukleiske kiseline takođe dirketno obuhvata njihove konzervativno modifikovane varijante (npr., degenerisane kodonske supstitucije) I komplementarne sekvence, kao i sekvencu koja je eksplicitno naznačena. Konkretnom, kako je u nastavku detaljnije opisano, degenerisane kodonske supstitucije mogu da se postignu generisanjem sekvenci u kojima trećina položaja jednog ili više odabranih (ili svih) kodona je supstituisana mešanimbaznim i/ili deoksiinozinskim ostacima (Batzer et al., (1991) Nucleic Acids Res.19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem.260:2605-2608; i Rossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98).
[0103] Pojam "operabilno vezana" u kontekstu nukleinskih kiselina se odnosi na funkcionalnu vezu između dva ili više polinukleotidnih (npr., DNK) segmenata. Obično se odnosi na funkcionalnu vezu transkripcione regulatorne sekvence i transkribovane sekvence. Na primer, promoterska ili pojačivačka sekvenca je operabilno vezana za kodirajuću sekvencu ako stimuliše ili modulira transkripciju kodirajuće sekvence u odgovarajućoj ćeliji domaćina ili drugom sistemu ekspresije. Generalno, promoterske transkripcione regulatorne sekvence koje su operabilno vezane za transkrinovanu sekvencu su fizički susedne u odnosu na transkribovanu sekvencu, tj., deluju kao cis-. Ipak, neke transkripcione regulatorne sekvence, kao što su pojačivači, ne moraju fizički biti susedne ili locirane u tesnoj blizini kodirajuće sekvence čiju transkripciju pojačavaju.
[0104] Pojmovi "polipeptid" i "protein" se ovde naizmenično koriste kako bi se označio polimer aminokiselinskih ostataka. Pojmovi se primenjuju na aminokiselinske polimere u kojoj jedan ili više aminokiselinskih ostataka predstavljaju veštački hemijski mimetik odgovarajuće aminokiselina koja se prirodno javlja, kao i na polimere aminokiselina kojse prirodno javljaju i polimer aminokiselina koje se prirodno ne javljaju. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, određena polipeptidna sekvenca takođe u potpunosti obuhvata njene konzervativno modifikovane varijante.
[0105] Pojam "subjekat" uključuje humane i nehumane životinje. Nehumane životinje uključuju sve kičmenjake, npr. sisare i nesisare, kao što su nehumani primati, ovce, psi, krave, pilići, vodozemci, i reptili. Osim kada je naznačeno, pojmovi "pacijent" ili "subjekat" se koriste naizmenično.
[0106] Pojmovi "BKV" ili "BK virus" se odnose na člana porodice
Polyomaviridae, roda Orthopoliomavirus. Poliomavirusi su ikosaedrični, neumotani, dvostruko razgranati DNK virusi sa genomom od približno 5,000 baznih parova. Mere se približno 40-45 nM u prečniku (Bennett et al., Microbes and Infection.2012:14(9):672-683).
[0107] "JCV" ili "JC virus" se odnosi na člana porodice Polyomaviridae, roda Orthopoliomavirus. JCV se odnosi na BKV, i takođe je ikosaedričnan, neumotan, dvostruko razgranati DNK virus sa genomom od približno 5,000 baznih parova. Mere približno 40-45 nM u prečniku (Johne et al., Arch. Virol.
2011;156(9):1627-1634).
[0108] Pojmovi "BKV nefropatija" ili "nefropatija povezana sa BKV" ili "BKVAN" se odnose na zapaljensku intersticijalnu nefropatiju koja je nastala kao rezultat litične infekcije sa BKV, koju karakterišu virusne citopatogene promene i virusna genska ekspresija, prevashodno u renalnom tubularnom epitelijumu.
[0109] Pojam "VP1" se odnosi na glavni protein podjediničnog kapsida poliomavirusa. "VP1 pentameri" se sastoje od pet monomera VP1.
Tabela 1-VP1 sekvence
[0110] "Čestice poput virusa" ili "VLP" predstavljaju skup VP1 pentamera u virusnim kapsidima. VLP su sastavljene od 72 VP1 pentamera. VLP su strukturno veoma slične stvarnom virusu ali im nedostaju manji kapsidni proteini (VP2 i VP3) kao i virusni DNK genom, te stoga nisu infektivni. VLP su korisne kao virusni epitopi i predstavljeni su u sličnoj konformaciji stvarnom virusu.
[0111] "IC50" (polumaksimalna inhibitorna koncentracija) se odnosi koncentraciju određenog antitela koje uključuje polovinu puta signala (50%) između kontrole osnovne linije i maksimalnog mogućeg signala. Na primer, IC50 je koncentracija antitela na kojoj 50% dostupnih mesta vezivanja na VP1 antigenu je zauzeto.
[0112] "EC50" (polumaksimalna efektivna koncentracija) se odnosi na koncentraciju određenog antitela koje izaziva odgovor na pola puta (50%) između kontrole osnovne linije i maksimalnog mogućeg efekta nakon konkretnog izlaganja ili lečenja. Na primer, EC50 je koncentracija antitela na pri kojoj se virusna infekcija neutrališe za 50%.
[0113] "EC90" se odnosi na koncentraciju određenog antitela koje indukuje odgovor koji odgovara 90% maksimalnog mogućeg efekta nakon konkretnog izlaganja ili lečenja. Na primer, EC90 je koncentracija antitela na kojoj se virusna infekcija neutrališe za 90%.
[0114] "Neutralizacija" se odnosi na inhibiciju virusne infekcije ćelije domaćina, kao što je pokazano odsustvom eksprimiranja virusnih gena. Bez vezivanja za bilo koju teoriju, mehanizmi neutralizacije određenim antitelom uključuju blokiranje interakcije virusnih kapsidnih proteina receptorima površinskih ćelija ili prekidom bilo koje faze unosa i prometnog postupka pre isporuke virusnog genoma jezgru ćelije domaćina.
[0115] Kako se ovde koriste, pojmovi "leče," "koji se leče," ili "lečenje" bilo koje bolesti ili poremećaja se odnosi u jednom aspektu, na poboljšanje bolesti ili poremećaja (tj., usporavanje ili zaustavljanje ili smanjenje razvoja bolesti ili najmanje jednog njegovog kliničkog simptoma). U drugom aspektu, "leče," "koji se leče," ili "lečenje" se odnosi na ublažavanje najmanje jednog fizičkog parametre koji uključuje one koje pacijentu nisu vidljivi. U jednom drugom aspektu, "leče," "koji se leče," ili "lečenje" se odnosi na moduliranje bolesti ili poremećaja, ili fizički, (npr., stabilizacijom simptoma koji se ne vidi), fiziološki, (npr., stabilizacijom fizičkog parametra), ili oboje.
[0116] Fraza "koji smanjuje verovatnoću" se odnosi na odlaganje početka ili razvoja ili napredovanja bolesti, infekcije ili poremećaja.
[0117] Pojam "terapeutski prihvatljiva količina" ili "terapeutski efektivna doza" se naizmenično odnosi na količinu koja je dovoljna da dovede do željenog rezultata (tj., smanjenja veličine tumora, inhibicije rasta tumora, sprečavanja metastaze, inhibicije ili sprečavanja virusne, bakterijske, gljivične ili parazitske infekcije). U nekim aspektima, terapeutski prihvatljiva količina ne izaziva i ne uzrokuje neželjena dejstva. Terapeutski prihvatljiva količina može da se odredi prvim davanjem male doze, a zatim postepenim povećavanjem doze do postizanja željenog efekta. "Profilaktički efektivna doza," i "terapeutski efektivna doza," molekula ovog otkrivanja može da spreči početak, ili može da dovede do smanjenja ozbiljnosti, tim redom, simptoma bolesti, koji uključuju simptome povezane sa infekcijom polioma virusom.
[0118] Pojam "zajedno primenjuje" se odnosi na istovremeno prisustvo dva aktivna agensa u krvi pojedinca. Aktivni agensi koji se daju zajedno mogu da se isporučuju istovremeno ili sekvencijalno.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0119]
Fig.1A-1D grafički predstavlja merenja afiniteta za anti-VP1 antitela na VP1 pentamerima za serotipe I-IV BKV SET ispitivanjem.
Fig.2 predstavlja tabelu SET vrednosti afiniteta (KD) za anti-VP1 antitela na VP1 pentamerima za serotipe I-IV BKV.
Fig.3A-3E grafički predstavlja merenja afiniteta za anti-VP1 antitela na VP1 pentamerima ili VLP za serotipe I-IV BKV putem Biacore.
Fig.4 predstavlja grafikon vezivanja anti-VP1 antitela za VLP serotipa I BKV kako je izmereno ELISA-om.
Fig.5 predstavlja grafikon vezivanja anti-VP1 antitela za VLP serotipa I BKV V kako je izmereno ELISA-om.
Fig.6 predstavlja grafikon vezivanja anti-VP1 antitela za pentamere VP1 serotipa I BKV V kako je izmereno ELISA-om.
Fig.7 je tabela IC50 vrednosti nastalih ELISA-om za vezivanje anti-VP1 antitela za pentamere VLP ili VP1 za serotipove I i IV BKV.
Fig.8 predstavlja grafikon vezivanja anti-VP1 antitela za VLP serotipa I BKV kako je izmereno ELISA-om.
Fig.9 je tabela IC50 vrednosti nastalih ELISA-om za vezivanja anti-VP1 antitela za VLP serotipa I BKV. Fig.10 predstavlja grafikon vezivanja anti-VP1 antitela za VLP JC virusa kako je izmereno ELISA-om. Fig.11 je tabela IC50 vrednosti nastalih ELISA-om za vezivanje anti-VP1 antitela za VLP JCV.
Fig.12A-B prikazuje dva blota. Gornji panel (Fig.12A) predstavlja Western blot koji ne demonstrira vezivanje anti-VP1 antitela za denaturisane BKV VP 1. Donji panel (Fig.12B) predstavlja dot-blot nedenaturisanih pentamera BKV VP1, čime se demonstrira vezivanje anti-VP1 antitela za nedenaturisane VP1 pentamere.
Fig.13A-13F grafički predstavlja vezivanje anti-VP1 antitela za pentamere VP1 serotipa I BKV putem Biacore, ali te tačkaste mutacije u VP1 mogu da prekinu vezivanje.
Fig.14 je tabela u kojoj su ukratko prikazani ključni ostaci za vezivanje identifikovani u epitopima anti-VP1 antitela.
Fig.15 predstavlja grafikon anti-VP1 antitela koji neutrališu infekciju serotipom I BKV.
Fig.16 predstavlja grafikon anti-VP1 antitela koji neutrališu infekciju serotipom II BKV.
Fig.17 predstavlja grafikon anti-VP1 antitela koji neutrališu infekciju serotipom III BKV.
Fig.18 predstavlja grafikon anti-VP1 antitela koji neutrališu infekciju serotipom IV BKV.
Fig.19 je tabela u kojoj je ukratko predstavljena aktivnost neutralisanja (EC50 i EC90) anti-VP1 antitela na serotipovima I-IV BKV i JC virusa.
Fig.20 predstavlja grafikon anti-VP1 antitela koja neutrališu infekciju serotipovima I, II, I IV BKV. Fig.21 je tabela koja ukratko predstavlja aktivnost neutralisanja (EC50 i EC90) anti-VP1 antitela na serotipovima I-IV BKV.
Fig.22 predstavlja grafikon anti-VP1 antitela koji neutrališu infekciju BKV serotipa I.
Fig.23 je tabela u kojoj je ukratko prikazana neutrališuća aktivnost (EC50 i EC90) anti-VP1 antitela na BKV serotipa I.
Fig.24 predstavlja grafikon anti-VP1 antitela koja neutrališu infekciju JCV.
Fig.25 predstavlja grafikon anti-VP1 antitela koja neutrališu infekciju JCV.
Fig.26 predstavlja tabelu koja ukratko prikazuje aktivnost neutralisanja (EC50 i EC90) anti-VP1 antitela na JCV infekciju.
Fig.27 predstavlja tabelu afiniteta antitela P8D11 na VLP JC virusa i VLP koje sadrže tačkaste mutacije.
Fig.28 predstavlja mapiranje epitopa deuterijumske razmene P8D11 Fab vezanog za pentamere BKV VP1.
Fig.29A je tabela koja prikazuje kontaktne ostatke anti-BKV antitela u EF petlji kada se određene mutacije uvode skeniranjem alanina. Fig.29B-29C prikazuje SPR grafikone vezivanja anti-BKV antitela za divlji tip i mutirane ostatke u VP1.
Fig.30 predstavlja kristalnu strukturu X-zraka P8D11 u kompleksu sa BKV VP1 pentamerom.
Fig.31A-B je grafički prikaz kako P8D11 stupa u kontakt sa ostacima VP1 pentamera.
DETALJAN OPIS
[0120] Ovo otkrivanje obezbeđuje za antitela, fragmente antitela (npr., antigen-vezujuće fragmente), koja vezuju i neutrališu BKV. Određenije, ovo otkrivanje je usmereno na antitela i fragmente antitela (npr., antigen-vezujuće fragmente) koji vezuju za VP1 proteine, i neutrališu virusnu infekciju nakon takvog vezivanja. Dodatno, ovo otkrivanje obezbeđuje antitela koja imaju poželjne farmakokinetičke karakteristike i druge poželjne atribute, i samim tim mogu da se koriste za smanjenje verovatnoće od ili lečenja nefropatije povezane sa BK virusom (npr. BKVAN). Ovo otkrivanje dodatno obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju antitela i postupke pravljenja i upotrebe takvih farmaceutskih kompozicija za sprečavanje i lečenje infekcije polioma virusom i povezanih poremećaja.
Anti-VP1 Antitela
[0121] Ovo otkrivanje obezbeđuje za antitela ili fragmente antitela (npr., antigen-vezujuće fragmente) koji se specifično vezuju za VP1. Antitela ili fragmenti antitela (npr., antigen-vezujući fragmenti) ovog otkrivanja uključuju, ali bez ograničenja na, humana monoklonalna antitela ili njihove fragmente, izolovane kao što je opisano, u primerima u nastavku.
[0122] Ovo otkrivanje u određenim aspektima obezbeđuje antitela ili fragmente antitela (npr., antigenvezujuće fragmente) koji se konkretno vezuju za VP1, pri čemu pomenuta antitela ili fragmenti antitela (npr., antigen-vezujući fragmenti) obuhvataju VH domen sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:12, 32, 52, 72, 92, 112, 132, 152, 172, 192, 212, 232, 252, 272, 292, 312, 328, 348, 362, 376, 390, 404, 418, 432, 446, 460, 474, i 488 (tabela 2). Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje antitela ili fragmente antitela (npr., antigen-vezujuće fragmente) koji se specifično vezuju za VP1, pri čemu pomenuta antitela ili fragmenti antitela (npr., antigen-vezujući fragmenti) obuhvataju VH CDR sa aminokiselinskom sekvencom bilo kog od CDR VH navedenih u tabeli 2. U određenim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje antitela ili fragmente antitela (npr., antigen-vezujuće fragmente) koji se specifično vezuju za VP1, pri čemu pomenuta antitela obuhvataju (ili alternativno, se sastoje od) jednog, dva, tri, ili više CDR Vh sa aminokiselinskom sekvencom bilo kog od CDR VH navedenih u tabeli 2.
[0123] Ovo otkrivanje obezbeđuje antitela ili fragmente antitela (npr., antigen-vezujuće fragmente) koji se specifično vezuju za VP1, pri čemu pomenuta antitela ili fragmenti antitela (npr., antigen-vezujući fragmenti) obuhvataju VL domen sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 22, 42, 62, 82, 102, 122, 142, 162, 182, 202, 222, 242, 262, 282, 302, 320, 338, 355, 369, 383, 397, 411, 425, 439, 453, 467, 481, i 495 (tabela 2). Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje antitela ili fragmente antitela (npr., antigen-vezujuće fragmente) koji se specifično vezuju za VP1, pri čemu pomenuta antitela ili fragmenti antitela (npr., antigen-vezujući fragmenti) obuhvataju CDR VL sa aminokiselinskom sekvencom bilo kog od CDR VL navedenih u tabeli 2. Određenije, ovo otkrivanje obezbeđuje antitela ili fragmente antitela (npr., antigen-vezujuće fragmente) koji se specifično vezuju za VP1, pri čemu pomenuta antitela ili fragmenti antitela (npr., antigen-vezujući fragmenti) obuhvataju (ili se alternativno, sastoje od) jednog, dva, tri ili više CDR VL sa aminokiselinskom sekvencom bilo kog od CDR VL navedenih u tabeli 2.
[0124] Druga antitela ili fragmenti antitela (npr., antigen-vezujući fragmenti) ovog otkrivanja uključuju aminokiseline koje su mutirane, a opet imaju najmanje 60, 70, 80, 90 ili 95 procentualnog identiteta u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u sekvencama opisanim u tabeli 2. U nekim aspektima, uključuje mutantne aminokiselinske sekvence pri čemu je najviše 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina mutirano u CDR regionima u poređenju sa CDR regionima prikazanim u sekvenci opisanoj u tabeli 2.
[0125] Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju VH, VL, teški lanac pune dužine, i laki lanac pune dužine antitela koja se specifično vezuju za VP1. Takve sekvence nukleinske kiseline mogu biti optimizovane za ekspresiju u ćelijama sisara.
