JP7514746B2 - 細胞 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、１つより多くのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞に関する。

発明の背景
若干の免疫治療剤が、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫コンジュゲートｍＡｂ、放射性コンジュゲートｍＡｂおよび二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを含め、がん処置での使用について記載されている。

典型的には、これらの免疫治療剤は、単一の抗原を標的とし、例えば、リツキシマブであればＣＤ２０を標的とし、ミエロタルグであればＣＤ３３を標的とし、そしてアレムツズマブであればＣＤ５２を標的とする。

ヒトＣＤ１９抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する９５ｋｄの膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１９は、Ｂ細胞分化の非常に初期から発現し、結局、形質細胞へのＢ細胞分化の末期には消失する。結果的に、ＣＤ１９は、多発性骨髄腫以外のすべてのＢ細胞悪性腫瘍上に発現する。正常なＢ細胞区画が失われることは、許容され得る毒性であるので、ＣＤ１９は、魅力的なＣＡＲ標的であり、ＣＡＲでＣＤ１９を標的化する臨床研究は、有望な結果を予見してきた。

腫瘍学の分野における特有の問題は、ゴルディ－コールドマン仮説によって提供される：この仮説は、ほとんどのがんに固有の高変異率に起因して、単一抗原を唯一標的化すると、前記抗原の調節によって腫瘍エスケープがもたらされ得ることを説明している。この抗原発現の調節は、ＣＤ１９を標的化する免疫治療薬を含む既知の免疫治療薬の有効性を低下させ得る。

したがって、ＣＤ１９を標的化する免疫治療薬に関する問題は、Ｂ細胞悪性腫瘍が変異してＣＤ１９陰性になり得ることである。これによって、ＣＤ１９を標的とする治療に反応性でないＣＤ１９陰性がんが再発し得る。例えば、１つの小児科の研究において、Ｇｒｕｐｐらは、急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）に対するＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体治療の後の全再発の半数がＣＤ１９陰性疾患に起因したことを報告した（５６^ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ）。

したがって、ＣＤ１９陽性がんをはじめとした多くのがんに関連するマーカー発現の複雑なパターンを反映する１つより多くの細胞表面構造を標的化することができる免疫治療薬が必要とされている。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）

キメラ抗原受容体は、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に結び付けるタンパク質である。キメラ抗原受容体の通常形態は、抗原認識性アミノ末端、スペーサー、Ｔ細胞生存および活性化シグナルを伝達する複合エンドドメインにすべて連結された膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である（図１Ａ参照）。

これらの分子の最も一般的な形態は、シグナル伝達エンドドメインにスペーサーおよび膜貫通ドメインを介して融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合体である。上記分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞がかかるＣＡＲを発現すると、Ｔ細胞はその標的抗原を発現する標的細胞を認識し、殺す。いくつかのＣＡＲが腫瘍関連抗原に対して開発されており、かかるＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いる養子移入手法は、現在様々ながんの処置についての臨床試験にかけられている。

がん処置のためにＣＡＲ手法を用いると、腫瘍不均一性および免疫エディティングによって、ＣＡＲ処置からのエスケープが引き起こされ得ることが認められた。例えば、Ｇｒｕｐｐらが記載した研究（２０１３；Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６８：１５０９－１５１８，ｐａｐｅｒ Ｎｏ ３８０，ＡＳＨ ２０１４）では、ＣＡＲ改変Ｔ細胞手法を急性Ｂリンパ性白血病の処置のために使用した。その臨床試験では、完全寛解の１０人の患者が１ヶ月後に再発し、そのうちの５人が、ＣＤ１９陰性疾患を再発したことが見出された。

したがって、がんエスケープおよび腫瘍不均一性の問題に対処する代替のＣＡＲ処置手法が必要とされている。
２つのＣＡＲ結合特異性の発現

タンデム型ＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲとして知られる二重特異性ＣＡＲは、複数のがん特異的マーカーを同時に標的化しようとして開発された。ＴａｎＣＡＲでは、細胞外ドメインは、リンカーにより連結された２つの抗原結合特異性をタンデムで含む。したがって、２つの結合特異性（ｓｃＦｖ）は両方とも、単一の膜貫通部分に連結されている：一方のｓｃＦｖは、膜に隣接し、他方は、遠位に存在する。

Ｇｒａｄａら（２０１３，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２：ｅ１０５）は、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖに続いてＧｌｙ－Ｓｅｒリンカー、そしてＨＥＲ２特異的ｓｃＦｖを含むＴａｎＣＡＲと記載している。そのＨＥＲ２－ｓｃＦｖは、膜近傍の位置に存在し、ＣＤ１９－ｓｃＦｖは、遠位に存在する。このＴａｎＣＡＲは、２つの腫瘍制限抗原（ｔｕｍｏｕｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ）の各々に対して異なるＴ細胞反応性を誘導すると示された。ＨＥＲ２（６３２ａａ／１２５Å）およびＣＤ１９（２８０ａａ，６５Å）のそれぞれの長さが、その特定の空間配置にふさわしいので、この配置が選択された。ＨＥＲ２ ｓｃＦｖは、ＨＥＲ２の最も遠位の４つのループに結合することも知られている。

この手法に関する問題は、膜近傍のｓｃＦｖが、遠位のｓｃＦｖの存在、特に抗原に結合した遠位のｓｃＦｖの存在のせいで到達できないことがあるということである。標的細胞上の抗原の空間配置を考慮して２つのｓｃＦｖの相対位置を選択する必要があることに照らすと、すべてのｓｃＦｖ結合対に対してこの手法を用いることは不可能であり得る。さらに、このＴａｎＣａｒ手法が２つより多いｓｃＦｖに対して使用され得る見込みはなく、３つまたはそれより多くのｓｃＦｖを有するＴａｎＣＡＲは、非常に大きな分子であり、それらのｓｃＦｖは、互いに折り畳まれて抗原結合部位を覆い隠す可能性がある。また、２つまたはそれより多くのさらなるｓｃＦｖによって膜貫通ドメインから離された最も遠位のｓｃＦｖによる抗原結合が、Ｔ細胞活性化を引き起こすことができ得ることも疑わしい。
したがって、Ｔ細胞などの細胞の表面上に２つのＣＡＲ結合特異性を発現する代替の手法が必要とされている。

５６ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ ２０１３；Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６８：１５０９－１５１８，ｐａｐｅｒ Ｎｏ ３８０，ＡＳＨ ２０１４ ２０１３，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２：ｅ１０５

発明の要旨
本発明者らは、２つのＣＡＲ（１つはＣＤ１９に特異的であり、もう１つはＣＤ２２に特異的である）を細胞表面に発現するＣＡＲ Ｔ細胞を開発した。

したがって、第１の態様において、本発明は、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを細胞表面に共発現する細胞を提供し、各ＣＡＲは、抗原結合ドメインを含み、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合する。

一方のＣＡＲがＣＤ１９に結合し、他方のＣＡＲがＣＤ２２に結合するという事実は、有益である。なぜなら、いくつかのリンパ腫および白血病は、ＣＤ１９標的化後にＣＤ１９陰性になり（またはおそらくＣＤ２２標的化後にＣＤ２２陰性になり）、万一これが生じる場合は「バックアップ」抗原をもたらすからである。

該細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞であり得る。Ｔ細胞に関して本明細書で挙げた特徴は、ＮＫ細胞などの他の免疫エフェクター細胞にも等しく当てはまる。
各ＣＡＲは、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）スペーサー；および
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン
を含み得る。各ＣＡＲは、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）スペーサー；
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；
（ｉｖ）エンドドメイン
を含み得る。

第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲがヘテロダイマーを形成しないように、第１のＣＡＲのスペーサーは、第２のＣＡＲのスペーサーとは異なり得る。

各ＣＡＲが、それぞれの標的抗原を認識するように適応させるように、第１のＣＡＲのスペーサーは、第２のＣＡＲのスペーサーとは異なる長さおよび／または立体配置を有し得る。

第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２上の膜遠位（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｄｉｓｔａｌ）エピトープに結合し得る。第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２のＩｇドメイン１、２、３または４、例えば、ＣＤ２２のＩｇドメイン３上のエピトープに結合し得る。

第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、エキソン１、３または４によってコードされるＣＤ１９上のエピトープに結合し得る。

一方のＣＡＲのエンドドメインは、共刺激ドメインおよびＩＴＡＭ含有ドメインを含み得；他方のＣＡＲのエンドドメインは、ＴＮＦ受容体ファミリーのドメインおよびＩＴＡＭ含有ドメインを含み得る。
例えば、一方のＣＡＲ（ＣＤ１９またはＣＤ２２特異的であり得る）は、以下の構造：ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ
（ここで、
ＡｇＢ１は、抗原結合ドメインであり；
スペーサー１は、スペーサーであり；
ＴＭ１は、膜貫通ドメインであり；
ｃｏｓｔｉｍは、共刺激ドメインであり；そして
ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）
を有し得、他方のＣＡＲ（ＣＤ２２またはＣＤ１９特異的であり得る）は、以下の構造：ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ
（ここで、
ＡｇＢ２は、抗原結合ドメインであり；
スペーサー２は、スペーサーであり；
ＴＭ２は、膜貫通ドメインであり；
ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体のエンドドメインであり；そして
ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）
を有し得る。

第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様において定義されたような第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）との両方をコードする核酸配列を提供する。

その核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｂＢ２－スペーサー２－ＴＭ２
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
その核酸配列は、Ｔ細胞において発現されるとき、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲがＴ細胞表面に共発現されるように切断部位で切断されるポリペプチドをコードする）
を有し得る。

上記核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－エンド１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｂＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－エンド２
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
その核酸配列は、Ｔ細胞において発現されるとき、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲがＴ細胞表面に共発現されるように切断部位で切断されるポリペプチドをコードする）
を有し得る。

２つのＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列は、自己切断性ペプチドまたは２つのＣＡＲを共発現する代替的手段を可能にする配列、例えば内部リボソーム進入配列または第２プロモーターまたは当業者が同じベクターから２種のタンパク質を発現させることができるような他の手段を可能にする配列をコードし得る。

代替的コドンは、相同組換えを回避するために、同一または類似のアミノ酸配列（例えば、膜貫通ドメインおよび／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン））をコードする配列の領域で使用され得る。例えば、２つのＣＡＲが、スペーサー、膜貫通ドメイン、および／またはエンドドメインの全部もしくは一部に対して同一または類似のアミノ酸配列を有するが、異なる核酸配列によってコードされるように、代替的コドンがこのまたはこれらの部分をコードする配列の一部分において使用され得る。

第３の態様において、本発明は、
（ｉ）第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列（この核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列である）
を有する）および
（ｉｉ）第２のキメラ抗原受容体をコードする第２の核酸配列（この核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２
（ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列である）
を有する）
を含むキットを提供する。

そのキットは、以下を含み得る：
（ｉ）第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列（この核酸配列は、以下の構造を有する）
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－エンド１
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する核酸配列；および
（ｉｉ）第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸配列であって、以下の構造：
ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－エンド２
（ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
エンド２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）

第４の態様において、本発明は、第１の核酸配列を含む第１のベクターおよび第２の核酸配列を含む第２のベクターを含むキットを提供する。

それらのベクターは、プラスミドベクター、レトロウイルスベクターまたはトランスポゾンベクターであり得る。それらのベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。

第５の態様において、本発明は、本発明の第２の態様に記載の核酸配列を含むベクターを提供する。そのベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。

そのベクターは、プラスミドベクター、レトロウイルスベクターまたはトランスポゾンベクターであり得る。

第６の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の細胞を作製するための方法を提供し、その方法は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする１つもしくはそれより多くの核酸配列；または上で定義されたような１つもしくはそれより多くのベクターをＴ細胞に導入する工程を含む。

その細胞は、患者、関連もしくは非関連造血系移植ドナー、完全に無関係のドナーから単離された試料に由来し得るか、臍帯血に由来し得るか、胚性細胞株から分化され得るか、誘導性前駆細胞株から分化され得るか、または形質転換細胞株から誘導され得る。

