RS64977B1

RS64977B1 - Nova anti-pd-l1 antitela

Info

Publication number: RS64977B1
Application number: RS20231228A
Authority: RS
Inventors: Yong Zheng; Jing Li; Zhisheng Chen
Original assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd; Wuxi Biologics Ireland Ltd
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2016-08-05
Publication date: 2024-01-31
Also published as: RU2018107658A; BR112018002428A2; FIC20250002I1; HUS2500002I1; IL256803B2; EP3332006A4; NL301311I2; WO2017020291A1; FI3332006T3; KR20180037222A; JP2022115897A; EP3332006A1; CA2993272A1; LT3332006T; US10981995B2; RU2018107658A3; AU2016301718A1; MX389090B; KR102914402B1; DK3332006T3

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetna objava se generalno odnosi na nova anti-PD-L1 antitela.

POZADINA

[0002] Sve veći broj dokaza iz pretkliničkih i kliničkih rezultata pokazao je da ciljno delovanje na imunske kontrolne tačke postaje pristup koji najviše obećava u lečenju pacijenata sa kancerima. Programirana ćelijska smrt 1, jedan od proteina imunske kontrolne tačke, igra značajnu ulogu u ograničavanju aktivnosti T ćelija koje obezbeđuju glavni mehanizam imunske otpornosti pomoću kog tumorske ćelije izbegavaju imunski nadzor. Interakcija PD-1 koji se eksprimira na aktiviranim T ćelijama, i PD-L1 koji se eksprimira na tumorskim ćelijama negativno reguliše imunski odgovor i odbacuje antitumorski imunitet. Ekspresija PD-L1 na tumorima je u korelaciji sa redukovanim preživljavanjem kod kancera jednjaka, pankreasa i drugih tipova kancera, ističući ovaj put kao novi obećavajući cilj za imunoterapiju tumora. Farmaceutske kompanije, kao što su Bristol-Myers Squibb (BMS), Merck, Roche i GlaxoSmithKline (GSK), razvile su više agenasa koji ciljno deluju na PD-1 put. Podaci iz kliničkih ispitivanja demonstrirali su rane dokaze trajne kliničke aktivnosti i ohrabrujući bezbednosni profil kod pacijenata sa različitim tipovima tumora. Nivolumab, PD-1 lek koji je razvio BMS, stavlja se u središte oblasti sledeće generacije. Sada u 6 studija kasne faze, lečenje je podstaklo skupljanje tumora u tri od 5 proučavanih grupa kancera, uključujući 18% od 72 pacijenta sa kancerom pluća, blizu trećine od 98 pacijenata sa melanomom i 27% od 33 pacijenta sa kancerom bubrega. Razvijen od strane kompanije Merck, lambrolizumab je potpuno humano monoklonalno IgG4 antitelo koje deluje prema PD-1, koje je dobilo FDA oznaku novi iskorak nakon što su stigli impresivni IB podaci za kancer kože. Rezultati studije faze IB pokazali su objektivan antitumorski odgovor kod 51% od 85 pacijenata sa kancerom, i potpun odgovor kod 9% pacijenata. Eksperimentalni MPDL3280A kompanije Roche demonstrirao je sposobnost skupljanja tumora kod 29 od 140 (21%) pacijenata sa uznapredovalim kancerom sa različitim veličinama tumora. WO2007005874 A2 između ostalog objavljuje izolovana monoklonalna antitela, posebno humana monoklonalna antitela koja se specifično vezuju za PD-L1. Objava takođe obezbeđuje postupke za detektovanje PD-L1, kao i postupke za lečenje različitih bolesti, uključujući kancer i infektivne bolesti, upotrebom anti-PD-L1 antitela.

[0003] Međutim, sve postojeće terapije možda neće biti zadovoljavajuće i prema tome su i dalje potrebna nova anti-PD-L1 antitela.

KRATAK SAŽETAK PRONALASKA

[0004] Predmetna objava obezbeđuje nova monoklonalna anti-PD-L1 antitela (posebno potpuno humana antitela), polinukleotide koji ih kodiraju, i postupke za njihovu upotrebu. Pozivanja na postupke lečenja u paragrafima 21-23, 25, 156 i 160-161 ovog opisa treba tumačiti kao pozivanja na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i medikamente iz predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela pomoću terapije (ili za dijagnozu). Obim pronalaska je definisan patentnim zahtevima koji su priloženi.

[0005] U jednom aspektu, predmetna objava obezbeđuje izolovana monoklonalna antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente, koji su sposobni da se specifično vezuju za humani PD-L1 pri Kd vrednosti ne većoj od 10<-9>M (npr. ne većoj od ≤9X10<-10>M, ≤8X10<-10>M, ≤7X10<-10>M, ≤6X10<-10>M, ≤5X10<-10>M, ≤4X10<-10>M, ≤3X10<-10>M, ≤2X10<-10>M, ili ≤10<-10>M) kao što je izmereno pomoću testa vezivanja tehnikom rezonance plazmona.

[0006] U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti vezuju se za PD-L1 majmuna pri EC50 ne većoj od 10 nM (npr. ne većoj od 1 nM, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,6 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,2 nM, 0,1 nM, 0,09 nM, 0,08 nM, 0,07 nM, 0,06 nM, 0,05 nM, 0,04 nM, 0,03 nM, 0,02 nM, ili 0,01 nM. U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti se ne vezuju za PD-L1 miša, ali se vezuju za PD-L1 majmuna sa afinitetom vezivanja koji je sličan onom kod humanog PD-L1. U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti snažno inhibiraju vezivanje humanog PD-L1 ili PD-L1 majmuna za njegov receptor (npr. PD-1), pri IC50 ne većoj od 100 nM (npr. ne većoj od 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,6 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,2 nM, ili 0,1 nM). U određenim primerima izvođenja, EC50 ili IC50 su izmerene pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS).

[0007] U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti imaju značajno redukovanu efektorsku funkciju. U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti ne posreduju u ADCC ili CDC ili oba.

[0008] Antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni sadrže:

a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 SEQ ID NO: 13, CDR2 SEQ ID NO: 15, i CDR3 SEQ ID NO: 17; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 SEQ ID NO: 19, CDR2 SEQ ID NO: 21, i CDR3 SEQ ID NO: 23;

b) ili

c) varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 SEQ ID NO: 37, CDR2 SEQ ID NO: 39, i CDR3 SEQ ID NO: 41 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 SEQ ID NO: 19, CDR2 SEQ ID NO: 21, i CDR3 SEQ ID NO: 23. Tako specificirana antitela specifično se vezuju za PD-L1.

[0009] U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni sadrže:

a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 47; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 49;

b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 55; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 49.

[0010] U određenim primerima izvođenja, antitela koja su ovde obezbeđena uključuju, na primer, 1.14.4 i 1.46.11.

[0011] U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni u kompeticiji su za isti epitop sa antitelima 1.4.1, 1.14.4, 1.20.15, i 1.46.11. U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni vezuju se za epitop koji sadrži najmanje jedan od sledećih aminokiselinskih ostataka PD-L1: E58, E60, D61, K62, N63 i R113.

[0012] U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti sposobni su da blokiraju vezivanje humanog PD-L1 za njegov receptor i na taj način obezbeđuju najmanje jednu od sledećih aktivnosti:

a) indukovanje proizvodnje IL-2 u CD4+ T ćelijama;

b) indukovanje proizvodnje IFNγ u CD4+ T ćelijama;

c) indukovanje proliferacije CD4+ T ćelija i

g) preokretanje supresivne funkcije T reg.

[0013] U određenim primerima izvođenja, antitela koja su ovde obezbeđena su monoklonalno antitelo, potpuno humano antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, rekombinantno antitelo, bispecifično antitelo, obeleženo antitelo, bivalentno antitelo, ili anti-idiotipsko antitelo.

[0014] U određenim primerima izvođenja, njegovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni su kamelizovano jednodomensko antitelo, dijatelo, scFv, scFv dimer, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv fragment, Fab, Fab', F(ab')2, ds dijatelo, nanotelo, domen antitelo, ili bivalentno domen antitelo.

[0015] U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni, dodatno sadrže konstantni region imunoglobulina.

[0016] U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni, dodatno sadrže konjugat.

[0017] U određenim primerima izvođenja, konjugat može biti detektabilni obeleživač, funkcionalna grupa koja modifikuje farmakokinetiku, ili funkcionalna grupa za prečišćavanje.

[0018] U sledećem aspektu, predmetna objava obezbeđuje izolovane polinukleotide koji kodiraju antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente koji su ovde obezbeđeni. U određenim primerima izvođenja, obezbeđeni su polinukleotidi koji kodiraju amino-kiselinske sekvence antitela ili antigen-vezujućih fragmenata koji su ovde objavljeni. U određenim drugim primerima izvođenja, obezbeđeni su vektori koji sadrže ove polinukleotide, i u određenim drugim primerima izvođenja obezbeđene su ćelije domaćini koje sadrže ove vektore. U određenim primerima izvođenja, obezbeđeni su postupci za ekspresiju jednog ili više antitela ili antigen-vezujućih fragmenata koji su ovde objavljeni kultivisanjem ovih ćelija domaćina pod uslovima u kojima se antitela ili antigen-vezujući fragmenti kodirani polinukleotidima eksprimiraju iz vektora. U određenim primerima izvođenja, polinukleotidi koji su ovde obezbeđeni operativno su povezani sa promotorom kao što je SV40 promotor u vektoru. U određenim primerima izvođenja, ćelije domaćini koje sadrže vektore koji su ovde obezbeđeni su ćelije jajnika kineskog hrčka, ili 293F ćelije.

[0019] U sledećem aspektu, predmetna objava obezbeđuje komplete koji sadrže antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.

[0020] U sledećem aspektu, PD-L1 antitela koja su ovde obezbeđena, kao što su 1.14.4 i 1.46.11, imaju dobru podnošljivost i visoku in vivo antitumorsku aktivnost kod životinje. U određenim primerima izvođenja, životinja koja ima tumorske ćelije kojoj se primenjuju PD-L1 antitela koja su ovde obezbeđena ima redukciju zapremine tumora za najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% u poređenju sa kontrolnom životinjom koja ima sličnu početnu vrednost zapremine tumora, ali joj je primenjen samo vehikulum.

[0021] U sledećem aspektu, predmetna objava obezbeđuje postupke detektovanja prisustva ili nivoa PD-L1 (npr. humani ili majmuna) u biološkom uzorku, koji sadrže izlaganje biološkog uzorka antitelu ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu koji je ovde obezbeđen, i određivanje prisustva ili nivoa PD-L1 u uzorku.

[0022] U sledećem aspektu, predmetna objava obezbeđuje postupke identifikovanja pojedinca koji ima poremećaj ili stanje koje će verovatno reagovati na antagonist PD-L1, koji sadrže: određivanje prisustva ili nivoa PD-L1 (npr. humani ili majmuna) u test biološkom uzorku iz pojedinca sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom koji je ovde obezbeđen, pri čemu prisustvo ili povećan nivo PD-L1 u test biološkom uzorku ukazuje na verovatnoću reagovanja. U određenim primerima izvođenja, postupci dodatno sadrže primenu efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji je ovde obezbeđen pojedincu za koga je određeno da ima poremećaj ili stanje koje će verovatno reagovati na antagonist PD-L1.

[0023] Predmetna objava dodatno obezbeđuje postupke praćenja terapijskog odgovora ili progresije bolesti kod subjekta koji je lečen sa antagonistom PD-L1, koji sadrže određivanje prisustva ili nivoa PD-L1 (npr. humani ili majmuna) u test biološkom uzorku iz pojedinca sa anti-PD-L1 antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom koji je ovde obezbeđen.

[0024] U sledećem aspektu, predmetna objava obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji je ovde obezbeđen i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. U određenim od ovih primera izvođenja, farmaceutski nosači mogu biti, na primer, razblaživači, antioksidansi, adjuvansi, ekscipijensi, ili netoksične pomoćne supstance.

[0025] U sledećem aspektu, predmetna objava obezbeđuje postupke lečenja stanja kod subjekta koje bi imalo koristi od povećanog imunskog odgovora, koji sadrže primenu subjektu efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji je ovde obezbeđen. U određenim primerima izvođenja, subjekt ima povećanu ekspresiju PD-L1.

[0026] Upotreba antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji je ovde obezbeđen u proizvodnji medikamenta za lečenje stanja koje bi imalo koristi od povećanog imunskog odgovora. U određenim primerima izvođenja, stanje je kancer ili hronična virusna infekcija.

KRATAK OPIS SLIKA

[0027]

Slika 1 predstavlja vezivanje potpuno humanih PD-L1 antitela za PD-1 eksprimirajuću CHO ćeliju kao što je izmereno pomoću FACS analize.

Slika 2 predstavlja potpuno humana PD-L1 antitela koja su blokirala vezivanje PD-1 za PD-L1 transfektovane CHO ćelije kao što je izmereno pomoću FACS analize.

Slika 3 pokazuje da su se potpuno humana PD-L1 antitela specifično vezala za PD-L1, ali se nisu vezala za PD-L2, kao što je izmereno pomoću FACS analize.

Slika 4 pokazuje da su se potpuno humana PD-L1 antitela vezala za humani PD-L1 i PD-L1 cinomolgus majmuna.

Slika 5 je puna kinetika afiniteta vezivanja PD-L1 antitela za humani PD-L1 u opsegu od 2,26E-10 do 4,78E-10 mol/l kao što je određeno pomoću rezonance površinskih plazmona.

Slika 6 ilustruje efekat potpuno humanih anti-PD-L1 antitela na proizvodnju IFNγ u specifičnom odgovoru T ćelija.

Slika 7 pokazuje da su potpuno humana anti-PD-L1 antitela poboljšala specifičnu proliferaciju T ćelija.

Slika 8 pokazuje da su potpuno humana PD-L1 antitela poboljšala proizvodnju IFNγ u mešovitoj limfocitnoj reakciji (MLR).

Slika 9 ilustruje efekat potpuno humanih anti-PD-L1 antitela na proizvodnju IL-2 u MLR.

Slika 10 pokazuje da anti-PD-L1 antitela promovišu proliferaciju T ćelija u MLR.

Slika 11 pokazuje da su anti-PD-L1 antitela preokrenula supresivnu funkciju T reg.

Slika 12 pokazuje da anti-PD-L1 antitelima nedostaje ADCC na aktiviranim T ćelijama.

Slika 13 pokazuje da anti-PD-L1 antitelima nedostaje CDC na aktiviranim T ćelijama.

Slike 14A i 14B pokazuju unakrsnu reaktivnost anti-PD-L1 antitela sa humanim/mišjim PD-1. 2 μg/ml 1.14.4 antitela obloženo je na ploču sa 96 bunarića preko noći i inkubirano sa (Slika 14A) hPD-L1-His proteinom i (Slika 14B) mPD-L1-His proteinom, zatim je dodato HRP-anti-His antitelo radi detekcije.

Slika 15 pokazuje hot spot ostatke mapirane na hPD-L1 strukturi. Mesto vezivanja antitela 1.14.4. Podaci su iz tabele 3. Boje na slikama treba da pomognu u izdvajanju razlika između epitopa.

Slika 16 pokazuje dobru in vivo podnošljivost hPD-L1 antitela 1.14.4. Tri doze antitela 1.14.4 (3 mg/kg, 10 mg/kg i 30 mg/kg) primenjene su putem višestrukih intraperitonealnih injekcija humanizovanom B-hPD-1 mišu. Tokom eksperimenta nije uočena značajna promena telesne težine.

Slika 17 pokazuje značajnu in vivo inhibiciju hPD-L1 antitela 1.14.4 na rast tumorskih ćelija. Posle 19 dana primene antitela, sve tri doze antitela 1.14.4 (3 mg/kg, 10 mg/kg i 30 mg/kg) pokazale su značajne antitumorske efekte na koje ukazuje inhibicija rasta tumora (TGI) od >40%.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0028] Sledeći opis objave je samo namenjen da ilustruje različite primere izvođenja objave. Kao takve, specifične modifikacije o kojima se raspravlja ne treba tumačiti kao ograničenja obima objave.