Tabela 2: anti- VP1 antitela
[0126] Druga antitela ovog otkrivanja uključuju ona u kojima aminokiseline ili nukelinske kiseline koje kodiraju te aminokiseline su mutirana; a opet imaju najmanje 60, 70, 80, 90 ili 95 procentualnog identiteta sa sekvencom koja je opisana u tabeli 2. U nekim aspektima, uključuje mutantne aminokiselinske sekvence pri čemu najviše 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina je mutirano u varijabilnim regionima u poređenju sa varijabilnim regionima prikazanim u sekvenci opisanoj u tabeli 2, pri čemu se suštinski zadržava ista terapeutska aktivnost.
[0127] Budući da svako od ovih antitela može da se vezuje za VP1, VH, VL, sekvence lakog lanca pune dužine i sekvence teškog lanca pune dužine (aminokiselinske sekvence i nukleotidne sekvence koje kodiraju aminokiselinske sekvence) mogu da se "pomešaju i upare" kako bi se napravila druga VP1-vezujuća antitela. Takva "pomešana i uparena" VP 1-vezujuća antitela mogu da se ispituju pomoću ispitivanja vezivanja poznatih u tehnici (npr., ELISA, i druga ispitivanja opisana u odeljku sa primerima). Kada se ovi lanci pomešaju i upare, VH sekvenca iz određenog VH/VL uparivanja bi trebalo da zameni strukturno sličnu VH sekvencu. Slično tome sekvenca teškog lanca pune dužine iz uparivanja određenog teškog lanca pune dužine / lakog lanca pune dužine bi trebalo da se zameni sa strukturno sličnom sekvencom teškog lanca pune dužine. Slično tome, VL sekvenca iz određenog uparivanja VH/VL bi trebalo da se zameni strukturno sličnom VL sekvencom. Slično tome, sekvenca lakog lanca pune dužine iz uparivanja određenog teškog lanaca pune dužine / lakog lanca pune dužine bi trebalo da se zameni strukturno sličnom sekvencom lakog lanca pune dužine. Shodno tome, u jednom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje za izolovano monoklonalno antitelo za njegov antigen-vezujući region sa: varijabilnim regionom teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:12, 32, 52, 72, 92, 112, 132, 152, 172, 192, 212, 232, 252, 272, 292, 312, 328, 348, 362, 376, 390, 404, 418, 432, 446, 460, 474, i 488 (tabela 2); i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 22, 42, 62, 82, 102, 122, 142, 162, 182, 202, 222, 242, 262, 282, 302, 320, 338, 355, 369, 383, 397, 411, 425, 439, 453, 467, 481 i 495 (tabela 2); pri čemu se antitelo specifično vezuje za VP1.
[0128] U drugom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje (i) izolovano monoklonalno antitelo sa: teškim lancem pune dužine koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je optimizovana za ekspresiju u ćeliji sisara izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 14, 34, 54, 74, 94, 114, 134, 154, 174, 194, 214, 234, 254, 274, 294, 313 i 330; i laki lanac pune dužine koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je optimizovana za ekspresiju u ćeliji sisara izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 24, 44, 64, 84, 104, 124, 144, 164, 184, 204, 224, 244, 264, 284, 304, 321, 340, ili (ii) funkcionalni protein koji obuhvata njegov antigen-vezujući protein.
[0129] U drugom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje VP1-vezujuća antitela koja obuhvataju CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i lakog lanca kao što je opisano u tabeli 2, ili njihove kombinacije.
Aminokiselinske sekvence CDR 1 VH antitela su prikazane u SEQ ID NO: 6, 26, 46, 66, 86, 106, 126, 146, 166, 186, 206, 226, 246, 266, 286, 306, 322, 342, 356, 370, 384, 398, 412, 426, 440, 454, 468, i 482. Te aminokiselinske sekvence iz CDR2 VH antitela su prikazane u SEQ ID NO: 7, 27, 47, 67, 87, 107, 127, 147, 167, 187, 207, 227, 247, 267, 287, 307, 323, 343, 357, 371, 385, 399, 413, 427, 441, 455, 469, i 483. Aminokiselinske sekvence CDR3 VH antitela su prikazane u SEQ ID NO: 8, 28, 48, 68, 88, 108, 128, 148, 168, 188, 208, 228, 248, 268, 288, 308, 324, 344, 358, 372, 386, 400, 414, 428, 442, 456, 470, i 484. Aminokiselinske sekvence iz CDR1 VL antitela su prikazane u SEQ ID NO: 16, 36, 56, 76, 96, 116, 136, 156, 176, 196, 216, 236, 256, 276, 296, 314, 332, 349, 363, 377, 391, 405, 419, 433, 447, 461, 475 i 489. Aminokiselinske sekvence iz CDR2 VL antitela su prikazane u SEQ ID NO 17, 37, 57, 77, 97, 117, 137, 157, 177, 197, 217, 237, 257, 277, 297, 315, 333, 350, 364, 378, 392, 406, 420, 434, 448, 462, 476 i 490. Aminokiselinske sekvence iz CDR3 VL antitela su prikazane u SEQ ID NO: 18, 38, 58, 78, 98, 118, 138, 158, 178, 198, 218, 238, 258, 278, 298, 316, 334, 351, 365, 379, 393, 407, 421, 435, 449, 463, 477 i 491.
[0130] Imajući u vidu da svako od ovih antitela može da se vezuje za VP1 i da je antigen-vezujuća specifičnost obezbeđena prevashodno od strane CDR1, 2 i 3 regiona, sekvence CDR1, 2 i 3 VH i CDR1, 2 i 3 VL sekvence mogu biti "pomešane i uparene" (tj., CDR od različitih antitela mogu biti pomešani i upareni, mada svako antitelo mora da sadrži CDR1, 2 i 3 VH i CDR1, 2 i 3 VL kako bi se napravili drugi VP1-vezujući molekuli. Takva "pomešana i uparena" VP1-vezujuća antitela mogu da se ispituju pomoću ispitivanja vezivanja poznatih u tehnici i onih opisanih u primerima (npr., ELISA). Kada su VH CDR sekvence pomešane i uparene, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvenca iz određene VH sekvence bi trebalo da se zameni strukturno sličnom CDR sekvencom(ama). Slično tome, kada su VL CDR sekvence pomešane i uparene, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvenca iz određene VL sekvence bi trebalo da se zameni strukturno sličnim CDR sekvencom(ama). Stručnjaku iz oblasti bi trebalo da bude jasno da nove VH i VL sekvence mogu biti napravljene supstituisanjem jednog ili više sekvenci VH i/ili VL CDR regiona sa strukturno sličnim sekvencama iz CDR sekvenci prikazanih za monoklonalna antitela ovog otkrivanja.
[0131] Shodno tome, ovo otkrivanje obezbeđuje izolovano monoklonalno antitelo ili njegov antigenvezujući region koji obuhvata teški lanac CDR1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 6, 26, 46, 66, 86, 106, 126, 146, 166, 186, 206, 226, 246, 266, 286, 306, 322, 342, 356, 370, 384, 398, 412, 426, 440, 454, 468, i 482; CDR2 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 7, 27, 47, 67, 87, 107, 127, 147, 167, 187, 207, 227, 247, 267, 287, 307, 323, 343, 357, 371, 385, 399, 413, 427, 441, 455, 469, i 483; CDR3 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 8, 28, 48, 68, 88, 108, 128, 148, 168, 188, 208, 228, 248, 268, 288, 308, 324, 344, 358, 372, 386, 400, 414, 428, 442, 456, 470, i 484; CDR1 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 16, 36, 56, 76, 96, 116, 136, 156, 176, 196, 216, 236, 256, 276, 296, 314, 332, 349, 363, 377, 391, 405, 419, 433, 447, 461, 475 i 489; CDR2 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 17, 37, 57, 77, 97, 117, 137, 157, 177, 197, 217, 237, 257, 277, 297, 315, 333, 350, 364, 378, 392, 406, 420, 434, 448, 462, 476 i 490; i laki lanac CDR3 koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 18, 38, 58, 78, 98, 118, 138, 158, 178, 198, 218, 238, 258, 278, 298, 316, 334, 351, 365, 379, 393, 407, 421, 435, 449, 463, 477 i 491; pri čemu se antitelo specifično vezuje za VP1.
[0132] U određenim aspektima, antitelo koje se specifično vezuje za VP1 predstavlja antitelo ili fragment antitela (npr., antigen-vezujući fragment) koji je opisan u tabeli 2.
1. Identifikacija epitopa i antitela koja se vezuju za isti epitop
[0133] Ovo otkrivanje obezbeđuje antitela i fragmente antitela (npr., antigen-vezujuće fragmente) koji se vezuju za epitop iz VP 1. U određenim aspektima antitela i fragmenti antitela mogu da se vezuju za isti epitop unutar sva četiri serotipa BKV i/ili JCV.
[0134] Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje antitela i fragmente antitela (npr., antigen-vezujuće fragmente) koji se vezuju za isti epitop kao anti-VP1 antitela opisana u tabeli 2. Dodatna antitela i fragmenti antitela (npr., antigen-vezujući fragmenti) samim tim mogu biti identifikovani na osnovu mogućnosti da unakrsno stupaju u kompeticiju (npr., da kompetetivno inhibiraj uvezivanje, na statistički značajan način) sa drugim antitelima u ispitivanjima vezivanja. Mogućnost ispitivanog antitela da inhibira vezivanje antitela i fragmenata antitela (npr., antigen-vezujućih fragmenata) ovog otkrivanja sa VP1 (npr., humani BKV ili JCV VP1) pokazuje da ispitivano antitelo može da uđe u kompeticiju sa tim antitelom ili fragmentom antitela (npr., antigen-vezujućim fragmentima) za vezivanje sa VP 1; takvo antitelo može, prema neograničavajućoj teoriji, da se vezuje za isti ili povezani (npr., strukturno sličan ili prostorno približan) epitop na VP1 kao antitelo ili fragment antitela (npr., antigen-vezujući fragmenti) sa kojima stupa u kompeticiju. U određenom aspektu, antitelo koje se vezuje za isti epitop na VP1 kao antitela ili fragmenti antitela (npr., antigen-vezujući fragmenti) ovog otkrivanja je humano ili humanizovano monoklonalno antitelo. Takva humana ili humanizovana monoklonalna antitela mogu biti pripremljena i izolovana kako je ovde opisano.
2. Dodatna izmena okvira Fc regiona
[0135] Ovo otkrivanje je otkrilo specifična anti-VP1 antitela. Ova antitela obuhvataju modifikovana antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente da dodatno obuhvataju modifikacije okvirnih ostataka unutar VH i/ili VL, npr. kako bi se poboljšala svojstva antitela. Obično takve okvirne modifikacije su načinjena kako bi se smanjila imunogenost antitela. Na primer, jedan pristup je da se "povratno mutira" jedan ili više okvirnih ostataka u odgovarajuću sekvencu nasledne linije. Konkretnije, antitelo koje je podvrgnuto somatskoj mutaciji može da sadrži okvirne ostatke koji se razlikuju od sekvence nasledne linije iz koje je antitelo izvedeno. Takvi ostaci mogu biti identifikovani poređenjem okvirnih sekvenci antitela sa sekvencama nasledne linije iz kojih je antitelo izvedeno. Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju nasledne linije, somatske mutacije mogu biti "povratno mutirane" u sekvencu nasledne linije, na primer, mutagenezom usmerenom na mesta. Takva "povratno mutirana" antitela su takođe predviđena da budu obuhvaćena.
[0136] Drugi tip okvirne modifikacije uključuje mutiranje jednog ili više ostataka unutar okvirnog regiona, ili čak unutar jednog ili više CDR regiona, radi uklanjanja epitopa T-ćelija da bi se time smanjila potencijalna imunogenost antitela. Ovaj pristup se takođe odnosi na "deimunizaciju" i detaljno su je u U.S. patentnoj prijavi br.2003/0153043 opisali Carr et al.
[0137] Pored ili u zamenu za modifikacije načinjene unutar okvira ili CDR regiona, antitela mogu biti konstruisana tako da uključuju modifikacije unutar Fc regiona, obično kako bi se izmenilo jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela, ako što je poluživot u serumu, fiksacija komplementa, vezivanje Fc receptora, i/ili ćelijska citotoksičnost zavisna od antigena. Dodatno, antitelo može biti hemijski modifikovano (npr., jedna ili više hemijskih grupa može biti pričvršćena za antitelo) ili biti modifikovano radi menjanja njegove glikosilacije, ponovo kako bi se izmenilo jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela. Svaki od ovih aspekata je dodatno detaljno opisan u nastavku.
[0138] U jednom aspektu, zglobni region CH1 se modifikuje tako da je broj cisteinskih ostataka u zglobnom regionu izmenjen, npr., povećan ili smanjen. Ovaj pristup su dodatno opisali Bodmer et al u U.S. patentu br.5,677,425. Broj cisteinskih ostataka u zglobnom regionu CH1 je izmenjen da, na primer, olakša skup lakih i teških lanaca ili da poveća ili smanji stabilnost antitela.
[0139] U drugom aspektu, Fc zglobni region antitela je mutiran tako da smanji biološki poluživot antitela. Konkretnije, jedna ili više aminokiselinskih mutacija se uvodi u region interfejsa CH2-CH3 domena FC-zglobnog fragmenta tako da antitelo oštećuje vezivanje proteina A Staphylococcyl (SpA) u odnosu na vezivanje nativnog Fc-zglobnog domena SpA. Ovaj pristup su dodatno detaljnije opisali Ward et al u U.S. patentu br.6,165,745.
[0140] Opet u drugim aspektima, Fc region je izmenjen zamenom najmanje jednog aminokiselinskog ostatak sa različitim aminokiselinskim ostatkom kako bi se izmenile efektorske funkcije antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselina može biti zamenjena različitim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima izmenjeni afinitet za efektorski ligand ali zadržava antigen-vezujuću mogućnost matičnog antitela. Efektorski ligand za koji je afinitet izmenjen može biti, na primer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa. Ovaj pristup su u, npr., oba U.S. patenta br.5,624,821 i 5,648,260, opisali Winter et al.
[0141] U drugom aspektu, jedna ili više aminokiselina izabrana iz aminokiselinskih ostataka može biti zamenjena različitim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo menja C1q vezivanje i/ili smanjenu ili ukinutu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). Ovaj pristup su u, npr., U.S. patentima br.
6,194,551 opisali Idusogie et al.
[0142] U drugom aspektu, jedan ili više aminokiselinskih ostataka su izmenjeni kako bi se time izmenila mogućnost antitela da se fiksira komplement. Ovaj pristup su u, npr., PCT objavi WO 94/29351 opisali Bodmer et al. U konkretnom aspektu, jedna ili više aminokiselina antitela ili njegov antigen-vezujući fragment ovog otkrivanja su zamenjeni jednim ili više alotipskih aminokiselinskih ostataka, za IgG1 podklasu i kappa izotip. Alotipski aminokiselinski ostaci takođe uključuju, ali bez ograničenja na, konstantni region teškog lanca IgG1, IgG2, i IgG3 podklasa kao i konstantni region lakog lanca kappa izotipa kao što su to opisali Jefferis et al., MAbs.1:332-338 (2009).
[0143] Opet u drugom aspektu, Fc region je modifikovan tako da poveća mogućnost antitela da posreduje u citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i/ili da poveća afinitet antitela za Fcy receptor modifikovanjem jedne ili više aminokiselina. Ovaj pristup je u, npr., PCT objavi WO 00/42072 opisao Presta. Štaviše, mesta vezivanja na humanim IgG1 for FcyRl, FcyRII, FcyRIII i FcRn su mapirana i varijante sa poboljšanim vezivanjem su opisane (videti Shields et al., J. Biol. Chem.276:6591-6604, 2001).
[0144] U još drugom aspektu, glikosilacija antitela je modifikovana. Na primer, aglikosilisano antitelo može biti napravljeno (tj., antitelo kojem nedostaje glikosilacija). Glikosilacija može biti izmenjena tako da, na primer, povećava afinitet antitela za "antigen." Takve ugljovodonične modifikacije mogu da se postignu, na primer, izmenom jednog ili više mesta glikosilacije unutar sekvence antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija može biti napravljena tako da dovede do eliminacije jednog ili više okvirnim mesta glikosilacije u varijabilnom regionu kako bi se time eliminisala glikosilacija na tom mestu. Takva aglikosilacija može da poveća afinitet antitela za antigen. Takav pristup su u, npr., U.S. patentima br.5,714,350 i 6,350,861 opisali Co et al.
[0145] Dodatno ili alternativno, antitelo može biti načinjeno u izmenjenom tipu glikosilacije, kao što je hipofukosilisano antitelo sa smanjenom količinom fukosilnih ostataka ili antitelo sa povećanim strukturama GlcNac koje se dele na dva dela. Dokazano je da izmenjeni obrasci glikosilacije povećavaju ADCC mogućnost antitela. Takve ugljovodonične modifikacije mogu da se postignu, na primer, eksprimiranjem antitela u ćeliji domaćina sa promenjenim alatima glikosilacije. Ćelije sa izmenjenim alatima flikosilacije su opisane u tehnici i mogu da se koriste kao ćelije domaćina u kojima se eksprimiraju rekombinantna antitela pa se time proizvodi antitelo izmenjene glikosilacije. Na primer, u EP 1,176,195 Hang et al. opisuje ćelijsku liniju sa funkcionalno prekinutim FUT8 genom, koji kodira fukozil transferazu, tako da antitela eksprimirana u ćelijskoj liniji pokazuju hipofukosilaciju. PCT objava WO 03/035835 od strane Presta opisuje varijantu CHO ćelijske linije, Lecl3 ćelije, sa smanjenom mogućnošću pričvršćivanja fukoze za Asn(297)-vezane ugljene hidrate, što takođe dovodi do hipofukosilacije antitela eksprimiranih u toj ćeliji domaćina (videti takođe Shields et al., (2002) J. Biol.
