RS60039B1 - Mono- ili di-supstituisani derivati indola kao inhibitori replikacije virusa denga-groznice - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na mono- ili di-supstituisane derivate indola, na postupke za sprečavanje ili tretman infekcija sa denga-virusom primenom pomenutih jedinjenja, a takođe se odnosi i na pomenuta jedinjenja kao lekove, a preferirano na njihovu upotrebu kao lekove za tretman ili sprečavanje infekcija sa denga-virusom. Ovaj pronalazak nadalje se odnosi na farmaceutske kompozicije ili kombinovane preparate pomenutih jedinjenja, na kompozicije ili preparate koje mogu da se upotrebljavaju kao lekovi, a preferirano za prevenciju ili tretman infekcija sa denga-virusom. Ovaj pronalazak takođe se odnosi na procese za pripremu pomenutih jedinjenja.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Flavivirusi, koji se prenose preko komaraca ili krpelja, uzrokuju infekcije koje ljudima ugrožavaju život, poput encefalitisa i hemoragičnu groznicu. Poznata su četiri posebna, ali blisko povezana serotipa flavivirusa denga, tako-zvani DENV1, -2, -3, i -4. Denga je endemska bolest u najvećem delu tropskih i suptropskih regiona širom sveta, predominantno u urbanim i polu-urbanim područjima. Prema Svetskoj zdravstvenoj organizaciji (World Health Organization, WHO), 2.5 milijardi ljudi, od kojih 1 milijarda dece, je ugroženo od DENV-infekcije (WHO, 2002). Procenjeno je da svake godine u svetu ima 50 do 100 miliona slučaja denga-groznice [DF], pola miliona slučaja ozbiljne denga-bolesti (tj. denga-hemoragična groznica [DHF] i denga sindrom šoka [dengue shock syndrome, DSS]), i više od 20000 smrti zbog toga. DHF je postao glavni uzrok hospitalizovanja i smrti među decom u endemskim regionima. Sve zajedno, denga-virus predstavlja najčešći uzrok neke arboviralne bolesti. Zbog nedavnih epidemija u zemljama Latinske Amerika, Jugo-istočne Azije i Zapadnog Pacifika (uključujući Brazil, Portoriko, Venecuelu, Kambodžu, Indoneziju, Vijetnam, Tajland), broj slučaja denga-zaraze je dramatično porastao zadnjih godina. Ne samo šta broj slučaja dengazaraze raste u novim područjima, već epidemije imaju tendenciju postajati sve jače.

[0003] Za sprečavanje i/ili kontrolisanje bolesti povezane sa infekcijom sa denga-virusom, kao postupci sada su dostupne samo strategije za iskorenjivanje komaraca sa ciljem da se kontroliše vektor. Mada je napravljen progres u razvijanju vakcina protiv denga-zaraze, još uvek postoje mnoge poteškoće. To uključuje postojanje fenomena koji je poznat kao antitelo-zavisno pojačavanje (antibody-dependent enhancement, ADE).

[0004] Oporavak od infekcije sa bilo kojim od pomenutih serotipa obezbeđuje celo-životni imunitet protiv određenog serotipa, ali donosi samo parcijalnu i prolaznu zaštitu od sledeće infekcije sa bilo kojim od preostala tri serotipa. Nakon infekcije sa drugim serotipom, već postojeća heterologna antitela formiraju komplekse sa novim serotipom denga-virusa, ali ne neutrališu patogen. Umesto toga, veruje se da je ulazak virusa u ćelije olakšan, koje rezultuje u ne-kontrolisanu virusnu replikaciju i visokog šiljka viralnog titra. U primarnim i sekundarnim infekcijama, viši viralni titari su povezani sa snažnijom denga-bolešću. Budući da majčina antitela mogu lako da pređu na novorođenčad dojenjem, to može da bude jedan od razloga zašto su deca više pogođena snažnijom denga-bolešću od odraslih osoba.

[0005] Na lokacijama sa dva ili više serotipa, koji cirkulišu istovremeno u populaciji, takođe poznate kao hiper-endemski regioni, rizik od ozbiljne denga-bolesti je značajno viši usled povećanog rizika od doživljavanja sekundarne, snažnije infekcije. Štaviše, u situacijama hiperendemičnosti, verovatnost pojave virulentnijih sojeva je povećana, koje sa svoje strane povećava verovatnost pojave denga-hemoragične groznice (DHF) ili denga sindrom šoka.

[0006] Komarci koji prenose denga-virus, uključujući Aedes aegypti i Aedes albopictus (tigrasti komarac), se kreću prema severnom delu sveta. Prema Američkim centrima za kontrolu bolesti i prevencije (United States Centers for Disease Control and Prevention, USCDC), obe vrste komaraca su trenutno sveprisutne u južnom Teksasu. Severnije širenje komaraca koji prenose denga-virus nije ograničeno samo na USA, već je primećeno i u Evropi.

[0007] Nedavno (decembar, 2015.), vakcina protiv denga-virusa, proizvedena od strane Sanofi Pasteur je najpre odobrena u Meksiko. Ova vakcina je takođe odobrena i u Brazilu, Filipinima i El Salvador. Procesi regulacionog ispitivanja su u toku i u drugim državama u kojima je denga-zaraza prioritet javnog zdravstva. Bez obzira na to, ova vakcina ostavlja puno prostora za poboljšanje zbog svoje ograničene efikasnosti, posebno protiv DENV-1 i -2, niske efikasnosti kod flavivirus-naïve subjekata i dugotrajnog doznog rasporeda.

[0008] Unatoč ovih nedostataka, pomenuta vakcina menja situaciju u endemskim okruženjima jer nudi zaštitu velikog dela populacije, ali verovatno ne i veoma maloj novorođenčadi, koji su najugroženiji od denga-virusa. Osim toga, pomenuti dozni raspored i veoma ograničena efikasnost kod flavivirus-naïve subjekata ju čini neprikladnom i verovatno neisplativom za putnike iz ne-endemskih područja koji putuju u denga-endemska područja. Gore-navedeni nedostaci vakcine protiv denga-virusa su razlog zašto još uvek postoji potreba za profilaktičnog antivirusnog preparata protiv denga-virusa koji bi bio namenjen upotrebi pre moguće infekcije.

[0009] Nadalje, danas nisu dostupni specifični antiviralni lekovi za tretman ili prevenciju od infekcija sa virusom denga-groznice. Jasno je da još uvek postoji velika neostvarena medicinska potreba za terapeuticima za prevenciju ili tretman viralnih infekcija kod životinja, naročito kod ljudi, a posebno protiv viralnih infekcija uzrokovanih sa flavivirusima, naročito denga-virusom. Veoma su potrebna jedinjenja sa dobrim anti-viralnim potencijalom, bez ili uz nizak nivo nus-pojava, uz široki spektar delovanja protiv višestrukih serotipova denga-virusa, niske toksičnosti i/ili dobrih farmakokinetičkih ili -dinamičkih karakteristika.

[0010] Ovaj pronalazak sada obezbeđuje jedinjenja, mono- ili di-supstituisane derivate indola, koja su visoko-potentna protiv sva četiri (4) serotipa denga-virusa. Takođe, jedinjenja u skladu sa ovim pronalaskom poseduju dobar farmakokinetički profil i, iznenađujuće, pomenuta specifična jedinjenja imaju poboljšanu hiralnu stabilnost.

REZIME PRONALASKA

[0011] Ovaj pronalazak se bazira na neočekivanom otkriću da barem jedan od gore-navedenih problema može da se reši primenom jedinjenja iz ovoga pronalaska.

[0012] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenja koja za koja je pokazano da poseduju potentno antiviralno delovanje protiv sva četiri (4) trenutno poznata serotipa. Ovaj pronalazak nadalje demonstrira da pomenuta jedinjenja efikasno inhibiraju proliferaciju denga-virusa (DENV). Prema tome, ova jedinjenja čine korisnu klasu potentnih jedinjenja koja mogu da se primenjuju u tretmanu i/ili prevenciji viralnih infekcija kod životinja, sisara i ljudi, a specifično u tretmanu i/ili prevencije infekcija sa denga-virusima.

[0013] Ovaj pronalazak nadalje se odnosi na jedinjenja koja mogu da se koriste kao lekovi i na jedinjenja koja mogu da se upotrebljavaju u proizvodnji medikamenata ili u tretmanu i/ili prevenciji viralnih infekcija, a naročito virusa koji pripadaju porodici denga-virusa koji napadaju životinje ili sisare, a naročito ljude. Ovaj opis takođe se odnosi na postupke za pripremu svih takvih jedinjenja i na farmaceutske kompozicije koje ih sadrži u nekoj efektivnoj količini.

[0014] Ovaj pronalazak takođe se odnosi na jedinjenja za primenu u postupku tretmana ili prevencije infekcija sa denga-virusom kod ljudi uz pomoć administriranja nekom pacijentu u potrebi neke efektivne količine jednog ili više takvih jedinjenja, ili neke njihove farmaceutski prihvatljive soli, opciono zajedno sa jednim ili više drugih lekova, poput nekog drugog antiviralnog agensa.

[0015] Jedan aspekt ovoga pronalaska je obezbeđivanje jedinjenja sa formulom (I)

neku njihovu stereo-izomernu formu, farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorf koji sadrže mono- ili di-supstituisanu indolnu grupu; pri čemu pomenuto jedinjenje je izabrano iz grupe gde:

R1je H, R2je F ili Cl, a R3je H ili CH3;

R1je F, R2je F, a R3je H;

R1je CH3, R2je OCH3, a R3je H;

R1je CH3, R2je F, a R3je H;

R1je CH3, R2je H, a R3je F;

R1je Cl, R2je H, a R3je CH3;

R1je OCF3, R2je H ili OCH3, a R3je H i

R1je OCF3, R2je H, a R3je CH3.

[0016] Naročito, jedinjenja iz ovoga pronalaska ili neka njihova stereo-izomerna forma, farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf su izabrana iz sledeće grupe:

[0017] Deo ovoga pronalaska takođe čini i farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje sa formulom (I) ili neku njegovu stereo-izomernu formu, farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorf zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, razblaživača ili nosioca.

[0018] Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja sa formulom (I) uključuju kisele adicione soli i bazne soli. Prikladne kisele adicione soli nastaju iz kiselina koji mogu da formiraju netoksične soli. Prikladne bazne soli nastaju iz baza koje formiraju ne-toksične soli.

[0019] Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu, takođe, da postoje kao ne-solvatizovane i solvatizovane forme. Termin "solvat", kao šta se ovde koristi, opisuje molekularne komplekse koji sadrže jedinjenje iz ovoga pronalaska i jedan ili više molekula farmaceutski prihvatljivog rastvarača, na primer, etanola.

[0020] Termin "polimorf" se odnosi na sposobnost jedinjenja iz ovoga pronalaska da postoji u više od jedne forme ili kristalne strukture.

[0021] Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se administriraju kao kristalni ili amorfni produkti. Pomenuti mogu da se dobiju, na primer, u formi čvrstih pločica, prahova, ili filmova primenom postupaka poput precipitacije, kristalizovanja, smrzavanja-sušenja, sušenja prskanjem, ili sušenja uz isparavanje. Pomenuti mogu da se administriraju sami za sebe ili kombinovano sa jednim ili više drugih jedinjenja iz ovoga pronalaska ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih lekova. Generalno, pomenuti se administriraju kao formulacija zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata. Termin "ekscipijent" ovde se koristi sa ciljem opisivanja bilo kojeg sastojaka koji je različit od jedinjenja iz ovoga pronalaska. Izbor ekscipijenta zavisi uglavnom o faktorima poput nekog naročitog modusa administriranja, uticaja ekscipijenta na rastvorljivost i stabilnost, i o prirodi dozne forme.

[0022] Jedinjenja iz ovoga pronalaska ili bilo koje podgrupe mogu da se formulišu u razne farmaceutske forme za potrebe administriranja.

[0023] Kao prikladne kompozicije mogu da se navedu sve kompozicije koje se uobičajeno primenjuju kod lekova koji se administriraju sistemski. Za pripremu farmaceutskih kompozicija iz ovoga pronalaska, neka efektivna količina određenog jedinjenja, opciono u formi adicione soli, kao aktivni sastojak je kombinovana u finoj smeši sa nekim farmaceutski prihvatljivim nosiocem, pri čemu pomenuti nosilac može da dolazi u brojnim formama u zavisnosti o formi preparata koji je poželjan za administriranje. Ove farmaceutske kompozicije su poželjne u unitarnoj doznoj formi koja je prikladna za, na primer, oralno ili rektalno administriranje. Na primer, kod pripreme kompozicija kao oralne dozne forme, može da se koriste bilo koji uobičajeni farmaceutski medijum poput, na primer, vode, raznih glikola, raznih ulja, alkohola i slično u slučaj oralnih tečnih preparata poput suspenzija, sirupa, eliksira, emulzija, i rastvora; ili čvrstih nosilaca poput raznih skrobova, šećera, kaolina, razblaživača, lubrikanata, veznika, agenasa za rahljenje i slično u slučaju raznih prahova, pilula, kapsula, i tableta. Zbog jednostavnosti administriranja, tablete i kapsule su najnaprednije oralne dozne unitarne forme, u kojem slučaju se primenjuju čvrsti farmaceutski nosioci. Takođe, uključeni su i čvrsti preparati koji mogu da se konvertuju, neposredno pre upotrebe, u tečne forme.

[0024] Posebno je korisno da se gore-pomenute farmaceutske kompozicije formulišu u unitarnu doznu formi radi jednostavnosti administriranja i uniformne doze. Unitarna dozna forma, kao šta se ovde koristi, se odnosi na fizički diskretne jedinice prikladne za unitarne doze, pri čemu svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog sastojaka za koju se zna da može da proizvede željeni terapeutski efekt zajedno sa nekim poželjnim farmaceutskim nosiocem. Primeri za takve unitarne dozne forme su tablete (uključujući tablete koje su pogodne za lomljenje ili omotane tablete), kapsule, pilule, paketići sa prahom, vafli, čepići, rastvori ili suspenzije za injektiranje i slično, i njihovi odvojeni višekratnici.

[0025] Stručnjaci za tretiranje infektivnih bolesti mogu da odrede efektivnu količinu na osnovu rezultata testova prikazanih ovde u daljnjem tekstu. Opšte uzeto, smatra se da se efektivna dnevna količina kreće u rasponu od 0.01 mg/kg do 50 mg/kg telesne težine, a bolje od 0.1 mg/kg do 10 mg/kg telesne težine. Može biti prikladno da se potrebna doza administrira uz pomoć dve, tri, četiri ili više pod-doza u odgovarajućim intervalima tokom celoga dana. Pomenute pod-doze mogu da budu formulisane kao unitarne dozne forme, na primer, takve koje sadrže od 1 do 1000 mg, a naročito od 5 do 200 mg aktivnog sastojka po unitarnoj doznoj formi.

[0026] Tačna doza i frekvencija administriranja zavisi o korišćenom jedinjenju sa formulom (I), o stanju koje se tretira, ozbiljnosti stanja koje se tretira, dobi, težini i opštem fizičkom stanju tretiranog pacijenta kao i o drugim lekovima koje osoba može da istovremeno uzima, kao šta je dobro poznato stručnjacima. Nadalje, jasno je da efektivna količina može da se smanji ili povećana u zavisnosti o odgovoru tretiranog subjekta i/ili u zavisnosti o proceni lekara koji prepisuje jedinjenja iz ovoga instant pronalaska. Rasponi efektivnih količina malopre pomenuti su, prema tome, samo smernice i ne ograničavaju okvir ili primenu ovoga pronalaska na bilo koji način.

[0027] Ovaj opis, takođe, uključuje sve izotope atoma prisutnih u jedinjenjima iz ovoga pronalaska. Na primer, izotopi vodonika uključuju tricijum i deuterijum, a izotopi ugljenika uključuju C-13 i C-14.

[0028] Jedinjenja koja se koriste u ovom pronalasku mogu, takođe, da postoje u svojoj stereohemijski izomernoj formi, koja definiše sva moguća jedinjenja sačinjena od istih atoma spojenih istom sekvencom veza, ali u različitim tri-dimenzionalnim strukturama, koje su međusobno različite. Osim ako je drugačije navedeno, hemijske oznake jedinjenja obuhvataju smešu svih mogućih stereo-hemijskih izomernih forma, koje pomenuta jedinjenja mogu da poseduju.

[0029] Pomenuta smeša može da sadrži sve dia-stereomere i/ili enantiomere bazične molekularne strukture pomenutog jedinjenja. Sve stereo-hemijske izomerne forme jedinjenja koja se koriste u ovom pronalasku, u čistoj formi ili kao međusobna smeša, su obuhvaćena okvirima ovoga pronalaska uključujući sve racemske smeše ili racemate.

