RS65343B1

RS65343B1 - Ćelija

Info

Publication number: RS65343B1
Application number: RS20240357A
Authority: RS
Inventors: Martin Pulé; Shaun Cordoba; Shimobi Onuoha; Simon Thomas
Original assignee: Autolus Ltd
Priority date: 2014-12-24
Filing date: 2015-12-23
Publication date: 2024-04-30
Also published as: KR20210098556A; MX2017006233A; SI3560953T1; US10174099B2; RU2768019C2; IL292508B1; RU2017121892A; US11034750B2; ES2744910T3; JP6633081B2; KR20210098557A; US20230331810A1; LT3560953T; EP3560953B1; AU2015370679C1; IL292508B2; AU2022205170A1; US20170340704A1; RU2022102250A; AU2022205170B2

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na ćelije koje sadrže više od jednog himernog antigenskog receptora (CAR).

POZADINA PRONALASKA

[0002] Opisani su brojni imunoterapijski agensi za upotrebu u lečenju karcinoma, uključujući terapeutska monoklonska antitela (mAbs), imunokonjugovana mAbs, radiokonjugovana mAbs i bi-specifični aktivatori T-ćelija.

[0003] Ovi imunoterapijski agensi obično ciljaju jedan antigen: na primer, Rituximab cilja CD20; Myelotarg cilja CD33; a Alemtuzumab cilja CD52.

[0004] Humani CD19 antigen je transmembranski glikoprotein od 95 kd koji pripada superfamiliji imunoglobulina. CD19 se eksprimira veoma rano u diferencijaciji B-ćelija i gubi se samo na terminalnoj diferencijaciji B-ćelija u plazma ćelije. Shodno tome, CD19 je eksprimiran na svim malignitetima B-ćelija osim multiplog mijeloma. Pošto je gubitak normalnog odeljka B-ćelija prihvatljiva toksičnost, CD19 je privlačna meta za CAR i kliničke studije koje ciljaju CD19 pomoću CAR receptora su pokazale obećavajuće rezultate.

[0005] Poseban problem u oblasti onkologije predstavlja Goldie-Coldman hipoteza: koja opisuje da jedno ciljanje jednog antigena može dovesti do bekstva tumora modulacijom pomenutog antigena zbog visoke stope mutacije svojstvene većini karcinoma. Ova modulacija ekspresije antigena može smanjiti efikasnost poznatih imunoterapeutika, uključujući one koji ciljaju CD19.

[0006] To znači da je problem sa imunoterapeuticima usmerenim na CD19 to što malignitet B-ćelija može da mutira i postane CD19-negativan. Ovo može dovesti do recidiva kod CD19-negativnih karcinoma koji ne reaguju na terapije koje ciljaju CD19. Na primer, u jednoj pedijatrijskoj studiji, Grupp i saradnici prijavili su da je polovina svih relapsa nakon terapije koja cilja CD19 himernim antigenskim receptorom za B-akutnu limfoblastnu leukemiju (B-ALL) bila posledica CD19-negativne bolesti (56. godišnji sastanak i izlaganje Američkog društva za hematologiju).

[0007] Stoga postoji potreba za imunoterapijskim agensima koji su sposobni da ciljaju više od jedne ćelijske površinske strukture kako bi odražavali složeni obrazac ekspresije markera koji je povezan sa mnogim vrstama karcinoma, uključujući CD19-pozitivne kancere.

Himerni antigenski receptori (CAR)

[0008] Himerni antigenski receptori su proteini koji kaleme specifičnost, na primer, monoklonskog antitela (mAb) na efektorsku funkciju T-ćelije. Njihov uobičajeni oblik je protein transmembranskog domena tipa I sa amino terminusom koji prepoznaje antigen, spejserom, transmembranskim domenom koji je povezan sa endodomenom jedinjenja koji prenosi signale preživljavanja i aktivacije T-ćelija (videti sliku 1A).

[0009] Najčešći oblik ovih molekula su fuzije jednolančanih varijabilnih fragmenata (scFv) dobijenih od monoklonskih antitela koja prepoznaju ciljni antigen, fuzionisane preko spejsera i trans-membranskog domena sa signalnim endodomenom. Takvi molekuli dovode do aktivacije T-ćelije kao odgovora na prepoznavanje mete od strane scFv. Kada T ćelije eksprimiraju takav CAR, one prepoznaju i ubijaju ciljne ćelije koje eksprimiraju ciljni antigen. Nekoliko CAR receptora je razvijeno protiv antigena povezanih sa tumorom, a pristupi usvajanja transfera koji koriste takve T ćelije koje eksprimiraju CAR su trenutno u fazi kliničkog ispitivanja za lečenje različitih karcinoma.

[0010] Uočeno je da pri korišćenju CAR pristupa za lečenje karcinoma, heterogenost tumora i imuno-uređivanje mogu dovedu do izbegavanja lečenja CAR receptorima. Na primer, u studiji koju su opisali Grupp i saradnici (2013; New Eng. J. Med 368:1509-1518, rad br.380, ASH 2014) pristup CAR-modifikovanih T ćelija je korišćen za lečenje akutne B-limfocitne leukemije. U tom kliničkom ispitivanju je otkriveno da je kod 10 pacijenata sa potpunom remisijom posle mesec dana došlo do relapsa, a 5 od njih imalo je relaps sa CD19-negativnom bolešću.

[0011] Stoga postoji potreba za alternativnim pristupima lečenja CAR receptorima koji se bave problemima bega karcinoma i heterogenosti tumora.

Ekspresija dve specifičnosti vezivanja CAR

[0012] Bispecifični CAR poznati kao tandem CAR ili TanCAR su razvijeni u pokušaju da istovremeno ciljaju više markera specifičnih za karcinom. U TanCAR receptorima, ekstracelularni domen obuhvata dve specifičnosti vezivanja antigena u tandemu, spojene linkerom. Dve specifičnosti vezivanja (scFvs) su stoga obe povezane sa jednim transmembranskim delom: jedan scFv je postavljen u položaj pored membrane, a drugi je u distalnom položaju.

[0013] Grada et al (2013, Mol Ther Nucleic Acids 2:e105) opisuju TanCAR koji uključuje CD19-specifičan scFv, praćen Gli-Ser linkerom, a zatim HER2-specifičan scFv. HER2-scFv je bio u položaju pored membrane, a CD19-scFv u distalnom položaju. Pokazalo se da Tan CAR indukuje različitu reaktivnost T ćelija protiv svakog od dva tumor restriktivna antigena. Ovaj raspored je izabran zato što odgovarajuće dužine HER2 (632 aa/125Å) i CD19 (280aa, 65Å) odgovaraju tom određenom prostornom rasporedu. Takođe je bilo poznato da je HER2 scFv vezao najudaljenije 4 petlje HER2.

[0014] Problem sa ovim pristupom je u tome što scFv pored membrane može biti nepristupačan zbog prisustva distalnog scFv, posebno onog koji je vezan za antigen. S obzirom na potrebu da se izaberu relativni položaji dva scFv obzirom na prostorni raspored antigena na ciljnoj ćeliji, možda neće biti moguće koristiti ovaj pristup za sve parove vezivanja scFv. Štaviše, malo je verovatno da bi se TanCar pristup mogao koristiti za više od dva scFv, TanCAR sa tri ili više scFv bi bio veoma veliki molekul i scFv bi se mogli dobro sklopiti jedan na drugi, zaklanjajući mesta vezivanja antigena. Takođe je diskutabilno da li bi vezivanje antigena najdistalnijim scFv, koji je odvojen od transmembranskog domena sa dva ili više daljih scFv, moglo da izazove aktivaciju T ćelija.

[0015] Stoga postoji potreba za alternativnim pristupom za ekspresiju dve specifičnosti vezivanja CAR na površini ćelije kao što je T ćelija.

[0016] WO 2014/055657 otkriva trans-signalizirajuće CAR T ćelije koje sadrže prvi CAR koji ima prvi signalni modul i drugi CAR koji ima poseban drugi signalni modul.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0017] Ovaj pronalazak obezbeđuje ćeliju koja ko-eksprimira prvi CAR i drugi CAR na površini ćelije, pri čemu svaki CAR sadrži intracelularni signalni domen, pri čemu intracelularni ćelijski signalni domen prvog CAR sadrži CD28 kostimulatorni domen i domen koji sadrži ITAM, ali ne sadrži endodomen porodice TNF receptora; a intracelularni signalni domen drugog CAR obuhvata endodomen familije TNF receptora izabran između OX40 ili 4-1BB endodomena i domena koji sadrži ITAM, ali ne sadrži kostimulatorni domen.

[0018] Antigen-vezujući domen prvog CAR može da se veže za CD19, a domen koji vezuje antigen drugog CAR može da se veže za CD22.

[0019] Činjenica da jedan CAR vezuje CD19, a drugi CAR vezuje CD22 je od prednosti jer neki limfomi i leukemije postaju CD19 negativni nakon ciljanja CD19 (ili možda CD22 negativni nakon ciljanja CD22), tako da daje "rezervni" antigen, ako se ovo dogodi.

[0020] Ćelija može biti imunska efektorska ćelija, kao što je T-ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK). Karakteristike koje se ovde pominju u vezi sa T ćelijom se podjednako primenjuju i na druge imunske efektorske ćelije, kao što su NK ćelije.

[0021] Svaki CAR može da sadrži:

1. (i) antigen-vezujući domen;

2. (ii) spejser; i

3. (iii) trans-membranski domen.

[0022] Spejser prvog CAR može da se razlikuje od spejsera drugog CAR, tako da prvi i drugi CAR ne formiraju heterodimere.

[0023] Spejser prvog CAR može imati drugačiju dužinu i/ili konfiguraciju od spejsera drugog CAR, tako da je svaki CAR prilagođen za prepoznavanje svog odgovarajućeg ciljnog antigena.

[0024] Antigen-vezujući domen drugog CAR može da se veže za distalni membranski epitop na CD22. Antigen-vezujući domen drugog CAR može da se veže za epitop na Ig domenu 1, 2, 3 ili 4 CD22, na primer na Ig domenu 3 CD22.

[0025] Antigen-vezujući domen prvog CAR može da se veže za epitop na CD19 koji je kodiran eksonom 1, 3 ili 4.

[0026] Na primer, jedan CAR (koji može biti specifičan za CD19 ili CD22) može imati strukturu:

AgB1-spejser1-TM1- costim-ITAM

pri čemu:

AgB1 je antigen-vezujući domen;

spejser 1 je spejser;

TM1 je transmembranski domen;

costim je CD28 kostimulatorni domen; i

ITAM je endodomen koji sadrži ITAM;

a drugi CAR (koji može biti CD22 ili CD19-specifičan) može imati strukturu:

AgB2-spejser2-TM2-TNF-ITAM

pri čemu:

AgB2 je antigen-vezujući domen;

spejser 2 je spejser;

TM2 je transmembranski domen;

TNF je endodomen TNF receptora izabran između OX40 ili 4-1BB endodomena; i ITAM je endodomen koji sadrži ITAM.

[0027] Predmetni pronalazak obezbeđuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira i prvi i drugi himerni antigenski receptor (CAR) kao što je gore definisano.

[0028] Sekvenca nukleinske kiseline može imati sledeću strukturu:

AgB1-spejser1-TM1 - costim- ITAM1-coexpr-AbB2-spejser2-TM2-TNF-ITAM2

pri čemu

AgB1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen-vezujući domen prvog CAR; spejser 1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira spejser prvog CAR; TM1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira transmembranski domen prvog CAR; costim je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira kostimulatorni domen CD28;

ITAM1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira endodomen prvog CAR koji sadrži ITAM;

coexpr je sekvenca nukleinske kiseline koja omogućava koekspresiju oba CAR receptora

AgB2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen-vezujući domen drugog CAR; spejser 2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira spejser drugog CAR; TM2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira transmembranski domen drugog CAR;

TNF je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira endodomen TNF receptora izabran između OX40 ili 4-1BB endodomena;

ITAM2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira endodomen drugog CAR koji sadrži ITAM;

koja sekvenca nukleinske kiseline, kada je eksprimirana u ćeliji, kodira polipeptid koji se cepa na mestu cepanja tako da se prvi i drugi CAR ko-eksprimiraju na površini ćelije.