第７の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の複数の細胞を含む医薬組成物を提供する。

第８の態様において、本発明は、疾患を処置および／または予防するための方法を提供し、その方法は、本発明の第７の態様に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む。

その方法は、以下の工程：
（ｉ）被験体からの細胞含有試料の単離
（ｉｉ）第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする１つもしくはそれより多くの核酸配列またはそのような核酸配列を含む１つもしくはそれより多くのベクターでのその細胞の形質導入またはトランスフェクション；および
（ｉｉｉ）その被験体に（ｉｉ）からの細胞を投与する工程
を含み得る。

上記疾患は、がんであり得る。そのがんは、Ｂ細胞悪性腫瘍であり得る。

第９の態様において、本発明は、疾患の処置および／または予防において使用するための本発明の第７の態様に記載の医薬組成物を提供する。

第１０の態様において、本発明は、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における本発明の第１の態様に記載の細胞の使用を提供する。
本発明はまた、
ａ）第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のヌクレオチド配列；
ｂ）第２のＣＡＲをコードする第２のヌクレオチド配列；
（ここで、一方のＣＡＲは、ＣＤ１９に結合し、他方のＣＡＲは、ＣＤ２２に結合する）および
ｃ）２つのＣＡＲが別々の実体として発現されるように、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間に配置された自己切断性ペプチドをコードする配列
を含む核酸配列も提供する。

代替的コドンは、同一または類似アミノ酸配列をコードする領域における第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列の１つまたはそれより多くの部分で使用されてもよい。

本発明はまた、そのような核酸を含むベクターおよび細胞も提供する。

本発明者らはまた、特性が改善された新規の抗ＣＤ１９ ＣＡＲおよび抗ＣＤ２２ ＣＡＲも開発した。

したがって、第１１の態様において、本発明は、
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－ＳＹＷＭＮ（配列番号１５）；
ＣＤＲ２－ＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫ（配列番号１６）
ＣＤＲ３－ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号１７）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号１８）；
ＣＤＲ２－ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号１９）
ＣＤＲ３－ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号２０）
を含むＣＤ１９結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

上記ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号２３もしくは配列番号２４として示されている配列を有するＶＨドメイン；または配列番号２５、配列番号２６もしくは配列番号４０として示されている配列を有するＶＬドメイン、あるいはＣＤ１９に結合する能力を保持し、少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらの変異型を含み得る。

上記ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号２１、配列番号２２もしくは配列番号３９として示されている配列、またはＣＤ１９に結合する能力を保持し、少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらの変異型を含み得る。

第１２の態様において、本発明は、
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－ＮＹＷＩＮ（配列番号２７）；
ＣＤＲ２－ＮＩＹＰＳＤＳＦＴＮＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２８）
ＣＤＲ３－ＤＴＱＥＲＳＷＹＦＤＶ（配列番号２９）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号３０）；
ＣＤＲ２－ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号３１）
ＣＤＲ３－ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号３２）
を含むＣＤ２２結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

上記ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号３５もしくは配列番号３６として示されている配列を有するＶＨドメイン；または配列番号３７もしくは配列番号３８として示されている配列を有するＶＬドメイン、あるいはＣＤ２２に結合する能力を保持し、少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらの変異型を含み得る。

上記ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号３３もしくは配列番号３４として示されている配列、またはＣＤ２２に結合する能力を保持し、少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらの変異型を含み得る。

第１３の態様において、本発明の第１１の態様に記載のキメラ抗原受容体または本発明の第１２の態様に記載のキメラ抗原受容体を細胞表面に発現する細胞が提供される。

第１４の態様において、本発明の第１１の態様に記載のキメラ抗原受容体または本発明の第１２の態様に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列が提供される。

第１５の態様において、本発明は、本発明の第１４の態様に記載の核酸配列を含むベクターを提供する。そのベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。

このベクターは、プラスミドベクター、レトロウイルスベクターまたはトランスポゾンベクターであり得る。

第１６の態様において、本発明は、本発明の第１３の態様による細胞を作製する方法であって、１つもしくはそれより多くの核酸配列（複数も可）または上記で定義した１つもしくはそれより多くのベクター（複数も可）を細胞に導入する工程を含む方法を提供する。

その細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり得る。細胞は、患者、関連もしくは非関連造血系移植ドナー、完全に無関係のドナーから単離された試料に由来するか、臍帯血に由来するか、胚性細胞株から分化されるか、誘導性前駆細胞株から分化されるか、または形質転換細胞株から誘導され得る。

第１７の態様において、本発明は、本発明の第１３の態様による複数の細胞を含む医薬組成物を提供する。

第１８の態様において、本発明は、疾患を処置および／または予防する方法であって、被験体に本発明の第１７の態様による医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。

その方法は、以下の工程：
（ｉ）被験体からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸配列またはそのような核酸配列を含むベクターでのその細胞の形質導入またはトランスフェクション；および
（ｉｉｉ）その被験体に（ｉｉ）からの細胞を投与する工程
を含み得る。

上記疾患は、がんであり得る。そのがんは、Ｂ細胞悪性腫瘍であり得る。

第１９の態様において、本発明は、疾患の処置および／または予防で使用するための本発明の第１７の態様による医薬組成物を提供する。

第２０の態様において、本発明は、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における本発明の第１３の態様による細胞の使用を提供する。

本発明の第１１の態様において定義されたような第１のＣＡＲおよび本発明の第１２の態様において定義されたような第２のＣＡＲを含む、本発明の第１の態様に記載の細胞も提供される。

本発明の第１１の態様において定義されたような第１のＣＡＲおよび本発明の第１２の態様において定義されたような第２のＣＡＲをコードする、本発明の第２の態様に記載の核酸配列も提供される。

本発明の第３の態様に記載のキットも提供され、ここで、第１の核酸配列は、本発明の第１１の態様において定義されたような第１のＣＡＲをコードし、第２の核酸配列は、本発明の第１２の態様において定義されたような第２のＣＡＲをコードする。

本発明の第１１の態様において定義されたような第１のＣＡＲおよび本発明の第１２の態様において定義されたような第２のＣＡＲをコードする核酸配列を含む、本発明の第５の態様に記載のベクターも提供される。

本発明者らはまた、共刺激ドメインと生存シグナルを生成するドメインとが、２つ（またはそれより多く）のＣＡＲの間に「分割」されている場合、ＯＲゲートシステムにおいて性能が改善されることも見出した。

したがって、第２１の態様において、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを細胞表面に共発現する細胞が提供され、各ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第１のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含み；第２のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む。

共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインであり得る。

ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインは、例えば、ＯＸ－４０または４－１ＢＢエンドドメインであり得る。

第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはまた、ＣＤ３ゼータエンドドメインなどのＩＴＡＭ含有ドメインも含み得る。

第１のＣＡＲは、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインであり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーであり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインであり；
ｃｏｓｔｉｍは、共刺激ドメインであり；そして
ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）
を有し得る。

第２のＣＡＲは、以下の構造：
ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ
（ここで、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインであり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーであり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインであり；
ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体のエンドドメインであり；そして
ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）
を有し得る。

第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲのうちの一方のＣＡＲが、ＣＤ１９を標的化し得、他方のＣＡＲが、ＣＤ２２を標的化し得る。

第２２の態様において、本発明の第２１の態様において定義されたような第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）との両方をコードする核酸配列が提供される。

その核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｂＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ２
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｓｔｉｍは、共刺激ドメインをコードする核酸配列であり；
ＩＴＡＭ１は、第１のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ＩＴＡＭ２は、第２のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し得る。

上記核酸配列は、細胞において発現されるとき、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲが細胞表面に共発現されるように切断部位で切断されるポリペプチドをコードし得る。

第２３の態様において、
（ｉ）本発明の第２１の態様において定義されたような第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列（この核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ１
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｓｔｉｍは、共刺激ドメインをコードする核酸配列であり；
ＩＴＡＭ１は、第１のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する）および
（ｉｉ）本発明の第２１の態様において定義されたような第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸配列（この核酸配列は、以下の構造：
ＡｂＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ２
（ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり；そして
ＩＴＡＭ２は、第２のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する）を含むキットが提供される。

第２４の態様において、本発明の第２２の態様に記載の、または本発明の第２３の態様において定義されたような、核酸配列を含むベクターが提供される。

第２５の態様において、本発明の第２１の態様に記載の細胞を作製するための方法が提供され、その方法は、本発明の第２２の態様に記載の核酸配列；本発明の第２３の態様において定義されたような第１の核酸配列および第２の核酸配列；または本発明の第２４の態様に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む。

第２６の態様において、本発明は、本発明の第２１の態様に記載の複数の細胞を含む医薬組成物を提供する。

疾患を処置および／または予防するための方法も提供され、その方法は、本発明の第２６の態様に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む。

疾患の処置および／または予防において使用するための本発明の第２６の態様に記載の医薬組成物も提供される。

疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における本発明の第２１の態様に記載の細胞の使用も提供される。

ＣＤ１９を標的化する１つのＣＡＲおよびＣＤ２２を標的化するもう１つのＣＡＲを提供することによって、これらのマーカーの各々を標的化することが可能であり、それによって、がんエスケープの問題が低減される。

それらのＣＡＲは、細胞の表面上に別々の分子として発現されるので、この手法は、ＴａｎＣＡＲに関連する空間的な問題および到達性の問題を克服する。細胞の活性化効率も改善される。各ＣＡＲが、それ独自のスペーサーを有する場合、そのスペーサーを適応させることが可能であり、ゆえに、結合ドメインが細胞表面から突き出る距離およびその可撓性などを特定の標的抗原に対して適応させることが可能である。この選択は、ＴａｎＣＡＲに関連する考慮すべき設計事項、すなわち、１つのＣＡＲが、Ｔ細胞膜と隣接している必要があり、もう１つのＣＡＲが、第１のＣＡＲとタンデムで遠位に配置される必要があることによって束縛されない。

切断部位によって分断された２つのＣＡＲをコードする単一の核酸を提供することによって、単純な単一の形質導入手順を用いて、２つのＣＡＲを共発現するように細胞を操作することが可能である。別々の構築物におけるＣＡＲエンコード配列を用いて二重トランスフェクション手順を使用することもできるが、これは、より複雑かつ高価であり得、それらの核酸に対してより多くの組込み部位を必要とし得る。二重トランスフェクション手順はまた、ＣＡＲをコードする両方の核酸が効果的に形質導入および発現されたかに関する不確実性にも関連し得る。