[0030] Čiste stereoizomerne forme ovde-pomenutih jedinjenja i njihovih intermedijara su definisane kao izomeri koji su značajno oslobođeni od drugih enantiomernih ili diastereomernih forma iste bazične molekularne strukture pomenutih jedinjenja ili intermedijara. Naročito, termin 'stereoizomerno čist' se odnosi na jedinjenja ili intermedijare koji sadrže stereoizomerni višak od barem 80% (tj. minimalno 90% jednog izomera i maksimalno 10% drugih mogućih izomera) pa do stereoizomernog viška od 100% (tj. 100% jednog izomera i ništa od drugog), naročito, jedinjenja ili intermedijari koji sadrže stereoizomerni višak od 90% pa do 100%, bolje koji sadrže stereoizomerni višak od 94% pa do 100%, a najbolje koji sadrže stereoizomerni višak od 97% pa do 100%. Termini 'enantiomerno čist' i 'diastereomerno čist' treba da se tumače na sličan način, ali uzimajući u obzir odgovarajući enantiomerni višak, odnosno diastereomerni višak neke određene smeše.

[0031] Čiste stereoizomerne forme jedinjenja i intermedijara koji se koriste u ovom pronalasku mogu da se dobiju primenom procedura koje su poznate stanju tehnike. Na primer, enantiomeri mogu da se međusobno razdvoje primenom selektivnog kristalizovanja njihovih diastereomernih soli sa optički aktivnim kiselinama ili bazama. Dobri primeri su vinska kiselina, dibenzoilvinska kiselina, ditoluoilvinska kiselina i kamfosumporna kiselina. Alternativno, enantiomeri mogu da se razdvoje primenom hromatografskih tehnika uz pomoć hiralnih stacionarnih faza. Pomenute čiste stereohemijske izomerne forme mogu, takođe, da se izvedu iz odgovarajućih čistih stereohemijski-izomernih forma prikladnih početnih materijala, pod uslovom da reakcija nastupa stereospecifično. Preferirano, ako je poželjan neki specifični stereoizomer, pomenuta jedinjenja će se sintetizovati uz pomoć stereospecifičnih postupaka pripreme. Prikladno, ovi postupci koriste enantiomerno čiste početne materijale.

Opšti pristupi sinteze

[0032] Sinteza jedinjenja sa opštom formulom I može da se provede kao šta je opisano u Shemi 1. Derivat 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)sirćetne kiseline sa opštom formulom II, koji sadrži O-zaštitnu grupu PG hidroksilne funkcije (PG može da bude, na primer, neka O-benzil zaštitna grupa), može da se konvertuje u odgovarajući kiseli hloridni derivat sa opštom formulom III uz pomoć reagensa za hloriranje poput, na primer, oksalil hlorida ili tionil hlorida. Friedel-Crafts-reakcija kiselog hlorida sa opštom formulom III sa supstituisanim indolom sa opštom formulom IV može da se provede uz korišćenje Lewis-ove kiseline (reagens) poput, na primer, Et2AlCl u nekom prikladnom rastvaraču poput, na primer, CH2Cl2i u prikladnim reakcionim uslovima koji tipično uključuju hlađenje sa ciljem da se dobije 3-acilovan indol sa opštom formulom V. Odstranjivanje zaštitne grupe PG sa pomenutih jedinjenja sa opštom formulom V može da se provede primenom, na primer, reduktivne hidrogenolize (PG = benzil) u nekom prikladnom rastvaraču poput, na primer, EtOAc koje daje jedinjenja sa opštom formulom VI. Uvođenje anilinskog ostatka na alfa-poziciju karbonilnog ostatka jedinjenja sa opštom formulom VI može da se ostvari uz pomoć reakcione sekvence koja uključuje, na primer, brominaciju VI sa reagensom poput, na primer, feniltrimetilamonijum tribromida u nekom prikladnom rastvaraču poput, na primer, THF koje daje jedinjenja sa opštom formulom VII, a naknadna reakcija pomenutih jedinjenja sa opštom formulom VII sa 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilinom (VIII) u nekom prikladnom rastvaraču poput, na primer, CH3CN, uz opciono korišćenje neke baza poput, na primer, TEA ili DIPEA obezbeđuje jedinjenja sa opštom formulom I u formi racemskih smeša. Hiralna-separacija jedinjenja sa opštom formulom I može da se provede uz pomoć, na primer, hiralne hromatografije koje daje enantiomere A i B sa opštom formulom I.

1

Enantiomeri I(A) i I(B)

Shema 1

[0033] Alternativno, konverzija intermedijara sa opštom formulom V u Jedinjenja sa opštom formulom I može, takođe, da se ostvari primenom reakcione sekvence koja je prikazana u Shemi 2: brominacija na alfa-poziciji karbonilne funkcije u intermedijarima sa opštom formulom V sa nekim prikladnim agensom za brominaciju poput, na primer, feniltrimetilamonijum tribromida u nekom prikladnom rastvaraču poput, na primer, THF obezbeđuje jedinjenja sa opštom formulom IX. Naknadna reakcija jedinjenja sa opštom formulom IX sa 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilinom (VIII) u nekom prikladnom rastvaraču poput, na primer, CH3CN, uz opciono korišćenje baze poput, na primer, TEA ili DIPEA obezbeđuje jedinjenja sa opštom formulom X. Nakon odstranjivanja O-zaštitne grupe (PG) sa jedinjenja sa opštom formulom X uz pomoć, na primer, reduktivne hidrogenolize (PG = benzil) u prikladnom rastvaraču poput, na primer, EtOAc ili MeOH dobiju se jedinjenja sa opštom formulom I u formi racemskih smeša. Hiralna-separacija jedinjenja sa opštom formulom I može da se provede primenom, na primer, hiralne hromatografije koje obezbeđuje enantiomere A i B sa opštom formulom I.

Enantiomeri I(A) i I(B) Shema 2

Primeri

LC/MS postupci

[0034] Merenje uz pomoć tečne hromatografije visoke performanse (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) je provedeno primenom LC-pumpe, diode-array (DAD) ili UV-detektora, a kolona je navedena u opisu odgovarajućih postupaka. Kada je bilo potrebno bili su uključeni i dodatni detektori (vidi tabelu u postupcima ispod).

[0035] Protok iz kolone je vođen u maseni spektrometar (Mass Spectrometer, MS) koji je bio konfigurisan sa jonskim izvorom pod atmosferskim pritiskom. Stručnjak zna kako se podešavaju i baždare parametri (na primer, raspon skeniranja, vreme prebivanja...) kako bi se dobili joni koji omogućavaju identifikaciju nominalne monoizotopne molekularne težine (MW). Skupljanje podataka je obavljeno primenom prikladnog softvera.

[0036] Jedinjenja su opisana uz pomoć njihovih eksperimentalnih retencionih vremena (Rt) i jona. Ako u tabeli sa podacima nije specifikovano drugačije, navedeni molekularni jon odgovara [M+H]<+>(protonovan molekul) i/ili [M-H]<->(deprotonovan molekul). U slučaj kada jedinjenje nije bilo direktno jonizabilno, specifikovan je tip adukta (tj. [M+NH4]<+>, [M+HCOO]-, itd...). Za molekule sa višestrukim izotopnim obrascima (Br, Cl), navedena vrednost je ona koja je dobivena za masu najnižeg izotopa. Svi rezultat su dobiveni uz pomoć eksperimentalne nesigurnosti koja se uobičajeno povezuje sa korišćenim postupkom.

[0037] Nadalje, "SQD" označava Single Quadrupole Detector, "MSD" Mass Selective Detector, "ST" sobna temperatura, "BEH" premošćeni etilsiloksan/silika hibrid, "DAD" Diode Array Detector, "HSS" High Strength Silica.

[0038] Oznake LC/MS-postupka (protok je izražen u mL/min; temperatura kolone (T) u °C; vreme voženja (run time) u minutima)

1

SFC/MS-postupci

[0039] SFC-merenje je provedeno primenom analitičke superkritične tečne hromatografije (Analytical Supercritical Fluid Chromatography, SFC) pri čemu se sistem sastojao od binarne pumpe za dovod ugljenik dioksida (CO2) i modifikatora, autosampler-a, kolonsku pećnicu, diode array detector-a koji je bio opremljen sa ćelijom za protok pod visokom pritiskom do najviše 400 bara. Ako je bio konfigurisan sa masenim spektrometrom (MS), protok iz kolone je vođen ka pomenutom MS. Stručnjak zna kako podesiti i baždariti parametre (na primer, raspon skeniranja, dwell time...) sa ciljem da se dobiju joni koji omogućavaju identifikaciju nominalne monoizotopne molekularne težine (MW) jedinjenja. Skupljanje podataka je obavljeno primenom prikladnog softvera.

[0040] Postupci za analitički SFC/MS (protok je izražen u mL/min; temperatura kolone (T) u °C; vreme voženja u minutima, Backpressure (BPR) u barima.

1

Tačke topljenja

[0041] Prikazani su šiljak-vrednosti ili rasponi topljenja, a dobiveni su uz eksperimentalnu nesigurnost koja se uobičajeno povezuje sa korišćenim analitičkim postupkom.

1

DSC823e (označen kao DSC)

[0042] Kod brojnih jedinjenja, tačke topljenja su određene uz pomoć DSC823e (Mettler-Toledo). Tačke topljenja su izmerene u temperaturom gradijentu od 10 °C/min. Maksimalna temperatura je bila 300 °C.

Optičke rotacije

[0043] Optičke rotacije su izmerene na polarimetru Perkin-Elmer 341 sa natrijumovom lampom a prikazane su kako sledi: [α]° (λ, c g/100 ml, rastvarač, T °C).

[0044] [α]λ<T>= (100α) / (l x c): gde l je duljina puta (path length) u dm, a c je koncentracija u g/100 ml za neki primerak na temperaturi T (°C) i kod neke talasne dužine λ (u nm). Ako je korišćena talasna dužina svetla bila 589 nm (natrijumova D linija), tada može da se koristi simbol D umesto toga. Znak rotacije (+ ili -) treba uvek biti prikazan. Kada se koristi ova jednačina, koncentracija i rastvarač su uvek prikazani u zagradama nakon rotacije. Pomenuta rotacija je prikazana uz pomoć stepena, a jedinice koncentracije nisu prikazane (pretpostavlja se da se radi o g/100 ml).

Primer 1: sinteza 1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)-fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Jedinjenje 1) i hiralna-separacija u enantiomere 1A i 1B.

1

CH3

Sinteza intermedijara 1a:

[0046] Rastvor 2-(4-fluoro-2-metoksifenil)sirćetne kiseline [CAS 886498-61-9] (2.15 g, 11.7 mmol) u suvom THF (40 mL) je ohlađen do 0 °C. Dodan je oksalil hlorid (2.04 mL, 23.4 mmol) i dve kapi DMF. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 min. Rastvarač je isparen pod smanjenim pritiskom. Talog je rastvoren u etanolu (40 mL), a reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom fleš-hromatografije na silika-gelu u gradijentu EtOAc (5% do 50%) u heptanu koje daje etil 2-(4-fluoro-2-metoksifenil)acetat 1a (2.40 g) u formi ulja.

Sinteza intermedijara 1b:

[0047] U rastvor etil 2-(4-fluoro-2-metoksifenil)acetata 1a (2.40 g, 11.3 mmol) u CH2Cl2(110 mL), ohlađen na -30 °C, kap po kap je dodan 1M rastvor BBr3u CH2Cl2(22.6 mL, 22.6 mmol) uz održavanje temperature ispod -20 °C. Reakciona smeša je mešana na -30 °C tokom 1 h pre gašenja sa metanolom. pH je podešen do vrednosti 8 uz pomoć dodavanja vodenog zasićenog rastvora NaHCO3. Faze su razdvojene. Vodena faza je ekstrahovana sa dihlorometanom. Organske faze su spojene, osušene preko Na2SO4, filtrirane i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom fleš-hromatografije na silika-gelu u gradijentu etil

1

acetata (5% do 50%) u heptanu koje daje etil 2-(4-fluoro-2-hidroksifenil)acetat 1b (2.10 g) u formi ulja.

Sinteza intermedijara 1c:

[0048] U smešu etil 2-(4-fluoro-2-hidroksifenil)acetata 1b [CAS 1261751-44-3] (1.24 g, 6.26 mmol) i cezijum karbonata (4.08 g, 12.5 mmol) u DMF (20 mL) je dodan benzil 2-bromoetil etar [CAS 1462-37-9] (1.61 g, 7.51 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Dodana je H2O, a reakciona smeša je ekstrahovana sa EtOAc. Organska faza je osušena preko Na2SO4, filtrirana i koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen promenom fleš-hromatografije na silika-gelu u gradijentu CH2Cl2(15% do 100%) u heptanu koje daje etil 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)acetat 1c (1.55 g).

Sinteza intermedijara 1d:

[0049] U rastvor etil 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)acetata 1c (1.55 g, 4.66 mmol) u smeši EtOH (45 mL) i THF (22 mL) je dodan 0.5 N NaOH (28 mL, 14.0 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smeša je delomično koncentrovana pod smanjenim pritiskom sa ciljem da se odstrane organski rastvarači. Talog je zakiseljen sa 1N HCI do pH 2-3 pa je ekstrahovan sa EtOAc. Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod smanjenim pritiskom koje daje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)sirćetnu kiselinu 1d (1.41 g).

Sinteza intermedijara 1e:

[0050] U rastvor 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)sirćetne kiseline 1d (1.41 g, 4.63 mmol) u suvom CH2Cl2(20 mL), ohlađen na 0 °C, su dodani oksalil hlorid (0.811 mL, 9.27 mmol) i DMF (2 kapi). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom koje daje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)acetil hlorid 1e (1.50 g) koji je bio korišćen u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

1

Sinteza intermedijara 1f:

[0051] 1M dietilaluminijum hlorid u heksanu (4.72 mL, 4.72 mmol) je dodan kap po kap, na 0 °C, u rastvor 6-fluoro-1H-indola [CAS 399-51-9] (0.42 g, 3.11 mmol) u CH2Cl2(6 mL). Nakon mešanja tokom 30 min na 0 °C, polako je dodan rastvor 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)acetil hlorida 1e (1.50 g, 4.66 mmol) u dihlorometanu (6 mL). Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 2 h. Dodan je 1M rastvor Rochelle-ove soli. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 h, a tada je ekstrahovana dva puta sa EtOAc. Organske faze su spojene, isprane sa slanicom, osušene preko MgSO4, filtrirane i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen promenom fleš-hromatografije na silika-gelu u gradijentu EtOAc (2% do 40%) u heptanu. Dodatno prečišćavanje sa fleš-hromatografijom na silika-gelu u gradijentu EtOAc (0% do 10%) u CH2Cl2daje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)etanon 1f (0.88 g).

Sinteza intermedijara 1g:

[0052] Smeša 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-etanona 1f (0.88 g, 2.09 mmol) i 10% paladijuma na ugljeniku (0.088 g) u EtOAc (90 mL) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 h u atmosferi H2. Reakciona smeša je filtrirana kroz pločicu celite<®>, a filter-kolač je ispran sa CH2Cl2i MeOH. Spojeni filtrati su koncentrovani pod smanjenim pritiskom. Talog je očvrsnuo uz pomoć mrvljenja sa CH2Cl2. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem pa su osušene u vakuum koje daje 1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)etanon 1g (0.59 g).

Sinteza intermedijara 1h:

[0053] Rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (0.70 g, 1.86 mmol) u THF (10 mL) je dodan, kap po kap na 0 °C, u rastvor 1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)etanona 1g (0.56 g, 1.69 mmol) u THF (15 mL). Smeša je mešana na 0 °C tokom 15 min i na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Precipitat je sakupljen filtriranjem pa je ispran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom koje daje 2-bromo-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)etanon 1h (0.69 g) koji je korišćen u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

Sinteza Jedinjenja 1 i hiralna-separacija u enantiomere 1A i 1B:

[0054] Smeša 2-bromo-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi) fenil)etanona 1h (0.69 g, 1.69 mmol) i 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4]

2

(1.02 g, 5.07 mmol) u CH3CN (10 mL) je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smeša je razređena sa EtOAc pa je isprana sa 1N HCl. Organski sloj je ispran sa vodenim zasićenim rastvorom NaHCO3, H2O i slanicom, osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom fleš-hromatografije na silika-gelu u gradijentu EtOAc (15% do 70%) u CH2Cl2. Frakcije koje sadrže željeno jedinjenje su spojene i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Talog je ponovo kristalizovan iz smeše EtOAc, Et2O i heptana koje daje prvu šaržu 1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Jedinjenje 1, 0.47 g) u formi racemske smeše. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom, a talog je ponovo kristalizovan iz smeše EtOAc, Et2O i heptana koje daje drugu šaržu Jedinjenja 1 (0.11 g) u formi racemske smeše.