Definicije

[0029] Termin "antitelo" kao što se ovde upotrebljava uključuje bilo koji imunoglobulin, monoklonalno antitelo, poliklonalno antitelo, multispecifično antitelo, ili bispecifično (bivalentno) antitelo koje se vezuje za specifični antigen. Nativno intaktno antitelo sadrži dva teška lanca i dva laka lanca. Svaki teški lanac sastoji se od varijabilnog regiona i prvog, drugog, i trećeg konstantnog regiona, dok se svaki laki lanac sastoji od varijabilnog regiona i konstantnog regiona. Teški lanci sisara su klasifikovani kao α, δ, ε, γ, i μ, i laki lanci sisara su klasifikovani kao λ ili κ. Antitelo ima "Y" oblik, sa stablom Y koje se sastoji od drugog i trećeg konstantnog regiona dva teška lanca povezana putem disulfidnog vezivanja. Svaki krak Y uključuje varijabilni region i prvi konstantni region jednog teškog lanca vezan za varijabilni i konstantni region jednog lakog lanca. Varijabilni regioni lakih i teških lanaca su odgovorni za vezivanje antigena. Varijabilni regioni u oba lanca generalno sadrže tri visoko varijabilne petlje koje se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR) (CDR lakog (L) lanca koji uključuju LCDR1, LCDR2, i LCDR3, CDR teškog (H) lanca koji uključuju HCDR1, HCDR2, HCDR3). CDR ograničenja za antitela i antigen-vezujuće fragmente koji su ovde objavljeni mogu biti definisana ili identifikovana konvencijama Kabat, Chothia, ili Al-Lazikani (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C. i Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989); Kabat E.A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Tri CDR su smeštena između omeđevajućih delova koji su poznati kao regioni okvira (FR), koji su više konzervirani od CDR i formiraju skelu za podržavanje hipervarijabilnih petlji. Konstantni regioni teških i lakih lanaca nisu uključeni u vezivanje antigena, ali pokazuju različite efektorske funkcije. Antitela se dodeljuju klasama na osnovu amino-kiselinske sekvence konstantnog regiona njihovog teškog lanca. Pet glavnih klasa ili izotipova antitela su IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, koje karakteriše prisustvo α, δ, ε, γ, i μ teških lanaca, respektivno. Nekoliko glavnih klasa antitela podeljeno je na podklase kao što su IgG1 (γ1 teški lanac), IgG2 (γ2 teški lanac), IgG3 (γ3 teški lanac), IgG4 (γ4 teški lanac), IgA1 (α1 teški lanac), ili IgA2 (α2 teški lanac).

[0030] Termin "antigen-vezujući fragment" kao što se ovde upotrebljava označava fragment antitela koji je formiran od dela antitela koji sadrži jedan ili više CDR, ili bilo koji drugi fragment antitela koji se vezuje za antigen ali ne sadrži strukturu intaktnog nativnog antitela. Primeri antigen-vezujućih fragmenata uključuju, bez ograničenja, dijatelo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv fragment, disulfidom stabilizovan Fv fragment (dsFv), a (dsFv)2, bispecifičan dsFv (dsFvdsFv'), disulfidom stabilizovano dijatelo (ds dijatelo), molekul jednolančanog antitela (scFv), scFv dimer (bivalentno dijatelo), multispecifično antitelo, kamelizovano jednodomensko antitelo, nanotelo, domen antitelo, i bivalentno domen antitelo. Antigen-vezujući fragment je sposoban da se vezuje za isti antigen za koji se vezuje roditeljsko antitelo. U određenim primerima izvođenja, antigen-vezujući fragment može da sadrži jedan ili više CDR iz određenog humanog antitela graftovane na region okvira iz jednog ili više različitih humanih antitela.

[0031] "Fab" u odnosu na antitelo označava onaj deo antitela koji se sastoji od jednog lakog lanca (i varijabilni i konstantni region) vezanog za varijabilni region i prvi konstantni region jednog teškog lanca disulfidnom vezom.

[0032] "Fabꞌ" označava Fab fragment koji uključuje deo regiona zgloba.

[0033] "F(abꞌ)2" označava dimer Fabꞌ.

[0034] "Fc" u odnosu na antitelo označava onaj deo antitela koji se sastoji od drugog i trećeg konstantnog regiona prvog teškog lanca koji je vezan za drugi i treći konstantni region drugog teškog lanca putem disulfidnog vezivanja. Fc deo antitela je odgovoran za različite efektorske funkcije kao što su ADCC, i CDC, ali ne funkcioniše u vezivanju antigena.

[0035] "Fv" u odnosu na antitelo označava najmanji fragment antitela koji nosi kompletno antigen-vezujuće mesto. Fv fragment se sastoji od varijabilnog regiona jednog lakog lanca koji je vezan za varijabilni region jednog teškog lanca.

[0036] "Jednolančano Fv antitelo" ili "scFv" označava projektovano antitelo koje se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca i varijabilnog regiona teškog lanca koji su međusobno povezani direktno ili putem sekvence peptidnog linkera (Huston JS et al. Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879(1988)).

[0037] "Jednolančano Fv-Fc antitelo" ili "scFv-Fc" označava projektovano antitelo koje se sastoji od scFv koje je povezano sa Fc regionom antitela.

[0038] "Kamelizovano jednodomensko antitelo", "antitelo teškog lanca", ili "HCAb" označava antitelo koje sadrži dva VHdomena i nema lakih lanaca (Riechmann L. i Muyldermans S., J Immunol Methods. Dec 10;231(1-2):25-38 (1999); Muyldermans S., J Biotechnol. Jun;74(4):277-302 (2001); WO94/04678; WO94/25591; US6005079 A. Antitela teškog lanca su prvobitno izvedena iz Camelidae (kamile, dromedari, i lame). Iako su lišena lakih lanaca, kamelizovana antitela imaju autentičan antigen-vezujući repertoar (Hamers-Casterman C. et al., Nature. Jun 3;363(6428):446-8 (1993); Nguyen VK. et al. "Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation," Immunogenetics. Apr;54(1):39-47 (2002); Nguyen VK. et al. Immunology. May;109(1):93-101 (2003)). Varijabilni domen antitela teškog lanca (VHH domen) predstavlja najmanju poznatu antigen-vezujuću jedinicu koja je generisana adaptivnim imunskim odgovorima (Koch-Nolte F. et al., FASEB J. Nov;21(13):3490-8. Epub 2007 Jun 15 (2007)).

1

[0039] "Nanotelo" označava fragment antitela koji se sastoji od VHH domena iz teškog lanca antitela i dva konstantna domena, CH2 i CH3.

[0040] "Dijatela" uključuju male fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, pri čemu fragmenti sadrže VHdomen koji je povezan sa VLdomenom u istom polipeptidnom lancu (VH-VLili VH-VL) (videti, npr. Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci USA. Jul 15;90(14):6444-8 (1993); EP404097; WO93/11161). Upotrebom linkera koji je prekratak da bi omogućio sparivanje između dva domena u istom lancu, domeni su primorani da se spare sa komplementarnim domenima drugog lanca, čime se stvaraju dva antigen-vezujuća mesta. Antigen-vezujuća mesta mogu da ciljaju iste ili različite antigene (ili epitope).

[0041] "Domen antitelo" označava fragment antitela koji sadrži samo varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. U određenim slučajevima, dva ili više VHdomena su kovalentno spojeni sa peptidnim linkerom kako bi se stvorilo bivalentno ili multivalentno domen antitelo. Dva VHdomena bivalentnog domen antitela mogu da ciljaju iste ili različite antigene.

[0042] U određenim primerima izvođenja, "(dsFv)2" sadrži tri peptidna lanca: dve VHfunkcionalne grupe povezane peptidnim linkerom i vezane disulfidnim mostovima za dve VLfunkcionalne grupe.

[0043] U određenim primerima izvođenja, "bispecifično ds dijatelo" sadrži VH1-VL2(povezan peptidnim linkerom) vezan za VL1-VH2(takođe povezan peptidnim linkerom) putem disulfidnog mosta između VH1i VL1.

[0044] U određenim primerima izvođenja, "bispecifični dsFv" ili "dsFv-dsFv'" sadrži tri peptidna lanca: VH1-VH2funkcionalnu grupu gde su teški lanci povezani peptidnim linkerom (npr. dugim fleksibilnim linkerom) i vezani za VL1i VL2funkcionalne grupe, respektivno, putem disulfidnih mostova, pri čemu svaki disulfidom spareni teški i laki lanac ima različitu antigensku specifičnost.

[0045] U određenim primerima izvođenja, "scFv dimer" je bivalentno dijatelo ili bivalentni ScFv (BsFv) koji sadrži VH-VL(povezan peptidnim linkerom) koji je dimerizovan sa drugom VH-VLfunkcionalnom grupom tako da Vn jedne funkcionalne gupe koordinišu sa VLdruge funkcionalne grupe i formiraju dva vezujuća mesta koja mogu da ciljaju iste antigene (ili epitope) ili različite antigene (ili epitope). U drugim primerima izvođenja, "scFv dimer" je bispecifično dijatelo koje sadrži VH1-VL2(povezan peptidnim linkerom) koji je povezan sa VL1-VH2(takođe povezan peptidnim linkerom) tako da VH1i VL1koordinišu i VH2i VL2koordinišu i svaki koordinisani par ima drugačiju antigensku specifičnost.

[0046] Termin "potpuno humano" kao što se ovde upotrebljava, sa pozivanjem na antitelo ili antigen-vezujući fragment, znači da antitelo ili antigen-vezujući fragment ima ili se sastoji od jedne ili više amino-kiselinskih sekvenci koje odgovaraju onoj u antitelu proizvedenom u čoveku ili od strane humane imunske ćelije, ili poreklom iz ne-humanog izvora kao što je transgena ne-humana životinja koja koristi repertoare humanih antitela ili druge sekvence koje kodiraju humana antitela. U određenim primerima izvođenja, potpuno humano antitelo ne sadrži amino-kiselinske ostatke (posebno antigen-vezujuće ostatke) koji su poreklom iz nehumanog antitela.

[0047] Termin "humanizovano" kao što se ovde upotrebljava, sa pozivanjem na antitelo ili antigen-vezujući fragment, znači da antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži CDR poreklom od ne-humanih životinja, FR regione poreklom od ljudi, i kada je primenljivo, konstantne regione poreklom od ljudi. Humanizovano antitelo ili antigen-vezujući fragment je koristan kao humani terapeutik u određenim primerima izvođenja pošto ima redukovanu imunogenost kod ljudi. U nekim primerima izvođenja, ne-humana životinja je sisar, na primer, miš, pacov, zec, koza, ovca, zamorac, ili hrčak. U nekim primerima izvođenja, humanizovano antitelo ili antigen-vezujući fragment se sastoji od suštinski svih humanih sekvenci osim CDR sekvenci koje su ne-humane. U nekim primerima izvođenja, FR regioni poreklom od ljudi mogu sadržati istu amino-kiselinsku sekvencu kao i humano antitelo iz kog su poreklom, ili mogu sadržati neke amino-kiselinske promene, na primer, ne više od 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ili 1 promene amino-kiselina. U nekim primerima izvođenja, takva promena amino-kiseline može biti prisutna samo u FR regionima teškog lanca, samo u FR regionima lakog lanca, ili u oba lanca. U nekim poželjnim primerima izvođenja, humanizovana antitela sadrže humani FR1-3 i humani JH i Jκ.

[0048] Termin "himerno", kao što se ovde upotrebljava, znači antitelo ili antigen-vezujući fragment, koji ima deo teškog i/ili lakog lanca koji je poreklom od jedne vrste, i ostatak teškog i/ili lakog lanca je poreklom od druge vrste. U ilustrativnom primeru, himerno antitelo može da sadrži konstantni region poreklom od čoveka i varijabilni region od ne-humane vrste, kao što je miš.

[0049] "PD-L1" kao što se ovde upotrebljava označava ligand programirane ćelijske smrti 1 (PD-L1, videti, na primer, Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027). Reprezentativna amino-kiselinska sekvenca humanog PD-L1 je objavljena pod NCBI pristupnim brojem: NP_054862.1, i reprezentativna sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani PD-L1 je pokazana pod NCBI pristupnim brojem: NM_014143.3. PD-L1 se eksprimira u placenti, slezini, limfnim čvorovima, timusu, srcu, fetalnoj jetri, i takođe se nalazi na mnogim ćelijama tumora ili kancera. PD-L1 se vezuje za svoj receptor PD-1 ili B7-1, koji se eksprimira na aktiviranim T ćelijama, B ćelijama i mijeloidnim ćelijama. Vezivanje PD-L1 i njegovog receptora indukuje transdukciju signala kako bi se suprimirala TCR-posredovana aktivacija proizvodnje citokina i proliferacija T ćelija. U skladu sa tim, PD-L1 igra značajnu ulogu u supresiji imunskog sistema tokom određenih događaja kao što su trudnoća, autoimunske bolesti, alografti tkiva, i veruje se da omogućava ćelijama tumora ili kancera da zaobiđu imunološku kontrolnu tačku i izbegnu imunski odgovor.

[0050] "Anti-PD-L1 antitelo" kao što se ovde upotrebljava označava antitelo koje je sposobno da se specifično vezuje za PD-L1 (npr. humani ili PD-L1 majmuna) sa afinitetom koji je dovoljan da obezbedi dijagnostičku i/ili terapijsku upotrebu.

[0051] Termin "specifično vezivanje" ili "specifično vezuje" kao što se ovde upotrebljava označava nenasumične reakcije vezivanja između dva molekula, kao što je na primer između antitela i antigena. U određenim primerima izvođenja, antitela ili antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni specifično vezuju humani i/ili PD-L1 majmuna sa afinitetom vezivanja (KD) od ≤10<-6>M (npr. ≤5X10<-7>M, ≤2X10<-7>M, ≤10<-7>M, ≤5X10<-8>M, ≤2X10<-8>M, ≤10<-8>M, ≤5X10<-9>M, ≤2X10<-9>M, ≤10<-9>M, oko 10<-10>M, 10<-10>M do 10<-9>M, 10<-10>M do 10<-8,5>M, ili 10<-10>M do 10<-8>M). KDkao što se ovde upotrebljava označava odnos stope disocijacije i stope asocijacije (koff/kon), može se odrediti upotrebom postupaka rezonance površinskih plazmona, na primer upotrebom instrumenta kao što je Biacore.

[0052] Sposobnost da "blokira vezivanje" ili "bude u kompeticiji za isti epitop" kao što se ovde upotrebljava označava sposobnost antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta da inhibira interakciju vezivanja između dva molekula (npr. humani PD-L1 i anti-PD-L1 antitelo) do bilo kog detektabilnog stepena. U određenim primerima izvođenja, antitelo ili antigen-vezujući fragment koji blokira vezivanje između dva molekula inhibira interakciju vezivanja između dva molekula za najmanje 50%. U određenim primerima izvođenja, ova inhibicija može biti veća od 60%, veća od 70%, veća od 80%, ili veća od 90%.

[0053] Termin "epitop" kao što se ovde upotrebljava označava specifičnu grupu atoma ili amino-kiselina na antigenu za koji se antitelo vezuje. Dva antitela mogu da vezuju isti epitop unutar antigena ukoliko pokazuju kompetitivno vezivanje za antigen. Na primer, ukoliko antitelo ili antigen-vezujući fragment kao što je ovde objavljeno blokira vezivanje primernih antitela kao što su 1.14.4 ili 1.46.11 za humani PD-L1, onda se može smatrati da antitelo ili antigen-vezujući fragment vezuju isti epitop kao ta primerna antitela.

[0054] Određeni amino-kiselinski ostatak unutar epitopa može biti mutiran, npr. alaninskenirajućom mutagenezom, i identifikuju se mutacije koje redukuju ili sprečavaju vezivanje

1

proteina. "Alanin-skenirajuća mutageneza" je postupak koji se može izvesti za identifikaciju određenih ostataka ili regiona proteina koji utiču na interakciju epitopa sa drugim jedinjenjem ili proteinom koji se za njega vezuje. Ostatak ili grupa ciljnih ostataka unutar proteina je zamenjen neutralnom ili negativno naelektrisanom amino-kiselinom (najpoželjnije alanin ili polialanin, ili konzervativna amino-kiselinska supstitucija). Bilo koja mutacija aminokiselinskih ostataka ili kodona koji kodiraju iste koja redukuje vezivanje proteina više od praga ili redukuje vezivanje proteina do maksimalnog stepena u odnosu na druge mutacije, verovatno će biti unutar epitopa vezanog od strane proteina. U određenim primerima izvođenja predmetne objave, epitop koji je kritičan za PD-L1 antitelo sadrži najmanje jedan od amino-kiselinskih ostataka E58, E60, D61, K62, N63 i R113.