上記ＣＡＲは、相同性の高い部分を有し得、例えば、膜貫通ドメインおよび／または細胞内シグナル伝達ドメインは、高度に相同である可能性がある。同一または類似のリンカーが、２つのＣＡＲに対して用いられる場合、それらのリンカーも高度に相同であり得る。このことから、それらの配列間での相同組換えの可能性があるので、両ＣＡＲを単一の核酸配列に提供する手法は不適当であると示唆される。しかしながら、本発明者らは、相同性の高い領域をコードする配列の一部分を「コドンゆらぎ」にすることによって、単一の構築物から２つのＣＡＲを高効率で発現することが可能であることを見出した。コドンゆらぎは、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域における代替的コドンの使用を含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを細胞表面に共発現する細胞であって、各ＣＡＲが、抗原結合ドメインを含み、該第１のＣＡＲの該抗原結合ドメインが、ＣＤ１９に結合し、該第２のＣＡＲの該抗原結合ドメインが、ＣＤ２２に結合する、細胞。
（項目２）
各ＣＡＲが、
（ｉ）抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）スペーサー；および
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン
を含み、前記第１のＣＡＲの該スペーサーは、前記第２のＣＡＲの該スペーサーとは異なる、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記第２のＣＡＲの前記抗原結合ドメインが、ＣＤ２２のＩｇドメイン１、２、３または４におけるエピトープに結合する、項目２に記載の細胞。
（項目４）
項目１～３のいずれかにおいて定義されたような前記第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および前記第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の両方をコードする核酸配列。
（項目５）
以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｂＢ２－スペーサー２－ＴＭ２
（ここで、
ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり
；
ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列である）
を有し、その核酸配列は、Ｔ細胞において発現されたとき、前記第１のＣＡＲおよび前記第２のＣＡＲが該Ｔ細胞表面に発現されるように、切断部位で切断されるポリペプチドをコードする、
項目４に記載の核酸配列。
（項目６）
ｃｏｅｘｐｒが、自己切断性ペプチドを含む配列をコードする、項目５に記載の核酸配列。
（項目７）
相同組換えを回避するために、代替的コドンが、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で使用される、項目５または６に記載の核酸配列。
（項目８）
（ｉ）項目１～３のいずれかにおいて定義されたような前記第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列であって、該核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１
（ここで、
ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列である）
を有する、第１の核酸配列、および
（ｉｉ）項目１～３のいずれかにおいて定義されたような前記第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸配列であって、該核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２
（ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列である）
を有する、第２の核酸配列
を含む、キット。
（項目９）
項目８において定義されたような前記第１の核酸配列を含む第１のベクター；および項目８において定義されたような前記第２の核酸配列を含む第２のベクターを含む、キット。（項目１０）
前記ベクターが、組込み型ウイルスベクターまたはトランスポゾンである、項目９に記載のキット。
（項目１１）
項目４～７のいずれかに記載の核酸配列を含む、ベクター。
（項目１２）
項目１１に記載の、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
（項目１３）
項目１～３のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、項目４～７のいずれかに記載の核酸配列；項目８において定義されたような第１の核酸配列および第２の核酸配列；ならびに／あるいは項目９において定義されたような第１のベクターおよび第２のベクターまたは項目１１もしくは１２に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、方法。
（項目１４）
前記細胞が、被験体から単離された試料に由来する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
項目１～３のいずれかに記載の複数の細胞を含む、医薬組成物。
（項目１６）
項目１５に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、疾患を処置および／または予防するための方法。
（項目１７）
以下の工程：
（ｉ）被験体からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）項目４～７のいずれかに記載の核酸配列；項目８において定義されたような第１の核酸配列および第２の核酸配列；項目９もしくは１０において定義されたような第１のベクターおよび第２のベクターまたは項目１１もしくは１２に記載のベクターでの該細胞の形質導入またはトランスフェクション；および
（ｉｉｉ）該被験体に（ｉｉ）からの該細胞を投与すること
を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記疾患が、がんである、項目１６または１７に記載の方法。
（項目１９）
前記がんが、Ｂ細胞悪性腫瘍である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
疾患の処置および／または予防において使用するための項目１５に記載の医薬組成物。
（項目２１）
疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における項目１～３のいずれかに記載の細胞の使用。
（項目２２）
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－ＳＹＷＭＮ（配列番号１５）；
ＣＤＲ２－ＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫ（配列番号１６）
ＣＤＲ３－ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号１７）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号１８）；
ＣＤＲ２－ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号１９）
ＣＤＲ３－ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号２０）
を含むＣＤ１９結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
（項目２３）
前記ＣＤ１９結合ドメインが、配列番号２３もしくは配列番号２４として示されている配列を有するＶＨドメイン；または配列番号２５、配列番号２６もしくは配列番号４０として示されている配列を有するＶＬドメイン、ＣＤ１９に結合する能力を保持し、少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらの変異型を含む、項目２２に記載のＣＡＲ。
（項目２４）
前記ＣＤ１９結合ドメインが、配列番号２１、配列番号２２もしくは配列番号３９として示されている配列、またはＣＤ１９に結合する能力を保持し、少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらの変異型を含む、項目２２に記載のＣＡＲ。
（項目２５）
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－ＮＹＷＩＮ（配列番号２７）；
ＣＤＲ２－ＮＩＹＰＳＤＳＦＴＮＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２８）
ＣＤＲ３－ＤＴＱＥＲＳＷＹＦＤＶ（配列番号２９）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号３０）；
ＣＤＲ２－ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号３１）
ＣＤＲ３－ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号３２）
を含むＣＤ２２結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
（項目２６）
前記ＣＤ２２結合ドメインが、配列番号３５もしくは配列番号３６として示されている配列を有するＶＨドメイン；または配列番号３７もしくは配列番号３８として示されている配列を有するＶＬドメイン、またはＣＤ２２に結合する能力を保持し、少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらの変異型を含む、項目２５に記載のＣＡＲ。
（項目２７）
前記ＣＤ２２結合ドメインが、配列番号３３もしくは配列番号３４として示されている配列、またはＣＤ２２に結合する能力を保持し、少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらの変異型を含む、項目２５に記載のＣＡＲ。
（項目２８）
前記第１のＣＡＲが、項目２２～２４のいずれかにおいて定義されたとおりであり、前記第２のＣＡＲが、項目２５～２７のいずれかにおいて定義されたとおりである、項目１～３のいずれかに記載の細胞。
（項目２９）
項目２２～２４のいずれかにおいて定義されたような第１のＣＡＲおよび項目２５～２７のいずれかにおいて定義されたような第２のＣＡＲをコードする、項目４～７のいずれかに記載の核酸配列。
（項目３０）
前記第１の核酸配列が、項目２２～２４のいずれかにおいて定義されたような第１のＣＡＲをコードし、前記第２の核酸配列が、項目２５～２７のいずれかにおいて定義されたような第２のＣＡＲをコードする、項目８～１０のいずれかに記載のキット。
（項目３１）
項目２９に記載の核酸配列を含む、項目１１または１２に記載のベクター。
（項目３２）
第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを細胞表面に共発現する細胞であって、各ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、該第１のＣＡＲの該細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含み；該第２のＣＡＲの該細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む、細胞。
（項目３３）
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８共刺激ドメインである、項目３２に記載の細胞。
（項目３４）
前記ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインが、ＯＸ－４０または４－１ＢＢエンドドメインである、項目３２または３３に記載の細胞。
（項目３５）
前記第１のＣＡＲおよび前記第２のＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＩＴＡＭ含有ドメインも含む、項目３２～３４のいずれかに記載の細胞。
（項目３６）
前記第１のＣＡＲが、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ
（ここで、
ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインであり；
スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーであり；
ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲの膜貫通ドメインであり；
ｃｏｓｔｉｍは、共刺激ドメインであり；
ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）
を有し、前記第２のＣＡＲが、以下の構造：
ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ
（ここで、
ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインであり；
スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーであり；
ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインであり；
ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体のエンドドメインであり；
ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）
を有する、項目３５に記載の細胞。
（項目３７）
項目３２～３６のいずれかにおいて定義されたような前記第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および前記第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の両方をコードする核酸配列。
（項目３８）
以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｂＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ２
（ここで、
ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｓｔｉｍは、共刺激ドメインをコードする核酸配列であり；
ＩＴＡＭ１は、前記第１のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ＩＴＡＭ２は、前記第２のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸配列であり、
その核酸配列は、細胞において発現されたとき、前記第１のＣＡＲおよび前記第２のＣＡＲが該細胞表面に発現されるように、切断部位で切断されるポリペプチドをコードする）を有する、項目３７に記載の核酸配列。
（項目３９）
（ｉ）項目３２～３６のいずれかにおいて定義されたような前記第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列であって、該核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ１
（ここで、
ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲ膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｓｔｉｍは、共刺激ドメインをコードする核酸配列であり；
ＩＴＡＭ１は、前記第１のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する、第１の核酸配列、および
（ｉｉ）項目３２～３６のいずれかにおいて定義されたような前記第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸配列であって、該核酸配列は、以下の構造：
ＡｂＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ２
（ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ＩＴＡＭ２は、前記第２のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する、第２の核酸配列
を含む、キット。
（項目４０）
項目３７または３８に記載の核酸配列を含む、ベクター。
（項目４１）
項目３７～３８のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、項目３７もしくは３８に記載の核酸配列；項目３９において定義されたような第１の核酸配列および第２の核酸配列；または項目４０に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、方法。
（項目４２）
項目３２～３６のいずれかに記載の複数の細胞を含む、医薬組成物。
（項目４３）
項目４２に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、疾患を処置および／または予防するための方法。
（項目４４）
疾患の処置および／または予防において使用するための項目４２に記載の医薬組成物。
（項目４５）
疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における項目３２～３６のいずれかに記載の細胞の使用。

ａ）古典的ＣＡＲを図示している模式図。（ｂ）～（ｄ）：種々の世代および並べ替えのＣＡＲエンドドメイン：（ｂ）最初の設計は、ＦｃεＲ１－γまたはＣＤ３ζエンドドメインを介してＩＴＡＭシグナルのみを伝達したが、後の設計は、同じ混成エンドドメインにおいてさらなる（ｃ）１つまたは（ｄ）２つの共刺激シグナルを伝達した。

Ｂ細胞の成熟経路／Ｂ細胞の発生。ＤＲ＝ＨＬＡ－ＤＲ；ｃＣＤ７９＝細胞質ＣＤ７９；ｃＣＤ２２＝細胞質ＣＤ２２。ＣＤ１９抗原とＣＤ２２抗原との両方が、Ｂ細胞成熟の初期において発現される。これらの細胞こそが、Ｂ細胞急性白血病に発展する。ＣＤ１９ならびにＣＤ２２の両方を同時に標的化することが、Ｂ細胞急性白血病の標的化に最もふさわしい。

抗ＣＤ１９ ＯＲ ＣＤ２２ ＣＡＲカセットを設計するための戦略。ＣＤ１９を認識するバインダーおよびＣＤ２２を認識するバインダーを選択する。最適なスペーサードメインおよびシグナル伝達ドメインを各ＣＡＲに対して選択する。（ａ）ＦＭＤ－２Ａペプチドを用いて両ＣＡＲが共発現されるように、ＯＲゲートカセットを構築する。組換えを回避するために、任意の相同配列をコドンゆらぎにする。（ｃ）２つのＣＡＲを別々のタンパク質としてＴ細胞表面上に共発現させる。

同一のペプチド配列のレトロウイルスベクターにおける共発現を可能にするが相同組換えを回避するコドンゆらぎの例。ここでは、野生型ＨＣＨ２ＣＨ３－ＣＤ２８ｔｍＺｅｔａが、コドンゆらぎのＨＣＨ２ＣＨ３－ＣＤ２８ｔｍＺｅｔａとアライメントしている。

抗ＣＤ１９ ＯＲ ＣＤ２２ ＣＡＲゲートの機能の実証。（ａ）構築物の略図：Ｓ１－シグナルペプチド１；ＨＡ－赤血球凝集素（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ）タグ；ＨＣＨ２ＣＨ３－ＩｇＧ１野生型配列のヒンジ、ＣＨ２ＣＨ３；ＣＤ２８ｔｍＺ－ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ３ゼータのゆらぎ配列；２Ａ－口蹄疫２Ａペプチド；Ｓ２－シグナルペプチド２；Ｖ５－ｖ５エピトープタグ；ａＣＤ２２－抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ；ＨＣＨ２ＣＨ３’－ＩｇＧ１のゆらぎ配列のヒンジ、ＣＨ２ＣＨ３；ＣＤ２８ｔｍＺ－ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ３ゼータのゆらぎ配列；（ｂ）単一ベクターからの２つの受容体の共発現。ＯＫＴ３および抗ＣＤ２８による刺激後に、末梢血Ｔ細胞にバイシストロニックベクターを形質導入した。形質導入の５日後に、抗Ｖ５－ＦＩＴＣ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および抗ＨＡ－ＰＥ（ａｂＣａｍ）で染色することによって、細胞を解析した。２つのＣＡＲは、Ｔ細胞表面上で同時に検出され得る。（ｃ）形質導入されていないＴ細胞、抗ＣＤ１９ ＣＡＲのみを発現しているＴ細胞、抗ＣＤ２２ ＣＡＲのみを発現しているＴ細胞、ならびに抗ＣＤ１９ ＯＲ ＣＤ２２ ＣＡＲゲートを発現しているＴ細胞を、ＣＤ１９もＣＤ２２も発現していない標的細胞、ＣＤ１９もしくはＣＤ２２を単独で発現している標的細胞、または両方の抗原を発現している標的細胞でチャレンジした。抗ＣＤ１９ ＯＲ ＣＤ２２ ＣＡＲゲートを発現しているＴ細胞は、一方の抗原が存在していなかったとしても、標的細胞を殺すことができた。