[0055] Hiralna-separacija enantiomera Jedinjenja 1 (620 mg) je provedena primenom hiralneseparacije normalne faze (Normal Phase Chiral Separation; stacionarna faza: Chiralpak<®>AD 1000A 20 µm (Daledl) (600 g), mobilna faza: EtOH/MeOH (1/1). Frakcije koje sadrže produkt su spojene i isparene pod smanjenim pritiskom koje obezbeđuje enantiomer 1A kao prvoeluirani produkt i enantiomer 1B kao drugo-eluirani produkt. Oba enantiomera su rastvorena u smeši vode (5 ml) MeOH (20 ml). Rastvarač je delomično isparen pod smanjenim pritiskom (40 °C, vodena banja) do rezidualne količine od približno 5 ml. Nastale suspenzije su razređene sa vodom (10-15 mL) pa su snažno mešane tokom 2 dana. Čvrste materije su izolovane filtracijom pa su osušene u vakuumu na sobnoj temperaturi koje obezbeđuje enantiomer 1A (227 mg) i enantiomer 1B (251 mg) u formi belih prahova.

Jedinjenje 1:

[0056]<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.87 - 4.10 (m, 2 H) 4.17 (m, 2 H) 5.30 (br. s., 1 H) 6.36 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 6.57 (t, J=1.6 Hz, 1 H) 6.65 (s, 1 H) 6.72 (td, J=8.5, 2.5 Hz, 1 H) 6.92 - 6.96 (m, 2 H) 7.03 - 7.10 (m, 2 H) 7.24 (dd, J=9.6, 2.3 Hz, 1 H) 7.38 (dd, J=8.6, 6.9 Hz, 1 H) 8.16 (dd, J=8.8, 5.6 Hz, 1 H) 8.68 (s, 1 H) 12.16 (br. s., 1 H) LC/MS (postupak LC-D): Rt3.43 min, MH<+>531

Enantiomer 1A:

[0057]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.89 - 4.07 (m, 2 H) 4.18 (t, J=4.7 Hz, 2 H) 5.30 (br t, J=5.7 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 6.55 - 6.59 (m, 1 H) 6.62 - 6.67 (m, 1 H) 6.71 (br td, J=8.4, 2.6 Hz, 1 H) 6.91 - 6.97 (m, 2 H) 7.01 - 7.09 (m, 2 H) 7.24 (dd, J=9.6, 2.4 Hz, 1 H) 7.38 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 8.15 (dd, J=8.9, 5.5 Hz, 1 H) 8.68 (s, 1 H) 12.16 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-B): Rt1.91 min, MH<+>531

[α]D<20>: 118.6° (c 0.<4335>, DMF)

Hiralni-SFC (postupak SFC-D): Rt1.68 min, MH<+>531, hiralna čistoća: 100%.

Enantiomer 1B:

[0058]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.71 (s, 3 H) 3.89 - 4.06 (m, 2 H) 4.17 (br t, J=4.8 Hz, 2 H) 5.30 (br t, J=5.2 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.55 - 6.59 (m, 1 H) 6.62 - 6.67 (m, 1 H) 6.71 (br td, J=8.4, 2.7 Hz, 1 H) 6.90 - 6.97 (m, 2 H) 7.02 - 7.10 (m, 2 H) 7.23 (dd, J=9.6, 2.5 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 8.15 (dd, J=8.8, 5.5 Hz, 1 H) 8.68 (s, 1 H) 12.15 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-B): Rt1.91 min, MH<+>531

[α]D<20>: -115.4° (c 0.3985, DMF)

Hiralni- SFC (postupak SFC-D): Rt2.20 min, MH<+>531, hiralna čistoća 100%.

Primer 2: sinteza 1-(6-hloro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)-fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Jedinjenje 2) i hiralna-separacija u enantiomere 2A i 2B.

[0059]

Sinteza intermedijara 2a:

[0060] 1M dietilaluminijum hlorid u heksanu (13.1 mL, 13.1 mmol) je dodan, kap po kap na 0 °C, u rastvor 6-hloro-1H-indola [CAS 17422-33-2] (1.33 g, 8.76 mmol) u CH2Cl2(20 mL). Nakon 30 min na 0 °C, polako je dodan rastvor 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)acetil hlorida 1e (4.24 g, 13.1 mmol, sinteza: vidi Primer 1) u CH2Cl2(10 mL). Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 3 h. Dodan je 1M rastvor Rochelle-ove soli. Nakon 30 min na sobnoj temperaturi, reakciona smeša je razređena sa CH2Cl2pa je isprana sa 6N HCl. Faze su razdvojene. Organska faza je isprana sa slanicom, filtrirana kroz filter za razdvajanje faza pa je koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom fleš-hromatografije na silika-gelu u gradijentu EtOAc (10% do 80%) u heptanu. Frakcije koje sadrže željeni produkt su spojene i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen uz pomoć precipitacije iz smeše EtOAc i heptana koje daje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-hloro-1H-indol-3-il)etanon 2a (2.39 g).

Sinteza intermedijara 2b:

[0061] Smeša 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-hloro-1H-indol-3-il)-etanona 2a (2.05 g, 4.68 mmol) i 10% paladijuma na ugljeniku (0.20 g) u EtOAc (30 mL) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 h u atmosferi H2. Reakciona smeša je filtrirana kroz dijatomejsku zemlju pa je isprana sa THF. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Talog je smrvljen sa EtOAc. Precipitat je sakupljen filtriranjem koje daje 1-(6-hloro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)etanon 2b (1.41 g).

Sinteza intermedijara 2c:

[0062] Rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (1.83 g, 4.87 mmol) u THF (15 mL) je dodan kap po kap, na 0 °C, u rastvor 1-(6-hloro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)etanona 2b (1.54 g, 4.43 mmol) u THF (30 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Precipitat je sakupljen filtriranjem pa je ispran sa THF. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom koje daje 2-bromo-1-(6-hloro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)etanon 2c (1.89 g) koji je korišćen u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

Sinteza Jedinjenja 2 i hiralna separacija u enantiomere 2A i 2B:

[0063] Smeša 2-bromo-1-(6-hloro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)-fenil)etanona 2c (1.89 g, 4.43 mmol) i 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (2.67 g, 13.3 mmol) u CH3CN (45 mL) je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Talog je podeljen između EtOAc i 1N HCl. Faze su razdvoje. Organska faza je isprana sa vodenim zasićenim rastvorom NaHCO3i slanicom, osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Talog

2

je prečišćen primenom fleš-hromatografije na silika-gelu u gradijentu EtOAc (40% do 100%) u heptanu. Frakcije koje sadrže željeni produkt su spojene i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Talog je smrvljen uz pomoć smeše Et2O i CH2Cl2. Precipitat je sakupljen filtriranjem pa je prečišćen primenom fleš-hromatografije na silika-gelu u gradijentu MeOH (1% do 10%) u CH2Cl2koje daje 1-(6-hloro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-etanon (Jedinjenje 2, 1.05 g) u formi racemske smeše.

[0064] Enantiomeri Jedinjenja 2 (1.01 g) su razdvojeni uz pomoć hiralnog SFC (stacionarna faza: Chiralpak<®>IA 5 µm 20 x 250 mm, mobilna faza: 50% CO2, 50% MeOH) koje daje 460 mg prvo-eluiranog enantiomera i 424 mg drugo-eluiranog enantiomera. Obe frakcije su ponovo prečišćene primenom fleš-hromatografije na silika-gelu (15-40 µm, 12 g, CH2Cl2/MeOH = 99.5/0.5). Čiste frakcije su spojene i isparene do suvoće. Talozi su očvrsnuli uz pomoć mrvljenja sa smešom Et2O i diizopropil etrom. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem pa su osušene koje obezbeđuje 353 mg prvo-eluiranog enantiomera i 363 mg drugo-eluiranog enantiomera. Prvo-eluirani enantiomer je dodatno prečišćen uz pomoć ahiralnog SFC (stacionarna faza: DEAP (dietilaminopropil) 5 µm 150 x 21.2 mm, mobilna faza: 60% CO2, 40% EtOH (+ 0.3% iPrNH2)). Čiste frakcije su spojene i isparene do suvoće, a tada su očvrsnule uz pomoć mrvljenja sa smešom MeOH/voda. Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa diizopropil etrom pa je osušen koje daje enantiomer 2A (269 mg). Drugo-eluirani enantiomer je dodatno prečišćen uz pomoć ahiralnog SFC (stacionarna faza: DEAP 5 µm 150 x 21.2 mm, mobilna faza: 60% CO2, 40% EtOH (+ 0.3% iPrNH2)). Čiste frakcije su spojene i isparene do suvoće, a tada su očvrsnule uz pomoć mrvljenja sa smešom MeOH/voda. Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa diizopropil etrom pa je osušen koje daje enantiomer 2B (261 mg).

Jedinjenje 2:

[0065]<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.10 (s, 3 H) 3.74 (s, 3 H) 3.86 - 4.12 (m, 2 H) 4.20 (m, 2 H) 5.32 (br. s., 1 H) 6.38 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.59 (s, 1 H) 6.67 (s, 1 H) 6.74 (td, J=8.4, 2.2 Hz, 1 H) 6.91 - 7.00 (m, 2 H) 7.08 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.24 (dd, J=8.5, 1.7 Hz, 1 H) 7.39 (t, J=7.7 Hz, 1 H) 7.52 (d, J=1.5 Hz, 1 H) 8.18 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 8.72 (s, 1 H) 12.24 (br. s., 1 H)

LC/MS (postupak LC-F): Rt1.25 min, MH<+>547

Enantiomer 2A:

[0066]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.89 - 4.07 (m, 2 H) 4.18 (br t, J=4.3 Hz, 2 H) 5.31 (br s, 1 H) 6.36 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.57 (s, 1 H) 6.65 (br s, 1 H) 6.72 (td, J=8.4, 2.0 Hz, 1 H) 6.90 - 6.98 (m, 2 H) 7.06 (br d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.22 (dd, J=8.5, 1.6 Hz, 1 H) 7.37 (t, J=7.7 Hz, 1 H) 7.50 (d, J=1.3 Hz, 1 H) 8.16 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 8.70 (s, 1 H) 12.21 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt2.94 min, MH<+>547

[α]D<20>: 127.6° (c 0.25, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-A): Rt2.02 min, MH<+>547, Hiralna čistoća 98.22%.

Tačka topljenja: 118 °C

Enantiomer 2B:

[0067]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.89 - 4.07 (m, 2 H) 4.15 - 4.20 (m, 2 H) 5.31 (br s, 1 H) 6.36 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 6.57 (s, 1 H) 6.65 (br s, 1 H) 6.72 (td, J=8.4, 2.0 Hz, 1 H) 6.89 - 6.99 (m, 2 H) 7.06 (br d, J=7.6 Hz, 1 H) 7.22 (dd, J=8.5, 1.3 Hz, 1 H) 7.37 (t, J=7.7 Hz, 1 H) 7.50 (d, J=1.3 Hz, 1 H) 8.16 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 8.70 (s, 1 H) 12.21 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt2.94 min, MH<+>547

[α]D<20>: -125.6° (c 0.2555, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-A): Rt2.40 min, MH<+>547, Hiralna čistoća 100%.

Tačka topljenja: 117 °C

Primer 3: sinteza 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Jedinjenje 3) i hiralna separacija u enantiomere 3A i 3B

[0068]

Sinteza intermedijara 3a:

2

[0069] 1M dietilaluminijum hlorid u heksanu (13.2 mL, 13.2 mmol) je dodan kap po kap, na 0 °C, u rastvor 6-fluoro-7-metil-1H-indola [CAS 57817-10-4] (1.3 g, 8.71 mmol) u CH2Cl2(17 mL). Nakon 30 min na 0 °C, polako je dodan rastvor 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)acetil hlorida 1e (4.22 g, 13.1 mmol, sinteza: vidi Primer 1) u dihlorometanu (17 mL). Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 2 h. Dodan 1M rastvor Rochelle-ove soli. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 h pa je ekstrahovana dva puta sa EtOAc. Organske faze su spojene, isprane sa slanicom, osušene preko MgSO4, filtrirane i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Talog je rastvoren sa minimalnom količinom CH2Cl2. Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa CH2Cl2i osušen u vakuumu koje daje prvu šaržu 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 3a (1.2 g). Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom flešhromatografije na silika-gelu u gradijentu EtOAc (5% do 50%) u heptanu. Frakcije koje sadrže produkt su spojene i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Talog je smrvljen sa CH3CN. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem, isprane sa CH2Cl2pa su osušene u vakuumu koje daje drugu šaržu 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 3a (0.88 g). Filtrat je delomično koncentrovan. Nastala čvrsta materija je sakupljena filtriranjem, isprana sa CH2Cl2i osušena u vakuumu koje daje treću šaržu 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 3a (0.17 g).

Sinteza intermedijara 3b:

[0070] Smeša 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 3a (1.95 g, 4.48 mmol) i 10% paladijuma na ugljeniku (0.2 g) u EtOAc (120 mL) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 h u atmosferi H2. Reakciona smeša je filtrirana kroz pločicu celite<®>. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Talog je rastvoren sa minimalnom količinom CH2Cl2. Precipitat je sakupljen filtriranjem pa je osušen u vakuumu koje daje 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanon 3b (1.27 g).

Sinteza intermedijara 3c:

[0071] Rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (1.77 g, 4.71-mmol) u THF (28 mL) je dodan kap po kap, na 0 °C, u rastvor 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 3b (1.48 g, 4.29 mmol) u THF (40 mL). Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 15 min pa na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Precipitat je sakupljen filtriranjem pa je ispran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom koje daje

2

2-bromo-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanon 3c (1.82 g) koji je korišćen u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

Sinteza Jedinjenja 3 i hiralna separacija u enantiomere 3A i 3B:

[0072] Smeša 2-bromo-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 3c (1.16 g, 2.63 mmol) i 3-metoksi-5-(metilsulfonil)-anilina [CAS 62606-02-4] (1.59 g, 7.90 mmol) u CH3CN (6 mL) i THF (6 mL) je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smeša je razređena sa EtOAc pa je isprana sa 1N HCl. Faze su razdvoje. Organska faza je isprana sa 1N HCl, vodenim zasićenim rastvorom NaHCO3, H2O i slanicom, osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom fleš-hromatografije na silika-gelu u gradijentu EtOAc (15% do 100%) u CH2Cl2. Frakcije koje sadrže željeno jedinjenje su spojene i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Talog je rastvoren sa minimalnom količinom CH2Cl2. Precipitat je sakupljen filtriranjem pa je osušen u vakuumu koje daje prvu šaržu 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Jedinjenje 3, 0.73 g) u formi racemske smeše. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Talog je smrvljen sa CH2Cl2i CH3CN. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem pa su osušene pod smanjenim pritiskom koje obezbeđuje drugu šaržu Jedinjenja 3 (0.23 g) u formi racemske smeše. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom fleš-hromatografije na silika-gelu u gradijentu EtOAc (15% do 100%) u CH2Cl2. Frakcije koje sadrže Jedinjenje 3 su spojene i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Talog je smrvljen sa CH2Cl2. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem pa su osušene pod smanjenim pritiskom koje obezbeđuje treću šaržu Jedinjenja 3 (0.20 g) u formi racemske smeše.

[0073] Hiralna separacija enantiomera Jedinjenja 3 (1.15 g) je provedena primenom hiralne separacije normalne faze (Normal Phase Chiral Separation; stacionarna faza: AS 20 µm, mobilna faza: 100% MeOH). Frakcije sa produktom su spojene i isparene koje obezbeđuje enantiomer 3A kao prvo-eluirani produkt i enantiomer 3B kao drugo-eluirani produkt. Enantiomer 3A je prečišćen primenom fleš-hromatografije (stacionarna faza: Grace Reveleris<®>silica 40 g, mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH, gradijent od 100/0/0 do 40/45/15). Frakcije koje sadrže produkt su spojene i isparene, pa su ko-isparene sa MeOH. Penasti talog je izmešan sa H2O (8 mL), a tada je dodan MeOH (2.5 mL), kap po kap. Nakon mešanja tokom 15 min, precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa smešom H2O/MeOH = 3/1 (4 x 1.5 mL), pa je osušen u vakuumu na 50 °C koje obezbeđuje enantiomer 3A (0.341 g). Enantiomer 3B je

2

prečišćen primenom fleš-hromatografije (stacionarna faza: Grace Reveleris® silica 40 g, mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH, gradijent od 100/0/0 do 40/45/15). Frakcije koje sadrže produkt su spojene i isparene. Uljasti talog je izmešan sa H2O (8 mL), a tada je dodan MeOH (17.5 mL), kap po kap. Nakon mešanja tokom 15 min, precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa MeOH/H2O = 1/1 (4 x 1.5 mL), pa je osušen u vakuumu na 50 °C koje obezbeđuje enantiomer 3B (0.266 g).