Chem.277:26733-26740). PCT objava WO 99/54342 od strane Umana et al. opisuje ćelijske linije koje su konstruisane da eksprimiraju glikoprotein-modifikujuće glikozilne transferaze (npr., beta(1,4)-N acetilglukosaminiltransferaze III (GnTIII)) tako da antitela eksprimirana u konstruisanim ćelijskim linijama ispoljavaju povećane strukture GlcNac koje se dele na dva što dovodi do povećane ADCC aktivnosti antitela (videti takođe Umana et al., Nat. Biotech.17:176-180, 1999).
[0146] U drugom aspektu, antitelo je modifikovano tako da poveća svoj biološki poluživot. Mogući su razni pristupi. Na primer, jedna ili više sledećih mutacija može biti uvedena: T252L, T254S, T256F, kao što je opisano u U.S. patentu br.6,277,375 prema Wardu. Alternativno, da bi se povećao biološki poluživot, antitelo može da se izmeni unutar CH1 ili CL regiona kako bi se zadržao epitop vezivanja spasilačkog receptora uzet iz dve petlje CH2 domena Fc regiona iz IgG, kao što su u U.S. Patentima br.
5,869,046 i 6,121,022 to opisali Presta et al.
[0147] Kako bi se ADCC aktivnost antitela svela na minimum, specifične mutacije u Fc regionu dovode do "Fc tihih" antitela koja imaju minimalnu interakciju sa efektorskim ćelijama. Generalno, "IgG Fc region" se koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca, uključujući Fc region nativne sekvence i varijantne Fc regione. Humani Fc region IgG teškog lanca je generalno definisan kao da obuhvata aminokiselinski ostatak iz položaja C226 ili iz P230 do karboksil-terminusa IgG antitela.
Numerisanje ostataka u Fc regionu je izvedeno prema Kabatovom EU indeksu. C- terminalni lizin (ostatak K447) Fc regiona može biti uklonjen, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanja antitela.
[0148] Tihe efektorske funkcije mogu da se dobiju mutacijom u Fc regionu antitela i opisane su u tehnici: LALA i N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol.20(6):685-691); i D265A (Baudino et al., 2008, J. Immunol.181 : 6664- 69) videti takođe Heusser et al., WO2012065950. Primeri tihih Fc lgG1 antitela predstavljaju LALA mutant koji obuhvata L234A i L235A mutaciju u lgG1 Fc aminokiselinskoj sekvenci. Drugi primer tihog lgG1 antitela je DAPA (D265A, P329A) mutacija (US 6,737,056). Drugo tiho lgG1 antitelo obuhvata N297A mutaciju, koja dovodi do aglikosilisanih/neglikosilisanih antitela.
[0149] Fc tiha antitela dovode do nikakve ili do male aktivnosti ADCC, što znači da Fc tiho antitelo ispoljava ADCC aktivnost koja je ispod 50% specifične ćelijske lize (niska ADCC aktivnost), ili koja je ispod 1% specifične ćelijske lize (bez ADCC aktivnosti).
3. Proizvodnja anti-VP1 antitela
[0150] Anti-VP1 antitela i fragmenti antitela (npr., antigen-vezujući fragmenti) mogu da se proizvedu na bilo koji način poznat u tehnici, uključujući ali bez ograničenja na, rekombinantnu ekspresiju, hemijsku sintezu, i enzimsku digestiju tetramera antitela, dok monoklonalno antitelo pune dužine može da se dobije, npr., hibridomom ili rekombinantnom proizvodnjom. Rekombinantna ekspresija može biti od odgovarajućih ćelija domaćina poznatih u tehnici, na primer, ćelije domaćina sisara, bekterijske ćelije domaćina, ćelije domaćina kod insekata, itd.
[0151] Ovo otkrivanje dodatno obezbeđuje polinukleotide koji kodiraju ovde opisana antitela, npr., polinukleotide koji kodiraju varijabilne regione ili segmente teških ili lakih lanaca koji obuhvataju regione za određivanje komplementarnosti kao što je ovde opisano. U nekim aspektima, polinukleotid koji kodira varijabilne regione teškog lanca ima najmanje 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence nukleinske kiseline sa polinukleotidom izabranim iz grupe koju čine SEQ ID NO: 13, 33, 53, 73, 93, 113, 133, 153, 173, 193, 213, 233, 253, 273 i 293. U nekim aspektima, polinukleotid koji kodira varijabilne regione lakog lanca ima najmanje 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence nukleinske kiseline sa polinukleotidom izabranim iz grupe koju čine SEQ ID NO:23, 43, 63, 83, 103, 123, 143, 163, 183, 203, 223, 243, 263, 283 i 303.
[0152] U nekim aspektima, polinukleotid koji kodira teški lanac ima najmanje 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence nukleinske kiseline sa polinukleotidom iz SEQ ID NO: 15, 35, 55, 75, 95, 115, 135, 155, 175, 195, 215, 235, 255, 275 i 295. U nekim aspektima, polinukleotid koji kodira laki lanac ima najmanje 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence nukleinske kiseline sa polinukleotidom iz SEQ ID NO: 25, 45, 65, 85, 105, 125, 145, 165, 185, 205, 225, 245, 265, 285 i 305.
[0153] Polinukleotidi ovog otkrivanja mogu da enkodiraju samo sekvencu varijabilnog regiona anti-VP1 antitela. Takođe mogu da kodiraju i varijabilni region i konstantni region antitela. Neke od polinukleotidnih sekvenci kodiraju polipeptid koji obuhvata varijabilne regione i teškog i lakog lanca jednog od primernog anti-VP 1 antitela. Neki drugi polinukleotidi kodiraju dva polipeptidna segmenta tim redom i suštinski su identični varijabilnim regionima teškog lanca i lakog lanca jednog od mišjih antitela.
[0154] Polinukleotidne sekvence mogu biti proizvedene de novo sintezom DNK čvrste faze ili PCR mutagenezom postojeće sekvence (npr., sekvenci kako su opisane u primerima u nastavku) koje kodiraju anti-VP1 antitelo ili njegov vezujući fragment. Direktna hemijska sinteza nukleinskih kiselina može da se postigne postupcima poznatim u tehnici, kao što je postupak fosfotriestra iz Narang et al., Meth.
Enzymol.68:90, 1979; postupak fosfotriestra iz Brown et al., Meth. Enzymol.68:109, 1979; postupak dietilfosforamidita iz Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; i postupak čvrste potpore iz U.S.
Patenta br.4,458,066. Uvođenje mutacija u polinukleotidnu sekvencu PCR-om može da se izvede kao što je opisano u, npr., PCR Technology: Principles and Applications for DNK Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res.19:967, 1991; i Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.
[0155] Takođe su ovom otkrivanju obezbeđeni ekspresioni vektori i ćelije domaćina za proizvodnju ovde opisanih anti-VP 1 antitela. Razni ekspresioni vektori mogu da se koriste za eksprimiranje polinukleotida koji kodiraju anti-VP1 antitelo lanca ili vezujuće fragmente. I ekspresioni vektori na bazi virusa kao i nevirusni mogu da se koriste za proizvodnju antitela u ćelijama domaćina sisara. Nevirusni vektori i sistemi uključuju plazmide, epizomalne vektore, obično sa ekspresionom kasetom za eksprimiranje proteina ili RNK, i humanih veštačkih hromozoma (videti, npr., Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Na primer, nevirusni vektori korisni za ekspresiju anti-VP1 polinukleotida i polipeptida u (npr., humanim) ćelijama sisara uključuju pThioHis A, B & C, pcDNK3.1/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego, CA), MPSV vektore, i brojne druge vektore poznate u tehnici za eksprimiranje drugih proteina. Korisni virusni vektori uključuju vektore bazirane na retrovirusima, adenovirusima, adenopovezanim virusima, herpes virusima, vektore bazirane na SV40, papiloma virusu, HBP Epstein Barr virusu, virusnim vektorima vakcinije i Semliki Forest virusu (SFV). Videti, Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol.49:807, 1995; i Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.
[0156] Izbor ekspresionog vektora zavisi od predviđenih ćelija domaćina u kojima se taj vektor eksprimira. Obično ekspresioni vektori sadrže promoter i druge regulatorne sekvence (npr., pojačivače) koje su operabilno vezane za polinukleotide koji kodiraju lanac anti-VP1 antitela ili fragment. U nekim aspektima, induciblni promoter se koristi da spreči ekspresiju umetnutih sekvenci osim u indukujućim uslovima. Inducibilni promoteri uključuju, npr., arabinozu, lacZ, metalotioneinski promoter ili promoter toplotnog šoka. Kulture transformisanih organizama mogu da se prošire u neindukovanim uslovima bez favorizovanja populacije za kodiranje sekvenci čiji ekspresioni proizvodi se bolje podnose u ćelijama domaćina. Pored promotera, drugi regulatorni elementi takođe mogu biti potrebni ili željeni za efikasnu ekspresiju lanca anti-VP1 antitela ili fragmenta. Ovi elementi obično uključuju ATG inicijativni kodon i mesto vezivanja susednog ribozoma ili druge sekvence. Pored toga, efikasnost ekspresije može biti pojačana uključivanjem pojačivača pogodnih za ćelijski sistem koji se koristi (videti, npr., Scharf et al., Results Probl. Cell Differ.20:125, 1994; i Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Na primer, SV40 pojačivač ili CMV pojačivač može da se koristi da poveća ekspresiju u ćelijama domaćina sisara.
[0157] Ekspresioni vektori takođe mogu da obezbede položaj sekvence signala sekrecije kako bi se obrazovao fuzioni protein sa polipeptidima koje kodiraju umetnute sekvence anti-VP1 antitela. Češće umetnute sekvence anti-VP1 antitela su vezane za signalnu sekvencu pre uključivanja u vektor. Vektori koji se koriste primaju sekvence koje kodiraju varijabilne domene lakog i teškog lanca anti-VP1 antitela ponekad takođe kodiraju konstantne regione ili njihove delove. Takvi vektori omogućavaju ekspresiju varijabilnih regiona kao fuzionih proteina sa konstantnim regionima što samim tim dovodi do proizvodnje intaktnih antitela ili njihovih fragmenata. Obično su takvi konstanti regioni humani.
[0158] Ćelije domaćina za čuvanje i eksprimiranje lanca anti-VP1 antitela mogu biti ili prokariotske ili eukariotske. E. coli je prokariotski domaćin koristan za kloniranje i eksprimiranje polinukleotida ovog otkrivanja. Drugi mikrobiološki domaćini pogodni za upotrebu uključuju bacile, kao što je Bacillus subtilis, i druge enterobakterije, kao što su Salmonella, Serratia, i razne vrste Pseudomonas. Kod ovih prokariotskih domaćina, takođe mogu da se naprave ekspresioni vektori, koji obično sadrže ekspresione kontrolne sekvence kompatibilne sa ćelijama domaćina (npr., poreklom umnožavanja). Pored toga, bilo koji broj dobro poznatih promotera će biti prisutan, kao što je promoterski sistem za laktozu, promoterski sistem za triptofan (trp), promoterski sistem beta-laktamaze, ili promoterski sistem iz lambda faga. Promoteri obično kontrolišu ekspresiju, opciono sa sekvencom operatera, i imaju sekvence ribozomskog mesta vezivanja i njima slične, za iniciranje i kompletiranje transkripcije i translacije. Drugi mikrobi, kao što je kvasac, takođe mogu da se koriste za eksprimiranje anti-VP1 polipeptida. Ćelije insekata u kombinaciji sa bakulovirusnim vektorima takođe mogu da se koriste.
[0159] U drugim aspektima, ćelije domaćina kod sisara se koriste da eksprimiraju i proizvedu anti-VP1 polipeptide ovog otkrivanja. Na primer, mogu biti ili ćelijska linija hibridoma koja eksprimira endogene imunoglobulinske gene (npr., klonovi mijelomskog hibridoma kao što je opisano u primerima) ili ćelijsku liniju sisata koja čuva egzogeni ekspresioni vektor. U njih spadaju bilo koja normalna smrta ili normalna ili abnormalna besmrtna životinja ili humana ćelija. Na primer, razvijene su brojne pogodne ćelijske linije domaćina sposobne da izlučuju intaktne imunoglobuline, uključujući CHO ćelijske linije, razne COS ćelijske linije, HeLa ćelije, ćelijske linije mijeloma, transformisane B-ćelije i hibridome. O upotrebi ćelijske kulture iz tkiva sisara za eksprimiranje polipeptida je generalno bilo reči u, npr., Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Ekspresioni vektori za ćelije domaćina kod sisara mogu da uključuju ekspresine kontrolne sekvence, kao što su poreklo replikacije, promoter, i pojačivač (videti, npr., Queen et al., Immunol. Rev.89:49-68, 1986), i neophodna informaciona mesta obrade, kao što su mesta vezivanja ribozoma, mesta RNK splajsa, mesta poliadenilacije, i transkripcione terminatorske sekvence. Ovi ekspresioni vektori obično sadrže promotere izvedene iz gena sisara ili iz virusa sisara. Pogodni promoteri mogu biti konstitutivni, specifični za određeni tip ćelija, specifični za konkretnu fazu, i/ili koji mogu da se moduliraju ili regulišu. Korisni promoteri uključuju, ali bez ograničenja na, promoter metalotioneina, glavni kasni promoter konstituivnog adenovirusa, promoter MMTV koji može da indukuje deksametazon, SV40 promoter, MRP polIII promoter, konstitutivni MPSV promoter, promoter CMV koji može da indukuje tetraciklin (kao što je humani neposredni-rani CMV promoter), konstitutivni CMV promoter, i kombinacije promotera i pojačivača poznate u tehnici.
[0160] Postupci za uvođenje ekspresionih vektora koji sadrže polinukleotidne sekvence od interesa variraju u zavisnosti od tipa ćelijskog domaćina. Na primer, transfekcija kalcijum hlorida se obično koristi za prokariotkse ćelije, dok se lečenje kalcijum-fosfatom ili elektroporacija mogu koristiti za druge domaćine ćelija (videti generalno Sambrook et al., supra). Drugi postupci uključuju, npr., elektroporaciju, lečenje kalcijum fosfatom, transformaciju posredovanu lipozomima, injekciju i mikroinjekciju, balističke postupke, virozome, imunolipozome, polikaciju: konjugate nukleinske kiseline, golu DNK, veštačke virione, spajanje sa strukturnim proteinom VP22 herpes virusa (Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997), unos DNK pojačan agensom, i ex vivo transdukciju. Za dugoročnu, visokoprinosnu proizvodnju rekombinantnih proteina, stabilna ekspresija će često biti poželjna. Na primer, ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju anti-VP1 antitelo lanca ili vezujuće fragmente mogu da se pripreme pomoću ekspresionih vektora koji sadrže virusna porekla replikacije ili endogene ekspresione elemente i selektabilni markerski gen. Nakon uvođenja vektora, ćelijama može biti omogućeno uzgajanje tokom 1-2 dana u obogaćenim podlogama pre nego što se prebaci na selektivne podloge. Svrha selektabilnog markera je da se obezbedi otpornost na izbor, i njegovo prisustvo omogućava rast ćelija koje uspešno eksprimiraju uvedene sekvence u selektivnim postupcima. Otporne, stabilno transfektovane ćelije mogu biti proliferisane upotrebom tehnika kulture iz tkiva pogodne za ćelijski tip.
Terapeutske i dijagnostičke upotrebe
[0161] Antitela, fragmenti antitela (npr., antigen-vezujući fragmenti) ovog otkrivanja su korisni u raznim primenama uključujući, ali bez ograničenja na, infekciju i bolest polioma virusom. U određenim aspektima, antitela, fragmenti antitela (npr., antigen-vezujuće fragmenti), i su korisni za neutralisanje BKV ili JCV infekcije i sprečavanje ili lečenje nefropatije BK virusom, na primer, BKVAN). Postupci upotrebe mogu biti postupci in vitro, ex vivo, ili in vivo.
[0162] U jednom aspektu, antitela, fragmenti antitela (npr., antigen-vezujuće fragmenti), su korisni za detektovanje prisustva BKV u biološkom uzorku. Pojam "detektovanje" kako se ovde koristi obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U određenim aspektima, biološki uzorak obuhvata ćeliju ili tkivo. U određenim aspektima, takva tkiva uključuju normalna i/ili kancerogena tkiva koja eksprimiraju BKV pri višim nivoima u odnosu na druga tkiva.
[0163] U jednom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje postupak detektovanja prisustva BKV u biološkom uzorku. U određenim aspektima, postupak obuhvata stupanje u kontakt sa biološkim uzorkom sa anti-VP1 antitelom u uslovima koji dozvoljavaju vezivanje antitela za antigen, i detektovanje da li se kompleks obrazuje između antitela i antigena. Biološki uzorak može da uključuje, bez ograničenja, uzorke iz urina ili krvi.
