RS62147B1 - Korteksolon 17 alfa valerat za upotrebu u lečenju tumora - Google Patents

Description

Opis pronalaska

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0001] Prisutni pronalazak obezbeđuje jedinjenje korteksolon 17.alfa. – valerat, sledeće formule: za upotrebu u lečenju karcinoma prostate, karcinoma pankreasa, karcinoma pluća, karcinoma gastrointestinalnog trakta, kancera bubrega,karcinoma štitne žlezde, karcinoma materice ili nadbubrežne žlezde, a pri čemu je karcinom prostate rezistentan na ciljnu terapiju protiv androgena.

korteksolon 17α-valerat

[0002] Drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na farmaceutske kompozicije koje sadrže navedeno jedinjenje, za upotrebu u lečenju navedenih stanja.

OSNOV PRONALASKA

[0003] Tumor ili neoplazija, je definisan kao masa novih tkiva koja se ponavlja i raste nezavisno od okolne strukture, i koja nema fiziološku upotrebu (Doreland's Medical Dictionary, 23 ED, 1960).

[0004] Dostupno je nekoliko klasifikacija tumora: za eksploataciju ovog patenta, najvažnija je klasifikacija epitelnih tumora.

[0005] Epitelni tumori su neoplazme izvedene iz epitelnih ćelija (tip ćelija koje linijski spajaju šuplje unutrašnje organe i površine tela). Ova grupa tumora uključuje mnoge najčešće vrste kancera, i uključuje većinu onih koji se razvijaju u dojci, prostati, plućima, pankreasu i probavnom traktu.

[0006] U nekim slučajevima, epitelni tumori mogu se takođe okarakterisati prisustvom određenih hormonskih receptora u ćelijama tumora koji daju tumoru hormonsku senzitivnost.

[0007] Karcinomi, koji su maligni tumori izvedeni iz epitelnih ćelija, čine oko 85 od svakih 100 kancera (85%).

[0008] Jedan primer epitelnog karcinoma je karcinom pankreasa (poznat kao kancer pankreasa).

[0009] Kancer pankreasa je jedan od najsmrtonosnijih oblika karcinoma. Egzokrine i endokrine ćelije pankreasa formiraju potpuno različite tipove tumora. Egzokrini tumori pankreasa predstavljaju najčešći tip tumora pankreasa (više od 95%). Iako se u pankreasu mogu razviti i benigne (ne-kancerogene) ciste i benigni tumori, većina ekzokrinih tumora pankreasa su maligni.

[0010] Karcinom pankreasa, naročito egzokrini karcinom pankreasa, a naročito najčešći duktalni adenokarcinom, spada u pet najčešćih uzroka smrti kod muškaraca i četiri najčešća kod žena. To je jedan od tumora sa najnepovoljnijim prognozama opstanka, koje su 5% kod muškaraca i 6% kod žena u pet godina od dijagnoze. Najveći broj slučajeva javlja se između 60 i 70 godina starosti (AIOM. Linea Guida Carcinoma del Pancreas Esocrino, ed. 2013).

[0011] Etiologija karcinoma ekzokrinog pankreasa je nepoznata. Prepoznate su genetske predispozicije (porodične) i neki rizični faktori kao što su pušenje, masna dijeta, dijabetes mellitus tip 2, hronični pankreatitis, i ekološki faktori kao što su rastvarači i pesticidi.

[0012] Karcinom egzokrinog pankreasa, u ranoj fazi je asimptomatičan, što objašnjava kašnjenje u dijagnozi, jer se simptomi javljaju kada je bolest u poodmakloj fazi, uz izuzetak slučajnog otkrivanja tokom dijagnostičkog ispitivanja drugih abdominalnih oboljenja.

[0013] Pacijenti sa dijagnozom kancera pankreasa obično imaju lošu prognozu: s obzirom na navedeno kašnjenje u dijagnozi, samo oko 15% slučajeva pokazuje ograničen tumor pankreasa, dok u preostalim slučajevima difuzija regionalnolokalizovanih limfnih čvorova je detektovana u oko 25% pacijenata, i onih sa prisutnom metastazom je detektovano u 60% slučajeva.

[0014] Srednje vrednosti u medicinskim statistikama pokazuju da je preživljavanje sa dijagnostikovanim kancerom u proseku od tri do šest meseci, dok su preživljavanja do 5 godina značajno manja od 5%.

[0015] Terapija karcinoma pankreasa je operacija, kada je to moguće, takođe sa palijativnim ciljevima.

[0016] Radikalna pankreatikoduodenektomija (glavna hiruška operacija) je trenutno jedina šansa za izlečenje, naročito kod minimalnih oboljenja.

[0017] Medicinska terapija, takođe povezana sa radioterapijom je ograničena na neoperativne slučajeve kada su prisutne metastaze, ili kao adjuvantni tretman nakon operacije. Iako postoje povremeni izveštaji za izvesne pacijente koji imaju pozitivan odgovor na gemcitabin ili fluorouracil, ili upravljanu kombinaciju doksorubicina, metotreksata, cisplatina, oksaliplatina, irinotekana, erlotiniba i tako dalje, rezultati hemoterapije su generalno nezadovoljavajući i često nisu bolji od neterapije uopšte (Martindale, 31 izd, str.530).

[0018] Theve i drugi 1983. godine su razmotrili moguće efekte polnih hormona na pankreas, na osnovu izveštaja o proteinskim receptorima steroida u tkivu pankreasa, visoki procenat estrogena vezuje protein u ljudskom pankreasu i kapacitet ljudskog tkiva pankreasa konvertuje glavni periferni estrogen, estron sulfat, u terminal biološki aktivog estradiola-17 beta.

[0019] Sa ovakvom pozadinom, proban je tamoksifen (antagonist estrogen receptora) u pacijentima sa neoperativnim adenokarcinonom pankreasa sa nekim preliminarnim rezultatima sličnim onim od strane Wong i drugi, 1993.

[0020] U kliničkoj praksi, godinama nadalje nije davao očekivane rezultate, ali je zaključak bio da čak iako anti-estrogen ne predstavlja optimalni oblik terapije, druge vrste hormonalne manipulacije bi trebale da budu probane za kancer pankreasa. Imajući u vidu navedeno gore u dokumentu, postoji snažna potreba za novim pristupima u tretmanu tumora, a naročito u lečenju karcinoma, i još preciznije u tretmanu epitelnih tumora, posebno benignog karcinoma ili karcinoma pankreasa (po mogućstvu egzokrinog karcinoma pankresa).

[0021] Brojna jedinjenja kao što su 17α-monoesteri, 21-monoesteri i 17α,21-diesteri kortoksolona i procesi za njihovu proizvodnju su poznati u tehnici. Dokument WO03//014141 opisuje jedinjenja koja pripadaju porodici steroida strukturno povezanih sa korteksolonom (poznat takođe kao 11-deoksikortizon) i koja imaju antiandrogenu aktivnost. Jedinjenje, kao što je korteksolon 17α-propionat, aktivno je u ometanju direktne akcije androgenih hormona na androgen receptor (AC) u tkivima.

[0022] Dokument WO2007/031349 otkriva C3-C1017α-ester 9,11-dehidrokorteksolone, derivate strukturno srodne korteksolonu, kao što je antigonadotrofični agens, koji mogu biti korisni u tretmanima oboljenja usko povezanih sa proizvodnjom gonadotrofina.

[0023] Dokument WO2009/019138 otkriva enzimske procese za dobijanje 17αmonoestara korteksolona i 9,11-dehidrokorteksolona; pored toga, takođe dalje otkriva postojanje nekoliko kristalnih oblika korteksolon 17α-propionata, nazvane kristalin oblik I, oblik II, oblik III i hidratni oblik IV, i određene procese za njihovo dobijanje.

[0024] Ciproteron acetat (skraćenica CPA), je sintetički steroid, koji se uzima u obzir kao standardna terapija za tretmane androgen-osetljivih tumora, posebno kancera prostate. Standardna terapija sa ciproteron acetatom dovela je do prilične neefikasnosti u tomorima sa smanjenom, ili odsutnom ekspresijom androgen receptora (Br. J. Cancer (1989), 60, 789-792).

[0025] U tehnici je poznato da prisustvo 17α-esterifikacije daje korteksolon 17α-estere različitih antiandrogenih aktivnosti, demonstrirano u životinjama (Celasco i drugi, Arzneim-Forsch 2005; 5:581-7).

[0026] Sada je iznenada pronađeno da korteksolon 17α (alfa)-monoestri, 21-monoestri i 17α (alfa), 21-diestri imaju neočekivane anti-tumorske efekte, i u izolovanim ćelijskim kulturama kancera in vitro i u ksenograftu prostate i u modelu kancera pankreasa in vivo na životinjama.

[0027] Anti-tumorski efekat prema predmetnom pronalasku, bio je očigledan i u ćelijama karcinoma koje nose androgeni receptor (AR<+>), kao što je u slučaju kancera ćelija prostate LNCaP ili kancer ćelija pankreasa Panc1, i, vrlo izenađujuće, takođe u ćelijama sa odsutnom ili smanjenom, ekspresijom androgenog receptora (AR-), kao ćelija kancera prostate PC3, ili kancer ćelija pankreasa MiaPaca. Antitumorski efekat prema predmetnom pronalasku, bio je takođe očigledan u karcinomima dojke (AR-), i u karcinomima gastrointestinalnog trakta (AR-).

KRATAK OPIS SLIKA

[0028] Pronalazak će sada biti opisan pomoću neograničavajućih slika i primera koji slede.

Slika 1: Prosečna promena veličine tumora pankreasa, mereno u odnosu na početak tretmana ubrizgavanjem subkutano (SC), u ksenograft životinjskom modelu ogoljenih miševa (MiaPaca ćelijska linija pankreasa) sa korteksolon 17α-benzoatom (na slici kao “06” i kao “CB-03-06”) u manjoj dozi (230 μM) i u većoj dozi (1150 μM). Referenca za "Nosač" (pomoćna supstanca) je kontrola tretiranih grupa sa 0,4% (zap./zap.) Tween 80 i 0,5% (tež./zap.) karboksimetilceluloze u normalnom slanom rastvoru. Miševi su tretirani sa jedinjenjem i nosačem SC dnevno, 28 dana (dnevni tretman). Oznaka prestanka tretmana se odnosi na dan kada je tretman završen. Slika 2: Prosečna promena veličine tumora pankreasa, mereno relativno na početku SC tretmana, u ksenograft životinjskom modelu ogoljenih miševa (MiaPaca ćelijska linija pankreasa) sa korteksolon 17α-valerat-21-propionatom (na slici kao “10” i kao “CB-03-10”) u manjoj dozi (230 μM) i u većoj dozi (1150 μM). Referenca za "nosač" je kontrola tretiranih grupa sa 0.4% (zap./zap.) Tween 80 i 0.5% (tež./zap.) karboksimetilceluloze u normalnom slanom rastvoru. Miševi su tretirani sa jedinjenjem i nosačem SC dnevno, 28 dana za redom. Oznaka prestanka tretmana se odnosi na dan kada je tretman završen.

Slika 3: Prosečna promena veličine tumora pankreasa, mereno u odnosu na početak SC tretmana u životinjskom modelu ogoljenih miševa (MiaPaca, ćelijska linija pankreasa) tretirano sa ciproteron acetatom (na slici kao CPA), korteksolon 17α-valerat-21-propionatom (na slici kao “10”) i korteksolon 17α-benzoatom (na slici kao “06”) (svako jedinjenje za manju dozu i za veću dozu) i sa nosačem (odnosno 0.4% (zap./zap.) Tween 80 i 0.5% (tež./zap.) karboksimetilceluloze u normalnom slanom rastvoru) tretirane kontrolne grupe. Svi miševi su tretirani sa jedinjenjem i nosačem SC dnevno, 28 dana uzastopno (dnevni tretman). Oznaka prestanka tretmana se odnosi na dan kada je

tretman završen.

Slika 4: Grafikon pokazuje P vrednosti nasuprot nosača (odnosno 0.4% (zap./zap.) Tween 80 i 0.5% (tež./zap.) karboksimetilceluloze u normalnom slanom rastvoru) tretirane kontrolne grupe najboljim dozama iz Slike 3. Svi miševi su tretirani jedinjenjima i nosačem SC dnevno, 28 dana za uzastopno (dnevni tretman). Oznaka prestanka tretmana odnosi se na dan kada je tretman završen.

Slika 5: Doza titracije citotoksičnosti korteksolon-izvedenih jedinjenja u ljudskoj prostati (a) i ćelijskim linijama kancera pankreasa (b).

Slika 6: Androgen receptor ekspresija nivoa u ćelijskim linijama kancera.

Slika 7: CB-03-10 i CB-03-05 aktivnost antagonista glukokortikoida. Mifepriston je upotrebljen kao pozitivna kontrola (potentni antagonist glukokortikoida).

Slika 8: CB-03-10 i CB-03-05 aktivnost agonista glukokortikoida. Deksametazon (Dex) je upotrebljen kao pozitivna kontrola (potentni agonist glukokortikoida).

Slika 9: CB-03-10 indukcija apoptoze u MiaPaca2 ćelijama.

Slika 10: Indukcija hvatanja ćelijskih ciklusa od strane različitih koncentracija CB-03-10 u MiaPaca2 ćelijama.