Jedinjenje 3:

[0074]<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.39 (s, 3 H) 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.90 -4.11 (m, 2 H) 4.17 (m, 2 H) 5.32 (br. s., 1 H) 6.39 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.57 (s, 1 H) 6.66 (s, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.3 Hz, 1 H) 6.89 - 7.10 (m, 4 H) 7.37 (t, J=7.1 Hz, 1 H) 7.99 (dd, J=8.7,5.5 Hz, 1 H) 8.63 (s, 1 H) 12.22 (br. s., 1 H)

LC/MS (postupak LC-E): Rt1.07 min, MH<+>545

Enantiomer 3A:

[0075]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.35 - 2.43 (m, 3 H) 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.89 - 4.10 (m, 2 H) 4.17 (t, J=4.8 Hz, 2 H) 5.32 (t, J=5.7 Hz, 1 H) 6.39 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.56 - 6.58 (m, 1 H) 6.65 - 6.68 (m, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.91 - 6.98 (m, 2 H) 6.98 - 7.07 (m, 2 H) 7.37 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 7.99 (dd, J=8.7, 5.2 Hz, 1 H) 8.63 (d, J=3.2 Hz, 1 H) 12.22 (d, J=3.2 Hz, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1.08 min, MH<+>545 [α]D<20>: 110.0° (c 0.46, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-E): Rt3.30 min, MH<+>545, Hiralna čistoća 100%.

Tačka topljenja: 212°C

Enantiomer 3B:

[0076]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.35 - 2.42 (m, 3 H) 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.90 - 4.10 (m, 2 H) 4.18 (t, J=4.8 Hz, 2 H) 5.32 (t, J=5.7 Hz, 1 H) 6.39 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.55 - 6.59 (m, 1 H) 6.66 - 6.68 (m, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.91 - 6.97 (m, 2 H) 6.98 - 7.07 (m, 2 H) 7.37 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 7.99 (dd, J=8.7, 5.2 Hz, 1 H) 8.64 (d, J=3.2 Hz, 1 H) 12.22 (d, J=3.2 Hz, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.08 min, MH<+>545

[α]D<20>: -107.3° (c 0.4985, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-E): Rt3.74 min, MH<+>545, Hiralna čistoća 100%.

Tačka topljenja: 214°C

2

Primer 4: sinteza 1-(6-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-etanona (Jedinjenje 4) i hiralna separacija u enantiomere 4A i 4B

[0077]

Sinteza intermedijara 4a:

[0078] 1M dietilaluminijum hlorid u heksanu (13.5 mL, 13.5 mmol) je dodan kap po kap, na 0 °C, u rastvor 6-hloro-7-metil-1H-indola [CAS 57817-09-1] (1.49 g, 9 mmol) u CH2Cl2(70 mL). Nakon 30 min na 0 °C, polako je dodan 2-(2-(2-(benziloksi)-etoksi)-4-fluorofenil)acetil hlorid 1e (8.5 g, 26.3 mmol) u CH2Cl2(20 mL) na 0 °C. Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 3 h. Dodana je smeša led-voda, a reakciona smeša je ekstrahovana sa CH2Cl2. Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran, a rastvarač je isparen u vakuumu. Sirovi produkt je prečišćen primenom fleš-hromatografije na silika-gelu (15-40 µm, 120 g, CH2Cl2/CH3OH = 99.5/0.5). Čiste frakcije su spojene i isparene do suvoće koje daje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)etanon 4a (1.86 g).

Sinteza intermedijara 4b:

[0079] Smeša 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 4a (1.76 g, 3.9 mmol) u CH3OH (40 mL) i THF (40 mL) je hidrogenovana pod atmosferskim pritiskom (H2) tokom 2 h uz pomoć Pd/C (10%) (170 mg, 0.16 mmol) koji je služio kao katalizator. Smeša je filtrirana kroz pločicu celite<®>pa je isprana sa smešom EtOAc/THF = 70/30. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Talog je pretvoren u čvrstu materiju uz pomoć mrvljenja sa smešom CH3CN/diizopropil etar. Precipitat je sakupljen

2

filtriranjem pa je osušen koje daje 1-(6-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)etanon 4b u formi belog praha (800 mg).

Sinteza Jedinjenja 4 i hiralna separacija enantiomera 4A i 4B:

[0080] U uslovima protoka N2na 0 °C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (0.89 g, 2.38 mmol) u THF (40 mL) je dodan kap po kap u rastvor 1-(6-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-etanona 4b (0.86 g, 2.38 mmol) u THF (20 mL). Smeša je mešana na 0 °C tokom 1 h, hladna banja je odstranjena, a mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi tokom 3 h. Dodan je 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilin [CAS 62606-02-4] (1.43 g, 7.13 mmol) u CH3CN (20 mL), kap po kap, a nastala smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h. Smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Talog je rastvoren uz pomoć EtOAc pa je ispran sa 1N HCl (dva puta), osušen preko MgSO4, filtriran, a rastvarač je isparen pod smanjenim pritiskom. Sirovi produkt je kristalizovan iz smeše CH3CN/diizopropil etar koje daje 1-(6-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanon (Jedinjenje 4, 1.07 g) u formi racemske smeše.

[0081] Enantiomeri Jedinjenja 4 (837 mg) su razdvojeni uz pomoć hiralnog SFC (stacionarna faza: Chiralcel<®>OD-H 5 µm 250 x 30 mm, mobilna faza: 60% CO2, 40% EtOH (+ 0.3% iPrNH2)) koje daje 326 mg prvo-eluiranog enantiomera i 350 mg drugo-eluiranog enantiomera. Prvo-eluirani enantiomer je bio preveden u čvrstu materiju uz pomoć mrvljenja sa smešom CH3CN/diizopropil etar. Precipitat je sakupljen filtriranjem pa je osušen koje daje 298 mg enantiomera 4A. Drugo-eluirani enantiomer je kristalizovan iz smeše CH3CN/diizopropil etar. Precipitat je sakupljen filtriranjem pa je osušen koje daje 267 mg enantiomera 4B.

Jedinjenje 4:

[0082]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.09 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.92 - 4.08 (m, 2 H) 4.13 - 4.21 (m, 2 H) 5.32 (br s, 1 H) 6.40 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 6.57 (s, 1 H) 6.67 (br s, 1 H) 6.71 (td, J=8.4, 2.0 Hz, 1 H) 6.92 - 6.98 (m, 2 H) 7.05 (br d, J=7.6 Hz, 1 H) 7.23 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.37 (t, J=7.7 Hz, 1 H) 8.00 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 8.64 (s, 1 H) 12.28 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3.07 min, MH<+>561

Enantiomer 4A:

[0083]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.91 - 4.07 (m, 2 H) 4.17 (t, J=4.6 Hz, 2 H) 5.31 (br s, 1 H) 6.39 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.57 (t, J=1.7 Hz, 1 H) 6.66 (br s, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.5 Hz, 1 H) 6.91 - 6.98 (m, 2 H) 7.04 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 7.22 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.5, 6.9 Hz, 1 H) 8.00 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 8.64 (s, 1 H) 12.28 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3.07 min, MH<+>561

[α]D<20>: -110.2° (c 0.256, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-B): Rt3.52 min, Hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 4B:

[0084]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.92 - 4.07 (m, 2 H) 4.17 (t, J=4.6 Hz, 2 H) 5.32 (br s, 1 H) 6.39 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 6.57 (t, J=1.7 Hz, 1 H) 6.66 (s, 1 H) 6.71 (td, J=8.4, 2.4 Hz, 1 H) 6.91 - 6.97 (m, 2 H) 7.04 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.22 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.8, 6.9 Hz, 1 H) 8.00 (d, J=8.5 Hz, 1 H) 8.64 (s, 1 H) 12.19 (br s, 1 H) LC/MS (postupak LC-C): Rt3.07 min, MH<+>561

[α]D<20>: 112.8° (c 0.257, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-B): Rt4.69 min, Hiralna čistoća 100%.

Tačka topljenja: 162 °C

Primer 5: sinteza 1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksi-etoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Jedinjenje 5) i hiralna separacija u enantiomere 5A i 5B

[0085]

Sinteza intermedijara 5a:

1

[0086] 1M dietilaluminijum hlorid u heksanu (9.5 mL, 9.50 mmol) je dodan kap po kap, na 0 °C, u rastvor 5,6-difluoro-1H-indola [CAS 169674-01-5] (0.73 g, 4.73 mmol) u CH2Cl2(20 mL). Nakon 30 min na 0 °C, polako je dodan rastvor 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)acetil hlorida 1e (2.29 g, 7.10 mmol, sinteza: vidi Primer 1) u dihlorometanu (12 mL). Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 3 h. Dodan je 1M rastvor Rochelle-ove soli. Nakon mešanja na sobnoj temperaturi tokom 2 h, reakciona smeša je zakiseljena sa 1N HCI pa je ekstrahovana dva puta sa EtOAc. Organske faze su spojene, isprane sa slanicom, osušene preko MgSO4, filtrirane i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom fleš-hromatografije na silika-gelu u gradijentu EtOAc (0% do 50%) u heptanu koje daje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)etanon 5a (0.66 g).

Sinteza intermedijara 5b:

[0087] Smeša 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-etanona 5a (0.66 g, 1.50 mmol) i 10% paladijuma na ugljeniku (0.07 g) u EtOAc (15 mL) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 h u atmosferi H2. Reakciona smeša je filtrirana kroz celite<®>. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen promenom flešhromatografije na silika-gelu u gradijentu EtOAc (30% do 85%) u heptanu koje daje 1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)etanon 5b (0.28 g).

Sinteza intermedijara 5c:

[0088] Rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (0.93 g, 2.47 mmol) u THF (10 mL) je dodan kap po kap, na 0 °C, u rastvor 1-(5,6-di-fluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)-fenil)etanona 5b (0.79 g, 2.29 mmol) u THF (15 mL). Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 15 min pa na sobnoj temperaturi tokom 2.5 h. Precipitat je sakupljen filtriranjem pa je ispran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom koje daje 2-bromo-1-5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)etanon 5c (0.98 g) koji je korišćen u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

Sinteza Jedinjenja 5 i hiralna separacija u enantiomere 5A i 5B:

[0089] Smeša 2-bromo-1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)etanona 5c (0.98 g, 2.28 mmol) i 3-metoksi-5-(metilsulfonil)-anilina [CAS 62606-02-4] (1.36 g, 6.78 mmol) u CH3CN (6 mL) i THF (6 mL) je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Talog je podeljen

2

između EtOAc i 1N HCl. Faze su razdvoje. Vodena faza je ekstrahovana dva puta sa EtOAc. Organske faze su spojene, isprane sa slanicom, osušene preko MgSO4, filtrirane i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom fleš-hromatografije na silika-gelu u gradijentu EtOAc (15% do 70%) u CH2Cl2. Frakcije koje sadrže željeno jedinjenje su spojene i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Talog je smrvljen sa EtOAc. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem pa su osušene u vakuumu koje daje 1-(5,6-difluoro-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)-amino)etanon (Jedinjenje 5, 0.53 g) u formi racemske smeše.

[0090] Hiralna separacija enantiomera Jedinjenja 5 (482 mg) je provedena uz pomoć hiralne separacije normalne faze (stacionarna faza: AS 20 µm, mobilna faza: 100% MeOH). Frakcije sa produktom su spojene i isparene pod smanjenim pritiskom koje obezbeđuje enantiomer 5A kao prvo-eluirani produkt i enantiomer 5B kao drugo-eluirani produkt. Enantiomer 5A je prečišćen primenom fleš-hromatografije (stacionarna faza: Grace Reveleris<®>silica 12 g, mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH, gradijent od 100/0/0 do 40/45/15). Frakcije koje sadrže produkt su spojene, isparene pod smanjenim pritiskom pa su ko-isparene iz CH3CN. Talog je liofilizovan iz smeše CH3CN (3 mL) i vode (3 mL) pa je osušen u vakuumu na 50 °C koje obezbeđuje enantiomer 5A (0.147 g). Enantiomer 5B je prečišćen primenom flešhromatografije (stacionarna faza: Grace Reveleris® silica 12 g, mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH, gradijent od 100/0/0 do 40/45/15). Frakcije koje sadrže produkt su spojene, isparene pod smanjenim pritiskom i ko-isparene iz CH3CN. Talog je liofilizovan iz smeše CH3CN (3 mL) i vode (3 mL) pa je osušen u vakuumu na 50 °C koje obezbeđuje enantiomer 5B (0.107 g).

Jedinjenje 5:

[0091]<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.89 - 4.09 (m, 2 H) 4.18 (m, 2 H) 5.30 (t, J=5.3 Hz, 1 H) 6.36 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 6.58 (s, 1 H) 6.65 (s, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.3 Hz, 1 H) 6.90 - 6.99 (m, 2 H) 7.07 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 7.37 (t, J=7.1 Hz, 1 H) 7.50 (dd, J=10.7,7.0 Hz, 1 H) 8.01 (dd, J=11.2,8.2 Hz, 1 H) 8.72 (s, 1 H) 12.29 (br. s., 1 H) LC/MS (postupak LC-F): Rt 1.10 min, MH+ 549

Enantiomer 5A:

[0092]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.86 - 4.07 (m, 2 H) 4.17 (t, J=4.8 Hz, 2 H) 5.30 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 6.35 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 6.57 (t, J=1.9 Hz, 1 H) 6.63 - 6.67 (m, 1 H) 6.72 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.91 - 6.97 (m, 2 H) 7.07 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 7.50 (dd, J=10.7, 7.0 Hz, 1 H) 8.01 (dd, J=11.1, 8.1 Hz, 1 H) 8.72 (s, 1 H) 12.29 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.03 min, MH<+>549

[α]D<20>: 122.7° (c 0.49, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-E): Rt3.28 min, MH<+>549, Hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 5B:

[0093]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.86 - 4.07 (m, 2 H) 4.18 (br t, J=4.8 Hz, 2 H) 5.30 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 6.36 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 6.58 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.63 - 6.67 (m, 1 H) 6.73 (td, J=8.5, 2.5 Hz, 1 H) 6.91 - 6.97 (m, 2 H) 7.07 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 7.38 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 7.50 (dd, J=10.7, 6.9 Hz, 1 H) 8.02 (dd, J=11.1, 8.1 Hz, 1 H) 8.72 (s, 1 H) 12.29 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.04 min, MH<+>549

[α]D<20>: -123.3° (c 0.48, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-E): Rt3.74 min, MH<+>549, Hiralna čistoća 100%.

Primer 6: sinteza 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona (Jedinjenje 6) i hiralna separacija u enantiomere 6A i 6B

[0094]

Sinteza intermedijara 6a:

[0095] 1M dietilaluminijum hlorid u heksanu (35.8 mL, 35.8 mmol) je dodan kap po kap, na 0 °C, u rastvor 6-metoksi-5-metil-1H-indola [CAS 1071973-95-9] (3.85 g, 23.9 mmol) u CH2Cl2(50 mL). Nakon 30 min na 0 °C, polako je dodan 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-

4

fluorofenil)acetil hlorid 1e (8.5 g, 26.3 mmol) u CH2Cl2(50 mL) na 0 °C. Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 3 h. Dodana je smeša led-voda, a reakciona smeša je ekstrahovana sa smešom CH2Cl2/CH3OH = 90/10. Organski sloj je ispran sa zasićenim rastvorom Rochelle-ove soli, a tada i sa slanicom, pa je osušen preko MgSO4, filtriran, a rastvarač je isparen pod smanjenim pritiskom. Talog je rastvoren sa minimalnom količinom CH2Cl2, precipitat je sakupljen filtriranjem pa je osušen koje obezbeđuje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 6a (6.6 g).

Sinteza intermedijara 6b:

[0096] Smeša 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 6a (5.2 g, 11.6 mmol) u CH3OH (200 mL) j THF (100 mL) je hidrogenovana pod atmosferskim pritiskom (H2) tokom 15 min uz 20% Pd(OH)2/C (2.45 g, 3.49 mmol). Smeša je filtrirana kroz pločicu celite<®>pa je isprana sa smešom EtOAc/THF = 70/30. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Jedinjenje je smrvljeno sa Et2O, precipitat je sakupljen filtriranjem pa je osušen koje daje 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 6b u formi belog praha (2.54 g).