マウスＣＤ２２ＡＬＡｂ ｓｃＦｖ、ヒト化ＣＤ２２ＡＬＡｂ ｓｃＦｖおよびＭ９７１ ｓｃＦｖのＢｉａｃｏｒｅ親和性測定。

マウスＣＤ１９ＡＬＡｂ ｓｃＦｖおよびヒト化ＣＤ１９ＡＬＡｂのＢｉａｃｏｒｅ親和性測定。

ＣＤ１９ＡＬＡｂ ｓｃＦｖに対する可溶性ｓｃＦｖ－ＣＤ１９結合の結合カイネティクスとｆｍｃ６３ ｓｃＦｖに対する可溶性ｓｃＦｖ－ＣＤ１９結合の結合カイネティクスとの比較。

比較研究において使用されたＣＤ１９ＡＬＡｂ ＣＡＲ、ｆｍｃ６３ ＣＡＲ、ＣＤ２２ＡＬＡｂ ＣＡＲおよびＭ９７１ ＣＡＲを図示している模式図。

ＣＤ１９ＡＬＡｂ抗原結合ドメインを有するＣＡＲとｆｍｃ６３結合ドメインを有する等価なＣＡＲとを比較する、ＣＤ１９陽性標的細胞の致死アッセイ。

Ａ）ＣＤ２２ＡＬＡｂ抗原結合ドメインを有するＣＡＲとＭ９７１結合ドメインを有する等価なＣＡＲとを比較する、ＣＤ２２陽性標的細胞の致死アッセイ。Ｂ）ＣＤ２２陽性ＳｕｐＴ１細胞と１：１で共培養した後のＩＦＮγ放出を比較するアッセイ。

ＣＤ１９の構造およびエキソン。

実施例５において試験された４つの構築物を図示している模式図および構築物のマップ。構築物のマップにおいて、‘でマークされた部分は、コドンゆらぎになっている。Ａ：ＣＤ１９ ＣＡＲとＣＤ２２ ＣＡＲとの両方が、４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し；Ｂ：ＣＤ１９ ＣＡＲとＣＤ２２ ＣＡＲとの両方が、ＯＸ４０－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し；Ｃ：ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し；Ｄ：ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＯＸ４０－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有する。 実施例５において試験された４つの構築物を図示している模式図および構築物のマップ。構築物のマップにおいて、‘でマークされた部分は、コドンゆらぎになっている。Ａ：ＣＤ１９ ＣＡＲとＣＤ２２ ＣＡＲとの両方が、４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し；Ｂ：ＣＤ１９ ＣＡＲとＣＤ２２ ＣＡＲとの両方が、ＯＸ４０－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し；Ｃ：ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し；Ｄ：ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＯＸ４０－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有する。 実施例５において試験された４つの構築物を図示している模式図および構築物のマップ。構築物のマップにおいて、‘でマークされた部分は、コドンゆらぎになっている。Ａ：ＣＤ１９ ＣＡＲとＣＤ２２ ＣＡＲとの両方が、４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し；Ｂ：ＣＤ１９ ＣＡＲとＣＤ２２ ＣＡＲとの両方が、ＯＸ４０－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し；Ｃ：ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し；Ｄ：ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＯＸ４０－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有する。 実施例５において試験された４つの構築物を図示している模式図および構築物のマップ。構築物のマップにおいて、‘でマークされた部分は、コドンゆらぎになっている。Ａ：ＣＤ１９ ＣＡＲとＣＤ２２ ＣＡＲとの両方が、４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し；Ｂ：ＣＤ１９ ＣＡＲとＣＤ２２ ＣＡＲとの両方が、ＯＸ４０－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し；Ｃ：ＣＤ１９ ＣＡＲは、４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し；Ｄ：ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＯＸ４０－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有し、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ複合エンドドメインを有する。

図１３に示された構築物を発現している細胞による標的細胞致死。

詳細な説明
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
図１で概略的に示されているＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に結び付けるキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことも可能である。スペーサードメインは、通常膜からバインダーを単離し、好適な配向をもたせるのに必要である。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサー、例えば、抗原によっては、ＣＤ８αからのストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジ単独でも十分であり得る。膜貫通ドメインは、細胞膜にタンパク質をつなぎ止め、スペーサーをエンドドメインに結び付ける。

初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖のどちらかの細胞内部分から誘導されたエンドドメインを有していた。したがって、これらの第一世代受容体は、免疫学的シグナル１を伝達するもので、同種標的細胞のＴ細胞による致死を誘発するのに十分ではあったが、Ｔ細胞を十分に活性化して増殖および生存をもたらすことはなかった。この限界を克服するため、複合エンドドメインが構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分の融合により、抗原認識後活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第二世代受容体がもたらされる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、Ｔ細胞増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給する。また、生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢなど、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む一部の受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナルおよび生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにいっそう強力な第三世代ＣＡＲが現在記載されている。

ＣＡＲコード核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを用いてＴ細胞に移入され得る。レンチウイルスベクターも使用され得る。こうして、多数のがん特異的Ｔ細胞が、養子細胞移入のために生成され得る。ＣＡＲが標的抗原と結合したとき、これにより、活性化シグナルの、それが発現されるＴ細胞への伝達がもたらされる。すなわち、ＣＡＲは、標的抗原を発現する腫瘍細胞に向けたＴ細胞の特異性および細胞傷害性を誘導する。.

本発明の第１の態様は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを共発現する細胞に関し、ここで、Ｔ細胞が、ＣＤ１９またはＣＤ２２のいずれかを発現している標的細胞を認識することができるように、一方のＣＡＲはＣＤ１９に結合し、他方のＣＡＲはＣＤ２２に結合する。

したがって、本発明の第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、両ＣＡＲは、活性化エンドドメインを含み得る。それらの２つのＣＡＲは、同じであり得るスペーサードメイン、または２つの異なる受容体の交差対合を防止するのに十分に異なり得るスペーサードメインを含み得る。ゆえに、細胞は、ＣＤ１９およびＣＤ２２のいずれかまたは両方を認識すると活性化するように操作され得る。このことは、ゴルディ－コールドマン仮説（ほとんどのがんに固有の高変異率に起因して、単一抗原を唯一標的化すると、前記抗原の調節によって腫瘍エスケープがもたらされ得る）によって示唆されているように腫瘍学の分野において有用である。２つの抗原を同時に標的化することによって、そのようなエスケープの可能性（ｐｒｏｂａｂｌｙ）が指数関数的に低下する。

２つのＣＡＲがヘテロダイマーを形成しないことは重要である。

本発明のＴ細胞の第１および第２のＣＡＲは、切断部位とともに両ＣＡＲを含むポリペプチドとして生成され得る。
シグナルペプチド

本発明の細胞のＣＡＲはシグナルペプチドを含み得、その結果、ＣＡＲがＴ細胞などの細胞の内側で発現されるとき、新生タンパク質を小胞体、それに続いて細胞表面へと指向させ、そこで発現される。

シグナルペプチドのコアは、単一アルファ－へリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、アミノ酸の短い正に荷電したストレッチから始まり得、これが転位中におけるポリペプチドの適切なトポロジーを強化する助けとなる。シグナルペプチドの末端に、典型的にはシグナルペプチダーゼにより認識され、切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、転位中または転位完了後に切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成させ得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼにより消化される。

シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に位置し得る。

シグナルペプチドは、配列番号１、２もしくは３、または５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸変異（挿入、置換または付加）を有するそれらの変異型を含み得るが、ただし、そのシグナルペプチドは、ＣＡＲの細胞表面発現を引き起こすようになおも機能する。

配列番号１のシグナルペプチドは、小型であり高効率である。末端グリシンの後で約９５％の切断をもたらすことから、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去をもたらすと予測される。

配列番号２のシグナルペプチドは、ＩｇＧ１に由来する。

配列番号３のシグナルペプチドは、ＣＤ８に由来する。

第１のＣＡＲに対するシグナルペプチドは、第２のＣＡＲのシグナルペプチドとは異なる配列を有し得る。
ＣＤ１９

ヒトＣＤ１９抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する９５ｋｄの膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１９は、単一の膜貫通ドメイン、細胞質のＣ末端および細胞外のＮ末端を有するＩ型膜貫通タンパク質として分類される。ＣＤ１９の一般構造を図１２に図示する。

ＣＤ１９は、正常なＢ細胞および腫瘍性Ｂ細胞ならびに濾胞樹状細胞のバイオマーカーである。実際に、ＣＤ１９は、Ｂ細胞芽球への発生中に最も早く認識可能なＢ系列細胞由来のＢ細胞上に存在するが、形質細胞に成熟すると消失する。ＣＤ１９は、主に、ＣＤ２１およびＣＤ８１とともにＢ細胞共受容体として作用する。活性化されると、ＣＤ１９の細胞質テイルは、リン酸化され、それによって、Ｓｒｃファミリーキナーゼによる結合およびＰＩ－３キナーゼのリクルートメントがもたらされる。ＣＤ１９は、Ｂ細胞分化の非常に初期に発現するが、結局、形質細胞へのＢ細胞分化の末期には消失する。結果的に、ＣＤ１９は、多発性骨髄腫以外のすべてのＢ細胞悪性腫瘍上に発現する。
以下の表に概要を述べるように、種々の設計のＣＡＲが種々の施設においてＣＤ１９に対して試験された：

上で示されたように、これまで行われた研究の大部分が、ＣＤ１９を認識する結合ドメインの一部としてハイブリドーマｆｍｃ６３に由来するｓｃＦｖを使用した。

図１２に示されているように、ＣＤ１９をコードする遺伝子は、１０個のエキソンを含む：エキソン１～４は、細胞外ドメインをコードし；エキソン５は、膜貫通ドメインをコードし；エキソン６～１０は、細胞質ドメインをコードする。

本発明のＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートにおいて、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９遺伝子のエキソン１によってコードされるＣＤ１９のエピトープに結合し得る。

本発明のＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートにおいて、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９遺伝子のエキソン３によってコードされるＣＤ１９のエピトープに結合し得る。

本発明のＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートにおいて、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９遺伝子のエキソン４によってコードされるＣＤ１９のエピトープに結合し得る。
ＣＤ１９ＡＬＡｂ

本発明者らは、バインダーｆｍｃ６３を含む公知の抗ＣＤ１９ ＣＡＲと比べて特性が改善された新規の抗ＣＤ１９ ＣＡＲを開発した（実施例２および３を参照のこと）。そのＣＡＲの抗原結合ドメインは、下記で特定されるＣＤＲおよびＶＨ／ＶＬ領域を有する、ＣＤ１９バインダーであるＣＤ１９ＡＬＡｂに基づく。

ゆえに、本発明はまた、ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－ＳＹＷＭＮ（配列番号１５）；
ＣＤＲ２－ＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫ（配列番号１６）
ＣＤＲ３－ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号１７）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号１８）；
ＣＤＲ２－ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号１９）
ＣＤＲ３－ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号２０）
を含むＣＤ１９結合ドメインを含むＣＡＲも提供する。

ＣＤ１９結合活性に悪影響を及ぼさずに、１つまたはそれより多くの変異（置換、付加または欠失）をそのＣＤＲまたは各ＣＤＲに導入することが可能であり得る。各ＣＤＲは、例えば、１つ、２つまたは３つのアミノ酸変異を有し得る。
本発明のＣＡＲは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含み得る。
配列番号２１（マウスＣＤ１９ＡＬＡｂ ｓｃＦｖ配列）