[0164] Takođe je uključen i postupak dijagnostikovanja poremećaja povezanog sa ekspresijom BKV ili JCV virusa. U određenim aspektima, taj postupak obuhvata stupanje u kontakt ispitivane ćelije sa anti-VP1 antitelom; određivanje nivoa ekspresije (bilo kvantitativno ili kvalitativno) BK virusa u ispitivanoj ćeliji detektovanjem vezivanja anti-VP1 antitela za BK virus; i poređenje nivoa infekcije u ispitivanoj ćeliji sa nivoom infekcije BK virusa u kontrolnoj ćeliji (npr. normalnoj ćeliji koja potiče od istog tkiva kao i ispitivana ćelija ili ćeliji koja nije zaražena BK virusom), pri čemu viši nivo prisustva BK virusa u ispitivanoj ćeliji sa kontrolnom ćelijom ukazuje na prisustvo poremećaja povezanog sa infekcijom BK virusom. U određenim aspektima, ispitivana ćelija se dobija od pojedinca kod kojeg postoji sumnja na infekciju BK virusom.
[0165] U određenim aspektima, postupak dijagnoze ili detekcije, kao što su prethodno opisani, obuhvata detektovanje vezivanja anti-VP1 antitela sa ćelijom zaraženom BKV. Primerno ispitivanje za detektovanje vezivanja anti-VP1 antitela za ćeliju zaraženu BKV ćelijom je ispitivanje "FACS".
[0166] Određeni drugi postupci mogu da se koriste za detektovanje vezivanja anti-VP1 antitela. Takvi postupci uključuju, ali bez ograničenja na, antigen-vezujuća ispitivanja koja su dobro poznata u tehnici, kao što su Western blotovi, radiološka imunološka ispitivanja, ELISA (imunoenzimska proba), "sendvič" imunoeseji, ispitivanja imunoprecipitacije, fluorescentni imunoeseji, imunoeseji proteina A, i imunohistohemija (IHC).
[0167] U određenim aspektima, anti-VP1 antitela su obeležena. Obeležja uključuju, ali bez ograničenja na, etikete ili grupe koje se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronskeguste, hemiluminiscentne, i radioaktivne etikete), kao i grupe, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr., putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije.
[0168] U određenim aspektima, anti-VP1 antitela su imobilisana na nerastvorljivoj matrici. Imobilizacija podrazumeva odvajanje anti-VP1 antitela od bilo kojeg BKV ili JCV proteina koji ostaje slobodan u rastvoru. To se konvencionalno postiže ili insolubilizacijom anti-VP1 antitela pre postupka ispitivanja, kao adsorpcijom na matricu ili površinu nerastvorljivu u vodi (Bennich et al, U.S. Patent br.3,720,760), ili kovalentnim spajanjem (na primer, upotrebom glutaraldehidnog unakrsnog vezivanja), ili insolubilizacijom anti-VP1 antitela nakon stvaranja kompleksa između anti-VP1 antitela i BKV ili JCV proteina, npr., imunoprecipitacijom.
[0169] Bilo koji aspekti dijagnoze ili detekcije mogu da se izvedu pomoću anti-VP1 antitela ovog otkrivanja umesto ili pored drugog anti-VP1 antitela.
[0170] U jednom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje za postupak lečenja, smanjenje verovatnoće ili poboljšanja bolesti koje obuhvata davanje antitela, fragmenta antitela (npr., antigen-vezujućih fragmenata), pacijentu, čime se bolest leči. U određenim aspektima, ta bolest koja se leči antitelima, fragmentima antitela (npr., antigen-vezujućim fragmentima), je infekcija virusom BK ili JC. Primeri bolesti BKV i JCV koje mogu da se leče i/ili sprečavaju uključuju, ali bez ograničenja na, nefropatiju, hemoragijski cistitis, progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju (PML), intersticijalne bolesti bubrega, ureteralne stenoze, neuronopatiju granularnih ćelija (GCN), vaskulitis, kolitis, retinitis, meningitis, i zapaljenski sindrom imunološke rekonstitucije (IRIS). U određenim aspektima, tu infekciju karakteriše BKV ili JCV koji eksprimiraju ćelije za koje se anti-VP1 antitela, fragmenti antitela (npr., antigen-vezujući fragmenti) mogu specifično vezivati.
[0171] Ovo otkrivanje obezbeđuje za postupke lečenja BK virusne infekcije i BKVAN koji obuhvataju davanje terapeutski efektivne količine antitela, fragmente antitela (npr., antigen-vezujuće fragmente). U određenim aspektima, taj subjekat je čovek.
[0172] U određenim aspektima, postupak smanjenja BK virusne infekcije obuhvata davanje subjektu terapeutski efektivne količine antitela ili fragmente antitela (npr., antigen-vezujuće fragmente). U određenim aspektima, taj subjekat je čovek. U određenim aspektima, subjekat je imunosupresivan. Za imunosupresivne subjekte, količina imunosupresije može da se poveća ili smanji usled terapeutskih efekata anti-VP1 antitela.
[0173] U određenim aspektima, transplantovano tkivo je inficirano BK virusom za koji se anti-VP1 antitelo vezuje. Kako je incidenca BK infekcije u opštoj populaciji visoka, postoji velika verovatnoća da u slučaju transplantacije bubrega, pacijent koji prima bubreg je pozitivan na BK virus ili je davalac koji obezbeđuje bubreg pozitivan na BK virus ili su obojica pozitivni na virus BK. Da bi se sprečio BKVAN, anti-VP1 antitela mogu da se daju primaocu transplantata bubrega, pre i/ili posle postupka transplantacije bubrega, u zavisnosti od seropozitivnosti davaoca bubrega ili primaoca transplantata. U drugom aspektu, anti-VP1 antitela mogu da se daju pacijentu kada se virus detektuje u urinu (virurija), ili kada se virus detektuje u krvi (viremija).
[0174] Za lečenje BK ili JCV virusne infekcije, odgovarajuće doziranje antitela, ili fragmenata antitela (npr., antigen-vezujućih fragmenata), zavisi od raznih faktora, kao što je tip infekcije koja se leči, ozbiljnosti i toka infekcije, odgovora na infekciju, stvaranja virusne otpornosti na terapiju, prethodnu terapiju, kliničku istoriju pacijenta, i tako dalje. Antitelo može da se daje jednom ili tokom više serija terapija koje traju od nekoliko dana do nekoliko meseci, ili dok lek ne počne da deluje ili dok se ne postigne umanjenje infekcije (npr., smanjenje virurije ili virusnog oštećenja bubrega). Rasporedi optimalnog doziranja mogu da se izračunaju iz merenja akumulacije leka u telu pacijenta i variraće u zavisnosti od relativne potentnosti pojedinačnog antitela ili fragmenta antitela (npr., antigen-vezujućeg fragmenta). U određenim aspektima, doza je od 0,01mg do 10 mg (npr., 0,01 mg, 0,05mg, 0,1mg, 0,5mg, 1mg, 2mg, 3mg, 4mg, 5mg, 7mg, 8mg, 9mg, ili 10mg) po kg telesne mase, i može da se daje jednom ili više puta dnevno, nedeljno, mesečno ili godišnje. U određenim aspektima, antitelo ili fragment antitela (npr., antigen-vezujući fragment), ovog otkrivanja se daje jednom svake dve nedelje ili jednom svake tri nedelje. Nadležni lekar može da proceni brzine ponavljanja za doziranje na osnovu izmerenog poluživota i koncentracija antitela u telesnim tečnostima ili tkivima.
Kombinovana terapija
[0175] U određenim slučajevima, antitelo ili fragment antitela (npr., antigen-vezujući fragment), ovog otkrivanja se kombinuje sa drugim terapeutskim agensima, kao što su antivirusni agensi, antialergijski agensi, agensi protiv mučnine (ili anti-emetici), lekovi za ublažavanje bolova, citoprotektivni agensi, imunosupresivi i njihove kombinacije.
[0176] Pojam "farmaceutska kombinacija" kako se ovde koristi se odnosi ili na fiksnu kombinaciju u jednom doznom jediničnom obliku, ili nefiksnoj kombinaciji ili kompletu delova za kombinovano davanje gde dva ili više terapeutskih agenasa mogu da se daju nezavisno u isto vreme ili odvojeno unutar vremenskih intervala, naročito gde ovi vremenski intervali omogućavaju da kombinovani partneri pokazuju saradnju, npr. sinergistički efekat.
[0177] Pojam "kombinovana terapija" se odnosi na davanje dva ili više terapeutskih agenasa da bi se lečilo terapeutsko stanje ili infekcija opisana u ovom otkrivanju. Takvo davanje obuhvata zajedničko davanje ovih terapeutskih agenasa suštinski istovremeno, kao što je pojedinačna kapsula sa fiksnim odnosom aktivnih sastojaka. Alternativno, takvo davanje obuhvata zajedničko davanje u višestrukim, ili u odvojenim posudama (npr., kapsulama, praškovima, i tečnostima) za svaki aktivni sastojak. Praškovi i/ili tečnosti mogu da se rekonstituišu ili razblaže do željene doze pre primene. Pored toga, takvo davanje takođe obuhvata upotrebu svake vrste terapeutskog agensa sekvencijalno, ili u približno isto vreme ili u različitim terminima. U svakom slučaju, režim lečenja će obezbediti korisne efekte kombinacije lekova u lečenju ovde opisanih stanja ili poremećaja.
[0178] Kombinovana terapija može da obezbedi "sinergiju" i obezbedi "sinergistički", tj., efekat koji se postiže kada se aktivni sastojci koriste zajedno je veći od zbira efekata koji nastaju kao rezultat odvojenog korišćenja jedinjenja. Sinergistički efekat može da se postigne kada su aktivni sastojci: (1) zajednički formulisani i koji se daju ili isporučuju istovremeno u kombinovanoj, jedinično doznoj formulaciji; (2) isporučeni naizmenično ili paralelno u obliku odvojenih formulacija; ili (3) nekim drugim režimom. Kada se isporučuju u naizmeničnoj terapiji, sinergistički efekat može da se postigne kada su jedinjenja koja se daju ili isporučuju sekvencijalno, npr., različitim injekcijama u odvojenim špricevima. Generalno, tokom naizmenične terapije, efektivna doza svakog aktivnog sastojka se daje sekvencijalno, tj., serijski, dok u kombinovanoj terapiji, efektivne doze dva ili više aktivnih sastojaka se daju zajedno.
[0179] U jednom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje postupak lečenja BKV ili JCV infekcijom davanjem subjektu kojem je to potrebno antitela zajedno sa terapijama imunosupresivima. Anti-VP1 antitela će delovati profilaktički kako bi se neutralisala BKV ili JCV primarna infekcija ili ponovna aktivacija virusa koja potiče od terapije imunosupresivima pre ili posle transplantacije. Primeri imunosupresivne terapije uključuju, ali bez ograničenja na; inhibitor monofosfat dehidrogenaze, inhibitor purinske sinteze, kalcineurinski inhibitor ili mTOR inhibitor. Konkretni primeri imunosupresivnih terapeutskih agenasa uključuju ali bez ograničenja na; mikofenolat mofetil (MMF), mikofenolat natrijum, azatioprin, takrolimus, sirolimus i ciklosporin.
Farmaceutske kompozicije
[0180] Da bi se pripremile farmaceutske ili sterilne kompozicije uključujući anti-VP1 antitela, ta antitela ovog otkrivanja se mešaju sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom. Kompozicije mogu dodatno da sadrže jedan ili više terapeutskih agenasa koji su pogodni za neutralisanje BKV ili JCV infekcije.
[0181] Formulacije terapeutskih i dijagnostičkih agenasa mogu da se pripreme mešanjem sa fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijensima, ili stabilizatorima u obliku, npr., liofilizovanih praškova, suspenzija, vodenih rastvora, losiona, ili suspenzija (videti, npr., Hardman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001; Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y., 2000; Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993; Lieberman, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY, 1990; Lieberman, et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990; Weiner and Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 2000).
[0182] U konkretnom aspektu, anti-VP1 antitelo je liofilizat u bočici koja sadrži antitelo. Taj liofilizat može da se rekonstituiše sa vodom ili farmaceutskim nosačem pogodnim za injekciju. Za naknadnu intravensku primenu, dobijeni rastvor će obično dodatno biti razblažen u rastvoru nosača.
[0183] Ovde otkrivena antitela su korisna u neutralizaciji BKV ili JCV kod pacijenata sa transplantovanim tkivom koji mogu biti imunosupresivni, tako da može da se koristi farmaceutski nosač saharoze i humani albumin kao što se prethodno koristi kod pacijenata sa transplantatom koštane srži koji primaju CytoGam<®>(DeRienzo et al. Pharmacotherapy 2000; 20:1175-8). Alternativno, anti-VP1 antitela mogu da se uvedu kod pacijenata sa transplantatom putem farmaceutskog nosača kao što je opisano kao što je opisano za drugo anti-virusno antitelo, Synagis<®>, kao što je opisano u WO2003/105894. U ovoj objavi, farmaceutski nosač se sastoji od histidina i/ili glicina, saharida (npr. saharoze) i poliola (npr. polisorbata).
[0184] Izbor režima primene za terapiju zavisi od nekoliko faktora, uključujući ozbiljnost infekcije, nivo simptoma, i pristupačnosti ciljanih ćelija u biološkoj matrici. U određenim aspektima, režim primene maksimalno povećava količinu terapeutskog agensa isporučenog pacijentu koja je konzistentna sa prihvatljivim nivoom neželjenih dejstava. Shodno tome, količina biološkog agensa zavisi delimično od određenog lica i ozbiljnosti stanja koje se leči. Dostupan je vodič prilikom izbora odgovarajućih doza antitela, citokina, i malih molekula (videti, npr., Wawrzynczak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, 1996; Kresina (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1991; Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993; Baert et al., New Engl. J. Med.348:601-608, 2003; Milgrom et al., New Engl. J. Med.341:1966-1973, 1999; Slamon et al., New Engl. J. Med.344:783-792, 2001;
Beniaminovitz et al., New Engl. J. Med.342:613-619, 2000; Ghosh et al., New Engl. J. Med.348:24-32, 2003; Lipsky et al., New Engl. J. Med.343:1594-1602, 2000).
[0185] Odgovarajuću dozu određuje lekar, npr., pomoću parametara ili faktora za koje se u tehnici zna ili postoji sumnja da će uticati na lečenje ili za koje se predviđa da će uticati na lečenje. Generalno, doza počinje sa količinom koja je nešto manja od optimalne doze i po malo se povećava nakon postizana željenog ili optimalnog efekta u odnosu na negativna neželjena dejstva. Važne dijagnostičke mere uključuju simptome, npr., infuzionih reakcija.
[0186] Stvarni nivoi doziranja aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama sa anti-VP1 antitelima može da varira tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapeutskog odgovora za određenog pacijenta, kompozicije, i načina primene, a da to nije toksično po pacijenta. Izabran nivo doziranja će zavisiti od raznih farmakokinetičkih faktora uključujući dejstvo neutralisanja antitela, način primene, vreme primene, poluživot antitela kod pacijenta, trajanje lečenja, druge lekove, jedinjenja i/ili materijale koji se koriste u kombinaciji sa određenim kompozicijama koje se koriste, uzrasta, pola, telesne mase, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora poznatih u medicini.
[0187] Kompozicije koje obuhvataju antitela ili njihove fragmente mogu biti obezbeđene kontinuiranom infuzijom, ili dozama u vremenskim intervalima od, npr., jednom dnevno, jednom nedeljno, ili 1-7 puta nedeljno. Doze mogu biti obezbeđene intravenski, subkutano, topikalno, oralno, nazalno, rektalno, intramuskularno, intracerebralno, ili inhalacijom. Konkretan protokol doziranja je onaj koji uključuje maksimalnu dozu ili učestalost doze koja izbegava značajna neželjena dejstva.
[0188] Za ovde opisana antitela, doza koja se daje pacijentu može biti 0,0001 mg/kg do 100 mg/kg telesne mase pacijenta. Doza može biti između 0,0001 mg/kg i 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg i 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg i 5 mg/kg, 0,0001 i 2 mg/kg, 0,0001 i 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg i 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg i 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg do 0,25 mg/kg, 0,0001 do 0,15 mg/kg, 0,0001 do 0,10 mg/kg, 0,001 do 0,5 mg/kg, 0,01 do 0,25 mg/kg ili 0,01 do 0,10 mg/kg telesne mase pacijenta. Doziranje antitela ili njihovih fragmenata može da se izračuna pomoću telesne mase pacijenata izražene u kilogramima (kg) pomnožene sa dozom koja se daje u mg/kg.
[0189] Doze antitela zatim mogu da se ponavljaju a primene mogu da se razdvoje najmanje za 1 dan, 2 dana, 3 dana, 5 dana, 10 dana, 15 dana, 30 dana, 45 dana, 2 meseca, 75 dana, 3 meseca, ili najmanje 6 meseci.
[0190] Efektivna količina za određenog pacijenta može da varira u zavisnosti od faktora kao što su stanje koje se leči, celokupno zdravstveno stanje pacijenta, postupak, način i doza primene i bezbednost neželjenih efekata (videti, npr., Maynard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla., 1996; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK, 2001).
[0191] Način primene mogu biti , npr., topikalni ili kutani, injekcijom ili infuzijom intravenskim, intraperiotonealnim, intracerebralnim, intramuskularnim, intraokularnim, intraarterijskim, intracerebrospinalninim, intralzionim, ili sistemima odloženog oslobađanja ili implantom
(videti, npr., Sidman et al., Biopolimers 22:547-556, 1983; Langer et al., J. Biomed. Mater. Res.15:167-277, 1981; Langer, Chem. Tech.12:98-105, 1982; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980; U.S. Pat. br.6,350,466 i 6,316,024). Po potrebi, kompozicija takođe može da uključuje agens za solubilizaciju ili lokalni anestetik kao što je lidokain za ublažavanje bola na mestu injekcije, ili oba. Pored toga, pulmonarna primena takođe može da se koriste, npr., upotrebom inhalatora ili raspršivača, i formulacije sa aerosolnim agensom.