Sinteza Jedinjenja 6 i hiralna separacija enantiomera 6A i 6B:

[0097] U uslovima protoka N2, na 0 °C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (2.4 g, 6.38 mmol) u THF (15 mL) je dodan kap po kap u rastvor 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)-etanona 6b (2.28 g, 6.38 mmol) u THF (100 mL). Smeša je mešana na 0 °C tokom 1 h, hladna banja je odstranjena, a mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi tokom 3 h.3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilin [CAS 62606-02-4] (3.85 g, 19.1 mmol) u CH3CN (45 mL) je dodan kap po kap, a nastala smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 72 h. Smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Talog je rastvoren sa EtOAc pa je ispran sa 1N HCl (dva puta), osušen preko MgSO4, filtriran, a rastvarač je isparen pod smanjenim pritiskom. Sirovi talog (4 g) je spojen sa drugom frakcijom (1 g) pa je sve prečišćeno primenom fleš-hromatografije na silika-gelu (15-40 µm, 120 g, CH2Cl2/CH3OH = 99/1). Čiste frakcije su spojene i isparene do suvoće koje daje 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)-amino)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanon (Jedinjenje 6, 1.3 g) u formi racemske smeše.

[0098] Enantiomeri Jedinjenja 6 (1.55 g) su razdvoji uz pomoć hiralnog SFC (stacionarna faza: Chiralcel<®>OD-H 5 µm 250 x 30 mm, mobilna faza: 60% CO2, 40% EtOH (+0.3% iPrNH2)) koje daje 590 mg prvo-eluiranog enantiomera i 613 mg drugo-eluiranog enantiomera. Prvoeluirani enantiomer je kristalizovan iz Et2O. Precipitat je sakupljen filtriranjem pa je osušen koje daje 529 mg enantiomera 6A. Drugo-eluirani enantiomer je kristalizovan iz Et2O. Precipitat je sakupljen filtriranjem pa je osušen koje daje 517 mg enantiomer 6B.

Jedinjenje 6:

[0099]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.21 (s, 3 H) 3.08 (s, 3 H) 3.71 (s, 3 H) 3.79 (s, 3 H) 3.90 - 3.97 (m, 1 H) 3.98 - 4.06 (m, 1 H) 4.17 (t, J=4.6 Hz, 2 H) 5.29 (br t, J=4.9 Hz, 1 H) 6.31 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 6.56 (t, J=1.7 Hz, 1 H) 6.64 (s, 1 H) 6.71 (td, J=8.4, 2.4 Hz, 1 H) 6.89 (s, 1 H) 6.91 - 6.95 (m, 2 H) 6.99 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.5, 6.9 Hz, 1 H) 7.91 (s, 1 H) 8.48 (s, 1 H) 11.82 (s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-G): Rt2.67 min, MH<+>557

Enantiomer 6A:

[0100]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.21 (s, 3 H) 3.08 (s, 3 H) 3.71 (s, 3 H) 3.79 (s, 3 H) 3.94 (dq, J=8.2, 4.1 Hz, 1 H) 4.03 (dq, J=11.7, 5.6 Hz, 1 H) 4.17 (t, J=4.6 Hz, 2 H) 5.29 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 6.32 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.56 (m, 1 H) 6.64 (br s, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.2 Hz, 1 H) 6.89 (s, 1 H) 6.91 - 6.96 (m, 2 H) 6.99 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.5, 6.9 Hz, 1 H) 7.91 (s, 1 H) 8.48 (s, 1 H) 11.82 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt2.87 min, MH<+>557

[α]D<20>: 125.5° (c 0.2527, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-C): Rt2.52 min, MH<+>557, Hiralna čistoća 100%.

Tačka topljenja: 232°C

Enantiomer 6B:

[0101]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.21 (s, 3 H) 3.08 (s, 3 H) 3.71 (s, 3 H) 3.79 (s, 3 H) 3.90 - 3.97 (m, 1 H) 3.99 - 4.07 (m, 1 H) 4.17 (t, J=4.6 Hz, 2 H) 5.29 (br s, 1 H) 6.32 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.56 (m, 1 H) 6.64 (br s, 1 H) 6.71 (td, J=8.4, 2.4 Hz, 1 H) 6.89 (s, 1 H) 6.91 -6.96 (m, 2 H) 6.99 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.4, 7.1 Hz, 1 H) 7.91 (s, 1 H) 8.48 (s, 1 H) 11.82 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt2.87 min, MH<+>557

[α]D<20>: -127.1° (c 0.2455, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-C): Rt4.14 min, MH<+>557, Hiralna čistoća 100%.

Tačka topljenja: 235°C

Primer 7: sinteza 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Jedinjenje 7) i hiralna separacija u enantiomere 7A i 7B.

[0102]

Sinteza intermedijara 7a:

[0103] 1M dietilaluminijum hlorid u heksanu (25.1 mL, 25.1 mmol) je dodan kap po kap, na 0 °C i u uslovima N2-protoka, u rastvor 6-fluoro-5-metil-1H-indola [CAS 162100-95-0] (2.5 g, 16.8 mmol) u CH2Cl2(135 mL). Nakon 10 min na 0 °C je dodan rastvor 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)acetil hlorida 1e (8.11 g, 25.1 mmol) u CH2Cl2(50 mL), kap po kap na 0 °C tokom perioda od 45 min, uz održavanje reakcione temperature ispod 5 °C. Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 2 h pa na 10 °C tokom 2 h. Reakciona smeša je ohlađen do 0 °C, a rastvor Rochelle-ove soli [6100-16-9] (9.46 g, 33.5 mmol) u vodi (10 mL) je dodan kap po kap. Nakon dodavanja, reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 10 min pa je ostavljena da se ugreje do sobne temperature. Dodani su THF (150 mL) i Na2SO4(40 g), a smeša je mešana tokom 18 h. Smeša je filtrirana kroz dicalite<®>pa je isprana sa puno THF. Spojeni filtrati su isparen pod smanjenim pritiskom, pa su ko-ispareni sa toluenom. Talog je kristalizovan iz CH3CN (10 mL), sakupljen filtriranjem, ispran sa CH3CN (2x), i osušen u vakuumu na 40 °C koje obezbeđuje prvu frakciju 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 7a (1.86 g). Filtrat je isparen pod smanjenim pritiskom. Talog (7.7 g) je prečišćen promenom fleš-hromatografije (stacionarna faza: Grace Reveleris<®>silica 120 g, mobilna faza: heptan/EtOAc, gradijent od 100/0 do 0/100). Frakcije koje sadrže produkt su spojene i ostavljene da stoje u otvorenoj posudi da se omogući isparavanje rastvarača i kristalizovanje produkta. Precipitat je izolovan uz pomoć filtracije, ispran 3x sa smešom heptan/EtOAc (1/1) pa je osušen u vakuumu na 40 °C koje obezbeđuje drugu (1.51 g) i treću (0.75 g) frakciju intermedijara 7a.

Sinteza intermedijara 7b:

[0104] Smeša 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 7a (1.86 g, 4.27 mmol) u metanolu (80 mL) je hidrogenovana pod atmosferskim pritiskom (H2) tokom 90 min uz 10% Pd/C (0.5 g). Smeša je filtrirana kroz pločicu dicalite® pa je isprana sa MeOH. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Čvrsti talog je izmešan sa diizopropil etrom (10 mL). Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa DIPE (4x 1.5 mL) pa je osušen u vakuumu na 50 °C koje daje 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksi-etoksi)fenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 7b (330 mg).

Sinteza Jedinjenja 7 i hiralna separacija enantiomera 7A i 7B:

[0105] U uslovima protoka N2, na 0 °C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (447 mg, 1.24 mmol) u THF (25 mL) je dodan kap po kap u rastvor 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)-etanona 7b (390 mg, 1.13 mmol) u THF (25 mL). Smeša je mešana na 0 °C tokom 2 h pa na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Reakciona smeša, koja sadrži sirovi 2-bromo-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 7c, je pomešana sa rastvorom 3-metoksi-5-(metilsulfonil)-anilina [CAS 62606-02-4] (579 mg, 2.88 mmol) i diizopropiletilamina (165 µL, 0.96 mmol) u CH3CN (100 mL), a reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći, u N2-atmosferi. Reakciona temperatura je naknadno povećana do 50 °C tokom 4 h pa do 60 °C tokom 24 h. Rastvarači su ispareni pod smanjenim pritiskom. Talog je rastvoren u DCM (100 mL) pa je ispran sa 1N HCI (100 mL). Organski sloj je ispran sa vodom (100 mL), osušen preko MgSO4, filtriran i isparen pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije (stacionarna faza: Grace Reveleris<®>120 g, eluent: EtOAc/EtOH(3:1)/heptan, gradijent od 0/100 do 50/50). Frakcije koje sadrže produkt su spojene i isparene pod smanjenim pritiskom. Čvrsti talog je kristalizovan iz smeše MeOH/voda. Precipitat je izolovan uz pomoć filtracije, ispran sa smešom MeOH/voda = 1/1 (4 mL) i osušen u vakuumu na 50 °C koje obezbeđuje racemski 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-etanon (Jedinjenje 7, 205 mg).

[0106] Hiralna separacija enantiomera Jedinjenja 7 je provedena uz pomoć preparativnog SFC (stacionarna faza: Chiralpak<®>Diacel AS 20 x 250 mm, mobilna faza: CO2, EtOH 0.4% iPrNH2). Frakcije koje sadrže produkt su spojene i isparene koje obezbeđuje enantiomer 7A kao prvo-eluirani produkt i enantiomer 7B kao drugo-eluirani produkt. Oba enantiomera su izmešana sa smešom MeOH/voda = 1/1 (10 mL), a nastala smeša je mešana tokom 1 h. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem i osušene u vakuumu na 40 °C koje obezbeđuje enantiomer 7A (8 mg) i enantiomer 7B (32 mg), oba u formi belog praha.

Enantiomer 7A:

[0107]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.30 (d, J=1.1 Hz, 3 H) 3.07 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.89 - 4.07 (m, 2 H) 4.18 (t, J=4.5 Hz, 2 H) 5.28 (br s, 1 H) 6.33 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.57 (t, J=1.7 Hz, 1 H) 6.64 (t, J=2.3 Hz, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.89 - 6.96 (m, 2 H) 6.99 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.19 (d, J=10.1 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.6, 7.0 Hz, 1 H) 8.03 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 8.61 (s, 1 H) 11.89 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-B): Rt1.95 min, MH<+>545

[α]D<20>: 141.4° (c 0.43, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-E): Rt3.36 min, MH<+>545, Hiralna čistoća 98.9%.

Enantiomer 7B:

[0108]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.30 (d, J=1.3 Hz, 3 H) 3.07 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.88 - 4.05 (m, 2 H) 4.18 (t, J=4.6 Hz, 2 H) 5.34 (br s, 1 H) 6.32 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.56 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.64 (t, J=2.1 Hz, 1 H) 6.70 (td, J=8.4, 2.3 Hz, 1 H) 6.89 - 6.95 (m, 2 H) 6.98 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.19 (d, J=10.1 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 8.02 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 8.62 (s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-B): Rt1.95 min, MH<+>545

[α]D<20>: -144.7° (c 0.465, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-E): Rt3.77 min, MH<+>545, Hiralna čistoća 100%.

Primer 8: sinteza 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Jedinjenje 8) i hiralna separacija u enantiomere 8A i 8B

[0109]

Sinteza intermedijara 8a:

[0110] 1M dietilaluminijum hlorid u heksanu (18.6 mL, 18.6 mmol) je dodan kap po kap, na 0 °C i u uslovima N2-protoka, u rastvor 7-fluoro-5-metil-1H-indola [CAS 442910-91-0] (1.85 g, 12.4 mmol) u CH2Cl2(100 mL). Nakon 5 min na 0 °C, dodan je rastvor 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)acetil hlorida 1e (6.0 g, 18.6 mmol) u CH2Cl2(35 mL), kap po kap na 0 °C tokom perioda od 50 min, uz održavanje reakcione temperature ispod 6 °C. Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 90 min pa na 10 °C tokom 1 h. Reakciona smeša je ohlađena do 0 °C, a rastvor Rochelle-ove soli [6100-16-9] (7.0 g, 24.8 mol) u vodi (7.5 mL) je dodan kap po kap. Nakon dodavanja, reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 10 min pa je ostavljena da se ugreje do sobne temperature. Dodani su THF (125 mL) i Na2SO4(30 g), a smeša je mešana tokom 18 h. Smeša je filtrirana kroz dicalite<®>, isprana sa puno THF, a spojeni filtrati su ispareni pod smanjenim pritiskom. Talog je izmešan sa CH3CN (7.5 mL) na 40 °C tokom 1 h. Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa CH3CN (2x), i osušen u vakuumu na 40 °C koje obezbeđuje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 8a (dve žetve: 0.55 g i 1.86 g).

Sinteza intermedijara 8b:

[0111] Smeša 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 8a (2.4 g, 5.51 mmol) u EtOAc (80 mL) i THF (10 mL) je hidrogenovana pod atmosferskim pritiskom (H2) tokom 15 min uz 10% Pd/C (0.5 g). Smeša je filtrirana kroz pločicu dicalite<®>, a filter-kolač je ispran sa EtOAc i THF. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Čvrsti talog je izmešan sa smešom diizopropil etar/dietil etar = 1/1 (30 mL). Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa smešom DIPE/Et2O = 1/1 (3x) pa je osušen

4

u vakuumu na 50 °C koje daje 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 8b (1.47 g).

Sinteza intermedijara 8c:

[0112] Rastvor 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 8b (1.47 g, 4.26 mmol) u THF (40 mL) je ohlađen do 0 °C, u uslovima protoka N2. Feniltrimetilamonijum tribromid [CAS 4207-56-1] (1.68 g, 4.47 mmol) je dodan deo po deo, a reakciona smeša je mešan na 0 °C tokom 2 h pa na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa THF, a spojeni filtrati su ispareni pod smanjenim pritiskom koje daje 2-bromo-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 8c (1.81 g) koji je korišćen u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

Sinteza Jedinjenja 8 i hiralna separacija enantiomera 8A i 8B:

[0113] 2-bromo-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 8c (1.81 g, 4.26 mmol), 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilin [CAS 62606-02-4] (1.71 g, 8.51 mmol) i diizopropiletilamin (1.47 mL, 8.51 mmol) su rastvoreni u CH3CN (60 mL) i THF (40 mL), a reakciona smeša je mešana na 60 °C tokom 18 h u N2-atmosfera. Reakciona smeša je ostavljena da dostigne sobnu temperaturu, pa je izlivena u vodu (400 mL). Produkt je ekstrahovan sa Et2O (2x). Spojeni organski slojevi su isprani sa slanicom, osušeni preko MgSO4, filtrirani, i ispareni pod smanjenim pritiskom. Talog (3.4 g) je prečišćen primenom fleš-hromatografije (stacionarna faza: Grace Reveleris<®>silika 80 g, mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH, gradijent od 100/0/0 do 40/45/15). Željene frakcije su spojene i isparene pod smanjenim pritiskom. Produkt je dodatno prečišćen uz pomoć preparativne HPLC (stacionarna faza: Uptisphere<®>C18 ODB - 10 µm, 200 g, 5 cm, mobilna faza: 0.25% rastvor NH4HCO3u vodi, CH3CN). Željene frakcije su spojene, a organske isparljive materije su isparene veoma polako na rotacionom evaporatoru pod smanjenim pritiskom (temperatura banje: 40 °C), koje omogućava precipitaciju produkta. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem, isprane sa vodom (4x), i osušene u vakuumu na 50 °C koje obezbeđuje racemski 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(7-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanon (Jedinjenje 8, 1.26 g). Hiralna separacija enantiomera Jedinjenja 8 je provedena uz pomoć hiralne separacije normalne faze (stacionarna faza: AS 20 µm, mobilna faza: 100% metanol). Frakcije koje sadrže produkt su spojene i isparene koje obezbeđuje enantiomer 8A kao prvo-eluirani produkt i enantiomer 8B kao drugo-eluirani produkt. Oba taloga su izmešana sa vodom (3 mL) i MeOH (2 mL), sakupljena filtriranjem, isprana (3x) sa smešom MeOH/voda (1/2), i osušena u vakuumu na 45 °C koje obezbeđuje enantiomer 8A (416 mg) i enantiomer 8B (399 mg).