配列番号２２（ヒト化ＣＤ１９ＡＬＡｂ ｓｃＦｖ配列－重鎖１９，カッパー１６）

配列番号３９（ヒト化ＣＤ１９ＡＬＡｂ ｓｃＦｖ配列－重鎖１９，カッパー７）

上記ｓｃＦｖは、ＶＨ－ＶＬ配向（配列番号２１、２２および３９に示されているように）またはＶＬ－ＶＨ配向であり得る。
本発明のＣＡＲは、以下のＶＨ配列のうちの１つを含み得る。
配列番号２３（マウスＣＤ１９ＡＬＡｂ ＶＨ配列）

配列番号２４（ヒト化ＣＤ１９ＡＬＡｂ ＶＨ配列）

本発明のＣＡＲは、以下のＶＬ配列のうちの１つを含み得る。
配列番号２５（マウスＣＤ１９ＡＬＡｂ ＶＬ配列）

配列番号２６（ヒト化ＣＤ１９ＡＬＡｂ ＶＬ配列，カッパー１６）

配列番号４０（ヒト化ＣＤ１９ＡＬＡｂ ＶＬ配列，カッパー７）

本発明のＣＡＲは、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、３９または４０として示されている配列の変異型を含み得るが、ただし、この変異型の配列は、ＣＤ１９に結合する能力を保持する（相補的なＶＬまたはＶＨドメインと結合するとき、適切ならば）。

２つのポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性は、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて自由に入手可能なＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に測定され得る。
ＣＤ２２

ヒトＣＤ２２抗原は、レクチンのＳＩＧＬＥＣファミリーに属する分子である。ヒトＣＤ２２抗原は、成熟Ｂ細胞およびいくつかの未熟Ｂ細胞の表面上に見られる。一般的に言えば、ＣＤ２２は、免疫系の過剰活性化および自己免疫疾患の発症を防止する制御性分子である。

ＣＤ２２は、Ｎ末端に位置する免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインによってシアル酸に特異的に結合する糖結合膜貫通タンパク質である。Ｉｇドメインが存在するために、ＣＤ２２は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ２２は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達に対する阻害性受容体として機能する。

ＣＤ２２は、２つのアイソフォーム、１つは７つのドメインならびに３つのＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ）およびＩＴＡＭを含む細胞質内テイルを有するもの；ならびにその代わりに、５つの細胞外ドメインおよび１つのＩＴＩＭを有する細胞質内テイルを含むスプライシング変異型として存在し得るＩｇＳＦの分子である。ＣＤ２２は、抗原に対するＢ細胞の応答の制御に関与する阻害性受容体であると考えられている。ＣＤ１９と同様に、ＣＤ２２は、ｐａｎ－Ｂ抗原であると広く見なされているが、いくつかの非リンパ系組織上での発現が記載されている。治療用モノクローナル抗体および免疫コンジュゲートによるＣＤ２２の標的化は、臨床試験に入っている。

抗ＣＤ２２ ＣＡＲの例は、Ｈａｓｏら（Ｂｌｏｏｄ；２０１３；１２１（７））によって記載されている。具体的には、ｍ９７１、ＨＡ２２およびＢＬ２２ ｓｃＦｖに由来する抗原結合ドメインを有する抗ＣＤ２２ ＣＡＲが記載されている。

抗ＣＤ２２ ＣＡＲの抗原結合ドメインは、３０～５０ｎＭ、例えば、３０～４０ｎＭの範囲のＫ_ＤでＣＤ２２に結合し得る。そのＫ_Ｄは、約３２ｎＭであり得る。

ＣＤ２２は、７つの細胞外ＩｇＧ様ドメインを有し、これらのドメインは、通常、Ｉｇドメイン１～Ｉｇドメイン７として特定されており、Ｉｇドメイン７が、Ｂ細胞膜に最も近位であり、Ｉｇドメイン７が、Ｉｇ細胞膜から最も遠位である（上記のＨａｓｏら、２０１３、図２Ｂを参照のこと）。
ＣＤ２２のアミノ酸配列に関するＩｇドメインの位置（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ２０２７３）を以下の表に要約する：

第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２上の膜遠位のエピトープに結合し得る。第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２のＩｇドメイン１、２、３または４上、例えば、ＣＤ２２のＩｇドメイン３上のエピトープに結合し得る。第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２のアミノ酸２０～４１６の間、例えば、ＣＤ２２のアミノ酸２４２～３２６の間に位置するエピトープに結合し得る。

抗ＣＤ２２抗体ＨＡ２２およびＢＬ２２（上記のＨａｓｏら、２０１３）ならびに下記に記載されるＣＤ２２ＡＬＡｂは、ＣＤ２２のＩｇドメイン３上のエピトープに結合する。

第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２上の膜近位エピトープに結合しない可能性がある。第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２のＩｇドメイン５、６または７上のエピトープに結合しない可能性がある。第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２のアミノ酸４１９～６７６の間、例えば、ＣＤ２２の５０５～６７６の間に位置するエピトープに結合しない可能性がある。
ＣＤ２２ＡＬＡｂ

本発明者らは、バインダーｍ９７１を含む公知の抗ＣＤ２２ ＣＡＲと比べて特性が改善された新規の抗ＣＤ２２ ＣＡＲを開発した（実施例２および３ならびに上記のＨａｓｏら（２０１３）を参照のこと）。そのＣＡＲの抗原結合ドメインは、下記で特定されるＣＤＲおよびＶＨ／ＶＬ領域を有するＣＤ２２バインダーであるＣＤ２２ＡＬＡｂに基づく。

ゆえに、本発明はまた、
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－ＮＹＷＩＮ（配列番号２７）；
ＣＤＲ２－ＮＩＹＰＳＤＳＦＴＮＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２８）
ＣＤＲ３－ＤＴＱＥＲＳＷＹＦＤＶ（配列番号２９）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号３０）；
ＣＤＲ２－ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号３１）
ＣＤＲ３－ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ（配列番号３２）
を含むＣＤ２２結合ドメインを含むＣＡＲも提供する。

ＣＤ２２結合活性に悪影響を及ぼさずに、１つまたはそれより多くの変異（置換、付加または欠失）をそのＣＤＲまたは各ＣＤＲに導入することが可能であり得る。各ＣＤＲは、例えば、１つ、２つまたは３つのアミノ酸変異を有し得る。
本発明のＣＡＲは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含み得る。
配列番号３３（マウスＣＤ２２ＡＬＡｂ ｓｃＦｖ配列）

配列番号３４（ヒト化ＣＤ２２ＡＬＡｂ ｓｃＦｖ配列）

上記ｓｃＦｖは、ＶＨ－ＶＬ配向（配列番号３３および３４に示されているように）またはＶＬ－ＶＨ配向であり得る。

本発明のＣＡＲは、以下のＶＨ配列のうちの１つを含み得る。
配列番号３５（マウスＣＤ２２ＡＬＡｂ ＶＨ配列）

配列番号３６（ヒト化ＣＤ２２ＡＬＡｂ ＶＨ配列）

本発明のＣＡＲは、以下のＶＬ配列のうちの１つを含み得る。
配列番号３７（マウスＣＤ２２ＡＬＡｂ ＶＬ配列）

配列番号３８（ヒト化ＣＤ２２ＡＬＡｂ ＶＬ配列）

本発明のＣＡＲは、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する、配列番号３３、３４、３５、３６、３７または３８として示されている配列の変異型を含み得るが、ただし、この変異型の配列は、ＣＤ２２に結合する能力を保持する（相補的なＶＬまたはＶＨドメインと結合するとき、適切ならば）。
Ｂ細胞発生およびその後の腫瘍におけるＢ細胞抗原の発現

ＣＤ１９は、ｐａｎ－Ｂ抗原であると広く見なされているが、非常にまれに、いくらかの系統転換（ｌｉｎｅａｇｅ ｉｎｆｉｄｅｌｉｔｙ）を示すことがある。ＣＤ１９分子は、より小さいドメインによって分断された２つの細胞外ＩｇＳＦドメイン、および１つのＩＴＡＭを有する、この分子の細胞外の部分とほぼ同じ大きさの長い細胞質内テイルを含む。ＣＤ１９は、Ｂ細胞の発生および活性化において鍵となる分子である。ＣＤ２２は、２つのアイソフォーム（１つは７つのドメインならびに３つのＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ）および１つのＩＴＡＭを含む細胞質内テイルを含み；ならび、その代わりに５つの細胞外ドメインおよび１つのＩＴＩＭを有する細胞質内テイルを含むスプライシング変異型である）として存在し得るＩｇＳＦの分子である。ＣＤ２２は、抗原に対するＢ細胞の応答の制御に関与する阻害性受容体であると考えられている。ＣＤ１９と同様に、ＣＤ２２も、ｐａｎ－Ｂ抗原であると広く見なされているが、いくつかの非リンパ系組織上での発現が記載されている（Ｗｅｎら（２０１２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｂａｌｔｉｍ．Ｍｄ １９５０ １８８，１０７５－１０８２）。治療用モノクローナル抗体および免疫コンジュゲートによるＣＤ２２の標的化は、臨床試験に入っている。ＣＤ２２特異的ＣＡＲの作製は、記載されている（Ｈａｓｏら、２０１３，Ｂｌｏｏｄ：Ｖｏｌｕｍｅ １２１；７：１１６５－７４およびＪａｍｅｓら、２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １８０；Ｉｓｓｕｅ １０；Ｐａｇｅｓ ７０２８－３８）。

Ｂ細胞白血病の詳細な免疫フェノタイピング研究（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｔｙｐｉｎｇ
ｓｔｕｄｙ）から、表面ＣＤ１９は常に存在し、表面ＣＤ２２はほぼ常に存在することが示されている。例えば、Ｒａｐｏｎｉら（２０１１，上記）は、Ｂ－ＡＬＬの４２７症例の表面抗原の表現型を調べたところ、調べた３４１症例においてＣＤ２２が存在することを見出した。

上に記載されたＣＡＲ１９を標的化した後のＣＤ１９ダウンレギュレーションの偶然性は、ゴルディ－コールドマン仮説によって説明され得る。ゴルディ－コールドマン仮説は、腫瘍細胞が、内在性の遺伝的不安定性に依存する率で抵抗性の表現型に変異すること、およびがんが耐性クローンを含有する確率は変異率および腫瘍サイズに依存することを予測する。がん細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞の直接的な致死に対して内在的に抵抗性になることは困難であり得るが、抗原の喪失はなおも起こり得る。実際に、この現象は、メラノーマ抗原およびＥＢＶ駆動性リンパ腫の標的化によってすでに報告されている。ゴルディ－コールドマン仮説によると、最も治癒が見込めるのは、非交差耐性標的を同時に攻撃することであり得る。ＣＤ２２が、Ｂ－ＡＬＬのほぼすべての症例において発現されることを考えると、ＣＤ２２とともにＣＤ１９を同時にＣＡＲによって標的化すれば、抵抗性のＣＤ１９陰性クローンの出現が減少する可能性がある。
抗原結合ドメイン

抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの部分である。抗体、抗体模倣物、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものを含め、多数の抗原結合ドメインが当技術分野では知られている。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対する十分な親和力をもつペプチド；単一ドメイン抗体；Ｄａｒｐｉｎ（設計されたアンキリン反復タンパク質）などの人工単一バインダー；またはＴ細胞受容体から誘導された単鎖を含み得る。

ＣＤ１９に結合するＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合できる任意のドメインであってよい。例えば、抗原結合ドメインは、表１に記載されているようなＣＤ１９バインダーを含み得る。

ＣＤ１９に結合するＣＡＲの抗原結合ドメインは、表２に示されているＣＤ１９バインダーのうちの１つに由来する配列を含み得る。

ＣＤ２２に結合するＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合できる任意のドメインであってよい。例えば、その抗原結合ドメインは、表３に記載されているようなＣＤ２２バインダーを含み得る。