Slika 11: Vremenski raspored aktivacija kaspaze u MiaPaca2 Ćelijama (8-24-48 časova). 20 μM (prugaste trake) ili 50 μM (neprozirne trake) ukazuje na koncentracije jedinjenja. Gemcitabin je potentni lek protiv citotoksičnosti pankreasa i pozitivna kontrola.

Slika 12: Aktivacija kaspaze na LNCaP ćelijskim linijama kancera prostate.

Slika 13: In vitro metabolizam CB-03-10 i CB-03-05 u (A) ljudskoj i (B) pacov plazmi.

Slika 14: CB-03-10 i CB-03-05 farmakokinetike izmerene in vivo u plazmi miševa posle subkutane i oralne primene.

Slika 15: CB-03-10 in vivo anti-tumorska aktivnost na miš ksenograft modelu kancera pankreasa kada se primeni ubrizgavanjem subkutano.

Slika 16: CB-03-10 in vivo anti-tumorska aktivnost u miš ksenograft modelu kancera prostate kada se primeni oralno gavagom (davanje leka silom kroz cev niz grlo do stomaka). Enzalutamid (Enza) potentni lek protiv citotoksičnosti prostate je upotrebjen kao pozitivna kontrola. Rezultati pokazuju da CB-03-10 Vs nosača je statistički znatno drugačiji od 7 dana, pa do 60 dana. Sa druge strane, enzalutamid naspram nosača je statistički značajan samo na 14 i 25 dan. Ovo poređenje pokazuje da CB-03-10 dostiže visoke statističke svrhe kao nosač dok enzalutamid ne postiže značajne statističke svrhe kao nosač.

Slika 17: CB-03-10 i CB-03-05 inhibicija polazne PSA sekrecije iz LMCaP ćelijskih linija kancera.

Slika 18: Androgen i glukotikoid receptor ekspresija u različitim ćelijskim linijama kancera.

DEFINICIJE

[0029] Osim ako nije drugačije definisano, svi stručni izrazi, beleške i druga naučna terminologija koja se upotrebljava u ovom dokumentu se namenjeni boljem razumevanju os strane stručnjaka iz ove oblasti, svega onoga na šta se ovaj dokument odnosi. U nekim slučajevima, opšte poznata značenja definisana su u ovom dokumentu za jasnoću i/ili pripremu referenci; na taj način uključivanje takve definicije ne treba smatrati za bitnu razliku od onoga što je generalno jasno stručnjacima iz ove oblasti.

[0030] Naročito, izrazi "fiziološki prihvatljiv ekscipijent" ili "farmaceutski prihvatljiv ekscipijent" u ovom dokumentu se odnose na supstance bez farmakološkog efekta koje ne proizvode negativne reakcije kada se primenjuju na sisaru, poželjno čoveku.

Fiziološki prihvatljivi ekscipijenti su stručno poznati i razotkriveni, na primer u Handbook of Pharmaceutical Exscipients, šesto izdanje (2009), koje je u ovaj dokument uključeno u vidu reference.

[0031] Izraz "alkil" koji se upotrebljava u ovom dokumentu označava zasićeni ravni ili razgranati ugljovodonik.

[0032] Izraz "aril" u ovom dokumentu odnosi se na aromatične sisteme mono- ili polikarbocikličnog prstena, pri čemu pojedinačni karbocikilični prsteni u sistemu polikarbocikličnog prstena mogu biti spojeni ili vezani jedni za druge preko pojedinačne veze. Pogodne "aril" grupe obuhvataju, ali nisu ograničene na, fenil, naftil, bifenil i slično.

[0033] Izraz "heteroaril" ovde u dokumentu se odnosi na aromatični sistem mono- i polikarbocikličnog prstena obuhvatajući najmanje heteroatom u sistemu prstena, pri čemu je pomenuti heteroatom izabran iz grupe koja obuhvata, ali nije ograničena na, azot, sumpor, kiseonik i slično, i pri čemu induvidualni ciklični prsteni u sistemima polikarbocikličnog prstena mogu biti spojeni ili vezani jedni drugima preko pojedinačne veze. Pogodne "heteroaril" grupe obuhvataju, ali nisu ograničene na, piridil, imidazolil, pirolil, furil, benzimidazolil, tiofuranil i slično.

[0034] Aril grupe mogu biti opciono supstituisane odnosno po potrebi zamenjene sa najmanje jednim od ugljenikovih atoma prstena sa grupom izabranom iz nižeg alkila, nižeg alkenila, nižeg haloalkila, nižeg haloalkenila, nižeg aloksi, nižeg halkalkenila, nižeg alkeniloksi, halogena, nitro, cijano, nižeg alkiltio, i slično.

[0035] Heteroaril grupe mogu biti opciono supstituisane sa najmanje jednim od ugljenikovih atoma ili sa najmanje jednim od atoma prstena sa grupom koja je izabrana iz alkila, nižeg haloalkila, nižeg aloksi, nižeg alkenila, nižeg halkalkenila, nižeg alkeniloksi, halogena, nitro, cijano, nižeg alkiltio, i slično.

[0036] Izraz "približno" u ovom dokumentu odnosi se na opseg eksperimentalne greške, koja se može pojaviti pri merenju.

[0037] Izrazi "obuhvatajući", "imajući", "uključujući" i "koja sadrži" se tumače kao otvoreni krajevi izraza (odnosno značenje "uključujući ali ne ograničavajući na") i uzeti su u obzir kao uključujući i/ili pružajući podršku i za izraze kao što su "u suštini se sastoji od","koji se u suštini sastoji od", "sastoji se od", "koji se sastoji od".

[0038] Izrazi "u suštini se sastoji od", "koji se u suštini sastoji od" se tumače kao poluzatvoreni izrazi, što znači da nema drugih sastojaka koji materijalno utiču na osnovne i nove karakteristike predmetnog pronalaska koji su uključeni (opcioni ekcipijent može takođe biti uključen).

[0039] Izrazi "sastoji se od", "koji se sastoji od" se tumače kao zatvoreni izrazi.

[0040] Kao što se upotrebljava ovde u dokumentu, izrazi "terapeutski efektivan iznos" i "efektivan iznos" odnosi se na količine koje su dovoljne da izazovu željeni biološki odgovor. U prisutnom pronalasku željeni biološki odgovor je da inhibira, smanji ili ublaži ozbiljnost, trajanje, progresiju ili početak oboljenja, poremećaja ili stanja, sprečavanje napredovanja, ponavljanja ili progresije oboljenja, poremećaja ili stanja ili simptoma povezanih sa oboljenjem, poremećajem ili stanjem. Precizna količina jedinjenja koja se daje subjektu će zavisiti od načina primene, vrste i ozbiljnosti oboljenja, poremećaja ili stanja i o karakteristikama subjekta, opštem zdravlju, godinama, polu, telesnoj težini i toleranciji na lekove. Stručno lice će moći da odredi odgovarajuće doze u zavisnosti od ovih i drugih faktora. Pogodne doze su poznate za odobrene agense i mogu se podesiti od strane stručnog lica a prema stanju subjekta, vrsti i stanju (-ima) koje se tretira i količini jedinjenja koje se upotrebljava, opisanog ovde u dokumentu. U slučajevima kada nijedan količinski iznos nije izričito naveden, treba pretpostaviti efektivnu količinu. Na primer, jedinjenja i farmaceutske kompozicije opisane ovde u dokumentu mogu biti primenjeni na subjekat u opsegu doza između približno 0.01 za 100 mg/kg telesne težine/po danu za terapeutski tretman.

[0041] Kao što se upotrebljava ovde u dokumentu, izrazi "tretirati", "tretman" i "lečenje" odnosi se na terapeutske tretmane uključujući smanjenje ili poboljšanje progresije, težine i/ili trajanja oboljenja, poremećaja i stanja, ili poboljšanje jednog ili više simptoma (konkretno, jedan ili više primetnih simptoma) oboljenja, poremećaja i stanja, rezultata primene jedne ili više terapija (na primer, jedan ili više terapeutskih agenasa koji predstavljaju jedinjenje kako je definisano u patentnim zahtevima). U specifičnoj primeni pronalaska terapeutski tretman uključuje melioraciju najmanje jednog merljivog fizičkog parametra oboljenja, poremećaja ili stanja. U drugoj primeni pronalaska terapeutski tretman uključuje inhibiciju napredovanja stanja, bilo fizičkog, na primer, stabilizacijom primetnog simptoma, bilo psihološkog, na primer, bilo stabilizacijom fizičkog parametra, ili oba. U drugoj primeni pronalaska terapeutski tretman uključuje smanjenje ili stabilizaciju oboljenja, poremećaja ili stanja. Izraz "kurativni tretman" kao što se upotrebljava ovde u dokumentu odnosi se na tretman koji ima za cilj da izleči oboljenje ili za poboljšanje simptoma povezanih sa oboljenjem.

[0042] Izraz "palijativni tretman" kao što se upotrebljava ovde u dokumentu odnosi se na tretman ili terapiju koji nemaju za cilj lečenje oboljenja već pružanje olakšanja.

[0043] Izraz "adjuvantni tretman" kao što se upotrebljava ovde u dokumentu odnosi se na tretman koji se daje kao dodatak primarnom, glavnom ili početnom tretmanu.

[0044] Izraz "neoadjuvantni tretman" kao što se upotrebljava ovde u dokumentu odnosi se na tretman koji se daje pre glavnog tretmana, sa ciljem da se smanji veličina ili obim tumora, čime se smanjuju posledice tehnika opsežnijeg tretmana koji bi bio potreban ako tumor nije smanjen veličinom ili obimom.

[0045] Izraz "simultane, odvojene ili sekvencijalne primene" u ovom dokumentu se odnose na primenu prvog i drugog bloka u isto vreme ili na takav način da će dva jedinjenja delovati u telu pacijenta u isto vreme ili primena jednog jedinjenja posle drugog jedinjenja na takav način da pruže terapijski efekat. U nekim primenama pronalaska jedinjenja se uzimaju uz obrok. U drugim primenama pronalaska, jedinjenja se uzimaju nakon obroka, kao što su terapija 30 minuta ili 60 minuta nakon obroka. U nekim primenama pronalaska, jedno jedinjenje se daje pacijentu u određenom vremenskom periodu praćeno davanjem drugog jedinjenja.

[0046] Kao što se upotrebljava ovde u dokumentu, izraz "subjekat" i "pacijent" upotrebljavaju se sa istim značenjem. Izraz "subjekat" i "pacijent" odnosi se na životinju (na primer pticu kao što je pile, prepelica ili ćurka ili sisara), posebno "sisar" uključujući ne-primate (na primer, krava, prase, konj, ovca, zec, morsko prase, pacov, mačka, pas i miš) i primate (na primer, majmun, šimpanza i čovek), a naročito čovek. U jednoj primeni pronalaska, subjekat je čovek.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0047] Sada je neočekivano otkriveno da specifični derivat korteksolona, naime, njegov 17.alfa.-valerat, ima terapeutski interesantna anti-tumorska svojstva: protiv izvesnih tumora, kao što je ovde definisano. Prema opštem konceptu, pronalazak je predstavljen jedinjenjem korteksolon 17.alfa.-valerata (videti prethodno navedene formule) za upotrebu u lečenju karcinoma prostate, karcinoma dojke, karcinoma pankreasa, karcinoma pluća, karcinoma gastrointestinalnog trakta, kancera bubrega, karcinoma štitne žlezde, karcinoma materice ili nadbubrežne žlezde, i pri čemu je karcinom prostate rezistentan na terapiju usmerenu protiv androgena.

[0048] Osim ako nije drugačije naznačeno, svi tautomerni oblici jedinjenja predmetnog pronalaska su u okviru opsega predmetnog pronalaska.

[0049] Pored toga, ako nije drugačije naznačeno, strukture prikazane ovde u dokumenu takođe treba da uključe jedinjenja koja se razlikuju samo u prisustvu jednog ili više izotopski obogaćenih atoma. Na primer, jedinjenja koja imaju prisutne strukture osim za vodonik zamenjen deuterijumom ili tritijumom, ili ugljenik zamenjen<13>C- ili<14>C-

1

obogaćenim ugljenikom su u okviru opsega predmetnog pronalaska. Ovakva jedinjenja su upotrebljena, na primer kao analitičke alatke ili kao sonde u biološkim testovima. Ovakva jedinjenja, posebno deuterijum analogna, mogu takođe biti terapeutski korisna.

[0050] Jedinjenja koja se pominju u ovom dokumentu su ovde definisana svojim hemijskim strukturama i/ili hemijskim nazivima. Hemijska struktura je određena identitetom jedinjenja i gde jedinjenje odgovara i hemijskoj strukturi i hemijskom nazivu, i gde je hemijski sukob između strukture i naziva.

Farmaceutski prihvatljive soli, solvati, klatrati, prolekovi i drugi derivati

[0051] Jedinjenja opisana ovde u dokumentu mogu da postoje u slobodnom obliku, ili, gde odgovara, kao soli. Ove soli koje su farmaceutski prihvatljive su od određenog interesa jer su korisne za primenu jedinjenja opisanih dole u dokumentu, u medicinske svrhe. Soli koje nisu farmaceutski prihvatljive su korisne u procesima proizvodnje, za izolaciju i u svrhe prečišćavanja, i u nekim slučajevima, za upotrebu u razdvajanju stereoizomernih oblika jedinjenja predmetnog pronalaska ili repromaterijala istih.