Jedinjenje 8:

[0114]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.39 (s, 3 H) 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.90 -4.03 (m, 2 H) 4.16 (t, J=4.7 Hz, 2 H) 5.22 (t, J=5.6 Hz, 1 H) 6.37 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.57 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.65 (t, J=2.3 Hz, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.87 - 6.96 (m, 3 H) 6.99 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.38 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 7.80 (br s, 1 H) 8.60 (s, 1 H) 12.50 (s, 1 H) LC/MS (postupak LC-B): Rt1.97 min, MH<+>545

Enantiomer 8A:

[0115]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.39 (s, 3 H) 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.89 -4.03 (m, 2 H) 4.16 (t, J=4.6 Hz, 2 H) 5.22 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 6.37 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.57 (t, J=1.9 Hz, 1 H) 6.65 (t, J=2.3 Hz, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.87 - 6.96 (m, 3 H) 6.99 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.38 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 7.80 (s, 1 H) 8.60 (s, 1 H) 12.50 (br s, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1.05 min, MH<+>545

[α]D<20>: 146.7° (c 0.54, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-E): Rt3.18 min, MH<+>545, Hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 8B:

[0116]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.39 (s, 3 H) 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.89 -4.03 (m, 2 H) 4.16 (t, J=4.6 Hz, 2 H) 5.22 (br t, J=5.3 Hz, 1 H) 6.36 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.57 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.65 (t, J=2.1 Hz, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.86 - 6.96 (m, 3 H) 6.99 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 7.80 (s, 1 H) 8.60 (s, 1 H) 12.50 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.05 min, MH<+>545

[α]D<20>: -144.5° (c 0.53, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-E): Rt3.59 min, MH<+>545, Hiralna čistoća 99.3%.

Primer 9: sinteza 1-(5-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-etanona (Jedinjenje 9) i hiralna separacija u enantiomere 9A i 9B

[0117]

Sinteza intermedijara 9a:

[0118] 1M dietilaluminijum hlorid u heksanu (28.1 mL, 28.1 mmol) je dodan kap po kap, na 0 °C i u uslovima N2-protoka, u rastvor 5-hloro-7-metil-1H-indola [CAS 15936-77-3] (3.1 g, 18.7 mmol) u CH2Cl2(175 mL). Nakon mešanja tokom 15 min na 0 °C, dodan je rastvor 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)acetil hlorida 1e (9.06 g, 28.1 mmol) u CH2Cl2(75 mL), kap po kap na 0 °C tokom perioda od 75 min, uz održavanje reakcione temperature ispod 4 °C. Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 4 h. Reakciona smeša je ohlađena do 0 °C, a rastvor Rochelle-ove soli [6100-16-9] (10.6 g, 37.4 mol) u vodi (11 mL) je dodan kap po kap. Nakon dodavanja, reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 10 min, a tada je ostavljena da se ugreje do sobne temperature. Dodani su THF (200 mL) i Na2SO4(45 g), a smeša je mešana tokom 18 h. Smeša je filtrirana kroz dicalite<®>, isprana sa puno THF, a spojeni filtrati su ispareni pod smanjenim pritiskom. Talog je izmešan sa CH3CN (15 mL) na 40 °C. Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa CH3CN (2x), i osušen u vakuumu na 40 °C koje obezbeđuje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(5-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)etanon 9a (4.0 g).

Sinteza intermedijara 9b:

[0119] Smeša 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(5-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 9a (4.0 g, 8.85 mmol) u EtOAc (80 mL) i THF (50 mL) je hidrogenovana pod atmosferskim pritiskom (H2) tokom 15 min uz 10% Pd/C (0.5 g). Smeša je filtrirana kroz pločicu dicalite<®>, a filter-kolač je ispran sa THF. Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Čvrsti talog je izmešan sa smešom diizopropil etar/dietil etar = 1/1 (40 mL). Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa smešom DIPE/Et2O = 1/1 (3x) i osušen u vakuumu

4

na 45 °C koje daje 1-(5-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-etanon 9b (2.88 g).

Sinteza intermedijara 9c:

[0120] Rastvor 1-(5-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)-fenil)etanona 9b (1.5 g, 4.15 mmol) u THF (40 mL) je ohlađen do 0 °C, u uslovima protoka N2. Feniltrimetilamonijum tribromid [CAS 4207-56-1] (1.64 g, 4.35 mmol) je dodan deo po deo, a reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 90 min pa na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa THF (3x), a spojeni filtrati su ispareni pod smanjenim pritiskom koje daje 2-bromo-1-(5-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksi-etoksi)fenil)etanon 9c (1.83 g) koji je korišćen u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

Sinteza Jedinjenja 9 i hiralna separacija enantiomera 9A i 9B:

[0121] 2-bromo-1-(5-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)-fenil)etanon 9c (1.83 g, 4.15 mmol), 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilin [CAS 62606-02-4] (1.67 g, 8.29 mmol) i diizopropiletilamin (1.43 mL, 8.29 mmol) su rastvoreni u CH3CN (60 mL) i THF (40 mL), a reakciona smeša je mešana na 55 °C tokom 20 h u N2-atmosferi. Reakciona smeša je ostavljena da dostigne sobnu temperaturu, pa je izlivena u vodu (400 mL). Produkt je ekstrahovan sa Et2O (2x). Spojeni organski slojevi su isprani sa slanicom, osušeni preko MgSO4, filtrirani, i ispareni pod smanjenim pritiskom. Talog je izmešan sa CH2Cl2(7.5 mL). Čvrste materije su sakupljene filtriranjem, isprane (2x) sa CH2Cl2, i osušene u vakuumu na 45 °C koje obezbeđuje racemski 1-(5-hloro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanon (Jedinjenje 9, 1.08 g).

[0122] Hiralna separacija enantiomera Jedinjenja 9 je provedena uz pomoć hiralne separacije normalne faze (stacionarna faza: AS 20 µm, mobilna faza: 100% metanol). Frakcije koje sadrže produkt su spojene i isparene koje obezbeđuje enantiomer 9A kao prvo-eluirani produkt i enantiomer 9B kao drugo-eluirani produkt. Oba enantiomera su kristalizovana iz CH2Cl2(4 mL), sakupljena filtriranjem, isprana (3x) sa CH2Cl2, i osušena u vakuumu na 45 °C koje obezbeđuje enantiomer 9A (256 mg) i enantiomer 9B (183 mg).

Enantiomer 9A:

[0123]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.47 (s, 3 H) 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.90 -4.07 (m, 2 H) 4.18 (t, J=4.6 Hz, 2 H) 5.28 (t, J=5.7 Hz, 1 H) 6.38 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.58 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.67 (t, J=2.2 Hz, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.89 - 6.97 (m, 2 H) 7.01 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.07 (d, J=1.1 Hz, 1 H) 7.37 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 7.99 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 8.64 (s, 1 H) 12.29 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-B): Rt2.06 min, MH<+>561

[α]D<20>: 145.3° (c 0.45, DMF)

Hiralni-SFC (postupak SFC-E): Rt 3.63 min, MH+ 561, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 9B:

[0124]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.47 (s, 3 H) 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.90 -4.07 (m, 2 H) 4.17 (t, J=4.7 Hz, 2 H) 5.28 (t, J=5.7 Hz, 1 H) 6.38 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.57 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.66 (t, J=2.1 Hz, 1 H) 6.71 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.90 - 6.97 (m, 2 H) 7.01 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.06 - 7.09 (m, 1 H) 7.37 (dd, J=8.6, 7.0 Hz, 1 H) 7.99 (d, J=1.8 Hz, 1 H) 8.64 (d, J=3.3 Hz, 1 H) 12.29 (d, J=2.9 Hz, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1.13 min, MH+ 561

[α]D<20>: -144.6° (c 0.605, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-E): Rt4.14 min, MH<+>561, Hiralna čistoća 100%.

Primer 10: sinteza 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona (Jedinjenje 10) i hiralna separacija u enantiomere 10A i 10B

[0125]

Sinteza intermedijara 10a:

4

[0126] 1M dietilaluminijum hlorid u heksanu (18.6 mL, 18.6 mmol) je dodan kap po kap, na 0 °C i u uslovima N2-protoka, u rastvor 5-(trifluorometoksi)-1H-indola [CAS 262593-63-5] (2.5 g, 12.4 mmol) u CH2Cl2(150 mL). Nakon mešanja tokom 15 min na 0 °C, dodan je rastvor 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)acetil hlorida 1e (6.02 g, 18.6 mmol) u CH2Cl2(100 mL), kap po kap na 0 °C, uz održavanje reakcione temperature ispod 7 °C. Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 1.5 h i na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Reakciona smeša je ohlađena do 0 °C, a rastvor Rochelle-ove soli [6100-16-9] (7.02 g, 24.9 mmol) u vodi (7 mL) je dodan kap po kap. Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 30 min, a tada je ostavljena da se ugreje do sobne temperature. Dodani su THF (150 mL) i Na2SO4(25 g), a smeša je mešana tokom 1.5 h. Smeša je filtrirana kroz dicalite<®>. Filter-kolač je ispran sa THF (4 x 150 mL), a spojeni filtrati su ispareni pod smanjenim pritiskom pa su ko-ispareni sa CH3CN. Rezidualno ulje je očvrsnulo nakon stajanja preko noći. Produkt je izmešan sa CH3CN (5 mL). Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa CH3CN (3 x 1 mL), i osušen u vakuumu na 50 °C koje obezbeđuje prvu frakciju 2-(2-(2-(benziloksi)-etoksi)-4-fluorofenil)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona 10a (1.3 g). Spojeni filtrati su ispareni pod smanjenim pritiskom. Talog (7 g) je prečišćen primenom fleš-hromatografije (stacionarna faza: Biotage<®>SNAP Ultra silica 100 g, mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH, gradijent od 100/0/0 do 40/45/15). Željene frakcije su spojene, isparene pod smanjenim pritiskom, i ko-isparene sa CH3CN i toluenom. Preostalo ulje je smrvljeno sa smešom toluen/heptan = 1/1 (30 mL). Čvrste materije su sakupljene filtriranjem, isprane 2x sa smešom toluen/heptan = 1/1, i osušene u vakuumu na 50 °C koje obezbeđuje drugu frakciju intermedijara 10a (1.97 g).

Sinteza intermedijara 10b:

[0127] Smeša 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona 10a (1.97 g, 4.04 mmol) u EtOAc (75 mL) i THF (10 mL) je hidrogenovana na sobnoj temperaturi pod atmosferskim pritiskom (H2) tokom 20 min uz 10% Pd/C (0.5 g). Smeša je filtrirana kroz pločicu dicalite<®>pa je isprana sa THF. Spojeni filtrati su koncentrovani pod smanjenim pritiskom. Čvrsti talog je izmešan sa CH2Cl2(3.5 mL). Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa CH2Cl2(3 x 1 mL) i osušen u vakuumu na 45 °C koje daje 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon 10b (1.49 g).

Sinteza intermedijara 10c:

[0128] Rastvor 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona 10b (1.49 g, 3.75 mmol) u THF (60 mL) je ohlađen do 0 °C, u uslovima protoka N2.

4

Dodan je feniltrimetilamonijum tribromid [CAS 4207-56-1] (1.48 g, 3.94 mmol), a reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 1 h pa na sobnoj temperaturi tokom 30 min. Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa THF (2x), a spojeni filtrati su ispareni pod smanjenim pritiskom koje daje 2-bromo-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon 10c (1.79 g) koji je bio korišćen u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

Sinteza Jedinjenja 10 i hiralna separacija enantiomera 10A i 10B:

[0129] 2-bromo-2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon 10c (1.79 g, 3.76 mmol), 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilin [CAS 62606-02-4] (3.41 g, 17.0 mmol) i diizopropiletilamin (2.92 mL, 17.0 mmol) su rastvoreni u CH3CN (90 mL), a reakciona smeša je mešana na 55 °C tokom 18 h u N2-atmosferi. Čvrsta frakcija je odstranjena filtracijom, isprana sa THF (2x) i odbačena (ne-reagovani početni materijal 3-metoksi-5-(metilsulfonil)-anilin). Voda je dodana u spojene filtrate, a produkt je ekstrahovan sa Et2O. Spojeni organski slojevi su isprani sa slanicom, osušeni preko MgSO4, filtrirani, i ispareni pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom kolonske hromatografije (stacionarna faza: Grace Reveleris® silica 80 g, mobilna faza: EtAOc:EtOH(3:1)/heptan, gradijent od 0/100 do 40/60). Frakcije sa produktom su spojene i isparene pod smanjenim pritiskom. Talog je dodatno prečišćen uz pomoć preparativne HPLC (stacionarna faza: RP XBridge® Prep C18 OBD - 10 µm, 50 x 150 mm, mobilna faza: 0.25% rastvor NH4HCO3u vodi, CH3CN). Frakcije koje sadrže produkt su spojene, isparene pod smanjenim pritiskom i ko-isparene sa MeOH koje daje racemski 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)-amino)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon (Jedinjenje 10, 861 mg). Hiralna separacija enantiomera Jedinjenja 10 (810 mg) je provedena uz pomoć hiralne separacije normalne faze (stacionarna faza: Whelk-O1 (R,R), mobilna faza: 80% heptan, 20% etanol). Frakcije koje sadrže produkt su spojene i isparene koje obezbeđuje enantiomer 10A kao prvo-eluirani produkt i enantiomer 10B kao drugo-eluirani produkt. Oba enantiomera su dodatno prečišćena uz pomoć kolonske hromatografije (Grace Reveleris<®>silica 12 g, eluent: EtAOc:EtOH(3:1)/heptan, gradijent od 0/100 do 40/60). Frakcije sa produktom su spojene, isparene pod smanjenim pritiskom i ko-isparene sa MeOH. Talozi su očvrsnuli uz pomoć precipitacije iz smeše rastvarača (MeOH i voda), sakupljeni su filtriranjem i osušeni na 50 °C u vakuumu koje obezbeđuje enantiomer 10A (119 mg) i enantiomer 10B (78 mg).

Enantiomer 10A:

4

[0130]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.85 - 4.08 (m, 2 H) 4.14 - 4.21 (m, 2 H) 5.32 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 6.37 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.57 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.64 (br s, 1 H) 6.69 - 6.78 (m, 1 H) 6.90 - 6.99 (m, 2 H) 7.08 (d, J=7.3 Hz, 1 H) 7.21 (br d, J=9.1 Hz, 1 H) 7.38 (dd, J=8.8, 7.0 Hz, 1 H) 7.56 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 8.07 (d, J=1.5 Hz, 1 H) 8.78 (s, 1 H) 12.37 (br s, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1.11 min, MH<+>597

[α]D<20>: -112.2° (c 0.565, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-E): Rt2.95 min, MH<+>597, Hiralna čistoća 99.8%.

Enantiomer 10B:

[0131]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.88 - 4.07 (m, 2 H) 4.14 - 4.21 (m, 2 H) 5.32 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 6.37 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.56 - 6.59 (m, 1 H) 6.65 (t, J=2.2 Hz, 1 H) 6.73 (td, J=8.4, 2.6 Hz, 1 H) 6.91 - 6.98 (m, 2 H) 7.08 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 7.21 (dd, J=9.0, 2.0 Hz, 1 H) 7.38 (dd, J=8.8, 7.0 Hz, 1 H) 7.56 (d, J=8.8 Hz, 1 H) 8.08 (d, J=1.5 Hz, 1 H) 8.78 (s, 1 H) 12.38 (br s, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1.11 min, MH+ 597

[α]D<20>: 112.1° (c 0.527, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-E): Rt2.65 min, MH<+>597, Hiralna čistoća 98.2%.

Primer 11: sinteza 2-(4-hloro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona (jedinjenje 11) i hiralna separacija do enantiomere 11A i 11B

[0132]

paracija

Enantiomeri 11A i 11B

4

Sinteza intermedijara 11a:

[0133] U ohlađeni (-15 °C) rastvor 3-metoksi-4-(trifluorometoksi)benzaldehida [CAS 853771-90-1] (50 g, 230 mmol) i etil azidoacetata (89 g, 690 mmol) u EtOH (400 mL) je dodan, kap po kap tokom perioda od 2 h, rastvor NaOEt (0.69 mol, pripremljen uz pomoć 15.9 g Na i 700 mL EtOH). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Nakon hlađenja u ledenoj banji, reakcija je bila ugašena sa zasićenim rastvorom NH4Cl (1.2 L), pa je mešana tokom 10 min. Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa vodom, pa je osušen koje daje (Z)-etil 2-azido-3-(3-metoksi-4-(trifluorometoksi)fenil)akrilat 11a (32 g) u formi žućkaste čvrste materije.

Sinteza intermedijara 11b:

[0134] Rastvor (Z)-etil 2-azido-3-(3-metoksi-4-(trifluorometoksi)fenil)akrilata 11a (3 g, 10 mmol) u ksilenu (40 mL) je grejan pod refluksom preko noći. Nakon hlađenja do sobne temperature, rastvarač je isparen do suvoće. Talog je smrvljen sa heksanom (50 mL), a precipitat je sakupljen filtriranjem koje daje metil 6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-2-karboksilat 11b (prinos: 1.4-1.6 g) u formi žute čvrste materije.