[0055] "1.4.1" kao što se ovde upotrebljava označava potpuno humano monoklonalno antitelo koje ima varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 43, varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 45, i humani konstantni region IgG4 izotipa.

[0056] "1.14.4" kao što se ovde upotrebljava označava potpuno humano monoklonalno antitelo koje ima varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 47, varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 49, i humani konstantni region IgG4 izotipa.

[0057] "1.20.15" kao što se ovde upotrebljava označava potpuno humano monoklonalno antitelo koje ima varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 51, varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 53, i humani konstantni region IgG4 izotipa.

[0058] "1.46.11" kao što se ovde upotrebljava označava potpuno humano monoklonalno antitelo koje ima varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 55, varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 49, i humani konstantni region IgG4 izotipa.

[0059] "Konzervativna supstitucija" sa pozivanjem na amino-kiselinsku sekvencu označava zamenu amino-kiselinskog ostatka drugim amino-kiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac sa sličnim fizičkohemijskim svojstvima. Na primer, mogu se napraviti konzervativne supstitucije između amino-kiselinskih ostataka sa hidrofobnim bočnim lancima (npr. Met, Ala, Val, Leu, i Ile), između ostataka sa neutralnim hidrofilnim bočnim lancima (npr. Cys, Ser, Thr, Asn i Gln), između ostataka sa kiselim bočnim lancima (npr. Asp, Glu), između amino-kiselina sa baznim bočnim lancima (npr. His, Lys, i Arg), ili između ostataka sa aromatičnim bočnim lancima (npr. Trp, Tyr, i Phe). Kao što je poznato u struci, konzervativna supstitucija obično ne uzrokuje značajnu promenu u konformacionoj strukturi proteina, i prema tome može zadržati biološku aktivnost proteina.

[0060] "Procenat (%) identičnosti sekvence" u odnosu na amino-kiselinsku sekvencu (ili sekvencu nukleinske kiseline) definisan je kao procenat ostataka amino-kiselina (ili nukleinske kiseline) u sekvenci kandidatu koji su identični ostacima amino-kiselina (ili nukleinske kiseline) u referentnoj sekvenci, posle poravnanja sekvenci i, ukoliko je potrebno, introdukovanja praznina, kako bi se postigao maksimalan broj identičnih amino-kiselina (ili nukleinskih kiselina). Konzervativna supstitucija amino-kiselinskih ostataka se može ili ne mora smatrati identičnim ostacima. Poravnanje u svrhu određivanja procenta identičnosti sekvence amino-kiselina (ili nukleinskih kiselina) može se postići, na primer, upotrebom javno dostupnih alata kao što su BLASTN, BLASTp (dostupno na veb stranici Američkog nacionalnog centra za informacije o biotehnologiji (NCBI), videti takođe, Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)), ClustalW2 (dostupno na veb stranici Evropskog instituta za bioinformatiku, videti takođe, Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. et al, Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007)), i ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Oni sa iskustvom u struci mogu da upotrebljavaju podrazumevane parametre koje obezbeđuje alat, ili mogu parametre da prilagode kao što je prikladno za poravnanje, kao što je na primer, pomoću odabira odgovarajućeg algoritma.

[0061] "T ćelija" kao što se ovde upotrebljava uključuje CD4<+>T ćelije, CD8<+>T ćelije, T pomoćničke T ćelije tipa 1, T pomoćničke T ćelije tipa 2, T pomoćničke T ćelije tipa 17 i inhibitorne T ćelije.

[0062] "Efektorske funkcije" kao što se ovde upotrebljava označavaju biološke aktivnosti koje se mogu pripisati vezivanju Fc regiona antitela za njegove efektore kao što su C1 kompleks i Fc receptor. Primeri efektorskih funkcija uključuju: citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) koja je indukovana interakcijom antitela i C1q na C1 kompleksu; ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) koja je indukovana vezivanjem Fc regiona antitela za Fc receptor na efektorskoj ćeliji; i fagocitozu.

[0063] "Kancer" ili "kancerozno stanje" kao što se ovde upotrebljava označava bilo koje medicinsko stanje koje je posredovano rastom neoplastičnih ili malignih ćelija, proliferacijom, ili metastazom, i uključuje i čvrste kancere i nečvrste kancere kao što je leukemija. "Tumor" kao što se ovde upotrebljava označava čvrstu masu neoplastičnih i/ili malignih ćelija.

[0064] "Lečiti" ili "lečenje" stanja kao što se ovde upotrebljava uključuje preveniranje ili ublažavanje stanja, usporavanje početka ili stope razvoja stanja, redukovanje rizika od razvoja stanja, preveniranje ili odlaganje razvoja simptoma koji su povezani sa stanjem, redukovanje ili okončanje simptoma koji su povezani sa stanjem, generisanje potpune ili delimične regresije stanja, izlečenje stanja, ili neku njihovu kombinaciju. U odnosu na kancer, "lečiti" ili

1

"lečenje" može označavati inhibiciju ili usporavanje rasta neoplastičnih ili malignih ćelija, proliferacije, ili metastaze, preveniranje ili odlaganje razvoja rasta neoplastičnih ili malignih ćelija, proliferacije, ili metastaze, ili neku njihovu kombinaciju. U odnosu na tumor, "lečiti" ili "lečenje" uključuje eliminisanje celog ili dela tumora, inhibiciju ili usporavanje rasta tumora i metastaze, preveniranje ili odlaganje razvoja tumora, ili neku njihovu kombinaciju.

[0065] "Izolovana" supstanca je izmenjena rukom čoveka iz prirodnog stanja. Ukoliko se "izolovana" kompozicija ili supstanca javlja u prirodi, ona je promenjena ili uklonjena iz svog prvobitnog okruženja, ili oba. Na primer, polinukleotid ili polipeptid koji je prirodno prisutan u živoj životinji nije "izolovan", ali je isti polinukleotid ili polipeptid "izolovan" ukoliko je dovoljno odvojen od koegzistirajućih materijala u svom prirodnom stanju tako da postoji u suštinski čistom stanju. U određenim primerima izvođenja, antitela i antigen-vezujući fragmenti imaju čistoću od najmanje 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% kao što je određeno pomoću elektroforetskih postupaka (kao što je SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje, kapilarna elektroforeza), ili hromatografskih postupaka (kao što je jonoizmenjivačka hromatografija ili HPLC na reverznim fazama).

[0066] Termin "vektor" kao što se ovde upotrebljava označava vehikulum u koji polinukleotid koji kodira protein može biti operativno insertovan tako da dovede do ekspresije tog proteina. Vektor se može upotrebljavati za transformaciju, transdukciju, ili transfekciju ćelije domaćina tako da dovede do ekspresije genetičkog elementa koji nosi u ćeliji domaćinu. Primeri vektora uključuju plazmide, fagemide, kozmide, veštačke hromozome kao što su veštački hromozom kvasca (YAC), veštački hromozom bakterija (BAC), ili veštački hromozom poreklom iz P1 (PAC), bakteriofage kao što su lambda fag i M13 fag, i životinjske viruse. Kategorije životinjskih virusa koji se upotrebljavaju kao vektori uključuju retrovirus (uključujući lentivirus), adenovirus, adeno-povezan virus, herpesvirus (npr. herpes simpleks virus), poksvirus, bakulovirus, papilomavirus, i papovavirus (npr. SV40). Vektor može da sadrži različite elemente za kontrolu ekspresije, uključujući sekvence promotora, sekvence inicijacije transkripcije, sekvence pojačivača, elemente koji se mogu selektovati, i reporterske gene. Pored toga, vektor može da uključuje oridžin replikacije. Vektor takođe može da sadrži materijale koji pomažu u njegovom ulasku u ćeliju, uključujući, ali ne ograničavajući se na virusnu česticu, lipozom, ili proteinsku oblogu.

[0067] Fraza "ćelija domaćin" kao što se ovde upotrebljava označava ćeliju u koju se egzogeni polinukleotid i/ili vektor introdukuje.

1

[0068] "Bolest koja je povezana sa ili je srodna sa PD-L1" kao što se ovde upotrebljava označava bilo koje stanje koje je uzrokovano, pogoršano, ili na drugi način povezano sa povećanom ili smanjenom ekspresijom ili aktivnostima PD-L1 (npr. humani PD-L1).

[0069] Termin "terapijski efikasna količina" ili "efikasna doza" kao što se ovde upotrebljava označava dozu ili koncentraciju leka koja je efikasna za lečenje bolesti ili stanja koja su povezana sa humanim PD-L1. Na primer, u odnosu na upotrebu antitela ili antigen-vezujućih fragmenata koji su ovde objavljeni za lečenje kancera, terapijski efikasna količina je doza ili koncentracija antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta sposobna da eliminiše ceo ili deo tumora, inhibira ili usporava rast tumora, inhibira rast ili proliferaciju ćelija koje posreduju u kanceroznom stanju, inhibira metastazu tumorskih ćelija, ublažava bilo koji simptom ili marker koji je povezan sa tumorom ili kanceroznim stanjem, prevenira ili odlaže razvoj tumora ili kanceroznog stanja, ili neka njihova kombinacija.

[0070] Termin "farmaceutski prihvatljiv" ukazuje da je naznačeni nosač, vehikulum, razblaživač, ekscipijens(i), i/ili so generalno hemijski i/ili fizički kompatibilan sa drugim sastojcima koji čine formulaciju, i fiziološki kompatibilan sa njihovim primaocem.

Anti-PD-L1 antitelo

[0071] U jednom aspektu, predmetna objava obezbeđuje anti-PD-L1 antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente. PD-1, takođe znan kao CD279, poznat je kao ključni receptor imunske kontrolne tačke koji se eksprimira od strane aktiviranih T ćelija, koji posreduje u imunosupresiji. PD-1 ligand 1 (PD-L1) je transmembranski protein od 40 kDa koji se eksprimira na različitim tumorskim ćelijama, stromalnim ćelijama ili oba, i vezuje se za PD-1. Inhibicija interakcije između PD-1 i PD-L1 može poboljšati T-ćelijske odgovore i stoga posreduje u anti-kancerskoj aktivnosti.

[0072] Predmetna objava obezbeđuje primere potpuno humanih monoklonalnih antitela 1.4.1, 1.14.4, 1.20.15, i 1.46.11, čije su CDR sekvence pokazane u Tabeli 1 u nastavku, i sekvence varijabilnog regiona teškog ili lakog lanca takođe su pokazane u nastavku.

1

�

[0073] 1.4.1-VH(30511): (SEQ ID NO: 43 za amino-kiselinu i SEQ ID NO: 44 za nukleinsku kiselinu) sa CDR 1-3 teškog lanca: SEQ ID NO: 1, 3, 5 su amino-kiselinske sekvence i SEQ ID NO: 2, 4, 6 su sekvence nukleinske kiseline, respektivno:

V segment: IGHV4-39*01

D segment: IGHD1-26*01

J segment: IGHJ4*02

2

[0074] 1.4.1-VL(30027): (SEQ ID NO: 45 za amino-kiselinu i SEQ ID NO: 46 za nukleinsku kiselinu) sa CDR 1-3 lakog lanca: SEQ ID NO: 7, 9, 11 su amino-kiselinske sekvence i SEQ ID NO: 8, 10, 12 su sekvence nukleinske kiseline, respektivno:

V segment: IGLV3-1*01

J segment: IGLJ2*01

[0075] 1.14.4-VH(29812): (SEQ ID NO: 47 za amino-kiselinu i SEQ ID NO: 48 za nukleinsku kiselinu) sa CDR 1-3 teškog lanca: SEQ ID NO: 13, 15, 17 su amino-kiselinske sekvence i SEQ ID NO: 14, 16, 18 su sekvence nukleinske kiseline, respektivno:

V segment: IGHV3-23*01

D segment: IGHD5-5*01

J segment: IGHJ4*02

[0076] 1.14.4-VL i 1.46.11-VL (29841): (SEQ ID NO: 49 za amino-kiselinu i SEQ ID NO: 50 za nukleinsku kiselinu) sa CDR 1-3 lakog lanca: SEQ ID NO: 19, 21, 23 su aminokiselinske sekvence i SEQ ID NO: 20, 22, 24 su sekvence nukleinske kiseline, respektivno:

V segment: IGLV3-21*02

J segment: IGLJ2*01

2

[0077] 1.20.15-VH(30712): (SEQ ID NO: 51 za amino-kiselinu i SEQ ID NO: 52 za nukleinsku kiselinu) sa CDR 1-3 teškog lanca: SEQ ID NO: 25, 27, 29 su amino-kiselinske sekvence i SEQ ID NO: 26, 28, 30 su sekvence nukleinske kiseline, respektivno:

V segment: IGHV4-39*01

D segment: neodređeno

J segment: IGHJ4*02

[0078] 1.20.15-VL(29907): (SEQ ID NO: 53 za amino-kiselinu i SEQ ID NO: 54 za nukleinsku kiselinu) sa CDR 1-3 lakog lanca: SEQ ID NO: 31, 33, 35 su amino-kiselinske sekvence i SEQ ID NO: 32, 34, 36 su sekvence nukleinske kiseline, respektivno:

V segment: IGLV3-1*01

J segment: IGLJ2*01

2

[0079] 1.46.11-VH(30626): (SEQ ID NO: 55 za amino-kiselinu i SEQ ID NO: 56 za nukleinsku kiselinu) sa CDR 1-3 teškog lanca: SEQ ID NO: 37, 39, 41 su amino-kiselinske sekvence i SEQ ID NO: 38, 40, 42 su sekvence nukleinske kiseline, respektivno:

V segment: IGHV3-23*01

D segment: IGHD5-5*01

J segment: IGHJ4*02

2

[0080] 1.46.11-VL(29841): (SEQ ID NO: 49 za amino-kiselinu i SEQ ID NO: 50 za nukleinsku kiselinu) sa CDR 1-3 lakog lanca: SEQ ID NO: 19, 21, 23 su amino-kiselinske sekvence i SEQ ID NO: 20, 22, 24 su sekvence nukleinske kiseline, respektivno:

V segment: IGLV3-21*02

J segment: IGLJ2*01

2

[0081] Anti-PD-L1 antitela i antigen-vezujući fragmenti iz pronalaska sadrže: a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 SEQ ID NO: 13, CDR2 SEQ ID NO: 15, i CDR3 SEQ ID NO: 17; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 SEQ ID NO: 19, CDR2 SEQ ID NO: 21, i CDR3 SEQ ID NO: 23 ili b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, i/ili SEQ ID NO: 41 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, i/ili SEQ ID NO: 23.

[0082] Stručnjak sa iskustvom će razumeti da CDR sekvence koje su obezbeđene u Tabeli 1 mogu biti modifikovane tako da sadrže jednu ili više supstitucija amino-kiselina, kako bi se obezbedila poboljšana biološka aktivnost kao što je poboljšan afinitet vezivanja za humani PD-L1. Na primer, biblioteka varijanti antitela (kao što su Fab ili scFv varijante) može da se generiše i eksprimira tehnologijom prikazivanja faga, i zatim pregleda na afinitet vezivanja za humani PD-L1. Kao sledeći primer, može se upotrebljavati računarski softver za virtuelnu simulaciju vezivanja antitela za humani PD-L1 i identifikaciju amino-kiselinskih ostataka na antitelima koja formiraju interfejs za vezivanje. Takvi ostaci mogu biti ili izbegnuti u supstituciji kako bi se sprečila redukcija afiniteta vezivanja, ili ciljani za supstituciju kako bi se obezbedilo jače vezivanje. U određenim primerima izvođenja, najmanje jedna (ili sve) supstitucija(e) u CDR sekvencama je konzervativna supstitucija.

[0083] U određenim primerima izvođenja, anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti su potpuno humani. Potpuno humana antitela nemaju problem imunogenosti kod ljudi i/ili smanjenog afiniteta vezivanja kao što se često uočava kod humanizovanih antitela.

[0084] U nekim primerima izvođenja, potpuno humana anti-PD-L1 antitela i njihovi antigenvezujući fragmenti sadrže: a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 47; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 49 ili b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 55; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 49.