[0052] Kao što se upotrebljava ovde u dokumentu, izraz "farmaceutski prihvatljive soli" odnosi se na soli jedinjenja koja su, u okviru medicinske procene, pogodne za upotrebu u kontaktu sa ljudskim tkivima i manjih životinja bez sporednih efekata, kao što su, toksičnost, iritacije, alergijske reakcije i slično ili su srazmerne razumnom korisno/rizičnom odnosu.

[0053] Farmaceutski prihvatljive soli su dobro poznate u tehnici. Na primer, S. M. Berge i drugi, opisuju farmaceutski prihvatljive soli detaljno u J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19. Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja opisane ovde u dokumentu uključuju one izvedene iz pogodne neorganske ili organske kiseline i baze. Ove soli se mogu pripremiti na licu mesta tokom finalne izolacije i prečišćavanja jedinjenja. Treba biti jasno da predmetni opis uključuje smeše/kombinacije različitih farmaceutski prihvatljivih soli, kao i smeše/kombinacije jedinjenja u slobodnom obliku i farmaceutski prihvatljive soli.

[0054] Pored jedinjenja opisanih ovde u dokumentu, farmaceutski prihvatljivi solvati (na primer, hidrati) i klatrati ovih jedinjenja mogu takođe biti od koristii u kompozicijama za lečenje ili sprečavanje ovde identifikovanih poremećaja.

[0055] Kao što se upotrebljava ovde u dokumentu, izraz "farmaceutski prihvatljivi solvati", su solvati oblikovani iz asocijacije molekula jednog ili više farmaceutski prihvatljivog solvata za jedno od ovde u dokumentu opisanih jedinjenja. Izraz solvati uključuje hidrate (na primer hemihidrate, monohidrate, dihidrate, trihidrate, tetrahidrate i slične).

[0056] Kao što se upotrebljava ovde u dokumentu, izraz "hidrat" označava da jedinjenje opisano ovde ili njegove soli dalje uključuju stehiometrijsku ili ne-stehiometrijsku količinu vode vezanu nekovalentnom među-molekularnom silom.

[0057] Kao što se upotrebljava ovde u dokumentu, izraz "klatrat" označava jedinjenje opisano ovde ili njegove soli u obliku kristalne rešetke koja sadrži razmake (na primer kanale) koji imaju unutar sebe zarobljen gost-molekul (na primer rastvor ili vodu).

Medicinske upotrebe

[0058] Objekat predmetnog pronalaska je korteksolon 17α-valerat (takođe, ovde označen i kao "05" ili kao "CB-03-05"), predstavljen kao:

CB-03-05 (korteksolon 17α-valerat).

za upotrebu u lečenju prethodno pomenutih bolesti koje se pominju prethodno u tekstu, a takođe i u patentnim zahtevima.

[0059] U drugoj primeni prisutnog pronalaska su kompozicije i farmaceutske kompozicije koje sadrže korteksolon 17.alfa.-valerat za upotrebu kao medikament u lečenju bolesti koje se pominju prethodno u tekstu, a takođe i u patentnim zahtevima.

[0060] U poželjnoj primeni predmetnog pronalaska otkrivenog ovde u dokumentu, tumorska oboljenja su kancer prostate. U poželjnoj primeni predmetnog pronalaska otkrivenog ovde u dokumentu, kancer prostate je adenokarcinom. U poželjnoj primeni predmetnog pronalaska otkrivenog ovde u dokumentu, tumorska oboljenja su kancer prostate sa odsutnom ili smanjenom ekspresijom AR. U drugoj poželjnoj primeni predmetnog pronalaska, tumorska oboljenja su kancer prostate sa mutiranim ili skraćenim androgen receptorima.

[0061] U idealnim uslovima, Korteksolon 17α-Valerat (CB-03-05) je za upotrebu kao anti-tumorski agensi gde tumorska oboljenja su kancer prostate sa mutiranim ili skraćenim androgen receptorima. Prema pronalasku, Korteksolon 17α-Valerat (CB-03-05) je za upotrebu u terapiji karcinoma prostate, koji su ili su postali rezistentni na antiandrogeni tretman, kao što su enzalutamidi. Ovo je posebno povoljno, zato što je nedavno pronađeno da nakon 6 meseci 30% karcinoma prostate postane otporno na enzalutamide, jer je AR mutirao ili se promenio. Zanimljivo je da ove rezistentne ćelije kancera regulišu GR. Korteksolon 17α-Valerat (CB-03-05), može da se upotrebi za tretman takvih kancera jer je aktivnost ovih jedinjenja takođe posredovana kroz GR.

[0062] U poželjnoj primeni predmetnog pronalaska otkrivenog u ovom dokumentu, egzokrini karcinom pankreasa je adenokarcinom. U poželjnoj primeni pronalaska, egzokrini kancer pankreasa je kancer sa odsustvom ili smanjenom ekspresijom AR-a.

[0063] U poželjnoj primeni predmetnog pronalaska otkrivenog u ovom dokumentu, pomenuti epitelni tumor je karcinom gastoinestinalnog trakta (po mogućstvu karcinom develog creva).

[0064] U još poželjnijoj primeni predmetnog pronalaska otkrivenog u ovom dokumentu, pomenuti epitelni tumor je karcinom dojke (po mogućstvu trostruko negativan karcinom dojke). Opciono, subjekat ili pacijent ne reaguje na lečenje ili ju vraćen na konvencionalnu terapiju.

[0065] U poželjnoj primeni predmetnog pronalaska otkrivenog u ovom dokumentu, tumorska oboljenja su kancer prostate sa mutiranom, odsutnom ili smanjenom ekspresijom AR-a.

[0066] U poželjnoj primeni predmetnog pronalaska otkrivenog u ovom dokumentu, egzokrini karcinom pankreasa je adenokarcinom. U poželjnoj primeni pronalaska, egzokrini kancer pankreasa sa odsutnom ili smanjenom ekspresijom AR-a.

[0067] Po mogućstvu, pomenuti subjekat je sisar. Po mogućstvu, pomenuti sisar je čovek.

[0068] Ilustracija farmakoloških svojstava jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se pronaći u ovom dokumentu u eksperimentalnom odeljku.

[0069] Korteksolon 17α-valerat (CB-03-05) može se pripremiti metodom opisanom u primeru 11.

Farmaceutske kompozicije

1

[0070] Jedinjenja opisana ovde u dokumentu mogu biti formulisana u farmaceutske kompozicije koje dalje obuhvataju farmaceutski prihvatljivi nosilac aktivne komponente, razblaživač, adjuvant ili nosač. U jednoj primeni, prisutni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži korteksolon 17.alfa.-valerat za upotrebu u lečenju koje su specifično navedene prethodno u tekstu, kao i u patentnim zahtevima, kao i farmaceutski prihvatljivog nosača, razblaživača, adjuvanta i vehikuluma. U konkretnoj primeni pronalaska, farmaceutska kompozicija sadrži efikasnu količinu ovog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i farmaceutski prihvatljivog nosača, razblaživača, adjuvanta ili vehikuluma. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju na primer, farmaceutski razblaživač, ekscipijent ili nosač, prikladno izabran u odnosu na planirani obrazac za primenu, i u skladu sa konvencionalnom farmaceutskom praksom.

[0071] Prema najpoželjnijoj primeni pronalaska, pomenuta farmaceutska kompozicija za prethodno pomenute upotrebe obuhvata, kao aktivni sastojak, korteksolon 17α-valerat (CB-03-05) u asocijaciji sa najmanje jednim fiziološki prihvatljivim ekscipijentom.

[0072] U poželjnom, ovde prikazanom primeru izvođenja prema pronalasku, karcinom prostate, kao što je definisano u patentnim zahtevima i karcinom pankreasa, više po mogućstvu egzokrini karcinom pankreasa ili karcinom dojke, kao što je, trostuko negativan kancer dojke. U drugoj poželjnoj primeni pronalaska, tumorska oboljenja su kancer prostate sa mutiranim ili skraćenim androgenim receptorima. Idealne su farmaceutske ompozicije koje sadrže Korteksolon 17α-Valerat (CB-03-05), za upotrebu kao anti-tumorski agens gde su tumorska oboljenja kancer prostate sa mutiranim ili skraćenim androgen receptorima. U ovom maniru, kancer prostate koji se leči prema predmetnom pronalasku rezistentan je, ili je postao rezistentan na ciljanu terapiju protiv androgena, kao što je enzalutamid.

[0073] Farmaceutske kompozicije za upotrebu prema predmetnom pronalasku mogu biti u čvrstom obliku, kao što su, na primer, prah, dehidrirani prah, granule, kaplete, tablete ili kapsule.Takođe, mogu se dodati, po želji, određeni zaslađivači, ukusi ili agensi bojenja. Aktivno jedinjenje može takođe biti u mikroenkapsulacijskom obliku sa jednim ili više ekscipijenta. Doze čvrstih oblika tablete, kapsule, pilule, i granule su mogu pripremiti premazima i ljuskama kao što su enterični premazi i drugi premazi dobro poznati u farmaceutskoj tehnici oblikovanja. Odgovarajući ekscipijenti za čvrste farmaceutske kompozicije mogu biti izabrani, bez ograničenja, među kategorijama poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, kao što su absorbenti, fileri, surfaktanti, pomoćna sredstva kompresije, vezioci, lubrikanti, dezintegranti, rastvarači, disgreganti, agensi za pospešivanje protoka, agensi sušenja smrzavanjem, glidanti, pomoćna sredstva liofilizacije, agensi za formiranje filma, boje, antioksidansi, i slično. Kao primer, pogodni ekscipijenti za čvrste farmaceutske kompozicije mogu biti izabrani, na način koji ne ograničava, iz kalcijum fosfata, magnezijum stearata, talka, ugljenih hidrata, mlečnog šećera, dekstrina, skroba, želatina, celuloza i njihovih derivata, polivinilpirolidona, agensa premazivanja, boja i voska. Bilo koja smeša ovih ekscipijenata može se pravilno upotrebiti prema predmetnom pronalasku.

[0074] Prema predmetnom pronalasku, čvrste farmaceutske kompozicije kao što su tablete, granule, kaplete, kapsule , i slično , mogu biti oblikovane kao odmah-oslobođeni oblici ili kao odloženo-oslobođeni oblici ili kao kontrolisanog oslobađanja ili kao proširenog oslobađanja ili kao produženog oslobađanja oblici, i pogodne su za primenu oralnim, ili podjezičnim putem ili kao implant.

[0075] Kontrolisana, proširena ili produžena kompozicija može biti pripremljena prema svim konvencionalnim metodama ili sistemima, na primer prema dokumentu WO00/76478.

[0076] Farmaceutske kompozicije za upotrebu prema pronalasku mogu biti u tečnom obliku, na primer, rastvori, emulzije, suspenzije ili sirupi. Doze tečnih oblika za oralnu primenu uključuju, ali nisu ograničene na, farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe i eliksire. Doze tečnih oblika u dodatku aktivnom jedinjenju, Pored aktivnog jedinjenja, tečni oblici doziranja mogu sadržati inertne razblaživače koji se obično upotrebljavaju u tehnici. Pored inertnih razblaživača, oralne kompozicije mogu takođe uključivati i adjuvante ko što su agensi vlaženja, agensi za emulziranje i suspendovanje, zaslađivači, ukusi i agensi mirisa. Odgovarajući ekscipijenti za tečnu farmaceutsku kompoziciju mogu biti izabrani, bez ograničenja, među kategorijama koje su dobro poznate stručnjacima iz ove oblasti, kao što su rastvarači, ko-rastvarači, nauljeni nosači, agensi puferovanja, surfaktanti, emulzicioni agensi, agensi za povećanje rastvorljivosti, agensi za suspendovanje, agensi za rastvaranje, helatni agensi, agensi kiselosti, alkalizovani agensi, antioksidansi, prezervativi, osmotski agensi, tonični agensi, agensi za kontrolisanje viskoznosti i slično. Na primer, pogodni farmaceutski ekscipijenti za tečne pripreme mogu biti izabrani iz vode za injekcije, organskih rastvora ili korastvora kao što su etanol, glikol ili glicerol i njihove smeše, prirodnih ulja kao što su sojino ulje, srednji lanac triglicerida, polioksol 15-hidroksistearata, polisorbata 80, polioksil 35-ricinusovog ulja, natrijum hlorida, natrijum fosfata, kalijum fosfata, i slično. Prema predmetnom pronalasku, pomenute tečne kompozicije mogu biti sterilne ili ne-sterilne. U jednoj primeni pronalaska, tečne farmaceutske kompozicije su terminalno sterilisane uz pomoć tehnika

1

dobro poznatih stručnjacima iz ove oblasti, kao što su suva topla sterilizacija, vlažna topla sterilizacija, gama radijacija, sterilizacija e-snopom i slično. U drugoj primeni pronalaska, tečne farmaceutske kompozicije su sterilisane sterilnom filtracijom i aseptičnim punjenjem u konačnim kontejnerima za primarno pakovanje. Tečne farmaceutske kompozicije za upotrebu prema predmetnom pronalasku, otkriveno ovde u dokumentu, mogu se upotrebiti injekcijama, infuzijama ili perfuzijama kao što su intravenozna, intramuskularna, intraperitonealna, subkutana ili intratumoralna primena.