[0029] Sekvenca nukleinske kiseline koja omogućava koekspresiju dva CAR receptora može da kodira samocepajući peptid ili sekvencu koja dozvoljava alternativne načine ko-ekspresije dva CAR, kao što je interna ulazna sekvenca ribozoma ili 2. orimiter ili drugi takav način gde stručnjak u predmetnoj oblasti može da eksprimira dva proteina iz istog vektora.

[0030] Alternativni kodoni mogu da se koriste u regionima sekvence koja kodira iste ili slične aminokiselinske sekvence, kao što je domen transmembranske i/ili intracelujlarne signalizacije T ćelija (endodomen) kako bi se izbegla homologna rekombinacija. Na primer, alternativni kodoni se mogu koristiti u delovima sekvence koji kodiraju spejser, transmembranski domen i/ili ceo ili deo endodomena, tako da dva CAR imaju iste ili slične aminokiselinske sekvence za ovaj deo ili ove delove ali su kodirani različitim sekvencama nukleinskih kiselina.

[0031] Predmetni pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži

1. (i) prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi himerni antigenski receptor (CAR), čija sekvenca nukleinske kiseline ima sledeću strukturu:

AgB1-spejser1-TM1- costim-ITAM1

pri čemu

AgB1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen-vezujući domen prvog CAR;

spejser 1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira spejser prvog CAR; TM1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira transmembranski domen prvog CAR;

costim je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira CD28 kostimulatorni domen;

ITAM1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira endodomen prvog CAR koji sadrži ITAM; i

2. (ii) drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugi himerni antigenski receptor, čija sekvenca nukleinske kiseline ima sledeću strukturu:

AgB2-spejser2-TM2-TNF-ITAM2

AgB2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen-vezujući domen drugog CAR; spejser 2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira spejser drugog CAR;

TM2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira transmembranski domen drugog CAR;

TNF je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira endodomen TNF receptora izabran između OX40 ili 4-1 BB endodomena;

ITAM2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira endodomen drugog CAR koji sadrži ITAM.

[0032] Predmetni pronalazak daje vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema ovom pronalasku. Vektor može da bude lentivirusni vektor.

[0033] Vektor može biti plazmidni vektor, retrovirusni vektor ili transpozonski vektor.

[0034] Predmetni pronalazak obezbeđuje metod za pravljenje ćelije prema pronalasku, koji obuhvata korak uvođenja jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju prvi i drugi CAR; ili jedan ili više vektora, kao što je gore definisano, u ćeliju ex vivo.

[0035] Ćelija može biti iz uzorka izolovanog od pacijenta, srodnog ili nesrodnog donora za transplantaciju hematopoeze, potpuno nepovezanog donora, iz krvi pupčane vrpce, diferencirana od embrionalne ćelijske linije, diferencirana od inducibilne progenitorske ćelijske linije ili izvedena iz transformisane ćelijske linije.

[0036] Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji od više ćelija prema pronalasku.

[0037] Opisan je i postupak za lečenje i/ili prevenciju bolesti, koji obuhvata korak davanja subjektu farmaceutske kompozicije prema pronalasku.

[0038] Postupak može da se sastoji od sledećih koraka:

1. (i) izolovanje uzorka koji sadrži ćeliju od subjekta;

2. (ii) transdukcija ili transfekcija ćelija sa jednom ili više sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju prvi i drugi CAR ili jednim ili više vektora koji sadrže takvu(e) sekvencu(e) nukleinske kiseline; i

3. (iii) davanje ćelija pod (ii) subjektu.

[0039] Bolest može biti karcinom. Karcinom može biti malignitet B ćelija.

[0040] Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bolesti.

[0041] Takođe je opisana upotreba ćelije prema pronalasku u proizvodnji leka za lečenje i/ili prevenciju bolesti.

[0042] Ovde je opisana sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži:

1. a) prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira prvi himerni antigenski receptor (CAR); 2. b) drugu nukleotidnu sekvencu koja kodira drugi CAR;

pri čemu jedan CAR vezuje CD19, a drugi CAR vezuje CD22; i

3. c) sekvencu koja kodira samocepajući peptid pozicioniran između prve i druge nukleotidne sekvence, tako da su dva CAR eksprimirana kao odvojeni entiteti.

[0043] Alternativni kodoni mogu da se koriste u jednom ili više delova prve i druge nukleotidne sekvence u regionima koji kodiraju istu ili sličnu(e) aminokiselinsku(e) sekvencu(e).

[0044] Ovde je takođe opisan vektor i ćelija koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu.

[0045] Predmetni pronalazači su takođe razvili nove anti-CD19 i anti-CD22 CAR sa poboljšanim svojstvima.

[0046] Ovde je opisan himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži CD19-vezujući domen koji sadrži

1. a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji ima regione koji određuju komplementarnost (CDR) sa sledećim sekvencama:

CDR1 - SYWMN (SEQ ID No.15);

CDR2 - QIWPGDGDTNYNGKFK (SEQ ID No.16)

CDR3 - RETTTVGRYYYAMDY (SEQ ID No.17); i

2. b) varijabilni region lakog landa (VL) koji ima CDR sa sledećim sekvencama:

CDR1 - KASQSVDYDGDSYLN (SEQ ID No.18);

CDR2 - DASNLVS (SEQ ID No.19)

CDR3 - QQSTEDPWT (SEQ ID No.20).

[0047] domen vezivanja CD19 može da sadrži VH domen koji ima sekvencu prikazanu kao SEQ ID No.23 ili SEQ ID No.24; ili VL domen koji ima sekvencu prikazanu kao SEQ ID No. 25, SEQ ID No.26 ili SEQ ID No.40 ili njihovu varijantu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence koja zadržava kapacitet da vezuje CD19.

[0048] Domen vezivanja CD19 može da sadrži sekvencu prikazanu kao SEQ ID No.21, SEQ ID No.22 ili SEQ ID No.39 ili njihovu varijantu koja ima najmanje 90% identiteta sekvence koja zadržava kapacitet da vezuje CD19.

[0049] Ovde je opisan himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži CD22-vezujući domen koji sadrži

CDR1 - NYWIN (SEQ ID No.27);

CDR2 - NIYPSDSFTNYNQKFKD (SEQ ID No.28)

CDR3 - DTQERSWYFDV (SEQ ID No.29); i

2. b) varijabilni region lakog landa (VL) koji ima CDR sa sledećim sekvencama:

CDR1 - RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID No.30);

CDR2 - KVSNRFS (SEQ ID No.31)

CDR3 - SQSTHVPWT (SEQ ID No.32).

[0050] domen vezivanja CD22 može da sadrži VH domen koji ima sekvencu prikazanu kao SEQ ID No.35 ili SEQ ID No.36; ili VL domen koji ima sekvencu prikazanu kao SEQ ID No. 37 ili SEQ ID No.38 ili njihovu varijantu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence koja zadržava kapacitet da vezuje CD22.

[0051] Domen vezivanja CD22 može da sadrži sekvencu prikazanu kao SEQ ID No.33 ili SEQ ID No.34 ili njihovu varijantu koja ima najmanje 90% identiteta sekvence koja zadržava kapacitet da vezuje CD22.

[0052] Ovde je opisana ćelija koja eksprimira takav himerni antigenski receptor koji sadrži domen koji se vezuje za CD19 ili takav himerni antigenski receptor koji sadrži domen koji se vezuje za CD22 na površini ćelije.

[0053] Ovde je opisana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira takav himerni antigenski receptor koji sadrži domen koji vezuje CD19 ili takav himerni antigenski receptor koji sadrži domen koji vezuje CD22.

[0054] Ovde je opisan vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline kao što je gore opisano. Vektor može da bude lentivirusni vektor.

[0055] Vektor može biti plazmidni vektor, retrovirusni vektor ili transpozonski vektor.

[0056] Ovde je opisan postupak za pravljenje ćelije kao što je opisano iznad, koji obuhvata korak uvođenja jedne ili više sekvenci, ili jedan ili više vektora, kao što je gore definisano, u ćeliju.

[0057] Ćelija može biti T-ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK). Ćelija može biti iz uzorka izolovanog od pacijenta, srodnog ili nesrodnog donora za transplantaciju hematopoeze, potpuno nepovezanog donora, iz krvi pupčane vrpce, diferencirana od embrionalne ćelijske linije, diferencirana od inducibilne progenitorske ćelijske linije ili izvedena iz transformisane ćelijske linije.

[0058] Ovde je opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži više ćelija kao što je gore opisano.

[0059] Ovde je opisan postupak za lečenje i/ili prevenciju bolesti, koji obuhvata korak davanja subjektu farmaceutske kompozicije subjektu kao što je opisano gore.

[0060] Postupak može da se sastoji od sledećih koraka:

1. (i) izolovanje uzorka koji sadrži ćeliju od subjekta;

2. (ii) transdukcija ili transfekcija ćelija sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira CAR ili vektorom koji sadrži takvu sekvencu nukleinske kiseline; i

3. (iii) davanje ćelija pod (ii) subjektu.

[0061] Bolest može biti karcinom. Karcinom može biti malignitet B ćelija.

[0062] Ovde je opisana farmaceutska kompozicija kao što je opisano gore za upotrebu u lečenju i/ili sprečavanju bolesti.

[0063] Ovde je opisana upotreba ćelije kao što je opisano gore za proizvodnju leka za lečenje i/ili prevenciju bolesti.

[0064] Takođe je data ćelija u skladu sa pronalaskom, koja sadrži prvi CAR koji sadrži domen vezivanja CD19 kao što je gore opisano i drugi CAR koji sadrži domen vezivanja CD22 kao što je gore opisano.

[0065] Takođe je data sekvenca nukleinske kiseline prema pronalasku, koja kodira prvi CAR koji sadrži domen vezivanja CD19 kao što je gore opisano i drugi CAR koji sadrži domen vezivanja CD22 kao što je gore opisano.

[0066] Takođe je obezbeđen komplet prema pronalasku, gde prva sekvenca nukleinske kiseline kodira prvi CAR koji sadrži domen vezivanja CD19 kao što je gore opisano, a druga sekvenca nukleinske kiseline kodira drugi CAR koji sadrži domen vezivanja CD22 kao što je gore opisano.

[0067] Takođe je obezbeđen vektor prema pronalasku, koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi CAR koji sadrži domen vezivanja CD19 kao što je gore opisano i drugi CAR koji sadrži domen vezivanja CD22 kao što je gore opisano.

[0068] Predmetni pronalazači su takođe otkrili da se, u sistemu ILI kapije, performanse poboljšavaju ako se kostimulatorni domen i domen koji proizvodi signale preživljavanja „podeli“ između dva (ili više) CAR receptora.

[0069] Obezbeđivanjem jednog CAR koji cilja CD19 i jednog CAR koji cilja CD22, moguće je ciljati svaki od ovih markera, čime se smanjuje problem bekstva karcinoma.

[0070] Pošto su CAR receptori eksprimirani na površini ćelije kao odvojeni molekuli, ovaj pristup prevazilazi prostorne probleme i probleme pristupačnosti povezane sa TanCAR receptorima. Efikasnost aktivacije ćelija je takođe poboljšana. Ako svaki CAR ima svoj spejser, moguće je prilagoditi rastojanje, a samim tim i udaljenost koju vezujući domen projektuje sa površine ćelije i njegovu fleksibilnost itd. do određenog ciljnog antigena. Ovaj izbor je nesputan razmatranjima dizajna povezanim sa TanCAR receptorima, tj. da jedan CAR treba da bude pored T ćelijske membrane, a jedan CAR treba da bude distalan, pozicioniran u tandemu sa prvim CAR.