[0085] Ovde se takođe razmatraju antitela i antigen-vezujući fragmenti koji su u kompeticiji za isti epitop sa anti-PD-L1 antitelima i njihovim antigen-vezujućim fragmentima koji su ovde obezbeđeni. Antitela blokiraju vezivanje 1.14.4 ili 1.46.11 za humani ili PD-L1 majmuna, na primer, pri IC50vrednosti (tj. koncentracija 50% inhibicije) ispod 10<-6>M, ispod 10<-7>M, ispod 10<-7,5>M, ispod 10<-8>M, ispod 10<-8,5>M, ispod 10<-9>M, ili ispod 10<-10>M. IC50vrednosti se određuju na osnovu testa kompeticije kao što su ELISA testovi, testovi kompetitivnog vezivanja radioliganda, i FACS analiza.

[0086] U nekim primerima izvođenja, anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni sposobni su da se specifično vezuju za humani PD-L1 sa

2

afinitetom vezivanja (Kd) od ≤10<-6>M (npr. ≤5X10<-7>M, ≤2X10<-7>M, ≤10<-7>M, ≤5X10<-8>M, ≤2X10<-8>M, ≤10<-8>M, ≤5X10<-9>M, ≤2X10<-9>M, ≤10<-9>M, oko 10<-10>M, 10<-10>M do 10<-8,5>M, ili 10<-10>M do 10<-8>M) kao što je izmereno pomoću testa vezivanja tehnikom rezonance plazmona. Afinitet vezivanja može biti predstavljen KDvrednošću, koja se izračunava kao odnos stope disocijacije i stope asocijacije (koff/kon) kada vezivanje između antigena i antigenvezujućeg molekula dostigne ravnotežu. Afinitet vezivanja antigena (npr. KD) može se na odgovarajući način odrediti upotrebom pogodnih postupaka koji su poznati u struci, uključujući, na primer, test vezivanja tehnikom rezonance plazmona upotrebom instrumenata kao što je Biacore (videti, na primer, Murphy, M. et al, Current protocols in protein science, Poglavlje 19, jedinica 19.14, 2006).

[0087] U određenim primerima izvođenja, antitela i njihovi fragmenti koji su ovde obezbeđeni vezuju se za humani PD-L1 sa EC50(tj. koncentracija 50% vezivanja) od 0,1 nM-100 nM (npr. 0,1 nM-50 nM, 0,1 nM-30 nM, 0,1 nM-20 nM, 0,1 nM-10 nM, ili 0,1n M-1 nM). Vezivanje antitela za humani PD-L1 može se izmeriti pomoću postupaka koji su poznati u struci, na primer, sendvič testom kao što su ELISA, Western Blot, FACS ili drugi test vezivanja. Kao ilustrativan primer, test antitelu (tj. prvo antitelo) je omogućeno da se veže za imobilizovani humani PD-L1 ili ćelije koje eksprimiraju humani PD-L1, posle ispiranja nevezanog antitela, introdukuje se obeleženo sekundarno antitelo koje se može vezati i stoga omogućiti detekciju vezanog prvog antitela. Detekcija se može obaviti čitačem mikroploče kada se upotrebljava imobilizovani PD-L1, ili upotrebom FACS analize kada se upotrebljavaju ćelije koje eksprimiraju humani PD-L1. U određenim primerima izvođenja, antitela i njihovi fragmenti koji su ovde obezbeđeni vezuju se za humani PD-L1 sa EC50(tj.

50% efikasne koncentracije) od 1 nM do 10 nM, ili 1 nM do 5 nM kao što je izmereno pomoću FACS analize.

[0088] U određenim primerima izvođenja, antitela i njihovi fragmenti koji su ovde obezbeđeni inhibiraju vezivanje humanog PD-L1 za njegov receptor pri IC50od 0,2nM-100 nM (npr.0,2 nM-50 nM, 0,2 nM-30 nM, 0,2 nM-20 nM, 0,2 nM -10 nM ili 1nM-10nM), kao što je izmereno u testu kompeticije.

[0089] U određenim primerima izvođenja, antitela i njihovi fragmenti koji su ovde obezbeđeni blokiraju vezivanje humanog PD-L1 za njegov receptor i na taj način obezbeđuju biološku aktivnost uključujući, na primer, indukovanje proizvodnje citokina iz aktiviranih T ćelija (kao što su CD4+ T ćelije i CD8+ T ćelije), indukovanje proliferacije aktiviranih T ćelija (kao što su CD4+ T ćelije i CD8+ T ćelije), i preokretanje supresivne funkcije T reg. Primeri citokina uključuju IL-2 i IFNγ. Termin "IL-2" označava interleukin 2, tip signalnog

2

molekula citokina u imunskom sistemu koji reguliše aktivnosti belih krvnih zrnaca (npr. leukocita). Termin "interferon gama (IFNγ)" je citokin koji proizvode prirodne ubice (NK), NK T ćelije, CD4+ i CD8+T ćelije, koji je kritičan aktivator makrofaga i inducer ekspresije molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). Proizvodnja citokina može se odrediti upotrebom postupaka koji su poznati u struci, na primer, pomoću ELISA. Postupci se takođe mogu upotrebljavati za detekciju proliferacije T ćelija, uključujući test inkorporacije [<3>H] timidina.

[0090] Anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti su specifični za humani PD-L1. U određenim primerima izvođenja, antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti ne vezuju se za PD-L2 (npr. humani PD-L2). Na primer, afinitet vezivanja sa PD-L2 je manji od 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili 1% od onog sa humanim PD-L1.

[0091] U određenim primerima izvođenja, antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti vezuju se za PD-L1 majmuna pri EC50 ne većoj od 100 nM, na primer, ne većoj od ili oko 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,6 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,2 nM, 0,1 nM, 0,09 nM, 0,08 nM, 0,07 nM, 0,06 nM, 0,05 nM, 0,04 nM, 0,03 nM, 0,02 nM, ili 0,01 nM, kao što je izmereno pomoću ELISA. U određenim primerima izvođenja, antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti vezuju se za PD-L1 majmuna pri EC50 od oko 1 nM - 10 nM.

[0092] U određenim primerima izvođenja, antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti ne vezuju se za PD-L1 miša, ali se vezuju za PD-L1 majmuna sa afinitetom vezivanja sličnim onom kod humanog PD-L1. Na primer, vezivanje primera antitela 1.4.1, 1.14.4, 1.20.15, i 1.46.11 za PD-L1 miša se ne može detektovati u konvencionalnim testovima vezivanja kao što su ELISA, ili FACS analiza, dok je vezivanje ovih antitela za PD-L1 majmuna na sličnom afinitetu ili EC50 vrednosti kao kod humanog PD-L1 kao što je izmereno pomoću ELISA ili FACS.

[0093] U nekim primerima izvođenja, anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti imaju redukovanu ili osiromašenu efektorsku funkciju. U nekim primerima izvođenja, anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti imaju konstantni region IgG4 izotipa, koji ima redukovanu ili osiromašenu efektorsku funkciju. Efektorske funkcije kao što su ADCC i CDC mogu dovesti do citotoksičnosti kod ćelija koje eksprimiraju PD-L1. Mnoge ćelije uključujući normalne ćelije mogu da eksprimiraju PD-L1. Kako bi se izbegla potencijalna neželjena toksičnost za te normalne ćelije, određeni primeri izvođenja antitela i antigen-vezujućih fragmenata koji su ovde obezbeđeni mogu imati redukovane ili čak osiromašene efektorske funkcije. Poznato je da različiti testovi procenjuju ADCC ili CDC aktivnosti, na primer, test vezivanja Fc receptora, test vezivanja C1q, i test lize ćelija, i ljudi od struke mogu lako da ih odaberu. Bez želje da se vezujemo za teoriju, ali veruje se da antitela sa redukovanim ili osiromašenim efektorskim funkcijama kao što su ADCC ili CDC ne bi uzrokovala nikakvu ili bi uzrokovala minimalnu citotoksičnost za PD-L1-eksprimirajuće ćelije, na primer one normalne ćelije, i prema tome ih poštedela od neželjenih sporednih efekata, dok bi u međuvremenu, tumorske ćelije koje eksprimiraju PD-L1 bile vezane od strane anti-PD-L1 antitela i prema tome ne bi mogle da pobegnu od imunske kontrolne tačke i dakle imunski sistem ih može prepoznati i eliminisati.

[0094] U određenim primerima izvođenja, anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni imaju redukovane sporedne efekte. Na primer, antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni mogu imati u potpunosti humanu IgG sekvencu i prema tome redukovanu imunogenost od one humanizovanog antitela. Kao sledeći primer, antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni mogu biti u IgG4 formatu kako bi se eliminisali ADCC i CDC.

[0095] U određenim primerima izvođenja, anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni imaju prednost u tome što se mogu upotrebljavati u kombinaciji sa imunogenim agensima, kao što su tumorske ćelije, prečišćeni tumorski antigen, i ćelije koje su transfektovane genima koji kodiraju imunostimulirajuće citokine, tumorske vakcine. Pored toga, anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu biti uključeni u kombinovane terapije, uključujući standardne hemio- i radio-terapije, terapije malim molekulima zasnovane na ciljnim molekulima, nove terapije modulatora drugih imunskih kontrolnih tačaka. U određenim primerima izvođenja, antitela i njihovi antigenvezujući fragmenti mogu se upotrebljavati kao baza za antitelo-lek konjugate, bispecifična ili multivalentna antitela.

[0096] Anti-PD-L1 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni mogu biti monoklonalno antitelo, poliklonalno antitelo, potpuno humano antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, rekombinantno antitelo, bispecifično antitelo, obeleženo antitelo, bivalentno antitelo, ili anti-idiotipsko antitelo. Rekombinantno antitelo je antitelo pripremljeno in vitro upotrebom rekombinantnih postupaka pre nego u životinjama. Bispecifično ili bivalentno antitelo je veštačko antitelo koje ima fragmente dva različita monoklonalna antitela i može da vezuje dva različita antigena. Antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji je "bivalentan" sadrži dva antigen-vezujuća mesta. Dva antigenvezujuća mesta mogu se vezivati za isti antigen, ili se svako može vezivati za drugačiji antigen, u kom slučaju se antitelo ili antigen-vezujući fragment karakteriše kao "bispecifičan".

1

[0097] U nekim primerima izvođenja, anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su ovde obezbeđeni su potpuno humana antitela. U određenim primerima izvođenja, potpuno humana antitela se pripremaju upotrebom rekombinantnih postupaka. Na primer, transgena životinja kao što je miš može biti napravljena da nosi transgene ili transhromozome gena humanog imunoglobulina, i prema tome sposobna je da proizvodi potpuno humana antitela posle imunizacije sa odgovarajućim antigenom kao što je humani PD-L1. Potpuno humana antitela mogu biti izolovana iz takve transgene životinje, ili alternativno, mogu se napraviti tehnologijom hibridoma fuzionisanjem ćelija slezine transgene životinje sa imortalizovanom ćelijskom linijom kako bi se generisale ćelije hibridoma koje sekretuju potpuno humana antitela. Primeri transgenih životinja uključuju, bez ograničenja, OmniRat, čija je endogena ekspresija gena imunoglobulina pacova inaktivirana i istovremeno projektovana tako da sadrži funkcionalne rekombinantne lokuse humanog imunoglobulina; OmniMouse, čija je endogena ekspresija gena mišjeg imunoglobulina inaktivirana i istovremeno projektovana tako da sadrži rekombinantne lokuse humanog imunoglobulina koji imaju deleciju J-lokusa i mutaciju C-kapa; OmniFlic, koji je transgeni pacov čija je endogena ekspresija gena imunoglobulina pacova inaktivirana i istovremno projektovan tako da sadrži rekombinantne lokuse humanog imunoglobulina koji imaju jedan zajednički, preuređeni VkJk laki lanac i funkcionalni teški lanac. Detaljnije informacije mogu se dodatno pronaći na: Osborn M. et al, Journal of Immunology, 2013, 190: 1481-90; Ma B. et al, Journal of Immunological Methods 400 - 401 (2013) 78-86; Geurts A. et al, Science, 2009, 325:433; US8907157 B2; EP patent 2152880B1; EP patent 2336329B1. Druge pogodne transgene životinje se takođe mogu upotrebljavati, na primer, HuMab miševi (videti, za detalje, Lonberg, N. et al. Nature 368(6474): 856859 (1994)), Xeno-Mouse (Mendez et al. Nat Genet. 1997, 15:146-156), TransChromo Mouse (Ishida et al. Cloning Stem Cells, 2002, 4:91-102) i VelocImmune Mouse (Murphy et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111:5153-5158), Kymouse (Lee et al. Nat Biotechnol, 2014, 32:356-363), i transgeni zec (Flisikowska et al. PLoS One, 2011, 6:e21045).

[0098] U nekim primerima izvođenja, anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti su kamelizovano jednodomensko antitelo, dijatelo, scFv, scFv dimer, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv- dsFv', Fv fragment, Fab, Fab', F(ab')2, ds dijatelo, nanotelo, domen antitelo, ili bivalentno domen antitelo.

[0099] U nekim primerima izvođenja, anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti dodatno sarže konstantni region imunoglobulina. U nekim primerima izvođenja, konstantni region imunoglobulina sadrži konstantni region teškog lanca i/ili lakog lanca.

2

Konstantni region teškog lanca sadrži CH1, CH1-CH2, ili CH1-CH3 regione. U nekim primerima izvođenja, konstantni region može dodatno da sadrži jednu ili više modifikacija za davanje poželjnih svojstava. Na primer, konstantni region može biti modifikovan tako da redukuje ili osiromaši jednu ili više efektorskih funkcija, da poboljša vezivanje FcRn receptora, ili da introdukuje jedan ili više ostataka cisteina.

[0100] U nekim primerima izvođenja, anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti dodatno sadrže konjugat. Razmatra se da različiti konjugati mogu biti povezani sa antitelima ili antigen-vezujućim fragmentima koji su ovde obezbeđeni (videti, na primer, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York, (1989)). Ovi konjugati mogu biti povezani sa antitelima ili antigen-vezujućim fragmentima kovalentnim vezivanjem, afinitetnim vezivanjem, interkalacijom, koordinatnim vezivanjem, kompleksiranjem, asocijacijom, mešanjem, ili dodavanjem, između ostalih postupaka. U određenim primerima izvođenja, antitela i antigen-vezujući fragmenti koji su ovde objavljeni mogu biti projektovani tako da sadrže specifična mesta izvan vezujućeg dela epitopa koja se mogu koristiti za vezivanje sa jednim ili više konjugata. Na primer, takvo mesto može uključivati jedan ili više reaktivnih amino-kiselinskih ostataka, kao što su na primer ostaci cisteina ili histidina, kako bi se olakšalo kovalentno povezivanje sa konjugatom. U određenim primerima izvođenja, antitela mogu biti povezana sa konjugatom indirektno, ili preko drugog konjugata. Na primer, antitelo ili antigen-vezujući fragmenti mogu biti konjugovani sa biotinom, a zatim indirektno konjugovani sa drugim konjugatom koji je konjugovan sa avidinom. Konjugat može biti detektabilni obeleživač, funkcionalna grupa koja modifikuje farmakokinetiku, funkcionalna grupa za prečišćavanje, ili citotoksična funkcionalna grupa. Primeri detektabilnih obeleživača mogu uključivati fluorescentne obeleživače (npr. fluorescein, rodamin, dansil, fikoeritrin, ili Texas red), enzim-supstrat obeleživače (npr. peroksidaza rena, alkalna fosfataza, luceriferaze, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze ili β-D-galaktozidaza), radioizotope (npr.<123>I,<124>I,<125>I,<131>I,<35>S,<3>H,<111>In,<112>In,<14>C,<64>Cu,<67>Cu,<86>Y,<88>Y,<90>Y,<171>Lu,<211>At,<186>Re,<188>Re,<153>Sm,<212>Bi, i<32>P, drugi lantanidi, luminescentni obeleživači), hromofornu funkcionalnu grupu, digoksigenin, biotin/avidin, molekul DNK ili zlato za detekciju. U određenim primerima izvođenja, konjugat može biti funkcionalna grupa koja modifikuje farmakokinetiku kao što je PEG koji pomaže da se produži poluživot antitela. Drugi pogodni polimeri uključuju, kao što su karboksimetilceluloza, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, kopolimeri etilen glikola/propilen glikola, i slično. U određenim primerima izvođenja, konjugat može biti funkcionalna grupa za prečišćavanje kao što je magnetna perla. "Citotoksična funkcionalna grupa" može biti bilo koji agens koji je štetan za ćelije ili koji može oštetiti ili ubiti ćelije. Primeri citotoksične funkcionalne grupe uključuju, bez ograničenja, taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, puromicin i njegove analoge, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilujuće agense (npr. mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin platinu (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr. daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr. daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC)), i antimitotičke agense (npr. vinkristin i vinblastin).