Metode primene

[0077] Jedinjenje i kompozicije opisane ovde u dokumentu mogu se primeniti oralno, parenteralno, inhalacijom, sprejem, topično, rektalno, nazalno, vaginalno ili preko implatiranih rezervoara. Izraz "parenteralno" kao što se upotrebljava ovde u dokumentu, uključuje, ali nije ograničeno na, subkutane, intravenozne, intramuskularne, intraartikularne, intra-sinovalne, intrastemalne, intratekalne, intrahepatične, intralezionalne, i intrakranialne injekcije ili infuzione tehnike.

[0078] Preparacije za injeciranje, na primer, sterilne, injekcione vodene ili uljane suspenzije mogu se oblikovati prema poznatim u tehnici potrebama odgovarajućih disperzionih ili vlažnih agensa i agensa za suspendovanje. Sterilna injekciona priprema može biti takođe sterilni injekcioni rastvor, suspenzija ili emulzija u netoksičnom parenteralnom prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču. Injekcione formulacije mogu biti sterilisane, na primer, filtracijom kroz filter za zadržavanje bakterija, ili uključujući sterilišuće agense u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje mogu biti rastvorene ili raspšene u sterilnoj vodi ili drugim sterilnim injekcionim posrednicima za upotrebnu tehniku.

[0079] Sterilni injekcioni oblici jedinjenja i kompozicija opisanih ovde u dokumentu, mogu biti vodene ili uljane suspenzije. Ove suspenzije mogu biti oblikovane prema tehnikama poznatim u struci upotrebom odgovarajućih disperzionih agensa zaslađivanja i agensa za suspendovanje. Sterilna injekciona priprema može takođe biti sterini injekcioni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parenteralno-prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču.

[0080] Jedinjenje za upotrebu u postupcima prema pronalasku mogu se formulisati u obliku jedinice doze. Izraz "oblik jedinice doze" odnosi se na pogodne kao uniitarne doze fizički zasebne jedinice za subjekat kome se pruža pomoć, za svaku jedinicu koja sadrži prethodno utvrđenu količinu aktivnog materijala izračunatog da proizvodi željeni

1

terapijski efekat, opciono u saradnji sa pogodnim farmaceutskim nosiocem aktivne komponente. Oblik jedinice doze može biti u obliku pojedinačne dnevne doze ili jedne ili više dnevnih doza (na primer, oko 1 do 4 ili više puta dnevno). Kada se upotrebljavaju višestruke dnevne doze, oblik jedinice doze može biti isti ili različit za svaku dozu pojedinačno.

[0081] Prema predmetnom pronalasku, korteksolon 17.alfa.-valerat ili farmaceutske kompozicije koje ga sadrže, poželjno su za primenu intravenskom injekcijom, još poželjnije kroz infuzionu torbu ili iglu ili kateter pumpu, ili intramuskularnom injekcijom, ili subkutano injekcijom, ili oralnim putem u obliku tableta ili kapsula.

[0082] Prema konkretnoj primeni pronalaska, pomenuta farmaceutska kompozicija je tečni oblik i pogodna je za injekciju i obuhvata korteksolon 17.alfa.-valerat u količini u iznosu koja se kreće od 0.1% do 50.0% težine po zapremini (tež./zap.), po mogućstvu od 0.25% do 25% tež./zap., još više po mogućstvu od 0.5% do 10% tež./zap., najviše po mogućstvu od 1% do 5% tež./zap.

[0083] Prema drugoj primeni pronalaska, pomenuta farrmaceutska kompozicija je u čvrstom obliku i obuhvata korteksolon 17.alfa.-valerat u količini koja se kreće od 0.1% do 50% težine po težini (tež./tež.), po mogućstvu od 0.5% do 40% tež./tež., još više po mogućstvu od 1% do 30% tež./tež.

[0084] Količina korteksolon 17.alfa.-valerata u pomenutoj farmaceutskoj kompoziciji je takva da nivo efikasnog doziranja može da se dobije primenom na sisara koji pati od stanja koja su specifično navedena prethodno u tekstu, kao i u patentnim zahtevima. Korteksolon 17.alfa.-valerat i farmaceutska kompozicija koja ga sadrži kao antitumorski aktivni sastojak za upotrebu u kurativnom ili adjuvantnom ili neoadjuvantnom ili palijativnom tretmanu bolesti koje su specifično navedena prethodno u tekstu, kao i u patentnim zahtevima, uključujući maligne neoplazije i metastaze, po mogućstvu za primenu na sisara, pri čemu je pomenuti sisar čovek ili životinja, po mogućstvu čovek.

Kombinovana terapija

[0085] Prema drugoj primeni pronalaska, jedinjenja, kompozicije i farmaceutske kompozicije mogu sadržati najmanje drugi aktivni sastojak, po mogućstvu hemoterapeutski aktivni sastojak, kao kombinacija za simultanu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu.

[0086] U konkretnim primenama pronalaska, korteksolon 17.alfa.-valerat i farmaceutska kompozicija koja sadrži korteksolon 17.alfa.-valerat i najmanje jedan fiziološki prihvatljiv

1

ekscipijent prema predmetnom pronalasku mogu biti upotrebljeni u kombinovanoj terapiji sa najmanje jednim drugim lekom, posebno sa hemoterapeutskim lekom. U konkretnim primenama pronalaska, korteksolon 17.alfa.-valerat može se primeniti istovremeno sa primenom drugog leka, posebno sa hemoterapeutskim lekom. U konkretnim primenama pronalaska, korteksolon 17.alfa.-valerat može se primeniti ranije ili naknadno od primene drugog leka, posebno hemoterapeutskog leka. Pomenuti najmanje jedan drugi lek, posebno hemoterapeutski lek, može biti efektivan za lečenje istog ili različitog oboljenja, poremećaja, ili stanja. Metodi koji su ovde opisani mogu da uključuju primenu korteksolon 17.alfa.-valerata ili farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedan drugi lek, po mogućstvu hemoterapeutski lek, obezbeđuju da kombinovana primena ne inhibira terapeutsku efikasnost jednog ili više jedinjenja prisutnog pronalaska i/ili ne proizvodi nepovoljno neprihvatljive kombinovane efekte.

Korteksolon 17α-valerat (ovde u dokumentu takođe označen kao "05" ili kao "CB-03-05")

[0087] Kao što je gore u dokumentu opisano, objekat prema predmetnom pronalasku je korteksolon 17α-valerat (ovde u dokumentu takođe označen kao "05" ili kao "CB-03-05"), predstavljen kao:

CB-03-05 (korteksolon 17α-valerat)

za upotrebu u lečenju stanja koja su specifično navedena prethodno u tekstu, kao i u patentnim zahtevima. U poželjnoj primeni pronalaska, tumorske bolesti su kancer prostate sa mutiranim ili skraćenim androgenim receptorima. Na ovaj način, kancer prostate koji može da se leči prema pronalasku, rezistentan je, ili je postao rezistentan na terapiju usmerenu protiv androgena, kao što je enzalutamid.

[0088] Prema još jednoj primeni, stanje je karcinom pankreasa, poželjno karcinom egzokrinog pankreasa.

1

[0089] Prema još jednoj primeni, stanje je karcinom dojke, poželjno trostruko negativni karcinom dojke (TNBC). U jednoj primeni, karcinom dojke je trostruko negativni karcinom dojke, a subjekt je u relapsu ili ne reaguje na konvencionalnu terapiju.

[0090] Prema još jednoj primeni, stanje je karcinom gastrointestinalnog trakta, kao što je karcinom debelog creva.

[0091] Prema drugom aspektu, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje sledeće strukturne formule:

i najmanje jedan fiziološki prihvatljiv ekscipijent za upotrebu kao medikament, u lečenju stanja koja su specifično navedena prethodno u tekstu, kao i u patentnim zahtevima.

[0092] U drugoj poželjnoj primeni pronalaska, tumorska oboljenja su kancer prostate sa mutiranim ili skraćenim androgenim receptorima. U ovom maniru, kancer prostate koji može biti tretiran prema pronalasku, rezistentan je ili je postao rezistentan na ciljanu terpiju protiv androgena, kao što je enzalutamid.

[0093] Prema drugoj primeni pronalaska, stanje je karcinom pankreasa, po mogućstvu karcinom egzokrinog pankreasa.

[0094] Prema drugoj primeni pronalaska, stanje je karcinom dojke, po mogućstvu trostruko negativan kancer dojke (TNBC). U konkretnoj primeni pronalaska, karcinom dojke je trostruko negativan kancer dojke i subjekat je u relapsu ili ne odgovara na konvencionalnu terapiju.

[0095] Prema drugoj primeni pronalaska, stanje je karcinom gastrointestinalnog trakta, kao što je karcinom debelog creva.

[0096] Farmaceutska kompozicija može takođe da obuhvata najmanje jedan drugi aktivni sastojak, po mogućstvu hemoterapeutski aktivni sastojak, za simultanu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu.

[0097] Po mogućstvu, subjekat je sisar. U idealnim uslovima, sisar je čovek.

PRIMERI

[0098] Od sledećih primera, primere prema predmetnom pronalasku čine samo oni koji

1

se odnose na, ili govore u prilog aktivnosti jedinjenja korteksolon 17.alfa.-valerat u lečenju stanja koja su specifično navedena u patentnim zahtevima.

Primer 1: in-vitro antitumorska aktivnost korteksolon 17α-benzoata (CB-03-06) na ćelijske linije kancera prostate

[0099] Eksperiment je izveden za testiranje i za definisanje antitumorskih aktivnosti in vitro Korteksolon 17α- benzoata na LNCaP (AR<+>) i PC3 (AR-), predstavnika linijskih ćelija kancera prostate sa androgenim receptorom (AR) pozitivne ili negativne ekspresije, odnosno. Eksperimentalni metod sastoji se od:

1. 3000 ćelija kancera je posejano na mikrotitar ploči sa 96 ležišta ravnog dna u kompletanom medijumu sadržavajući 2% ćumura izdvojenog goveđeg seruma. 2. Posle 24 časa, 10 nM DHT (dihidrotestosteron) sa ili bez anti-androgen jedinjenja, ili DMSO nosača (negativna kontrola) se dodaje kulturama.

3. Posle 3 dana, broj održivih ćelija je kvantifikovan upotrebom testa ATP-zavisne proliferacije.

[0100] Cij testa je utvrditi koncentraciju za koju svako jedinjenje ubija 50% ćelija kancera (IC50) u pogledu na potencijalnu primenu jedinjenja u in vivo životinjskom testu.

[0101] Podaci iz Eksperimenta 1 su otpremljeni kroz krivu odgovora sigmoidalne doze i analizirani upotrebom Prizma softvera za statističku analizu. Podaci iz Eksperimenta 2 su analizirani upotrebom nelinearne regresije najmanjih kvadrata krive uklopljeno u Prizma softver za statističku analizu.

[0102] IC50 vrednost nađena za svaku liniju je data u sledećoj tabeli, u odnosu na poznata poređenja najpotentnijeg anti-androgenog steroida, CPA, i Enzaltamida, oralnih androgen receptor inhibitora mogućnosti da prolongiraju opstanak u čoveku sa metastazom kastracija-otpornog kancera prostate trenutno upotrebljenog za lečenje kancera prostate. Rezultati iz dva kompletna eksperimenta slede.

Eksperiment 1

[0103] Rezultati otpremljeni kroz krivu odgovora sigmoidalne doze u Prizma softver za statističku analizu.

2

[0104] IC50 vrednost pokazuje da antitumorska aktivnost Korteksolon 17α-benzoata, čak iako sa slabim korelacijskim tj. uzajamno povezanim smerom, mogla bi se smatrati da nije striktno zavisna od ekspresije androgen receptora, što je različito kod uporednika.

Eksperiment 2

[0105] Rezultati ispod uključuju dodatne eksperimente za one iz Eksperimenta 1. Rezultati su analizirani upotrebom nelinearne regresije najmanjih kvadrata krive uklopljenih u Prizma softver za statističku analizu.

Primer 2: in-vitro antitumorska aktivnost korteksolon 17α-valerat-21-propionata (CB-03-10) na ćelijske linije kancera prostate

[0106] Eksperiment je izveden za testiranje i definisanje anti-tumorske aktivnosti in vitro korteksolona (CB-03-10) na LNCaP (AR<+>) i PC3 (AR-), predstavljanjem ćelijskih linija kancera prostate sa AR pozitivnom i negativnom ekspresijom, odnosno. Eksperimentalni metod se sastoji od:

1. 3000 ćelija kancera je posejano na mikrotitar ploči sa 96 ležišta sa ravnim dnom u kompletnom medijumu koji sadrži 2% uglja izdvojenog goveđeg seruma.

2. Posle 24 časa, 10 nM DHT-a (dihidrotestosterona) sa ili bez anti-androgenih jedinjenja, ili DMSO nosača (negativna kolona) se dodaje kulturama.

3. Posle 3 dana, broj održivih ćelija je kvantifikovan (određena je količina i obim) upotrebom testa ATP-zavisne proliferacije.

[0107] Cilj testa je da utvrdi koncentraciju koja za svako jedinjenje ubija 50% ćelija kancera (IC50) pregledom potencijalne primene jedinjenja in vivo u testu na životinjama.

[0108] Podaci iz Eksperimenta 1 otpremljeni su kroz krivu odgovora sigmoidalne doze i analizirani upotrebom Prizma softvera za statističku analizu.

[0109] Vrednost IC50 nađena za svaku liniju koja je data u tabeli, u odnosu na dobro poznata poređenja: najpotentnijeg anti-androgenog steroida, CPA, i enzalutamida, oralnih AR antagonista koji mogu da prolongiraju opstanak u čoveku sa metastazom kastracije-rezistentnog kancera prostate.