スペーサードメイン
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと連結し、空間的に抗原結合ドメインをエンドドメインから分離させるためのスペーサー配列を含む。可撓性スペーサーは、抗原結合ドメインを異なる方向で配向させることにより、結合を促進し得る。

本発明の細胞では、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、異なるスペーサー分子を含む。例えば、スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８ストークまたはマウスＣＤ８ストークを含み得る。あるいは、スペーサーは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似した長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替的リンカー配列を含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合性モチーフを除去するために改変され得る。

抗ＣＤ１９ ＣＡＲに対するスペーサーは、ＣＤ８ストークスペーサー、またはＣＤ８ストークスペーサーと等しい長さを有するスペーサーを含み得る。抗ＣＤ１９ ＣＡＲに対するスペーサーは、少なくとも３０アミノ酸または少なくとも４０アミノ酸を有し得る。抗ＣＤ１９ ＣＡＲに対するスペーサーは、３５～５５アミノ酸、例えば、４０～５０アミノ酸を有し得る。抗ＣＤ１９ ＣＡＲに対するスペーサーは、約４６アミノ酸を有し得る。

抗ＣＤ２２ ＣＡＲに対するスペーサーは、ＩｇＧ１ヒンジスペーサー、またはＩｇＧ１ヒンジスペーサーに等しい長さを有するスペーサーを含み得る。抗ＣＤ２２ ＣＡＲに対するスペーサーは、３０アミノ酸未満または２５アミノ酸未満を有し得る。抗ＣＤ２２
ＣＡＲに対するスペーサーは、１５～２５アミノ酸、例えば、１８～２２アミノ酸を有し得る。抗ＣＤ２２ ＣＡＲに対するスペーサーは、約２０アミノ酸を有し得る。
これらのスペーサーに対するアミノ酸配列の例を下記に示す：
配列番号４（ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２ＣＨ３）

配列番号５（ヒトＣＤ８ストーク）：

配列番号６（ヒトＩｇＧ１ヒンジ）：

配列番号７（ＣＤ２エクトドメイン）

配列番号８（ＣＤ３４エクトドメイン）

ＣＡＲは典型的にはホモダイマーであるため（図１ａ参照）、交差対合がヘテロダイマー性キメラ抗原受容体を生じさせ得る。これは、例えば以下の様々な理由により望ましくない：（１）エピトープは、標的細胞上で同じ「レベル」にはないことがあり得、その結果、交差対合したＣＡＲは１つの抗原に結合できるのみであり得る；（２）２つの異なるｓｃＦｖからのＶＨおよびＶＬは、取り換え可能であるが、標的を認識できないか、またはなお悪いことには予想外で予測外の抗原を認識することがあり得る。第１のＣＡＲのスペーサーは、交差対合を回避するため第２のＣＡＲのスペーサーとは十分に異なり得る。第１のスペーサーのアミノ酸配列は、第２のスペーサーとはアミノ酸レベルで５０％、４０％、３０％または２０％より低い同一性を共有し得る。
膜貫通ドメイン

膜貫通ドメインは、膜にわたるＣＡＲの配列である。

膜貫通ドメインは、膜において熱力学的に安定しているいかなるタンパク質構造であってよい。これは、典型的には幾つかの疎水性残基で構成されるアルファ・へリックスである。いかなる膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインでも、本発明の膜貫通部分を供給するのに使用され得る。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および範囲は、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０／）を用いて当業者により決定され得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造、すなわち膜にわたるのに十分な長さを有する疎水性アルファへリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列であるとすれば、人工的に設計されたＴＭドメインもまた使用され得る（米国特許第７０５２９０６Ｂ１号は、合成膜貫通成分について記載している）。

膜貫通ドメインは、ＣＤ２８から誘導され得、良好な受容体安定性を与える。

上記膜貫通ドメインは、ヒトＴｙｒｐ－１に由来し得る。ｔｙｒｐ－１の膜貫通配列を配列番号４５として示す。
配列番号４５

活性化エンドドメイン

エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部分である。抗原認識後、受容体がクラスター形成し、天然ＣＤ４５およびＣＤ１４８は、シナプスから排除され、シグナルは細胞へ伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３－ゼータのエンドドメイン成分である。これは、抗原が結合された後、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３－ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない可能性があるので、追加の共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、ＣＤ３－ゼータと併用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得るか、または３つ全部が一緒に使用され得る。

本発明の細胞は、２つのＣＡＲを含み、各々がエンドドメインを有する。
第１のＣＡＲのエンドドメインおよび第２のＣＡＲのエンドドメインは、
（ｉ）ＩＴＡＭ含有エンドドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータ由来のエンドドメイン；および／または
（ｉｉ）共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８由来のエンドドメイン；および／または
（ｉｉｉ）生存シグナルを伝達するドメイン、例えば、ＯＸ－４０または４－１ＢＢなどのＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメイン
を含み得る。

１つの配置において、共刺激ドメインおよび生存シグナル生成ドメインは、１つのＯＲゲートにおける２つ（またはそれより多く）のＣＡＲの間で「共有」される。例えば、ＯＲゲートが、２つのＣＡＲ、ＣＡＲ ＡおよびＣＡＲ Ｂを有する場合、ＣＡＲ Ａは、共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８エンドドメイン）を含み得、ＣＡＲ Ｂは、ＯＸ－４０または４－１ＢＢなどのＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含み得る。

ＩＴＡＭモチーフを含むエンドドメインであれば、いずれも本発明における活性化エンドドメインとして作用し得る。幾つかのタンパク質が、１つまたはそれより多くのＩＴＡＭモチーフを伴うエンドドメインを含むことが知られている。かかるタンパク質として少し例を挙げれば、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖およびＣＤ３デルタ鎖が挙げられる。ＩＴＡＭモチーフは、サインＹｘｘＬ／Ｉを与える、任意の２つの他のアミノ酸によりロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンとして容易に認識され得る。常というわけではないが、典型的には、これらのモチーフの２つが、分子（ＹｘｘＬ／Ｉｘ（６－８）ＹｘｘＬ／Ｉ）のテイルにおける６～８個の間のアミノ酸により分離される。このため、当業者であれば、活性化シグナルを伝達するための１つまたはそれより多くのＩＴＡＭを含む既存のタンパク質を容易に見出すことができる。さらに、モチーフが単純であり、複合２次構造が要求されないと仮定すると、当業者であれば、活性化シグナルを伝達するための人工ＩＴＡＭを含むポリペプチドを設計できる（合成シグナル伝達分子に関する、国際公開第２０００／０６３３７２号参照）。

活性化エンドドメインを伴うＣＡＲの膜貫通および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）は、配列番号９、１０または１１に示された配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
配列番号９は、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ３Ｚエンドドメインを含む。

配列番号１０は、ＣＤ２８膜貫通ドメインならびにＣＤ２８およびＣＤ３ゼータエンドドメインを含む。

配列番号１１は、ＣＤ２８膜貫通ドメインならびにＣＤ２８、ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメインを含む。

変異型配列が、有効な膜貫通ドメインおよび有効な細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを提供するものと仮定すれば、該配列は、配列番号９、１０または１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
「分割」ＯＲゲートエンドドメイン

本発明は、共刺激ドメイン／生存シグナルドメインが２つのＣＡＲの間で「分割」されているＯＲゲートを提供する。

この点において、本発明は、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを細胞表面に共発現する細胞を提供し、各ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第１のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含み；第２のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む。

第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲは、異なる抗原に結合し得る。例えば、第１のＣＡＲは、ＣＤ１９に結合し得、第２のＣＡＲは、ＣＤ２２に結合し得るか；あるいは、第１のＣＡＲは、ＣＤ２２に結合し得、第２のＣＡＲは、ＣＤ１９に結合し得る。

第１のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含み、生存シグナルを伝達するドメイン（例えば、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメイン）を含まない。第２のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含み、共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８エンドドメイン）を含まない。

共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインであり得る。ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号４１として示される配列を有し得る。
配列番号４１（ＣＤ２８共刺激エンドドメイン）

本発明のＣＡＲは、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する、配列番号４１として示された配列の変異型を含み得るが、ただし、変異型の配列は、抗原認識の際にＴ細胞を共刺激する能力を保持し、すなわち、シグナル２をＴ細胞に提供する。

ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインは、ＯＸ４０または４－１ＢＢエンドドメインであり得る。ＯＸ４０エンドドメインは、配列番号４２として示される配列を有し得る。４－１ＢＢエンドドメインは、配列番号４３として示される配列を有し得る。
配列番号４２（ＯＸ４０エンドドメイン）

配列番号４３（４－１ＢＢエンドドメイン）

本発明のＣＡＲは、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する、配列番号４２または４３として示された配列の変異型を含み得るが、ただし、その変異型の配列は、抗原認識の際に生存シグナルをＴ細胞に伝達する能力を保持する。

第１および／または第２のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはまた、ＩＴＡＭ含有ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインも含み得る。ＣＤ３ゼータドメインは、配列番号４４として示される配列を有し得る。
配列番号４４（ＣＤ３ゼータエンドドメイン）

本発明のＣＡＲは、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する、配列番号４４として示された配列の変異型を含み得るが、ただし、その変異型の配列は、抗原認識の際にＴ細胞シグナル伝達を誘導する能力、すなわち、シグナル１をＴ細胞に提供する能力を保持する。
第１のＣＡＲは、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインであり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーであり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインであり；
ｃｏｓｔｉｍは、共刺激ドメインであり；そして
ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）
を有し得る。

「Ｃｏｓｔｉｍ」は、ＣＤ２８共刺激ドメインであり得る。

「ＩＴＡＭ」は、ＣＤ３ゼータエンドドメインであり得る。

第２のＣＡＲは、以下の構造：
ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ
（ここで、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインであり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーであり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインであり；
ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体のエンドドメインであり；そして
ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）
を有し得る。

「ＴＮＦ」は、ＴＮＦ受容体のエンドドメイン、例えば、ＯＸ４０または４－１ＢＢエンドドメインであり得る。

「分割」エンドドメインを有する、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）との両方をコードする核酸配列；ならびに上で定義されたような分割エンドドメインを含む２つの核酸（１つは、第１のＣＡＲをコードし、もう１つは、第２のＣＡＲをコードする）を含むキットも提供される。
共発現部位

本発明の第２の態様は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする核酸に関する。

核酸は、切断部位により連結された２つのＣＡＲ分子を含むポリペプチドを生成し得る。切断部位は、ポリペプチドが産生されるとき、外部の切断活性を一切必要とせずに第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲへと直ちに切断されるように、自己切断性であり得る。

様々な自己切断性部位が知られており、それらとしては、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチドおよび類似配列（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１），８２，１０２７－１０４１）、例えば、配列番号１２として示される配列を有するＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス由来の２Ａ様配列のような配列が挙げられる：
配列番号１２

共発現配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）であり得る。共発現配列は、内部プロモーターであり得る。
細胞

本発明は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを細胞表面に共発現する細胞に関し、ここで、一方のＣＡＲは、ＣＤ１９に結合し、他方のＣＡＲは、ＣＤ２２に結合する。

該細胞は、免疫学的細胞など、細胞表面でＣＡＲを発現することができる任意の真核生物細胞であってよい。

特に、細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞であり得る。

Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的役割を演じるリンパ球のタイプである。それらは、細胞表面におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球とは区別することができる。下記で概説する通り、様々なタイプのＴ細胞がある。

ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスで他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面でＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。これらの細胞は、種々のサイトカインを分泌することにより、種々のタイプの免疫応答を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、幾つかのサブタイプのうちの１つに分化し得る。

細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植拒絶でも関与する。ＣＴＬは、それらの表面でＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全有核細胞の表面に存在する、ＭＨＣクラスＩに随伴する抗原に結合することにより標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌されるＩＬ－１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活化され得、実験的自己免疫脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防止する。