Videti, npr., U.S. Pat. br.6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, i 4,880,078; i PCT objava br. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, i WO 99/66903, od kojih je ovde svaki svojom referencom uključen u celosti.
[0192] Kompozicija ovog otkrivanja takođe može da se daje jednim ili više načina davanja pomoću jednog ili više raznih postupaka poznatih u tehnici. Kao što će stručnjak proceniti, put i/ili način primene će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. Izabrani putevi primene za antitela uključuju intravenski, intramuskularni, intradermalni, intraperitonealni, subkutani, spinalni ili drugi parenteralni putevi primene, na primer injekcijom ili infuzijom. Parenteralna primena može da predstavlja načine primene pored enteralne i topikalne primene, obično injekcijom, i uključuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratehalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.
Alternativno, kompozicija ovog otkrivanja može da se daje neparenteralnim putem, kao što je topikalni, epidermalni, ili mukozni put primene, na primer, intranazalno, oralno, vaginalnom rektalno, sublingvalno ili topikalno. U jednom aspektu, antitela ovog otkrivanja se daju infuzijom. U drugom aspektu, antitela se daju subkutano.
[0193] Ako se antitela iz ovog pronalaska primenjuju u sistemu sa kontrolisanim ili produženim otpuštanjem, pumpa se može koristiti za postizanje kontrolisanog ili produženog otpuštanja (videti Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng.14:20, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med.321:574, 1989). Polimerni materijali mogu da se koriste za postizanje kontrolisanog ili produženog oslobađanja antitela u okviru terapija (videti npr., Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem.23:61, 1983; videti takođe Levy et al., Science 228:190, 1985; During et al., Ann. Neurol.25:351, 1989; Howard et al., J. Neurosurg.71:105, 1989; U.S. Pat. br.5,679,377; U.S. Pat. br.5,916,597; U.S. Pat. br.5,912,015; U.S. Pat. br.5,989,463; U.S. Pat. br.5,128,326; PCT objava br. WO 99/15154; i PCT objava br. WO 99/20253. Primeri polimera koji se koriste u formulacijama sa odloženim oslobađanjem uključuju, ali bez ograničenja na, poli(2-hidroksi etil metakrilat), poli(metil metakrilat), poli(akrilna kiselina), poli(etilen-ko-vinil acetat), poli(metakrilna kiselina), poliglikolidi (PLG), polianhidridi, poli(N-vinil pirolidon), poli(vinil alkohol), poliakrilamid, poli(etilen glikol), polilaktidi (PLA), poli(laktid-ko-glikolidi) (PLGA), i poliortoestre. U jednom aspektu, polimer koji se koristi u formulaciji sa produženim oslobađanjem je inertan, bez luživih nečistoća, stabilna prilikom čuvanja, sterilan i biodegradabilan. Sistem kontrolisanog ili produženog oslobađanja može da se postavi u blizini profilaktičkog ili terapeutskog cilja, čime je potrebna samo frakcija sistemske doze (videti, npr., Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138, 1984).
[0194] O kontrolisanim sistemima za oslobađanje je bilo reči u prikazu kod Langer, Science 249:1527-1533, 1990). Bilo koja tehnika poznata stručnjaku može da se koristi za proizvodnju formulacija sa produženim oslobađanjem koje obuhvataju jedno ili više antitela ovog otkrivanja. Videti, npr., U.S. patentna prijava br.4,526,938, PCT objava WO 91/05548, PCT objava WO 96/20698, Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-189, 1996; Song et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995; Cleek et al., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.24:853-854, 1997; i Lam et al., Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater.24:759-760, 1997, od kojih je ovde svaki svojom referencom uključen u celosti.
[0195] Ako se antitela ovog otkrivanja daju topikalno, mogu biti formulisana u obliku masti, krema, transdermalnog flastera, losiona, gela, spreja, aerosola, rastvora, emulzije, ili drugog oblika poznatog stručnjaku iz oblasti. Videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Za topikalne dozne oblike koji ne mogu da budu u obliku spreja, obično se koriste viskozni do polučvrsti ili čvrsti oblici koji sadrže nosač ili jedan ili više ekscipijenasa koji su kompatibilni sa lokalnom primenom i imaju dinamičku viskoznost, u nekim slučajevima, veću od vode. Pogodne formulacije uključuju, bez ograničenja, rastvore, suspenzije, emulzije, kreme, masti, praškove, linimente, meleme i njima slične, koji se po želji sterilizuju ili mešaju sa pomoćnim sredstvima (npr. konzervansima, stabilizatorima, ovlaživačima, puferima ili solima) za uticaj na različita svojstva, kao što je, na primer, osmotski pritisak. Drugi pogodni topikalni dozni oblici uključuju aerosolne preparate koji mogu biti u spreju, pri čemu je aktivni sastojak, u nekim slučajevima, u kombinaciji sa čvrstim ili tečnim inertnim nosačem, upakovan u mešavinu sa isparljivim sredstvom pod pritiskom (npr., reaktivnim gorivom u gasovitom stanju, kao što je freon) ili u boci za stiskanje. Ovlaživači ili omekšivači takođe mogu da se dodaju u farmaceutske kompozicije i dozne oblike po želji. Primeri takvih dodatnih sastojaka su dobro poznati u tehnici.
[0196] Ako se kompozicije koje obuhvataju antitela daju intranazalno, mogu biti formulisane u obliku aerosola, spreja, mista ili u obliku kapi. Određenije, profilaktički ili terapeutski agensi za upotrebu prema ovom otkrivanju mogu biti konvencionalno isporučeni u obliku aerosola u spreju u pakovanju pod pritiskom ili raspršivačem, sa upotrebom pogodnog reaktivnog goriva (npr., dihlorodifluorometana, trihlorofluorometana, dihlorotetrafluoroetana, ugljen-dioksida ili drugo gasa). U slučaju aerosola pod pritiskom, dozna jedinica može da se odredi obezbeđivanjem ventila za isporučivanje metrisane količine. Kapsule i kertridži (koji se sastoje od, npr., želatina) za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu biti formulisani tako da sadrže mešavinu prašaka jedinjenja i pogodnu praškastu osnovu kao što je laktoza ili skrob.
[0197] Postupci za zajedničku primenu ili lečenje sa drugim terapeutskim agensom,
npr., imunosupresivom, citokinom, steroidom, hemoterapijskim agensom, antibiotikom, ili zračenjem su poznati u tehnici (videti, npr., Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.). Efektivna količina terapeutskog sredstva može da smanji simptome za najmanje 10%; za najmanje 20%; najmanje oko 30%; najmanje 40%, ili najmanje 50%.
[0198] Dodatne terapije (npr., profilaktički ili terapeutski agensi), koje mogu da se daju u kombinaciji sa anti-VP1 antitelima mogu da se daju sa manje od 5 minuta razmaka, manje od 30 minuta razmaka, 1 sat razmaka, na oko 1 sat razmaka, na oko 1 do oko 2 sata razmaka, na oko 2 sata do oko 3 sata razmaka, na oko 3 sata do oko 4 sata razmaka, na oko 4 sata do oko 5 sati razmaka, na oko 5 sati do oko 6 sati razmaka, na oko 6 sati do oko 7 sati razmaka, na oko 7 sati do oko 8 sati razmaka, na oko 8 sati do oko 9 sati razmaka, na oko 9 sati do oko 10 sati razmaka, na oko 10 sati do oko 11 sati razmaka, na oko 11 sati do oko 12 sati razmaka, na oko 12 sati do 18 sati razmaka, 18 sati do 24 sata razmaka, 24 sata do 36 sati razmaka, 36 sati do 48 sati razmaka, 48 sati do 52 sata razmaka, 52 sata do 60 sati razmaka, 60 sati do 72 sata razmaka, 72 sata do 84 sati razmaka, 84 sati do 96 sati razmaka, ili 96 sati do 120 sati razmaka iz anti-VP1 antitela ovog otkrivanja. Te dve ili više terapija mogu da se daju tokom jedne iste vizite pacijentu.
[0199] U određenim aspektima, anti-VP1 antitela mogu biti formulisana tako da se obezbedi pravilna distribucija in vivo. Na primer, krvno moždana barijera (BBB) isključuje mnogo visoko hidrofilnih jedinjenja. Kako bi se obezbedilo da se anti-VP1 antitela ukrštaju sa BBB (po želji), mogu biti formulisana, na primer, u lipozomima. Za postupke proizvodnje lipozoma, videti, npr., U.S. Pat. br.
4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi mogu da obuhvataju jednu ili više grupa koje se selektivno prenose u konkretne ćelije ili organe, čime se pojačava ciljana isporuka leka (videti, npr., Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol.29:685). Primeri ciljajućih grupa uključuju folat ili biotin (videti, npr., U.S. patentna prijava br.5,416,016 to Low et al.); manoside (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun.
153:1038); antitela (Bloeman et al., (1995) FEBS Lett.357:140; Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother.39:180); surfactant protein A receptor (Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol.1233:134); p 120 (Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem.269:9090); videti takođe K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett.346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
[0200] Ovo otkrivanje obezbeđuje protokole za davanje farmaceutske kompozicije koja obuhvata antitela sama ili u kombinaciji sa drugim terapijama subjektu kojem je to potrebno. Kombinovane terapije (npr. profilaktička ili terapijska sredstva) mogu da se daju subjektu istovremeno ili uzastopno. Terapija (npr. profilaktički ili terapeutski agensi) kombinovanih terapija takođe mogu da se daju ciklično. Biciklična terapija uključuje davanje prve terapije (npr. prvog profilaktičog ili terapeutskog agensa) kroz određeno vreme, nakon čega sledi primena druge terapije (npr. drugi profilaktički ili terapeutski agens) kroz određeno vreme i ponavljanje ove sekvencijalne primene, tj. ciklusa, kako bi se smanjio razvoj rezistencije na jednu od terapija (npr. sredstava) kako bi se izbegla ili smanjila neželjena dejstva jedne od terapija (npr. sredstava), i/ili kako bi se poboljšala efikasnost terapija.
[0201] Terapije (npr. profilaktički ili terapeutski agensi) kombinovanih terapija ovog otkrivanja mogu da se daju subjektu istovremeno. Pojam "istovremeno" nije ograničen na primenu terapija
(npr. profilaktička ili terapijska sredstva) tačno u isto vreme, već se pre misli da se farmaceutska kompozicija koja sadrži antitela ili njihove fragmente daje subjektu u nizu i unutar vremenskog intervala tako da antitela mogu da deluju zajedno sa drugom terapijom (terapijama) kako bi se obezbedila veća korist nego da su primenjivani na drugi način. Na primer, svaka terapija može da se daje subjektu u isto vreme ili sekvencijalno bilo kojim redom u različitim vremenskim tačkama; međutim, ako se ne daju u isto vreme, trebalo bi da se daju dovoljno blizu u vremenu kako bi se obezbedio željeni terapeutski ili profilaktički efekat. Svaka terapija koja se daje odvojeno subjektu, u bilo kom odgovarajućem obliku I bilo kojim pogodnim putem. U raznim aspektima, terapije (npr., profilaktički ili terapeutski agensi) se daju subjektu manje od 15 minuta, manje od 30 minuta, manje od 1 sata razmaka, na oko 1 sat razmaka, na oko 1 sat do oko 2 sata razmaka, na oko 2 sata do oko 3 sata razmaka, na oko 3 sata do oko 4 sata razmaka, na oko 4 sata do oko 5 sati razmaka, na oko 5 sati do oko 6 sati razmaka, na oko 6 sati do oko 7 sati razmaka, na oko 7 sati do oko 8 sati razmaka, na oko 8 sati do oko 9 sati razmaka, na oko 9 sati do oko 10 sati razmaka, na oko 10 sati do oko 11 sati razmaka, na oko 11 sati do oko 12 sati razmaka, 24 sati razmaka, 48 sati razmaka, 72 sata razmaka, ili 1 nedelje razmaka. U drugim aspektima, dve ili više terapija (npr., profilaktički ili terapeutski agensi) se daju tokom iste vizite pacijentu.
[0202] Profilaktički ili terapeutski agensi kombinovanih terapija mogu da se daju subjektu u istoj farmaceutskoj kompoziciji. Alternativno, profilaktički ili terapeutski agensi kombinovanih terapija mogu da se daju istovremeno subjektu u odvojenim farmaceutskim kompozicijama. Profilaktički ili terapeutski agensi mogu da se daju subjektu istim ili različitim putevima primene.
PRIMERI
Primer 1: Generisanje anti-VP1 antitela
[0203] B ćelije koje eksprimiraju anti-VP1 antitela su lizovane i VH (teški) i VL (laki) lanci su sekvencirani pomoću RT-PCR i analizirani kako bi se identifikovala mesta post-translacione modifikacije (PTM).
Plazmidi VH i VL lanaca su transfektovani u CHO ćelijsku liniju sisara u IgG1 vektoru srži za ekspresiju IgG1 antitela pune dužine.
[0204] Postupci za generisanje monoklonalnih antitela pomoću tehnologije hibridoma su poznati u tehnici (Antibody Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology vol.901, 2012, Chapter 7: 117). Ukratko, ženke miševa Balb/c su imunizovane sa VLP iz serotipa I BKV, serotipa IV, i JCV (bilo pojedinačno ili u kombinaciji) pomoću raznih strategija primarnog pojačanja, doza imunogena, i adjuvanasa (uključujući ali bez ograničenja na Freundov adjuvans i MF59 adjuvans). Supernatant uspešno spojenih (rastućih) hibridoma pregledan je na prisutnost anti-VP1 antitela pomoću ELISA, zatim na funkcionalnu aktivnost u ispitivanjima neutralizacije. CDR-ovi iz odabranih mišjih IgG su humanizovani presađivanjem na šablone primaoca humanog okvira, klonirani u vektore ekspresije srži IgG1 sisara i transfektovani u CHO ćelijskoj liniji sisara za ekspresiju potpunih IgG1 antitela.
[0205] U tehnici su poznati postupci za stvaranje monoklonalnih antitela pomoću tehnologije prikaza faga (Antibody Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology vol.901, 2012, Chapter 3: 33). Ukratko, biblioteka humanih B-ćelijskih antitela u scFv formatu sa Vx je pretražena na anti-VP1 antitela pomoću rastvora sa magnetskim zrncima povezanim sa streptavidinom u kompleksu sa biotinilisanim VLP-ovima BKV serotipa IV tokom 3 kruga selekcije uz povećanu strogost. Izolati su najpre eksprimirani kao scFv i pretraženi na vezanje na BKV serotip IV VLP i pentamere pomoću ELISA. Odabrani izolati su zatim klonirani i eksprimirani kao IgG1, ponovo analizirani na vezanje na VP1 (serotip I i IV) pomoću ELISA i na funkcionalnu aktivnost u testovima neutralizacije, i transfektovani u CHO ćelijskoj liniji sisara za ekspresiju punih IgG1 antitela.
Sažetak A anti-VP1 antitela je dat u tabeli 3.
Tabela 3: anti-VP1 antitela
Primer 2: Sazrevanje afiniteta anti-VP1 antitela
[0206] Anti-VP1 antitela su afinitetno sazrevala u kvascima PCR-om sklonom greškama ili mutagenezom usmerenom na CDR. VP1 proteini iz svakog od četiri serotipa BKV (kao što je prikazano u tabeli 4) korišćeni su kao antigen u najviše tri kruga selekcije pomoću FACS analize. VH (teški) i/ili VL (laki) lanci sa pojačanim afinitetom vezivanja za VP1 pomoću FACS analize zatim su klonirani u vektore ekspresije srži IgG1 sisara i transfektovani su u CHO ćelijskoj liniji sisara za ekspresiju potpunih IgG1 antitela.
Tabela 4
Primer 3: stvaranje BK virusa i čestica poput virusa (VLP)
[0207] Genomski klonovi serotipa I BKV su dobijeni od ATCC (pBR322-BKV MM, cat#45026; pBR322-BKV Dunlop, cat#45025). Infektivni genomski klonovi himernih virusa za serotip II, III i IV su napravljeni pomoću strategije kloniranja prethodno opiasne (Broekema et al, Virology 2010407:368-373). Ukratko, jedinstvena restrikciona mesta (SacII, Pmll) su uvedena u genome BKV serotipa I koji flankiraju VP1-VP2-VP3 kodirajući region pomoću mutageneze koja je usmerena na mesto. Kodirajući region za VP1 iz izolata SB serotipa II (GenBank pristup CAA79596.1), izolata AS serotipa III (GenBank pristup AAA46882.1) i soja ITA-4 serotipa IV (GenBank pristup BAF75132) su sintetisani u kontekstu VP2/VP3 kodirajućeg regiona iz izolata serotipa I (Genewiz, La Jolla, CA), tako da sintetisani fragmenti obuhvaćeni SacII-PmlI regionom se koriste za kombinacije zamene kao što je opisano u Broekema et
al., supra. Dobijeni himerni genomski klonovi zatim su korišćeni za stvaranje zaliha infektivnih virusa visokog titra u primarnim epitelskim ćelijama proksimalnih tubula bubrega (RPTE) (ATCC, kat. br. PCS-400-010) kako je prethodno opisano (Abend et al, J. Virology 200781:272-279).