[0071] Obezbeđivanjem jedne nukleinske kiseline koja kodira dva CAR receptora razdvojena mestom cepanja, moguće je konstruisati ćelije da ko-eksprimiraju dva CAR receptora korišćenjem jednostavne procedure za jednu transdukciju. Procedura dvostruke transfekcije bi se mogla koristiti sa sekvencama koje kodiraju CAR u odvojenim konstruktima, ali bi to bilo složenije i skuplje i zahtevalo bi više integracionih mesta za nukleinske kiseline.

Procedura dvostruke transfekcije bi takođe bila povezana sa neizvesnošću da li su obe nukleinske kiseline koje kodiraju CAR transdukovane i efikasno eksprimirane.

[0072] CAR će imati delove visoke homologije, na primer, transmembranski i/ili intracelularni signalni domeni će verovatno biti visoko homologni. Ako se isti ili slični linkeri koriste za dva CAR receptora, oni će takođe biti visoko homologni. Ovo bi sugerisalo da bi pristup gde su oba CAR receptora obezbeđena na jednoj sekvenci nukleinske kiseline bio neprikladan, zbog verovatnoće homologne rekombinacije između sekvenci. Međutim, predmetni pronalazači su otkrili da je "kolebanjem kodona" delova oblasti koje kodiraju sekvencu visoke homologije moguće eksprimirati dva CAR receptora iz jednog konstrukta sa visokom efikasnošću. Kolebanje kodona uključuje korišćenje alternativnih kodona u regionima sekvence koja kodira iste ili slične aminokiselinske sekvence.

OPIS SLIKA

[0073]

Slika 1: Shematski dijagram koji ilustruje klasični CAR. (b) do (d): Različite generacije i permutacije CAR endodomena: (b) početni dizajni su prenosili ITAM signale sami preko FcεR1-γ ili CD3ζ endodomena, dok su kasniji dizajni prenosili dodatno (c) jedan ili (d) dva kostimulativna signala u istom endodomenu jedinjenja.

Slika 2: Put sazrevanja B-ćelija / ontogenija B-ćelija. DR=HLA-DR; cCD79 = citoplazmatski CD79; cCD22 = citoplazmatski CD22. I CD19 i CD22 antigeni se eksprimiraju tokom ranih faza sazrevanja B-ćelija. Ove ćelije se razvijaju u akutne leukemije B-ćelija. Ciljanje na CD19 i CD22 istovremeno je najpogodnije za ciljanje akutnih leukemija B-ćelija.

Slika 3: Strategije za dizajn anti-CD19 ILI CD22 CAR kasete. Biraju se veziva koja prepoznaju CD19 i veziva koja prepoznaju CD22. Optimalni spejser domen i signalni domen se biraju za svaki CAR. (a) kaseta ILI kapije je konstruisana tako da se oba CAR receptora ko-ekspresuju korišćenjem FMD-2A peptida. Sve homologne sekvence se podvrgavaju kolebanju kodona da bi se izbegla rekombinacija. (c) Dva CAR receptora se ko-eksprimiraju kao odvojeni proteini na površini T-ćelija.

Slika 4: Primer kolebanja kodona da bi se omogućila ko-ekspresija u retrovirusnom vektoru identičnih peptidnih sekvenci, uz izbegavanje homologne rekombinacije. Ovde je divlji tip HCH2CH3-CD28tmZeta usklađen sa HCH2CH3-CD28tmZeta sa kolebanjem kodona.

Slika 5: Demonstriranje funkcionalnosti anti-CD19 ILI CD22 CAR kapije. (a) Nacrt konstrukta: S1 - signalni peptid 1; HA - oznaka hemaglutina; HCH2CH3 - zglob, CH2CH3 sekvence divljeg tipa IgG1; CD28tmZ - CD28 transmembranski domen i CD3 Zeta kolebljiva sekvenca; 2A - 2A peptid bolesti slinavke i šapa; S2 - signalni peptid 2; V5 - v5 oznaka epitopa; aCD22 - anti-CD22 scFv; HCH2CH3' - zglob, CH2CH3 od IgG1 kolebljive sekvence; CD28tmZ - CD28 transmembranski domen i CD3 Zeta kolebljiva sekvenca.; (b) Koekspresija dva receptora iz jednog vektora. T-ćelije periferne krvi transdukovane su bicistronskim vektorom nakon stimulacije sa OKT3 i anti-CD28. Ćelije su analizirane pet dana nakon transdukcije bojenjem sa anti-V5-FITC (invitrogen) i anti-HA-PE (abCam). Dva CAR receptora se mogu detektovati istovremeno na površini T-ćelije. (c) Netransdukovane T-ćelije, T-ćelije koje eksprimiraju samo anti-CD19 CAR, T-ćelije koje eksprimiraju samo anti-CD22 CAR i T-ćelije koje eksprimiraju anti-CD19 ILI CD22 CAR kapiju su izazvane ciljnim ćelijama koje ne eksprimiraju ni CD19 ili CD22, ili CD19 ili CD22 pojedinačno, ili oba antigena. T-ćelije koje eksprimiraju anti-CD19 ILI CD22 CAR kapiju mogu ubiti ciljne ćelije čak i ako je jedan antigen bio odsutan.

Slika 6: Određivanje afiniteta za mišji CD22ALAb scFv, humanizovani CD22ALAb scFv i M971 scFv korišćenjem Biacore sistema

Slika 7: Određivanje afiniteta za mišji CD19ALAb scFv i humanizovani CD19ALAb korišćenjem Biacore sistema

Slika 8: Poređenje kinetike vezivanja između vezivanja rastvorljivog scFv-CD19 za CD19ALAb scFv i fmc63 scFv

Slika 9: Šematski dijagram koji ilustruje CD19ALAb CAR, fmc63 CAR, CD22ALAb CAR i M971 CAR koji se koristi u uporednim studijama

Slika 10: Test ubijanja CD19 pozitivnih ciljnih ćelija upoređujući CAR sa antigenvezujućim domenom CD19ALAb i ekvivalentnim CAR sa fmc63-vezujućim domenom.

Slika 11: A) Test ubijanja CD22 pozitivnih ciljnih ćelija upoređujući CAR sa antigenvezujućim domenom CD22ALAb i ekvivalentnim CAR sa M971-vezujućim domenom. B) Test koji upoređuje oslobađanje IFNγ nakon ko-kulture 1:1 sa CD22 pozitivnim SupT1 ćelijama

Slika 12: Struktura CD19 i egzoni

Slika 13: Šematski dijagrami i mape konstrukta koje ilustruju četiri konstrukta testirana u Primeru 5. U mapi konstrukta, delovi označeni sa ' su sa kolebanjem kodona.

A: I CD19 i CD22 CAR imaju endodomene jedinjenja 41BB-CD3zeta; B: I CD19 i CD22 CAR imaju endodomene jedinjenja OX40-CD3zeta; C: CD19 CAR ima endodomen jedinjenja 41BB-CD3zeta, a CD22 CAR ima endodomen jedinjenja CD28-CD3zeta; i D: CD19 CAR ima endodomen jedinjenja OX40-CD3zeta, a CD22 CAR ima endodomen jedinjenja CD28-CD3zeta

Slika 14: Ubijanje ciljnih ćelija ćelijama koje eksprimiraju konstrukte prikazane na Slici 13.

DETALJAN OPIS

HIMERNI ANTIGENSKI RECEPTORI (CAR)

[0074] CAR receptori, koji su šematski prikazani na Slici 1, su himerni transmembranski proteini tipa I koji povezuju ekstracelularni domen koji prepoznaje antigen (vezivo) sa intracelularnim signalnim domenom (endodomenom). Vezivo je tipično jednolančani varijabilni fragment (scFv) izveden iz monoklonskog antitela (mAb), ali može biti zasnovano na drugim formatima koji sadrže mesto vezivanja antigena slično antitelu. Spejser domen je obično neophodan da bi se vezivo izolovalo od membrane i da bi mu se omogućila odgovarajuća orijentacija. Uobičajeni spejser domen koji se koristi je Fc IgG1. Kompaktniji spejseri mogu biti dovoljni npr. stabljika CD8α, pa čak i samo IgG1 zglob, u zavisnosti od antigena. Trans-membranski domen ankeriše protein u ćelijskoj membrani i povezuje spejser sa endodomenom.

[0075] Rani dizajn CAR receptora su imali endodomene izvedene iz intracelularnih delova bilo g lanca FceR1 ili CD3ζ. Shodno tome, ovi receptori prve generacije su prenosili imunološki signal 1, koji je bio dovoljan da pokrene ubijanje T-ćelija srodnih ciljnih ćelija, ali nisu uspeli da u potpunosti aktiviraju T-ćeliju da se razmnožava i preživi. Da bi se prevazišlo ovo ograničenje, konstruisani su endodomeni jedinjenja: fuzija intracelularnog dela kostimulativnog molekula T-ćelije sa onim od CD3ζ dovodi do receptora druge generacije koji mogu da prenesu aktivirajući i kostimulativni signal istovremeno nakon prepoznavanja antigena. Kostimulativni domen koji se najčešće koristi je CD28. Ovo obezbeđuje najmoćniji kostimulativni signal – naime imunološki signal 2, koji pokreće proliferaciju T-ćelija. Takođe su opisani neki receptori koji uključuju endodomene porodice TNF receptora, kao što su blisko povezani OX40 i 41BB koji prenose signale preživljavanja. Sada su opisani još moćniji CAR receptori treće generacije koji imaju endodomene sposobne da prenose signale aktivacije, proliferacije i preživljavanja.

[0076] Nukleinske kiseline koje kodiraju CAR mogu se preneti u T ćelije koristeći, na primer, retrovirusne vektore. Mogu se koristiti lentivirusni vektori. Na ovaj način može da se generiše veliki broj T ćelija specifičnih za karcinom za adoptivni ćelijski transfer. Kada se CAR vezuje za ciljni antigen, to rezultira prenosom aktivirajućeg signala do T-ćelije na kojoj se eksprimuje. Tako CAR usmerava specifičnost i citotoksičnost T ćelije ka tumorskim ćelijama eksprimirajući ciljani antigen.

[0077] Ovde je opisana ćelija koja koeksprimira prvi CAR i drugi CAR, pri čemu jedan CAR može da veže CD19, a drugi CAR može da veže CD22, tako da T-ćelija može da prepozna ciljne ćelije koje eksprimiraju bilo koji od ovih markera.

[0078] Dakle, kao što je ovde opisano, domeni za vezivanje antigena prvog i drugog CAR receptora predmedtnog pronalaska vezuju se za različite antigene i oba CAR receptora sadrže aktivirajući endodomen. Dva CAR receptora mogu da sadrže spejser domene koji mogu biti isti, ili dovoljno različiti da spreče unakrsno uparivanje dva različita receptora. Stoga se ćelija može konstruisati da se aktivira nakon prepoznavanja jednog ili oba CD19 i CD22. Ovo je korisno u oblasti onkologije kao što ukazuje Goldie-Coldman hipoteza: jedno ciljanje jednog antigena može dovesti do bekstva tumora modulacijom pomenutog antigena zbog visoke stope mutacije svojstvene većini karcinoma. Istovremenim ciljanjem dva antigena, verovatnoća takvog bekstva se eksponencijalno smanjuje.

[0079] Važno je da se dva CAR receptora ne heterodimerizuju.

[0080] Prvi i drugi CAR T ćelije predmetnog pronalaska mogu se proizvesti kao polipeptid koji sadrži oba CAR receptora, zajedno sa mestom cepanja.

SIGNALNI PEPTID

[0081] CAR ćelije ovog pronalaska mogu sadržati signalni peptid, tako da kada se CAR eksprimuje unutar ćelije, kao što je T-ćelija, nastali protein se usmerava na endoplazmatski retikulum, a zatim i na površinu ćelije, gde je eksprimovan.

[0082] Jezgro signalnog peptida može da sadrži dugi deo hidrofobnih aminokiselina koje imaju tendenciju da formiraju jedan alfa heliks. Signalni peptid može početi sa kratkim pozitivno naelektrisanim delom aminokiselina, što pomaže da se primeni pravilna topologija polipeptida tokom translokacije. Na kraju signalnog peptida tipično se nalazi deo aminokiselina koju prepoznaje i cepa signalna peptidazoa. Signalna peptidaza se može cepati tokom ili nakon završetka translokacije da bi se stvorio slobodni signalni peptid i zreli protein. Slobodni signalni peptidi se zatim digestiraju specifičnim proteazama.