Sinteza intermedijara 11c:

[0135] U smešu metil 6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-2-karboksilata 11b (25 g, 87 mmol) u MeOH/H2O (2/1, 300 mL) je dodan NaOH (7 g, 175 mmol), a smeša je grejana pod refluksom do pojave bistrog rastvora. Nakon hlađenja do sobne temperature, najveći deo metanola je odstranjen pod smanjenim pritiskom, a preostao vodeni rastvor je zakiseljen sa konc. HCl do pH 3-4. Produkt je ekstrahovan sa EtOAc (2 x 250 mL). Spojeni organski slojevi su isprani sa slanicom, osušeni, i ispareni pod smanjenim pritiskom koje daje 6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-2-karboksilnu kiselinu 11c (22.7 g) u formi sive čvrste materije.

Sinteza intermedijara 11d:

[0136] Suspenzija 6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-2-karboksilne kiseline 11c (7.5 g, 27 mmol) i Cu (1.22 g, 0.7 ekviv.) u hinolinu (150 mL) je grejana do 220-230 °C u inertnoj atmosferi tokom 12 h. Nakon hlađenja do sobne temperature, smeša je razređena sa metil tertbutil etrom (MTBE, 400 mL) pa je isprana sa zasićenim vodenim rastvorom NaHSO4(2 x 500 mL). Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran kroz kratku pločicu silika-gela, pa je isparen pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom kolonske hromatografije koje daje 6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol 11d (3.75 g) u formi žute čvrste materije.

4

Sinteza intermedijara 11e:

[0137] 1M dietilaluminijum hlorid u heksanu (7.8 mL, 7.8 mmol) je dodan kap po kap na 0 °C u rastvor 6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indola (1.2 g, 5.19 mmol) u CH2Cl2(25 mL). Nakon 30 min na 0 °C, dodan je 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)acetil hlorid 1e (1.94 g, 6.0 mmol) u CH2Cl2(25 mL), kap po kap. Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 3 h. Reakcija je pažljivo ugašena na 0 °C uz pomoć leda, a tada i sa vodom. Slojevi su razdvojeni, a vodeni sloj je ekstrahovan sa CH2Cl2. Spojeni organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani, a rastvarač je isparen pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen uz pomoć flešhromatografije na silika-gelu (15-40 µm, 80 g, eluent: CH2Cl2). Čiste frakcije su spojene pa isparene do suvoće koje daje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon 11e (1.6 g).

Sinteza intermedijara 11f:

[0138] U uslovima N2-protoka, na 0 °C, rastvor trimetilfenilamonijum tribromida (1.1 g, 2.9 mmol) u THF (40 mL) je dodan kap po kap u rastvor 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)-etanona 11e (1.5 g, 2.9 mmol) u THF (40 mL). Smeša je mešana na 0 °C tokom 1 h, hladna banja je odstranjena, a mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi tokom 3 h. Dodan je 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilin [CAS 62606-02-04] (1.75 g, 8.7 mmol) u CH3CN (40 mL), a nastala smeša je mešana tokom 48 h na 50 °C. Smeša je koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Talog je rastvoren sa EtOAc, ispran sa vodom, 1N HCl (3x), a tada ponovo sa vodom. Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran, a rastvarač je isparen pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen uz pomoć flešhromatografije na silika-gelu (15-40 µm, 80 g, eluent: CH2Cl2). Čiste frakcije su spojene i isparene do suvoće koje daje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon 11f (1 g).

Sinteza Jedinjenja 11 i hiralna separacija u enantiomere 11A i 11B:

[0139] Smeša 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona 11f (1 g, 1.39 mmol) u CH3OH (30 mL) je hidrogenovana pod atmosferski pritiskom (H2) tokom 1 h uz Pd/C 10% (300 mg, 0.28 mmol) kao katalizator. Reakciona smeša je razređena sa CH2Cl2pa je filtrirana kroz pločicu celite<®>. Filtrat je isparen pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom fleš-hromatografije na silika-gelu (15-40 µm, 40 g, eluent: CH2Cl2/CH3OH = 99/1).

Druga runda prečišćavanja je provedena uz pomoć HPLC reverzne faze (stacionarna faza: XBridge<®>- C1810 µM, 30 x 150 mm, mobilna faza: gradijent od 50% NH4HCO3(0.2%)/50% MeOH do 0% NH4HCO3(0.2%)/100% MeOH). Čiste frakcije su spojene i isparene do suvoće koje daje, nakon očvršćavanja u diizopropil etru, 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon (jedinjenje 11, 170 mg) u formi racemske smeše. Enantiomeri Jedinjenja 11 (150 mg) su razdvojeni uz pomoć hiralnog SFC (stacionarna faza: Chiralpak<®>AD-H 5 µm, 250 x 20 mm, mobilna faza: 70% CO2, 30% iPrOH (+ 0.3% iPrNH2)) koje daje 67 mg prvo-eluiranog enantiomera i 70 mg drugo-eluiranog enantiomera. Prvo-eluirani enantiomer je očvrsnuo iz smeše diizopropil etar/petroleum etar koje daje 58 mg enantiomera 11A. Drugo-eluirani enantiomer je očvrsnuo iz smeše diizopropil etar/petroleum etar koje daje 58 mg enantiomera 11B.

***11***

Jedinjenje 11:

[0140]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.07 (s, 3 H) 3.71 (s, 3 H) 3.86 (s, 3 H) 3.88 -4.06 (m, 2 H) 4.17 (t, J=4.5 Hz, 2 H) 5.26 (br s, 1 H) 6.33 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 6.57 (d, J=1.5 Hz, 1 H) 6.63 (s, 1 H) 6.72 (td, J=8.6, 2.5 Hz, 1 H) 6.89 - 6.97 (m, 2 H) 7.01 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 7.17 (s, 1 H) 7.38 (dd, J=8.6, 7.1 Hz, 1 H) 8.03 (d, J=1.0 Hz, 1 H) 8.61 (s, 1 H) 12.14 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt2.99 min, MH<+>627

Jedinjenje 11A:

[0141]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.87 (s, 3 H) 3.89 -4.08 (m, 2 H) 4.16-4.19 (m, 2 H) 5.30 (br s, 1 H) 6.34 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 6.57 (s, 1 H) 6.63 (br s, 1 H) 6.72 (td, J=8.4, 1.9 Hz, 1 H) 6.90 - 6.98 (m, 2 H) 7.05 (br d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.17 (s, 1 H) 7.38 (t, J=7.7 Hz, 1 H) 8.04 (s, 1 H) 8.63 (s, 1 H) 12.14 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt2.99 min, MH<+>627

[α]D<20>: -90.3° (c 0.29, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-F): Rt 2.31 min, MH+ 627, Hiralna čistoća 100%.

Jedinjenje 11B:

[0142]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.87 (s, 3 H) 3.89 -4.08 (m, 2 H) 4.14-4.20 (m, 2 H) 5.30 (br s, 1 H) 6.34 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 6.57 (s, 1 H) 6.63 (br s, 1 H) 6.72 (td, J=8.4, 2.0 Hz, 1 H) 6.90 - 6.99 (m, 2 H) 7.05 (d, J=7.6 Hz, 1 H) 7.17 (s, 1 H) 7.38 (t, J=7.6 Hz, 1 H) 8.04 (s, 1 H) 8.63 (s, 1 H) 12.10 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt2.99 min, MH<+>627

1

[α]D<20>: 95.4° (c 0.26, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-F): Rt3.29 min, MH<+>627, Hiralna čistoća 100%.

Primer 12: sinteza 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)-etanona (jedinjenje 12) i hiralna separacija enantiomera 12A i 12B

[0143]

Sinteza intermedijara 12a:

[0144] Smeša 1M boron(III) hlorida u CH2Cl2(25.5 mL, 25.5 mmol) i aluminijum(III) hlorida (3.40 g, 25.5 mmol) je razređena sa CH2Cl2(20 mL) pa je ohlađena u ledenoj banji u N2-atmosferi. Kap po kap je dodan rastvor 2-metil-4-(trifluorometoksi)anilina [CAS 86256-59-9] (4.88 g, 25.5 mmol) i hloroacetonitrila (3.24 mL, 51.0 mmol) u CH2Cl2(7.5 mL). Nakon dodavanja, ledena banja je odstranjena, a smeša je grejana pod refluksom tokom 8 h. Smeša je ponovo ohlađena do 0 °C uz pomoć ledene banje. Kap po kap je dodana 2N HCl (75 mL) koje je uzrokovalo snažnu precipitaciju. Nastala suspenzija je grejana pod refluksom tokom 90 min, pa je ohlađena do sobne temperature. Čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije. Filterkolač je ispran sa CH2Cl2(4x). Filtrati su spojeni, a faze su razdvojene. Organski sloj je izolovan, ispran sa vodenim rastvorom NaHCO3, osušen preko MgSO4, filtriran i isparen pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom fleš-hromatografije (stacionarna faza: Biotage<®>SNAP Ultra Silica 100 g, mobilna faza: heptan/CH2Cl2, gradijent od 100/0 do 0/100).

2

Željene frakcije su spojene i koncentrovane do rezidualnog volumena od 30 mL. Precipitat je sakupljen filtriranjem, ispran sa heptanom i CH2Cl2, pa je osušen u vakuumu na 50 °C koje obezbeđuje 1-(2-amino-3-metil-5-(trifluorometoksi)fenil)-2-hloroetanon 12a (1.37 g). Filtrat je koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Čvrsti talog je izmešan sa smešom heptana (20 mL) i diizopropil etra (3 mL), sakupljen filtriranjem, ispran sa heptanom (3x) i osušen u vakuumu na 50 °C koje obezbeđuje drugu frakciju 12a (0.24 g).

Sinteza intermedijara 12b:

[0145] Natrijum borohidrid (326 mg, 8.61 mmol) je dodan u mešani rastvor 1-(2-amino-3-metil-5-(trifluorometoksi)fenil)-2-hloroetanona 12a (1.92 g, 7.17 mmol) u tert-butanolu (50 mL) i vodi (5 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 min pa na 90 °C tokom 2.5 h. Dodana je voda (50 mL), a produkt je ekstrahovan sa dietil etrom (2x). Spojeni organski slojevi su isprani sa slanicom, osušeni preko MgSO4, filtrirani i ispareni pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen uz pomoć fleš-hromatografije (stacionarna faza: Biotage<®>SNAP Ultra silica 25 g, mobilna faza: heptan/EtOAc, gradijent od 100/0 do 20/80). Željene frakcije su spojene, koncentrovane pod smanjenim pritiskom, ko-isparene sa heptanom i osušene u vakuumu na 50 °C koje obezbeđuje 7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol 12b (1.2 g).

Sinteza intermedijara 12c:

[0146] 1M dietilaluminijum hlorid u heksanu (16.5 mL, 16.5 mmol) je dodan kap po kap, na 0 °C, u rastvor 7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indola 12b (2.36 g, 11.0 mmol) u CH2Cl2(150 mL). Nakon mešanja tokom 25 min na 0 °C, dodan je rastvor 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)acetil hlorida 1e (5.3 g, 16.4 mmol) u CH2Cl2(75 mL), kap po kap, uz održavanje reakcione temperature ispod 5 °C. Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 1 h pa na sobnoj temperaturi tokom 2.5 h. Reakciona smeša je ohlađen do 0 °C, a rastvor Rochelle-ove soli (6.20 g, 22.0 mmol) u vodi (6 mL) je dodan kap po kap. Reakciona smeša je mešana tokom 30 min na 0 °C. Ledena banja je odstranjena, a smeša je ostavljena da dostigne sobnu temperaturu. Dodani su THF (200 mL) i Na2SO4(25 g), a smeša je mešana preko noći. Reakciona smeša je filtrirana kroz dicalite<®>, a filter-kolač je ispran sa THF (4 x 150 mL). Filtrati su spojeni i ispareni pod smanjenim pritiskom. Čvrsti talog je izmešan sa smešom rastvarača DIPE (25 mL) i EtOAc (2 mL). Čvrste materije su sakupljene filtriranjem, isprane sa DIPE (3x) i osušene na 50 °C u vakuum koje daje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon 12c (4.3 g).

Sinteza intermedijara 12d:

[0147] U uslovima protoka N2, na 0 °C, feniltrimetilamonijum tribromid (3.39 g, 9.0 mmol) je dodan u mešani rastvor 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-1-(7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona 12c (4.3 g, 8.6 mmol) u THF (40 mL). Smeša je mešana na 0 °C tokom 1 h pa na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Čvrste materije su odstranjene filtracijom, a filter je ispran sa THF (2x). Spojeni filtrati su ispareni pod smanjenim pritiskom koje daje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-2-bromo-1-(7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon 12d (6.9 g), koji je bio korišćen u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

Sinteza intermedijara 12e:

[0148] U N2-atmosferi, smeša 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-2-bromo-1-(7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona 12d (6.73 g, 11.6 mmol), 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-04] (4.67 g, 23.2 mmol) i diizopropiletilamina (4.00 mL, 23.2 mmol) u CH3CN (90 mL) je mešana tokom 48 h na 55 °C. Dodana je voda (125 mL), a produkt je ekstrahovan sa Et2O (2x). Spojeni organski slojevi su isprani sa slanicom, osušeni preko MgSO4, filtrirani, a rastvarač je isparen pod smanjenim pritiskom. Talog je izmešan sa CH2Cl2, koje je dovelo do precipitacije ne-reagovanog početnog materijala tj. 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina. Čvrste materije su odstranjene filtracijom, a filtrat je isparen pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen primenom fleš-hromatografije (stacionarna faza: Grace Reveleris<®>silica 80 g, mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH, gradijent od 100/0/0 do 40/45/15). Frakcije sa čistim produktom su spojene i isparene do suvoće koje daje 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon 12e (4.37 g).

Sinteza Jedinjenja 12 i hiralna separacija u enantiomere 12A i 12B:

[0149] Smeša 2-(2-(2-(benziloksi)etoksi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona 12e (4.37 g, 5.11 mmol) u EtOAc je hidrogenovana na sobnoj temperaturi pod atmosferskim pritiskom (H2) tokom 3 h uz Pd/C 10% (500 mg) kao katalizator. Reakciona smeša je filtrirana kroz pločicu dicalite<®>, a filter-kolač je ispran sa puno THF. Isparljive materije su isparene pod smanjenim pritiskom. Talog je izmešan sa CH2Cl2/EtOAc (90/10) tokom 30 min. Čvrste materije su

4

sakupljene filtriranjem pa su osušene u vakuumu na 50 °C preko noći koje daje racemski 2-(4-fluoro-2-(2-hidroksietoksi)fenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon (Jedinjenje 12, 2.02 g, čistoća utvrđena uz pomoć LC/MS: 95%). Frakcija Jedinjenja 12 (505 mg) je dodatno prečišćena primenom preparativne HPLC (stacionarna faza: RP XBridge<®>Prep C18 OBD - 10 µm, 30 x 150 mm, mobilna faza: 0.25% rastvor NH4HCO3u vodi, MeOH). Frakcije sa produktom su spojene, isparene pod smanjenim pritiskom i ko-isparene sa MeOH. Talog je očvrsnuo iz rastvora MeOH uz pomoć polaganog dodavanja vode. Precipitat je sakupljen filtriranjem i osušen na 50 °C u vakuumu koje obezbeđuje čisto Jedinjenje 12 (300 mg).

[0150] Enantiomeri Jedinjenja 12 (1569 mg) su razdvoji uz pomoć hiralnog SFC (stacionarna faza: Daicel Chiralpak<®>IA, mobilna faza: izokratno 75% CO2, 20% dihlormetan 0.2 % izopropilamin, 5% metanol 0.2 % izopropilamin). Frakcije sa produktom su spojene i isparene pod smanjenim pritiskom. Prvo-eluirani enantiomer je dodatno prečišćen primenom fleš-hromatografije (stacionarna faza: Grace Reveleris<®>Silica 40 g, mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH, gradijent od 100/0/0 do 40/45/15). Željene frakcije su spojene i koncentrovane do rezidualnog volumena od ∼15 mL. Smeša je ostavljena da stoji tokom 30 min. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem, isprane 3x sa smešom heptan/EtOAC = 4/1, i osušene u vakuumu na 45 °C koje obezbeđuje enantiomer 12A (324 mg). Drugo-eluirani enantiomer je dodatno prečišćen uz pomoć fleš-hromatografije (stacionarna faza: Grace Reveleris<®>Silica 40 g, mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH, gradijent od 100/0/0 do 40/45/15). Željene frakcije su spojene i koncentrovane do rezidualnog volumena od ∼10 mL. Smeša je ostavljena da stoji tokom 18 h. Čvrste materije su sakupljene filtriranjem, isprane 3x sa smešom heptan/EtOAc = 4/1, i osušene u vakuumu na 50 °C koje obezbeđuje enantiomer 12B (295 mg).