記憶Ｔ細胞は、感染の消散後長期にわたって持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同種抗原に再曝露されると、迅速に多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、過去の感染に対する「記憶」をもつ免疫系を提供する。記憶Ｔ細胞は、３つのサブタイプ：セントラル記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２タイプのエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。記憶Ｔ細胞は、典型的には細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。

以前にはサプレッサーＴ細胞として知られていた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に非常に重要である。それらの主たる役割は、免疫反応の終末に向けてＴ細胞媒介性免疫を制止し、胸腺での負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。

ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス－天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞については記載されている。

天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られている）は、胸腺で生じ、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発達中のＴ細胞との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在により他のＴ細胞からは区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞の発達を防止し得るため、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸが引き起こされ得る。

適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られている）は、正常な免疫応答中に生じ得る。

本発明のＴ細胞は、上記で挙げたＴ細胞タイプのいずれでもよいが、特にＣＴＬであり得る。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系の一部を形成する細胞溶解性細胞の１タイプである。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的にウイルス感染細胞からの内生シグナルに対して、迅速な応答を提供する。

ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生じる共通のリンパ性前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺で分化および成熟し、次いでそこから循環系に入ることが知られている。

本発明のＣＡＲ細胞は、上記で挙げた細胞タイプのいずれでもよい。

ＣＡＲ発現ＴまたはＮＫ細胞などのＣＡＲ発現細胞は、患者自身の末梢血から（第１団）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において（第２団）、または非関連ドナーからの末梢血（第３団）から生体外で作製され得る。

本発明はまた、本発明によるＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞を含む細胞組成物を提供する。該細胞組成物は、本発明による核酸での血液試料の生体外形質導入により作製され得る。

あるいは、ＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞などの関連する細胞タイプへの誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の生体外分化から誘導され得る。あるいは、溶解機能を保持し、治療薬として作用することができるＴ細胞系などの不死化細胞系も使用され得る。

これらのすべての実施形態において、ＣＡＲ細胞は、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つによりＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより生成される。

本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、被験体由来の生体外Ｔ細胞であり得る。Ｔ細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料から得てもよい。Ｔ細胞は、ＣＡＲエンコード核酸で形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理により活性化および／または拡大され得る。
本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、
（ｉ）被験体または上記で挙げた他の供給源からのＴ細胞含有試料の単離；および
（ｉｉ）第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする１つまたはそれより多くの核酸配列（複数も可）によるＴ細胞の形質導入またはトランスフェクション
により作製され得る。

次いで、Ｔ細胞は精製され得、例えば、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲの共発現に基づいて選択され得る。
核酸配列

本発明の第２の実施態様は、本発明の第１の実施態様で記載した第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする１つまたはそれより多くの核酸配列（複数も可）に関する。

その核酸配列は、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列であり得る。

その核酸配列は、ＣＤ１９に結合する１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＣＤ２２に結合する別のＣＡＲをコードし得る。

その核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｂＢ２－スペーサー２－ＴＭ２
（ここで、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、両ＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
その核酸配列は、Ｔ細胞において発現されるとき、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲが細胞表面に共発現されるように、切断部位において切断されるポリペプチドをコードする）を有し得る。

第１のＣＡＲは、ＣＤ１９に結合し得、第２のＣＡＲは、ＣＤ２２に結合し得る。あるいは、第１のＣＡＲは、ＣＤ２２に結合し得、第２のＣＡＲは、ＣＤ１９に結合し得る。

代替的コドンは、相同組換えを回避するために、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で使用され得る。

遺伝暗号の縮重に起因して、同じアミノ酸配列をコードする代替的コドンを使用することが可能である。例えば、コドン「ｃｃｇ」および「ｃｃａ」の両方ともが、アミノ酸プロリンをコードするので、「ｃｃｇ」の使用は、翻訳されるタンパク質の配列内のこの位置におけるアミノ酸に影響せずに「ｃｃａ」と交換され得る。

各アミノ酸をコードするために使用され得る代替的ＲＮＡコドンを表３に要約する。
表３

代替的コドンは、特に、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲにおいて同一または類似のスペーサーが使用されている場合、第１のＣＡＲのスペーサーおよび第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列の一部分において使用され得る。図４は、スペーサーＨＣＨ２ＣＨ３－ヒンジをコードする２つの配列を示しており、そのうちの１つにおいて、代替的コドンが使用されている。

代替的コドンは、特に、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲにおいて同一または類似の膜貫通ドメインが使用されている場合、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインおよび第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列の一部分において使用され得る。図４は、ＣＤ２８膜貫通ドメインをコードする２つの配列を示しており、そのうちの１つにおいて、代替的コドンが使用されている。

代替的コドンは、第１のＣＡＲのエンドドメインの全部または一部および第２のＣＡＲのエンドドメインの全部または一部をコードする核酸配列の一部分において使用され得る。代替的コドンは、ＣＤ３ゼータエンドドメインにおいて使用され得る。図４は、ＣＤ３ゼータエンドドメインをコードする２つの配列を示しており、そのうちの１つにおいて、代替的コドンが使用されている。

代替的コドンは、１つまたはそれより多くの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８エンドドメインにおいて使用され得る。

代替的コドンは、生存シグナルを伝達する１つまたはそれより多くのドメイン、例えば、ＯＸ４０および４１ＢＢエンドドメインにおいて使用され得る。

代替的コドンは、ＣＤ３ゼータエンドドメインをコードする核酸配列の一部分および／または１つもしくはそれより多くの共刺激ドメインをコードする核酸配列の一部分および／または生存シグナルを伝達する１つもしくはそれより多くのドメインをコードする核酸配列の一部分において使用され得る。
ベクター

本発明はまた、１つまたはそれより多くのＣＡＲエンコード核酸配列（複数も可）を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。かかるベクターは、宿主細胞へ核酸配列（複数も可）を導入するのに使用され得、それにより、その宿主細胞が第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを発現する。

ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンに基づくベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。

本ベクターは、Ｔ細胞に対しトランスフェクションまたは形質導入を行うことができるものであればよい。
医薬組成物

本発明はまた、本発明の第１の実施態様によるＴ細胞またはＮＫ細胞などの複数のＣＡＲ発現細胞を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、所望により１種またはそれより多くのさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含んでいてもよい。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であり得る。
処置方法

本発明の細胞は、Ｂ細胞リンパ腫細胞などのがん細胞を殺すことができる。Ｔ細胞などのＣＡＲ発現細胞は、患者本人の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）由来の造血性幹細胞移植の環境において、または無関係のドナー（第三者）由来の末梢血からのいずれかで、生体外で創出され得る。あるいは、ＣＡＲ Ｔ細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞からＴ細胞への生体外分化に由来し得る。これらの場合、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡによるトランスフェクションをはじめとした多くの手段のうちの１つによって、ＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって作製される。

本発明の細胞は、がん細胞などの標的細胞を殺すことができてもよい。その標的細胞は、ＣＤ１９またはＣＤ２２の発現によって認識可能である。

Ｃａｍｐａｎａら（Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４３，５９－７５（２０００））より引用。ｃＩｇμ－細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｉｃ）免疫グロブリン重鎖；ｓＩｇμ－表面免疫グロブリン重鎖。

種々のタイプのＢ細胞白血病において一般に調べられたリンパ系抗原の発現は、Ｂ細胞の発生のそれをきっちりと反映している（図２を参照のこと）。

本発明のＴ細胞は、がん、特にＢ細胞悪性腫瘍を処置するために使用され得る。

ＣＤ１９またはＣＤ２２を発現するがんの例は、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むＢ細胞リンパ腫；ならびにＢ細胞白血病である。

例えば、Ｂ細胞リンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）または粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小細胞リンパ球性リンパ腫（慢性リンパ性白血病と重複）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫、縦隔（胸腺）原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫（ワルデンシュトレームマクログロブリン血症として顕在化し得る）、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾臓辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性体腔性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫または原発性中枢神経系リンパ腫であり得る。

Ｂ細胞白血病は、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞前リンパ性白血病、前駆Ｂリンパ芽球性白血病またはヘアリーセル白血病であり得る。

Ｂ細胞白血病は、急性リンパ芽球性白血病であり得る。

本発明のＴ細胞による処置は、標準的手法で起こることが多い腫瘍細胞のエスケープまたは放出を防止するのを助け得る。

以下、実施例により本発明をさらに記載するが、これは、本発明を実施する上で当業者を助ける役割を果たすことを意味するもので、本発明の範囲をいかなる意味にせよ限定する意図はない。

実施例１－ＣＤ１９／ＣＤ２２論理的「ＯＲ」ゲートの実証実験
ＣＤ１９「ＯＲ」ＣＤ２２ ＣＡＲゲートを、同じベクターにおけるＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ２２ ＣＡＲの共発現によって構築した。抗ＣＤ１９バインダーは、再表面化（ｒｅ－ｓｕｒｆａｃｅｄ）Ｂ４抗体（Ｒｏｇｕｓｋａら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９，８９５－９０４）に由来するｓｃＦｖであり、抗ＣＤ２２バインダーは、ヒト化ＲＦＢ４抗体に由来するｓｃＦｖであった。ヒトＩｇＧ１ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３スペーサーを両ＣＡＲに対して使用し、そのスペーサーのコード配列をコドンゆらぎにして、組込み型ベクターによる相同組換えを回避した。両ＣＡＲにおけるＴＭドメインは、ＣＤ２８のＴＭドメインに由来し、両ＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ３－ゼータを含んだ。また、これらの相同配列をコドンゆらぎにした。ＦＭＤ－２Ａペプチドによって分断されたインフレームの２つのＣＡＲをクローニングすることによって、共発現を行った。ＣＤ１９／ＣＤ２２「ＯＲ」ゲート構築物の核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３および１４として示す。
配列番号１３

配列番号１４

両ＣＡＲの共発現を実証するために、各ＣＡＲのｓｃＦｖをエピトープタグでタグ化した（それぞれＨＡまたはＶ５）。これに続いて単一のオープンリーディングフレームをＳＦＧレトロウイルスベクターにクローニングした。このベクターをＴ細胞に形質導入し、抗ＨＡおよび抗Ｖ５で染色し、フローサイトメトリーで発現を調べることによって、そのカセットを発現しているＴ細胞表面上に両ＣＡＲを検出できた。

次に、ＣＤ１９ ＯＲ ＣＤ２２ ＣＡＲゲートを発現しているＴ細胞を、ＣＡＲを発現していないコントロールＴ細胞または抗ＣＤ１９ ＣＡＲのみもしくは抗ＣＤ２２ ＣＡＲのみを発現しているコントロールＴ細胞とともに、いずれの抗原も発現していない標的細胞または両方もしくは一方の抗原を発現している標的細胞でチャレンジした。本発明者らは、ＯＲゲートＣＡＲ Ｔ細胞が、いずれか一方または両方の標的抗原を発現している標的細胞を殺すことができたことを見出した（図５）。
実施例２－ＣＤ１９ＡＬＡｂおよびＣＤ２２ＡＬＡｂの特定および特徴づけ

ＣＤ１９バインダー（ＣＤ１９ＡＬＡｂ）を特定し、ヒト化し、マウスＩｇＧおよびマウスｓｃＦｖの両方ならびにヒト化ＩｇＧおよびヒト化ｓｃＦｖの両方の結合親和性を特定し、「ゴールドスタンダード」抗ＣＤ１９バインダーであるｆｍｃ６３と比較した。並行して、ＣＤ２２バインダー（ＣＤ２２ＡＬＡｂ）を特定し、ヒト化し、マウスＩｇＧおよびマウスｓｃＦｖの両方ならびにヒト化ＩｇＧおよびヒト化ｓｃＦｖの両方の結合親和性を特定し、「ゴールドスタンダード」抗ＣＤ２２バインダーであるＭ９７１と比較した。