[0083] Signalni peptid može biti na amino terminusu molekula.

[0084] Signalni peptid može da sadrži SEQ ID No.1, 2 ili 3 ili njegovu varijantu koja ima 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinskih mutacija (insercije, supstitucije ili adicije) pod uslovom da signalni peptid još uvek funkcioniše na izazivaju ekspresiju CAR na površini ćelije.

SEQ ID No.1: MGTSLLCWMALCLLGADHADG

[0085] Signalni peptid SEQ ID No.1 je kompaktan i izuzetno efikasan. Predviđeno je da će dati oko 95% cepanja nakon terminalnog glicina, dajući efikasno uklanjanje signalnom peptidazom.

SEQ ID No.2: MSLPVTALLLPLALLLHAARP

[0086] Signalni peptid SEQ ID No.2 je izveden iz lgG1.

SEQ ID No.3: MAVPTQVLGLLLLWLTDARC

[0087] Signalni peptid SEQ ID No.3 je izveden iz CD8.

[0088] Signalni peptid za prvi CAR može da ima drugačiju sekvencu od signalnog peptida drugog CAR.

CD19

[0089] Humani CD19 antigen je transmembranski glikoprotein od 95 kd koji pripada superfamiliji imunoglobulina. CD19 je klasifikovan kao transmembranski protein tipa I, sa jednim transmembranskim domenom, citoplazmatskim C-terminusom i ekstracelularnim N-terminusom. Opšta struktura za CD19 je ilustrovana na slici 12.

[0090] CD19 je biomarker za normalne i neoplastične B ćelije, kao i folikularne dendritične ćelije. U stvari, prisutan je na B ćelijama od najranijih prepoznatljivih ćelija B-loze tokom razvoja do blasta T-ćelija, ali se gubi sazrevanjem do plazma ćelija. On prvenstveno deluje kao koreceptor B ćelija u kombinaciji sa CD21 i CD81. Nakon aktivacije, citoplazmatski rep CD19 postaje fosforilisan, što dovodi do vezivanja kinazama Src porodice i regrutovanja PI-3 kinaze. CD19 se eksprimira veoma rano u diferencijaciji B-ćelija i gubi se samo na terminalnoj diferencijaciji B-ćelija u plazma ćelije. Shodno tome, CD19 je eksprimiran na svim malignitetima B-ćelija osim multiplog mijeloma.

[0091] Različiti dizajni CAR su testirani u odnosu na CD19 u različitim centrima, kao što je navedeno u sledećoj tabeli:

Tabela 1

[0092] Kao što je gore prikazano, većina studija sprovedenih do danas koristila je scFv izveden iz hibridoma fmc63 kao deo vezujućeg domena za prepoznavanje CD19.

[0093] Kao što je prikazano na slici 12, gen koji kodira CD19 sadrži deset egzona: egzoni 1 do 4 kodiraju ekstraćekstracelularni domen; egzon 5 kodira transmembranski domen; a egzoni 6 do 10 kodiraju citoplazmatski domen,

[0094] U CD19/CD22 ILI kapiji, antigen-vezujući domen anti-CD19 CAR može da veže epitop CD19 kodiranog eksonom 1 gena CD19.

[0095] U CD19/CD22 ILI kapiji, antigen-vezujući domen anti-CD19 CAR može da veže epitop CD19 kodiranog eksonom 3 gena CD19.

[0096] U CD19/CD22 OR kapiji, antigen-vezujući domen anti-CD19 CAR može da veže epitop CD19 kodiranog eksonom 4 gena CD19.

CD19ALAb

[0097] Predmetni pronalazači su razvili novi anti-CD19 CAR koji ima poboljšana svojstva u poređenju sa poznatim anti-CD19 CAR koji sadrži vezivo fmc63 (videti Primere 2 i 3). Domen za vezivanje antigena CAR može biti zasnovan na CD19 vezivu CD19ALAb, koji ima CDR i VH/VL regione identifikovane u nastavku.

[0098] Ovde je opisan CAR koji sadrži CD19-vezujući domen koji sadrži a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji ima regione koji određuju komplementarnost (CDR) sa sledećim sekvencama:

CDR1 - SYWMN (SEQ ID No.15);

CDR2 - QIWPGDGDTNYNGKFK (SEQ ID No.16)

CDR3 - RETTTVGRYYYAMDY (SEQ ID No.17); i

b) varijabilni region lakog landa (VL) koji ima CDR sa sledećim sekvencama:

CDR1 - KASQSVDYDGDSYLN (SEQ ID No.18);

CDR2 - DASNLVS (SEQ ID No.19)

CDR3 - QQSTEDPWT (SEQ ID No.20).

[0099] Možda je moguće uvođenje jedne ili više mutacija (supstitucije, adicije, delecije) u jedan ili svaki CDR bez negativnog uticaja na aktivnost vezivanja CD19. Svaki CDR može, na primer, imati jednu, dve ili tri aminokiselinske mutacije.

[0100] CAR može da sadrži jednu od sledećih aminokiselinskih sekvenci:

SEQ ID No.21 (miš a CD19ALAb scFv sekvenca)

SEQ ID No.22 (humanizovana CD19ALAb scFv sekvenca - teška 19, kapa 16)

SEQ ID No.39 (humanizovana CD19ALAb scFv sekvenca - teška 19, kapa 7)

[0101] scFv može biti VH-VL orijentisan (kao što je prikazano u SEQ ID No.21, 22 i 39) ili VL-VH orijentisan.

[0102] CAR može da sadrži jednu od sledećih VH sekvenci:

SEQ ID No.23 (miš a CD19ALAb VH sekvenca)

SEQ ID No.24 (humanizovana CD19ALAb VH sekvenca)

[0103] CAR može da sadrži jednu od sledećih VL sekvenci:

SEQ ID No.25 (mišja CD19ALAb VL sekvenca)

SEQ ID No.26 (humanizovana CD19ALAb VL sekvenca, kapa 16)

SEQ ID No.40 (humanizovana CD19ALAb VL sekvenca, kapa 7)

[0104] CAR može da sadrži varijantu sekvence prikazane kao SEK ID br.21, 22, 23, 24, 25, 26, 39 ili 40 koja ima najmanje 80, 85, 90, 95, 98 ili 99% identiteta sekvence, pod uslovom da varijantna sekvenca zadrži kapacitet da veže CD19 (kada je u sprezi sa komplementarnim VL ili VH domenom, ako je prikladno).

[0105] Procentualni identitet između dve polipeptidne sekvence može se lako odrediti pomoću programa kao što je BLAST koji je besplatno dostupan na http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.

CD22

[0106] Humani CD22 antigen je molekul koji pripada SIGLEC porodici lektina. Nalazi se na površini zrelih B ćelija i na nekim nezrelim B ćelijama. Uopšteno govoreći, CD22 je regulatorni molekul koji sprečava prekomernu aktivaciju imunskog sistema i razvoj autoimunih bolesti.

[0107] CD22 je transmembranski protein koji se vezuje za šećer, koji specifično vezuje sijalinsku kiselinu sa domenom imunoglobulina (Ig) koji se nalazi na njegovom N-kraju. Prisustvo Ig domena čini CD22 članom superfamilije imunoglobulina. CD22 funkcioniše kao inhibitorni receptor za signalizaciju receptora B ćelija (BCR).

[0108] CD22 je molekul IgSF koji može postojati u dve izoforme, jednoj sa sedam domena i intra-citoplazmatskim repom koji se sastoji od tri ITIM (inhibiciona motiva zasnovana na imunskom receptoru tirozina) i jednog ITAM; i varijanti spajanja koja se umesto toga sastoji od pet ekstracelularnih domena i intra-citoplazmatskog repa koji nosi jedan ITIM. Smatra se da je CD22 inhibitorni receptor uključen u kontrolu odgovora B-ćelija na antigen. Kao i CD19, CD22 se široko smatra pan-B antigenom, iako je opisana ekspresija na nekom nelimfoidnom tkivu. Ciljanje CD22 terapeutskim monoklonskim antitelima i imunokonjugatima je ušlo u kliničko ispitivanje.

[0109] Primere anti-CD22 CAR opisali su Haso et al. (Blood; 2013; 121(7)). Konkretno, opisani su anti-CD22 CAR sa anigen-vezujućim domenima koji su izvedeni iz m971, HA22 i BL22 scFvs.

[0110] Antigen-vezujući domen anti-CD22 CAR može da veže CD22 sa KDu opsegu 30-50 nM, na primer 30-40 nM. The KDmože biti oko 32nM.

[0111] CD-22 ima sedam ekstracelularnih IgG domena, koji se obično identifikuju kao Ig domen 1 do Ig domen 7, pri čemu je Ig domen 7 najproksimalniji u odnosu na B ćelijsku membranu, a Ig domen 7 najdistalniji u odnosu na Ig ćelijsku membranu (videti Haso et al 2013 kao gore na Slici 2B).

[0112] Pozicije Ig domena u smislu aminokiselinske sekvence CD22 (http://www.uni rot.or /uni rot/P20273 su sumirane u sledećo tabeli:

[0113] Antigen-vezujući domen drugog CAR može da se veže za distalni membranski epitop na CD22. Antigen-vezujući domen drugog CAR može da se veže za epitop na Ig domenu 1, 2, 3 ili 4 CD22, na primer na Ig domenu 3 CD22. Antigen-vezujući domen drugog CAR može da se veže za epitop koji se nalazi između aminokiselina 20-416 na CD22, na primer između amino kiselina 242-326 na CD22.

[0114] Anti-CD22 antitela HA22 i BL22 (Haso et al 2013 kao gore) i CD22ALAb, opisana u nastavku, vezuju se za epitop na Ig domenu 3 CD22.

[0115] Domen koji se vezuje za antigen drugog CAR se možda neće vezati za membranski proksimalni epitop na CD22. Antigen-vezujući domen drugog CAR se možda neće vezati za epitop na Ig domenu 5, 6 ili 7 CD22. Antigen-vezujući domen drugog CAR se možda neće vezati za epitop koji se nalazi između aminokiselina 419-676 na CD22, kao što je između 505-676 na CD22.

CD22ALAb

[0116] Predmetni pronalazači su razvili novi anti-CD22 CAR koji ima poboljšana svojstva u poređenju sa poznatim anti-CD22 CAR koji sadrži vezivo m971 (videti Primere 2 i 3 i Haso et al (2013) kao gore). Domen za vezivanje antigena CAR je zasnovan na CD22 vezivu CD22ALAb, koji ima CDR i VH/VL regione identifikovane u nastavku.

[0117] Ovde je opisan CAR koji sadrži CD22-vezujući domen koji obuhvata

CDR1 - NYWIN (SEQ ID No.27);

CDR2 - NIYPSDSFTNYNQKFKD (SEQ ID No.28)

CDR3 - DTQERSWYFDV (SEQ ID No.29); i

2. b) varijabilni region lakog landa (VL) koji ima CDR sa sledećim sekvencama:

CDR1 - RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID No.30);

CDR2 - KVSNRFS (SEQ ID No.31)

CDR3 - SQSTHVPWT (SEQ ID No.32).

[0118] Možda je moguće uvođenje jedne ili više mutacija (supstitucije, adicije, delecije) u jedan ili svaki CDR bez negativnog uticaja na aktivnost vezivanja CD22. Svaki CDR može, na primer, imati jednu, dve ili tri aminokiselinske mutacije.

[0119] CAR može da sadrži jednu od sledećih aminokiselinskih sekvenci:

SEQ ID No.33 (miš a CD22ALAb scFv sekvenca)

SEQ ID No.34 (humanizovana CD22ALAb scFv sekvenca)

[0120] scFv može biti VH-VL orijentisan (kao što je prikazano u SEQ ID No.33, i 34) ili VL-VH orijentisan.