Jedinjenje 12:

[0151]<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.52 (s, 3 H) 3.06 (s, 3 H) 3.74 (s, 3 H) 3.93 -4.05 (m, 2 H) 4.19 (t, J=4.8 Hz, 2 H) 5.07 (br t, J=5.3 Hz, 1 H) 6.37 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 6.59 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.65 (t, J=2.1 Hz, 1 H) 6.70 (td, J=8.4, 2.4 Hz, 1 H) 6.89 (d, J=7.8 Hz, 1 H) 6.90 - 6.95 (m, 2 H) 7.01 (br s, 1 H) 7.40 (dd, J=8.7, 6.9 Hz, 1 H) 7.93 (br s, 1 H) 8.63 (s, 1 H) 12.10 - 12.32 (m, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.17 min, MH<+>611

Jedinjenje 12A:

[0152]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.51 (s, 3 H) 3.08 (s, 3 H) 3.73 (s, 3 H) 3.91 -4.08 (m, 2 H) 4.18 (t, J=4.6 Hz, 2 H) 5.29 (t, J=5.7 Hz, 1 H) 6.40 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.58 (t, J=1.9 Hz, 1 H) 6.66 (t, J=2.3 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.91 - 6.98 (m, 2 H) 7.00 - 7.06 (m, 2 H) 7.38 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 7.92 (br s, 1 H) 8.70 (d, J=3.3 Hz, 1 H) 12.37 (d, J=2.9 Hz, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1.16 min, MH<+>611

[α]D<20>: 77.9° (c 0.425, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-E): Rt2.65 min, MH<+>611, Hiralna čistoća 91.1%.

Jedinjenje 12B:

[0153]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.51 (s, 3 H) 3.08 (s, 3 H) 3.72 (s, 3 H) 3.90 -4.07 (m, 2 H) 4.18 (t, J=4.6 Hz, 2 H) 5.29 (t, J=5.7 Hz, 1 H) 6.40 (d, J=7.7 Hz, 1 H) 6.58 (t, J=1.9 Hz, 1 H) 6.66 (t, J=2.1 Hz, 1 H) 6.72 (td, J=8.5, 2.4 Hz, 1 H) 6.89 - 6.98 (m, 2 H) 6.99 - 7.08 (m, 2 H) 7.38 (dd, J=8.6, 6.8 Hz, 1 H) 7.92 (br s, 1 H) 8.70 (s, 1 H) 12.37 (br s, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1.15 min, MH<+>611

[α]D<20>: -81.4° (c 0.435, DMF)

Hiralni SFC (postupak SFC-E): Rt3.01 min, MH<+>611, Hiralna čistoća 92.5%.

ANTIVIRALNA DELOVANJA JEDINJENJA IZ OVOGA PRONALASKA

Antiviralni opit sa DENV-2

[0154] Antiviralno delovanje svih jedinjenja iz ovoga pronalaska je testirano protiv soja DENV-2 16681 koji je bo označen sa pojačanom zelenom fluorescentnom belančevinom (eGPF). Medijum za kulturu se sastoji od minimalnog esencijalnog medijuma obogaćenog sa 2% fetalnim kravljim serumom koji je bio inaktivisan toplinom, 0.04% gentamicinom (50 mg/mL) i 2 mM L-glutaminom. Vero-ćelije, dobivene iz ECACC, su suspendovane u medijumu za kulturu pa je po 25 µL dodano u pločice sa 384-komorica (2500 ćelija/komorici), koje su već sadržavale antiviralna jedinjenja. Tipično, pomenute pločice sadrže serijska razblaženja (5-puta u 9 koraka razblaživanja) testiranog jedinjenja u koncentraciji 200-puta od konačne koncentracije u 100% DMSO (200 nL). Osim toga, svaka koncentracija jedinjenja je testirana četvorostruko (raspon finalne koncentracije: 25 µM – 0.000064 µM ili 2.5 µM – 0.0000064 µM za najaktivnija jedinjenja). Konačno, pločica je sadržavala komorice u kojima se nalaze virusnu-kontrolu (koja sadrži ćelije i virus, ali ne i jedinjenje), ćelijsku-kontrolu (koja sadrže ćelije bez virusa i jedinjenja) i medijumsku-kontrolu (koja sadrže medijum bez ćelija, virusa i jedinjenja). U komorice sa medijumskom-kontrolom je dodano 25 µL medijuma kulture umesto Vero-ćelija. Jednom kada se ćelije dodaju u pločice, pločice se inkubiraju tokom 30 min na sobnoj temperaturi kako bi se omogućilo da se ćelije ravnomerno distribuiraju u komoricama. Nakon toga, pločice su bile inkubirane u vlažnom inkubatoru (37 °C, 5% CO2) do sledećeg dana. Tada je dodan soj DENV-2 16681, označen sa eGFP, u omeru virusnih čestica u odnosu na metu (multiplicity of infection, MOI) od 0.5. Prema tome, 15 µL virusne suspenzije su dodane u sve komorice koje sadrže testirano jedinjenje, a komorice su označene kao virusna-kontrola. Istovremeno, 15 µL medijuma kulture je dodano u medijumske- i ćelijske-kontrole. Sledeće, pločice su bile inkubirane tokom 3 dana u vlažnom inkubatoru (37 °C, 5% CO2). Na dan očitanja je izmerena eGFP-fluorescencija uz pomoć automatskog fluorescencijskog mikroskopa kod 488 nm (plavi laser). Uz pomoć domaćeg LIMS-sistema su izračunate krivulje inhibicionog doznog odgovora za svako jedinjenje pa je određena vrednost pola maksimalne efektivne koncentracije (EC50). Prema tome, procenat inhibicije (I) za svaku testiranu koncentraciju je izračunat uz pomoć sledeće formule: I = 100*(ST-SCC)/(SVC-SCC); ST, SCCi SVCsu količina eGFP-signala u komoricama sa testiranim jedinjenjem, ćelijskoj-kontroli i virusnoj-kontroli. EC50predstavlja koncentraciju nekog jedinjenja kod koje je replikacija virusa inhibirana za 50%, kao šta je izmereno uz pomoć 50% redukcije eGFP-fluorescentnog intenziteta upoređeno sa virusnom-kontrolom. EC50je izračunat primenom linearne interpolacije (Tabela 1).

[0155] Istovremeno, na istim pločicama je procenjena toksičnost pomenutih jedinjenja. Jednom kada je očitanje eGFP-signala bilo gotovo, 40 µL ATPlite (boja za ćelijsku vijabilnost) je dodano u sve komorice pločice sa 384-komorica. ATP je prisutan u svim metabolički aktivnim ćelijama, a koncentracija opada veoma brzo kada ćelije uđu u nekrozu ili apoptozu. Sistem ATPLite-opita se bazira na proizvodnji svetla uzrokovanog reakcijom ATP-a sa dodanom luciferazom i D-luciferinom. Pločice su inkubirane tokom 10 min na sobnoj temperaturi. Sledeće, pločice su izmerene na aparatu ViewLux. Vrednost pola maksimalne citotoksične koncentracije (CC50) je takođe određena, a definisana je kao koncentracija koja je potrebna da smanji luminescentni signal za 50% upoređeno sa istim iz komorica sa ćelijskom-kontrolom. Konačno, određen je indeks selektivnosti (SI) za sva jedinjenja, koji je izračunat kako sledi: SI = CC50/EC50.

Tabela 1: EC50, CC50, i SI za jedinjenja iz ovoga pronalaska u antiviralnom opitu sa DENV-2

[0156] Opit kvantitativnog-PCR-a sa tetravalentnom reverznom transkriptazom (RT-qPCR): Protokol A. Antiviralno delovanje jedinjenja iz ovoga pronalaska je testirano protiv sojeva DENV-1 TC974#666 (NCPV), DENV-2 16681, DENV-3 H87 (NCPV) i DENV-4 H241 (NCPV) i EDEN (SG/06K2270DK1/2005; pristupni broj u GenBank: QG398256) primenom opita sa RT-qPCR. U skladu sa time, Vero-ćelije su inficirane sa DENV-1, ili -2, ili -3, ili -4 u prisutnosti ili odsutnosti testiranih jedinjenja. 3. dana nakon infekcije, ćelije su lizirane, a ćelijski lizati su korišćeni za pripremu cDNA obe viralne mete (3'UTR iz DENV; Tabela 2) i ćelijskog referentnog gena (β-aktin, Tabela 2). Naknadno je proveden dvostruki PCR u realnom vremenu uz pomoć instrumenta Lightcycler480. Generisana Cp-vrednost je obrnutoproporcionalna količini RNA-ekspresije pomenutih meta. Inhibicija replikacije DENV uz pomoć testiranog jedinjenja rezultuje pomakom Cp-a za 3'UTR-gen. Sa druge strane, ako je testirano jedinjenje toksično za ćelije, sličan efekt će biti primećen kod ekspresije β-aktina. Komparativni ΔΔCp-postupak je korišćen da se izračuna EC50, koji se bazira na relativnoj genskoj ekspresiji ciljanog gena (3'UTR) normalizovanog za ćelijski housekeeping-gen (βaktin). Osim toga, CC50-vrednosti su određene na bazi Cp-vrednosti dobivene kod housekeeping-gena β-aktin.

Tabela 2: Prajmeri i probe korišćene u kvantitativnom RT-PCR u realnom vremenu

[0157] Medijum za kulturu se sastojao od minimalnog esencijalnog medijuma obogaćenog sa 2% fetalnim kravljim serumom koji je bio inaktivisan toplinom, 0.04% gentamicinom (50 mg/mL) i 2 mM L-glutaminom. Vero-ćelije, dobivene iz ECACC, su suspendovane u medijumu za kulturu, a tada je dodano 75 µL po komorici pločice sa 96-komorica (10000 ćelija/komorici), koja je već sadržavala antiviralna jedinjenja. Tipično, pomenute pločice su sadržavale serijska razblaženja (5-puta u 9 koraka razblaženja) testiranog jedinjenje 200-puta od finalne koncentracije u 100% DMSO (500 nL; raspon finalne koncentracije: 25 µM – 0.000064 µM ili 2.5 µM – 0.0000064 µM za najaktivnija jedinjenja). Osim toga, svaka pločica sadrži komorice koje su označene kao virusne-kontrole (koje sadrže ćelije i virus, ali ne i jedinjenje) i ćelijske-kontrole (koje sadrže ćelije, ali ne virus niti jedinjenje). Jednom kada su ćelije dodane u pločice, pločice su inkubirane u vlažnom inkubatoru (37 °C, 5% CO2) do sledećeg dana. Denga-virusi serotipa-1, -2, -3 i -4 su razređeni sa ciljem da se dobije Cp od ∼22-24 u ovom opitu. Prema tome, 25 µL virusne suspenzije je dodano u sve komorice koje sadrže testirano jedinjenje i u komorice koje su označene kao virusna-kontrola. Istovremeno, 25 µL medijuma za kulturu je dodano u ćelijske-kontrole. Sledeće, pločice su inkubirane tokom 3 dana u vlažnom inkubatoru (37 °C, 5% CO2). Nakon 3 dana, supernatant je odstranjen iz komorica, a ćelije su isprane dva puta sa ledeno-hladnim PBS (∼100 µL). Ćelijski peleti u pločicama sa 96-komorica su uskladišteni na -80 °C tokom poslednjeg dana. Sledeće, RNA je ekstrahovana uz pomoć kompleta hemikalija za lizu Cells-to-CT™ u skladu sa instrukcijama proizvođača (Life Technologies). Ćelijski lizati mogu da se uskladište na -80 °C ili mogu da se odmah koriste za korak reverzne transkripcije.

[0158] Tokom koraka reverzne transkripcije je pripremljena smeša A (tabela 3A) pa je dodano 7.57 µL po komorici u pločicu sa 96-komorica. Nakon dodavanja po 5 µL ćelijskih lizata, proveden je korak denaturacije u trajanju od 5 min na 75 °C (tabela 3B). Nakon toga je dodano 7.43 µL smeše B (tabela 3C) pa je iniciran korak reverzne transkripcije (tabela 3D) kako bi se generisala cDNA.

[0159] Konačno, pripremljen je smeša za RT-qPCR, smeša C (tabela 4A), pa je 22.02 µL po komorici dodano u pločice LightCycler qPCR sa 96-komorica kojima je dodano po 3 µL cDNA, a qPCR je proveden u skladu sa uslovima iz tabele 4B na aparatu LightCycler 480.

[0160] Uz primenu softvera LightCycler i domaćeg LIMS-sistema, izračunate su krivulje odgovora na dozu za svako jedinjenje, pa su određene vrednost pola maksimalne efektivne koncentracije (EC50) i vrednost pola maksimalne citotoksične koncentracije (CC50) (Tabele 5-8).

Tabela 3: sinteza cDNA uz primenu Smeše A, denaturacije, Smeše B i reverzne transkripcije.

Smeša A

A

B Korak denaturacije:

C Smeša B

1

D Protokol sinteze cDNA

Tabela 4: smeša za qPCR i protokol.

A Smeša C

B Protokol za qPCR3

2

Tabela 5: EC50, CC50, i SI za jedinjenja protiv serotipa 1 u opitima RT-qPCR

Tabela 6: EC50, CC50, i SI za jedinjenja protiv serotipa 2 u opitima RT-qPCR

Tabela 7: EC50, CC50, i SI za jedinjenja protiv serotipa 3 u opitima RT-qPCR

Tabela 8: EC50, CC50, i SI za jedinjenja protiv serotipa 4 u opitima RT-qPCR

4

N= broj nezavisnih eksperimenata u kojima su testirana jedinjenja.

Claims (8)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje, naznačeno time, što ima formulu (I)
2. neka njegova stereo-izomerna forma, farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf koji sadrže mono- ili di-supstituisanu indolnu grupu; a pomenuto jedinjenje je izabrano iz grupe gde: R1je H, R2je F ili Cl, a R3je H ili CH3; R1je F, R2je F, a R3je H; R1je CH3, R2je OCH3, a R3je H; R1je CH3, R2je F, a R3je H; R1je CH3, R2je H, a R3je F; R1je Cl, R2je H, a R3je CH3; R1je OCF3, R2je H ili OCH3, a R3je H i R1je OCF3, R2je H, a R3je CH3. 2. Jedinjenje ili njegova stereo-izomerna forma, farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time, što je pomenuto jedinjenje izabrano iz grupe koja obuhvata:
3. 3. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži jedinjenje sa formulom (I) ili neku njegovu stereoizomernu formu, farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorf u skladu sa zahtevom 1 ili 2 zajedno so jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, razblaživača ili nosilaca.
4. 4. Jedinjenje sa formulom (I) ili neka njegova stereo-izomerna forma, farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf u skladu sa zahtevom 1 ili farmaceutska kompozicija u skladu sa zahtevom 3, naznačeni time, što su namenjeni za upotrebu kao medikamenti.
5. 5. Jedinjenje sa formulom (I) ili neka njegova stereo-izomerna forma, farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf u skladu sa zahtevom 1 ili neka farmaceutska kompozicija u skladu sa zahtevom 3, naznačeni time, što su namenjeni za primenu u tretmanu denga-bolesti.
6. 6. Jedinjenje predstavljeno sa sledećom strukturnom formulom (I)

   neka njegova stereo-izomerna forma, farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf koji sadrže mono- ili di-supstituisanu indolnu grupu; a pomenuto jedinjenje je izabrano iz grupe gde: R1je H, R2je F ili Cl, a R3je H ili CH3; R1je F, R2je F, a R3je H; R1je CH3, R2je OCH3, a R3je H; R1je CH3, R2je F, a R3je H; R1je CH3, R2je H, a R3je F; R1je Cl, R2je H, a R3je CH3; R1je OCF3, R2je H ili OCH3, a R3je H i R1je OCF3, R2je H, a R3je CH, naznačeno time, što je namenjeno za primenu u inhibiranju replikacije denga-virusa u nekom biološkom primerku ili u nekom pacijentu.
7. 7. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa zahtevom 6, naznačeno time, što dodatno podrazumeva ko-administriranje nekog dodatnog terapeutskog agensa.
8. 8. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa zahtevom 7, naznačeno time, što je pomenuti dodatni terapeutski agens neki drugi antiviralni agens. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5