Polinukleotidi i rekombinantni postupci

[0101] Predmetna objava obezbeđuje izolovane polinukleotide koji kodiraju anti-PD-L1 antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente.

[0102] Izolovani polinukleotidi mogu kodirati varijabilni region teškog lanca i sadržati sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 48 i SEQ ID NO: 56. Takođe su objavljene njihove homologne sekvence koje imaju najmanje 80% (npr. najmanje 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) identičnosti sekvence. U nekim primerima izvođenja, izolovani polinukleotidi kodiraju varijabilni region lakog lanca i sadrže sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 50. Takođe su objavljene njihove homologne sekvence koje imaju najmanje 80% (npr. najmanje 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) identičnosti sekvence. U određenim primerima izvođenja, procentualna identičnost je posledica degeneracije genetičkog koda, dok kodirana proteinska sekvenca ostaje nepromenjena.

[0103] Izolovani polinukleotid koji kodira anti-PD-L1 antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente (npr. uključujući sekvence u Tabeli 1) može da se insertuje u vektor za dodatno kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju, upotrebom rekombinantnih tehnika koje su poznate u struci. U sledećem primeru izvođenja, antitelo se može proizvesti homolognom rekombinacijom koja je poznata u struci. DNK koja kodira monoklonalno antitelo se lako izoluje i sekvencira upotrebom konvencionalnih procedura (npr. upotrebom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance

4

antitela). Mnogi vektori su dostupni. Komponente vektora generalno uključuju, ali nisu ograničene na, jedno ili više od sledećeg: signalnu sekvencu, oridžin replikacije, jedan ili više gena markera, element pojačivač, promotor (npr. SV40, CMV, EF-1α), i sekvencu terminacije transkripcije.

[0104] U nekim primerima izvođenja, vektorski sistem uključuje sisteme sisara, bakterija, kvasaca, itd. i sadrži plazmide kao što su, ali ne ograničavajući se na, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TVL, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2.2 itd. i druge laboratorijski i komercijalno dostupne vektore. Pogodni vektori mogu uključivati, plazmid, ili virusne vektore (npr. retroviruse sa defektnom replikacijom, adenoviruse i adeno-povezane viruse).

[0105] Vektori koji sadrže polinukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili antigen-vezujući fragment mogu se introdukovati u ćeliju domaćina radi kloniranja ili ekspresije gena. Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju DNK u vektorima ovde su ćelije prokariota, kvasaca, ili viših eukariota koje su prethodno opisane. Pogodni prokarioti za ovu svrhu uključuju eubakterije, kao što su Gram-negativni ili Gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae kao što je Escherichia, npr. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr. Salmonella typhimurium, Serratia, npr. Serratia marcescans, i Shigella, kao i Bacilli kao što su B. subtilis i B. licheniformis, Pseudomonas kao što je P. aeruginosa, i Streptomyces.

[0106] Pored prokariota, eukariotski mikrobi kao što su filamentozne gljivice ili kvasci su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju anti-PD-L1 antitelo. Saccharomyces cerevisiae, ili obični pekarski kvasac, najčešće se upotrebljava među nižim eukariotskim mikroorganizmima domaćinima. Međutim, izvestan broj drugih rodova, vrsta, i sojeva su uobičajeno dostupni i korisni ovde, kao što je Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces domaćini kao što su, npr. K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, i K. marxianus; yarowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces kao što je Schwanniomyces occidentalis; i filamentozne gljivice kao što su, npr. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, i Aspergillus domaćini kao što su A. nidulans i A. niger.

[0107] Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanih antitela ili antigen-fragmenta koji su ovde obezbeđeni izvedeni su iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni bakulovirusni sojevi i varijante i odgovarajuće permisivne insekatske ćelije domaćini iz domaćina kao što su Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegypti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (voćna mušica), i Bombyx mori. Različiti virusni sojevi za transfekciju su javno dostupni, npr. L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, i takvi virusi se mogu upotrebljavati kao virus ovde u skladu sa predmetnim pronalaskom, posebno za transfekciju Spodoptera frugiperda ćelija. Kulture biljnih ćelija pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza, i duvana takođe se mogu koristiti kao domaćini.

[0108] Međutim, interesovanje je najveće za ćelije kičmenjaka, i propagacija ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinska procedura. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humana embrionalna linija bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); Sertolijeve ćelije miša (TM4, Mather, Biol. Reprod.

23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije bubrega psa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bafalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane ćelije pluća (W 138, ATCC CCL 75); humane ćelije jetre (Hep G2, HB 8065); tumor dojke miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija humanog hepatoma (Hep G2). U nekim poželjnim primerima izvođenja, ćelija domaćin je 293F ćelija.

[0109] Ćelije domaćini su transformisane sa prethodno opisanim ekspresionim ili klonirajućim vektorima za proizvodnju anti-PD-L1 antitela i kultivisane u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovanim na odgovarajući način za indukciju promotora, selekciju transformanata, ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence.

[0110] Ćelije domaćini koje se upotrebljavaju za proizvodnju antitela ili antigen-vezujućih fragmenata koji su ovde obezbeđeni mogu se kultivisati u različitim medijumima. Komercijalno dostupni medijumi kao što su Hamov (Hamꞌs) F10 (Sigma), minimalni esencijalni medijum (MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), i Dulbekov (Dulbeccoꞌs) modifikovani Iglov (Eagleꞌs) medijum (DMEM) (Sigma) pogodni su za kultivisanje ćelija domaćina. Pored njih, bilo koji od medijuma koji su opisani u Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), US4767704 A; US4657866 A; US4927762 A; US4560655 A; ili US5122469 A; WO 90/03430; WO 87/00195; ili U.S. pat. re. 30,985 može se upotrebljavati kao medijum za kulturu ćelija domaćina. Bilo koji od ovih medijuma može se po potrebi suplementovati sa hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin, ili faktor rasta epiderma), solima (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum, i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je lek GENTAMYCIN<™>), elementima u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja koja su uobičajeno prisutna u krajnjim koncentracijama u mikromolarnom opsegu), i glukozom ili ekvivalentnim izvorom energije. Bilo koji drugi neophodni suplementi takođe mogu biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate onima sa iskustvom u struci. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH, i slično, su oni koji su prethodno upotrebljeni sa ćelijom domaćinom koja je odabrana za ekspresiju, i biće očigledni stručnjaku sa prosečnim iskustvom.

[0111] Kada se upotrebljavaju rekombinantne tehnike, antitelo se može proizvesti unutarćelijski, u periplazmatskom prostoru, ili se direktno sekretovati u medijum. Ukoliko se antitelo proizvodi unutarćelijski, kao prvi korak, čestični ostaci, bilo ćelija domaćina ili liziranih fragmenata, uklanjaju se, na primer, pomoću centrifugiranja ili ultrafiltracije. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) opisuju proceduru za izolovanje antitela koja se sekretuju u periplazmatski prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta se odmrzava u prisustvu natrijum acetata (pH 3,5), EDTA, i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 min. Ostaci ćelija mogu se ukloniti centrifugiranjem. Tamo gde se antitelo sekretuje u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se generalno prvo koncentruju upotrebom komercijalno dostupnog filtera za koncentrovanje proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltracione jedinice. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka za inhibiciju proteolize, i antibiotici mogu biti uključeni kako bi se sprečio rast slučajnih kontaminanata.

[0112] Antitelo koje je pripremljeno iz ćelija može se prečistiti upotrebom, na primer, hidroksilapatit hromatografije, gel elektroforeze, dijalize, DEAE-celulozne jonoizmenjivačke hromatografije, amonijum sulfat precipitacije, odsoljavanja, i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija poželjna tehnika prečišćavanja. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrste i izotipa bilo kog Fc domena imunoglobulina koji je prisutan u antitelu. Protein A se može upotrebljavati za prečišćavanje antitela koja su zasnovana na humanim .gama.1, .gama.2, ili .gama.4 teškim lancima (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Protein G se preporučuje za sve izotipove miša i za humane .gama.3 (Guss et al., EMBO J. 5:1567 1575 (1986)). Matriks za koji je prikačen afinitetni ligand najčešće je agaroza, ali su dostupni i drugi matriksi. Mehanički stabilni matriksi kao što su staklo sa kontrolisanim porama ili poli(stirendivinil)benzen omogućavaju brže stope protoka i kraće vreme obrade nego što se može postići sa agarozom. Tamo gde antitelo sadrži CH3 domen, korisna je Bakerbond ABX.TM. smola (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) za prečišćavanje. Druge tehnike za prečišćavanje proteina kao što su frakcionisanje na jonoizmenjivačkoj koloni, etanolna precipitacija, HPLC na reverznim fazama, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparin SEPHAROSE<™>hromatografiji na anjon- ili katjon-izmenjivačkoj smoli (kao što je kolona poliasparaginske kiseline), hromatofokusiranje, SDS-PAGE, i amonijum sulfat precipitacija su takođe dostupni u zavisnosti od antitela koje treba da se izdvoji.

[0113] Nakon bilo kog jednog ili više preliminarnih koraka prečišćavanja, smeša koja sadrži antitelo od interesa i kontaminante može biti podvrgnuta hromatografiji sa hidrofobnim interakcijama na niskoj pH upotrebom pufera za eluiranje na pH između oko 2,5-4,5, poželjno izvedene pri niskim koncentracijama soli (npr. od oko 0-0,25 M soli).

Kompleti

[0114] Predmetna objava obezbeđuje komplete koji sadrže anti-PD-L1 antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente. U nekim primerima izvođenja, kompleti su korisni za detektovanje prisustva ili nivoa PD-L1 u biološkom uzorku. Biološki uzorak može da sadrži ćeliju ili tkivo.

[0115] U nekim primerima izvođenja, komplet sadrži anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji je konjugovan sa detektabilnim obeleživačem. U nekim drugim primerima izvođenja, komplet sadrži neobeleženo anti-PD-L1 antitelo ili antigen-vezujući fragment, i dodatno sadrži sekundarno obeleženo antitelo koje je sposobno da se vezuje za neobeleženo anti-PD-L1 antitelo. Komplet može dodatno da sadrži uputstvo za upotrebu, i pakovanje koje odvaja svaku od komponenti u kompletu.

[0116] U određenim primerima izvođenja, anti-PD-L1 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment povezani su sa supstratom ili uređajem korisnim u sendvič testu kao što je ELISA, ili u imunografskom testu. Koristan supstrat ili uređaj mogu biti, na primer, mikrotitarska ploča i test traka.

Farmaceutska kompozicija i postupak lečenja

[0117] Predmetna objava dodatno obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-PD-L1 antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

[0118] Farmaceutski prihvatljivi nosači za upotrebu u farmaceutskim kompozicijama koje su ovde objavljene mogu uključivati, na primer, farmaceutski prihvatljive tečne, gel, ili čvrste nosače, vodene vehikulume, nevodene vehikulume, antimikrobne agense, izotonične agense, pufere, antioksidanse, anestetike, agense za suspendovanje/dispergovanje, agense za sekvestriranje ili heliranje, razblaživače, adjuvanse, ekscipijense, ili netoksične pomoćne supstance, druge komponente koje su poznate u struci, ili njihove različite kombinacije.

[0119] Pogodne komponente mogu uključivati, na primer, antioksidanse, filere, bajndere, dezintegrante, pufere, konzervanse, lubrikante, arome, zgušnjivače, agense za bojenje, emulgatore ili stabilizatore kao što su šećeri i ciklodekstrini. Pogodni antioksidansi mogu uključivati, na primer, metionin, askorbinsku kiselinu, EDTA, natrijum tiosulfat, platinu, katalazu, limunsku kiselinu, cistein, tioglicerol, tioglikolnu kiselinu, tiosorbitol, butilovani hidroksanizol, butilovani hidroksitoluen, i/ili propil galat. Kao što je ovde objavljeno, uključivanje jednog ili više antioksidanasa kao što je metionin u kompoziciju koja sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment i konjugate kao što je ovde obezbeđeno smanjuje oksidaciju antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta. Ova redukcija oksidacije sprečava ili redukuje gubitak afiniteta vezivanja, čime se poboljšava stabilnost antitela i maksimalizuje rok trajanja. Zbog toga su u određenim primerima izvođenja obezbeđene kompozicije koje sadrže jedno ili više antitela ili antigen-vezujućih fragmenata kao što je ovde objavljeno i jedan ili više antioksidanasa kao što je metionin. Dodatno su obezbeđeni postupci za sprečavanje oksidacije, produženje roka trajanja, i/ili poboljšanje efikasnosti antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde obezbeđeno mešanjem antitela ili antigenvezujućeg fragmenta sa jednim ili više antioksidanasa kao što je metionin.

[0120] Zarad dodatnog ilustrovanja, farmaceutski prihvatljivi nosači mogu uključivati, na primer, vodene vehikulume kao što su injekcija natrijum hlorida, Ringerova (Ringerꞌs) injekcija, injekcija izotonične dekstroze, injekcija sterilne vode, ili injekcija dekstroze i Ringerovog rastvora sa laktatom, nevodene vehikulume kao što su fiksna ulja biljnog porekla, pamukovo ulje, kukuruzno ulje, susamovo ulje, ili ulje kikirikija, antimikrobne agense u bakteriostatskim ili fungistatskim koncentracijama, izotonične agense kao što su natrijum hlorid ili dekstroza, pufere kao što su fosfatni ili citratni puferi, antioksidanse kao što su natrijum bisulfat, lokalne anestetike kao što je prokain hidrohlorid, agense za suspendovanje i dispergovanje kao što su natrijum karboksimetilceluoza, hidroksipropil metilceluloza, ili polivinilpirolidon, agense za emulgovanje kao što je polisorbat 80 (TWEEN-80), agense za sekvestriranje ili heliranje kao što su EDTA (etilendiamintetrasirćetna kiselina) ili EGTA (etilen glikol tetrasirćetna kiselina), etil alkohol, polietilen glikol, propilen glikol, natrijum hidroksid, hlorovodonična kiselina, limunska kiselina, ili mlečna kiselina. Antimikrobni agensi koji se koriste kao nosači mogu se dodati farmaceutskim kompozicijama u kontejnerima sa više doza i uključuju fenole ili krezole, merkurijale, benzil alkohol, hlorobutanol, estre metil i propil p-hidroksibenzoeve kiseline, timerosal, benzalkonijum hlorid i benzetonijum hlorid. Pogodni ekscipijensi mogu uključivati, na primer, vodu, fiziološki rastvor, dekstrozu, glicerol, ili etanol. Pogodne netoksične pomoćne supstance mogu uključivati, na primer, agense za vlaženje ili emulgovanje, pH puferske agense, stabilizatore, pojačivače rastvorljivosti, ili agense kao što su natrijum acetat, sorbitan monolaurat, trietanolamin oleat, ili ciklodekstrin.

[0121] Farmaceutske kompozicije mogu biti tečni rastvor, suspenzija, emulzija, pilula, kapsula, tableta, formulacija sa produženim oslobađanjem, ili prašak. Oralne formulacije mogu uključivati standardne nosače farmaceutskog stepena čistoće kao što su manitol, laktoza, skrob, magnezijum stearat, polivinil pirolidon, natrijum saharin, celuloza, magnezijum karbonat, itd.

[0122] U primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije su formulisane u injektabilnu kompoziciju. Injektabilne farmaceutske kompozicije mogu se pripremiti u bilo kom konvencionalnom obliku, kao što je na primer tečni rastvor, suspenzija, emulzija, ili čvrsti oblici pogodni za dobijanje tečnog rastvora, suspenzije, ili emulzije. Preparati za injekcije mogu uključivati sterilne i/ili nepiretičke rastvore spremne za injekciju, sterilne suve rastvorljive proizvode, kao što su liofilizovani praškovi, spremni za kombinovanje sa rastvaračem neposredno pre upotrebe, uključujući hipodermične tablete, sterilne suspenzije spremne za injekciju, sterilne suve nerastvorljive proizvode spremne za kombinovanje sa vehikulumom neposredno pre upotrebe, i sterilne i/ili nepiretičke emulzije. Rastvori mogu biti bilo vodeni ili nevodeni.

[0123] U određenim primerima izvođenja, parenteralni preparati sa jediničnom dozom se pakuju u ampulu, bočicu ili špric sa iglom. Svi preparati za parenteralnu primenu treba da budu sterilni i nepiretički, kao što je poznato i praktikovano u struci.