[0208] VLP-ovi koji predstavljaju svaki od četiri serotipa BKV-a se generišu ekspresijom VP1 u ćelijama insekata Sf9 i ekstrahovani su iz smrznutih ćelijskih peleta iz 1 L kulture ultrazvukom (3 x 45 sekundi pulsa, odmor 5 minuta između pulseva na ledu), izolacijom peletiranjem VLP kroz jastučić od 20% saharoze (116000 g tokom 2,5 sata), i prečišćavanjem razmenom anjona sa 5 ml GE HiTrap Q HP kolonom (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) nakon čega sledi prečišćavanje pomoću 10 ml Capto<™>Core700 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) kolonom za isključivanje veličine na bazi smole i konačno pročišćavanjem na koloni za isključivanje veličine GE Sephacryl S50026/60 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA). Pripremljeni VLP-ovi su korišćeni u ELISA i SPR ispitivanjima vezivanja u primerima 6 i 7.
Primer 4: Prečišćavanje BKV VP1 pentamera
[0209] VP1 proteini iz svakog od četiri serotipa BKV (sekvence prikazane u tabeli 5 u nastavku) klonirani su sa N terminalnim GST-6xHis-TEV sekvencama i subklonirani u pGEX odredišnom vektoru (GE Healthcare, Pittsburgh, PA). GST fuzioni proteini eksprimirani su u E. coli, ekstrahovani iz ćelijskih peleta pomoću mikrofluidizatora (15,000 PSI) i pročišćeni afinitetnom hromatografijom imobilisanih metalnih jona (IMAC) pomoću 20 ml nikal sefaroze 6 Fast Flow kolone (GE Healthcare, Pittsburg, PA) . Oznaka GST-6xHis-TEV je odcepljena inkubacijom preko noći sa TEV proteazom i završno prečišćavanje je sprovedeno pomoću 5 ml His-Trap Fast Flow kolone (GE Heathcare, Pittsburg, PA), nakon čega je usledila Superdex 20026/60 kolona za isključivanje veličine (GE Heathcare, Pittsburg, PA).
Tabela 5
Primer 5: Merenja afiniteta anti-VP1 antitela (SET ispitivanje)
[0210] Ispitivanje ravnotežne titracije rastvora (SET) korišćeno je za određivanje afiniteta interakcije (KD) antitela sa VP1 pentamerima BKV iz sva četiri serotipa. Antitela su ispitana pri koncentraciji od 1 pM (konstantno), VP1 pentameri su serijski razblaženi od početne koncentracije od 10 nM. Rastvor antitela: VP1 pentamera je inkubiran preko noći, zatim ispitan na nevezana antitela pomoću MSD ploče niza (Meso Scale Discovery Cat#L21XA, Rockville MD) obložene VP1 pentamerom. KDutvrđeno je uklapanjem dijagrama sa modelom prilagođavanja 1:1 (prema Piehler et al. J. Immunol. Methods.1997; 201(2):189-206).
[0211] U ispitivanjima SET, KDvrednosti su bile slične za anti-VP1 antitela koja se vezuju za pentamere serotipa I BKV, u opsegu od 0,9 do 5,0 pM. P8D11 i derivati P8D11 imali su uporedive KDvrednosti za vezivanje za BKV pentamere serotipa II, III i IV, i u poređenju sa drugim antitelima, imali su najmanje 3,5 puta veći afinitet na pentamere serotipa II i 47 puta veći afinitet na pentamere serotipa IV. To je prikazano na slici 1A-1D. Osim toga, P8D11 i derivati P8D11 pokazali su afinitet vezivanja u opsegu od 2,5 do 6,0 pM na pentamere serotipa III, dok druga antitela nisu imala detektabilno vezivanje na pentamere serotipa III u ispitivanim uslovima. Sažetak podataka o SET afinitetu za ova anti-VP1 antitela se nalazi na slici 2.
Primer 6: Vezivanje anti-VP1 antitela za pentamere VP1 i VLP (ELISA)
[0212] Vezivanje anti-VP1 antitela za pentamere VP1 i VLP analizirano je pomoću ELISA. Ukratko, Immulon 2HB ploče (VWR, 62402-972) obložene su sa 100 ng/bunarčić BKV VLP ili VP1 pentamera preko noći. Antitela su serijski razblažena u PBS sa 0,5% BSA i ostavljena su da se vežu za ploče obložene antigenom tokom 2 sata. Ploče su isprane sa PBS-om i zatim inkubirane sa sekundarnim antitelima (HRP-konjugovani zečji anti-humani IgG, Southern Biotech #6140-05) razblaženim 1:6000 u 0,5% BSA u PBS-u tokom 1 sata. Ploče su isprane sa PBS i supstratom peroksidaze za mikrobunarčiće tetrametilbenzidina (TMB) (KPL, 52-00-031L) korišćen je za razvijanje reakcija.
[0213] Anti-VP1 antitela EBB-C1975-A3, A7, E7 i B5 su pokazala slično vezivanje za VLP (IC50 u opsegu od 0,044 do 0,1 nM) ili VP1 pentamere (IC50 u opsegu od 0,026 do 0,078 nM) iz BKV serotipa IV, ali smanjeno i aktivnosti varijabilnog vezivanja za VLP serotipa I (IC50 u opsegu od 4,32 do 85,7 nM). Ovi podaci su grafički prikazani na Fig.4-6 i sažeti na Fig.7. Nasuprot tome, anti-VP1 antitela iz serije 2081 i 2075 pokazala su pojačanu aktivnost vezivanja za VLP serotipa I, sa IC50 u opsegu od 0,046 do 0,267 nM i ovi podaci su prikazani na Fig.8 i 9. Anti-VP1 antitela specifična za JCV antitela serije 2077 pokazala su aktivnost vezivanja za JCV VLP u opsegu od 0,034 do 0,651 nM i ti su podaci prikazani na Fig.10 i 11.
Primer 7: Vezivanje anti-VP1 antitela za VP1 pentamere i VLP putem SPR
[0214] Vezivanje anti-VP1 antitela za VP1 pentamere i VLP analizirano je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Ukratko, biotinilisani protein A je imobilisan na SPR površini čipa obloženoj streptavidinom, a anti-VP1 antitela su uhvaćena na dobijenoj površini vezivanjem za protein A. BKV VP1 pentameri ili VLP-ovi se zatim prenose preko površine i ostavljaju se da se vežu za anti-VP1. VP1 antitela tokom faze združivanja, nakon čega sledi ispiranje puferom tokom faze disocijacije.
[0215] SPR je korišćena za procenu vezivanja anti-VP1 antitela EBB-C1975-A3, A7, E7 i B5 za četiri serotipa BKV, u odnosu na pozitivnu kontrolu (P165E2). Sva četiri antitela su imala vrlo slične profile vezivanja za pentamere VP1: bez vezivanja za pentamere serotipa I i III, atipično vezivanje za pentamere serotipa II (veliki pomak mase i bez povratka na početnu vrednost) i vezivanje za pentamere serotipa IV slične P165E2, ali sa nižim afinitetom (Fig.3A, 3C i 3E). Za VLP-ove, EBB-C1975-A3, A7 i E7 dele slične profile vezivanja: atipično vezivanje za VLP-ove serotipa I i bez vezivanja za VLP-ove serotipa III.
Međutim, profil vezivanja EBB-C1975-B5 je bio različit sa značajnim vezivanjem za VLP-ove serotipa I i III, čime je demonstrirano vezivanje za različite epitope na VP1 (Fig.3B i 3D).
[0216] SPR je takođe korišćena za karakterizaciju vezivanja anti-VP1 antitela P165E2, NEG447, P7G11A i P8D11 za VP1 pentamere skeniranjem mutageneze alanina (Fig.13A-F i Fig.14). Sva anti-VP1 antitela su pokazala smanjeno vezivanje za mutante F66A i I145A VP1, zbog ukupnog uticaja mutacije na strukturu pentamera VP1 (Fig.13B i 13F). Pored toga, K69A i E82A su uticali na vezivanje P165E2, NEG447 i P7G11A (Fig.13D i 13E).
Primer 8: Anti-VP1 antitela se vezuju za konformacioni epitop
[0217] Da bi se odredilo da li se anti-VP1 antitela vezuju za konformacioni epitop, korišćeni su Western blotovi denaturisanog proteina pomoću SDS-PAGE i tačkasti blotovi proteina u nativnoj konformaciji. Ukratko, VP1-pentamer serotipa I ili IV BKV je pokrenut na SDS-PAGE i prebačen na nitroceluloznu membranu (Western blot) ili direktno na nitroceluloznu membranu (dot blot). Obe membrane su inkubirane sa anti-VP1 antitelima, a zatim sa anti-humanim IgG sekundarnim antitelima konjugovanim sa infracrvenim fluorescentnim bojama za detekciju pomoću sistema Licor Odyssey.
[0218] Komercijalno dostupno pozitivno kontrolna antitelo (Abcam 53977) za koje je poznato da prepoznaje linearni epitop je detektovalo denaturisani i nedenaturisani VP1. Međutim, P165E2, P7G11 i P8D11 nisu uspeli da detektuju denaturisani VP 1 na Western blotu, što ukazuje da se ova antitela vezuju za konformacioni (nelinearni) epitop VP1 (Fig.12A i 12B).
[0219] Radi dodatne karakterizacije epitopa anti-VP1 antitela, skeniranje alaninske mutagenize se izvodi za ostatke, prevashodno u VP1 BC petlji, za koju se zna da je izložena na površini viriona i unutar glavnog mesta interakcije za receptore na ćelijskoj površini. Ovi mutirani VP1 pentameri ispitivani su na vezivanje za P8D11 i P7G11A u ispitivanjima površinske plazmonske rezonance (SPR) kako je prethodno opisano u primeru 7. Mutacije na nekoliko položaja uticale su na vezivanje P7G11A (F66A, K69A, E82A, 1145A) (Fig. 13A-F i Fig.14). Međutim, mutacije na samo dva mesta su dovele do smanjenja vezivanja P8D11 (F66A, 1145A) (Fig.14). Kako su mutacije na F66 i I145 dovele do gubitka vezivanja svih ispitivanih antitela, bez vezivanja za bilo koju teoriju, verovatno je da te mutacije dovode do opšteg poremećaja strukture pentamera VP1. Svi ostali VP1 pentameri sa ispitivanim mutacijama BC petlje zadržali su vezivanje P8D11. Nasuprot tome, ispitivanja razmene vodonik-deuterijuma su identifikovala zaštićeno područje unutar EF petlje VP1 nakon vezivanja P8D11 Fab fragmenta. Ispitivanja naknadnog skeniranja mutageneze alanina potvrđuju da ključni kontaktni ostaci za vezivanje P8D11 unutar ovog regiona uključuju Y169, R170 i K172, pri čemu su D/E175, K181, N182, T184 i Q186 do M190 važni ostaci kako je određeno izmenom deuterijuma ((YRXKXX (D/E)XXXXXKNXTXQ) (SEQ ID NO: 500)). Ovo je dalje opisano u primeru 14 do primera 17.
Primer 9: Neutralizacija BK virusa anti-VP1 antitelima
[0220] Infektivni serotip BKV I i himerni virusi koji predstavljaju serotip II, III i IV prethodno su inkubirani sa pročišćenim antitelima 1 sat kako bi se omogućilo vezivanje i neutralizacija. Primarne epitelske ćelije proksimalnih tubula bubrega (RPTE) (ATCC, kat. br. PCS-400-010) su zatim izložene mešavini virusa i antitela tokom 4 sata, zamenjene svežim podlogama i inkubirane 48 sati kako bi se omogućio ulazak virusa i ekspresija gena. Ćelije su fiksirane sa 4% paraformaldehidom i analizirane imunofluorescencijom kako bi se otkrila ekspresija TAg (Calbiochem DP02, pAb416 mišje anti-SV40 TAg antitelo).
Imunofluorescencija je analizirana analizom slike visokog sadržaja pomoću Cellomics ArrayScan<®>VTI HCS Reader za kvantifikovanje psorcenta BKV-zaraženih ćelija (TAg-pozitivne, DAP1-pozitivne), sa podacima predstavljenim kao procenat inhibicije infekcije u odnosu na netretirane kontrolne bunarčiće.
[0221] Kao što je prikazano na Fig.15-23, anti-VP1 antitela su neutralisana BKV infekcijom, uključujući podskup antitela koja neutrališu infekciju pomoću sva četiri serotipa BKV BKV (I-IV). Ova anti-VP1 antitela konkretno uključuju P8D11, modifikacije P8D11, i EBB-C1975-B5.
Primer 10: Neutralizacija JC virusa antitelima anti-VP1 virusa
[0222] Infektivni JCV izolati Mad-1 i Mad-4 imaju identične VP1 sekvence (GenBank pristup NP_043511). Ovi JCV izolati su prethodno inkubirani sa pročišćenim antitelima 1 sat kako bi se omogućilo vezivanje i neutralizacija. COS7 ćelije (ćelijska linija bubrega sličnih fibroblastima afričkog zelenog majmuna koja eksprimira SV40 TAg, ATCC kat. br. CRL-1651) zatim su izložene mešavini virusa i antitela 4 sata, zamenjene svežom podlogom i inkubirane 72 sata kako bi se omogućio ulazak virusa i ekspresija gena. Ćelije su fiksirane sa 4% paraformaldehidom i analizirane imunofluorescencijom kako bi se otkrila ekspresija JCV VP1 (Abcam 53977, zečje poliklonalno anti-SV40 VP1 antitelo). Ispitivanje je analizirano analizom slike visokog sadržaja pomoću Cellomics ArrayScan<®>VTI HCS čitača (Thermo Fisher, Waltham MA) za kvantifikovanje procenta ćelija zaraženih JCV-om (VP1-pozitivne, DAP1-pozitivne), sa podacima predstavljenim kao procenat inhibicije infekcije u odnosu na netretirane kontrolne bunarčiće. Kao što je prikazano na Fig.24-26, podskup anti-VP1 antiela neutralizuje infekciju JCV-om, uključujući P8D11 i 2077-seriju antitela.
Primer 11: Virusna otpornost
[0223] Eksperimenti sa izborom otpornosti sa P8D11 antitelima su sprovedeni u kulturama ćelija proksimalnog tubularnog epitela bubrega (RPTE) zaraženih serotipom I ili serotipom IV BKV. U ispitivanjima serotipa I nije primećen prodor virusa u kulturama sa P8D11 do 6 prolaza (84 dana) i stoga nisu identifikovane varijante povezane sa otpornošću (RAV). Nije bilo dodatnog prolaza mimo ove tačke, jer ni jedan virus nije mogao biti detektovan. Nasuprot tome, virusni prodor je otkriven na prolazu 3 (dan 42) sa drugim antitelom. Sekvenciranje BKV VP1 iz ovih kultura identifikovalo je varijantu povezanu sa otpornošću (RAV) sa 20 promena aminokiselina kroz VP1, bez promena koje se grupišu oko specifičnih aminokiselina u sekvenci VP1. Naknadna fenotipska karakterizacija ovog združenog RAV virusa pokazala je potpuni gubitak aktivnosti neutralizacije (>7692 puta pomak u EC50) u poređenju sa divljim tipom virusa, ali malu promenu (3,9 puta) u EC50 P8D11. Osim toga, VP1 mutant E82K je identifikovan kao RAV tokom izbora sa drugim anti-VP1 antitelom (vidi primer 8), a karakterizacija kloniranog E82K mutantnog virusa pokazala je da ova varijanta daje 15,880 puta pomak u EC50 u upotrebi sa divljim tipom virusa, ali nije pokazao unakrsnu otpornost na P8D11.
[0224] Slično, u kulturama serotipa IV BKV, otpornost nije otkrivena sa P8D11 nakon 6 prolaza (84 dana). Opet, nije bilo prolaza mimo ove tačke, budući da ni jedan virus nije mogao da se detektuje, ipak, otpornost na drugačija anti-BK antitela je odabrana već u prolazu 1 (dan 14). Promene u aminokiselinama L68R i E73K identifikovane su kao promene u odnosu na referentne mutacije i obezbedile su 600- odnosno 227-struke pomake u vrednostima EC50, ali nisu pokazale unakrsnu otpornost na P8D11. Ukratko, P8D11 ima visoku barijeru otpornosti i održava neutralizirajuće delovanje protiv otpornih varijanti za oba serotipa I i IV.
Primer 12: Toksičnost
[0225] Budući da je VP1 egzogena, neljudski cilj koji nije eksprimiran na površini ćelije, ovde otkrivena anti-VP1 antitela predstavljaju nizak rizik za toksičnost kod ljudi. Ispitivanje TCR je pokazao da nije bilo bojenja 42 ljudska tkiva i razmaza krvi pomoću P8D11, što potvrđuje odsutnost unakrsne reaktivnosti anti-VP1 antitela sa ljudskim proteinima. Anti-VP1 antitela nisu pokazala ćelijsku citotoksičnost u zavisnosti od antitela (ADCC) in vitro, u skladu sa činjenicom da se protein VP1 ne eksprimira na površini ćelije domaćina.
Primer 13: Ispitivanje afiniteta SET P8D11 na JCV VLP
[0226] Progresivna multifokalna leukoencefalopatija (PML) je retka, ali često smrtonosna infekcija mozga imunokompromitovanih pacijenata JC virusom. Glavni kapsidni protein (VP1) JC virusa uključen je u vezivanje receptora sijalinske kiseline na površini ćelija domaćina. Određene mutacije u VP1, poput aminokiselina L55 i S269, ukidaju prepoznavanje sijalinske kiseline i igraju ulogu u patogenezi PML-a (Chen et al., mAbs 2015; 7(4), 681-692). Ove dve mutacije se često javljaju kod bolesnika sa PML-om (Gorelik et al., J. Infect. Dis.2011204:103-114 i Reid et al., J. Infect. Dis.2011.; 204: 237-244). Antitela ovog otkrivanja su ispitana kako bi se videlo da li se vezuju za mutirane JCV VLP-ove sa mutacijama na tim pozicijama. Vezivanje anti-VP1 antitela za te VLP-ove bi ukazivalo da JC virus koji nosi ove uobičajene VP1 mutacije ne bi bio otporan na terapiju.