Eksperiment 1

[0110] Rezultati su otpremljeni kroz krivu odgovora sigmoidalne doze u Prizma softveru za statističku analizu.

Eksperiment 2

[0111] Rezultati ispod uključuju dodatne eksperimente za ove u Eksperimentu 1. Rezultati se analiziraju upotrebom nelinearne regresije najmanjih kvadrata krive uklopljenih u Prizma softver za statističku analizu.

[0112] Vrednosti IC50 pokazuju anti-tumorsku aktivnost korteksolon 17α-valert-21-propionata (CB-03-10) uzajamno povezanu sa androgen receptor ekspresijom u ćelijskim linijama.

Primer 3: in-vitro antitumorska aktivnost korteksolon 17α-benzoata (CB-03-06) na ćelijske linije kancera pankreasa

[0113] Eksperiment je izveden za testiranje i definisanje antitumorske aktivnosti in vitro jedinjenja korteksolon 17α- benzoata na ćelijske linije dva tumora pankreasa, Panc1 (AR<+>) i MiaPaca2 (AR nizak), predstavnika ćelijskih linija kancera pankreasa.

[0114] Linije se takođe mogu klasifikovati kao pozitivne (AR<+>) ili negativne/niske (AR<+/->) za prisutnost i ekspresiju androgen receptora.

[0115] Eksperimentalni metod se sastoji od:

1. 3000 ćelija je posejano na mikrotitar ploči sa 96 ležišta ravnog dna u kompletnom medijumu koji sadrži 2% uglja izdvojenog goveđeg seruma

2. Posle 24 časa, 10 nM DHT (dihidrotestosteron) sa ili bez anti-androgenih jedinjenja, ili DMSO nosača (negativna kontrola) se dodaje kulturama.

3. Posle 3 dana, broj vijabilnih ćelija je kvantifikovan upotrebom testa ATP-zavisne proliferacije.

[0116] Cilj testa je utvrđivanje koncentracija od kojih svako jedinjenje ubija 50% ćelija kancera (IC50) pregledom potencijalne primene jedinjenja in vivo u testu sa životinjama.

[0117] Podaci iz Eksperimenta 1 se otpremaju kroz krivu odgovora sigmoidalne doze i analiziraju upotrebom Prizma softvera za statističku analizu. Podaci iz Eksperimenta 2 se analiziraju upotrebom nelinearne regresije najmanjeg kvadrata krive uklopljene u Prizma softver za statističku analizu.

[0118] Vrednosti IC50 pronađene za svaku od linija prikazane su u sledećoj tabeli, u odnosu na dobro poznata poređenja najpotentnijeg anti-androgenog steroida, CPA i enzalutamida, potentnog oralnog AR antagonista.

Eksperiment 1

[0119] Rezultati su otpremljeni kroz krive odgovora sigmoidalne doze u Prizma softveru za statističku analizu.

Eksperiment 2

[0120] Rezultati ispod uključuju dodatne eksperimente na ove u Eksperimentu 1.

2

Rezultati su analiziirani upotrebom nelinearne regresije najmanjih kvadrata krive uklopljene u Prizma softver za statističku analizu.

[0121] Vrednosti IC50 prikazuju da su antitumorske aktivosti korteksolon 17α-benzoata najmanje duplo više nego aktivnosti uporednika (CPA i enzalutamida). Dok se MiaPaca2 karakteriše niskom/nultom AR ekspresijom, antikancer aktivnosti jedinjenja nisu direktno u korelaciji sa ekspresijom androgen receptora u ćelijskim linijama kancera.

Primer 4: in vitro antitumorska aktivnosti korteksolon 17α-valerat-21-propionata (CB-03-10) na ćelijske linije kancera pankreasa

[0122] Eksperiment je izveden za testiranje i definisanje antitumorske aktivnosti in vitro korteksolona (CB-03-10) na ćelijske linije predstavnika tumora pankreasa, naime Panc1 (AR<+>) i MiaPaca2 (AR niski) predstavnika ćelijskih linija kancera pankreasa.

[0123] Linije se takođe mogu klasifikovati kao pozitivne (AR<+>) ili negativne (AR<+/->) za prisustvo i ekspresiju androgenog receptora.

[0124] Eksperimentalni metod se sastoji od:

1. 3000 ćelija kancera je posejano na mikrotitar ploči sa 96 ležišta ravnog dna u kompletnom medijumu koji sadrži 2% uglja izdvojenog goveđeg seruma

2. Posle 24 časa, 10 nM DHT (dihidrotestosterona) sa ili bez anti-androgenih jedinjenja, ili DMSO nosaača (negativna kontrola) se dodaje kulturama.

3. Posle 3 dana, broj održivih broj ćelija je kvantifikovan upotrebom testa za ATP-zavisnu proliferaciju.

[0125] Cilj testa je utvrđivanje koncentracije svakog od jedinjenja, koja ubija 50% ćelija kancera (IC50) pregledom potencijalne primene jedinjenja in vivo u testiranju na životinjama.

[0126] Podaci iz Eksperimenta 1 su otpremljeni kroz krive odgovora sigmoidalne doze i analizirani upotrebom Prizma softvera za statističku analizu. Podaci iz Eksperimenta 2 su analizirani upotebom nelinearne regresije najmanjeg kvadrata krivine uklopljenih u Prizma softver za statističku analizu.

[0127] Vrednosti IC50 pronađene za svaku liniju su prikazane u sledećoj tabeli, poređeno sa dobro poznatim uporednicima: najpotentnijim anti-androgenim steroidom, CPA, i enzalutamidom, oralnim AR antagonistom.

Eksperiment 1

[0128] Rezultati su otpremljeni kroz krive odgovora sigmoidalne doze u Prizma softveru za statističku analizu.

Eksperiment 2

[0129] Rezultati ispod uključuju dodatne eksperimente za ove iz Eksperimenta 1. Rezultati su analizirani upotrebom nelinearne regresije najmanjeg kvadrata krive uklopljenih u Prizma softver za statističku analizu.

[0130] Vrednosti IC50 pokazuju da antitumorska aktivnost Korteksolon 17α-valerat-21-propionata (CB-03-10) nije u korelaciji sa ekspresijom androgen receptora na ćeljske linije kancera pankreasa.

Primer 5: in-vivo ksenograft humanog tumora pankreasa u miševima

2

[0131] Provera aktivnosti korteksolon 17α-benzoata (CB-03-06) na ksenograftu tumora pankreasa koji raste u ogoljenim muškim miševima je procenjen u poređenju sa najpotentnijim anti-androgenim stereoidom ciproteron acetatom (CPA).

[0132] Korteksolon 17α-benzoat i ciproteron acetat se zasebno rastvaraju u DMSO/2-hidroksipropil β-ciklodekstrinu (nosaču).

[0133] Test je izveden poređenjem antitumorske aktivnosti Korteksolon 17α-benzoata za dva različita doziranja (8.0 mg/kg, odgovara otprilike za 230 μM, i 40 mg/kg, odgovara otprilike za 1150 μM), naspram vehikuluma (odnosno 0.4% (zap./zap.) Tween 80 i 0.5% (tež./zap.) karboksimetilceluloze u normalnom slanom rastvoru) i naspram uporednog ciproteron acetata za dva različita doziranja (7.4 mg/kg i 37 mg/kg).

[0134] 1x10<6>MiaPaca-2 ćelije suspendovane u matigelu se ubrizgava subkutano injekcijom u 6 nedelja starim atimskim ogoljenim miševima.

[0135] Tretman testiranim jedinjenjima, sa nosiocem i sa uporednim jedinjenjem, inicira se nakon što veličina tumora dostigne 50 mm<3>posle transplantacije. Sva jedinjenja se ubrizgavaju injekcijom od 100 μl/mišu, za niže doze rastvora (prosečno 230 μM) ili 100 μl/mišu za više doze rastvora (prosečno 1150 μM) korteksolon 17α-benzoata, nosioca i ciproteron acetata, odnosno. Jedinjenja i kontrole se primenjuju ubrizgavanjem subkutano dnevno, 28 dana.

[0136] Tumori su mereni svakih 4 dana digitalnim nonijusom.

[0137] Rezultati su prikazani na Slici 1 kao prosečna promena veličine tumora u odnosu na početak tretmana. Veličina tumora je izračunata prema formuli 0.5236(r1)<2>(r2) gde je r1 > r2.

[0138] Trake sa greškama su SEM za 7-10 miševa po grupi za tretman. P vrednosti se izračunavaju prema Studentskim testovima.

[0139] Visoke doze korteksolon 17α-benzoata održavaju povećanje veličine tumora pankreasa manje od 5 puta od veličine tumora na početku tretmana. U suprotnom, prosečni tumor u nosaču, kao i u grupama tretiranim ciproteron acetatom je povećan do 12 puta. Iz ovih podataka očigledna je antitumorska aktivnost predmetnog pronalaska, korteksolon 17α-benzoata.

Primer 6 – in-vivo ksenograft humanog tumora pankreasa u miševima

[0140] Aktivnost korteksolona (CB-03-10) na ksenograft (ksenotransplant) modelu tumora pankreasa u ogoljenim muškim miševima proverava se u poređenju sa antiandrogenim steroidom ciproteron acetatom (CPA).

2

[0141] Korteksolon (CB-03-10) i ciproteron acetat su zasebno rastvoreni u DMSO/2-hidroksipropil β-ciklodekstrinu (nosaču).

[0142] Test je izvršen poređenjem anti-tumorske aktivnosti korteksolon 17α-valerat-21-propionata (CB-03-10) u dve različite doze (približno 8.6 mg/kg i 43 mg/kg) naspram nosača (odnosno 0.4% (zap./zap.) Tween 80 i 0.5% (tež./zap.) karboksimetilceluloze u normalnom slanom rastvoru) i naspram uporednog ciproteron acetata za dva različita doziranja (7.4 mg/kg i 37 mg/kg).

[0143] 1 x 10<6>MiaPaca-2 ćelija suspendovano u matrigelu se ubrizgava subkutano injekcijom u 6 nedelja starim atimskim ogoljenim miševima.

[0144] Tretman sa testiranim jedinjenjem, sa nosačem i sa uporednim jedinjenjem pokrenut je pošto je tumor dostigao veličinu od 50 mm<3>nakon implantacije, injekcijskim ubrizgavanjem 100 μl/mišu za nižu dozu rastvora (približno 230 μM) ili 100 μE/mišu više doze rastvora (približno 1150 μM) korteksolona (CB-03-10), vehikuluma i ciproteron acetata, redom. Jedinjenja i kontrole se primenjuju ubrizgavanjem subkutano dnevno, 28 dana.

[0145] Tumori su mereni svaka 4 dana sa digitalnim nonijusom.

[0146] Rezultati su prikazani na Slici 2 kao prosečna promena veličine tumora u odnosu na početak tretmana. Veličina tumora je izračunata prema formuli 0.5236(r1)<2>(r2) gde je r1 < r2.

[0147] Trake s greškama su SEM za 7-10 miševa po grupi za tretman. P vrednosti su izračunate prema Studentskom testu.

[0148] Visoke doze Korteksolona (CB-03-10) održavaju veličinu tumora pankreasa manju 5- puta od tumora na početku tretmana. Štaviše, kada je zaustavljen tretman, veličina tumora je sklona ponovnom rastu, ali sa manjom stopom i rastom. U suprotnom, prosečni tumor u nosaču i u ciproteron acetat tretmanu grupa povećane veličine do 12-puta i više, dovodi do potrebe za prikrivanjem nekih od životinja iz tih grupa iz etičkih razloga. Iz ovih podataka, očigledna je antitumorska aktivnost jedinjenja prema predmetnom pronalasku, korteksolona (CB-03-10).

[0149] Iz podataka Primera 5 i 6, in vivo antitumorske aktivnosti korteksolon 17αbenzoata i korteksolona (CB-03-10) in vivo protiv tumora pankreasa potvrđeno je, i u oba jedinjenja imaju antitumorsku aktivnost veću nego ciproteron acetat u istom modelu životinje (videti Sliku 3).

Primer 7: in-vitro terapeutski indeks na ćelijskim linijama kancera pankreasa

2

[0150] Kako bi se procenila sigurnost jedinjenja koja će biti testirana u eksperimentima održivosti ćelijskih linija, treba uzeti u obzir sve faktore koji utiču na opstanak ćelija i održivost. U tom smislu, ocena unutrašnje toksičnosti jedinjenja i uporednika je veoma važna. Odnos IC50 jedinjenja na periferne mononuklearne ćelije krvi (PBMC) i IC50 na ćelijske linije kancera, čini terapeutski indeks i pokazuje koje je najsigurnije jedinjenje za testiranje.

[0151] IC50 vrednosti su testirane u PBMC ćelijama za 2 različita statusa aktivacije:

stimulisane – ćelije koje se aktivno dele

u mirovanju – mirujuće ćelije koje se ne dele

[0152] U tabelama ispod prikazani su rezultati, redom, za stimulisane PBMC ćelije i PBMC ćelije u mirovanju: IC50 (mikroM) na stimulisanim PBMC ćelijama

Eksperiment 1

[0153]

Eksperiment 2

[0154]

2

[0155] Paralelno sa istim eksperimentom se ponavlja na odmarajućem PBMC-u za dobijanje rezultata ispod.