[0124] U određenim primerima izvođenja, sterilni, liofilizovani prašak priprema se rastvaranjem antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde objavljeno u pogodnom rastvaraču. Rastvarač može da sadrži ekscipijens koji poboljšava stabilnost ili druge farmakološke komponente praška ili rekonstituisanog rastvora, pripremljenog od praška.

4

Ekscipijensi koji se mogu upotrebljavati uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, dekstrozu, sorbital, fruktozu, kukuruzni sirup, ksilitol, glicerin, glukozu, saharozu ili drugi pogodni agens. Rastvarač može da sadrži pufer, kao što je citrat, natrijum ili kalijum fosfat ili drugi takav pufer koji je poznat onima sa iskustvom u struci, u jednom primeru izvođenja, oko neutralne pH. Naknadna sterilna filtracija rastvora praćena liofilizacijom pod standardnim uslovima koji su poznati onima sa iskustvom u struci obezbeđuje poželjnu formulaciju. U jednom primeru izvođenja, rezultujući rastvor će biti raspoređen u bočice za liofilizaciju. Svaka bočica može da sadrži jednu dozu ili više doza anti-PD-L1 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta ili njegovu kompoziciju. Prepunjavanje bočica sa malom količinom iznad one potrebne za dozu ili skup doza (npr. oko 10%) je prihvatljivo kako bi se olakšalo tačno uzimanje uzorka i precizno doziranje. Liofilizovani prašak se može čuvati pod odgovarajućim uslovima, kao što je na oko 4 °C do sobne temperature.

[0125] Rekonstitucija liofilizovanog praška sa vodom za injekcije obezbeđuje formulaciju za upotrebu u parenteralnoj primeni. U jednom primeru izvođenja, za rekonstituciju, sterilna i/ili nepiretička voda ili drugi pogodan tečni nosač se dodaje liofilizovanom prašku. Precizna količina zavisi od odabrane terapije koja se daje, i može se odrediti empirijski.

[0126] Terapijski postupci koji su takođe obezbeđeni, sadrže: primenu terapijski efikasne količine antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde obezbeđeno subjektu kome je to potrebno, čime se leči ili prevenira stanje ili poremećaj koji je povezan sa PD-L1. U sledećem aspektu, obezbeđuju se postupci za lečenje stanja kod subjekta koje bi imalo koristi od pojačane regulacije imunskog odgovora, koji sadrže primenu terapijski efikasne količine antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde obezbeđeno subjektu kome je to potrebno.

[0127] Terapijski efikasna količina antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta, kao što je ovde obezbeđeno zavisiće od različitih faktora koji su poznati u struci, kao što su na primer telesna težina, starost, istorija bolesti, lekovi koje trenutno uzima, zdravstveno stanje subjekta i potencijal za unakrsne reakcije, alergije, osetljivost i neželjene sporedne efekte, kao i put primene i stepen razvoja tumora. Doziranje može proporcionalno redukovati ili povećati neko sa prosečnim iskustvom u struci (npr. lekar ili veterinar) kao što je naznačeno ovim i drugim okolnostima ili zahtevima.

[0128] U određenim primerima izvođenja, antitelo ili antigen-vezujući fragment kao što je ovde obezbeđeno, može se primeniti u terapijski efikasnoj dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 100 mg/kg (npr. oko 0,01 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 35 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 45 mg/kg, oko 50 mg/kg, oko 55 mg/kg, oko 60 mg/kg, oko 65 mg/kg, oko 70 mg/kg, oko 75 mg/kg, oko 80 mg/kg, oko 85 mg/kg, oko 90 mg/kg, oko 95 mg/kg, ili oko 100 mg/kg). U određenim od ovih primera izvođenja, antitelo ili antigen-vezujući fragment primenjuje se u dozi od oko 50 mg/kg ili manje, i u određenim od ovih primera izvođenja doza je 10 mg/kg ili manje, 5 mg/kg ili manje, 1 mg/kg ili manje, 0,5 mg/kg ili manje, ili 0,1 mg/kg ili manje. U određenim primerima izvođenja, primenjena doza može da se promeni tokom lečenja. Na primer, u određenim primerima izvođenja inicijalna primenjena doza može biti veća od naknadno primenjene doze. U određenim primerima izvođenja, primenjena doza može da varira tokom lečenja u zavisnosti od reakcije subjekta.

[0129] Dozni režimi se mogu prilagoditi kako bi se obezbedio optimalan željeni odgovor (npr. terapijski odgovor). Na primer, može se primeniti jedna doza, ili se može primeniti nekoliko podeljenih doza tokom vremena.

[0130] Antitela i antigen-vezujući fragmenti koji su ovde objavljeni mogu se primenjivati bilo kojim putem koji je poznat u struci, kao što je na primer parenteralnim (npr. subkutana, intraperitonealna, intravenska, uključujući intravensku infuziju, intramuskularna ili intradermalna injekcija) ili neparenteralnim (npr. oralno, intranazalno, intraokularno, sublingvalno, rektalno, ili topikalno) putevima.

[0131] Stanja i poremećaji koji su povezani sa PD-L1 mogu biti bolesti ili poremećaji povezani sa imunitetom. U određenim primerima izvođenja, stanja i poremećaji povezani sa PD-L1 uključuju tumore i kancere, na primer, nesitnoćelijski kancer pluća, sitnoćelijski kancer pluća, kancer bubrežnih ćelija, kolorektalni kancer, kancer jajnika, kancer dojke, kancer pankreasa, karcinom želuca, kancer mokraćne bešike, kancer jednjaka, mezoteliom, melanom, kancer glave i vrata, kancer štitne žlezde, sarkom, kancer prostate, glioblastom, kancer grlića materice, karcinom timusa, leukemiju, limfome, mijelome, mycosis fungoides, kancer Merkelovih ćelija, i druge hematološke malignitete, kao što su klasični Hočkinov (Hodgkin) limfom (CHL), primarni medijastinalni B-krupnoćelijski limfom, B-ćelijski limfom bogat T-ćelijama/histiocitima, EBV-pozitivan i -negativan PTLD, i EBV-povezan difuzni B-krupnoćelijski limfom (DLBCL), plazmablastni limfom, ekstranodalni NK/T-ćelijski limfom, nazofaringealni karcinom, i primarni efuzioni limfom povezan sa HHV8, Hočkinov limfom, neoplazma centralnog nervnog sistema (CNS), kao što je primarni CNS limfom, tumor kičmene moždine, gliom moždanog stabla. U određenim primerima izvođenja, tumori i kanceri su metastatski, naročito metastatski tumori koji eksprimiraju PD-L1. U određenim primerima izvođenja, stanja i poremećaji koji su povezani sa PD-L1 uključuju autoimunske bolesti, kao što su sistemski eritemski lupus (SLE), psorijaza, sistemska skleroderma, autoimunski dijabetes i slično. U određenim primerima izvođenja, stanja i poremećaji koji su povezani sa PD-L1 uključuju infektivne bolesti kao što je hronična virusna infekcija, na primer, virusna infekcija hepatitisa B, hepatitisa C, herpes virusa, Epštajn-Bar (Epstein-Barr) virusa, HIV, citomegalovirusa, herpes simpleks virusa tipa I, herpes simpleks virusa tipa 2, humanog papiloma virusa, adenovirusa, epidemije herpes virusa povezane sa Kapoši Vest (Kaposi West) sarkomom, virusa tankog prstena (Torquetenovirus), JC virusa ili BK virusa.

Postupci upotrebe

[0132] Predmetna objava dodatno obezbeđuje postupke upotrebe anti-PD-L1 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata.

[0133] U nekim primerima izvođenja, predmetna objava obezbeđuje postupke lečenja stanja ili poremećaja koji su povezani sa PD-L1 kod pojedinca, koji sadrže primenu terapijski efikasne količine anti-PD-L1 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. U određenim primerima izvođenja, identifikovan je pojedinac koji ima poremećaj ili stanje za koje je verovatno da će reagovati na antagonist PD-L1.

[0134] Prisustvo ili nivo PD-L1 na biološkom uzorku od interesa može ukazivati na to da li bi pojedinac od koga je biološki uzorak dobijen verovatno mogao da reaguje na antagonist PD-L1. Mogu se upotrebljavati različiti postupci za određivanje prisustva ili nivoa PD-L1 u test biološkom uzorku pojedinca. Na primer, test biološki uzorak može biti izložen anti-PD-L1 antitelu ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu, koji se vezuje za i detektuje eksprimirani PD-L1 protein. Alternativno, PD-L1 se takođe može detektovati na nivou ekspresije nukleinske kiseline, upotrebom postupaka kao što su qPCR, reverzna transkriptaza PCR, mikročip, SAGE, FISH, i slično. U nekim primerima izvođenja, test uzorak je poreklom od kancerske ćelije ili tkiva, ili imunskih ćelija koje infiltriraju tumor. U određenim primerima izvođenja, prisustvo ili povećan nivo PD-L1 u test biološkom uzorku ukazuje na verovatnoću reagovanja. Termin "povećan" kao što se ovde upotrebljava, označava ukupno povećanje od ne manje od 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ili veće, nivoa PD-L1 proteina u test uzorku kao što je detektovano upotrebom antitela ili antigen-vezujućih fragmenata koji su ovde obezbeđeni, u poređenju sa nivoom PD-L1 proteina u referentnom uzorku kao što je detektovano upotrebom istog antitela. Referentni uzorak može biti kontrolni uzorak koji je dobijen od zdravog ili neobolelog pojedinca, ili zdrav ili neoboleli uzorak koji je dobijen od istog pojedinca od kog je dobijen test uzorak. Na

4

primer, referentni uzorak može biti neoboleli uzorak pored ili u blizini test uzorka (npr. tumora).

[0135] Antitela ili antigen-vezujući fragmenti koji su ovde objavljeni mogu se primenjivati sami ili u kombinaciji sa jednim ili više dopunskih terapijskih sredstava ili agenasa. Na primer, antitela ili antigen-vezujući fragmenti koji su ovde objavljeni mogu se primenjivati u kombinaciji sa hemioterapijom, terapijom zračenjem, hirurškim zahvatom za lečenje kancera (npr. tumorektomija), jednim ili više antiemetika ili drugim tretmanima za komplikacije koje proizlaze iz hemioterapije, ili bilo kojim drugim terapijskim agensom za upotrebu u lečenju kancera ili bilo kog medicinskog poremećaja koji je posredovan PD-L1. U određenim od ovih primera izvođenja, antitelo ili antigen-vezujući fragment kao što je ovde objavljeno koji se primenjuje u kombinaciji sa jednim ili više dopunskih terapijskih agenasa, može se primenjivati istovremeno sa jednim ili više dopunskih terapijskih agenasa, i u određenim od ovih primera izvođenja antitelo ili antigen-vezujući fragment i dopunski terapijski agens(i) mogu da se primenjuju kao deo iste farmaceutske kompozicije. Međutim, antitelo ili antigenvezujući fragment koji se primenjuje "u kombinaciji" sa drugim terapijskim agensom ne mora da se primenjuje istovremeno sa ili u istoj kompoziciji kao agens. Smatra se da se antitelo ili antigen-vezujući fragment primenjen pre ili posle drugog agensa primenjuje "u kombinaciji" sa tim agensom što je fraza koja je ovde upotrebljena, čak i ukoliko se antitelo ili antigenvezujući fragment i drugi agens primenjuju putem različitih puteva. Tamo gde je moguće, dopunski terapijski agensi koji se primenjuju u kombinaciji sa antitelima ili antigenvezujućim fragmentima koji su ovde objavljeni, primenjuju se u skladu sa rasporedom koji je naveden u listi informacija o proizvodu dopunskog terapijskog agensa, ili u skladu sa Physicians’ Desk Reference 2003 (Physicians’ Desk Reference, 57th Ed; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002)) ili protokolima koji su dobro poznati u struci.

[0136] U određenim primerima izvođenja, terapijski agensi mogu da indukuju ili podstaknu imunski odgovor protiv kancera. Na primer, vakcina protiv tumora može da se upotrebljava da indukuje imunski odgovor na određeni tumor ili kancer. Terapija citokinom se takođe može upotrebljavati za poboljšanje prezentacije tumorskog antigena imunskom sistemu. Primeri terapije citokinom uključuju, bez ograničenja, interferone kao što su interferon-α, -β i -γ, faktore stimulacije kolonija kao što su CSF makrofaga, CSF granulocita-makrofaga, i CSF granulocita, interleukine kao što su IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, i IL-12, faktore nekroze tumora kao što su TNF-α i TNF-β. Agensi koji inaktiviraju imunosupresivne ciljeve takođe se mogu upotrebljavati, na primer, inhibitori TGF-beta, inihibitori IL-10, i inhibitori Fas liganda. Druga grupa agenasa uključuje one koji aktiviraju imunsko reagovanje na tumorske ćelije ili ćelije kancera, na primer, one koji poboljšavaju aktivaciju T ćelija (npr. agonisti kostimulatornih molekula T ćelija kao što su CTLA-4, ICOS i OX-40), i one koji pojačavaju funkciju dendritskih ćelija i prezentaciju antigena.

[0137] Predmetna objava dodatno obezbeđuje postupke praćenja terapijskog odgovora ili progresije bolesti kod subjekta koji se leči antagonistom PD-L1, koji sadrže određivanje prisustva ili nivoa PD-L1 u test biološkom uzorku iz pojedinca sa anti-PD-L1 antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom. U određenim primerima izvođenja, postupci dodatno sadrže poređenje nivoa PD-L1 u test biološkom uzorku sa nivoom PD-L1 u uporedivom uzorku koji je prethodno dobijen od istog pojedinca, pri čemu redukcija, ili usporavanje ili zaustavljanje povećanja nivoa PD-L1 u test biološkom uzorku ukazuje na pozitivan terapijski odgovor ili kontrolisanu progresiju bolesti. Uporedivi uzorak može biti isti tip uzorka kao i test uzorak, ali je dobijen od istog pojedinca pre lečenja, ili tokom ranije faze lečenja.

[0138] Sledeći primeri su obezbeđeni da bolje ilustruju pronalazak za koji se traži zaštita patenta i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje obima pronalaska. Sve specifične kompozicije, materijali, i postupci koji su opisani u nastavku, u celini ili delimično, spadaju u obim predmetnog pronalaska. Ove specifične kompozicije, materijali, i postupci nemaju za cilj da ograniče pronalazak, već samo da ilustruju specifične primere izvođenja koji spadaju u obim pronalaska.

PRIMER 1: Generisanje hibridoma koji proizvode antitela

[0139] 1.1 Imunizacija: ženke OMT pacova (dobijene od Open Monoclonal Technology, Inc., Palo Alto, US, starosti 8-10 nedelja) prajmovane su sa 10 μg humanog PD-L1 ECD proteina u TiterMax putem injekcije u jastuče na stopalu, i zatim podstakivane svaka 3 dana sa PD-L1 ECD proteinom u adjuvansu aluminijum fosfatnog gela putem injekcije u jastuče na stopalu, dok nisu bile spremne za fuziju. Titri seruma sa anti-PD-L1 antitelima ispitivani su pomoću ELISA ili FACS svake druge nedelje.

[0140] 1.2 Fuzija ćelija: Tri dana pre fuzije, životinje su dobile konačni podsticaj sa 10 μg humanog PD-L1 ECD proteina u PBS kroz intraperitonealnu injekciju. Na dan fuzije, limfni čvorovi su sakupljeni i pripremljeni za dobijanje suspenzije pojedinačnih ćelija. Dobijeni limfociti su pomešani sa ćelijama mijeloma (P3) u odgovarajućem odnosu. Ćelijska smeša je

4

isprana i resuspendovana pri 2,0 X 10<6>ćelija/ml u ECF rastvoru. Fuzija je izvedena upotrebom električnog instrumenta BTX 2000.

[0141] 1.3 Primarni i sekundarni pregled supernatanta hibridoma: posle kultivisanja tokom 7-14 dana na 37 °C, deo supernatanta hibridoma ispitan je upotrebom Mirrorball analize. Ukratko, supernatant hibridoma je razblažen 5 puta u 1X PBS. CHO-K1 ćelije koje eksprimiraju PD-L1 su pomešane sa sekundarnim antitelom obeleženim fluorohromom i DraQ5. U svaki bunarić ploče sa 384 bunarčića dodato je 20 μl ćelijske smeše i 20 μl razblaženog uzorka supernatanta hibridoma i inkubirano tokom najmanje 2 sata na sobnoj temperaturi u mraku, dok nije spremno za analizu na Mirrorball<®>visoko osetljivom citometru za mikroploče. Pozitivne rezultate je potvrdila FACS upotrebom CHO-K1 ćelija koje eksprimiraju PD-L1. Ćelije su obojene sa uzorcima supernatanta hibridoma, nakon čega je usledilo bojenje sa 2. antitelom sa FITC konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG Fc. Odgovarajuće roditeljske ćelijske linije su upotrebljene kao negativne kontrole. Obojene ćelije su analizirane upotrebom BD Biosciences FACSCanto II i FlowJo Version softvera.

[0142] 1.4 Subklon: ćelijske linije hibridoma sa potvrđenim pozitivnim vezivanjem za ćelije koje eksprimiraju PD-L1 upotrebljene su za subkloniranje. Ukratko, za svaku ćelijsku liniju hibridoma, ćelije su izbrojane i razblažene kako bi se dobilo 5 ili 1 ćelija na 200 μl u medijumu za kloniranje. Stavljeno je 200 μl/bunariću u ploče sa 96 bunarića. Ploče su inkubirane na 37 °C, 5% CO2dok nisu bile spremne za sledeću analizu.

[0143] 1.5 Test izotipa: ELISA ploče su obložene sa 50 μl/bunariću kozjih anti-pacovskih IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA i IgM antitela pri 1 μg/ml, respektivno. Posle blokiranja, 50 μl uzorka supernatanta hibridoma dodato je u svaki bunarić, i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Kozji anti-pacovski kapa laki lanac-HRP je upotrebljen kao detektujuće antitelo. Bojena reakcija je razvijena upotrebom TMB supstrata tokom 10 minuta, i zaustavljena sa 2M HCl. Ploče su zatim očitane na 450 nm na ELISA čitaču mikroploča.

[0144] 1.6 Test vezivanja zasnovan na ćelijama: Kako bi se ispitala aktivnost vezivanja potpuno humanih antitela za cilj, CHO-K1 ćelije koje eksprimiraju humani PD-L1 ili zrele dendritske ćelije (mDC) obojene su sa potpuno humanim antitelima, nakon čega je usledilo bojenje sa 2. antitelom sa FITC konjugovanim kozjim anti-humanim IgG Fc. Odgovarajuće roditeljske ćelijske linije su upotrebljene kao negativne kontrole. Obojene ćelije su analizirane upotrebom BD Biosciences FACSCanto II i FlowJo Version softvera.

[0145] CHO ćelije transfektovane humanim PD-L1 pune dužine obojene su antitelima prema humanom PD-L1 iz hibridoma pacova, nakon čega je usledilo bojenje sa 2. antitelom sa FITC konjugovanim kozjim anti-pacovskim IgG Fc i analizirane su pomoću FACS. Kao što je

4

pokazano na Slici 1, antitela 1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 i 1.46.11 su se specifično vezala za PD-L1 eksprimiran na CHO ćelijama sa vrednostima EC50 od oko 1 nM.

PRIMER 2: Promena Fc dela i prečišćavanje

[0146] Antitela u supernatantu ćelijske kulture 293F su zatim prečišćena upotrebom afinitetne hromatografije sa proteinom A.

PRIMER 3: Karakterizacija potpuno humanih antitela

[0147] 3.1 Test kompeticije pomoću FACS: kako bi se ispitalo da li potpuno humana antitela mogu da blokiraju vezivanje PD-L1 za PD-1, CHO-K1 ćelije koje eksprimiraju humani PD-L1 inkubirane su sa različitim koncentracijama potpuno humanih antitela na 4 °C tokom 1 sata. Nevezana antitela su isprana, i zatim je ćelijama dodat mišji Fc-označeni humani PD-1. Vezivanje humanog PD-1 za ćeliju koja eksprimira PD-L1 detektovano je upotrebom FITC-konjugovanog kozjeg anti-mišjeg IgG, nakon čega je usledila analiza upotrebom BD Biosciences FACSCanto II i FlowJo Version softvera.

[0148] CHO ćelije koje eksprimiraju humani PD-L1 su inkubirane sa različitim koncentracijama potpuno humanih antitela (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 i 1.46.11). Zatim je ćelijama dodat mišji Fc-označeni humani PD-1. Vezivanje humanog PD-1 za ćeliju koja eksprimira PD-L1 detektovano je upotrebom FITC-konjugovanog kozjeg anti-mišjeg IgG, nakon čega je usledila FACS analiza. Kao što je pokazano na Slici 2, sva testirana potpuno humana PD-L1 antitela blokirala su vezivanje PD-1 za PD-L1 eksprimiran na transfektovanim CHO ćelijama, i 1.14.4, 1.20.15 i 1.46.11 su pokazala IC50 vrednost od oko 10 nM.

[0149] 3.2 Test afiniteta pomoću rezonance površinskih plazmona (SPR): Antitela su okarakterisana za afinitet i kinetiku vezivanja za PD-L1 pomoću SPR testa upotrebom ProteOn XPR36 (Bio-Rad). Protein A protein (Sigma) je imobilizovan na GLM senzorski čip (Bio-Rad) preko kuplovanja amina. Prečišćena antitela su tekla preko senzorskog čipa i uhvaćena su proteinom A. Čip je rotiran za 90° i ispran tekućim puferom (1XPBS/0,01% Tween20, Bio-Rad) sve dok osnovne vrednosti nisu bile stabilne. Pet koncentracija humanog PD-L1 i tekući pufer tekli su prema antitelu u protočnoj ćeliji pri stopi protoka od 100 μl/min za fazu asocijacije od 240 s, nakon čega je usledila disocijacija od 600 s. Čip je regenerisan sa pH 1,7 H3PO4posle svakog ciklusa. Kriva asocijacije i disocijacije je prilagođena 1:1 Langmiur modelu vezivanja upotrebom ProteOn softvera.

4

[0150] Kao što je pokazano na Slici 5, afiniteti potpuno humanih PD-L1 antitela za rekombinantni humani PD-L1 bili su od 4,78E-10 do 2,26E-10 mol/l, kao što je izmereno pomoću rezonance površinskih plazmona.

[0151] 3.3 Test afiniteta pomoću FACS: afinitet vezivanja antitela za PD-L1 na ćelijskoj površini izveden je pomoću FACS analize upotrebom CHO-K1 ćelija koje eksprimiraju humani PD-L1. Testirana antitela su 1 u 2 serijski razblažena u puferu za ispiranje (1XPBS/1% BSA) i inkubirana sa ćelijama na 4 °C tokom 1 h. Dodato je sekundarno antitelo kozji anti-humani IgG Fc FITC (Jackson Immunoresearch Lab) i inkubirano na 4 °C u mraku tokom 1 h. Ćelije su zatim jednom isprane i resuspendovane u 1XPBS/1% BSA, i analizirane pomoću protočne citometrije (BD). Intenzitet fluorescencije će se konvertovati u vezane molekule/ćeliji na osnovu kvantitativnih perli QuantumTM MESF kompleta (Bangs Laboratories, Inc.). KD je izračunata upotrebom Graphpad Prism5.

[0152] 3.4 Funkcionalni test in vitro: kako bi se procenila sposobnost potpuno humanih antitela u modulaciji reagovanja T ćelija, uključujući proizvodnju citokina i proliferaciju ćelija, izvedena su sledeća tri testa.

[0153] 3.4.1 Alogeni MLR: monociti su izolovani iz zdravih donora upotrebom kompleta za obogaćivanje humanih monocita u skladu sa uputstvom proizvođača. Ćelije su kultivisane tokom 5 - 7 dana da se diferenciraju u dendritske ćelije (DC). 18 do 24 sati pre upotrebe, 1 μg/ml LPS je dodat ćelijskoj kulturi kako bi se indukovala maturacija DC.

[0154] CD4<+>T ćelije su izolovane upotrebom kompleta za obogaćivanje humanih CD4<+>T ćelija u skladu sa protokolom proizvođača, i zatim su stimulisane sa zrelim ili nezrelim alogenim DC u prisustvu ili odsustvu potpuno humanih antitela ili kontrolnih Ab. Nivoi IL-2 i IFNγ u supernatantu kulture izmereni su pomoću ELISA na dan 3 i dan 5, respektivno. Proliferacija CD4<+>T ćelija je procenjena pomoću inkorporacije [<3>H] timidina.

[0155] Kao što je pokazano na Slici 9, sva testirana potpuno humana PD-L1 antitela (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 i 1.46.11) su povećala sekreciju IL-2 na dozno zavisan način. Kao što je pokazano na Slici 8, sva testirana potpuno humana PD-L1 antitela (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 i 1.46.11) su povećala sekreciju IFNγ na dozno zavisan način. Kao što je pokazano na Slici 10, sva testirana potpuno humana PD-L1 antitela (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 i 1.46.11) su poboljšala proliferaciju T ćelija zavisnu od koncentracije.

[0156] 3.4.2 Autologni Ag-specifični imunski odgovor: PBMC i monociti su izolovani iz istog donora. PBMC su kultivisane u prisustvu CMV pp65 peptida i niske doze IL2 (20 U/ml). U međuvremenu, DC su generisane kultivisanjem monocita kao što je ranije pomenuto. Posle 5 dana, DC su pulsirane sa pp65 peptidom i zatim dodate CD4<+>T ćelijama u

4

prisustvu ili odsustvu potpuno humanih antitela ili kontrolnog Ab. Nivoi IL-2 i IFNγ u supernatantu kulture izmereni su pomoću ELISA na dan 3 i dan 5, respektivno. Proliferacija CMVpp65-specifičnih CD4<+>T ćelija je procenjena pomoću inkorporacije [<3>H] timidina.

[0157] Kao što je pokazano na Slici 6, proizvodnja IFNγ u specifičnom T ćelijskom odgovoru je poboljšana potpuno humanim PD-L1 antitelima (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 i 1.46.11). Slika 7 pokazuje da su potpuno humana PD-L1 antitela poboljšala proliferaciju CMV<+>- CD4<+>T ćelija zavisnu od koncentracije stimulisanu autolognim DC napunjenim CMV pp65 peptidom.

[0158] 3.4.3 Test supresije T reg: regulatorne T ćelije (T reg) su ključni imunski modulator i igraju ključnu ulogu u održavanju samotolerancije. CD4<+>CD25<+>T reg su povezane sa tumorima pošto je povećan broj T reg pronađen kod pacijenata sa višestrukim kancerima i povezan je sa lošijom prognozom. Kako bismo direktno procenili efekat anti-humani PD-L1 potpuno humanih antitela na inhibitornu funkciju T reg, uporedili smo funkciju T reg u prisustvu ili odsustvu potpuno humanih antitela ili kontrolnog Ab. Ukratko, CD4<+>CD25<+>T reg i CD4<+>CD25<->T ćelije su razdvojene pomoću MACS. CD4<+>CD25<+>T reg i CD4<+>CD25<->T ćelije (odnos T reg:T eff 1:1) su kokultivisane sa alogenim mDC u prisustvu ili odsustvu potpuno humanih antitela ili kontrolnih Ab u različitim koncentracijama. Kao negativna kontrola nije upotrebljeno nijedno antitelo ili je upotrebljeno izotip antitelo. Proizvodnja citokina i proliferacija T ćelija su izmerene kao što je prethodno pomenuto.

[0159] Kao što je pokazano na Slici 11, PD-L1 antitelo 1.20.15 poništilo je supresivnu funkciju T reg i obnovilo reagujuću proliferaciju T ćelija i sekreciju IFNγ.

[0160] 3.5 Test ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) i citoksičnosti zavisne od komplementa (CDC): pošto se humani PD-L1 eksprimira u različitim tipovima ćelija, i na zdravim i na tumorskim ćelijama, kako bi se minimalizovala neželjena toksičnost na zdrave PD-L1<+>ćelije, potvrđeno je da odabrana anti-PD-L1 potpuno humana antitela nemaju ADCC i CDC funkciju.

[0161] 3.5.1 ADCC: ciljne ćelije (mDC) i različite koncentracije potpuno humanih antitela su prethodno inkubirane u pločama sa 96 bunarića tokom 30 min, zatim su dodate IL-2 aktivirane PBMC (efektor) u odnosu efektor/cilj od 50:1. Ploče su inkubirane tokom 6 sati na 37 °C u inkubatoru sa 5% CO2. Liza ciljnih ćelija određena je kompletom za detekciju citotoksičnosti (Roche). Optička gustina je izmerena pomoću Molecular Devices SpectraMax M5e čitača ploča. Kontrolno hAb (IgG1) i kontrolno hAb (IgG4) upotrebljena su kao pozitivna i negativna kontrola, respektivno.

4

[0162] Upotrebom IL-2 aktiviranih PBMC kao izvora ćelija prirodnih ubica (NK) i mDC koje eksprimiraju visoke nivoe PD-L1 na ćelijskoj površini kao ciljnih ćelija, potpuno humana PD-L1 antitela (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 i 1.46.11) nisu posredovala u ADCC (Slika 12).

[0163] 3.5.2 CDC: ciljne ćelije (mDC), razblaženi komplement humanog seruma (Quidel-A112) i različite koncentracije potpuno humanih antitela pomešani su u ploči sa 96 bunarića. Ploča je inkubirana tokom 4 h na 37 °C u inkubatoru sa 5% CO2. Liza ciljnih ćelija određena je pomoću CellTiter glo (Promega-G7573). Rituksan (Roche) i ćelijska linija humanog B limfoma Raji (CD20 pozitivna) upotrebljeni su kao pozitivna kontrola. Kao što je pokazano na Slici 13, potpuno humana PD-L1 antitela nisu posredovala u CDC.

[0164] 3.6 Test grupisanja pomoću FACS: Kako bi se ispitalo da li su potpuno humana antitela bila u istoj grupi za epitope kao i reper antitelo, CHO-K1 ćelije koje eksprimiraju humani PD-L1 inkubirane su sa različitim koncentracijama potpuno humanih antitela na 4 °C tokom 1 sata. Nevezana antitela su isprana, i zatim je ćelijama dodato biotin-označeno kontrolno Ab. Vezivanje biotin-označenog kontrolnog Ab za ćelije koje eksprimiraju PD-L1 detektovano je upotrebom PE-konjugovanog streptavidina, nakon čega je usledila analiza upotrebom BD Biosciences FACSCanto II i FlowJo Version softvera.

[0165] Rezultati testa grupisanja pokazali su da se epitop na humanom PD-L1 vezanom za potpuno humana PD-L1 antitela (tj. 1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 i 1.46.11) razlikuje od postojećih PD-L1 antitela (tj. reper antitelo).

[0166] 3.7 Test vezivanja između vrsta: unakrsna reaktivnost Ab na PD-L1 cinomolgusa i murina izmerena je pomoću ELISA. Humani, cino i mišji PD-L1 su obloženi na ELISA ploče, respektivno. Posle blokiranja, potpuno humana antitela su dodata u ploču i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom najmanje 2 sata. Vezivanje antitela za obložene antigene detektovano je upotrebom kozjeg anti-humanog IgG Fc-HRP. Bojena reakcija je razvijena upotrebom TMB supstrata i zaustavljena sa 2M HCl. ELISA ploče su analizirane na 450 nm upotrebom Molecular Device M5e čitača mikroploča.

[0167] Kao što je pokazano na Slici 4, rezultat ELISA eksperimenta demonstrirao je da se testirana potpuno humana PD-L1 vezuju za PD-L1 cinomolgus majmuna na dozno zavisan način. Međutim, nijedno od testiranih antitela (1.4.1, 1.14.4, 1.20.15 i 1.46.11) nije se vezalo za PD-L1 murina.

[0168] 3.8 Test vezivanja između porodica pomoću FACS: kako bi se ispitala aktivnost vezivanja između porodica potpuno humanih antitela, ćelijske linije koje eksprimiraju PD-L2 obojene su sa potpuno humanim antitelima, nakon čega je usledilo bojenje sa 2. antitelom sa FITC konjugovanim kozjim anti-humanim IgG Fc. Ćelije koje eksprimiraju PD-L1 upotrebljene su kao pozitivna kontrola. Odgovarajuće roditeljske ćelijske linije upotrebljene su kao negativne kontrole. Obojene ćelije su analizirane upotrebom BD Biosciences FACSCanto II i FlowJo Version softvera.

[0169] CHO ćelije transfektovane sa PD-L1 ili PD-L2 obojene su sa potpuno humanim PD-L1 antitelima i analizirane su pomoću FACS. Kao što je pokazano na Slici 3, potpuno humana PD-L1 antitela vezala su se specifično za PD-L1, ali ne i za PD-L2 iz porodice PD-1 liganda.

Primer 4: Mapiranje epitopa potpuno humanog antitela

[0170] Da bi se odredili epitopi predmetnog antitela 1.14.4 koje je ovde obezbeđeno, eksperimenti skeniranja alanina na hPD-1 i procena efekta na vezivanje antitela sprovedeni su upotrebom 1.14.4.

[0171] Sprovedeni su eksperimenti skeniranja alanina na hPD-L1 i procenjen je njihov efekat na vezivanje antitela. Ostaci alanina na hPD-L1 su mutirani u kodone glicina, i svi ostali ostaci su mutirani u kodone alanina. Za svaki ostatak vanćelijskog domena hPD-L1 (ECD), izvršene su tačkaste supstitucije amino-kiselina upotrebom dva uzastopna PCR koraka. pcDNA3.3-hPD-L1_ECD.His plazmid koji kodira ECD humanog PD-L1 i C-terminusnu Hisoznaku upotrebljen je kao templat, i skup mutagenog prajmera je upotrebljen za prvi korak PCR upotrebom QuikChange lightning multi site-directed kompleta za mutagenezu (Agilent technologies, Palo Alto, CA). Dpn I endonukleaza je upotrebljena za digestiju roditeljskog templata posle reakcije sinteze mutantnog lanca. U drugom koraku PCR, linearna DNK ekspresiona kaseta koja je sačinjena od CMV promotora, vanćelijskog domena (ECD) PD-L1, His-oznake i poliadenilacije timidin kinaze (TK) herpes simpleks virusa amplifikovana je i prolazno eksprimirana u HEK293F ćelijama (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

[0172] Monoklonalno antitelo 1.14.4 je obloženo u pločama za ELISA test vezivanja. Posle interagovanja sa supernatantom koji sadrži kvantifikovani mutant PD-L1 ili humani/mišji PD-L1_ECD.His protein (Sino Biological, China), dodato je HRP konjugovano anti-His antitelo (1:5000; Rockland Immunochemicals, Pottstown, PA) kao detektujuće antitelo. Apsorbanca je normalizovana u skladu sa prosekom kontrolnih mutanata. Posle postavljanja dodatne granične vrednosti za -struku promenu vezivanja (<0,55), identifikovani su finalno određeni ostaci epitopa.

[0173] Sprovedene su aktivnosti vezivanja antitela 1.14.4 za humani PD-L1 i PD-L1 murina (Slika 14). Pronađeno je da se naše vodeće 1.14.4 vezuje za humani PD-L1 (Slika 14A), ali se ne vezuje za PD-L1 miša (Slika 14B).

1

[0174] Efekat 131 PD-L1 tačkaste mutacije na vezivanje antitela pokazan je u Tabeli 2. Provera pozicija svih ovih ostataka na hPD-L1 kristalnim strukturama (PDB kod 3BIK i 4ZQK) otkrila je da nije verovatno da će neke amino-kiseline (npr. Gly159, Tyr160, Pro161) direktno kontaktirati bilo koja antitela. Uočene redukcije vezivanja najverovatnije su rezultat nestabilnosti ili čak kolapsa hPD-L1 strukture posle supstitucija alanina. Posle postavljanja dodatne granične vrednosti za -struku promenu vezivanja (<0,55), finalno određeni ostaci epitopa navedeni su u Tabeli 3. Oni su 6 pozicija prema 1.14.4.

[0175] Svi podaci u Tabeli 3 su prema tome mapirani na kristalnoj strukturi hPD-L1 kako bi se napravila bolja vizualizacija i poređenje (Slika 15).

Tabela 2. Efekat PD-L1 tačkastih mutacija na vezivanje antitela

1.14.4

PD-L1 #Ostatka -struka promena<a>SD

P 216 0,563 0,017

T 37 0,569 0,004

K 129 0,586 0,011

G 70 0,602 0,019

D 49 0,603 0,002

L 50 0,614 0,005

2

PD-L1 #Ostatka -struka promena<a>SD A 52 0,622 0,010 G 110 0,632 0,000 P 133 0,664 0,007 G 95 0,668 0,016 N 131 0,680 0,000 Y 81 0,692 0,007 Y 118 0,701 0,005 V 128 0,701 0,012 V 68 0,707 0,012 I 64 0,716 0,009 V 111 0,723 0,003 L 106 0,732 0,008 E 218 0,732 0,000 T 127 0,735 0,021 E 72 0,748 0,025 V 225 0,749 0,048 A 232 0,756 0,010 K 189 0,759 0,021 V 76 0,760 0,010 L 48 0,770 0,006 E 71 0,772 0,012 F 19 0,780 0,045 T 201 0,781 0,012 N 35 0,788 0,003 PD-L1 #Ostatka -struka promena<a>SD Q 107 0,792 0,001 A 109 0,797 0,004 E 205 0,801 0,010 V 21 0,803 0,011 R 186 0,805 0,008 G 33 0,807 0,000 D 215 0,811 0,015 S 34 0,813 0,006 K 105 0,816 0,004 H 78 0,821 0,006 E 217 0,823 0,136 G 119 0,825 0,010 E 39 0,831 0,002 E 188 0,833 0,000 P 43 0,834 0,010 V 44 0,837 0,001 L 231 0,838 0,003 Y 56 0,840 0,002 Y 28 0,842 0,015 L 175 0,842 0,009 N 236 0,848 0,019 I 199 0,848 0,011 K 185 0,853 0,003 K 25 0,857 0,080

4

PD-L1 #Ostatka -struka promena<a>SD D 90 0,858 0,003 D 103 0,863 0,007 T 203 0,870 0,015 R 212 0,870 0,006 T 22 0,875 0,004 I 206 0,876 0,002 V 29 0,882 0,001 T 102 0,887 0,001 T 154 0,888 0,004 T 179 0,893 0,030 G 120 0,895 0,007 F 191 0,897 0,021 T 196 0,898 0,049 Q 91 0,906 0,016 P 24 0,907 0,009 E 31 0,908 0,033 K 89 0,913 0,009 I 54 0,918 0,045 N 96 0,924 0,007 R 82 0,934 0,003 T 32 0,935 0,009 S 117 0,935 0,010 S 169 0,939 0,018 E 45 0,942 0,002 PD-L1 #Ostatka -struka promena<a>SD N 183 0,944 0,021 T 181 0,947 0,038 V 23 0,948 0,019 L 27 0,949 0,001 E 237 0,956 0,001 L 214 0,958 0,013 R 125 0,959 0,009 S 79 0,962 0,007 D 26 0,963 0,010 T 20 0,974 0,017 S 80 0,974 0,015 Q 66 0,979 0,016 A 18 0,979 0,011 Q 83 0,982 0,003 V 174 0,983 0,009 D 73 0,988 0,014 K 162 0,990 0,008 T 180 1,000 0,025 R 86 1,001 0,003 A 98 1,009 0,002 Q 77 1,011 0,002 M 59 1,012 0,006 Q 100 1,012 0,002 K 75 1,015 0,021 PD-L1 #Ostatka -struka promena<a>SD

M 115 1,016 0,040

V 143 1,016 0,031

V 147 1,017 0,005

L 74 1,021 0,018

N 135 1,026 0,130

A 51 1,035 0,037

M 36 1,036 0,005

L 142 1,047 0,072

Q 47 1,051 0,030

K 124 1,056 0,004

H 69 1,056 0,003

K 41 1,071 0,036

K 46 1,085 0,029

L 88 1,102 0,017

Y 123 1,108 0,005

I 38 1,132 0,026

S 93 1,145 0,024

A 121 1,147 0,018

L 94 1,189 0,021

D 122 1,215 0,026

<a>-struka promena vezivanja je u odnosu na vezivanje nekoliko tihih supstitucija alanina.

Tabela 3. Identifikacija potencijalnih epitopa

PD-L1 prema 1.14.4 lokacija ostatka

E 58 C niz

E 60 C niz

D 61 C niz

K 62 CCꞌ petlja

N 63 CCꞌ petlja

R 113 F niz

Granična vrednost: -struka promena <0,55

[0176] Kao što je pokazano na Slici 15, hot spot ostaci zaduženi za vezivanje hPD-L1 su svi sakupljeni u C nizu, CCꞌ petlji i F nizu (Slika 15). Provera pozicija ostataka na kompleksnim kristalnim strukturama hPD-1/hPD-L1 (PDB kod 4ZQK, 4Å) otkrila je da su ovi ostaci uglavnom locirani na A, C, F i G nizovima. Epitopi 1.14.4 su uglavnom doprineli ostacima na C nizovima, koji imaju direktno preklapanje sa mestom interakcije hPD-1 i hPD-L1, što ukazuje na mehanizme u smislu vezivanja hPD-L1 i blokiranja hPD-1.

Primer 5: In vivo inhibicija potpuno humanog antitela hPD-L1 na rast tumora

[0177] Kako bi se procenila inhibicija hPD-L1 antitela na rast tumora, 5X10<5>ćelija/0,1 ml MC38-B7H1 tumorskih ćelija je inokulisano subkutano na prednje desno rebro 42 mužjaka B-hPD-1 humanizovanih miševa. Kada je veličina tumora dostigla oko 100 mm<3>, miševi su podeljeni u grupe (5 grupa, 7 po grupi) i primenjivani su im agensi na sledeći način: Grupa 1: vehikulum, Grupa 2: kontrolno antitelo BMK6 (videti detaljan opis u WO2011066389A1), Grupa 3: 1.14.4, 3 mg/kg, Grupa 4: 1.14.4, 10 mg/kg i Grupa 5: 1.14.4, 30 mg/kg. Svim grupama su agensi primenjivani putem intraperitonealne injekcije jednom svaka dva dana sa šest uzastopnih primena. Životinje su kontinuirano posmatrane još sledeće dve nedelje posle završetka primene. Zapremina tumora i telesna težina merene su dva puta nedeljno, i zabeleženi su odnosi između promene telesne težine miša i perioda primene, i promene zapremine tumora i perioda primene. Na kraju eksperimenta, izračunati su i statistički analizirani odnos zapremina tumora u grupama sa terapijom prema grupi sa vehikulumom (T/C) i inhibicija rasta tumora (TGI). T-test je urađen sa Graphpad Prism 5 i zapremina tumora je statistički analizirana. P<0,05 se smatralo da ima značajne razlike.

[0178] Zapremina tumora je merena dva puta nedeljno upotrebom pomičnog kljunastog merila za dugački prečnik i kratki prečnik, i formula za izračunavanje zapremine je: zapremina tumora = 0,5 X dugački prečnik X kratki prečnik<2>. Stopa rasta tumora izračunata je na osnovu rezultata merenja: T/C (%) = zapremina tumora grupe sa terapijom / zapremina tumora grupe negativne kontrole X 100%. Inhibicija rasta tumora TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] x 100, pri čemu je Ti prosečna zapremina tumora grupe sa terapijom na dan i, T0 je prosečna zapremina tumora grupe sa terapijom na dan 0, Vi je prosečna zapremina tumora kontrolne grupe na dan i, a V0 je prosečna zapremina tumora kontrolne grupe na dan 0.

[0179] Tokom eksperimenta, telesna težina životinja u svakoj grupi nije pokazala značajno smanjenje (Tabela 4 i Slika 16), što ukazuje na dobru podnošljivost test agenasa. Posle 19 dana primene (tj. 25 dana posle inokulacije tumorskih ćelija), zapremina tumora u grupi sa vehikulumom dostigla je 2359 mm<3>, i u poređenju sa grupom sa vehikulumom, zapremine tumora u grupama sa visokom, srednjom i niskom dozom antitela 1.14.4 pokazale su značajno smanjenje (prosečna zapremina tumora je bila 949 mm<3>, 1416 mm<3>i 1115 mm<3>, respektivno). Sve tri doze antitela pokazale su značajne antitumorske efekte, na šta ukazuje TGI od 62,8%, 42,0% i 55,4%, respektivno (Tabela 4 i Slika 17). Kontrolno antitelo BMK6 je takođe pokazalo značajan antitumorski efekat (prosečna zapremina tumora je 1241 mm<3>, i TGI je 49,7%). Prema tome, rezultati su pokazali da antitelo 1.14.4 pokazuje značajan antitumorski efekat, i inhibicije za sve grupe sa visokom, srednjom i niskom dozom bile su iznad 40%.

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, naznačeno time što sadrži:

a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 SEQ ID NO: 13, CDR2 SEQ ID NO: 15, i CDR3 SEQ ID NO: 17; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 SEQ ID NO: 19, CDR2 SEQ ID NO: 21, i CDR3 SEQ ID NO: 23; ili b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 SEQ ID NO: 37, CDR2 SEQ ID NO: 39, i CDR3 SEQ ID NO: 41; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 SEQ ID NO: 19, CDR2 SEQ ID NO: 21, i CDR3 SEQ ID NO: 23;

pri čemu se antitela specifično vezuju za PD-L1.

2. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što sadrži:

a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 47; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 49; ili

3. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što je sposobno da se specifično vezuje za humani PD-L1 pri Kd vrednosti ne većoj od 10<-8>M, kao što je izmereno pomoću testa vezivanja tehnikom rezonance plazmona;

koje se vezuje za PD-L1 majmuna pri EC50 ne većoj od 10 nM, ili ne većoj od 1 nM, i ne vezuje se za PD-L1 miša;

sposobno je da inhibira vezivanje humanog PD-L1 ili PD-L1 majmuna za njegov receptor pri IC50 ne većoj od 100 nM;

koje se ne vezuje za PD-L2;

koje ne posreduje u ADCC ili CDC ili oba;

koje je potpuno humano monoklonalno antitelo, poželjno pri čemu je potpuno humano monoklonalno antitelo proizvedeno od strane transgenog pacova;

2

i vezuje se za epitop koji sadrži sledeće amino-kiselinske ostatke PD-L1: E58, E60, D61, K62, N63 i R113.

4. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što je sposobno da blokira vezivanje humanog PD-L1 za njegov receptor i na taj način obezbedi najmanje jednu od sledećih aktivnosti:

a) indukovanje proizvodnje IL-2 u CD4<+>T ćelijama;

b) indukovanje proizvodnje IFNγ u CD4<+>T ćelijama;

c) indukovanje proliferacije CD4<+>T ćelija; i

g) preokretanje supresivne funkcije T reg.

poželjno koje je dijatelo, scFv, scFv dimer, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv fragment, Fab, Fab', F(ab')2, ds dijatelo,

poželjno koje dodatno sadrži konstantni region imunoglobulina.

5. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što dodatno sadrži konjugat.

6. Izolovani polinukleotid naznačen time što kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnim zahtevima 1-5.

7. Vektor naznačen time što sadrži izolovani polinukleotid prema patentnom zahtevu 6.

8. Ćelija domaćin naznačena time što sadrži vektor prema patentnom zahtevu 7.

9. Postupak ekspresije antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačen time što sadrži kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 10 pod uslovima u kojima se polinukleotid prema patentnom zahtevu 7 eksprimira.

10. Komplet naznačen time što sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5.

11. Postupak

detektovanja prisustva ili nivoa humanog PD-L1 ili PD-L1 majmuna u biološkom uzorku, koji sadrži izlaganje biološkog uzorka antitelu ili njegovom antigenvezujućem fragmentu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, i određivanje prisustva ili nivoa humanog PD-L1 ili PD-L1 majmuna u uzorku; ili identifikovanja pojedinca koji ima kancer ili tumor, koji sadrži: određivanje prisustva ili nivoa PD-L1 u test biološkom uzorku iz pojedinca sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, pri čemu prisustvo ili povećan nivo PD-L1 u test biološkom uzorku ukazuje na verovatnoću reagovanja, poželjno koji dodatno sadrži primenu terapijski efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 pojedincu; ili

praćenja terapijskog odgovora ili progresije bolesti kod subjekta koji se leči sa antagonistom PD-L1, koji sadrži određivanje prisustva ili nivoa PD-L1 u test biološkom uzorku iz pojedinca sa anti-PD-L1 antitelom ili njegovim antigenvezujućim fragmentom prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6.

12. Farmaceutska kompozicija naznačena time što sadrži antitelo ili njegov antigenvezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

13. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 naznačeno time što je za upotrebu u lečenju kancera ili hronične virusne infekcije.

4