[0227] Dve serije od dvadeset i dva serijska razblaženja VLP-a su pripremljene u puferu za uzorke.
Dodate su dve konstantne koncentracije antitela P8D11. Koncentracija korišćenog antitela P8D11 je bila ili 9nM ili 1pM. Opseg koncentracije JCV konsenzusa bio je u opsegu od 105 µg/ml-72 pg/ml. Opseg koncentracije JCV L55F mutanta bio je 300 µg/ml-143 pg/ml. Opseg koncentracije JCV S269F mutanta bio je 300 µg/ml-143 pg/ml. Zapremina od 60 µl svake mešavine VLP:antitela raspoređena je u duplikatima na polipropilensku mikrotitarsku ploču sa 384 bunarčića (PP MTP). Pufer uzorka služio je kao negativna kontrola, a uzorak koji nije sadržao antigen kao pozitivna kontrola (Bmax). Ploča je zatvorena i inkubirana preko noći (o/n) na sobnoj temperaturi (RT). Standardna MSD ploča sa nizom od 384 bunarčića obložena je o/n sa 2 i 0,002 µg/ml pentamernog proteina BKV-VP1 serotipa I. Nakon tri puta ispiranja sa 50 ul/bunarčiću pufera za ispiranje, ploča je blokirana sa 50 µl/bunarčiću blokirajućeg pufera 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, zapremina od 30 µl/bunarčiću i svake mešavine VLP:antitela prenesena je iz PP MTP na obloženu MSD ploču i inkubirana 20 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon dodatnog koraka ispiranja, 30 µl antitela za detekciju (razblaženog 1:2000) u puferu uzorka je dodato u svaki bunarčić i inkubirano 30 minuta na sobnoj temperaturi. MSD ploča je isprana i dodato je 35 µl/bunarčiću pufera za očitavanje i inkubirano 5 minuta. ECL signali su mereni sa MSD SECTOR Imager 6000.
[0228] Korišćeni su sledeći reagensi: goveđi serumski albumin (BSA), (VWR Cat#422351S), fosfatom puferisan slani rastvor (PBS) 10x, (Teknova Cat#P0195), MSD pufer za očitavanje T 4x, (Meso Scale Discovery Cat#R92TC-1), Tris-puferisani slani rastvor (TBS) 20x, (Teknova Cat#T1680), Tween-20, (VWR Cat#437082Q). Korišćeni su sledeći puferi; blokirajući pufer: 1x PBS 5% (w/v) BSA, pufer za oblaganje: 1x PBS, pufer za uzorke: 1x PBS 0.5% (w/v) BSA 0.02% (v/v) Tween-20, pufer za ispiranje: 1x TBS 0.05% (v/v) Tween-20 i pufer za očitavanje: 1x MSD Read Buffer.
[0229] Ispitivanje ravnotežne titracije rastvora (SET) je korišćeno za određivanje afiniteta interakcije (KD) P8D11 sa JCV VLP-ovima kao što je opisano u primeru 5. P8D11 antitelo je ispitano u koncentracijama od 9 nM ili 1 pM (konstantno) i JCV VLP-ovi su serijski razblaženi na sledeći način: koncenzusni VLP-ovi su bili u opsegu od 105 µg/ml-72 pg/ml, i L55F i S269F mutantni VLP-ovi oba su bili u opsegu od 300 µg/ml-143 pg/ml. Rastvor antitela:VP1 pentamera je inkubiran preko noći, zatim ispitan na nevezana antitela upotrebom ploče MSD niza (Meso Scale Discovery, Cat#L21XA, Rockville MD) obložene VP1 pentamerom. KDje utvrđeno uklapanjem dijagrama sa modelom uklapanja 1:1 (prema Piehler et al. J. Immunol. Metode.1997.; 201(2):189-206). Analiza je provedena pomoću KinExA<®>Softver Pro i n-Curve Analysis kompanije Sapidyne (Boise ID).
[0230] Fig.27 prikazuje rezultate SET ispitivanja u tabelarnom obliku. Ovi podaci obezbeđuju određivanje afiniteta (KD) antitela P8D11 prema koncenzusnim JCV VLP-ima i VLP-ima koji sadrže mutacije VP1 koje su često povezane sa PML-om. P8D11 pokazuje afinitet vezivanja za sve JCV VLP-ove u niskom nanomolarnom opsegu. Međutim, afinitet vezivanja za L55F mutanta bio je približno 2 puta niži od afiniteta za divlji tip (koncenzus) i VLP-ove S269F mutanta. Stoga, ovo ukazuje na to da bi P8D11 antitelo i dalje bilo efikasna terapija protiv bilo divljeg tipa JC virusa ili JC virusa sa mutacijama koje su često povezane sa PML-om.
Primer 14: Ispitivanje deuterijumske razmene (P8D11 Fab u kompleksu sa BKV VP1 pentamerima) za mapiranje epitopa
[0231] Masena spektrometrija deuterijumske razmene (HDx-MS) meri uzimanje deuterijuma na amidnoj osnovi proteina. Ova merenja su osetljiva na dostupnost amidnih rastvarača i na promene u mreži vodoničnih veza amidnih srži. HDx-MS se često koristi za upoređivanje proteina u dva različita stanja, kao što su apo i vezan za ligand, i povezan sa brzom digestijom pepsinom. U takvim eksperimentima moguće je locirati regione, obično od 10 do 15 aminokiselina, koji pokazuju diferencijalno uzimanje deuterijuma između dva različita stanja. Regioni koji su zaštićeni ili direktno uključeni u vezivanje liganda ili su alostertički pogođeni vezivanjem antitela za ligand.
[0232] U ovim eksperimentima, uzimanje deuterijuma proteina BKV VP1 (SEQ ID NO:502) mereno je u odsustvu i prisustvu P8D11 Fab fragmenta. Regioni u VP1 koji pokazuju smanjenje uzimanja deuterijuma nakon vezivanja Fab fragmenta verovatno su uključeni u epitop; međutim, zbog prirode merenja, takođe je moguće detektovati promene udaljene od direktnog mesta vezivanja (alostrički efekti). Generalno, regioni koji imaju najveću zaštitu uključeni su u direktno vezivanje.
[0233] Eksperimenti mapiranja epitopa se izvode na platformi Waters Synapt ® G2 HDx-MS, koja uključuje LEAP ® robotski sistem, nanoACQUITY® UPLC sistem, i maseni spektrometar Synapt ® G2. U ovom postupku, kontrolni eksperimenti se sprovode u troduplim ponavljanjima na sledeći način.
Pentamer VP1 serotipa I BKV se razblaži u 110 µl 95% deuterisanog PBS pufera (pH 7,4) i inkubira na sobnoj temperaturi na stonom rotatoru tokom 25 minuta (%D = 85,5%). Deuterijumska razmena se ugasi dodavanjem hladnog pufera za gašenje u razmeri 1:1 (6M uree i 1M TCEP pH = 2,5) na ledu tokom 5 minuta. Nakon gašenja epruveta se prenosi na LEAP sistem (Thermo kutija je podešena na 2°C) a ugašeni uzorak se ubrizgava LEAP sistemom na UPLC sistem radi analize. UPLC sistem uključuje imobilisanu pepsin kolonu 2,1 mm x 30mm (Life Technologies 2-3131-00) koja se održava na 12°C. Za razdvajanje se koristi gradijent acetronitrila od 2 do 35% u trajanju od 8 minuta i kolona Waters UPLC CSH C181,0 x 100mm. Zatim se sprovode trodupli eksperimenti koristeći antitelo. P8D11 Fab fragment je imobilisan na Protein G agaroznim biserima (Thermo Scientific Cat#22851) koristeći standardne tehnike. Ukratko, antitelo se centrifugira radi uklanjanja pufera za čuvanje. Zatim se dodaje 200 µl PBS pufera (pH 7.4) i koncentracija VP1 pentamera na imobilisani P8D11 Fab fragment i inkubira 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, kompleks se centrifugira i opere sa 200 µl PBS pufera, a zatim se ponovo centrifugira. Za deuterijumsku razmenu, 200 µl deuterisanog PBS se dodaje na antigenantitelo kompleks za inkubaciju na sobnoj temperaturi tokom 25 minuta (%D = 85,5%). Zatim se uklanja deuterijumski pufer i odmah dodaje 125 µl hladnog pufera za gašenje. Nakon 5 minuta gašenja, kolona se centrifugira i protok se prenosi u prethodno ohlađenu HPLC bočicu. Uzorak se analizira koristeći istu onlajn pepsin digestiraju / LC-MS podešavanje kao kontrolni eksperiment.
[0234] Rezultati ovih merenja su sažeti na Fig.28. Fig.28 prikazuje razlike ispravljene na osnovnoj liniji između kontrolnog i uzorka vezanog za P8D11 antitelo, podeljene standardnom greškom u merenju. Na ovom grafikonu, što je negativnija vrednost, to ukazuje na veću količinu zaštite u datom regionu nakon vezivanja P8D11 Fab fragmenta za VP1 pentamer serotipa I BKV. Primećujemo najznačajnije količine zaštite u aminokiselinama 168-190 proteina VP1 nakon vezivanja P8D11 Fab fragmenta. Ovaj region petlje EF je visoko konzervisan kod sva četiri serotipa BK virusa i JC virusa, što se može videti u sekvenci podebljanoj i podvučenoj u tabeli 1 ((NYRTKYPXGTXXPKNXTXQSQVM) (SEQ ID NO:501)).
[0235] Zaključno, podaci o deuterijumskom mapiranju ukazuju da se P8D11 antitelo vezuje za epitop unutar EF petlje VP1BKV. Ovaj region je visoko konzerviran kod sva četiri serotipa BKV i JC virusa, što potvrđuje rezultat da P8D11 ima neutrališuću aktivnost kod sva četiri serotipa BKV i JC virusa.
Primer 15: Skeniranje ciljanog alanina i SPR za mapiranje epitopa P8D11
[0236] Biacore površinska plazmonska rezonanca (SPR) korišćena je za karakterizaciju vezivanja anti-VP1 antitela za VP1 pentamere generisane za mapiranje epitopa skeniranjem alanin mutageneze.
Eksperimenti su izvedeni na 25°C u fosfatnom puferu sa pH 7,4 (PBS) sa dodatkom 0,005% Tween 20 deterdženta (Calbiochem #655206) i izvršeni su na Biacore T-200 instrumentu (GE Healthcare Life Sciences). Biotinilisani protein A (Sigma #P2165) bio je imobilisan na senzorskom čipu Series S streptavidina do približno 1200 jedinica odgovora (RU), a preostala slobodna streptavidinska mesta su blokirana sa biotin-PEG (Pierce EZ-Link #PI21346). Antitela su uhvaćena na senzorskom čipu pripremljenog proteina A sa injekcijom u trajanju od 4 sekunde pri brzini protoka od 30 µl/minut.
Antitela su imobilisana u opsegu od 20-40 RU na ćelijama protoka 2, 3 i 4, pri čemu ćelija protoka 1 ostaje kao referentna ćelija bez bilo kog antitela. Pentameri VP1 su zatim ubrizgani preko čipa tokom 200 sekundi pri 100 µl/min, nakon čega su sledile injekcije pufera radi praćenja disocijacije. Između svakog pentamera i koncentracije pentamera, površina senzorskog čipa je regenerisana injekcijom 25 mM NaOH tokom 60 sekundi pri brzini protoka od 30 µl/minut kako bi se uklonila antitela pre ponovnog hvatanja antitela na površinama proteina A za sledeći ciklus. Analiza podataka je rađena u GE BiaEvaluation softveru gde je primenjeno dvostruko referentno oduzimanje. Procena efekta alanin mutageneze na vezivanje pentamera VP1 je postignuta poređenjem nivoa vezivanja RU i oblika krivih vezivanja u poređenju sa onima kod pentamera divlje vrste.
[0237] Kao što je ranije bilo reči, epitopi za antitela P8D11 i P7G11A su konformacioni i nekontinuirani (Fig.12A-B). Ovde, pojedinačne mutacije alanina na Y169, R170 i K172 u EF petlji VP1 BKV aboliraju vezivanje P8D11 (Fig.29A i 29B). Mutacije na Y169 i R170 takođe aboliraju vezivanje antitela P7G11A, međutim, vezivanje ovog antitela nije pogođeno promenama na položaju K172 u EF petlji VP1 BKV (Fig. 29A i 29C).
Primer 16: Mapiranje epitopa kristalografijom x-zraka
[0238] Određena je kristalna struktura scFv lanca antitela P8D11 vezanog za BKV glavni kapsidni protein VP1 u svom pentamernom obliku. Kako je u nastavku detaljnije opisano, 5.5:1 rastvor scFv:BKV-VP1 pentamera je korišćen da se proizvede pogodan kompleks kristalografije koji se sastoji od pet scFv lanaca koji se vezuju za svaki pentamer. Kristalografija proteina se zatim koristi kako bi se napravila struktura atomske rezolucije i definisao epitop.
Kristalizacija i određivanje strukture
[0239] P8D11 scFv/BKV-VP1 kompleks je koncentrovan do 5,2 mg/ml i skeniran je zbog kristalizacije. Kristali za sakupljanje podataka su uzgajani difuzijom pare koja pada na 18 °C. Kristali su uzgajani mešanjem 1,0 µl kompleksa sa 1,0 µl rastvora iz posude za čuvanje koji sadrži 25% (w/v) PEG3350, 0.2 M magnezijum hlorid i 0,1M Bis-Tris pH 7,0, i ekvilibrisanjem kapi u odnosu na 350 µl iste posude za čuvanje rastvora. Kristali su uzgajani preko noći i uzgajanje je nastavljeno još par dana. Pre prikupljanja podataka, kristali su prebačeni u 75% posude za čuvanje rastvora plus 25% glicerola i brzinski ohlađeni u tečnom azotu.
[0240] Podaci o difrakciji su interno prikupljeni na Rigaku FRE+ izvor bakra i detektora X-zraka R-ose. Podaci su obrađeni i skalirani pomoću Autoproc (Global Phasing, LTD). Podaci o BKV-VP1 su obrađeni do 2.66 Å u prostornoj grupi P42212 sa dimenzijama ćelija =224.4 Å, b=224.4 Å, c=144,04 Å, alfa=90°, beta=90°, gamma=90°. Struktura kompleksa je rešena molekulskom zamenom pomoću Phaser (McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst.40:658-674) sa BKV-VP1 pentamerom kao modelom za pretragu. Konačni model je sagrađen u COOT (Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. D60:2126-2132) i rafinisan sa Buster-om (Global Phasing, LTD, Cambridge, UK). Vrednosti Rwork i Rfree su 17,1% i 21.4%, tim redom; a vrednosti korena srednje kvadratne (r.m.s) devijacije vezanih dužina i vezanih uglova su 0,010Å i 1,18°, tim redom.
[0241] Ostaci BKV-VP 1-pentamera koji su u kontaktu sa P8D 11 scFv, ti tipovi interakcija, i zatrpane površinske oblasti su svi identifikovani putem PISA (Krissinel et al., (2007) J Mol Biol.372:774-97) i navedeni su u tabeli 6. Zaključeno je da svaki monomer VP1-pentamera sadrži pojedinačan izolovani epitop za P8D11 antitelo. Samim tim pet scFv domena se vezuje za svaki pentamer na pet hemijski i stearično ekvivalentnih položaja. Detalji za interakcije na svakom epitopu su suštinski identični tako da samo jedan interfejs scFv/VP1-epitopa se ovde analizira.
Epitopi P8D11-scFv na BKV-VP1
Celokupna struktura
[0242] Sveukupno savijanje svake strukture VP1-pentamera poliomavirusa je izuzetno homologno na nivou tercijarne strukture. Primarne sekvence su dobro konzervirane sa identitetom kao na 69-85%. Svaki pentamer se sastoji od pet monomera, pri čemu se svaki sastoji od trolančane β ploče koja se naslanja na drugu petolančanu β ploču a zatim četvorolančanu β ploču. P8D11 scFv je VH-VL fuzioni protein sa linkerom od 20 aminokiselina između VH i VL domena. Kao što je prikazano na Fig.30, VH-VL fuzioni protein se vezuje za epitop koji se nalazi na bočnoj, spoljašnjoj površini BKV-VP1-pentamera.
Epitop iz P8D11
[0243] Kristalna struktura BKV-VP1/P8D11 kompleksa se koristi za identifikovanje P8D11 epitopa na BKV-VP1. Interakcija površine na VP1 putem P8D11-scFv se obrazuje od nekoliko uzastopnih i isprekidanih (tj. nesusednih) sekvenci: naime ostataka 77-80, 169-186, i 191-192, kao što je detaljno dato u tabeli 6. Ti ostaci obrazuju trodimenzionalni konformacioni epitop koji prepoznaje P8D11-scFv (Fig.31A-B). Ovaj epitop koji je definisan kristalografijom se dobro slaže sa onim koji je definisan masenom spektrometrijom deuterijumske razmene vodonika (HDx-MS), u kojoj su ostaci 168-190 suštinski zaštićeni sa P8D11-Fab (Fig.28). Takođe postoji dobro slaganje sa skenom alanina koji je izveden na ključnim aminokiselinama epitopa (Fig.29A-C) koji je pokazao da su TYR169, ARG170 i LYS 172 kontaktni ostaci koji predstavljaju deo epitopa P8D11 antitela.