IC50 (mikroM) na odmarajući PBMC

Eksperiment 1

[0156]

Eksperiment 2

[0157]

[0158] Rezultirajući terapeutski indeks (TI) izračunat na stimulisanom PBMC-u prikazan je u tabeli ispod:

TI na stimulisani PBMC

Eksperiment 1

[0159]

2

Eksperiment 2

[0160]

i rezultirajući terapeutski indeks izračunava se na odmarajućem (preko noći) PBMC-u i prikazan je u tabeli ispod:

TI na odmarajući PBMC

Eksperiment 1

[0161]

Eksperiment 2

[0162]

[0163] U tabelama, vrednost 0 označava višu toksičnost u PBMC-u nego u ćelijskim linijama kancera

Primer 8: in-vitro antitumorska aktivnosti korteksolon 17α-benzoata i korteksolona (CB- 03-10) na ćelijskim linijama epitelnog intestinalnog kancera

[0164] Eksperiment je izveden za testiranje i definisanje antikancerske aktivnosti in vitro korteksolon 17α-benzoata i korteksolon 17α-valerat-21-propionata na ćelijskim linijama predstavnika epitelnih intestinalnih tumora, to jest HT29. Eksperimentalni metod se sastoji od:

1. Jednoslojne HT-29 ćelije presvučene tankim slojem metala u: 96-ležišta na mikrotitar ploči u gustini od 2 x 10<4>ćelije/ml. Presvučene ćelije su sačuvane na 37°C u 5% CO2 i ostavljene da očvrsnu za 24 časa.

2. Nakon toga se ćelije inkubiraju za 72 časa sa test jedinjenjima u koncentracijama od 0.16, 0.8, 4, 20, 100 i 500 mM.

3. Posle 72 časa tretmana, izvodi se MTT kolorimetrijski test.

[0165] Cilj testa je utvrđivanje koncentracije na kojoj svako jedinjenje ubija 50% ćelija kancera (IC50) prikazom potencijalne primene jedinjenja in vivo u testu na životinjama.

[0166] Podaci se analiziraju upotrebom nelinearne regresije najmanjeg kvadrata krive uklopljenih u Prizma softver za statističku analizu.

[0167] Vrednost IC50 nađena za svaku liniju je data u sledećoj tabeli.

[0168] Inhibicija (%) u različitim mikromolarnim koncentracijama za dva proizvoda na HT29

1

[0169] Vrednosti IC50 izračunate za dva proizvoda (date ovde ispod) prikazuju da oba jedinjenja pokazuju evidentne antikancer aktivnosti – na HT29.

IC50 izračunate (mikromolarnom koncentracijom)

Primer 9: in-vitro terapeutski indeks na ćelijskim linijama epitelnog intestinalnog kancera

[0170] Kako bi se procenila sigurnost jedinjenja koja će biti testirana u ćelijskim linijama održivosti eksperimenata, sve faktore koji utiču na opstanak i održivost ćelije treba uzeti u obzir. U tom smislu, procena unutrašnje toksičnosti jedinjenja i uporednika je zaista veoma bitna. Odnos između IC50 jedinjenja na PBMC-u i IC50 na ćelijskim linijama kancera konstruišu terapeutski indeks, važan parametar za definisanje efikasnosti proizvoda u sigurnim uslovima. [0171] IC50 u PBMC-ima testirani su u 2 različita aktivaciona statusa:

Stimulisani – aktivnim deljenjem ćelija

Odmarajući – u mirnom stanju, koji ne dele ćelije

[0172] Rezultirajući terapeutski indeksi (TI) izračunati na Stimulisanom i Odmarajućem PBMC-u prikazani su u sledećim tabelama:

Eksperiment 1

[0173]

Eksperiment 2

[0174]

2

[0175] Iz ovih podataka potvrđena je anti-tumorska aktivnost i sigurnost jedinjenja prisutnog pronalaska, korteksolon 17α-valerat-21-propionata, protiv ćelija epitelnog intestinalnog kancera.

Primer 10 – Sinteza korteksolon 17α-benzoata

[0176] Korteksolon 17α-benzoat je pripremljen prema šemi sinteze, uključujući sledeće korake:

[0177] U Koraku 1 korteksolon se rastvara u odgovarajućem slanom rastvoru (na primer, etil acetatu). Piridinijum tosilat ili p-toluen sulfonska kiselina se dodaje u katalitičkoj količini (1-10 % mol-a) praćeno sa tri-alkil ortobenzoatom (R = metal ili R = etil). Reakciona smeša se zagreva do 80°C za 3 do 6 časova.

[0178] Nakon uklanjanja rastvora i kristalizacije u alkoholnom rastvoru, korteksolon ortobenzoat 1 je dobijen kao čvsta supstanca.

[0179] U Koraku 2, korteksolon ortobenzoat 1 (R = metal ili R = etil) se rastvara u alkoholnom rastvaraču (na primer, metanolu) i tretira sa 0.1N acetatnog pufera u refluksu. Nakon uklanjanja rastvora, reziduum se pročišćava tretmanom sa demi-vodom i korteksolon-17-α-benzoat je oporavljen kao čvrsta supstanca.

Primer 11 - Sinteza Korteksolona (CB-03-10) (3) i Korteksolon 17α-Valerata (CB-03-05) (2)

[0180] Korteksolon 17α-valerat-21-propionat (CB-03-10) se priprema prema sledećoj sintetičkoj šemi:

Korak 1: Korteksolon se rastvara u odgovarajućem slanom rastvoru (na primer, etil acetatu). Piridinijum tosilat ili p-toluen sulfonska kiselina su dodaju u katalitičkom iznosu (1-10 % mol-a), praćeno tri-alkil ortovaleratom (R = metil ili R = etil). Reakciona smeša se zagreva do 80°C za 3-5 časova i, posle uklanjanja rastvora i kristalizacije u alkoholnom rastvoru, dobija se korteksolon ortovalerat 1. U Koraku 2, korteksolon ortovalerat 1 (R = metil ili R = etil) se rastvara u alkoholnom rastvoru (na primer, metanolu) i tretira se sa 0.1N sirćetnog pufera (pH 3 do 3.9) u refluksu. Nakon uklanjanja rastvora praćeno tretmanom sa pročišćenom vodom, korteksolon-17α-valerat 2 je oporavljen kao čvrsta supstanca.

U Koraku 3, korteksolon-17α-valerat 2 se rastvara u piridinu i dodaje sa 1 ekvivalent propionil hlorida. Kada je konverzija kompletna, smeša se razblaži sa vodom, i proizvod 3 se oporavi kao čvrsta supstanca i prečišćava kristalizacijom sa alkoholima.

Primer 12 – Analiza in vitro anti-kancerske aktivnosti jedinjenja izvedenog iz korteksolona CB-03-10

4

[0181] Testirana je sposobnost CB-03-10 za inhibiranje rasta ćelijskih linija kancera uspostavljenih in vitro.

[0182] Ćelijske linije kancera pri gustini od 3000 ćelija su posejane na mikrotitar ploči u 96-ležišta ravnog dna u kompletnom medijumumu koji sadrži 2% uglja izdvojenog goveđeg seruma. Nakon 24 časa dodaju se testirana jedinjenja ili DMSO/nosač (0.1% konačne koncentracije kao negativna kontrola). CPA ili enzalutamid, dva potentna prepoznata anti-androgena su upotrebljena kao pozitivna kontrola za citotoksičnost ćelija. Nakon 3 dana, broj održivih ćelija se kvantifikuje upotrebom testa ATP-zavisne održivosti ćelija (Promega Cell Titer Glo). Na Slici 5 je prikazana doza titracije citotoksične aktivnosti korteksolon izvedenih jedinjenja na čoveka i ćelijske linije pankreasa.

[0183] Određivanje koncentracije na kojoj svako jedinjenje ubija 50% ćelija kancera (IC50) prikazana je da iskaže sposobnost CB-03-10 i drugih jedinjenja da inhibiraju rast ćelija kancera. Svako jedinjenje se titrira od 3 uM do 200 uM. Nakon 3 dana, broj održivih ćelija se kvantifikuje upotrebom testa ATP-zavisne proliferacije. Podaci prikazani u Tabeli I se analiziraju nelinearanom regresijom najmanje jednog kvadrata krive uklopljeno u Prizma statistički softver.

CB-03-04

CB-03-03

[0184] Po podacima prikazanim na Slici 5 i Tabeli I jasno je da korteksolon izvedena jedinjenja ubijaju ćelije kancera u različitim koncetracijama i IC50. CB-03-10 ubija ćelije kancera prostate (tabela a) bolje nego potentni anti-androgen CPA. Još važnije je da CB-03-10 inhibira in vitro rast ćelija kancera prostate bolje nego enzalutamid, kao novi i potentni anti-androgen lek koji se trenutno upotrebljava na klinici kao prvi izbor za androgen zavisne kancere prostate.

[0185] Zanimljivo je da CB-03-10 inhibira rast brzo rastućih ćelijskih linija u pankreasu (tabela b) poznatih za ekspresiju androgen receptora (AR) veoma niskih nivoa. Ovi podaci ukazuju da je mehanizam akcije koji se odnosi na citotoksičnost, anti-androgena aktivnost.

Primer 13 – Analiza ekspresije androgenog receptor na testiranim ćelijskim linijama kancera

[0186] FACS testovi su prikazani na testiranim ćelijskim linijama prostate i pankreasa u Tabeli I za bolje razumevanje odnosa između AR ekspresije na ćelijskim linijama kancera i mogućnosti CB-03-10 za inhibiranje rasta ćelija kancera.

[0187] Slika 6 prikazuje nivo AR ekspresije na testiranim ćelijama kancera. Kao što je očekivano, FACS analize AR ekspresije u ćelijskim linijama prostate i pankreasa su konzistentni sa objavljenim nivoima ekspresije: LNCaP > Panc1 > PC3 = MiaPaca2.

[0188] Za bolje objašnjenje korelacije između AR i IC50 Tabela I se implementira dodavanjem AR ekspresije testiranih ćelijskih linija kancera (Tabela II)

[0189] Tabela II. AR ekspresija ćelijskih linija kancera prostate i pankreasa i IC50 jedinjenja izvedenih iz korteksolona

[0190] Kao što se očekuje inhibicija rasta prikazana je potentnim anti-androgenom CPA i enzalutamidom u korelaciji su sa AR ekspresijom ćelija kancera prostate. Inhibitorske aktivnosti CB-03-10, takođe su u korelaciji (strogo manje) sa AR ekspresijom u ćelijama kancera prostate. Međutim, postoji jedna kontra korelacija između AR ekspresije i inhibitorne aktivnosti u ćelijama kancera pankreasa. Sva testirana jedinjenja su aktivnija u donjoj AR ekspresiji MiaPaca2 (AR+/-) u poređenju sa Panc1 ćelijama (AR ). Ovi rezultati nagoveštavaju moguće AR-nezavisne mehanizme akcije u kanceru pankreasa. CB-03-10 je jedan od najpotentnijih jedinjenja u seriji. CB-03-10 je znatno potentniji od enzalutamida u ćelijskim linjama kancera prostate.

Primer 14 – Analize in vitro anti-kancerske aktivnosti jedinjenja izvedenih iz korteksolona, posebno CB-03-10, na većem uzorku ćelijskih linija kancera dobijenih od čvrstih tumora

[0191] Dok izgleda da citotoksična aktivnost CB-03-10 nije u korelaciji sa AR ekspresijom, testiran je veći uzorak solidnih tumora. MCF7, ćelijska linija kancera dojke (AR<+/->), dodatno ćelijska linija pankreasa sa višom AR ekspresijom (BxPC3) i ćelijska linija intestinalnog kancera (HT29) (AR-) dodati su prethodnom panelu. Rezultati su prikazani u Tabeli III.

Tabela III. IC50 CB-03-10 na ćelijskim linijama kancera okarakterisan AR i GR ekspresijom

[0192] CB-03-10 snažno inhibira ćelijsku održivost višestrukih ćelijskih linija kancera iz različitih epitelnih porekla. Jedinjenja citotoksične aktivnosti nisu u korelaciji sa ekspresijom AR. Pored toga, CB-03-10 je potentniji od enzalutamida u svim testiranim ćelijskim linijama kancera.

Primer 15 – Terapeutski indeks jedinjenja izvedenih iz korteksolona na različitim ćelijskim linijama kancera

[0193] Terapeutski indeks (TI) (takođe se pominje kao terapijski prozor ili sigurnost prozora ili ponekad kao terapijski odnos) je određivanje iznosa terapeutskog agensa koji izaziva terapijski efekat na iznos koji izaziva toksičnost. IC50 jedinjenja je određen na novim ćelijama izolovanim iz ljudske krvi (PBMC). Toksičnost jedinjenja je određena kao što sledi:

Terapeutski indeks = Sigurnost/Potencija = IC50 stimulisanog PBMC-/ IC50 ćelija kancera

[0194] Rezultati su prikazani u Tabeli IV

4

Tabela IV. Terapeutski indeks jedinjenja izvedenih iz korteksolona na panelu ćelijskih linija kancera

[0195] Sva jedinjenja izvedena iz korteksolona prikazuju robustan sigurnosni profil. CB-03-10 prikazuje visok terapeutski indeks. Ovo otkriva da CB-03-10 ima sigurniji profil u poređenju sa CPA i enzalutamidom.