実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置においてＨＢＳ－Ｐをランニング緩衝液および希釈緩衝液として使用して行った。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン２．０をデータ処理に使用した。結合カイネティクスを調べるために、マウス抗ヒトＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧをＣＭ５センサーチップに共有結合させた。ＩｇＧまたはｓｃＦｖ－Ｆｃタンパク質を捕捉し、様々な濃度の相互作用パートナータンパク質を３０μｌ／分の流速でフローセルに注入した。１：１ラングミュア結合モデルに従うカーブフィッティングによって、運動速度定数を得た。バルク屈折率の差を、捕捉抗体が活性表面と同じレベルに固定化されたブランクのコントロールフローセルを用いて減算した。緩衝液のみを用いて、二重参照減算（ｄｏｕｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）を行った。

結果を図６～８に示す。

データから、ヒト化ＣＤ２２ＡＬＡｂが、ＣＤ２２に対してマウスＣＤ２２ＡＬＡｂに匹敵する結合親和性（図６）および類似の結合カイネティクスを有することが示される。ｓｃＦｖフォーマットにおけるマウスＣＤ２２ＡＬＡｂとヒト化ＣＤ２２ＡＬＡｂとの両方が、ＣＤ２２に対して、ゴールドスタンダードのＣＤ２２結合抗体Ｍ９７１よりも有意に高い結合親和性を有する（図６）。

ＩｇＧフォーマットにおけるマウスＣＤ１９ＡＬＡｂおよびヒト化ＣＤ１９ＡＬＡｂの結合親和性は、類似していることを見出した（データ示さず）が、驚いたことに、ｓｃＦｖフォーマットでは、ヒト化ＣＤ１９ＡＬＡｂの結合親和性が、マウスＣＤ１９ＡＬＡｂより高いことを見出した（図７）。ＣＤ１９ＡＬＡｂの結合親和性は、ゴールドスタンダードの抗ＣＤ１９Ａｂ ｆｍｃ６３の結合親和性に匹敵する（おそらくわずかに良好である）（図８）。
実施例３－ＣＤ１９ＡＬＡｂ／ｆｍｃ６３ ＣＡＲおよびＣＤ２２ＡＬＡｂ／Ｍ９７１
ＣＡＲによる比較機能アッセイ

ＣＡＲの抗原結合ドメインは、その機能に影響し得る。この研究では、ＣＤ１９ＡＬＡｂおよびＣＤ２２ＡＬＡｂを含むＣＡＲを創出し、ｆｍｃ６３またはＭ９７１に基づく抗原結合ドメインを有する等価なＣＡＲと機能を比較した。

ｆｍｃ６３（抗ＣＤ１９）およびＭ９７１（抗ＣＤ２２）に基づくｓｃＦｖを含むＣＡＲは、両方のＣＡＲが臨床開発中であるので、ゴールドスタンダード抗体と見なされ得る。

ＣＤ１９ＡＬＡｂ、ｆｍｃ６３、ＣＤ２２ＡＬＡｂおよびＭ９７１に基づいてＣＡＲを構築し、発現させた。それらの構造を図９に示す。それらのＣＡＲは、もっぱら抗原結合ドメインが異なる。すべての構築物において、結合ドメインをＣＤ８ストークスペーサーとともに膜に連結させ、４１ＢＢおよびＣＤ３－ゼータ由来の細胞内活性化モチーフを含んだ。

ＣＡＲ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびエンベロープタンパク質ＲＤ１１４をコードするプラスミドによる２９３Ｔ細胞の一過性のトランスフェクションによって、レトロウイルスを作製した。３日後、上清を回収し、それを用いて、レトロネクチンがコーティングされたプレート上で、ＰＨＡ／ＩＬ２によって活性化されたＰＢＭＣに等力価のレトロウイルスを形質導入した。形質導入の６日後にＣＡＲの発現をフローサイトメトリーによって確認し、ＰＢＭＣを、ＣＤ１９＋ＢＦＰ ＳｕｐＴ１細胞（ｆｍｃ６３およびＣＤ１９ＡＬＡｂ
ＣＡＲ）またはＣＤ２２＋ＢＦＰ ＳｕｐＴ１細胞（Ｍ９７１およびＣＤ２２ＡＬＡｂ
ＣＡＲ）のいずれかと１：１の比で共培養した。１日後および３日後に、標的細胞致死をアッセイした。また、１日後および３日後に、上清を取り出し、インターフェロンγのレベルをＥＬＩＳＡによってアッセイした。

結果を図１０および１１に示す。

図１０に示されているように、ＣＤ１９ＡＬＡｂ抗原結合ドメインを有するＣＡＲは、１日目と３日目との両方において、ｆｍｃ６３結合ドメインを有する等価なＣＡＲよりも多くのＣＤ１９＋ｖｅ標的細胞の致死をもたらした（図１０）。

ＣＤ２２に関しては、ＣＤ２２ＡＬＡｂ抗原結合ドメインを有するＣＡＲは、３日後に、Ｍ９７１結合ドメインを有する等価なＣＡＲよりも多くのＣＤ２２＋ｖｅ標的細胞の致死をもたらした（図１１ａ）。ＣＤ２２ＡＬＡｂ ＣＡＲを用いたときのＩＦＮγの放出は、同じ時間が経過した後のＭ９７１ ＣＡＲよりも有意に多かった。

ゆえに、ＣＤ１９ＡＬＡｂおよびＣＤ２２ＡＬＡｂに基づく抗原結合ドメインを有するＣＡＲは、ｆｍｃ６３およびＭ９７１に基づく等価なＣＡＲと比べて、標的細胞の致死に関して改善された特性を有する。

上記のＨａｓｏら（２０１３）で報告された知見を考えると、ＣＤ２２ＡＬＡｂの結果は、特に驚くべきものである。その研究では、抗ＣＤ２２抗体ＨＡ２２、ＢＬ２２およびｍ９７１に基づく結合ドメインを有する種々の抗ＣＤ２２ ＣＡＲを作製して試験した。ＨＡ２２およびＢＬ２２ ｓｃＦｖは、ＣＤ２２のＩｇドメイン３に結合するのに対して、ｍ９７１は、ＣＤ２２のＩｇドメイン５～７内に結合する（Ｈａｓｏら（２０１３）図２Ｂを参照のこと）。ｍ９７１由来のＣＡＲは、ＨＡ２２由来のＣＡＲよりも優れた標的細胞致死活性を示すことが報告され、この知見は、そのＣＡＲによって標的化されたＣＤ２２エピトープの重要性に起因する（Ｈａｓｏら（２０１３）１１６８頁、最後のパラグラフ全体）。ＣＤ２２の膜近位ドメインの標的化は、高度に活性な抗ＣＤ２２ ＣＡＲを開発する際の「鍵となるエレメント」であると結論づけられる（考察の最後のパラグラフ）。この知見に反して、本明細書中の図１１に示されるデータは、ＣＤ２２のＩｇドメイン３におけるエピトープを標的化するＣＤ２２ＡＬＡｂ（ｍ９７１によって標的化されるＩｇドメイン５～７エピトープと比べて「膜遠位」エピトープ）が、ｍ９７１に基づく抗ＣＤ２２ ＣＡＲよりも優れた標的細胞致死能を有することを実証している。
実施例４－種々のエンドドメインの組み合わせを有するＯＲゲート構築物の調査

４つのＯＲゲート構築物を図１３に示されているように開発した。それらのすべてが、同一の抗原結合ドメイン、スペーサードメインおよび膜貫通ドメインを有するＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートをコードした：構築物間の唯一の差異は、エンドドメインにあり、それらは、以下の表に示されているとおりであった：

各ＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートを発現している細胞がインビトロでＲａｊｉ細胞を殺す能力を、上に記載されたようにアッセイした。様々なＯＲゲートの組み合わせを発現している形質導入されたＰＢＭＣを、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋Ｒａｊｉ標的細胞とともに、１：１と１：１０との両方のエフェクター：標的細胞比で７２時間共培養した。

結果を図１４に示す。４つすべてのＯＲゲートが、ｆｍｃ６３およびＭ９７１ ＣＡＲよりも有意に良好に標的細胞を殺すと見出された。１：１０エフェクター：標的細胞比を用いたとき、一方のＣＡＲに４－１ＢＢゼータ／ＯＸ４０ゼータを有し、他方のＣＡＲにＣＤ２８ゼータを有する、「分割」エンドドメインＯＲゲートが、最善の致死活性を有したことが示された。

上記の明細書で挙げた出版物は全て、参照により本明細書に援用する。本発明の記載された方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と共に記載したが、請求されている本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、分子生物学、細胞生物学または関連分野における専門家にとって明白な、本発明を実施するために記載された方法の様々な修飾も以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。

Claims (9)

1. 第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを細胞表面に共発現する細胞であって、各ＣＡＲが、細胞内シグナル伝達ドメインを含み、該第１のＣＡＲの該細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激ドメインを含むが、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含まず、該第２のＣＡＲの該細胞内シグナル伝達ドメインがＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含むが、共刺激ドメインを含まず、該共刺激ドメインがＣＤ２８共刺激ドメインであり、該ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインがＯＸ－４０または４－１ＢＢエンドドメインであり、該第１および第２のＣＡＲが異なる抗原結合ドメインを有し、ここで、該第１および第２のＣＡＲの該細胞内シグナル伝達ドメインが、ＩＴＡＭ含有ドメインも含み、該ＩＴＡＭ含有ドメインがＣＤ３ゼータドメインであり、該抗原結合ドメインが１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）または単一ドメイン抗体を含む、細胞。
2. 前記第１のＣＡＲが、以下の構造：
   ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ
   （ここで、
   ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインであり；
   スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーであり；
   ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲの膜貫通ドメインであり；
   ｃｏｓｔｉｍは、共刺激ドメインであり；
   ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）
   を有し、
   前記第２のＣＡＲが、以下の構造：
   ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ
   （ここで、
   ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインであり；
   スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーであり；
   ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインであり；
   ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体のエンドドメインであり；
   ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）
   を有する、請求項１に記載の細胞。
3. 請求項１～２のいずれか一項に定義される通りの第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の両方をコードする核酸。
4. 以下の構造：
   ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ２
   （ここで、
   ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸であり；
   スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸であり
   ；
   ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸であり；
   ｃｏｓｔｉｍは、共刺激ドメインをコードする核酸であり；
   ＩＴＡＭ１は、前記第１のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸であり；
   ｃｏｅｘｐｒは、両方のＣＡＲの共発現を可能にする核酸であり、
   ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸であり；
   スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸であり；
   ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸であり；
   ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体のエンドドメインをコードする核酸であり；
   ＩＴＡＭ２は、前記第２のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸である）
   を有し、その核酸は、細胞において発現されたとき、前記第１および第２のＣＡＲが細胞表面に共発現されるように、切断位置で切断されるポリペプチドをコードする、
   請求項３に記載の核酸。
5. （ｉ）請求項１～２のいずれか一項に定義される通りの第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸であって、該核酸は、以下の構造：
   ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ１
   （ここで、
   ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸であり；
   スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸であり；
   ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸であり；
   ｃｏｓｔｉｍは、共刺激ドメインをコードする核酸であり；
   ＩＴＡＭ１は、前記第１のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸である）
   を有する、第１の核酸、および
   （ｉｉ）請求項１～２のいずれか一項に定義される通りの第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸であって、該核酸は、以下の構造：
   ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ２
   （ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸であり；
   スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸であり；
   ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸であり；
   ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体のエンドドメインをコードする核酸であり；
   ＩＴＡＭ２は、前記第２のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸である）
   を有する、第２の核酸
   を含む、請求項１～２のいずれかに記載の細胞を作製するためのキット。
6. 請求項３または４に記載の核酸を含む、ベクター。
7. 請求項１～２のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、請求項３または４に記載の核酸；請求項５に定義される通りの第１の核酸および第２の核酸；または請求項６に記載のベクターを生体外で細胞に導入する工程を含む、方法。
8. 請求項１～２のいずれかに記載の複数の細胞を含む、医薬組成物。
9. 疾患の処置および／または予防における使用のための請求項８に記載の医薬組成物。

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