[0121] CAR može da sadrži jednu od sledećih VH sekvenci:

SEQ ID No.35 (miš a CD22ALAb VH sekvenca)

SEQ ID No.36 (humanizovana CD22ALAb VH sekvenca)

[0122] CAR može da sadrži jednu od sledećih VL sekvenci:

SEQ ID No.37 (miš a CD22ALAb VL sekvenca)

SEQ ID No.38 (humanizovana CD22ALAb VL sekvenca)

[0123] CAR može da sadrži varijantu sekvence prikazane kao SEQ ID No.33, 34, 35, 36, 37 ili 38 koja ima najmanje 80, 85, 90, 95, 98 ili 99% identiteta sekvence, pod uslovom da varijantna sekvenca zadrži kapacitet da veže CD22 (kada je u sprezi sa komplementarnim VL ili VH domenom, ako je prikladno).

EKSPRESIJA ANTIGENA B-ĆELIJA TOKOM ONTOGENIJE B-ĆELIJA I NAKNADNI TUMORI

[0124] CD19 se naširoko smatra pan-B antigenom, iako vrlo povremeno, može da pokaže određenu hematopoeznu lozu. Molekul CD19 se sastoji od dva ekstracelularna IgSF domena odvojena manjim domenom i dugim intracitoplazmatskim repom, velikim skoro kao ekstracelularni deo molekula, koji nosi jedan ITAM. CD19 je ključni molekul u razvoju i aktivaciji B-ćelija. CD22 je molekul IgSF koji može postojati u dve izoforme, jednoj sa sedam domena i intra-citoplazmatskim repom koji se sastoji od tri ITIM (inhibiciona motiva zasnovana na imunskom receptoru tirozina) i jednog ITAM; i varijanti spajanja koja se umesto toga sastoji od pet ekstracelularnih domena i intra-citoplazmatskog repa koji nosi jedan ITIM. Smatra se da je CD22 inhibitorni receptor uključen u kontrolu odgovora B-ćelija na antigen. Kao i CD19, CD22 se široko smatra pan-B antigenom, iako je opisana ekspresija na nekom nelimfoidnom tkivu (Wen et al. (2012) J. Immunol. Baltim. Md 1950188, 1075-1082). Ciljanje CD22 terapeutskim monoklonskim antitelima i imunokonjugatima je ušlo u kliničko ispitivanje. Generacija CD22 specifičnih CAR je opisana u (Haso et al, 2013, Blood: Volume 121; 7: 1165-74, i James et al 2008, Journal of immunology, Volume 180; Izdanje 10; Strane 7028-38).

[0125] Detaljne studije imunofenotipizacije leukemije B-ćelija pokazuju da dok je površinski CD19 uvek prisutan, površinski CD22 je skoro uvek prisutan. Na primer, Raponi i saradnici (2011, kao gore) proučavali su fenotip površinskog antigena u 427 slučajeva B-ALL i pronašli da je CD22 prisutan u 341 proučavanom slučaju.

[0126] Mogućnost smanjenja CD19 nakon ciljanja CAR19 opisanog iznad može se objasniti Goldie-Coldman hipotezom. Goldie-Coldman hipoteza predviđa da ćelije tumora mutiraju do otpornog fenotipa brzinom koja zavisi od njihove intrinzične genetske nestabilnosti i da verovatnoća da će karcinom sadržati rezistentne klonove zavisi od brzine mutacije i veličine tumora. Iako je možda teško da ćelije karcinoma postanu suštinski otporne na direktno ubijanje citotoksičnih T-ćelija, gubitak antigena ostaje moguć. Zaista, ova pojava je ranije prijavljivana sa ciljanim antigenima melanoma i limfomima izazvanim EBV. Prema Goldie-Coldman hipotezi, najbolja šansa za izlečenje bila bi istovremeni napad na mete koje nisu unakrsno otporne. S obzirom na to da je CD22 eksprimiran u skoro svim slučajevima B-ALL, istovremeno CAR ciljanje CD19 zajedno sa CD22 može smanjiti pojavu rezistentnih CD19 negativnih klonova.

ANTIGEN-VEZUJUĆI DOMEN

[0127] Domen koji se vezuje za antigen je deo CAR receptora koji prepoznaje antigen. Brojni antigen-vezujući domeni su poznati u predmetnoj oblasti, uključujući one zasnovane na mestu vezivanja antigena antitela, mimeticima antitela i receptorima T-ćelija. Na primer, antigen-vezujući domen n može da sadrži: jednolančani varijabilni fragment (scFv) izveden iz monoklonskog antitela; prirodni ligand ciljnog antigena; peptid sa dovoljnim afinitetom za cilj; jednodomensko antitelo; veštačko jedno vezivo kao što je Darpin (dizajniran protein ponovljenih ankirina); ili jednolančani izveden iz T-ćelijskog receptora.

[0128] Antigen vezujući domen CAR receptora koji vezuje CD19 može da bude bilo koji domen koji je sposoban da veže CD19. Na primer, antigen-vezujući domen može da sadrži CD19 vezivo kao što je opisano u Tabeli 1.

[0129] Antigen-vezujući domen CAR receptora koji se vezuje za CD19 može da sadrži sekvencu izvedenu iz jednog od veziva za CD19 prikazanih u Tabeli 2.

Tabela 2

[0130] Antigen vezujući domen CAR receptora koji vezuje CD22 može da bude bilo koji domen koji je sposoban da veže CD22. Na primer, antigen-vezujući domen može da sadrži CD22 vezivo kao što je opisano u Tabeli 3.

Tabela 3

DOMEN SPEJSERA

[0131] CAR receptori sadrže spejser sekvencu za povezivanje antigen-vezujućeg domena sa transmembranskim domenom i prostorno odvajanje antigen-vezujućeg domena od endodomena. Fleksibilni spejser omogućava antigen-vezujućem domenu da se orijentiše u različitim pravcima kako bi se olakšalo vezivanje.

[0132] U ćeliji predmetnog pronalaska, prvi i drugi CAR mogu da sadrže različite molekule spejsera. Na primer, spejser sekvenca može, na primer, da sadrži IgG1 Fc region, IgG1 zglob ili humano CD8 stablo ili mišje CD8 stablo. Spejser može alternativno da sadrži alternativnu sekvencu linkera koja ima sličnu dužinu i/ili svojstva razmaka između domena kao IgG1 Fc region, IgG1 šarka ili CD8 stablo. Ljudski IgG1 spejser može biti izmenjen da bi se uklonili Fc vezujući motivi.

[0133] Spejser za anti-CD19 CAR može da sadrži spejser CD8 ili spejser koji ima dužinu ekvivalentnu CD8 spejseru. Spejser za anti-CD19 CAR može imati najmanje 30 amino kiselina ili najmanje 40 amino kiselina. Može imati između 35-55 aminokiselina, na primer između 40-50 aminokiselina. Može imati oko 46 aminokiselina.

[0134] Spejser za anti-CD22 CAR može da sadrži IgG1 zglobni spejser ili spejser koji ima dužinu ekvivalentnu IgG1 zglobnom spejseru. Spejser za anti-CD22 CAR može imati manje od 30 amino kiselina ili manje od 25 amino kiselina. Može imati između 15-25 aminokiselina, na primer između 18-22 aminokiselina. Može imati oko 20 aminokiselina.

[0135] Primeri sekvenci aminokiselina za ove spejsere su dati u nastavku:

[0136] Pošto su CAR obično homodimeri (videti Sliku 1a), unakrsno uparivanje može dovesti do heterodimernog himernog antigenskog receptora. Ovo je nepoželjno iz različitih razloga, na primer: (1) epitop možda nije na istom "nivou" na ciljnoj ćeliji, tako da ukršteni CAR može biti u stanju da se veže samo za jedan antigen; (2) VH i VL iz dva različita scFv mogu da se zamene i ili ne uspeju da prepoznaju cilj ili, još gore, da prepoznaju neočekivani i nepredviđeni antigen. Spejser prvog CAR može biti dovoljno različit od spejsera drugog CAR da bi se izbeglo unakrsno uparivanje. Aminokiselinska sekvenca prvog spejsera može da deli manje od 50%, 40%, 30% ili 20% identiteta na nivou aminokiselina sa drugim spejserom.

TRANSMEMBRANSKI DOMEN

[0137] Transmembranski domen je sekvenca CAR koja obuhvata membranu.

[0138] Transmembranski domen može biti bilo koja proteinska struktura koja je termodinamički stabilna u membrani. Ovo je tipično alfa heliks koji se sastoji od nekoliko hidrofobnih ostataka. Transmembranski domen bilo kog transmembranskog proteina može se koristiti za snabdevanje transmembranskog dela pronalaska. Prisustvo i raspon transmembranskog domena proteina mogu odrediti stručnjaci u ovoj oblasti koristeći TMHMM algoritam (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/). Sem toga, imajući u vidu da je transmembranski domen proteina relativno jednostavna struktura, tj. polipeptidna sekvenca za koju se predviđa da formira hidrofobni alfa heliks dovoljne dužine da obuhvati membranu, veštački dizajniran TM domen se takođe može koristiti (US 7052906 B1 opisuje sintetičke transmembranske komponente).

[0139] Transmembranski domen može da potiče od CD28, što daje dobru stabilnost receptora.

[0140] Transmembranski domen može biti izveden iz humanog Tyrp-1. tyrp-1 transmembranska sekvenca je prikazana kao SEQ ID No.45.

SEQ ID No.45

IIAIAVVGALLLVALIFGTASYLI

AKTIVIRANJE ENDODOMENA

[0141] Endodomen je deo CAR za prenos signala. Nakon prepoznavanja antigena, klaster receptora, nativni CD45 i CD148 se isključuju iz sinapse i signal se prenosi u ćeliju. Najčešće korišćena komponenta endodomena je komponenta CD3-zeta koja sadrži 3 ITAM. Ovo prenosi aktivacioni signal na T ćeliju nakon što se antigen veže. CD3-zeta možda neće obezbediti potpuno kompetentan aktivacioni signal i može biti potrebna dodatna kostimulatorna signalizacija. Na primer, himerni CD28 i OX40 se mogu koristiti sa CD3-Zeta za prenos proliferativnog signala / signala preživljavanja, ili se sva tri mogu koristiti zajedno.

[0142] Ćelija ovog pronalaska sadrži dva CAR receptora, svaki sa intracelularnim signalnim domenom; endodomen prvog CAR obuhvata kostimulatorni domen, pri čemu je kostimlatorni domen CD28 kostimulatorni domen, i domen koji sadrži ITAM, ali ne sadrži endodomen porodice TNF receptora; a endodomen drugog CAR obuhvata endodomen familije TNF receptora, pri čemu je endodomen familije TNF receptora OX40 ili 4-1BB endodomen, i domen koji sadrži ITAM, ali ne sadrži kostimulatorni domen.

[0143] Kao takvi, domeni koji proizvode signale kostimulacije i preživljavanja se „dele“ između dva (ili više) CAR receptora u ILI kapiji. Na primer, ako ILI kapija ima dva CAR receptora, CAR A i CAR B, CAR A sadrži CD28 kostimulatorni domen, a CAR B sadrži endodomen porodice TNF receptora, izabran između OX40 ili 4-1BB endodomena.

[0144] Endodomen koji sadrži ITAM motiv može da deluje kao aktivacioni endodomen u ovom pronalasku. Poznato je da nekoliko proteina sadrži endodomene sa jednim ili više ITAM motiva. Primeri takvih proteina uključuju CD3 epsilon lanac, CD3 gama lanac i CD3 delta lanac da spomenemo samo neke. ITAM motiv se lako može prepoznati kao tirozin odvojen od leucina ili izoleucina pomoću bilo koje dve druge aminokiseline, dajući potpis YxxL/I. Tipično, ali ne uvek, dva od ovih motiva su razdvojena sa između 6 i 8 aminokiselina u repu molekula (YxxL/Ix(6-8)YxxL/I). Stoga, stručnjak u ovoj oblasti može lako da pronađe postojeće proteine koji sadrže jedan ili više ITAM za prenos aktivacionog signala. Dalje, s obzirom na to da je motiv jednostavan i da nije potrebna složena sekundarna struktura, stručnjak u ovoj oblasti može da dizajnira polipeptide koji sadrže veštačke ITAM za prenos aktivacionog signala (videti WO 2000/063372, koji se odnosi na sintetičke signalne molekule).

[0145] Transmembranski i intracelularni T-ćelijski signalni domen (endodomen) CAR sa aktivirajući endodomenom može da sadrži sekvencu prikazanu kao SEQ ID No.9 ili 10 ili njenu varijantu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence.

SEQ ID No.9 koji sadrži CD28 transmembranski domen i CD3 Z endodomen

SEQ ID No.10 koji sadrži CD28 transmembranski domen i CD28 i CD3 Zeta endodomene

SEQ ID No.11 koji sadrži CD28 transmembranski domen i CD28, OX40 i CD3 Zeta endodomene (samo za referencu).

[0146] Varijanta sekvence može imati najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99% identičnost sekvence sa SEQ ID No.9 ili 10, pod uslovom da sekvenca obezbeđuje efikasan transmembranski domen i efikasan intracelularni signalni domen T ćelija.

„PODELJENI“ ENDODOMENI „ILI“ KAPIJE

[0147] Ovaj pronalazak obezbeđuje ILI kapiju u kojoj su domeni signala kostimulacije/preživljavanja „podeljeni“ između dva CAR receptora.

[0148] U tom smislu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju koja ko-eksprimira prvi himerni antigenski receptor (CAR) i drugi CAR na površini ćelije, pri čemu svaki CAR sadrži intracelularni signalni domen, pri čemu intracelularni ćelijski signalni domen prvog CAR sadrži CD28 kostimulatorni domen i domen koji sadrži ITAM, ali ne sadrži endodomen porodice TNF receptora; a intracelularni signalni domen drugog CAR obuhvata endodomen familije TNF receptora izabran između OX40 ili 4-1BB endodomena i domena koji sadrži ITAM, ali ne sadrži kostimulatorni domen.

[0149] Prvi i drugi CAR mogu da se vežu za različite antigene. Na primer, prvi CAR može da veže CD19, a drugi CAR može da veže CD22; alternativno, prvi CAR može da veže CD22, a drugi CAR može da veže CD19.

[0150] Intracelularni signalni domen prvog CAR sadrži CD28 kostimulatorni domen i ne sadrži domen koji prenosi signale preživljavanja (kao što je endodomen porodice TNF receptora). Intracelularni signalni domen drugog CAR sadrži endodomen familije TNF receptora izabran između OX40 ili 4-1BB endodomena i ne sadrži kostimulativni domen (kao što je CD28 endodomen).

[0151] Kostimulativni domen je CD28 kostimulativni domen. CD28 kostimulativni domen može imati sekvencu prikazanu kao SEQ ID No.41.

SEQ ID No.41 (CD28 kostimulatorni endodomen) SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

[0152] CAR iz pronalaska može da sadrži varijantu sekvence prikazane kao SEQ ID No.41 koja ima najmanje 80, 85, 90, 95, 98 ili 99% identiteta sekvence, pod uslovom da varijantna sekvenca zadrži kapacitet da kostimuliše T ćelije nakon prepoznavanja antigena, tj. da obezbedi signal 2 T ćelijama.

[0153] Endodomen familije TNF receptora je OX40 ili 4-1BB endodomen. OX40 kostimulativni domen može imati sekvencu prikazanu kao SEQ ID No.42.4-1BB kostimulativni domen može imati sekvencu prikazanu kao SEQ ID No.43.

SEQ ID No.42 (OX40 endodomen) RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI SEQ ID No.43 (4-1BB endodomen) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

[0154] CAR može da sadrži varijantu sekvence prikazane kao SEQ ID No.42, ili 43 koja ima najmanje 80, 85, 90, 95, 98 ili 99% identiteta sekvence, pod uslovom da varijantna sekvenca zadrži kapacitet da transmituje signal preživljavanja na T ćelije nakon prepoznavanja antigena.

[0155] Intracelularni signalni domen prvog i drugog CAR obuhvata domen koji sadrži ITAM, kao što je CD3 zeta domen. CD3 zeta domen može imati sekvencu prikazanu kao SEQ ID No. 44.

SEQ ID No.44 (CD3zeta endodomen)

[0156] CAR može da sadrži varijantu sekvence prikazane kao SEQ ID No.44 koja ima najmanje 80, 85, 90, 95, 98 ili 99% identiteta sekvence, pod uslovom da varijantna sekvenca zadržava kapacitet da indukuje signaliziranje T-ćelije nakon prepoznavanja antigena, tj. davanje signala 1 T ćelijama.

[0157] Prvi CAR može imati strukturu:

AgB1-spejser1-TM1-costim-ITAM

pri čemu:

AgB1 antigen-vezujući domen prvog CAR;

spejser 1 je spejser prvog CAR;

TM1 transmembranski domen prvog CAR;

costim je kostimulatorni domen; i

ITAM je endodomen koji sadrži ITAM.

„Costim“ je CD28 kostimulatorni domen.

"ITAM" može biti CD3 zeta endodomen.

[0158] Drugi CAR može imati strukturu:

AgB2-spejser2-TM2-TNF-ITAM

pri čemu:

AgB2 antigen-vezujući domen drugog CAR;

spejser 2 je spejser drugog CAR;

TM2 transmembranski domen drugog CAR;

TNF je receptorski endodomen TNF; i

ITAM je endodomen koji sadrži ITAM.

TNF je endodomen familije TNF receptora OX40 ili 4-1BB endodomena; i

[0159] Takođe je obezbeđena sekvenca nukleinske kiseline koja kodira i prvi i drugi himerni antigenski receptor (CAR) sa „razdvojenim“ endodomenima; i komplet koji sadrži dve nukleinske kiseline, jednu koja kodira prvi CAR i jednu koja kodira drugi CAR koji sadrži podeljene endodomene kao što je gore definisano.

MESTO KO-EKSPRESIJE

[0160] Pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira prvi i drugi CAR.

[0161] Nukleinska kiselina može da proizvede polipeptid koji se sastoji od dva CAR molekula spojena mestom cepanja. Mesto cepanja može biti samocepajuće, tako da kada se polipeptid proizvodi, on se odmah cepa u prvi i drugi CAR bez potrebe za bilo kakvom spoljašnjom aktivnošću cepanja.

[0162] Poznata su različita mesta za samocepanje, uključujući 2A peptid virusa bolesti slinavke i šapa (FMDV) i sličnu sekvencu (Donnelly et al, Journal of General Virology (2001), 82, 1027-1041), na primer kao sekvenca slična 2A iz virusa Thosea asigna koja ima sekvencu prikazanu kao SEQ ID No.12:

SEQ ID No.12

RAEGRGSLLTCGDVEENPGP.

[0163] Sekvenca koekspresije može biti interna ulazna sekvenca ribozoma (IRES). Koeksprimirajuća sekvenca može biti unutrašnji promoter

ĆELIJA

[0164] Ćelija prema pronalasku može biti bilo koja eukariotska ćelija sposobna da eksprimuje CAR na površini ćelije, kao što je imunološka ćelija.

[0165] Tačnije, ćelija može biti imunska efektorska ćelija kao što je T ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK).

[0166] T ćelije ili T limfociti su tip limfocita koji igra centralnu ulogu u imunitetu posredovanom ćelijama. Mogu se razlikovati od drugih limfocita, kao što su B ćelije i prirodne ćelije ubice (NK ćelije), po prisustvu T-ćelijskog receptora (TCR) na površini ćelije. Postoje različite vrste T ćelija, kao što je sažeto u nastavku.

[0167] Pomoćne T pomoćne ćelije (TH ćelije) pomažu drugim belim krvnim zrncima u imunološkim procesima, uključujući sazrevanje B ćelija u plazma ćelije i memorijske B ćelije, i aktivaciju citotoksičnih T ćelija i makrofaga. TH ćelije eksprimiraju CD4 na svojoj površini. TH ćelije se aktiviraju kada su predstavljene sa peptidnim antigenima od strane MHC klase II molekula na površini ćelija koje predstavljaju antigen (APC). Ove ćelije se mogu diferencirati u jedan od nekoliko podtipova, uključujući TH1, TH2, TH3, TH17, Th9 ili TFH, koji luče različite citokine da bi olakšali različite tipove imunoloških odgovora.

[0168] Citotoksične T ćelije (TC ćelije ili CTL) uništavaju virusno inficirane ćelije i tumorske ćelije, a takođe su umešane u odbacivanje transplantata. CTL eksprimiraju CD8 na svojoj površini. Ove ćelije prepoznaju svoje mete vezivanjem za antigen povezan sa MHC klase I, koji je prisutan na površini svih ćelija sa jezgrom. Preko IL-10, adenozina i drugih molekula koje luče regulatorne T ćelije, CD8+ ćelije mogu biti inaktivirane do anergičnog stanja, što sprečava autoimune bolesti kao što je eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis. Memorijske T ćelije su podskup T ćelija specifičnih za antigen koje dugo opstaju nakon što je infekcija nestala. Oni se brzo šire na veliki broj efektorskih T ćelija nakon ponovnog izlaganja njihovom srodnom antigenu, obezbeđujući tako imunološki sistem „sećanjem“ na prethodne infekcije. Memorijske T ćelije se sastoje od tri podtipa: centralne memorijske T ćelije (TCM ćelije) i dve vrste efektorskih memorijskih T ćelija (TEM ćelije i TEMRA ćelije). Memorijske ćelije mogu biti ili CD4+ ili CD8+. Memorijske T ćelije tipično eksprimiraju protein ćelijske površine CD45RO.

[0169] Regulatorne T ćelije (Treg ćelije), ranije poznate kao supresorske T ćelije, ključne su za održavanje imunološke tolerancije. Njihova glavna uloga je da isključe imunitet posredovan T ćelijama pred kraj imunološke reakcije i da potisnu autoreaktivne T ćelije koje su izbegle proces negativne selekcije u timusu.

[0170] Opisane su dve glavne klase CD4+ Treg ćelija – Treg ćelije koje se javljaju u prirodi i adaptivne Treg ćelije.

[0171] Prirodno prisutne Treg ćelije (takođe poznate kao CD4+CD25+FoxP3+ Treg ćelije) nastaju u timusu i povezane su sa interakcijama između T ćelija u razvoju sa aktiviranim mijeloidnim (CD11c+) i plazmacitoidnim (CD123+) dendritskim ćelijama sa TSLP. Prirodne Treg ćelije se mogu razlikovati od drugih T ćelija po prisustvu intracelularnog molekula zvanog FoxP3. Mutacije gena FOXP3 mogu sprečiti razvoj regulatornih T ćelija, izazivajući fatalnu autoimunu bolest IPEKS.

[0172] Prilagodljive Treg ćelije (poznate i kao Tr1 ćelije ili Th3 ćelije) mogu nastati tokom normalnog imunološkog odgovora.

[0173] T ćelija prema pronalasku može biti bilo koji od tipova T ćelija navedenih iznad, posebno CTL.

[0174] Ćelije prirodne ubice (NK) su tip citolitičke ćelije koja čini deo urođenog imunskog sistema. NK ćelije pružaju brze odgovore na urođene signale iz ćelija inficiranih virusom na MHC nezavisan način

[0175] NK ćelije (koje pripadaju grupi urođenih limfoidnih ćelija) su definisane kao veliki granularni limfociti (LGL) i čine treću vrstu ćelija diferenciranih od uobičajenih limfoidnih progenitora koji stvaraju B i T limfocite. Poznato je da se NK ćelije diferenciraju i sazrevaju u kostnoj srži, limfnom čvoru, slezini, krajnicima i timusu gde zatim ulaze u cirkulaciju.

[0176] CAR ćelije prema pronalasku mogu biti bilo koji od tipova ćelija navedenih iznad.

[0177] Ćelije koje eksprimiraju CAR, kao što su T ili NK ćelije koje eksprimiraju CAR, mogu biti stvorene ex vivo bilo iz pacijentove sopstvene periferne krvi (prva strana), ili u okruženju transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija iz periferne krvi donora ( druga strana), ili periferna krv od nepovezanog davaoca (treća strana).

[0178] Opisana je ćelijska kompozicija koja sadrži T ćelije koje eksprimiraju CAR i/ili NK ćelije koje eksprimiraju CAR u skladu sa ovim pronalaskom. Kompozicija ćelija može biti napravljena transdukcijom uzorka krvi ex vivo sa nukleinskom kiselinom prema ovom pronalasku.

[0179] Alternativno, ćelije koje eksprimiraju CAR mogu biti izvedene iz ex vivo diferencijacije inducibilnih progenitorskih ćelija ili embrionalnih progenitorskih ćelija na relevantni tip ćelije, kao što su T ćelije. Alternativno, može se koristiti imortalizovana ćelijska linija kao što je T-ćelijska linija koja zadržava svoju litičku funkciju i može delovati kao terapeutik.

[0180] U svim ovim otelotvorenjima, CAR ćelije se generišu uvođenjem DNK ili RNK kodiranja za CAR receptore na jedan od mnogih načina, uključujući transdukciju virusnim vektorom, transfekciju sa DNK ili RNK.

[0181] CAR T ćelija prema pronalasku može biti ex vivo T ćelija subjekta. T ćelija može biti iz uzorka mononukleiskih ćelija periferne krvi (PBMC). T ćelije se mogu aktivirati i/ili proširiti pre transdukcije nukleinskom kiselinom koja kodira CAR, na primer tretmanom sa anti-CD3 monoklonskim antitelom.

[0182] CAR T ćelija pronalaska može se napraviti:

1. (i) izolacijom uzorka koji sadrži T ćelije subjekta ili drugih izvora navedenih gore; i 2. (ii) transdukcijom ili transfekcijom ćelija sa jednom ili više sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju prvi i drugi CAR

[0183] T ćelije tada mogu da budu prečišćene, na primer, odabrane na osnovu koekspresije prvog i drugog CAR.

SEKVENCE NUKLEINSKIH KISELINA

[0184] Pronalazak se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi CAR i drugi CAR kako je definisano u ćeliji pronalaska.

[0185] Sekvenca nukleinske kiseline može biti, na primer, RNK, DNK ili cDNK sekvenca.

[0186] Sekvenca nukleinske kiseline može da kodira jedan himerni antigenski receptor (CAR) koji se vezuje za CD19 i drugi CAR koji se vezuje za CD22.

[0187] Sekvenca nukleinske kiseline može imati sledeću strukturu:

AgB1-spejser1-TM1 - costim- ITAM1-coexpr-AbB2-spejser2-TM2-TNF-ITAM2

pri čemu

AgB1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen-vezujući domen prvog CAR; spejser 1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira spejser prvog CAR;

TM1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira transmembranski domen prvog CAR;

costim je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira CD28 kostimulatorni domen; ITAM1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira endodomen prvog CAR koji sadrži ITAM;

AgB2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen-vezujući domen izabranog CAR;

spejser 2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira spejser drugog CAR;

[0188] Prvi CAR može da veže CD19, a drugi CAR može da veže CD22. Alternativno, prvi CAR može da veže CD22, a drugi CAR može da veže CD19.

[0189] Alternativni kodoni mogu da se koriste u regionima sekvence koja kodira iste ili slične sekvence aminokiselina, kako bi se izbegla homologna rekombinacija.

[0190] Zbog degeneracije genetskog koda, moguće je koristiti alternativne kodone koji kodiraju istu sekvencu aminokiselina. Na primer, kodoni "ccg" i "cca" oba kodiraju aminokiselinu prolin, tako da korišćenje "ccg" može biti zamenjeno za "cca" bez uticaja na aminokiselinu na ovoj poziciji u sekvenci prevedenog proteina.

[0191] Alternativni RNK kodoni koji se mogu koristiti za kodiranje svake aminokiseline su rezimirani u tabeli 3.

Tabela 3

[0192] Alternativni kodoni mogu da se koriste u delovima sekvence nukleinske kiseline koji kodiraju spejser prvog CAR i spejser drugog CAR, posebno ako se isti ili slični spejseri koriste u prvom i drugom CAR.

Na slici 4 prikazane su dve sekvence koje kodiraju spejser HCH2CH3 - zgloba, od kojih su u jednoj korišćeni alternativni kodoni.

[0193] Alternativni kodoni mogu da se koriste u delovima sekvence nukleinske kiseline koji kodiraju transmembranski domen prvog CAR i transmembranu drugog CAR, posebno ako se isti ili slični transmembranski domeni koriste u prvom i drugom CAR. Slika 4 prikazuje dve sekvence koje kodiraju CD28 transmembranski domen, od kojih su u jednoj korišćeni alternativni kodoni.

[0194] Alternativni kodoni mogu da se koriste u delovima sekvence nukleinske kiseline koji kodiraju ceo ili deo endodomena prvog CAR i ceo ili deo endodomena drugog CAR.

Alternativni kodoni se mogu koristiti u CD3 zeta endodomenu. Slika 4 prikazuje dve sekvence koje kodiraju CD3 zeta endodomen, od kojih su u jednoj korišćeni alternativni kodoni.

[0195] Alternativni kodoni mogu da se koriste u jednom ili više kostimulativnih domena, kao što je endodomen CD28.

[0196] Alternativni kodoni mogu da se koriste u jednom ili više domena koji prenose signale preživljavanja, kao što su endodomeni OX40 i 41BB.

[0197] Alternativni kodoni mogu da se koriste u delovima sekvence nukleinske kiseline koji kodiraju CD3zeta endodomen i/ili delovima sekvence nukleinske kiseline koji kodiraju jedan ili više kostimulatornih domena i/ili delovima sekvence nukleinske kiseline koji kodiraju jedan ili više domena koji prenose signale preživljavanja.

VEKTOR

[0198] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje vektor, koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CAR. Takav vektor može da se koristi za uvođenje sekvence nukleinske kiseline u ćeliju domaćina tako da eksprimuje prvi i drugi CAR.

[0199] Vektor može, na primer, da bude plazmid ili virusni vektor, kao što je retrovirusni vektor ili lentivirusni vektor, ili vektor zasnovan na transpozonu ili sintetička mRNA.

[0200] Vektor može biti sposoban da transfekuje ili transdukuje T ćeliju.

FARMACEUTSKA KOMPOZICIJA

[0201] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži više ćelija koje eksprimiraju CAR, kao što su T ćelije ili NK ćelije prema pronalasku. Farmaceutska kompozicija može dodatno da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent. Farmaceutska kompozicija može opciono da sadrži jedan ili više daljih farmaceutski aktivnih polipeptida i/ili jedinjenja. Takva formulacija može, na primer, biti u obliku pogodnom za intravensku infuziju.

POSTUPAK LEČENJA

[0202] Ćelije ovog pronalaska su sposobne da ubijaju ćelije karcinoma, kao što su ćelije limfoma B-ćelija. Ćelije koje eksprimiraju CAR, kao što su T ćelije, mogu biti stvorene ex vivo bilo iz pacijentove sopstvene periferne krvi (prva strana), ili u okviru transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija iz periferne krvi donora (druga strana) ili periferne krvi od nepovezanog donora (treća strana). Alternativno, CAR T-ćelije mogu biti izvedene iz ex-vivo diferencijacije inducibilnih progenitornskih ćelija ili embrionalnih progenitorskih ćelija u T-ćelije. U ovim slučajevima, CAR T-ćelije se generišu uvođenjem DNK ili RNK kodiranja za CAR na jedan od mnogih načina uključujući transdukciju virusnim vektorom, transfekciju sa DNK ili RNK.

[0203] Ćelije ovog pronalaska mogu biti sposobne da ubiju ciljne ćelije, kao što su ćelije karcinoma. Ciljna ćelija je prepoznatljiva po ekspresiji CD19 ili CD22.

Tabela 4 - eks resi a limfoidnih anti ena na limfoidne leukemi e

[0204] Preuzeto od Campana et al. (Immunophenotyping of leukemia. J. Immunol. Methods 243, 59-75 (2000)). cIg µ - teški lanac citoplaznog imunoglobulina; slg µ - površinski teški lanac imunoglobulina.

[0205] Ekspresija najčešće proučavanih limfoidnih antigena na različitim tipovima leukemije B-ćelija blisko odražava ekspresiju ontogenije B-ćelija (vidi sliku 2).

[0206] Ćelije ovog pronalaska mogu da se koriste za lečenje kancera, posebno maligniteta B-ćelija.

[0207] Primeri karcinoma koji eksprimiraju CD19 ili CD22 su B-ćelijski limfomi, uključujući Hočkinov limfom i ne-Hočkinov limfom; i leukemije B-ćelija.

[0208] Na primer, B-ćelijski limfom može biti difuzni velikoćelijski limfom B (DLBCL), folikularni limfom, limfom marginalne zone (MZL) ili limfom limfnog tkiva povezan sa mukozom (MALT), limfatični limfom malih ćelija (preklapa se sa hroničnom limfocitnom leukemijom), mantle ćelijski limfom (MCL), Burkitov limfom, primarni medijastinalni (timus) limfom velikih B-ćelija, limfoplazmacitni limfom (može se manifestovati kao Valdenstrom makroglobulinemija), limfom B-ćelijske nodalne marginalne zone (NMZL), limfom marginalne zone slezine (SMZL), intravaskularni limfom velikih B-ćelija, primarni efuzioni limfom, limfomatoidna granulomatoza, limfom velikih B-ćelija bogatih T ćelijama/histiocitima ili primarni limfom centralnog nervnog sistema.

[0209] Leukemija B-ćelija može biti akutna limfoblastna leukemija, hronična limfocitna leukemija B-ćelija, prolimfocitna leukemija B-ćelija, prekursorska B limfoblastna leukemija ili leukemija dlakavih ćelija.

[0210] Leukemija B-ćelija može biti akutna limfoblastna leukemija.

[0211] Tretman ćelijama prema pronalasku može pomoći da se spreči beg ili oslobađanje tumorskih ćelija što se često dešava standardnim pristupima.

[0212] Pronalazak će sada biti dalje opisan u vidu primera, koji imaju za cilj da pomognu nekom sa uobičajenim veštinama u predmetnoj oblasti u sprovođenju pronalaska i nemaju za cilj da na bilo koji način ograniče obim pronalaska.

PRIMERI

Primer 1 - Dokaz koncepta CD19/CD22 logičke kapije „ILI“ (za referencu)

[0213] CD19 „ILI“ CD22 CAR kapija je konstruisana ko-ekspresijom CD19 i CD22 CAR u istom vektoru. Anti-CD19 vezivo je bio scFv izveden iz B4 antitela izbačenog na površinu (Roguska et al. (1996) Protein Eng.9, 895-904), a anti-CD22 vezivo je bilo scFv izvedeno iz humanizovanog RFB4 antitela. Humani IgG1 zglobni-CH2-CH3 spejser je korišćen za oba CAR receptora, čija je kodirajuća sekvenca kolebana kodonom da bi se izbegla homologna rekombinacija integrišućeg vektora. TM domen u oba CAR receptora izveden je iz domena CD28, a oba CAR endodomena se sastoje od CD3-Zeta. Još jednom, ove homologne sekvence su kolebane kodonom. Koekspresija je postignuta kloniranjem dva CAR receptora u okviru razdvojenom peptidom FMD-2A. Sekvenca nukleinske kiseline i aminokiseline konstrukta CD19/CD22 „OR“ kapije prikazana je kao SEQ ID NO: 13 i 14, respektivno.

[0214] Da bi se demonstrirala koekspresija oba CAR receptora, scFv svakog CAR je označen oznakom epitopa (HA ili V5 respektivno). Ovaj naknadni pojedinačni otvoreni okvir čitanja je kloniran u SFG retrovirusni vektor. T-ćelije su transdukovane ovim vektorom i oba CAR receptora su se mogla detektovati na površini T-ćelija koje eksprimiraju kasetu bojenjem sa anti-HA i anti-V5 i proučavanjem ekspresije protočnom citometrijom.

[0215] Dalje, T-ćelije koje eksprimiraju CD19 ILI CD22 CAR kapiju su bile izazvane ciljnim ćelijama, ne eksprimirajući nijedan, oba ili jedan antigen zajedno sa kontrolnim T-ćelijama koje nisu eksprimirale CAR, ili samo anti-CD19 CAR, ili samo anti-CD22 CAR. Otkrili smo da ILI-gejtovane CAR T-ćelije mogu da ubiju ciljne ćelije koje eksprimiraju jedan ili oba ciljna antigena (Slika 5).

Primer 2 - Identifikacija i karakterizacija CD19ALAb i CD22ALAb

[0216] Identifikovano je CD19 vezivo (CD19ALAb), humanizovano i afiniteti vezivanja mišjih i humanizovanih IgG i scFv su identifikovani i upoređeni sa "zlatnim standardom" anti-CD19 veziva, fmc63. Paralelno, identifikovano je CD22 vezivo (CD22ALAb), humanizovano i afiniteti vezivanja mišjih i humanizovanih IgG i scFv su identifikovani i upoređeni sa "zlatnim standardom" anti-CD22 veziva, M971.

[0217] Eksperimenti su izvedeni na Biacore T200 instrumentu koristeći HBS-P kao pufer za rad i razblaživanje. Za obradu podataka korišćen je BIAevaluation softver verzije 2.0. Za kinetiku vezivanja, mišji anti-humani IgG ili kozji anti-mišji IgG kovalentno je povezan sa CM5 senzorskim čipom. IgG ili scFv-Fc proteini su uhvaćeni, a različite koncentracije proteina partnera u interakciji su ubrizgane preko protočne ćelije pri brzini protoka od 30 µl/min. Konstante kinetičke brzine su dobijene prilagođavanjem krive prema 1:1 Langmuir modelu vezivanja. Razlike u indeksu prelamanja su oduzete korišćenjem prazne kontrolne protočne ćelije u kojoj je antitelo za hvatanje imobilisano na isti nivo kao aktivna površina. Dvostruko referentno oduzimanje je izvedeno korišćenjem samog pufera.

[0218] Rezultati su prikazani na slikama 6 do 8.

[0219] Podaci pokazuju da humanizovani CD22ALAb ima uporediv afinitet vezivanja za CD22 za mišji CD22ALAb (slika 6) i slične kinetike vezivanja. I mišji i humanizovani CD22ALAb u scFv formatu imaju značajno veći afinitet vezivanja za CD22 nego antitelo koje se vezuje za CD22 po zlatnom standardu, M971 (Slika 6).

[0220] Iako je utvrđeno da je afinitet vezivanja mišjeg i humanizovanog CD19ALAb u IgG formatu sličan (podaci nisu prikazani), iznenađujuće je utvrđeno da je afinitet vezivanja humanizovanog CD19ALAb veći od mišjeg CD19ALAb u scFv formatu (Slika 7). Afinitet vezivanja CD19ALAb je uporediv (verovatno malo bolji) od onog kod zlatnog standarda anti-CD19 Ab, fmc63 (Slika 8).

Primer 3 - Uporedni funkcionalni testovi sa CD19ALAb/fmc63 CAR i CD22ALAb/M971 CAR

[0221] Antigen-vezujući domen CAR može da utiče na njegovu funkciju. U ovoj studiji, kreirani su CAR receptori koji sadrže CD19ALAb i CD22ALAb i funkcija je upoređena sa ekvivalentnim CAR receptorom koji ima antigen-vezujući domen zasnovan na fmc63 ili M971.

[0222] CAR receptori koji sadrže scFvs zasnovane na fmc63 (anti-CD19) i M971 (anti-CD22) mogu se smatrati zlatnim standardom antitela pošto su oba CAR receptora u kliničkom razvoju.

[0223] CAR receptori su konstruisani i eksprimirani na osnovu CD19ALAb, fmc63, CD22ALAb i M971. Njihova struktura je prikazana na slici 9. CAR receptori su se razlikovali isključivo u domenu vezivanja za antigen. U svim konstruktima, domeni vezivanja su bili vezani za membranu pomoću CD8 stabljike i sadržali su intracelularne aktivacione motive iz 41BB i CD3-zeta.

[0224] Retrovirusi su proizvedeni prolaznom transfekcijom 293T ćelija sa plazmidima koji kodiraju CAR receptore, gag/pol i protein omotač RD114. Posle 3 dana supernatanti su sakupljeni i korišćeni za transdukciju PHA/IL2-aktiviranih PBMC sa jednakim titrima retrovirusa na pločama obloženim retronektinom. Šest dana nakon transdukcije CAR-ekspresija je potvrđena protočnom citometrijom i PBMC su zajedno kultivisane u odnosu 1:1 sa CD19+ BFP SupT1 ćelijama (fmc63 i CD19ALAb CAR) ili CD22+ BFP SupT1 ćelijama (M971 i CD22ALAb CAR). Ubijanje ciljne ćelije je analizirano nakon jednog i tri dana. Takođe nakon jednog i tri dana, supernatanti su uklonjeni i nivoi interferona-γ su analizirani ELISA testom.

[0225] Rezultati su prikazani na slikama 10 i 11.

[0226] Kao što je prikazano na slici 10, CAR sa domenom za vezivanje antigena CD19ALAb dao je više ubijanja CD19+ve ciljnih ćelija (Slika 10) i na Dan 1 i Dan 3, nego ekvivalentni CAR sa domenom za vezivanje fmc63.

[0227] Što se tiče CD22, CAR sa domenom za vezivanje antigena CD22ALAb dao je više ubijanja CD22+ve ciljnih ćelija (Slika 11a) posle tri dana nego ekvivalentni CAR sa domenom za vezivanje M971. Oslobađanje IFNγ je bilo značajno veće kod CD22ALAb CAR nego kod M971 CAR nakon istog vremenskog okvira.

[0228] CAR receptori koji imaju antigen-vezujući domen zasnovan na CD19ALAb i CD22ALAb stoga imaju poboljšana svojstva u smislu ubijanja ciljnih ćelija od ekvivalentnih CAR receptora zasnovanih na fmc63 i M971.

[0229] Rezultat CD22ALAb je posebno iznenađujući, imajući u vidu nalaze koje su prijavili Haso et al (2013) kao gore. U toj studiji su napravljeni i testirani različiti anti-CD22 CAR receptori, sa domenima vezivanja na osnovu anti-CD22 antitela HA22, BL22 i m971. HA22 i BL22 scFv se vezuju za Ig domen 3 CD22, dok se m971 vezuje za Ig domen 5-7 CD22 (videti Haso et al (2013) Slika 2B). Prijavljeno je da je CAR izveden iz m971 pokazao superiornu aktivnost ubijanja ciljnih ćelija u odnosu na CAR dobijen od HA22, koji nalaz se pripisuje važnosti epitopa CD22 koji je cilj CAR receptora (Haso et al (2013) strana 1168, poslednji ceo paragraf). Zaključeno je da je ciljanje membranskog proksimalnog domena CD22 "ključni element" u razvoju visoko aktivnog anti-CD22 CAR (Diskusija, poslednji pasus). Suprotno ovom nalazu, podaci prikazani ovde na Slici 11 pokazuju da CD22ALAb, koji cilja epitop u Ig domenu 3 CD22 - epitop "distalne membrane" u poređenju sa epitopom Ig domena 5-7 koji cilja m971 - ima superiornu sposobnost ubijanja ciljne ćelije u odnosu na anti-CD22 CAR baziran na m971.

Primer 4 - Istraživanje konstrukata kapije ILI sa različitim kombinacijama endodomena

[0230] Četiri konstrukta kapije ILI su razvijena kao što je prikazano na slici 13. Svi su kodirali CD19/CD22 ILI kapije koje imaju identične antigen-vezujuće domene, spejser domene i transmembranske domene: jedina razlika između konstrukata bila je u endodomenima, koji su bili kao što je prikazano u sledećoj tabeli:

[0231] Kapacitet ćelija koje eksprimiraju svaku CD19/CD22 ILI kapiju da bi ubili Raji ćelije analiziran je in vitro kao što je gore opisano. Transdukovane PBMC koje eksprimiraju različite kombinacije ILI kapija su zajedno kultivisane 72 sata sa CD19+/CD22+ Raji ciljnim ćelijama u odnosu 1:1 i 1:10 efektor:ciljna ćelija.

[0232] Rezultati su prikazani na slici 14. Utvrđeno je da sve četiri ILI kapije ubijaju ciljne ćelije znatno bolje od fmc63 i M971 CAR. Sa odnosom efektor:ciljna ćelija 1:10, pokazalo se da su „split” endodomenske ILI kapije, koje imaju 4-1BBzeta/OX40zeta na jednom CAR i CD28zeta na drugom CAR, imale najbolju aktivnost ubijanja.

Claims

Patentni zahtevi

1. Ćelija koja ko-eksprimira prvi himerni antigenski receptor (CAR) i drugi CAR na površini ćelije, pri čemu svaki CAR sadrži intracelularni signalni domen, naznačena time što intracelularni signalni domen prvog CAR sadrži CD28 kostimulatorni domen i domen koji sadrži ITAM ali ne sadrži endodomen familije TNF receptora; i intracelularni signalni domen drugog CAR sadrži endodomen familije TNF receptora izabran između OX40 ili 4-1BB endodomena i domen koji sadrži ITAM, ali ne sadrži kostimulativni domen.

2. Ćelija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što prvi CAR ima strukturu:

AgB1-spejser1-TM1-costim-ITAM

pri čemu:

AgB1 je antigen-vezujući domen prvog CAR;

spejser 1 je spejser prvog CAR;

TM1 je transmembranski domen prvog CAR;

costim je kostimulatorni domen; i

ITAM je endodomen koji sadrži ITAM;

a drugi CAR ima strukturu:

AgB2-spejser2-TM2-TNF-ITAM

pri čemu:

AgB2 je antigen-vezujući domen drugog CAR;

spejser 2 je spejser drugog CAR;

TM2 je transmembranski domen drugog CAR;

TNF je receptorski endodomen TNF; i

ITAM je endodomen koji sadrži ITAM.

3. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira i prve i druge himerne antigenske receptore (CAR) kao što je definisano u bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.

4. Sekvenca nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 3, koja ima sledeću strukturu: AgB1-spejser1-TM1 - costim- ITAM1-coexpr-AbB2-spejser2-TM2-TNF-ITAM2

pri čemu

spejser 1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira spejser prvog CAR;

costim je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira kostimulatorni domen;

coexpr je sekvenca nukleinske kiseline koja omogućava koekspresiju oba CAR receptora;

AgB2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen-vezujući domen drugog CAR;

spejser 2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira spejser drugog CAR;

TNF je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira endodomen TNF receptora;

5. Komplet koji sadrži

(i) prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi himerni antigenski receptor (CAR) kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, čija sekvenca nukleinske kiseline ima sledeću strukturu:

AgB1-spejser1-TM1-costim-ITAM1

pri čemu

spejser 1 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira spejser prvog CAR;

costim je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira kostimulatorni domen;

(ii) drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugi himerni antigenski receptor (CAR) kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, čija sekvenca nukleinske kiseline ima sledeću strukturu:

AbB2-spejser2-TM2-TNF-ITAM2

spejser 2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira spejser drugog CAR;

TNF je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira endodomen TNF receptora; i ITAM2 je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira endodomen drugog CAR koji sadrži ITAM.

6. Vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 3 ili 4.

7. Postupak za pravljenje ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, koji obuhvata korak uvođenja: sekvence nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 3 ili 4; prvu sekvencu nukleinske kiseline i drugu sekvencu nukleinske kiseline kao što je definisano u patentnom zahtevu 5; ili vektor prema patentnom zahtevu 6, u ćeliju ex vivo.

8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži više ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2.

9. Farmaceutsku kompozicija prema patentnom zahtevu 8 za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bolesti.