Primer 16 – Afinitet vezivanja CB-03-10 za androgeni receptor

[0196] Prethodni eksperimenti demonstrirali su snažnu citotoksičnu aktivnost CB-03-10 na ćelijske linije kancera izvedenih iz tumora različitog porekla. Ova citotoksična aktivnost nije kompletno u korelaciji sa anti-androgen receptor ekspresijom na testiranim ćelijama kancera. Zasnovano na ovim dokazima dizajnirani su testovi afiniteta jedinjenja u odnosu na AR da bi se odredio relativni afinitet vezivanja CB-03-10 za divlji tip AR konkurentnim testom upotrebom Polar Screen opreme iz Tehnologije života. Ukratko, AR se dodaje na fluorescentni androgen ligand (Fluomone<TM>AL Green) iz kompleksa AR-LBD. Konkurenti rasejani u fluorescentnom Fluomore<TM>AL Grin ligandu iz AR-LBD uzrokuje fluorescentnim ligandom da padaju ubrzano tokom veka trajanja fluorescenta, što rezultira niskom vrednosti polarizacije. Nekonkurenti se neće rasejati fluorescentnim ligandom iz kompleksa, pa vrednost polarizacije ostaje visoka. Pomak vrednosti polarizacije u prisustvu test jedinjenja se upotrebljava za određivanje relativnog afiniteta test jedinjenja za AR-LBD. CB-03-10 afinitet za AR receptor je 1.1E-06 (IC50 molska); u istom testu afinitet dihidrotestosterona (potentnog vezioca AR receptora) je 1.1E-08. CB-03-10 afinitet vezivanja za AR receptor u poređenju sa DHT je nizak i karakteriše CB-03-10 kao potencijalni molekul za vezivanje AR.

Primer 17 – Transkripciona aktivnost CB-03-10 na glukokortikoidni receptor

[0197] Androgeni i glukokortikoidni hormoni podstiču divergentne i često suprostavljene efekte u ćelijama, tkivima, i životinjama. Širok spektar fizioloških i bioloških dokaza ukazuje da receptori koji posreduju ove efekte, androgen i glukokortikoidni receptori (odnosno, AR i GR, redom), u transkripcionalnoj aktivnosti, utiču jedni na druge. Ukratko, epitelne ćelije čovekovog bubrega koje su transfektovane sa DNK-a gradeći sadržaj GR vezivanja lokacije za luminescentno baziran reporter molekule. Nakon 24 časa, ćelije se tretiraju pod režimom antagonista ili agonista. Nakon još 24 časa, luminescent koji je proporcionalan za GR antagonistom transkripcionalne aktivnosti se kvantifikuje.

[0198] Test antagonista je zasnovan na inhibiciji luminescenta prouzrokovanoj deksametazonom (Dex).

[0199] Antagonist aktivnost CB-03-10 se upoređuje sa poznatim GR antagonistom. Mifepriston (naziva se i RU486), kao što je prikazano na Slici 7.

[0200] Test agonista je zasnovan na indukciji luminescenta CB-03-10 agonist aktivnost CB-03-10 se upoređuje sa RU486 koji je poznat da nema agonist aktivnost, što je prikazano na Slici 8.

[0201] Kao što je prikazano na Slici 7, CB-03-10 je potentni antagonist (10 puta manji nego RU486). Nasuprot tome, CB-03-10 je suštinski neefikasan kao GR agonist dok je u veoma visokim koncentracijama koje su potrebne za izazivanje aktivnosti što je 20% od 50 nM Dex.

Primer 18 – CB-03-10 indukcija apoptoze i hvatanje ćelijskog ciklusa

[0202] Većina antikancer citotoksičnih lekova u trenutnoj upotrebi pokazali su da indukuju apoptoze u potkožnim ćelijama. Činjenica je da različiti agensi koji su u interkciji sa različitim ciljevima, uzrokuju umiranje ćelija, a neke uobičajene funkcije ukazuju da određena citotoksičnost ima sposobnost da angažuje ove takozvane “programirane” ćelije smrti. CB-03-10 se procenjuje da bi se utvrdilo da li mehanizam citotoksičnosti u ćelijskim linijama kancera posreduje apoptoze i hvatanje ćelijskog ciklusa. Ćelijske linije kancera su posejane na mikrotitar ploči sa 6-ležišta sa ravnim dnom. Nakon 24 časa dodaju se testirana jedinjenja ili DMSO nosač (negativna kontrola). Nakon još 24 časa ćelije su namazane i umrljane sa fluorescein uparenim Anneksinom V i Propidijum jodidom i analizirane protočnom citomertijom.

[0203] Slika 9 jasno prikazuje kako je CB-03-10 sposoban da indukuje apoptoze u ćelijskim linijama kancera pankreasa. CB-03-10 indukuje apoptoze u ukupno 28% ćelija (ranih i kasnih apoptoza) naspram samo 11% stalnom kontrolom.

[0204] Apoptoze mogu nastati za G1/S ili G2/M tranzicije na ćelijskom ciklusu. Ćelije se tretiraju sa CB-03-10 24 časa a onda se oporavljaju na formaldehidu i umrljaju sa propidijum jodidom. Podaci na Slici 10 prikazuju CB-03-10 izazvan S fazom bloka za niže koncentracije a onda sa G2/M blokom za više koncentracije. Nedostatak G1 bloka prikazuje da nema efekta na p53. S i G2/M blokovi mogu prikazivati aktivnost na kontrolnim tačkama molekula ćelijskog ciklusa. Za S fazu, mogući cilj je ciklin zavisna kneza 2 (CDK2). Gemzar i cisplatin su primeri lekova koji imaju ulogu u S fazi. Za G2, mogući cilj je CDK1.

Primer 19 – Analiza indukcije kaspaze pomoću CB-03-10

[0205] Iz predhodnih proučavanja utvrđeno je da CB-03-10 indukuje apoptoze pomoću aneksin V mrlja u Miapaca2 ćelijama. Za bolju analizu fenomena merene su enzimatske aktivnosti Kaspaze 8 (inicijator kaspaze za spoljne putanje) i Kaspaze 9 (inicijator kaspaze za unutrašnje putanje) i za Kaspaze 3 i 7 (efektore kaspaze).

[0206] U tu svrhu, MiaPaca2 ćelije su posejane na mikrotitar ploči sa 96 ležišta ravnog dna za kulturu. Posle 24 časa test jedinjenja se dodaju ćelijama. Gemcitabin (poznat kao hemoterapeutski agens kancera pankreasa) i DMSO se upotrebljavaju kao pozitivna i negativna kontrola. Nakon 8, 24 i 48 časova inkubacije sa test jedinjenjima, ćelije su lizirane u puferu koji sadrži kaspaze 3/7 ili 8 ili 9 substrata i stabilne luciferaze u odgovarajućem puferu. Lizati su prenešeni na bele neprozirne ploče pre merenja luminescenta u Tecan Safir instrumentu. Paralelne ploče tretirane identično se upotrebljavaju za određivanje održivosti ćelija. Sve aktivosti kaspaze su korigovane za broj održivih ćelija. Rezultati su prikazani na Slici 11.

[0207] Aktivnosti kaspaze 8 i 9 (paneli A i B) indukovane sa CB-03-10. Ova indukcija je bila brza, povezano sa dozom, i već očigledna nakon 8 časova i veoma visoka i to 7 puta povećana u poređenju sa kontrolom.

[0208] Gemcitabin (poznat kao hemoterapijski agens upotrebljen za tretman kancera pankreasa) takođe indukuje aktivnosti kaspaze 8 i 9 ali sa odgođenim i manje potentnim odgovorom u odnosu na CB-03-10. 2 do 3 puta povećane aktivnosti Kaspaze 8 i 9 se ne vide sve do oznake od 48 časova.

[0209] Kaspaze 3/7 (panel C) se indukuju sa CB-03-10 takođe u ovom slučaju već za 8 časova i za stvarno visok nivo nakon 48 časova inkubacije. Interesantno je da CB-03-05 ne pokazuje dobar profil za aktivaciju kaspaze. Gemcitabin povećanje u aktivnosti Kaspaze 3/7 nije se pokazalo sve do oznake od 48 časova.

[0210] Isti test je ponovljen upotrebom LNCaP ćelijskih linija kancera pankreasa (Slika 12). U ovom slučaju pozitivna kontrola je, enzalutamid kao potentan i novi antiandrogen koji se trenutno upotrebljava na klinikama za lečenje pacijenata sa kancerom

4

prostate. Rezultati su prikazani na Slici 12 za 24 časa inkubacije kada je aktivnost kaspaze na najvišoj tački.

[0211] Eksperiment jasno prikazuje da CB-03-10 indukuje Inicijator (8 i 9) i Efektor (3/7) aktivnosti kaspaze bolje od enzalutamida (koji se upotrebljava kao negativna kontrola). Ovi rezultati pokazuju jak indukcioni odnos CB-03-10 za aktivnosti kaspaze na ćelijske linije kancera prostate, koji utiču na unutrašnje i spoljašnje putanje, potvrđujući inhibiciju primetnu na MiaPaca2 ćelijskim kulturama.

Primer 20 – CB-03-10 in vitro netabolizam u plazmi pacova i čoveka

[0212] Za dobijanje nekih uvida na metabolizam CB-03-10 u ljudskoj i pacov plazmi, dizajniran je specifični test. Ukratko, jedinjenja se inkubiraju u različitom vremenskom trajanju u ljudskoj i pacov plazmi na 37°C. Nakon inkubacije uzorci su testirani za prisustvo intaktnog jedinjenja tečnom hromatografijom. Vreme i koncentracije su prikazani na Slici 13.

[0213] Rezultati pokazuju da se CB-03-10 brzo raspada za CB-03-05 u ljudskoj plazmi, i to brže se raspada u pacovu u odnosu na ljudsku plazmu.

Primer 21 – Analiza CB-03-10 in vivo farmakokinetike u životinjskom modelu (mišu)

[0214] Farmakokinetika CB-03-10 se izračunava u plazmi miševa nakon intravenozne (IV), subkutane (SC) i oralne primene (PO).

[0215] Sledeće doze (tabela ispod) se primenjuju u miševima (3 po grupi), a krv se skuplja u naznačeno vreme. Plazma uzorci se analiziraju pomoću HPLC-MS/MS.

[0216] CB-03-10 nije detektovan u plazmi ni nakon 1 časa bez obzira na rutu primene. Međutim, CB-03-10 se metaboliše u CB-03-05 sa telom izloženim 189 (SC) i 47 (PO) časova/ml (Slika14).

Primer 22 – In vivo testiranje CB-03-10 u mišjem modelu ksenografta humanog kancera pankreasa (MiaPaca2 ćelijske linije)

[0217] Iz ranijih proučavanja primećeno je da CB-03-10 snažno inhibira in vitro rast linija ćelija kancera pankreasa MiaPaca2 (AR<+/->). Istraženo je da li ovaj rezultat može biti preveden u in vivo model ksenograft za kancer pankreasa. CPA poznati androgeni su upotrebljeni kao kontrola. Ukratko, 1x10<6>MiaPaca2 ćelije suspendovane u matrigelu su ubrizgane subkutano (SC) injekcijom u 6 nedelja stare muške atimske ogoljene miševe. Tumori su mereni svaka 4 dana sa digitalnim nonijusom. Veličina tumora se izračunava prema formuli: 0.5236(r1)2(r2) gde r1 > r2. Tretman sa CB-03-10 i kontrola jedinjenja su pokrenuti nakon što je tumor doveden do veličine od 50 mm<3>. Jedinjenja rastvorena u DMSO/2-hidroksipropil b-ciklodekstrin (nosaču) se ubrizgava subkutano injekcijom (SC) dnevno (100 μl/mišu) koncentracije od 40 mg/kg dnevno za 28 uzastopnih dana. Slika 15 pokazuje povećanje prosečnog tumora u ksenograft modelu in vivo nakon ubrizgavanja CB-03-10 subkutano injekcijom (SC) u odnosu na nosač.

[0218] Na Slici 15, CB-03-10 pokazuje snažnu i značajnu in vivo aktivnost antipankreas tumora kada se uporedi sa kontrolom. To takođe pokazuje značajnu antitumorsku aktivnost (p<0.5) u poređenju sa nosačem samo ili CPA (ne pokazuje).

[0219] Tokom perioda tretmana CB-03-10 održavaju tumor pankreasa 5 puta manjim u odnosu na početnu veličinu. Nasuprot tome, prosečni tumor u nosaču ili CPA tretmanu grupa povećava se u veličini do 12 puta. CB-03-10 pored inhibicije rasta tumora takođe pokazuje prednost u opstanku miševa. Što je važnije, 14 dana nakon zaustavljenog tretmana, CB-03-10 tretiranih miševa zadržava znatno manje tumore u poređenju na nosačem ove grupe (6 puta prema 14 puta, odnosno).

[0220] Srednji opstanak je 70 dana za miševe tretirane sa CB-03-10 u poređenju sa 60 dana sa nosačem tretiranih miševa ili sa 40 dana za CPA. Ova značajna vremenska razlika pravi 2 do 4 puta više rizika od smrti sa nosačem tretirane grupe.