[0244] P8D11-scFv epitop na BKV-VP1. Svi ostaci BKV-VP1 koji su u kontaktu sa P8D11-scFv u kristalnoj strukturi su identifikovani putem PISA, navedeni i sortirani po svojim zatrpanim površinskim oblastima putem P8D11-scFv. Tipovi interakcije su takođe navedeni tamo gde je to primenjivo.
Tabela 6
Anti-VP1 Vodonična Slani ASA* BSA* Ostatak VP1 Vodonična Slani ASA* BSA* scFv ostatak veza most pentamera veza most

Claims (23)

  1. Primer 18: Formulacija [0245] Anti-VP1 antitela ovde opisana su monoklonalna antitela, IgG1 izotip sa lambda lakim lancem, i mogu biti liofilizovana. Ova antitela su rastvorljiva i stabilna u puferu formulacije histidina i saharoze tokom 4 nedelje. Pored toga, anti-VP1 antitela su rastvorljiva na >200 mg/ml kao minimalno formulisana supstanca leka (npr., u puferu histidina u odsustvu stabilizatora). [0246] Zbog naknadne intravenske primene, dobijeni rastvor će obično dodatno biti razblažen u rastvoru nosača u rastvor antitela koji je spreman da se koristi za infuziju. [0247] Važni analitički postupci koji ukazuju na stabilnost prilikom odabira najstabilnije formulacije, između ostalih, obuhvataju hromatografiju isključivanja po veličini čestica kako bi se odredili agregatni nivoi, ispitivanje subvidljivih čestica, i ispitivanje potentnosti. [0248] Smatra se da su ovde opisani primeri i aspekti dati samo u ilustrativne svrhe. Patentni zahtevi 1. Antitelo koje se vezuje za VP1 protein BKV i JCV, pri čemu pomenuto antitelo ili njegov antigenvezujući fragment obuhvata: varijabilni region teškog lanca koji obuhvata (a) HCDR1 (CDR-region za određivanje komplementarnosti) iz SEQ ID NO: 6, (b) HCDR2 iz SEQ ID NO:7, (c) HCDR3 iz SEQ ID NO:8 i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: (d) LCDR1 iz SEQ ID NO:16, (e) LCDR2 iz SEQ ID NO:17, i (f) LCDR3 iz SEQ ID NO:18.
  2. 2. Antitelo prema zahtevu 1, pri čemu pomenuto antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata: (i) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:12, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO: 22; (ii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 32, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO: 42; (iii) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 52, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO: 62; (iv) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO: 72, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO: 82; (v) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:92, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:102; ili (vi) varijabilni region teškog lanca (vH) koji obuhvata SEQ ID NO:112, i varijabilni region lakog lanca (vL) koji obuhvata SEQ ID NO:122.
  3. 3. Antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 2 koji zadržava najmanje 95, 96, 97, 98 ili 99% identiteta ili u varijabilnom lakom ili varijabilnom teškom regionu.
  4. 4. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu to antitelo je monoklonalno antitelo, himerno antitelo, humanizovano antitelo, jednolančano antitelo(scFv) ili fragment antitela.
  5. 5. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu to antitelo ili njegov fragment ima smanjenu glikosilaciju ili nema glikosilaciju ili je hipofukosilisan.
  6. 6. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od prethodnih zahteva koja dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač.
  7. 7. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 6, pri čemu taj farmaceutski prihvatljiv nosač sadrži histidin ili neki šećer.
  8. 8. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7, pri čemu je taj šećer saharoza.
  9. 9. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata brojna antitela ili antigen-vezujuće fragmente prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu najmanje 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5% ili više antitela u kompoziciji imaju ostatak α2,3-vezane sijalinske kiseline.
  10. 10. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata brojna antitela ili antigen-vezujuće fragmente prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu ni jedno od tih antitela ne obuhvata GlcNAc koji se deli na dva dela.
  11. 11. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-5 za upotrebu kao lek.
  12. 12. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-5, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevima 6-10, za upotrebu u postupku neutralizacije infekcije BK ili JC virusom in vivo.
  13. 13. Antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1-5, ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 6-10, za upotrebu u lečenju ili smanjenju verovatnoće od: nefropatije, nefropatije povezane sa BKV (BKVAN), hemoragijskog cistitisa (HC), progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML), neuronopatije granularnih ćelija (GCN), intersticijalne bolesti bubrega, ureteralne stenoze, vaskulitisa, kolitisa, retinitisa, meningitisa, i zapaljenskog sindroma imunološke rekonstitucije (IRIS).
  14. 14. Antitelo ili njegov fragment, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema zahtevu 13, pri čemu se pacijentu pomenuto antitelo ili njegov fragment ili pomenuta farmaceutska kompozicija daje u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutskih agenasa.
  15. 15. Antitelo ili njegov fragment, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu terapeutski agens predstavlja imunosupresivni agens.
  16. 16. Antitelo ili njegov fragment, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema zahtevu 15, pri čemu taj imunosupresivni agens predstavlja inhibitor monofosfat dehidrogenaze, inhibitor purinske sinteze, kalcineurinski inhibitor ili mTOR inhibitor; pri čemu taj inhibitor monofosfat dehidrogenaze predstavlja mikofenolat mofetil (MMF) ili mikofenolat natrijum; inhibitor purinske sinteze je azatioprin, kalcineurinski inhibitor je takrolimus ili ciklosporin; ili mTOR inhibitor je sirolimus.
  17. 17. Antitelo ili njegov fragment, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu terapeutski agens predstavlja dodatno anti-VP1 antitelo.
  18. 18. Nukelinska kiselina koja kodira antitelo ili antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1.
  19. 19. Vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu prema zahtevu 18.
  20. 20. Ćelija domaćina koja obuhvata vektor prema zahtevu 19.
  21. 21. Postupak za proizvodnju antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina i obnavljanje antitela iz kulture.
  22. 22. Dijagnostički reagens koji obuhvata antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1 koji je obeležen.
  23. 23. Dijagnostički reagens prema zahtevu 22, pri čemu je to obeležje izabrano iz grupe koju čine radioaktivno obeležje, fluorofor, hromofor, agens za snimanje, i metalni jon.
RS20240355A 2015-09-16 2016-09-08 Antitela za neutralizaciju poliomavirusa RS65441B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2015089764 2015-09-16
PCT/IB2016/055339 WO2017046676A1 (en) 2015-09-16 2016-09-08 Polyomavirus neutralizing antibodies
EP16766397.0A EP3350218B1 (en) 2015-09-16 2016-09-08 Polyomavirus neutralizing antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65441B1 true RS65441B1 (sr) 2024-05-31

Family

ID=56936456

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240355A RS65441B1 (sr) 2015-09-16 2016-09-08 Antitela za neutralizaciju poliomavirusa

Country Status (23)

Country Link
US (8) US9862760B2 (sr)
EP (2) EP4414385A3 (sr)
JP (4) JP7053455B2 (sr)
CN (2) CN108026166B (sr)
AR (1) AR106043A1 (sr)
AU (1) AU2016322814B2 (sr)
CA (1) CA2995795A1 (sr)
DK (1) DK3350218T5 (sr)
ES (1) ES2973856T3 (sr)
FI (1) FI3350218T3 (sr)
HR (1) HRP20240413T1 (sr)
HU (1) HUE065935T2 (sr)
IL (2) IL296800A (sr)
LT (1) LT3350218T (sr)
MX (2) MX392098B (sr)
PL (1) PL3350218T3 (sr)
PT (1) PT3350218T (sr)
RS (1) RS65441B1 (sr)
SI (1) SI3350218T1 (sr)
SM (1) SMT202400124T1 (sr)
TW (2) TWI726911B (sr)
UY (1) UY36905A (sr)
WO (1) WO2017046676A1 (sr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9862760B2 (en) 2015-09-16 2018-01-09 Novartis Ag Polyomavirus neutralizing antibodies
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
WO2018088850A2 (ko) * 2016-11-11 2018-05-17 다이노나(주) Cd40에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
US11433132B2 (en) 2017-12-01 2022-09-06 Novartis Ag Polyomavirus neutralizing antibodies
US10946238B1 (en) 2018-07-23 2021-03-16 Life Fitness, Llc Exercise machines having adjustable elliptical striding motion
SG11202108627SA (en) 2019-02-18 2021-09-29 Lilly Co Eli Therapeutic antibody formulation
US12410238B2 (en) 2019-06-19 2025-09-09 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Monoclonal antibodies against JC virus
WO2021236724A2 (en) * 2020-05-20 2021-11-25 Remd Biotherapeutics, Inc. Human endothelin receptor a (etar) antagonist antibodies
SI4126932T1 (sl) * 2020-06-09 2024-03-29 Memo Therapeutics Ag Molekule protiteles virusa anti-bk
CN116096746A (zh) * 2020-06-12 2023-05-09 维拉治疗公司 多瘤病毒中和抗体的给药
AU2021372533A1 (en) * 2020-10-29 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Chicken anemia virus (cav)-based vectors
AU2022232943A1 (en) * 2021-03-12 2023-09-28 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Neutralizing monoclonal antibodies to bk virus
WO2023175171A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Bk polyomavirus antibodies and uses thereof
US20250270328A1 (en) * 2022-05-18 2025-08-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Klrb1 binding agents and methods of use thereof
CN118725124B (zh) * 2023-03-29 2025-09-16 东莞市朋志生物科技有限公司 抗胃蛋白酶原ⅱ抗体、检测胃蛋白酶原ⅱ的试剂和试剂盒
WO2025111317A1 (en) * 2023-11-21 2025-05-30 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Klrb1 binding agents and methods of use thereof
EP4659810A1 (en) 2024-06-07 2025-12-10 Université de Strasbourg Bkv neutralizing antibodies
WO2025252939A1 (en) * 2024-06-07 2025-12-11 Universite De Strasbourg Bk virus neutralizing antibodies
EP4659811A1 (en) * 2024-06-07 2025-12-10 Université de Strasbourg Bk virus neutralizing antibodies
WO2025252935A1 (en) 2024-06-07 2025-12-11 Universite De Strasbourg Bkv neutralizing antibodies
CN119320446B (zh) * 2024-12-02 2026-01-20 上海云泽生物科技有限公司 一种抗bkv抗体及其应用
CN120623324B (zh) * 2025-08-13 2025-10-31 北京溯本源和生物科技有限公司 一种用于bk病毒vp1蛋白检测的单克隆抗体3c7及应用

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3720760A (en) 1968-09-06 1973-03-13 Pharmacia Ab Method for determining the presence of reagin-immunoglobulins(reagin-ig)directed against certain allergens,in aqueous samples
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
CA2071867A1 (en) 1989-11-06 1991-05-07 Edith Mathiowitz Method for producing protein microspheres
CA2109528A1 (en) 1991-05-01 1992-11-02 Gregory A. Prince A method for treating infectious respiratory diseases
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US6132764A (en) 1994-08-05 2000-10-17 Targesome, Inc. Targeted polymerized liposome diagnostic and treatment agents
CA2207961A1 (en) 1995-01-05 1996-07-11 Robert J. Levy Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
AU710347B2 (en) 1995-08-31 1999-09-16 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
DK0885002T3 (da) 1996-03-04 2011-08-22 Penn State Res Found Materialer og fremgangsmåder til forøgelse af cellulær internalisering
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
CA2277801C (en) 1997-01-16 2002-10-15 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
WO1998056915A2 (en) 1997-06-12 1998-12-17 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
CA2336139C (en) 1998-06-24 2008-10-14 Advanced Inhalation Research, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US7244592B2 (en) 2002-03-07 2007-07-17 Dyax Corp. Ligand screening and discovery
US7132100B2 (en) 2002-06-14 2006-11-07 Medimmune, Inc. Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations
US7462697B2 (en) 2004-11-08 2008-12-09 Epitomics, Inc. Methods for antibody engineering
EP1846451B1 (en) * 2005-01-24 2013-05-15 Medimmune Limited Human antibodies against human ngf
LT2796466T (lt) * 2007-12-07 2018-02-26 Zymogenetics, Inc. Humanizuotų antikūnų molekulės, specifinės il-31 atžvilgiu
US8080244B2 (en) * 2008-11-21 2011-12-20 Los Alamos National Security, Llc Anti-influenza M2e antibody
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
BR112013016495A2 (pt) 2010-12-27 2018-05-22 Japan Health Sciences Foundation anticorpo monoclonal que reconhece a proteína l2 do papilomavírus humano (hpv) e método para medir o título de anticorpo que neutraliza o hpv usando a mesma
PH12013502043A1 (en) 2011-04-01 2013-12-16 Memorial Sloan Kettering Cancer Center T cell receptor-like antibodies specific for a wt1 peptide presented by hla-a2
RS58910B1 (sr) 2012-03-20 2019-08-30 Biogen Ma Inc Antitela koja neutrališu virus jcv
US9567391B2 (en) * 2012-03-20 2017-02-14 Biogen Ma Inc. JCV neutralizing antibodies
ITTO20120570A1 (it) 2012-06-27 2013-12-28 Pomona Ricerca Srl Anticorpo monoclonale diretto contro il virus jc
WO2014102399A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Neurimmune Holding Ag Recombinant human antibodies for therapy and prevention of polyomavirus-related diseases
US9931393B2 (en) 2013-12-20 2018-04-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunogenic JC polyomavirus compositions and methods of use
DK3099713T3 (da) * 2014-02-02 2020-04-14 Medimmune Ltd Kimært protein bestående af et ngf-antagonistdomæne og et tnfa-antagonistdomæne
US20170360926A1 (en) 2014-12-24 2017-12-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. PREDICTING OUTCOME OF TREATMENT WITH AN ANTI-alpha4beta7 INTEGRIN ANTIBODY
US9862760B2 (en) 2015-09-16 2018-01-09 Novartis Ag Polyomavirus neutralizing antibodies
US11433132B2 (en) 2017-12-01 2022-09-06 Novartis Ag Polyomavirus neutralizing antibodies
SI4126932T1 (sl) 2020-06-09 2024-03-29 Memo Therapeutics Ag Molekule protiteles virusa anti-bk
CN116096746A (zh) 2020-06-12 2023-05-09 维拉治疗公司 多瘤病毒中和抗体的给药

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022002524A (ja) 2022-01-11
IL257541B (en) 2022-11-01
HUE065935T2 (hu) 2024-06-28
WO2017046676A1 (en) 2017-03-23
SI3350218T1 (sl) 2024-05-31
US9862760B2 (en) 2018-01-09
HRP20240413T1 (hr) 2024-07-19
JP2025143348A (ja) 2025-10-01
US20220363735A1 (en) 2022-11-17
ES2973856T3 (es) 2024-06-24
US20180079799A1 (en) 2018-03-22
MX392098B (es) 2025-03-21
SMT202400124T1 (it) 2024-05-14
EP3350218B1 (en) 2024-02-28
US11161894B2 (en) 2021-11-02
CA2995795A1 (en) 2017-03-23
US10654914B2 (en) 2020-05-19
PL3350218T3 (pl) 2024-08-12
US12077571B2 (en) 2024-09-03
AU2016322814B2 (en) 2019-01-24
IL257541A (en) 2018-04-30
TW201722987A (zh) 2017-07-01
US20200190167A1 (en) 2020-06-18
IL257541B2 (en) 2023-03-01
JP2018535648A (ja) 2018-12-06
JP2023071881A (ja) 2023-05-23
CN108026166A (zh) 2018-05-11
US20250051423A1 (en) 2025-02-13
PT3350218T (pt) 2024-03-27
EP4414385A3 (en) 2024-10-30
JP7053455B2 (ja) 2022-04-12
CN113929771B (zh) 2024-08-27
EP4414385A2 (en) 2024-08-14
DK3350218T5 (da) 2024-09-30
FI3350218T3 (fi) 2024-03-22
US10435460B2 (en) 2019-10-08
TWI789744B (zh) 2023-01-11
US20190071488A1 (en) 2019-03-07
TWI726911B (zh) 2021-05-11
DK3350218T3 (da) 2024-04-02
JP7284790B2 (ja) 2023-05-31
LT3350218T (lt) 2024-04-10
CN113929771A (zh) 2022-01-14
US20170088605A1 (en) 2017-03-30
JP7706489B2 (ja) 2025-07-11
AR106043A1 (es) 2017-12-06
US20230399382A1 (en) 2023-12-14
CN108026166B (zh) 2021-10-08
EP3350218A1 (en) 2018-07-25
UY36905A (es) 2017-04-28
US20190002533A1 (en) 2019-01-03
US11639378B2 (en) 2023-05-02
MX2018003282A (es) 2018-05-16
IL296800A (en) 2022-11-01
AU2016322814A1 (en) 2018-03-29
US10450366B2 (en) 2019-10-22
TW202200611A (zh) 2022-01-01
MX2022005253A (es) 2022-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12077571B2 (en) Polyomavirus neutralizing antibodies
US20230079587A1 (en) Polyomavirus neutralizing antibodies
CN112165974B (zh) 乙型肝炎抗体
HK40059983B (zh) 多瘤病毒中和抗体
HK40059983A (en) Polyomavirus neutralizing antibodies