Primer 23 – In vivo testiranje CB-03-10 primenjenog oralno u miš ksenograftu ljudskog modela kancera prostate (LNCaP ćelije)

4

[0221] Iz ranijih proučavanja zabeleženo je da je CB-03-10 takođe efikasan u inhibiciji in vitro rasta kancera prostate LNCaP ćelijske linije. Istraženo je da li ovaj rezultat može biti izveden u in vivo ksenograft modelu kancera prostate. 3x10<6>LNCaP ćelije suspendovane u matigelu su ubrizgane injekcijom (u desni bok) u 6 nedelja stare ogoljene muške atimik miševe. Tumori su mereni kao što je opisano gore u dokumentu. Tretmani sa CB-03-10 i kontrolnim jedinjenjima pokrenuti su nakon što je tumor dostigao 50 mm<3>. Formulacije za doziranje su pripremljene u 15% vitamina E-TPGS i 65% od 0.5% tež./zap. CMC rastvora u 20 mM citrat pufera (pH 4). Oralno doziranje je dnevno (100 mg/kg u 200 μl/mišu) za 28 uzastopnih dana. Rezultati su crtani kao prosečna promena veličine tumora u odnosu na početak tretmana. Slika 16 prikazuje rezultate dobijene iz modela in vivo ksenograft kancera prostate nakon oralne primene CB-03-10. enzalutamid, novi i potentni anti-androgen je upotrebljen kao pozitivna kontrola.

[0222] Oralna primena CB-03-10 pokazala je bolju anti-tumorsku aktivnost od enzalutamida tokom perioda tretmana od 28 dana. Veličina tumora se povećala samo 2 puta sa CB-03-10 i 3 puta sa enzalutamidom u odnosu na 10 puta u negativnoj kontrolnoj grupi.

[0223] CB-03-10 je takođe efikasniji nego enzalutamid u održavanju male veličine tumora prostate, povećanje nakon tretmana je zaustavljeno (5 prema 8 puta). Čak nakon 6 nedelja posle završenog tretmana, prosečna veličina tumora u CB-03-10 grupi bila je 3.6 puta manja nego u grupi nosača.

Primer 24 – CB-03-10 inhibicija in vitro sekrecije prostata-specifičnog antigena (PSA) iz LNCaP ćelija kancera prostate

[0224] Prostata-specifični antigen, ili PSA, je protein proizveden od strane ćelija žlezde prostate. PSA test meri nivo PSA u krvi čoveka. PSA nivo u krvi je često povećan u čoveku sa kancerom prostate i upotrebljava se kao surogat marker za test progresije kancera prostate u ljudskoj populaciji. Nakon posmatranja da je CB-03-10 sposoban da inhibira in vivo rast kancera prostate, određena je sposobnost jedinjenja da inhibira in vitro PSA sekreciju iz ćelija kancera. LNCaP ćelije su posejane na mikroplater ploči sa 96 ležišta ravnog dna u medijumu koji sadrži ugalj izdvojenog seruma sa ili bez 10 nM DHT-a. Nakon 24 časa test jedinjenja se dodaju ćelijama, upotrebom DMSO kao nosača negativne kontrole i enzalutamida kao pozitivne kontrole. Nakon 48 časova

4

inkubacije sa test jedinjenjima, supernatanti su izvađeni i testirani sa Elisa testom za PSA i iste ćelije su lizirane za procenu održivosti ćelije.

[0225] Kao što je očekivano čist anti-androgen, enzalutamid, je potentan za inhibiranu sekreciju PSA sa IC50< 3 μM; CB-03-10 je takođe potentan PSA inhibitor (IC509 μM). Međutim, enzalutamid aktivnost ne titrira dobro kao CB-03-10. Napomena, Korteksolon, rodni ili konačni metabolit svih testiranih jedinjenja, je suštinski neaktivan na sekreciju PSA (IC50 od 612 μM).

Kada je testirana ćelijska održivost ovih ćelija, enzalutamid je pokazao IC50 od 61 μM i CB-03-10 je pokazao IC50 od 11 μM. Ovo potvrđuje snažan rast inhobitorske aktivnosti oba jedinjenja. Ono što je važnije i interesantnije, korteksolon rodni i finalni metabolit svih testiranih jedinjenja, inhibira LNCaP održivost samo za veoma visoke koncentracije (IC50 od 153 μM) i to je suštinski neaktivno kao citotoksično jedinjenje za ćelijske linije kancera.

Primer 25 – Analiza in vitro anti-kancerske aktivnosti CB-03-10 na ćelijskim linijama kancera dojke

[0226] Trostruko Negativan Kancer Dojke (TNBC) čini oko 20% novootkrivenog invazivnog kancera dojke. Ovaj podtip kancera nije podržan od strane hormona estrogena i progesterona, ni prisustva previše HER2 receptora, i zbog ovih razloga pacijenti ne reaguju na konvencionalne terapije (na primer, Tamoksifen ili Herceptin). Stoga, ovaj kancer se odlikuje otpornošću na hemoterapiju i niskim opstankom pacijenata.

[0227] Postoji korelacija između otpornosti ovog kancera i visoke GR ekspresije (Cancer therapy 2013.). Postoje klinička testiranja GR antagonista (Mifepriston/RU486) u kombinaciji sa hemoterapijom za tretiranje TNBC-a. Međutim, mifepriston klinička upotreba je ugrožena usled poli farmakologije vezane za progesteron receptor (PR) antagonizam. Za procenu da li CB-03-10 može da se upotrebi kao potencijalni lek za kancer dojke, a posebno TNBC, citotoksični testovi izvedeni su upotrebom ćelijskih linja kancera dojke okarakterisane različitim ekspresijama hormonskih receptora.

[0228] Ćelijske linje kancera dojke izabrane za testove su:

MCF7 ćelije kancera dojke (ER<+>PR<+>Her2<+>, GR<+/->)

MDA-MB-231 TBNC ćelije (ER-PR-Her2<->, GR<++>)

4

[0229] Pre testiranja inhibicije rasta ćelija, ćelije kancera dojke se označe za AR i GR receptorima ekspresije pomoću FACS-a, kao što je prethodno opisano. Podaci prikazani na Slici 18 potvrđuju receptor ekspresije kao što je naznačeno u literaturi.

[0230] Za citotoksični test: ćelije su posejane na mikrotitar ploči sa 96 ležišta ravnog dna kultura u medijumu koji sadrži ugalj izdvojenog seruma. Nakon 24 časa, test jedinjenja se dodaju ćelijama. DMSO je upotrebljen kao negativna kontrola nosača i RU486 kao pozitivna kontrola. Nakon 72 časa inkubacije, ćelije su izvađene, lizirane i održivost je određena upotrebom cell titer-glo testa za održivost.

[0231] Tabela VI prikazuje IC50 za CB-03-10 na gore pomenutim ćelijskim linijama kancera dojke

[0232] CB-03-10 je aktivan na obe ćelijske linije kancera dojke, ali izgleda da je aktivniji u MCF7 ćelijama nego u MDA-MB-231, što nagoveštava da GR nije jedini cilj ovog jedinjenja. RU486, mifepriston, (GR/PR antagonist) ne utiče na, kao što se očekivalo, održivost GR<+/->MCF7 ćelija, dok inhibira, na veoma niskom stepenu, održivost za TNBC GR<+>MDA-MB-231 ćelija na maksimumu od 25% za 100 μM. Interesantno da je CB-03-05 aktivan samo u MCF7, ali ne u MDA-MB- 231. Nije jasno koji receptor je odgovoran za ovaj diferencijalni efekat jer se ove ćelije razlikuju za najmanje 4 receptora. Ako nije GR, onda to može biti ER (estrogen receptor), PR (progesteron receptor) ili Her2 koji su izraženi u MCF7 ali ne i u MDA MDA-MB-231.

OPŠTI ZAKLJUČAK

[0233] Ovi primeri pokazuju da Korteksolon 17a-valerat-21-propionat (CB-03-10), posebno ima superiornu aktivnost izvan drugih poznatih korteksolon izvedenih jedinjenja. Videli smo povećane rezultate in-vitro i in-vivo u zahtevima za, na primer:

I) opšte in-vitro anti-tumorske aktivnosti;

II) in-vitro anti-tumorske aktivnosti ne direktno u korelaciji sa AR ekspresijom; III) in-vitro anti-tumorske aktivnosti direktno u korelaciji sa GR ekspresijom;

IV) terapeutski indeks (TI); i

V) In vivo anti-tumorske aktivnosi protiv tumora pankreasa i prostate;

4

VI) Jasno je po podacima prikazanim u tabeli I ispod, da korteksolon izvedena jedinjenja ubijaju ćelije kancera pri razičitim koncentracijama i IC50. Međutim, CB-03-06 i CB-03-10 pokazuju najbolje IC50 u poređenju sa drugim jedinjenjima u korteksolon izvedenoj seriji preko ćelijskih linija kancera različitog porekla. Čak i metabolit CB-03-05 od CB-03-10, pokazuje dobar IC50 iznos u LNCaP, ćelijama kancera prostate (IC50 32 mikroM). Niži IC50 je izložen za jaču in vitro antitumorsku aktivnost.

Tabela I. IC50 korteksolon-izvedenih jedinjenja testiran u ćelijskim linijama kancera prostate i pankreasa

II) AR ekspresija je testirana na ćelijskim linijama kancera, videti Tabelu II

[0234] U ćelijskim linijama kancera prostate, kao što je očekivano, inhibicija rasta pokazuje potentne antiandrogene kao što su CPA i enzalutamid u korelaciji sa AR ekspresijom u ćelijama kancera prostate (veća je AR ekspresija i bolje je citotoksične aktivnosti, izraženo kao donji IC50). Takođe CB-03-04 prikazan u IC50 od 46 kada je testiran na LNCaP (ćelijske linije kancera prostate izražene visokim nivoom androgen receptora) ali za IC50 mnogo viši (135) kada je testiran na PC3 da AR ekspresija je niža ili nula. Posebna citotoksična aktivnost CB-03-06 i CB-03-10 očigledno nije pod uticajem androgen receptor ekspresije na ćelije kancera prostate. CB-03-06 i CB-03-10 se odlukuje veoma dobrim IC50 skoro bez obzira na AR ekspresiju.

4

[0235] U ćelijskim linijama kancera pankreasa, gde je AR ekspresija niska ili skoro nula, CB-03-06 i CB-03-10 pokazuju potentnu citotoksičnu aktivnost, veću nego CPA i enzalutamid. Veća aktivnost može biti uzrok mehanizma za dodatne akcije u odnosu na vezivanje sa drugim recetorima.

Tabela II. AR ekspresija ćelijskih linija kancera prostate i pankreasa i IC50 korteksolonizvedenih jedinjenja

[0236] III) Terapeutski indeks (TI) (takođe se naziva terapeutski prozor, prozor sigurnosti ili terapeutski odnos) je poređenje iznosa terapeutskih agensa koji izazivaju terapijski efekat za iznos koji izaziva toksičnost. IC50 jedinjenja određena je na novim ćelijama izolovanim iz ljudske krvi (PBMC). Toksičnost jedinjenja se određuje kao što sledi:

Terapeutski indeks = Sigurnost/Potencija = IC50 stimulisanog PBMC / IC50 ćelija

kancera

[0237] Rezultati su prikazani u Tabeli VII. Sva korteksolon izvedena jedinjenja pokazuju robustan bezbedonosni profil toksičnosti. Međutim, CB-03-06 i CB-03-10, pokazuju najveći terapeutski indeks kada se testiraju na svih 7 ćelijskih linija kancera testiranih in vitro.

Tabela VII. Terapeutski indeks korteksolon izvedenih jedinjenja na panelu ćelijskih linija kancera

[0238] IV) Trostruko negativan kancer dojke (TNBC) kao što je prikazano u primeru 25. Citotoksična aktivnost CB-03-10 prikazana je posebno impresivno jer uobičajni konvencionalni terapeutski agensi ne rade na ćelijskim linijama trostruko negativnog kancera dojke (TNBC). TNBC je definisan kao nedostatak ekspresije estrogen i progesteron receptora kao ERBB2 pojačanje. Bez odgovora je na endokrinu ili anti-ERBB2 terapiju. Nedavna proučavanja pokazuju neke potencijalne terapeutske mete za TNBC. Međutim, i dalje ima loš ishod. Uzimajući u obzir citotoksičnu aktivnost i odličan sigurnosni profil CB-03-10; CB-03-10 je nov i poboljšan kandidat za klinički tretman ovog kancera.

1

Claims (6)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule:

   korteksolon 17α-valerat za upotrebu u lečenju karcinoma prostate; karcinoma dojke; karcinoma pankreasa; karcinoma pluća; karcinoma gastrointestinalnog trakta, kancera bubrega; karcinoma štitne žlezde; karcinoma uterusa; ili karcinoma nadbubrežne žlezde; i gde je karcinom prostate rezistentan na ciljanu anti androgenu terapiju.
2. 2. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što ciljanu anti androgenu terapiju predstavlja enzalutamid.
3. 3. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje formule:

   korteksolon 17α-valerat za upotrebu u lečenju karcinoma prostate; karcinoma dojke; karcinoma pankreasa; karcinoma pluća; karcinoma gastrointestinalnog trakta, kancera bubrega; karcinoma štitne žlezde; karcinoma uterusa; ili karcinoma nadbubrežne žlezde; i gde je karcinom prostate rezistentan na ciljanu anti androgenu terapiju.
4. 4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačena time što ciljanu anti androgenu terapiju predstavlja enzalutamid. 2
5. 5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 ili 4 i najmanje jedan drugi aktivni sastojak, poželjno hemioterapeutski aktivan sastojak.
6. 6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3-5, za upotrebu sa drugom kompozicijom koja sadrži najmanje jedan drugi aktivni sastojak, poželjno hemioterapeutski aktivan sastojak, za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu.