RS55144B1 - Disupstituisani benzotienil-pirolotriazini i njihovo korišćenje kao inhibitora fgfr kinaze - Google Patents

Description

[0001]Ovaj se pronalazak odnosi na nove supstituisane 5-(l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-f][l,2,4]triazin-4-amin derivate koji poseduju protein tirozin kinaza inhibicione aktivnosti, na procese za pripremu takvih jedinjenja, na farmaceutske kompozicije koje sadrže takva jedinjenja i na korišćenje takvih jedinjenja ili kompozicija za lečenje proliferativnih poremećaja, određenije kancera i tumorskih bolesti.

[0002]Kancer je vodeći uzrok smrti širom sveta i odgovoran je za 7,6 milion smrtnih slučajeva (oko 13% svih smrtnih slučajeva) u 2008. Za smrti od kancera se smatra da će nastaviti da raastu širom sveta do preko 11 miliona u 2030. (izvor WHO. Fact Sheet No. 297, Februar 2011).

[0003JPostoji više načina kako mogu nastati kanceri što je jedan od razloga zasto je njihova terapija teška. Jedan od načina na koji transformacija ćelija može da se desi je nakon genske promene. Završetak projekta humanog genoma pokazao je genomsku nestabilnost i heterogenost humanih gena odgovornih za kancer. Sadašnje strategije da se identifikuju ove genske promene ubrzale su proces otkrivanja gena odgovornih za kancer. Genska abnormalnost može, na primer, dovesti do prekomerne ekspresije proteina i stoga do nefiziološke aktivacije tih proteina. Jedna porodica proteina iz koje poreklo vode brojni onkoproteini su tirozin kinaze, određenije receptorske tirozin kinaze (RTK). U poslednje dve decenije, brojni pravci istraživnja pokazali su važnost RTK-posredovanog signalizovanja u štetnom ćelijskom rastu koji dovodi do kancera. Zadnjih godina, postignuti su obećavajući rezultati u klinici sa selektivnim malomolekulskim inhibitorima tirozin kinaza kao novom klasom antitumorigeničnih agensa [Svvinnev i Anthonv, Nature Rev. Drug Disc. 10 (7), 507-519(2011)].

(0004)Faktori rasta fibroblasta (FGF) i njihovi receptori (FGFR) čine deo jedinstvenog i raznolikog signalizacionog sistema koji ima ključnu ulogu u različitim biološkim procesima koji obuhvataju različite aspekte embrionskog razvoja i patofiziologije odraslih [Itoh i Ornitz. J. Biochem. 149 (2). 121-130 (2011)]. Na prostorno-vremenski način. FGF stimulišu kroz vezanje na FGFR širok raspon ćelijskih funkcija, uključujući migraciju, proliferaciju. diferencijaciju i preživljavanje.

[0005]FGF porodica obuhvata 18 sekretovanih polipeptidnih faktora rasta koji se vežu na četiri vizoko konzervisane receptorske tirozin kinaze (FGFR-1 do -4) eksprimisane na ćelijskoj površini. Uz to. FGFR-5 može da veže FGF ali ne poseduje kinazni domen. te je prema tome lišen intracelulamog signalizovanja. Specifičnost iigand/receptor interakcije je pojačana brojnim transkripcionim i translacionim procesiranjima koji rezultuju sa više izoformi pomoću alternativne inicijacije transkripcije, alternativnog izrezivanja i C-terminalnih kraćenja. Različiti heparan sulfat proteoglikani (npr. sindekani) mogu da budu deo FGF/FGFR kompleksa i jako utiču na sposobnost FGF da indukuju signalizacione odgovore [Polanska et al, Developmental Dynamics 238 (2), 277-293 (2009)]. FGFR su receptori na ćelijskoj površini koji se sastoje od tri ekstracelularnog imunoglobulinu sličnog domena, transmembranskog domena koji jedanput prolazi membranu i intracelulamog dimerizovanog tirozin kinaznog domena. Vezanje FGF dovodi intracelularne kinaze u međusobnu blizinu, omogućavajući im da transfosforiliraju jedna drugu. Sedam mesta fosforilacije je identifikovano (npr. u FGFR-i Tyr463, Tyr583, Tyr585, Tyr653, Tyr654. Tyr730 i Tyr766).

[0006]Neke od tih fosfotirozin grupa deluju na mesta za pristajanje za nizvodno signalizujuće molekule koje i sami mogu direktno da budu fosforilisani sa FGFR. što dovodi do aktivacije više puteva za prenos signala. Tako, MAPK signalizaciona kaskada je uključena u ćelijski rast i diferencijaciju. P13 K/Akt signalizaciona kaskada je uključena u ćelijsko preživljavanje i determinaciju ćelijske sudbine, dok PI3K i PKC signalizacione kaskade imaju funkciju u kontroli ćelijske polarnosti. Nekoliko povratnih inhibitora FGF signalizovanja je sada identifikovano i uključuje članove Spry (Sproutv) i Sef (slične ekspresije kao FGF) porodice. Uz to, u određenim uslovima. FGFR se otpušta iz pre-Golđijevih membrana u citosol. Receptor i njegov ligand. FGF-2. se zajedno transportuju u jezgro mehanizmom koji uključuje importin i uključeni su u CREB-vezujući protein (CBP) kompleks, čest i esencijalni transkripcioni koaktivator koji deluje kao upravljački faktor za aktivaciju gena. Uočene su višestruke korelacije između imunohistohemijske ekspresije FGF-2, FGFR-1 i FGFR-2, te njihove citoplazmatske i nuklearne lokalizacije u tumorskim ćelijama. Na primer. u adenokarcinomima pluća ova povezanost je takođe nađena na nivou jezgra, naglašavajući aktivnu ulogu kompleksa u jezgru [Kore i Friesel. Curr. Cancer Drugs Targets 5. 639-651 (2009)].

[0007]FGF su široko eksprimisani kako u tkivima koja se razvijaju, tako i u tkivima odraslih, te imaju važne uloge u različitim normalnim i patološkim procesima, uključujući razvoj tkiva, regeneraciju tkiva, angiogenezu, neoplastičku transformaciju, migraciju ćelija, ćelijsku diferencijaciju i ćelijsko preživljavanje. Uz to. FGF su kao proangiogeni faktori takođe uključeni u nastajući fenomen rezistencije na inhibiciju receptora vaskularnog endotelnog faktora rasta-2 ( VEGFR-2) [Bergers i Hanahan. Nat. Rev. Cancer 8, 592-603 (2008)].

[0008]Noviji onkogenomski profili signalizacionih mreža pokazali su važnu ulogu aberantnog FGF signalizovanja u nastanku nekih Čestih humanih kancera [Wesche et al.. Biochem. J. 437 (2), 199-213 (2011)]. O Ugandu nezavisno konstitutivno FGFR signalizovanje opisano je u mnogim humanim kancerima. poput kancera mozga, kancera glave i vrata, gastričnog kancera i kancera jajnika. FGFR-mutirane forme kao i FGFR-intragenske translokacije identifikovane su u malignim bolestima poput mijeloproliferativnih bolesti. Interesantno, iste mutacije za koje se otkrilo da su uzrok mnogih razvojnih poremećaja se takođe nađu u tumorskim ćelijama (npr. mutacije nađene kod ahondroplazije i tanatoforičke displazije, koje uzrokuju dimerizovanje i prema tome konstitutivnu aktivaciju FGFR-3, se takođe često nađu kod kancera bešike). Mutacija koja potiče dimerizovanje je samo jedan mehanizam koji može da poveća o ligandu nezavisno signalizovanje od FGFR. Druge mutacije smeštene unutar ili izvan kinaznog domena FGFR mogu da promene konformaciju domena, što dovodi do trajno aktivnih kinaza.

[0009]Amplifikacija hromosomske regije 8p 11-12, genomske lokacijeFGFR- 1,je česta fokalna amplifikacija u kanceru dojke i dešava se kod približno 10% kancera dojke, pretežno u na receptor estrogena pozitivnim kancerima. OFGFR- 1amplifikacijama je takođe

izvešteno kod nemikroćelijskog skvamoznog karcinoma pluća, te su takođe nađene sa niskom incidencijom kod kancera jajnika, kancera bešike i rabđomiosarkoma. Slično tome. približno 10% gastričkih kancera pokazujeFGFR- 2amplifikaciju, što je povezano uz kancere sa lošom prognozom, difuznog tipa. Štaviše, za višestruke polimorfizme jednog nukleotida (SNP)

smeštene u FGFR-1 do -4 nađeno je da koreliraju sa povećanim rizikom za razvoj selektivnih kancera ili je izvešteno kako su povezani sa lošom prognozom (npr. FGFR-4 G388R alel kod kancera dojke, kancera kolona i adenokarcinoma pluća). Direktna uloga tih SNP u promovisanju kancera je još uvek kontroverzna.

[0010]Rezimirano, proveden je velik broj\ n vilroiin vivostudija koje su potvrdile FGFR-1 do -4 kao važne mete u kancerima, te su opsežni pregledi rezimirali te nalaze [vidi, na primer. Heinzle et aL Expert Opin. Ther. Targets 15 (7). 829-846 (2011): Wesche et al.. Biochem. J. 437 (2), 199-213 (2011); Greulich i Pollock. Trends u Moiecular Medicine 17 (5). 283-292

(2011); Haugsten et al., Mol. Cancer Res. 8 (11), 1439-1452 (2010)]. Nekoliko je strategija sleđeno da bi se oslabilo aberantno FGFR-1 do -4 signalizovanje u humanim tumorima uključujući blokirajućaantitela i malomolekulske inhibitore, između ostalih. Brojni selektivni malomolekulski FGFR inhibitori su trenutno u kliničkom razvoju, poput AZD-4547 (Astra-Zeneca) i BJG-398 (Novartis).

f00111Uprkos značajnim naprecima koji su uopšteno postignuti u terapiji kancera tokom poslednjih godina, postoji kontinuisana potreba da se iđentifikuju nova anti-kancer jedinjenja sa poboljšanim osobinama, poput veće snage, veće selektivnosti, smanjene toksičnosti i/ili bolje tolerabilnosti. Prema tome, tehnički problem kojeg se rešava prema ovom pronalasku može da se posmatra kao donošenje alternativnih jedinjenja koja poseduju inhibitomu aktivnost prema FGFR kinazama, nudeći time nove terapijske opcije za lečenje FGFR-posredovanih bolesti, određenije kancera i drugih proliferativnih poremećaja.

[0012]Fuzionisani hetero-5.6-biciklički inhibitori kinaze koji nose 9- ili 10-člani biciklički heteroaril supstituent obelodanjeni su u WO 2007/061737-A2 i WO 2005/097800-A1. odnosno. Za ova jedinjenja se navodi da su korisna za lečenje kancera i drugih bolesti zbog njihovog inhibitornog dejstva na mTOR (meta rapamicina kod sisara) i/ili IGF-1R (receptor inzulinu sličnog faktora rasta tipa 1) kinaze. Daljnje hetero-5,6-bicikličke osnovne strukture povezane sa inhibicijom kinaza opisane su u,inier ulici,WO 01/19828-A2, WO 2007/079164-A2 i WO 2010/051043-A1.

[0013] 4-aminopirolo[2.1-f][l,2,4]triazin derivati sa različitim inhibicionim profilima protiv brojnih protein kinaza obelodanjeni su u.inter aliu,WO 00/71129-A1, WO 2007/056170-A2. WO 2007/061882-A2, WO 2007/064932-A2. WO 2009/136966-A1 i WO 2010/126960-A1.

[0014jU wO 2005/121147-A1. WO 2007/064883-A2 i WO 2007/064931-A2. 4-aminopirolo[2,l-f]-[l,2.4]triazin derivati koji sadrže supstituisanu điarilurea grupu u 5-poziciji su opisani kako poseduju FGFR-1 inhibitornu aktivnost. Međutim, druge receptorske tirozin kinaze, naročito VEGFR, PDGFR i Tie-2 kinaze. su takođe značajno inhibisane ovom određenom klasom jedinjenja. Budući je hipotezirano kako bi takva višekinazna aktivnost mogla da vodi do pojačavanja potencijalnih nuspojava tokom lečenja. cilj je ovog pronalaska identifikovati nove agense koji poseduju poboljšanu selektivnost prema FGFR kinazama, time nudeći nove opcije za lolerabilniju terapiju kancera.

[0015]Iznenađujuće, sada je pronađeno kako određeni 4-aminopirolo[2,l-f][l,2,4]triazin derivati koji nose specifično supstituisani benzotiofen-2-il ostatak na 5-poziciji pokazuju snažnu i selektivnu inhibiciju FGFR kinaza, naročito FGFR-1 i FGFR-3 kinaza, koja čini ova jedinjenja naročito korisnim za lečenje proliferativnih poremećaja, poput kancera i tumorskih bolesti.

[0016]Prema tome. u jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na 6.7-disupstituisane 5-( 1-benzotiofen-2-il)-pirolo[2,l-f][1.2,4]triazin-4-amin derivate opšte formule (I)

u Čemu

R<*>je vodonik, hloro, metil ili inetoksi,

R<2>je vodonik ili metoksi,

uz uslov da barem jedan od R' i R<2>je drugačiji od vodonik,

G<1>predstavlja hloro, (G-C-O-alkil, (Ci-C4)-alkoksikarbonil. 5-člani aza-heteroaril ili grupu -CH2-OR\ -CH2-NR<4>R<5>ili -C(=0)-NR4R6, u čemu

R3 je vodonik, (Ci-Ct)-alkil, (Ci-CfiJ-cikloalkil ili fenil. u čemu

(i) pomenuti (Ci-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi. (G-CVHlkoksi. hidroksikarbonil. (Ci-C4)-alkoksikarbonil. amino. aminokarbonil, mono-fCi-CV)-alkilaminokarbonil. di-(Ci-C4)-alkilaminokarbonil. (C?-C(,)-cikloalkil ili do tri fluoro atoma,

i

(/;) pomenuti (CVCh)-cikloalkil je opcionalno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od (O-CO-alkil. hidroksi i amino,

i

(/'/;) pomenuti fenil je opcionalno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od fluoro, hloro. bromo. cijano. tritluorometil. trifluorometoksi. (Ci-C4)-alkil i (Ct-C4)-alkoksi.

R4 je vodonik ili (Ci-C4)-alkil,

R5 je vodonik, (Ci-C4)-alkil. (Ci-C4)-alkilkarbonil, (C3-C(,)-cikloalkil ili 4- do 6-člani heterocikloalkil. u čemu (i) pomenuti (Ci-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi. (Ci-Ci)-alkoksi. hidroksikarbonil. (Ci-C4)-alkoksikarbonil. aminokarbonil, mono-fG-CV)-alkilaminokarbonil, di-(Ci-C4)-alkilaminokarbonil ili (C3-C6)-cikloalkil,

i

f/7) pomenuti (C.3-C6)-cikloalkil je opcionalno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od (Ci-C4)-alkil. hidroksi i amino,

i

(///) pomenuti 4- do 6-člani heterocikloalkil je opcionalno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od (Ci-C4)-alkil, hidroksi, okso i amino,

R6 je vodonik, (Ci-C4)-alkiI. (Ci-Cis)-cikloalkil ili 4- do 6-člani heterocikloalkil, u

čemu

(i) pomenuti (Ci-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi, (Ci-C4)-alkoksi. hidroksikarbonil, (Ci-C4)-alkoksikarbonil. amino, aminokarbonil, mono-(Ci-C4)-alkilaminokarbonil. di-(Ci-C4)-alkilaminokarbonil ili (Cj-CfO-cikloalkil.

i

(//') pomenuti (C3-C6)-cikloalkil je opcionalno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta

nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od (Ci-C4)-alkil, hidroksi i amino.

i

(///)pomenuti 4- do 6-člani heterocikloalkil je opcionalno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od (Ci-O)-alkil, hidroksi.

okso i amino,

ili

R<4>i R<3>ili R<4>i R<6>, odnosno, su vezani i, uzeti zajedno sa atomom azota na kojeg su vezani, formiraju monociklički, zasićeni 4- do 7-člani heterocikloalkil prsten koji može da sadrži drugi heteroatom u prstenu odabran između N(R<7>) i O. te koji može da bude supstituisan na ugljenikovim atomima prstena sa jednim ili dva supstituenta nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od (Cj-CO-alkil, okso, hidroksi. amino i aminokarbonil i u čemu

R7 je vodonik. (Ci-C4)-alkil, formil ili (Ci-C4)-alki!karbonil.

i

G<2>predstavlja hloro, cijano, (C,-C4)-alkil ili grupu -CR<SA>R<SB->OH, -CH2-NR<9>R"\ - C(=0)-NR"R<12>ili -CH2-OR<15>, u čemu

R8A iRmsu nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od vodonik, (Ci-C4)-alkil, ciklopropil i ciklobutil,

R9 je vodonik ili (C1-C4)-alkil.

R'° je vodonik. (C,-C4)-a!ki]. (Ci-C4)-alkilkarbonil, (Cs-CVcikloalkil ili 4- do 6-člani heterocikloalkil. u čemu (i) pomenuti (Ci-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi, amino. aminokarbonil,

mono-(Ci-C4)-alkilaminokarbonil ili di-(Ci-C4)-alkilaminokarbonil,

i

(//*)pomenuti (Cj-CVj-cikloalkil je opcionalno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta

nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od (C]-C4)-alkil. hidroksi i amino,

i

(///)pomenuti 4- do 6-člani heterocikloalkil je opcionalno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od (Ci-C4)-alkil, hidroksi. okso i amino.

R" je vodonik ili (Ci-C4)-alkil,

R12 je vodonik, (Ci-C^-alkil. (CVCfO-cikloalkil ili 4- do 6-člani heterocikloalkil. u čemu (i) pomenuti (Ci-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi. amino, aminokarbonil.

mono-(Ci-C4)-alkilaminokarboni! ili di-(CVC4)-alkilaminokarbonil.

i

(//')pomenuti (C3-C16)-cikloalki1 je opcionalno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta

nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od (Ct-Cj)-alkil, hidroksi i amino,

i

(//'/')pomenuti 4- do 6-člani heterocikloalkil je opcionalno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od (G-CO-alkil. hidroksi.

okso i amino,

ili

R<9>i R<10>ili R'<1>i R<12>. odnosno, su vezani i. uzeti zajedno sa atomom azota na kojeg su vezani, formiraju monociklički. zasićeni 4- do 7-člani heterocikloalkil prsten koji može da sadrži drugi heteroatom u prstenu odabran između N(R<Li>), O, S i S(0>2. te koji može da bude supstituisan na ugljenikovim atomima prstena sa do tri supstituenta nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od fluoro, (Ct-C4)-alkil. okso. hidroksi.

amino i aminokarbonil i u čemu

R13 je vodonik, (Ci-C4)-alkil, (CVGO-cikloalkii. formil ili (G-C4)-alkiikarbonil.

i

R<l5>je(G-C4)-alkil,

uz usklov da G<1>nije hloro kada G2 je hloro ili cijano.

[0017]Jedinjenja prema ovom pronalasku mogu takođe da budu prisutna u obliku njihovih soli, solvata i/ili solvata soli.

[0018|Jedinjenja prema pronalasku su jedinjenja formule (1) i njihove soli. solvati i solvati soli, jedinjenja uključena u formulu (I) od formula (I-A), (1-B). (I-C). (I-D) i (I-E) pomenuta u sledećem tekstu, njihove soli. solvati i solvati soli, te jedinjenja uključena u formulu (I) i pomenuta u sledećem tekstu kao procesni produkti i/ili primeri izvođenja i njihove soli, solvati i solvati soli, gde jedinjenja uključena u formulu (I) i pomenuta u sledećem tekstu već nisu soli. solvati i solvati soli.

[0019]Soli za svrhe ovog pronalaska su poželjno farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja prema pronalasku (na primer, vidi S. M. Berge et al.. "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 1977, 66. 1-19). Soli koje nisu same podesne za farmaceutsko korišćenje ali mogu da se koriste, na primer. za izolovanje ili prečišćavanja jedinjenja prema pronalasku su takođe uključene.

[0020]Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kiselinske ađicione soli mineralnih kiselina, karboksilnih kiselina i sulfonskih kiselina, na primer soli hlorovodonične kiseline, bromovodonične kiseline, sumporne kiseline, fosforne kiseline, metansulfonske kiseline, etansulfonske kiseline, benzensulfonske kiseline, toluensulfonske kiseline, naftalendisulfonske kiseline, mravlje kiseline, sirćetne kiseline, trifluorosirćetne kiseline, propionske kiseline, mlečne kiseline, vinske kiseline, jabučne kiseline, limunske kiseline, fumarne kiseline, maleinske kiseline i benzojeve kiseline.

[00211Farmaceutski prihvatljive soli takođe uključuju soli uobičajenih baza, poput na primer i poželjno soli alkalnog metala (na primer soli natrij uma i kali juma). soli zemnoalkalnog metala (na primer soli kalcijuma i magnezij uma) i amonijum soli dobivene iz amonijaka ili organskih amina, poput ilustrativno i poželjno etilamina, dietilamina. trietilamina.N. N-diizopropiletilamina, monoetanolamina, dietanolamina. trietanolamina. dimetilaminoetanola. dietilaminoetanola, prokaina, dicikloheksilamina, dibenzilamina. A-metilmorfolina, .V-metilpiperidina, arginina. lizina i 1,2-etilendiamina.

[0022JSolvati u kontekstu pronalaska su obeleženi kao oni oblici jedinjenja prema pronalasku koji formiraju kompleks u čvrstom ili tečnom stanju stehiometrijskom koordinacijom sa molekulima rastvarača. Hidrati su specifični oblik solvata, u kojem se koordinacija dešava sa vodom. Hidrati su poželjni solvati u kontekstu ovog pronalaska.

[0023]Jedinjenja ovog pronalaska mogu. bilo prirodom asimetričnih centara ili ograničenom rotacijom, da budu prisutna u obliku izomera (enantiomera. dijastereomera). Bilo koji izomer može da bude prisutan u kojem je asimetrični centar u (#)-,( S)-ili (7?,S)-konfiguraciji.

[0024]Takođe će da se primeti da kada su dva ili više asimetričnih centara prisutni u jedinjenjima pronalaska, često će da bude moguće nekoliko dijastereomera i enantiomera primernih struktura i kako čisti dijastereomeri i čisti enantiomcri predstavljaju poželjna izvođenja. Podrazumeva se kako su čisti stereoizomeri. čisti dijastereomeri. Čisti enantiomeri i smeše od toga. unutar obima pronalaska.

[0025]Geometrijski izomeri prirodom supstituenata oko dvostruke veze ili prstena mogu da budu prisutni ucis(= Z-) ilitrom(=E-)obliku i oba izomerna oblika su obuhvaćena unutar obima ovog pronalaska.

[0026]Svi izomeri, bilo razdvojeni, čisti, delimično Čisti ili u racemskoj smesi, od jedinjenja ovog pronalaska su obuhvaćeni unutar obima ovog pronalaska. Prečišćavanje pomenutih izomera i razdvajanje pomenutih izomernih smeša može da se postigne standardnim tehnikama poznatim u struci. Na primer. dijastereomerne smeše mogu da se razdvoje u individualne izomere hromatografskim procesima ili kristal i sanj em i racemati mogu da se razdvoje u odgovarajuće enantiomere bilo hromatografskim procesima na hiralnim fazama ili odeljivanjem.

[0027] Uz to, svi mogući tautomerni oblici jedinjenja opisani iznad su uključeni prema ovom pronalasku.

[0028]Ovaj pronalazak takođe obuhvata sve podesne izotopske varijante jedinjenja prema pronalasku. Izotopska varijanta jedinjenja prema pronalasku se pođrazumeva da znači jedinjenje kojem je barem jedan atom unutar jedinjenja prema pronalasku zamenjen za drugi atom istog atomskog broja, ali sa različitom atomskom masom od atomske mase koja se uobičajeno ili pretežno javlja u prirodi. Primeri izotopa koji mogu da se ugrade u jedinjenje prema pronalasku su oni vodonika, ugljenika, azota. kiseonika, fluora, hlora. broma i joda. poput 2H (deuterijum), 3H (tricijum).I3C,<l4>C.<15>N.<I7>0.<IS>0. i8F. '''Cl,<S2>Br.<I23>I.<I24>I.i2<y>Ii<131>1. Određene izotopske varijante jedinjenja prema pronalasku, naročito one u kojima su ugrađeni jedan ili više radioaktivnih izotopa, mogu da budu korisne, na primer. za ispitivanje mehanizma delovanja ili distribucije aktivnog jedinjenja u telu. Zbog komparativno lake pripreme i detektabilnosti, naročito su jedinjenja obeležena sa 'H ili<l4>C izotopima podesna za ovu svrhu. Uz to. ugrađivanje izotopa, na primer deuterijuma. može da dovede do određenih terapijskih koristi kao posledica veće metaboličke stabilnosti jedinjenja, na primer produljivanjem poluživota u telu ili smanjivanjem potrebne aktivne doze. Takve modifikacije jedinjenja prema pronalasku mogu prema tome u nekim slučajevima takođe konstituisati poželjno izvođenje ovog pronalaska. Izotopske varijante jedinjenja prema pronalasku mogu da se pripreme procesima poznatim stručnjacima, na primer postupcima opisanima ispod i postupcima opisanima u radnim primerima, korišćenjem odgovarajućih izotopskih modificacija određenih reagensa i/ili početnih jedinjen ja u tome.

[0029] U kontekstu ovog pronalaska, supstituenti i ostaci imaju sledeće značenje, sem ako nije drugačije specifikovano: (Ci- G- alkil u kontekstu pronalaska predstavlja ravnolančani ili razgranati alkil radikal koji poseduje 1 do 4 atoma ugljenika. Mogu da se pomenu primerom i poželjno: metil, etil, n-propil. izopropil, n-butil, /zo-butil, .veobutil i/t/v-butil.

( Ci- C4- alkoksi u kontekstu pronalaska predstavlja ravnolančani ili razgranati alkoksi radikal koji poseduje 1 do 4 atoma ugljenika. Mogu da se pomenu primerom i poželjno: metoksi, etoksi, n-propoksi, izopropoksi. «-butoksi. /zobutoksi, .sec-butoksi i /fr/-butoksi.

Mono-( Ci-C 4)- alkilamino u kontekstu pronalaska predstavlja amino grupu sa ravnolančanim ili razgranatim alkil supstituentom koji sadrži 1 do 4 atoma ugljenika. Mogu da se pomenu primerom i poželjno: metilamino, etilamino. /7-propilamino. izopropilamino. n-butilamino i/er/-butilamino.

Di-( Ci- C4)- alkilamino u kontekstu pronalaska predstavlja amino grupu sa dva identična ili različita ravnolančana ili razgranata alkil supstituenta od kojih svaki sadrži 1 do 4 atoma ugljenika. Mogu da se pomenu primerom i poželjno:N, N-dimetilamino, A'.A'-dietilamino. A-etil-A'-metilainino. A-metil-A'-«-propilamino. A-izopropil-A'-metilamino, A-izopropiI-Aw?-propilamino,A7.A-diizopropilamino. N- n-butil-jV-metilamino i A<f->^r/-butil-A'-metilamino.

(Ci-C 4)- alkilkarbonil u kontekstu pronalaska predstavlja ravnolančani ili razgranati alkil radikal koji poseduje 1 do 4 atoma ugljenika koji je vezan na ostatak molekula putem karbonil grupe [-C(=0)-]. Mogu da se pomenu primerom i poželjno: acetil, propionil, n-butiril, /zo-butiril. «-pentanoil i pivaloil.

( Ci- C4)- alkoksikarbonil u kontekstu pronalaska predstavlja ravnolančani ili razgranati alkoksi radikal koji poseduje 1 do 4 atoma ugljenika koji je vezan na ostatak molekula putem karbonil grupe [-C(=0)-]. Mogu da se pomenu primerom i poželjno: metoksikarbonil, etoksikarbonil, «-propoksikarbonil, izopropoksikarbonil.n-butoksikarbonil i to-/-butoksikarbonil.

Mono-( Ci- C4)- alkilaminokarbonil u kontekstu pronalaska predstavlja amino grupu koja je vezana na ostatak molekula putem karbonil grupe [-C(=0)-] i koja poseduje ravnolančani ili razgranati alkil supstituent koji poseduje 1 do 4 atoma ugljenika. Mogu da se pomenu primerom i poželjno: metilaminokarbonil. etilaminokarbonil./?-propilaminokarbonil, izopropilaminokarbonil,H-butilaminokarboni! ileri-butilaminokarboni I.

BL-(Ci-C4)- alkilaminokarbonil u kontekstu pronalaska predstavlja amino grupu koja je vezana na ostatak molekula putem karbonil grupe [-C{=0)-] i koja poseduje dva identična ili različita ravnolančana ili razgranata alkil supstituenta koji poseduju u svakom slučaju 1 do 4 atoma ugljenika. Mogu da se pomenu primerom i poželjno: A7,jV-dimeti lam inokarboni 1.N, A'-dieti lam i nokarbonil,A-eti l-A'-met i lami no karboni 1, ,V-metil-A'-o-propilaminokarbonil. A'-izopropil-.V-metilaminokarbonil./V.A-diizopropilaminokarbonil, A-rc-butil-A'-metiiaminokarbonil i A-/c/7-butil-A'-metilaminokarbonil.

(jC3-C h)- cikloalkil u kontekstu pronalaska predstavlja monoeiklički. zasićeni karbocikal koji poseduje 3 do 6 atoma ugljenika u prstenu. Mogu da se pomenu primerom: ciklopropil, ciklobutil. ciklopentil i cikloheksil. Poželjni su ciklopropi! i ciklobutil.

4- do 7- člani heterocikloalkil i 4- do 6- ćlani heterocikloalkil u kontekstu pronalaska predstavljaju monoeiklički. zasićeni heterocikal sa 4 do 7 ili, odnosno. 4 do 6 atoma u prstenu ukupno, koji sadrži jedan ili dva identična ili različita heteroatoma u prstenu iz serije N. O, S i S(0)i i koji može da bude vezan putem atoma ugljenika u prstenu ili putem atoma azota u prstenu (ako je prisutan). Poželjan je 4- do 6-člani heterocikloalkil koji sadrži jedan atom azota u prstenu i opcionalno jedan daljnji heteroatom u prstenu iz serije N. 0 ili S(0)z- 5- ili 6- člani heterocikloalkil koji sadrži jedan atom azota u prstenu i opcionalno jedan daljnji heteroatom u prstenu iz serije N ili O je naročito poželjan. Mogu da se pomenu primerom: azetidinil, oksetanil, tietanil, pirolidinil. pirazolidinil. imidazolidinil, tetrahidrofuranii. tiolanil. 1.1-dioksidotiolanil, 1,2-oksazolidinil, t.3-oksazolidinil. 1.3-tiazolidinil, piperidinil, piperazinil. tetrahidropiranil. tetrahidrotiopiranil. 1.3-dioksanil, 1,4-dioksanil. 1.2-oksazinanil, morfoiinil, tiomorfolinil. 1.1-đioksidotiomorfoiinil. azepanil, 1,4-diazepanil i 1,4-oksazepanil. Poželjno su azetidinil, pirolidinil. pirazolidinil. imidazolidinil, 1,2-oksazolidinil, 1.3-oksazolidinil. piperidinil. piperazinil, 1,2-oksazinanil. morfoiinil i tiomorfolinil. Naročito poželjni su pirolidinil. piperidinil. piperazinil i morfoiinil.

5- člani aza- heteroaril u kontekstu pronalaska predstavlja aromatski heterociklički radikal (heteroaromatski) koji poseduje 5 atoma u prstenu ukupno, koji sadrži barem jedan atom azota u prstenu i opcionalno jedan ili dva daljnja heteroatoma u prstenu iz serije N, 0 i/ili S i koji je vezan putem atoma ugljenika u prstenu ili opcionalno putem atoma azota u prstenu (kada je dopušteno valencom). Poželjan je 5-Člani aza-heteroaril koji sadrži jedan atom azota u prstenu ijedan ili dva daljnja heteroatoma u prstenu iz serije N i/ili O. Mogu da se pomenu primerom: pirolil. pirazolil. imidazolil.

oksazolil, tiazolil. izoksazolil, izotiazolil, triazolil. oksadiazolil i tiadiazoiil. Poželjno su pirazolil, imidazolil, oksazolil. izoksazolil i oksadiazolil,

Okso supstituent u kontekstu pronalaska predstavlja atom kiseonika. koji je vezan na

atom ugljenika putem dvostruke veze.

|0030]U kontekstu ovog pronalaska, za sve radikale koji se pojavljuju nekoliko puta. značenje toga je nezavisno jedan od drugog. Ako su radikali u jedinjenjima prema pronalasku supstituisani, radikali mogu da budu mono- ili polisupstituisani, sem ako nije drugačije specifikovano. Poželjna je supstitucija sa jednim ili sa dva ili tri identična ili različita supstituenta. Supstitucija sa jednim ili sa dva identična ili različita supstituenta je naročito poželjna.

100311U poželjnom izvođenju, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja opšte formule (I), u čemu

R<1>je hloro, metil ili metoksi,

R<2>je vodonik ili metoksi.

G<1>predstavlja hloro, (G-C4)-alkil, (Cj-C4)-alkoksikarbonil ili 5-Člani aza-heteroaril odabran iz grupe koja se sastoji od pirazolil, imidazolil. oksazolil, izoksazolil i oksadiazolil ili predstavlja grupu -CH2-OR<3>ili -CH2-NR4R\ u čemu R3 je vodonik, (Ci-C4)-alkil ili (CVCVRikloalkil,

u čemu pomenuti (Ci-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi, (G-C4)-alkoksi. hidroksikarbonil, (Ci-C4)-alkoksikarbonil. amino, aminokarbonil, (C3-C(,)-ciklo-alkil ili do tri fluoro atoma.

R4 je vodonik ili (Ci-C4)-alkil.

R5 je vodonik, (Ci-C4)-alkil. (Ci-C4)-alkilkarbonil, (Cj-CJ-cikloalkil ili 5- ili 6-člani heterocikloalkil, u čemu

(/) pomenuti (G-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi. hidroksikarbonil ili (CV

C6)-cikloalkil,

i

(/'/)pomenuti 5- ili 6-člani heterocikloalkil je opcionalno supstituisan sa okso.

ili

R<4>i R^ su vezani i, uzeti zajedno sa atomom azota na kojeg su vezani, formiraju monoeiklički, zasićeni 4- do 6-člani heterocikloalkil prsten koji može da sadrži drugi heteroatom u prstenu odabran između N(R<7>) i 0 i koji može da bude supstituisan na atomu ugljenika u prstenu sa okso ili hidroksi i u čemu

R7 je vodonik ili (Ci-Ci)-alkil,

i

G<2>predstavlja hloro, cijano, (C,-C4)-alkil ili grupu -CR^R^-OH. -CH2-NRl)R,(>, - C(=0)-NR"R<12>ili -CH2-OR15. u čemu

R<8A>i R<8B>su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od vodonik. (G-C-O-alkil i eiklopropil.

K9 jevodonik ili metil.

R10 je vodonik, (Ci-C4)-alkil, (Ct-C4)-alkilkarbonil, (C^-C^O-cikloalkil ili 5- ili 6-člani heterocikloalkil. u čemu

(/) pomenuti (G-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi ili aminokarbonil. i

</7) pomenuti 5- ili 6-člani heterocikloalkil je opcionalno supstituisan sa okso,

R" je vodonik ili metil,

R12 je vodonik, (Ci-C4)-alkil, (C3-C(,)-cikloalkil ili 5- ili 6-člani heterocikloalkil, u čemu

(/) pomenuti (G-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi.

i

(//')pomenuti 5- ili 6-člani heterocikloalkil je opcionalno supstituisan sa okso.

ili

R<9>i R'° ili R<11>i R<12>, odnosno, su vezani i, uzeti zajedno sa atomom azota na kojeg su vezani, formiraju monoeiklički, zasićeni 4- do 6-člani heterocikloalkil prsten koji može da sadrži drugi heteroatom u prstenu odabran između N(R<13>). O, S i S(0)2, te koji može da bude supstituisan na ugljenikovim atomima prstena sa do tri supstituenta nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od fluoro. (Ci-C4)-alkil. okso. hidroksi.

amino i aminokarbonil i u čemu

R<13>je vodonik, (G-C4)-alkil, eiklopropil. ciklobutil, formil ili (G-C4)-alkilkarbonil, i

R15 je metil ili etil,

uz usklov da G<1>nije hloro kada G2 je hloro ili cijano.

|0032j U naročito poželjnom izvođenju, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja opšte formule (I), u čemu

R<1>je metil,

R<2>je metoksi.

G<1>predstavlja metil, oksazoI-5-il ili grupu -CH2-OR3 ili -CH?-NR4R\ u čemu

R3 je vodonik, (G-C4)-alkil. eiklopropil ili ciklobutil,

u čemu pomenuti (Ct-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi. metoksi, etoksi, hidroksikarbonil, metoksikarbonil, etoksikarbonil. amino, aminokarbonil, eiklopropil. ciklobutil ili do tri fluoro atoma,

R4 je vodonik. metil ili etil,

R-je vodonik. (Ci-C4)-alkil, acetil, eiklopropil. ciklobutil ili 2-oksopirolidin-3-il, u čemu pomenuti (Ci-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi. hidroksikarbonil, eiklopropil ili ciklobutil,

ili

R<4>i R<5>su vezani i, uzeti zajedno sa atomom azota na kojeg su vezani, formiraju monoeiklički, zasićeni 5- ili 6-člani heterocikloalkil prsten koji može da sadrži drugi heteroatom u prstenu odabran između NH i O i koji može da bude supstituisan na

atomu ugljenika u prstenu sa okso ili hidroksi,

i

G2 predstavlja metil ili grupu -CR^R^-OH, -CH2-NR<9>R<I>() ili -C(=0)-NR<M>R<12>. u čemu

R<8A>iRmsu nezavisno vodonik ili metil.

R9je vodonik,

R10 je vodonik, (Ci-C4)-alkil, acetil, eiklopropil. ciklobutil ili 2-o ksopiro I i d i n-3 - i 1, u čemu pomenuti (Ci-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi ili aminokarbonil,

R" je vodonik ili metil,

R12 je vodonik, (Ci-C4)-alkil, eiklopropil, ciklobutil ili 2-oksopirolidin-3-il,

u čemu pomenuti (Cj-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi.

ili

R<9>i R<10>ili R<n>i R<12>, odnosno, su vezani i, uzeti zajedno sa atomom azota na kojeg su vezani, formiraju monoeiklički. zasićeni 4- do 6-člani heterocikloalkil prsten koji može da sadrži drugi heteroatom u prstenu odabran između N(R<13>). O i S(0)2. te koji može da bude supstituisan na ugljenikovim atomima prstena sa do tri supstituenta nezavisno odabranih iz grupe koja se sastoji od fluoro. metil. okso. hidroksi, amino i aminokarbonil i u čemu

R'3 je vodonik, formi! ili acetil.

[0033]U posebnom izvođenju, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja opšte formule (I), u čemu

R<1>je metil,

i

R2 je metoksi.

[0034]U daljnjem posebnom izvođenju, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja opšte formule (I), u čemu

G<1>predstavlja grupu -CH2-OR3, u čemu

R3 je vodonik ili (G-CO-alkil opcionalno supstituisan sa hidroksi, metoksi, amino. aminokarbonil ili do tri fluoro atoma.

[0035]U drugom posebnom izvođenju, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja opšte formule (I), u čemu

G<1>predstavlja grupu -CH2-NR4R\ u čemu

R<4>je vodonik ili metil.

R5 je (G-GO-alkil, acetil, eiklopropil, ciklobutil ili 2-oksopirolidin-3-il.

u čemu pomenuti (Ci-CtValkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi.

ili

R<4>i R'su vezani i, uzeti zajedno sa atomom azota na kojeg su vezani, formiraju monoeiklički. zasićeni 5- ili 6-člani heterocikloalkil prsten koji može da sadrži drugi heteroatom u prstenu odabran između NH i O i koji može da bude supstituisan na atomu ugljenika u prstenu sa okso ili hidroksi.

[0036]U drugom posebnom izvođenju, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja opšte formule (I), u čemu

G2 predstavlja grupu -CH2-NR9<R>I(<I>. u čemu

R<9>je vodonik,

R10 je acetil ili 2-oksopirolidin-3-il,

ili

R9 i R<10>su vezani i, uzeti zajedno sa atomom azota na kojeg su vezani, formiraju monoeiklički, zasićeni 5- ili 6-člani heterocikloalkil prsten koji može da sadrži drugi heteroatom u prstenu odabran između N(R<13>) i O. te koji može da bude supstituisan na ugljenikovim atomima prstena sa do dva supstituenta nezavisno odabrana iz grupe koja se sastoji od metil, okso, hidroksi i amino i u čemu R13 je vodonik. formil ili acetil.

[0037]U još jednom posebnom izvođenju, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja opšte formule (I), u čemu

G<2>predstavlja grupu -C(=0)-NR1 'R'2, u čemu

R" je vodonik,

R12 je (Ci-C4)-alkil ili 2-oksopirolidin-3-il,

u čemu pomenuti (G-C4)-alkil je opcionalno supstituisan sa hidroksi,

ili

R<11>i R<12>su vezani i, uzeti zajedno sa atomom azota na kojeg su vezani, formiraju monoeiklički. zasićeni 4- do 6-člani heterocikloalkil prsten koji može da sadrži drugi heteroatom u prstenu odabran između NH i O i koji može da bude supstituisan na atomu ugljenika u prstenu sa okso ili hidroksi.

[0038] U naročito poželjnom izvođenju, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja opšte formule (I), u čemu

R<1>je metil.

R<2>je metoksi.

G<1>predstavlja grupu -CH2-OR<3>, u Čemu

R3 je (Ci-C4)-alkil opcionalno supstituisan sa hidroksi. amino ili aminokarbonil.

i

G<2>predstavlja grupu -CH2-NRlJRH) ili -C(0)-NR"R<12>. u čemu

R9 je vodonik,

R10 je 2-oksopirolidin-3-il, ili

R<g>i R10 su vezani i, uzeti zajedno sa atomom azota na kojeg su vezani, formiraju piperazin-l-il, 3-oksopiperazin-l-il ili 4-acetilpiperazin-l-il prsten.

R<n>je vodonik.

R12 je 2-oksopirolidin-3-il,

ili

R<11>i R<12>su vezani i, uzeti zajedno sa atomom azota na kojeg su vezani, formiraju 3-hidroksiazetidin-l-il, 4-hidroksipiperidin-l-il ili 3-oksopiperazin-l-il prsten.f0039]Definicije ostataka specifično navedenih u odnosnim kombinacijama ili poželjnim kombinacijama ostataka su takođe zamenjene kako se želi definicijama ostataka drugih kombinacija, bez obzira na određene kombinacije navedene za ostatke. Kombinacije dva ili više iznad pomenutih poželjnih raspona su naročito poželjne.

|0040| Jedinjenja opšte formule (I) mogu da se pripreme različitim sintetskim putcvima koji su primarno upravljani prirodom određenih odabranih G<1>i G<2>grupa (vidi definicije iznad).

[0041J Prema tome, u drugom izvođenju, ovaj pronalazak se odnosi na proces za pripremu jedinjenja opšte formule (I), karakterisan time da

[A] 6-supstituisani 4-aminopirolo[2,l-t][1.2,4Jtriazin formule (II)

u čemu R<3>ima značenje opisano iznad,

prvo reaguje sa formaldehidom i aminom formule (III)

u čemu R<9>i R'<u>imaju značenja opisana iznad,

u prisustvu kiseline da se dobije jedinjenje formule ( IV)

u čemu R<3>, R9 i R<10>imaju značenja opisana iznad,

zatim bromuje ujedinjenje formule (V)

u čemuR<3>,R9 i R<10>imaju značenja opisana iznad. i nakon toga kupluje sa benzotiofen-2-il boronatom formule (VI)

u čemuR<1>i R<2>imajuznačenja opisana iznad, i

R<14>predstavlja vodonik ili (G-C4)-alkil ili oba R<14>ostatka su vezani zajedno da formiraju -(CH2)2-, -C(CH3)2-C(CH3)2-. -(CH2)3-- -CH2-C(CH3)2-CH2- ili -C(=0)-CH2-N(CH3)-CH2-C(=0) most.

u prisustvu paladijumskog katalizatora i baze da se dobije ciljano jedi nj enje formule (I-A)

u Čemu R<1>, R<2>. R<3>, R<9>i R<ln>imaju značenja opisana iznad,

ili

[B] 6-supstituisani 4-aminopirolo[2,l-f][! .2,4]triazin formule (II)

u čemu R3 ima značenje opisano iznad,

se prvo formiluje sa MA'-dimetilformamidom u prisustvu fosfori! hlorida u aldehid formule (VII)

u čemu R-' ima značenje opisano iznad, zatim bromuje u jedinjenje formule (VIII)

u čemu R<3>ima značenje opisano iznad.

i nakon toga kupluje sa benzotiofen-2-il boronatom formule (VI)

u čemu R<1>,R2 i R<14>i<m>aju značenja opisana iznad,

u prisustvu paladijumskog katalizatora i baze da se dobije jedinjenje formule (IX)

u čemuR<1>,R2 i R<3>imaju značenja opisana iznad,

koje zatim ili

[B-l] reaguje sa aminom formule (III)

u čemu R<9>i R<10>i<m>ajuznačenja opisana iznad,

u prisustvu kiseline i redukcionog agensa da se dobije ciljano jedinjenje formule (1-A)

u čemu R<1>, R<2>, R3,Rg i R<10>imaju značenja opisana iznad, ili

|B-2] oksiduje u karboksilnu kiselinu formule (X)

u čemuR<1>,R2 i R<3>imaju značenja opisana iznad,

i na kraju kupluje sa aminom formule (XI)

u čemu R<11>i R<12>imaju značenja opisana iznad.

u prisustvu kondenzacionog agensa da se dobije ciljano jedinjenje formule (I-B)

u čemuR<1>, R<2>, R<3>, R" i R<12>imaju značenja opisana iznad,

ili

jC] 6-supstituisani 4-amino-5-bromopirolo[2.l-fJ[1.2.4]triazin formule (XII)

se prvo kupluje sa benzotiofen-2-il boronatom formule (VI)

u čemu R<1>,R2 i R14 imaju značenja opisana iznad,

u prisustvu paladijumskog katalizatora i baze da se dobije jedinjenje formule (XIII )

u čemu R<1>i R<2>imaju značenja opisana iznad,

i zatim reaguje sa formaldehidom i aminom formule (III)

u čemu R<y>i R'° imaju značenja opisana iznad,

u prisustvu kiseline da se dobije jedinjenje formule (1-C)

u čemu R<1>, R<2>. R<9>i R<10>imaju značenja opisana iznad,

koje se nakon toga bilo

[C-l] oksiduje u aldehid formule (XIV)

u čemu R<1>. R<2>, R<9>i R<10>imaju značenja opisana iznad,

i tretira sa aminom formule (XV)

u čemuR4 i R"1 imaju značenja opisana iznad,

u prisustvu kiseline i redukcionog agensa da se dobije ciljano jedinjenje formule (I-D)

u čemuR<1>, R<2>, R<4>,R<5>.R<9>i R<1>" imajuznačenja opisana iznad,

ili

[C-2] konvertuje u odgovarajući 6-(halometil) derivat formule (XVI)

u čemuR<1>,R<2>,R<9>i R'° imajuznačenja opisana iznad,

i X je hloro, bromo ili jodo,

i tretira sa alkoholom formule (XVII)

u čemu R<3A>ima značenjeR3 kako je opisano iznad sem vodonika. u prisustvu baze da se dobije ciljano jedinjenje formule (I-E)

u čemu R<1>,R2, R<3A>, R<l>) i R<10>imaju značenja opisana iznad,

nakon Čega opcionalno sledi, gde je prikladno, (/) razdvajanje jedinjenja formule (I) tako dobivenih u njihove pojedine enantiomere i/ili dijastereomere. poželjno koristeći hromatografske postupke, i/ili(//)konvertovanje jedinjenja formule (I) u njihove pojedine hidrate. solvate. soli i/ili hidrate ili solvate soli tretiranjem sa odgovarajućim rastvaračima i/ili kiselinama ili bazama.

[0042]Jedinjenja formula (I-A). (I-B), (I-C), (I-D) i (I-E). koja mogu da se pripreme procesima opisanim iznad, svako predstavljaju određeni podskup jedinjenja opšte formule (I).

[0043]Procesni koraci [A] (II) — (IV) i [C] (XIII) — (I-C). koji predstavljaju reakcije aminometilacije Manih tipa, se izvode na uobičajen način tretiranjem odnosnog početnog jedinjenja sa smešom vodenog formaldehida i amin komponentom (III) u prisustvu kiselinskog katalizatora poput mravlje kiseline ili sirćetne kiseline. Poželjno, sirćetna kiselina se koristi i kao katalizator i kao rastvarač. Reakcija je uobičajeno izvodi pri temperaturi u rasponu od + 20°C do +80°C.

[0044]Kao agens za bromovanje za procesne korake [A] (IV) —► (V) i [Bj (VII) —► (VIII). poželjno se koriste A-'-bromosukcinimid (NBS). 1.3-dibromo-5,5-dimeti!hidantoin (DBDMH) ili elementarni brom. Reakcije su uopšteno izvode u inertnom rastvaraču. poput dihlorometana. hloroforma, tetrahidrofurana, acetonitrila ili A'',,V-dimetiIformamida (DMF). unutar temperaturnog opsega od -78°C do +20°C.

|0045]Reakcije kuplovanja [A] (V) + (VI) -» (I-A), [B] (VIII) + (VI) — (IX) i |C| (XII) + (VI) —»(XIII) ["Suzuki-Mijaura kuplovanje"] se uopšteno izvode u inertnom rastvaraču uz pomoć paladijumskog katalizatora i vodene baze. Paladijumski katalizatori podesni za ovu svrhu uključuju, na primer, paladijum(ll) acetat. palađijum(II) hlorid. bis(trifenilfosfm)paladijum(II) hlorid, bis(acetonitril)paIadijum(II) hlorid. [l.T-bis(difenilfosfino)ferocen]paladijumfII) hlorid. tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0), bis(dibenzilidenaceton)paladijum(0) i tris-(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0), opcionalno u kombinaciji sa drugim fosfin ligandima poput, na primer. 2-đicikloheksilfosfmo-2'.4'.6'-triizopropilbifenila (X-Phos), 2-dicikloheksil-fosfino-2'.6'-dimetoksibifenila (S-Phos). 4.5-bis(difeniltbsfino)-9,9-dimetilksantena(ksantfos) ili 4-(di-/er/-butilfosfino)-A'.A-dimetilanilina. Takođe, mogu da se koriste paladijum pre-katalizatori iz kojih se generiše katalitički aktivna vrsta pod uslovima reakcije, poput {2'-aminobi-fenil-2-il)(hloro)paladijum-dicikloheksil(2',4',6'-triizopropilbifeniI-2-il)fbsfina [vidi. na primer. S. Kotha et al.. Tetrahedron 58. 9633-9695 (2002): T. E. Barder et al.. J. Am. Chem. Soc. 127 (13). 4685-4696 (2005); S. L. Buchvvald et al., J. Am. Chem. Soc, 132 (40), 14073-14075 (2010) i daljnje reference navedene u tome].

[0046]Podesne baze za ove reakcije kuplovanja su određeni je karbonati alkalnog metala, poput natrijum, kalijum ili cezijum karbonata, fosfati alkalnog metala, poput natrijum ili kalijum fosfata ili fluoridi alkalnog metala, poput kalijum ili cezijum fluorida. Uobičajeno, te baze se upotrebljavaju kao vodeni rastvori. Reakcije se izvode u organskim rastvaračima koji su inertni pod uslovima reakcije. Poželjno, upotrebljavaju se sa vodom mešljivi organski rastvarači, poput 1,2-dimetoksietana. tetrahidrofurana. 1,4-dioksana, acetonilrila. A'.A-dimetilformamida (DMF) ili dimetilsulfoksida (DMSO), ali drugi inertni rastvarači. poput dihlorometana ili toluena, mogu takođe da se koriste.

[0047]Procesni korak [B] (II) —► (VII) ["Vilsmajer-Hak formilacija"] se izvodi na uobičajeni način tretiranjem pirolotriazina (II) u A, A-dimetilformamid (DMF) rastvaraču sa fosfori! hloridom. Reakcija se uobičajeno izvodi pri temperaturi od 0°C do +80°C.

[0048]Redukcioni agensi podesni za reakcije reduktivne aminacije |B-1] (IX) + (III) —> (I-A) i [C-l] (XIV) + (XV) —? (I-D) su uobičajeno borohiđriđi alkalnog metala, poput lilijum borohidrida, natrijum borohidrida, kalijum borohidrida. natrijum cijanoborohidrida ili natrijum triacetoksiborohidrida. Transformacije se uopšteno izvodi u prisustvu kiseline, poželjno sirćetne kiseline, u alkoholnom ili etarskom rastvaraču. poput metanola, etanola, izopropanola. tetrahidrofurana ili 1.4-dioksana. unutar temperaturnog opsega od 0°C do +80°C. zavisno od reaktivnosti amin komponenti (III) i (XV). odnosno, i/ili određenog korišćenog borohidrida.

|0049]Za reakciju oksidacije u procesnom koraku [B-2] (IX) — (X), oksidacija sa natrijum hloritom u prisustvu hvatača hipohlorita poput 2-metil-2-butena predstavlja postupak odabira [upor. H. W. Pinnick et al.. Tetrahedron 37. 2091-2096 (1981): A. Raach i 0. Reiser. i. Prakt. Chem. 342 (6), 605-608 (2000) i reference navedene u tome]. Reakcija se uobičajeno izvodi u tetrahidrofuran/voda smeši pri temperaturi između 0°C i ambijentalne temperature.

|0050)Kondenzacioni agensi podesni za procesni korak [B-2] (X) + (XI) -* (I-B) [formacija amida] uključuju, na primer, karbodiimide poput A'.A'-đietil-. A'.A-dipropik A.,V-diizopropiI-. /V.A'-dicikloheksilkarbodiimida (DCC) ili A'-(3-dimetilaminopropil)-A',-etilkarbodiimida (EDC), derivate fozgena poput A'.A'-karbonildiimidazola (CDI) ili izobutil hloro formata, a-hloroenamine poput l-hloro-2-metil-l-dimetilamino-l-propena. fosforna jedinjenja poput propan-fosfonskog anhidrida, dietil cijanofosfonata. bis(2-okso-3-oksazolidinil)fosforil hlorida. benzotriazol-l-iloksi-tris(dimetilamino)fosfonijum heksalluorofosfata (BOP) ili benzotriazol-l-iloksi-tris(pirolidino)fosfonijum heksalluoro fosfata (P)'BOP) i uronijum jedinjenja poputć M"benzotriazol-1 -il)-A. N. Ar'.A"-tetrametil uronijumtetrafluo robo rata (TBTU), 0-(benzotriazol-l-il)-A<r>,A'..V'.A<r>'-tetrametiluronijum heksafluorofosfata (HBTU). 2-(2-okso-1 -(2/f)-piridil)-1.1.3.3-tetrameti I uronijum tetrafluoroborata (TPTU).()-(7-azabenzotriazol-l-il)-A'.A<r>,/V'.A''-tetra-metiluronijum heksafluorofosfata (HATU) ili 0-(lH-6-hlorobenzotriazol-1 -il)-l, 1,3,3-tetra-metiluronijum tetrafluoroborata (TCTU). ako je prikladno u kombinaciji sa daljnjim pomoćnim supstancama. poput 1-hidroksibenzotriazola (HOBt) ili A^-hidroksisukcinimida (HOSu). i/ili bazama poput karbonata alkalnih metala, na primer natrijum ili kalijum karbonata ili organskim amin bazama poput trietilamina,N-metilpiperidina. A'-metilmorfolina (NMM). A'.A'-diizopropiletilamina (DIPEA). piridina ili 4-A<f>,A'-dimetilaminopiridina (DMAP). Prednost je dana korišćenju f^-(7-azabenzotriazol-l-il)-N. N, N', N -tetrametiluronijumheksafluorofosfata (HATU) ili^-(benzotriazol-1 -iI)-A'. N. N',A"-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TBTU) u kombinaciji sa A.A-diizopropiletil-aminom (DIPEA) i opcionalno 1-hidroksibenzotriazolom (HOBt).

[00511 Inertni rastvarači za procesni korak [B-2] (X) + (XI) — > (1-B) su, na primer. etri poput dietil etra,/m-butilmetil etra. tetrahidrofurana. 1.4-dioksana ili 1,2-dimetoksietana. ugljovodonici poput benzena, toluena, ksilena. heksana ili cikloheksana, halogenisani

ugljovodonici poput dihlorometana, trihlorometana. ugljenik tetrahlorida. 1,2-dihloroetana, trihloroetilena ili hlorobenzena ili drugi rastvarači poput acetona, acetonitrila. etil acetata, piridina. dimetilsulfoksida (DMSO). AvV-dimetilformamida (DMF). A^V'-di metil propi len uree (DMPU) ili A-metilpirolidinona (NMP). Takođe je moguće koristiti smeše tih rastvarača. Prednost je dana korišćenju di hlorometana. tetrahidrofurana,A'.A -dimetilformamida ili smeša od toga. Reakcije se uopšteno izvode pri temperaturi u rasponu od 0°C do+60°C. poželjno pri +10°C do +40°C.

[0052]Oksiđacioni agensi koji mogu da konvertuju primarni alkohol (I-C) u aldehid (XIV)

(proces [C-l]) pod blagim uslovima uključuju l.l,l-triacetoksi-l.l-dihidro-1.2-benzjodoksol-3(l//)-on ("Des-Martin perjodinan"), 2.2.6.6-tetrametilpiperidin-l-oksil (TEMPO) u kombinaciji sa sekundarnim oksidansima poput jodosobenzen-/./-điacetata ili natrijum hipohlorita i na dimetilsulfoksidu (DMSO) bazirane oksidacione sisteme poput DMSO/trifluorosirćetni anhidrid ili DMSO/A<r>.A"-dicikloheksilkarbodiimid (DCC). Prednost je dana l,l,l-triacetoksi-l,l-dihidro-1.2-benzjodoksol-3(l/-/)-onu. Reakcija se uopšteno izvodi u inertnom rastvaraču, poželjno koristeći dihlorometan.

[0053]Za hidroksi-u-halogen transformaciju u procesnom koraku [C-2] (I-C) —>■ (XVI). mogu da se upotrebe različiti standardni postupci i reagensi koji su dobro poznati u struci. Reagensi odabira su tionil hlorid [za X = Cl], tetrabromometan/trifenilfosfin [za X = Br] i jod/trifenilfosfin [za X = I], Priprema 6-(hlorometil) derivata (XVI) [X = Cl j je poželjna iz razloga jednostavnosti izvođenja i stabilnosti jedinjenja.

[0054]Baze podesne za procesni korak [C-2] (XVI)+(XVII) —> (I-E) [formacija etra] su određenije karbonati alkalnog metala poput litijum. natrijum. kalijum ili cezijum karbonata, acetati alkalnog metala poput natrijum ili kalijum acetata ili uobičajeno tercijarni amin baze poput trietilamina, A'-metilmorfolina. A-metilpiperidina, A',A'-diizopropiietilamina ili piridina. Prednost je dana A'.A<r->diizopropiletilaminu (DIPEA). Reakcija (XVI) + (XVII) —* (I-E) se izvodi u inertnom rastvaraču, poput tetrahidrofurana ili bez rastvarača, koristeći višak alkohola (XVII). pri temperaturi u rasponu odh-20°C do +200°C. poželjno pri +50°C do +150°C. Uz prednost, konvertovanje se izvodi pomoću mikrotalasnog reaktorskog uređaja.

|0055|Reakciona sekvenca (I-C) —* (XVI) —► (I-E) može da se izvodi u dva odvojena koraka, tj. sa izolacijom i prečišćavanjem Intermedijerg jedinjenja (XVI) ili može da se

izvodi koristeći postupak ujednom sudu, tj. upotrebljavajući sirovi intermedijer (XVI) kako je dobijen u reakciji pripreme.

[0056]U slučajevima gde primarni ili sekundarni amin funkcionalni deo formira deo G<1>ili G<2>grupe u ciljnim jedinjenjima formule (I), ponekad može da bude prikladno u reakcijama pripreme opisanima iznad koristiti zaštićeni derivat ovog amina kao reakcionu komponentu umesto slobodnog amina. Za tu svrhu, mogu da se upotrebe konvencionalne privremene amino-zaštitne grupe, poput acil grupa( npr.acetil ili triiluoroacetil) ili zaštitnih grupa karbamat tipa (npr. Boe-, Cbz- ili Fmoc-grupa). Poželjno se koristi Boe (7er/-butoksikarbonil) grupa. Slično tome. hidroksi funkcionalna grupa koja je deo G<1>ili G2 grupe može privremeno da se blokira u prekursorskim jedinjenjima i procesnim intennedijerima. na primer kao tetrahidropiranil (THP) etar ili kao silil etar derivat, poput trimetilsilil ili/i>/7-butildimetilsilil etra.

]0057|Ove zaštitne grupe mogu zatim istovremeno da se pocepaju tokom izvođenja u vodenom medijumu i postupaka prečišćavanja ili se uklone u narednom, zasebnom reakcionom koraku koristeći standardne postupke dobro poznate u struci. Priprema takvih zaštićenih intermedijera iz odgovarajućih slobodnih amina ili alkohola se takođe lako postigne sledeći opšte postupke opisane u literaturi [vidi. na primer, T. W. Greene i P. Wuts. Protective Groups in Organic Svnthesis. Wilcy, New York. 1999].

[0058]Određeni tipovi zaštićenih (tj. acilovanih) amin derivata pokazuju značajnu FGFR-inhibišuću aktivnost i sami po sebi. Prema tome, takva jedinjenja su takođe obuhvaćena opštom formulom (I) kako je definisano iznad.

[0059]Priprema jedinjenja pronalaska može da se ilustruje pomoću sledećih reakcionih šema:

(0060J6-supstituisani 4-aminopirolo[2,l -f][l,2,4]triazini formule (II) mogu, na primer, da se pripreme sa dva različita puta koji su prikazani na Šemi 5 ispod. U prvom putu. 4-amino-6-cijanopirolo[2,l-f][1.2.4]triazin (XVIII) se konvertuje u estar (XIX) pomoću kiselinom

posredovane alkoholize i zatim redukuje u 6-(hidroksimetil) jedinjenje (Ha) [R<3>u (II) = H] koristeći litijum trietilborohidrid. Standardnom transformacijom u odgovarajući 6-(halometil)pirolotriazin, poput hloro jedinjenja (XX). nakon čega sledi tretiranje sa alkoholom formule (XVII) u prisustvu baze. lako se dobiju etar derivati formule (11b) [R<3>u (II) # H]. Priprema početnog jedinjenja (XVIII) je opisana ranije [vidi int. pat. apl. WO 2007</>064883 (Intermedijer AX / Korak 3)].

[00611Drugi put počinje sa zaštićenim 1-amino-4-bromo-2-cijanopirolom (XXI) [priprema dana u Int. pat. apl. WO 2007/064883 (Intermedijer AAE, Korak 3)]. Deprotonovanjem uretan azota, naknadnim metalovanjem na 4-poziciji i reakcijom sa formaldehidom dobije se 4-(hidroksimetil) derivat (XXII). Tretiranje sa hlorovodonikom. nakon Čega sledi dodavanje alkohola (XVII) i kondenzovanje sa formamidinon koristeći postupak u jednom sudu zatim daje ciljno jedinjenje formule (Ilb). Ovaj put je naročito podesan za pripremu alkil etar derivata [R3A u (Ilb) = (G-CO-alkil] zbog toga što u tim slučajevima alkoholni reaktant (XVII) može takođe da služi kao reakcioni rastvarač.

{0062] 4-amino-5-bromopirolo[2.1-f|[1.2.4]triazinderivat formule (XII) se Iako dobije iz 4-amino-6-(hidroksimetil)pirolo[2,l-f][l,2,4]triazina (Ha) (upor. Šema 5) pomoću inicijalne

5.7-dibrominacije koristeći l,3-dibromo-5,5-dimetilhidantoin i naknadno selektivnom 7-debrominacijom putem halogen-metal izmene sa n-butillitijumom, nakon čega sledi zagasivanje sa metanolomom (vidi Šemu 6 ispod).

[0063JBenzotiofen-2-il boronati formule (VI) mogu prikladno da se pripreme počevši od supstituisani tiofenol derivata formule (XXIV) (vidi Šemu 7 ispod). Alkilacija sa bromo-acetalom (XXV) i naknadno polifosfornom kiselinom posredovana ciklizacija daje benzotiofen intermedijere formule (XXVII) koji se zatim metaluju u 2-poziciji i reaguju sa trialkil boratom. Alkalno izvođenje daje slobodne (benzotiofen-2-il)boronske kiseline formule (Via) koje mogu da se transformišu. ako se želi. u cikličke boronate, npr. takozvane MIDA boronate formule (VIb), standardnim postupcima poznatim u struci [vidi. na primer.

D. M. Knapp et al., J. Am. Chem. Soc. 131 (20), 6961-6963 (2009)J.

[upor. P. A. Ple i L. J. Marnett, J. Heterocvclic Chem. 25 (4), 1271-1272 (1988); A. Venturelli et al.. J. Med. Chem. 50 (23). 5644-5654 (2007)].

[0064]Jedinjenja formula (III). (XI), (XV). (XVII). (XXIV) i (XXV) su ili komercijalno dostupna, poznata iz literature ili mogu da se pripreme od lako dostupnih početnih materijala prilagođavanjem standardnih postupaka opisanih u literaturi. Detaljni postupci i literaturne reference za pripremu početnih materijala mogu takođe da se nadu u Eksperimentalnom delu u sekciji o pripremi početnih materijala i intennedijera.

[0065]Priprema daljnjih podgrupa jedinjenja opšte formule (I) je ilustrovana na sledećim reakcionim šemama 8-14. Potrebni pirolotriazin prekursori mogu lako da se sintetizuju uobičajenim postupcima dobro poznatim u struci i daljnje sintetske transformacije, u najviše slučajeva, slede puteve za pripremu koji su navedeni u procesnoj sekciji iznad, koristeći slične tipove reakcija, poput, na primer. bromovanja, boronat kuplovanja, aminometilovanja. reduktivnog aminovanja. oksidovanja i/ili reakcija formiranja etra ili amida. Daljnji detalji su dani u Eksperimentalnom delu o pripremi primernih izvođenja i njihovih odnosnih prekursorskih jedinjenja.

[R8A,R8<B>= (Ci-C4)-alkiI, eiklopropil ili ciklobutil]. [R<8A>= (Ci-C4)-alkil, eiklopropil ili ciklobutil; X = Cl. Br ili Ij. [R = (Ci-C4)-alkil]. [R = hloro ili (Ci-C4)-alkil; za pripremu početnog materijala (XXVIII), vidi int. pat. apl. WO 2007/064883 i WO 2007/056170, odnosno]. [za pripremu početnog jedinjenja (XXIX), vidi Šemu 14 ispod].

[0066]Jedinjenja ovog pronalaska poseduju korisne farmakološke osobine i mogu da se koriste za prevenciju i lečenje poremećaja u ljudi i drugih sisara.

[0067] Jedinjenja ovog pronalaska su snažni inhibitori aktivnosti ili ekspresije receptorskih tirozin kinaza, određenije FGFR kinaza i pre svega FGFR-1 i FGFR-3 kinaza, U određenim izvođenjima, poremećaji koji se odnose na aktivnost FGFR kinaza su proliferativni poremećaji, određenije kancer i tumorske bolesti.

[0068] U kontekstu ovog pronalaska, izraz "lečenje" ili "lečiti" uključuje inhibisanje, odgađanje, olakšavanje, ublažavanje, zaustavljanje, smanjivanje ili uzrokovanje regresije bolesti, poremećaja, stanja ili okolnosti, razvoja i/ili progresije od toga. i/ili simptoma od toga. Izraz "prevencija" ili "prevenisati" uključuje smanjivanje rizika za bolovanje od. dobijanje ili doživljavanje bolesti, poremećaja, stanja ili okolnosti, razvoja i/ili progresije od toga, i/ili simptoma od toga. Izraz prevencija uključuje profilaksu. Lečenje ili prevencija poremećaja, bolesti, stanja ili okolnosti mogu da budu delimični ili potpuni.

|0069] Izraz "proliferativni poremećaj" uključuje poremećaje koji uključuju neželjenu ili nekontrolisanu proliferaciju ćelije. Jedinjenja ovog pronalaska mogu da se upotrebe da se spreči, inhibiše, blokira, smanji, snizi, kontroliše ild.. ćelijska proliferacija i/ili ćelijska deoba. i/ili izazove apoptoza. Ovaj postupak obuhvata prirnenu na subjektu kojemu je to potrebno, uključujući sisara, uključujući čoveka. količine jedinjenja ovog pronalaska ili farmaceutski prihvatljive soli, izomera, polimorfa. metabolita, hidrata ili solvata od toga koji su delotvorni u lečenju ili prevenciji poremećaja.

[0070| Kroz ovaj dokument, iz razloga jednostavnosti, prednost je dana korišćenju jezika u jednini naprema jeziku u množini, ali se uopšteno smatra kako je uključen i jezik u množini ako nije drukčije navedeno. Na primer, za izraz "Postupak lečenja bolesti kod pacijenta, koji obuhvata prirnenu na pacijentu delotvorne količine jedinjen ja formule (I)" predviđeno je da uključuje simultano lečenje više od jedne bolesti kao i prirnenu više od jednog jedinjenja formule (I).

[0071] Proliferativni poremećaji koji mogu da se leče i/ili prevenišu sa jedinjenjima ovog pronalaska određenije uključuju, ali nisu ograničeni na, grupu kancera i tumorskih bolesti. Oni se podrazumevaju u značenju, određenije, sledećih bolesti, ali bez ograničavanja na njih: mamarnih karcinoma i mamarnih tumora (duktalni i lobularni oblici, takođein silu),tumora respiratornog trakta (mikroćelijskog i nemikroćelijskog karcinoma pluća, parvocelularnog i neparvocelularnog karcinoma, bronhijalnog karcinoma, bronhijalnog adenoma. pleuropulmonarnog blastoma), cerebralnih tumora (npr. moždanog debla i hipotalamusa, astrocitoma, glioblastoma, meduloblastoma, ependimoma i neuro-ektodermalnih i pinealnih tumora), tumora organa za varenje (jednjaka, želuca, žučnog mehura, tankog creva, debelog creva, rektuma. anusa), tumora jetre (inter alia hepatocelularnog karcinoma, holangiocelularnog karcinoma i mesnog hepatocelularnog i holangiocelularnog karcinoma), tumora u području glave i vrata (grkljana, hipofarinksa, nazofarinksa, orofarinksa, usana i usne šupljine), tumora kože (karcinoma pločastog epitela. Kaposijevog sarkoma, malignog melanoma, kancera kože Merkelovih ćelija i nemelanomatoznog kancera kože), tumora mekog tkiva (inter alia sarkoma mekog tkiva, osteosarkoma, malignih fibroznih histiocitoma. limfosarkoma i rabdomiosarkoma), tumora oka (inter alia intraokularnog melanoma. uvealnog melanoma i retinoblastoma), tumora endokrinih i egzokrinih žlezda (npr. štitne i paraštitnih žlezda, gušterače i pljuvačne žlezde), tumora urinarnog trakta (tumora bešike, penisa, bubrega, renalne karlice i mokraćovoda), tumora reproduktivnih organa (karcinoma endometrijuma, cerviksa. jajnika, vagine, vuive i materice kod žena i karcinoma prostate i testisa kod muškaraca), kao i udaljenih metastaza od toga. Ovi poremećaji takođe uključuju proliterativne bolesti krvi u čvrstom obliku i kao cirkulišuće krvne ćelije, poput limfoma. leukemija i mijeloproliferativne bolesti, npr. akutnu mijeloidnu. akutnu limfoblastičnu. hroničnu limfocitičnu. hroničnu mijelogeničnu i leukemiju vlasastih ćelija i AIDS-om povezane limfome, Hodžkinove limfome, neHodžkinove limfome, kožne limfome T-ćelija, Burkitove limfome i limfome u centralnom nervnom sistemu.

[0072] Zbog njihovg profila aktivnosti i selektivnosti, veruje se kako su jedinjenja ovog pronalaska narćito podesna za lečenje kancera i tumorskih bolesti dojke (mamarnih). pluća, želuca (gastričnih), bešike i jajnika. Nadalje, jedinjenja ovog pronalaska mogu da budu naročito podesna za prevenciju ili supresiju tumorskih metastaza uopšte.

[0073] Drugi proliferativni poremećaji koji mogu da se leče i/ili prevenišu sa jedinjenjima i postupcima ovog pronalaska uključuju psorijazu. keloide i druge hiperplazije koje zahvataju kožu, bulozne poremećaje povezane sa formiranjem subepiđermalnog mehura uključujući bulozni pemfigoid, ervthema multiforme i dermatitis herpetiformis. fibrotičke poremećaje poput plućne fibroze. ateroskleroze. restenoze i ciroze jetre, renalne bolesti uključujući proliferativne poremećaje mezangijalnih ćelija, glomerulopatije, glomerulonefritis. dijabetičku nefropatiju. malignu nefrosklerozu i bolest policističnog bubrega, benignu hiperplaziju prostate (BPH). angiogenetske ili proliferativne poremećaje krvnih sudova i sindrome trombotičke mikroangiopatije.

[0074] Jedinjenja ovog pronalaska su takođe korisna za lečenje i/ili prevenciju oftalmoloških bolesti poput, na primer, sa starošću povezane makulame degeneracije (AMD), suve makulame degeneracije, ishemične okluzije retinalne vene, dijabetičkog edema makule, dijabetičke retinopatije, retinopatije nedonoščadi i drugih retinopatija.

[0075]Druga stanja koja mogu da se lece i/ili prevenišu primenom jedinjenja ovog pronalaska uključuju ginekološke bolesti poput endometrioze. mioma i ovarijskih cista, metaboličke poremećaje povezane sa adipogenezom. metabolizmom žuči, metabolizmom fosfata, metabolizmom kalcijuma i/ili mineralizacijom kosti, poremećaje skeleta poput, na primer, dvarfizma, ahondrodisplatije i Fajferovog sindroma, bolesti hrskavice poput osteoartritisa i poliartritisa, reumatoidnog artritisa, ćelavost i odbacivanje transplantata.

[0076] Bolesti pomenute iznad su dobro karakterisane kod ljudi, ali takođe postoje sa uporedivom etiologijom kod drugih sisara i mogu kod njih da se leče sa jedinjenjima i postupcima ovog pronalaska.

[0077] Prema tome, ovaj pronalazak se nadalje odnosi na korišćenje jedinjenja prema pronalasku za lečenje i/ili prevenciju poremećaja, naročito prethodno pomenutih poremećaja.

[0078] Ovaj pronalazak se nadalje odnosi na korišćenje jedinjenja prema pronalasku za pripremu farmaceutske kompozicije za lečenje i/ili prevenciju poremećaja, naročito prethodno pomenutih poremećaja.

|0079| Ovaj pronalazak se nadalje odnosi na korišćenje jedinjenja prema pronalasku u postupku za lečenje i/ili prevenciju poremećaja, naročito prethodno pomenutih poremećaja.

(0080] Ovaj pronalazak se nadalje odnosi na postupak za lečenje i/ili prevenciju poremećaja, naročito prethodno pomenutih poremećaja, korišćenjem delotvorne količine barem jednog od jedinjenja prema pronalasku.

[0081] Jedinjenja ovog pronalaska mogu da se primenjuju kao jedini farmaceutski agens ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapijskih agensa sve dok ova kombinacija ne dovodi do neželjenih i/ili neprihvatljivih nuspojava. Takva kombinaciona terapija uključuje prirnenu formulacije pojedinačnog farmaceutskog doziranja koje sadrži jedinjenje formule (I), kako je definisano iznad i jednog ili više dodatnih terapijskih agensa, kao i prirnenu jedinjenja formule (I) i svakog od dodatnih terapijskih agensa u njihovoj zasebnoj formulaciji farmaceutskog doziranja. Na primer, jedinjenje formule (I) i terapijski agens mogu da se primene na pacijentu zajedno u pojedinačnoj (fiksnoj) kompoziciji za oralno doziranje poput

tablete ili kapsule ili svaki agens može da se primeni u zasebnim formulacijama za doziranje.

(0082]Gde se koriste zasebne formulacije za doziranje, jedinjenje formule (I) i jedan ili više dodatnih terapijskih agensa mogu da se primene u suštini istovremeno (tj. istodobno) ili u zasebno raspoređenim vremenima (tj. sekvencijalno).

[0083] Određenije, jedinjenja ovog pronalaska mogu da se koriste u fiksnoj ili razdvojenoj kombinaciji sa drugim antikancer agensima poput alkilujućih agensa, antimetabolita. iz biljaka dobijenih antitumorskih agensa, agensa za hormonalnu terapiju, inhibitora topoizomeraze. tubulin inhibitora, inhibitora kinaze, ciljanih lekova, antitela. antitelo-lek konjugata (ADC), imunoloških lekova, modifikatora biološkog odgovora, antiangiogenetskih jedinjenja i drugih antiproliferativnih, citostatskih i/ili citotoksičnih supstanci. U tom pogledu, sledeće je neograničavajuća lista primera sekundarnih agensa koji mogu da se koriste u kombinaciji sa jedinjenjima ovog pronalaska:

[0084] Abareliks, abirateron, aklarubicin, afatinib. aflibercept, aldesleukin, alemtuzumab, alitretinoin, alfaradin. altretamin, aminoglutetimid, amonafid, amrubicin, amsakrin. anastrozol, andromustin, arglabin, asparaginaza, aksitinib, 5-azacitidin, baziliksimab, belotekan, bendamustin, bevacizumab, beksaroten. bikalutamid. bisantren. bleomicin. bortezomib, bosutinib, brivanib alaninat, buserelin. busulfan, kabazitaksel, CAL-101. kalcijum folinat, kalcijum levofolinat. kamptotecin. kapecitabin, karboplatin, karmofur, kannustin. katumaksomab, kediranib, kehnoleukin. ketuksimab. hlorambucil. hlotmadinon, hlormetin, cidofovir, cisplatin, kladribin, klodronska kiselina, klofarabin. kombretastatin. krizantaspas, krizotinib. ciklofosfamid, ciproteron. citarabin, dakarbazin. daktinomicin, darbepoetin alfa, darinaparsin, dasatinib. daunorubicin, decitabin, degareliks. denileukin diftitoks. denosumab, deslorelin, dibrospidijum hlorid. docetaksel, dovitinib, đoksifluridin. doksorubicin, dutasterid. ekulizumab, edrekolomab, etlornitin. eliptinijum acetat. eltrombopag, endostatin, enocitabin. epimbicin. epirubicin, epitiostanol. epoetin alfa. epoetin beta, epotilon, eptaplatin. eribulin. erlotinib. estradiol, estramustin, etopozid. everolimus. eksatekan, eksemestan, eksisulind, fadrozol. fenretinid. filgrastim. finasterid, navopiridol. fludarabin, 5-tluorouracil, fluoksimesteron, flutamid. foretinib, formestan, fotemustin. fulvestrant, ganireliks, gefitinib, gemcitabin, gemtuzumab, gimatekan. gimeracil, glufosfamid, glutoksim, goserelin, histrelin, hidroksiurea. ibandronska kiselina, ibritumomab tiuksetan, idambicin, ifosfamid, imatinib, imikvimod, improsulfan, intedanib. interferon alfa, interferon alfa-2a. interferon alfa-2b, interferon beta, interferon gama, interleukin-2. ipilimumab. irinotekan, iksabepilon. lanreotid. lapatinib. lasofoksifen. lenalidomid, lenograstim, lentinan, lenvatinib, lestaurtinib. letrozoi, leuprorelin. ievamisol, linifanib. linsitinib, lisurid, lobaplatin, lomustin, lonidamin. lurtotekan. mafosfamid, mapatumumab. masitinib, masoprokol. medroksiprogesteron. megestrol, melarsoprol. meifalan. mepitiostan, merkaptopurin. metotreksat. metil aminolevulinat. metiltestosteron, mifamurtid. mifepriston, miltefosin, miriplatin, mitobronitol, mitoguazon. mitolaktol. mitomicin. mitotan. mitoksantron, molgramostim. motesanib, nandrolon. nedapiatin, nelarabin, neratinib, nilotinib, nilutamid, nimotuzumab, nimustin, nitrakrin, nolatreksed, ofatumumab, oprelvekin, oksaliplatin, paklitaksel. palifermin, pamidroniska kiselina, panitumumab. pazopanib, pegaspargaza, peg-epoetin beta, pegfilgastrim, peg-interferon alfa-2b. pelitreksol, pemetreksed, pemtumomab, pentostatin, peplomicin. pertbsfamid. perifosin. pertuzumab. picibanil, pirambicin. pirarubicin, pleriksafor. plikamicin. poliglusam, poliestradiol fosfat, ponatinib, porfimer natrijum, pralatreksat. prednimustin, prokarbazin. prokodazol. PX-866. kvinagolid. raloksifen, raltitreksed, ranibizumab, ranimustin, razoksan. regorafenib. risedronska kiselina, rituksimab. romidepsin. romiplostim, rubitekan. sarakatinib, sargramostim, satraplatin, selumetinib, sipuleucel-T. sirolimus, sizofiran. sobuzoksan, sorafenib, streptozocin. sunitinib. talaporfin. tamibaroten. tamoksifen. tandutinib. tasonermin. teceleukin, tegafur, telatinib, temoporfin, temozolomid. temsirolimus, teniposid. testolakton. testosteron. tetrofosmin, talidomid, tiotepa, timalfasin. tiogvanin. tipifamib. tivozanib. toceranib, tocilizumab. topotekan, toremifen, tositumomab. trabektedin, trastuzumab. treosulfan, tretinoin, triapin, trilostan, trimetreksat, triptorelin. trofosfamid, ubenimeks, valrubicin, vandetanib, vapreotid, varlitinib. vatalanib. vemurafenib. vidarabin, vinblastin, vinkristin. vindesin, vinflunin. vinorelbin. voiociksimab. vorinostat. zinostatin. zoledronska kiselina i zorubicin.

[0085| Uopšteno, sledećim ciljevima može da se teži sa kombinacijom jedinjenja ovog pronalaska sa drugim antikancer agensima: poboljšana aktivnost u usporavanju rasta tumora, u smanjivanju njegove veličine ili Čak u njegovoj potpunoj eliminaciji u poređenju sa lečenjem sa pojedinačnim aktivnim jedinjenjem;

mogućnost upotrebe hemoterapeutika korišćenih u nižoj dozi nego pri monoterapiji;

mogućnost tolerabilnije terapije sa malo nuspojava u poređenju sa individualnom primenom:

mogućnost lečenja šireg spektra kancera i tumorskih bolesti:

postizanje višeg stepena odgovora na terapiju;

duže vreme preživljavanja pacijenta u poređenju sa standardnom terapijom.

[0086]Prema tome, u daljnjem izvođenju, ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije koje obuhvataju barem jedno od jedinjenja prema pronalasku i jedan ili više dodatnih terapijskih agensa za lečenje i/ili prevenciju poremećaja, naročito prethodno pomenutih poremećaja.

[0087]U lečenju kancera. jedinjenja ovog pronalaska mogu takođe da se upotrebljavaju zajedno sa radijacionom terapijom i/ili hirurškom intervencijom.

[0088]Nadalje, jedinjenja formule (I) mogu da se upotrebljavaju, kao takva ili u kompozicijama, u istraživanju i dijagnostici ili kao analitički referentni standardi i slično, što je dobro poznato u struci.

[0089]Kada se jedinjenja ovog pronalaska primenjuju kao farmaceutski agensi, na ljudima i drugim sisarima. mogu da sedaju per seili kao farmaceutska kompozicija koja sadrži, na primer, 0,1% do 99,5% (poželjnije, 0.5% do 90%) aktivnog sastojka u kombinaci ji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa.

[0090] Prema tome, u drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije koje obuhvataju barem jedno od jedinjenja prema pronalasku, konvencionalno zajedno sa jednim ili više inertnih, netoksičnih, farmaceutski podesnih ekscipijensa i na korišćenje toga za lečenje i/ili prevenciju poremećaja, naročito prethodno pomenutih poremećaja.

f0091JJedinjenja prema pronalasku mogu da deluju sistemski i/ili lokalno. Za tu svrhu, mogu da se primene na podesan način poput, na primer. oralnim, parenteralnim. pulmonamim. nazalnim, lingvalnim, sublingvalnim, bukalnim. rektalnim, đermalnim, transdermalnim, konjunktivalnim, optičkim ili topikalnim putem ili kao implantat ili stent.

[0092]Za te puteve primene, jedinjenja pronalaska mogu da se primene u podesnim aplikacionim oblicima.

(0093)Podesni za oralnu prirnenu su aplikacioni oblici koji funkcionišu prema pređašnjoj struci i dostavljaju jedinjenja prema pronalasku brzo i/ili na modifikovan način i koji sadrže jedinjenja prema pronalasku u kristalnom, amorfnom i/ili rastvorenom obliku, poput, na primer. tableta (neobložene ili obložene tablete, na primer posedujući enterične obloge ili obloge koje su nerastvorljive ili se rastvaraju sa odgodom i kontrolišu otpuštanje jedinjenja prema pronalasku), tableta koje brzo dezintegrišu u ustima ili filmova/vafera. filmova/liofilizata, kapsula (npr. tvrde ili meke želatinske kapsule), šećerom obloženih

tableta, granula, peleta, prahova, emulzija, suspenzija, aerosola ili rastvora.

[0094] Parenteralna primena može da se izvodi uz izbegavanje apsorpcionog koraka (intravenozno, intraarterijalno. intrakarđijalno, intraspinalno ili intralumbalno) ili sa uključivanjem apsorpcije (intramuskularno, supkutano. intrakutano. perkutano ili intraperitonealno). Korisni oblici za parenteralnu prirnenu uključuju injekcione i infuzione preparate u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, liofilizata i sterilnih prahova.

[0095] Oblici podesni za druge puteve primene uključuju, na primer, inhalatorne farmaceutske oblike (npr. inhaler praha, nebulizatori). kapi za nos. rastvore ili sprejeve.

tablete ili kapsule za prirnenu lingvalno. sublingvalno ili bukalno (npr. trošeje, lozenge). supozitorijume. preparate za uvo i oko (npr. kapi. pomade). vaginalne kapsule, vodene suspenzije (losioni, smeše za protresanje), lipofilne suspenzije, pomade, kreme, mleka. paste, pene, prahove za zaprašivanje, transdermalne terapijske sisteme (npr. flasteri), implantate i stentove.

[0096] U poželjnom izvođenju, farmaceutska kompozicija koja obuhvata jedinjenje formule (I) kako je definisano iznad je dana u obliku podesnom za oralnu prirnenu. U drugom poželjnom izvođenju, farmaceutska kompozicija koja obuhvata jedinjenje formule (I) kako je definisano iznad je dana u obliku podesnom za intravenoznu prirnenu.

[0097] Jedinjenja prema pronalasku mogu da se konvertuju u navedene oblike za prirnenu na načinpoznat per semešanjem sa inertnim, netoksičnim, farmaceutski podesnim ekscipijensima. Ovi ekscipijensi uključuju, inter alia. nosače (npr. mikrokristalnu celulozu, laktozu, manitol), rastvarače (npr. tečne polietilen glikole), emulgatore (npr. natrijum dodecil sulfat), surfaktante (npr. polioksisorbitan oleat), disperznte (npr. polivinilpirolidon), veštačke i prirodne polimere (npr. albumin), stabilizatore (npr. antioksidanse poput, na primer. askorbinske kiseline), boje {npr. neorganske pigmente poput, na primer. oksida gvožđa) i agense za prikrivanje ukusa i/ili mirisa.

[0098]Poželjna doza jedinjenja ovog pronalaska je maksimum kojeg pacijent može da toleriše i ne razvije ozbiljne nuspojave. Ilustrativno, jedinjenje ovog pronalaska može da se primeni parenteralno pri dozi od oko 0,001 mg/kg do oko 1 mg/kg. poželjno od oko 0,01 mg/kg do oko 0,5 mg/kg telesne težine. Za oralnu prirnenu. primerni raspon doze je oko 0.01 do 100 mg/kg, poželjno oko 0,01 do 20 mg/kg i još poželjnije oko 0,1 do 10 mg/kg telesne težine. Rasponi intermedijerni iznad navedenim vrednostima su takođe predviđeni kao deo pronalaska.

[0099] Ipak, stvarne dozne razine i vremenski tok primene aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama pronalaska mogu da se menjaju tako da se postigne količina aktivnog sastojka koja je delotvoma u postizanju željenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način primene. bez da je toksična za pacijenta. Prema tome. može da bude neophodno, gde je prikladno, odstupiti od navedenih količina, određenije kao funkcija starosti, pola, telesne težine, ishrane i opšteg zdravstvenog statusa pacijenta, biodostupnosti i farmakodinamičkih karakteristika određenog jedinjenja i njegovih načina i puta primene. vremena ili intervala tokom kojeg se odvija primena. odabranog doznog režima, odgovora individualnog pacijenta na aktivni sastojak, specifične bolesti o kojoj se radi. stepena ili zahvaćenosti ili težine bolesti, vrste istovremenog lečenja{tj. interakcije jedinjenja pronalaska sa drugim zajedno primenjenim terapeuticima) i drugih relevantnih okolnosti.

[0100] Prema tome, u nekim slučajevima može da bude zadovoljavajuće raditi sa manje od prethodno pomenute minimalne količine, dok u drugim slučajevima navedena gornja granica mora da se prevaziđe. Lečenje može đa se otpočne sa manjim dozama, koje su manje od optimalne doze jedinjenja. Prema tome, doziranje može da se poveća malim uvećanjima dok se ne dostigne optimalni efekt pod tim okolnostima. Za lakšu prirnenu. ukupna dnevna doza može da se podeli i primeni u individualnim porcijama raspoređenima tokom dana.

[0101] Sledeća primerna izvođenja ilustruju pronalazak. Pronalazak nije ograničen na primere. [0102)Procenti u sledećim testovima i primerima su. sem ako nije drugačije navedeno, težinski; delovi su težinski. Razmere rastvarača. razmere razblaženja i koncentracije navedene za tečnost/tečnost rastvore su svaki bazirani na zapremini.

A.Primeri

Skraćenice i akronimi:

(0103|

Ac acetil

AC2O anhidrid sirćetne kiseline

AcOH sirćetna kiselina

vod. vodeno (rastvor)

Boe/£T/-butoksikarbonil

br. široko ('1I-NMR signal)

Bu butil

kat. katalitički

konc. koncentrisano

d dublet('H-NMR signal)

DBDMH 1,3-dibromo-5.5-dimetilhidantoin

DCI direktno hemijsko jonizovanje (MS)

DCM dihlorometan

Des-Martin perjođinan 1,1,1 -triacetoksi-1.1 -dihidro-1,2-benzjođoksol-3( 1 /f)-on DIPEAN, N- di izopropi leti I am i n

DMF iV,/V-dimetiltbrmamid

DMSO dimetilsulfoksid

El jonizacija udarom elektrona (MS)

ekv. ekvivalent(i)

ESI elektrosprej jonizacija (MS)

Et etil

EtOAc etil acetat

GC-MS sa gasnom hromatografijom kuplovana masena spektroskopija

h čas(ova)

Hal halogen

'H-NMR spektroskopija protonske nuklearne magnetske rezonance HPLC tečna hromatografija visoke performanse

iPr izopropil

LC-MS sa tečnom hromatografijom kuplovana masena spektroskopija

Me metil

MeOH metanol

min minut(i)

MS masena spektroskopija

m/z razmer masa-naprema-naelektri sanj u {M S)

NBS /V-bromosukcinimid

rt-Bu ^7-butil

NCS A-hlorosukcinimid

od teor. od teorijskog (hemijski prinos)

Pd/C paladijum na ugljenu

PdCb(dppt) [1,1 '-bis(difeniIfosfino)ferocen]dihloropaladijum(II)

Pd(dba)i bis(dibenzilidenaceton)paladij um

Ph fenil

PPA politbsforna kiselina

Q kvartet ('H-NMR signal)

kvant. kvantitativno (prinos)

rac racemsko

RfTLC retencioni faktor

RP reverzna faza (HPLC)

st sobna temperatura

Rt retenciono vreme (HPLC)

s singlet ('H-NMR signal)

zas. zasićeni (rastvor)

t triplet ('H-NMR signal)

TBAF tetra-n-butilamonijum fluorid

TBDMS /m-butildimetilsilil

TBTU ;V-[(l//-benzotriazol-l-iloksi)(đimetilamino)metilen]-A,r-metil-metanaminijum

tetrafluoroborat

tBu/<?/7-butil

tentercijarni

TFA trifluorosirćetna kiselina

THF tetrahidrofuran

TLC tankoslojna hromatografija

LC- MS iGC- MSpostupci:

Postupak1 ( LC- MS) :

[0104]Instrument: Micromass Quattro Premier sa Waters UPLC Acquity; kolona: Thermo Hypersil GOLD 1,9u, 50 mm x 1 mm; eluens A: 1 L voda + 0.5 mL 50% vod. mravlja kiselina, eluens B: 1 L acetonitril + 0.5 mL 50% vod. mravlja kiselina; gradijent: 0,0 min 90% A -> 0,1 min 90% A -> 1.5 min 10% A -? 2.2 min 10% A; temperatura: 50°C: brzina toka: 0,33 mL/min; UV detekcija: 210 nm.

Postupak2( LC- MS) :

[0105)Instrument: Waters Acquity SQD UPLC Sistem: kolona: Waters Acquity UPLC HSS T3 1,8u, 50 mm x 1 mm; eluens A: 1 L voda + 0,25 mL 99% mravlja kiselina, eluens B: 1 L acetonitril + 0.25 mL 99% mravlja kiselina; gradijent: 0,0 min 90% A —» 1.2 min 5% A —* 2,0 min 5% A; pećnica: 50°C; brzina toka: 0.40 mL/min; UV detekcija: 210-400 nm.

Postupak3 ( LC- MS) :

[0106] Instrument: Micromass Cmattro Micro sa HPLC Agilent 1100 Series; kolona: YMC-Triart Cl8 3u, 50 mm x 3 mm; eluens A: 1 L voda + 0.01 mol amonijum karbonat, eluens B: 1 L acetonitril; gradijent: 0,0 min 100% A —* 2.75 min 5% A —* 4,5 min 5% A; pećnica: 40°C; brzina toka: 1.25 mL/min; UV detekcija: 210 nm.

Postupak 4 ( LC- MS) :

[0107]Instrument: Waters Acquity SQD UPLC Svstem; kolona: VVaters Acquity UPLC HSS T3 1,8u, 30 mm x 2 mm; eluens A: 1 L voda + 0.25 mL 99% mravlja kiselina, eluens B: 1 L acetonitril + 0,25 mL 99% mravlja kiselina: gradijent: 0.0 min 90% A —> 1.2 min 5% A —► 2,0 min 5% A; pećnica: 50°C: brzina toka: 0.60 mL/min; UV detekcija: 208-400 nm.

Postupak5( LC- MS) :

|0108]Instrument: Micromass Quattro Premier sa Waters UPLC Acquity; kolona: Thermo Hypersil GOLD l,9u, 50 mm x 1 mm; eluens A: 1 L voda + 0.5 mL 50% vod. mravlja kiselina, eluens B: 1 L acetonitril + 0,5 mL 50% vod. mravlja kiselina; gradijent: 0,0 min 97% A- >0.5 min 97% A -> 3,2 min 5% A -> 4.0 min 5% A: temperatura: 50°C; brzina toka: 0.3 mL/min; UV detekcija: 210 nm.

Postupak 6( GC- MS) ;

|0109|Instrument: Micromass GCT. GC6890: kolona: Restek RTX-35. 15 m x 200 nm x 0.33 um; konstantni tok sahelijumom: 0.88 mL/min; pećnica: 70°C; ulaz: 250°C; gradijent: 70°C, 30°C/min -» 310°C (održavati tokom 3 min).

Postupak7( LC- MS) :

(0110]Instrument MS: Waters Micromass QM: Instrument HPLC: Agilent 1100 Series; kolona: Agilent ZORBAX Extend-Cl 8 3.0 mm x 50 mm, 3,5u; eluens A: 1 L voda + 0.01 mol amonijum karbonat, eluens B: I L acetonitril: gradijent: 0.0 min 98% A —» 0.2 min 98% A -» 3,0 min 5% A —► 4,5 min 5% A; temperatura: 40°C: brzina toka: ! ,75 mL/min; UV detekcija: 210 nm.

Postupak 8 ( LC- MS) :

(0111)Instrument MS: Waters Micromass ZQ; Instrument HPLC: Agilent 1100 Series; kolona: Agilent ZORBAX Extend-CI8 3.0 mm x 50 mm. 3.5u; eluens A: 1 L voda + 0,01 mol amonijum karbonat, eluens B: 1 L acetonitril: gradijent: 0,0 min 98% A —> 0.2 min 98% A —► 3.0 min 5% A -* 4,5 min 5% A; temperatura: 40°C; brzina toka: 1,75 mL/min; UV detekcija: 210 nm.

Opšti postupci prečišćavanja( vidi Tabelu I i II ispod ) :

Postupak Pl:

(0112)Preparativna RP-HPLC (Reprosil Cl 8, gradijent acetonitril/0.2% vod. trifluorosirćetna kiselina).

Postupak P2:

[0113]Preparativna RP-HPLC (XBridge Cl 8, gradijent acetonitril/voda + 0,1% vod. amonijak).

Postupak P3:

[0I14|Preparativna RP-HPLC (Sunfire Cl8. gradijent acetonitril/voda).

Postupak P4:

[0115]Preparativna RP-HPLC (XBridge Cl8, gradijent acetonitril/voda + 0.05% vod. amonijak).

Postupak P5:

[0116|Produkt dobijen iz prethodnih RP-HPLC prečišćavanja se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE, PL-HCO3MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari.

Postupak P6:

[0117|Rastvor produkta u etil acetatu se ispere sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata. nakon čega sledi zas. vod. rastvor natrijum hlorida, osuši preko magnezijum sulfata, profiltruje i upari.

Početni materijali i lntermedijeri:

Intermedijer 1A

2-metoksi-4-metilanilin

[0118]

jOl 19]Smeša 5-metil-2-nitroanisola (265 g, 1.58 mol) i 10% Pd/C (39.75 g) u THF (1,32 L) se meša preko noći pri st pod l atm vodonika. Filtracijom preko dijatomejske zeml je i evaporisanjem dobije se 216,1 g sirovog produkta koji se koristi u sledećem koraku bez daljnjeg prečišćavanja.

LC-MS (postupak 3): Rt = 2,39 min; MS (ESIpoz): m/z - 138 (M+H)<1>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d&): 6 = 6.45-6.63 (m. 3H). 4.46 (s, 2H), 3.72 (s. 3H). 2.16 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 2A

2-metoksi-4-metilbenzentiol

[0120]

Postupak 1:

[0121]Rastvor natrijum nitrita (7 g, 101.4 mmol) u vodi (25 ml) se doda kapajući u ohlađeni (0°-5°C) rastvor Intermedijera 1A (13,7 g. 100 mmol) u koncentriranoj hlorovodoničnoj

kiselini (30 ml) i vodi (85 ml). Nakon mešanja pri 0°C tokom 10 min. doda se natrijum acetat (15 g, 182.8 mmol). Nastala smeša se doda kapajući u vreli rastvor (70<o->80°C) kalijum O-etil ditio-karbonata (30 g, 187.1 mmol) u vodi (140 ml), meša pri između 70°C i 80°C tokom 1 h. te zatim ohladi na st. Smeša se ekstrahira dvaput sa etil acetatom i kombinovani organski

ekstrakti se osuše preko natrijum sulfata i upare. Ostatak se rastvori u 1.3 M rastvoru kalijum hidroksida u etanolu (300 ml). Doda se glukoza (8 g) i nastala smeša se refluksuje tokom 3 h. Zatim, etanolni rastvarač se upari, te se ostatak razblaži sa vodom i zakiseli sa 6 N vodenom sumpornom kiselinom. Cink u prahu (15 g) se doda pažljivo i nastala smeša se zagrejava do 50°C tokom 30 min. Smeša se zatim ohladi na st. razblaži sa dihlorometanom i profiitruje. Filtrat se ekstrahira dvaput sa dihlorometanom i kombinovani organski ekstrakti se osuše preko natrijum sulfata i upare, čime se dobije 14,3 g sirovog produkta koji se koristi u sledećem koraku bez daljnjeg prečišćavanja.

Postupak 2:

[0122]U 2,9 L THF se doda topli rastvor 355 ml (6.67 mol) koncentrisane sumporne kiseline u 1,1 L vode. Pri 50°C. dodaju se 293 g (1,33 mol) 2-metoksi-4-metilbenzensulfonil hlorida uz mešanje. Zatim, pažljivo se doda 521 g (7.97 mol) cinka u prahu u porcijama (penušanje) i blago egzotermna reakcija se ohladi u vodenom kupatilu da se održava temperatura od 50°-55°C. Smeša se nakonloga meša pri 55°C tokom 3 h. Napredovanje reakci je se prati pomoću TLC (silikagel. petroletar/etil acetat 95:5). Reakciona smeša se izlije u 13.6 L vode. dodaju se 6,8 L dihlorometana i smeša se meša tokom 5 min. Nakon dekantovanja od preostalog cinka i separacije faza. vodena faza se ekstrahira još jednom sa 6,8 L dihlorometana. Kombinovane organske faze se isperu sa 10% rastvorom soli. osuše i upare pri 40°C pod smanjenim pritiskom čime se dobije 237 g sirovog produkta. Ovaj materijal se koristi u sledećem koraku bez daljnjeg prečišćavanja. Analitički uzorak se dobije hromatografijom na silikagelu sa petroletar/etil acetat (97:3 ) kao eluensom.

LC-MS (postupak 1): R, = 1.21 min; MS (ESIneg): m/z = 153 (M-H)'

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 7.17 (d. IH). 6.81 (s, IH). 6.66 (d. IH). 4.63 (br. s. IH). 3.80 (s.3H),2.26 (s, 3H)ppm.

Intermedijer 3A

l-[(2,2-dietoksietil)sulfanil)-2-metoksi-4-metilben/en

|0123]

|0124|237 g sirovog materijala od Intermedijera 2A. 287 g {1.46 mol) bromoacetalđehiđ-dietilacetala i 862 g (2,65 mol) cezijum karbonata se suspenzuju u 2 L DMF. Reakciona temperatura se u početku povisi na 40°C. zatim se mešanje nastavi preko noći pri ambijentalnoj temperaturi. Reakciona smeša se razdeli između 10 L vode i 2.7 L etil acetata. Vodena faza se ekstrahira sa drugom porcijom od 2,7 L etil acetata. Kombinovane organske faze se isperu sa 10% rastvorom soli, osuše i upare. Nastali uljasti ostatak se prečisti hromatografijom na silikagelu sa petroletar/etil acetat (95:5) kao eluensom.

Prinos: 236 g uljaste supstance (66% od teor.)

GC-MS (postupak 6): R. = 6,03 min; MS (EIpos): m/z = 270 (M)<+>1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 - 7.16 (d, IH). 6.82 (s, IH). 6.73 (d. IH).4.55 (t. IH), 3.80 (s, 3H), 3.52-3.64 (m, 2H), 3.39-3.51 (m, 2H). 2.96 (d. 2H). 2.33 (s, 3H), 1.09 (t, 6H) ppm.

Intermedijer 4A

7-metoksi-S-metil-l-benzotiofen

|0125|

[0126]U refluksujuću smešu 13 g polifosforne kiseline i 150 ml hlorobenzena kapajući se doda rastvor 5,2 g (19.2 mmol) Intermedijera 3A i retluksovanje se nastavi preko noći. Nakon hlađenja, organski sloj se dekantuje te se ostatak i boca isperu dvaput sa DCM. Kombinovane organske faze se upare pri smanjenom pritisku. Ostatak (3,76 g) se hromatografiše na silikagelu sa izoheksan/0-10% etil acetat kao eluensom.

Prinos: 1,69 g uljaste supstance (49% od teor.)

GC-MS (postupak 6): R, = 5,20 min; MS (EIpos): m/z = 178 (M)<+>'H-NMR (400 MHz, DMSO-oV): 8 = 7.68 (d. IH), 7.34 (d. IH). 7.28 (s, IH). 6.78 (s. IH), 3.93 (s. 3H), 2.43 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 5A

(7-metoksi-S-metil-l -benzotiofen-2-il)boronska kiselina

|0127|

[0128]Pod atmosferom argona, 26,7 g (150 mmol) Intermedijera 4A se rastvore u 270 ml THF i ohlade na -70°C. Između -70°C i -65°C, kapajući se dodaju 66 ml (165 mmol) 2.5 N rastvora n-butillitijuma u heksanu unutar 20 min, što rezultuje formiranjem belog taloga. Nakon mešanja tokom I h pri -70°C. dodaju se 41,5 ml (180 mmol) triizopropil borata pri ovoj temperaturi unutar 10 min (što rezultuje gustom suspenzijom). Mešanje se nastavi tokom 1 h pri -70°C, pre nego se reakciona smeša ostavi da se zagreje na st preko noći. Zatim se dodaju 400 ml zasićenog vod. rastvora amonijum hlorida, slojevi se razdvoje i vodeni sloj se ekstrahira još jednom sa THF. Kombinovane organske faze se upare pod smanjenim pritiskom. Tako dobivenom ostatku dodaju se 200 ml vode i 86 ml 2 N vod. rastvora natrijum hidroksida. Rastvor se ispere dvaput sa DCM. zatim zakiseli sa 35 ml 3 M sumporne kiseline i nastala suspenzija se meša snažno tokom 1 h. Talog se odfiltrira uz ođsisavanje i osuši preko noći pri 45°Cin vacuo.

Prinos: 28,25 g bezbojne čvrste supstance (94% čisto prema LC-MS. 80% od teor.)

LC-MS (postupak 2): Rt = 0,87 min; MS (ESIpoz): m/z = 223 (M+H)'

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 7.17 (d. IH), 6.81 (s. IH). 6.66 (d. IH). 4.63 (br. s. IH). 3.80 (s. 3H), 2.26 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 6A

2-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-6-metil-l,3i6,2-dioksazaborokan-4,8-dion

|0129]

[0130] 6,3g (28,4 mmol) Intermedijera 5A i 4.2 g (28.4 mmol) 2,2'-(metilimino)disirćelne kiseline se rastvore u smeši 45 ml DMSO i 400 ml toluena te refluksuju tokom 16 h koristeći Din-Stark aparat. Nakon evaporisanja. ostatak se rastvori u etil acetatu i ispere tri puta sa vodom i jedanput sa rastvorom soli. Organska faza se osuši preko magnezij um sulfata i upari do zapremine od oko 200 ml. Istaloži se bela čvrsta supstanca koja se profiltruje, ispere sa etil acetatom i osušiin vacuoda se dobije prvi prinos (5,52 g) jedinjenja iz naslova. Drugi prinos (3,32 g) se dobije nakon evaporisanja matične tečnosti i fleš hromatografije preko sloja silikagela koristeći cikloheksan/0-100% etil acetat kao eluens.

Prinos: 8,84 g (ukupna čistoća 92.5% po LC-MS, 87% od teor.)

LC-MS (postupak 2): R, = 0,93 min; MS (ESIpoz): m/z = 334 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-df>): 5 - 7.42 (s. IH), 7.26 (s. IH). 6.76 (s. IH), 4.40 (d. 2H). 4.17 (d, 2H), 3.92 (s. 3H), 2.63 (s, 3H). 2.42 (s. 3H) ppm.

Intermedijer 7A

Etil 4-aminopirolo[2,l-f]|l,2,4]triazin-6-karboksilat

[0131]

[0132]Rastvor 4-aminopirolo[2,l-f][l,2.4]triazin-6-karbonitrila (3.9 g, 24,5 mmol; priprema opisana u PCT int. pat. apl. WO 2007/064883) u etanolu (124.8 mi) se meša sa koncentrisanom sumpornom kiselinom (62.4 ml) pri 80°C preko noći. Nakon hlađenja na st. reakciona smeša se izlije na 800 g leda i dovede do pH 6-7 sa koncentrisanim vod. rastvorom natrijum hidroksida. Etil acetat (500 ml) i đihlorometan (500 ml) se dodaju u suspenziju i

nastala smeša se profiltruje preko dijatomejske zemlje. Organski sloj se razdvoji od vodenog sloja. Čvrsta supstanca se rastvori u vreloj vodi (1 L) i vodeni sloj se ekstrahira dvaput sa etil

acetatom. Kombinovani organski slojevi se osuše preko natrijum sulfata i upare. Ostatak se triturira sa izopropanol/dietiletar smešom i čvrsta supstanca se odfiltrira. čime se dobije 2,5 g (49% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,59 min; MS (ESIpoz): m/z = 206 (M+H)<f>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 6 = 8.11-7.97 (m, 3H). 7.88 (s, IH). 7.34 (br. s, 1H), 4.27 (q, 2H). 1.30 (t, 311) ppm.

Intermedijer 8A

(4-aminopirolo(2,l-f](l,2,4]triazin-6-il)metanol

(0133]

|0134|Na ledu ohlađen rastvor Intermedijera 7A (3,0 g, 14.5 mmol) u THF (30 ml) se tretira sa 1 M rastvorom litijum trietilborohidrida u THF (58 ml) i meša pri st tokom 45 min. Reakciona smeša se zatim ohladi na 0°C, zagasi sa metanolom. zagreje polako na st i adsorbuje na dijatomejsku zemlju. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijorn na silikagelu (dihlorometan/metanol 20:1 —► 4:1 gradijent) dobije se 2.21 g (92,5% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 3): R, - 1,46 min; MS (ESIpoz): m/z = 164 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-dfi): 5 = 7.75 (s. i H). 7.64 (br. s, 2H), 7.50 (br. d, 1H). 6.79 (br. d, 111), 5.01 (t, IH), 4.50 (d, 2H) ppm.

Intermedijer9A

ter/-butil(2-cijano-4-(hidroksimetil)-l//-pirol-l-il|karbamat

(0135]

[01361Pod argonom, 1 M rastvor metilmagnezijum bromida u THF (13.3 ml) se doda tokom 15 min u rastvor/ć77-butil (4-bromo-2-cijano-l//-pirol-l-il)karbamata (3.7 g. 12,09 mmol: priprema opisana u PCT int. pat. apl. WO 2007/064883, Intermedijer AAE. Korak 3) u THF (37 ml) ohlađen na -60°C. Nakon 30 min. u reakciju se doda 1,6 M rastvor n-butillitijuma u heksanu (15,1 ml, 24.2 mmol) tokom 10 min i nastala smeša se meša između -60°C i -40°C tokom 1 h. Zatim se u reakciju doda paraformaldehid (1.09 g, 36,3 mmol), te se reakciona smeša polako zagreje na st i meša preko noći. Nakon zagasivanja sa zas. vod. rastvorom amonijum hlorida, vodeni sloj se ekstrahira dvaput sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida. osuše preko natrijum sulfata i upare. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (cikloheksan/etil acetat 2: l —> 1:1) dobije se 2.04 g (69% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): Rt= 0,70 min; MS (ESIpoz): m/z - 238 i M • 11)'

'H-NMR (400 MHz, DMSO-df>): 6 = 10.79 (br. s. IH). 7.09 (d. IH). 6.86 (d. 1 H). 4.97 (t, 1H), 4.28 (d, 2H), 1.45 (s, 9H) ppm.

Intermedijer 10A

6-(metoksimetil)pirolo [2,1 -f] [ 1,2,4] triazin-4-amin

[0137]

Postupak l:

[0138]Rastvor Intermedijera 8A (1,3 g. 7,9 mmol) u THF (25 ml) se tretira sa tionil hloridom (1,15 ml, 15,8 mmol) i meša pri st tokom 2 h. Nakon evaporisanja, ostatak se rastvori u metanolu (25 ml) i tretira sa natrijum acetatom (1.3 g. 15,8 mmol). Smeša se meša tokom 3 h pri 65°C. te zatim ponovo upari. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/metanol 100:2) dobije se 787 mg (55% od teor.) jedinjenja iz naslova.

Postupak 2:

|0139|Rastvor Intermedijera 9A (6.14 g, 25,88 mmol) u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1.4-dioksanu (15 ml) se meša pri st tokom 5 h. Nakon razblaženja sa metanolom (73 ml), mešanje pri st se nastavi preko noći. Zatim se dodaju kalijum fosfat (54,9 g. 258.65 mmol) i formamidinijum acetat (13,46 g, 129.32 mmol ). te se nastala smeša meša pri 65°C tokom 17 h. Reakciona smeša se upari, doda se zas. vod. rastvor natrijum hlorida i smeša se ekstrahira sa dihlorometanom, nakon čega sledi etil acetat. Kombinovane organske faze se osuše preko natrijum sulfata i upare. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/metanol 40:1 —» 20:1) dobije se 2.36 g (49% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 3): R, - 1,72 min; MS (ESIpoz): m/z = 179 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 6 = 7.77 (s. IH). 7.69 (br. s. 2H). 7.57 (s. 111), 6.81 (s, 1H). 4.42 (s, 2H), 3.25 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 11A

4-amino-6-(metoksimetil)pirolo[2,l-f)[l,2,4]triazin-7-karbaldehid

[0140]

[0141]Fosforil hlorid (13,7 ml, 147,18 mmol) se doda u rastvor Intermedijera 10A (5.24 g. 29,43 mmol) u DMF (80 ml) pri 0°C. Nastala smeša se meša pri 60°C tokom 8 h. zatim pažljivo zagasi sa vodom i neutrališe sa 4 M vod. rastvorom natrijum hidroksida. Vodeni sloj se ekstrahira sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, osuše preko magnezijum sulfata i upare. Rastvor ostatka u metanolu (50 ml) se tretira sa natrijum acetatom (2.41 g. 29.43 mmol) i refluksuje preko noći. Reakciona smeša se razblaži sa vodom i ekstrahira sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, osuše preko magnezijum sulfata i upare, čime se dobije 2.66 g sirovog produkta koji se koristi u sledećem koraku bez daljnjeg prečišćavanja. LC-MS (postupak 4): Rt = 0,50 min; MS (ESIpoz): m/z = 207 (M+Hr

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 10.35 (s, IH), 8.20 (br. s. 2H). 8.07 (s, IH). 7.06 (s,

1 H), 4.72 (s, 2H), 3.39 (s. 3H) ppm.

Intermedijer 12A

4-amino-5-bromo-6-(metoksimetil)pirolo[2,I-f|[l,2,4|triazin-7-karbaldehid

[0142]

[0143]Rastvor Intermedijera 11A (sirovi. 2,66 g) u DMF (30 ml), ohlađen na -30°C, se tretira sa rastvorom /V-bromosukcinimida (NBS; 2,52 g. 14.19 mmol) u DMF (14 ml). Nastala smeša se polako zagreje na 0°C. Nakon 1 časa, smeša se zagreje na st, meša tokom daljnjih 15 min i zatim zagasi sa 1 M vod. rastvorom natrijum tiosulfata. Talog se odfilirira i ispere sa etil acetatom, čime se dobije 1.1 g (100% čistoća, 30% od teor.) kao prvi prinos jedinjenja iz naslova. Preostali filtrat se ekstrahira sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida. osuše preko natrijum sulfata i upare. Prečišćavanjem ostatka kolonskom hromatografijom na silikagelu (cikloheksan/etil acetat 1:1

—* 1:3) dobije se daljnjih 1,39 g (70% Čistoća, 26% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,67 min; MS (ESIpoz): m/z = 283/285 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 6 = 10.36 (s, IH), 8.63 (br. s, IH), 8.13 (s. IH), 7.23 (br. s, 1 H), 4.64 (s. 2H), 3.26 (s. 3H) ppm.

Intermedijer 13A

4-amino-6-(metoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)piroIo[2,l-f] [1,2,4]-triazin-7-karbaldehid

10144]

[0145]Pod argonom, degasirani 0,5 M vod. rastvor kalijum fosfata (9,9 ml) se doda u rastvor Intermedijera 12A (710 mg, 2,49 mmol), Intermedijera 5A (921 mg. 3.73 mmol) i (2'-amino-biienil-2-il)(hloro)paladij^^ (1:1: 196 mg, 249 umol; vidi S. L. Buchvvald et al., J. Am. Chem. Soc. 132 (40), 14073-14075 (2010)) u degasiranom THF (28,4 ml). Nastala smeša se meša pri 60°C tokom 2 h i zatim upari. Prečišćavanjem ostatka kolonskom hromatografijom na silikagelu (cikloheksan/etil actetat 5:1 —► 1:1) dobije se 550 mg (51% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt- 1,06 min; MS (ESIpoz): m/z = 383 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz. DMSO-da): 6 = 10.50 (s. IH), 8.43 (br. s, IH). 8.21 (s, IH). 7.42 (s. 1H), 7.33 (s, IH), 6.87 (s, IH). 6.09 (br. s, IH), 4.58 (s, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.19 (s. 3H). 2.46 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 14A

6-(etoksimetil)pirolo|2,l-f)[l,2,4]triazin-4-amin

[0146]

Postupak 1:

|0147|U suspenziju 2 g (12,2 mmol) Intermedijera 8A u 40 ml THF dodaju se 1,78 ml (24,4 mmol) tionil hlorida pri st unutar 20 sek. Smeša se meša tokom 1.5 h. zatim upari do suva i ostatak se rastvori u 40 ml etanola. Dodaju se 2 g (24.4 mmol) natrijum acetata i smeša se meša pri 70°C tokom 1 h 45 min. Reakciona smeša se ponovo upari i doda se zas. vod. rastvor natrijum hidrogenkarbonata. Smeša se ekstrahira pet putra sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida. osuše sa magnezijum sulfatom i upare do suva. dajući 2.02 g sirovog produkta koji se prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu sa dihlorometanom/metanol (0-2%) kao eluensom. Prinos: 1,37 g (58% od teor.).

Postupak 2:

[0148JKorak 1: Rastvor Intermedijera 9A (2.3 g. 9.69 mmol) u l.4-dioksanu (5 ml) se tretira sa 4 M rastvorom hlorovodonika u 1,4-dioksanu (24 ml, 96.9 mmol) i meša pri st tokom 130 min. Zatim se suspenzija profiltruje, te se talog ispere sa 1,4-dioksanom (5 ml) i osušiin vacuočime se dobije 1,01 g (54% od teor.) intermedijernog jedinjenja l-amino-4-(hIorometil)-l//-pirol-2-karbonitril hidrohlorida.

[0149]Korak 2: Sveže pripremljen l-amino-4-(hlorometil)-l//-pirol-2-karbonitril hidrohlorid iz Koraka 1 (0,3 g, 1,82 mmol) se rastvori u etanolu (10 ml) i meša pri st tokom 5 min. Bistri rastvor se tretira sa formamidin acetatom (813 mg, 7.81 mmol) i kalijum fosfatom (1.66 g, 7,81 mmol ) te meša prvo pri st tokom 3 dana. zatim pri 80°C tokom 10.5 h. Doda se još formamidin acetata (488 mg. 4,69 mmol) i smeša se meša tokom daljnjih 18 h pri 80°C. Smeša se zatim ohladi na st te se dodaju voda i etil acetat. Organska faza se razdvoji i vodena faza se ekstrahira dvaput sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, osuše sa magnezijum sulfatom i upare. Ostatak se rastvori u smeši metanola i dihlorometana, adsorbuje nadijatomejsku zemlju, osušiin vacitoi na kraju prečisti hromatografijom na silikagelu (gradijent 0-10% metanol/dihlorometan) čime se dobije 260 mg (78% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 3): R, = 2,02 min; MS (ESIpoz): m/z = 193 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz. DMSO-d()): 8 = 7.77 (s. IH), 7.59-7.74 (br. s. 2H). 7.56 (s, IH). 6.82 (s.

IH), 5.76 (s, IH), 4.46 (s, 2H), 3.46 (q, 2H). 1.13 (t. 3H) ppm.

Intermedijer 15A

4-amino-6-(etoksimetil)pirolo[2,l-f][l,2,4]triazin-7-karbaldehid

[0150]

[0151]U rastvor 2.1 g (10.9 mmol) Intermedijera 14A u 40 ml suvog DMF. dodaju se 5.1 ml (54,6 mmol) fosfori! hlorida kapajući pri 0°C pod atmosferom argona. Smeša se meša pri 60°C tokom 10 h. Zatim se pažljivo doda voda i smeša se meša pri ambijentalnoj temperaturi dok se svi reaktivni intermedijeri ne unište (HPLC kontrola). Kiseli rastvor se neutrališe sa 1 M vod. rastvorom natrijum hidroksida i ekstrahira tri puta sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, osuše preko magnezijum sulfata i upare pri smanjenom pritisku.

Prinos: 1,94 g (čistoća 90%, 81% od teor.)

LC-MS (postupak 5): R, = 1,49 min; MS (ESIpoz):m/z- 221 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-de): 6 = 10.35 (s, IH). 8.14-8.26 (m. 2H). 8.07 (s. IH). 7.07 (s, IH), 4.76 (s, 2H), 3.58 (q. 2H). 1.20 (t, 3H) ppm.

Intermedijer 16A

4-amino-5-bromo-6-(etoksimetil)pirolo|2,l-f||l,2,4jtriazin-7-karbaldehid

|01521

[0153]U rastvor 73 g (0,33 mol) Intermedijera 15A u 1.9 L DMF kapajući se doda rastvor 65 g (0,37 mol) NBS u 200 ml DMF pri -15°C. Smeša se ostavi da se zagreje na 0°C i meša tokom 3 h pri ovoj temperaturi. Reakciona smeša se izlije u 2% vod. rastvor natrijum tiosulfata uz mešanje, te se talog ođfiltrira, ispere sa vodom i osuši preko fosfornog pentoksidain vacuo.

Prinos: 85,6 g (86% od teor.)

LC-MS (postupak 2): R, = 0,76 min; MS (ESIpoz): m/z = 299/301 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz. DMSO-do): § = 10.36 (s. IH). 8.62 (br. s. 1H), 8.13 (s, IH). 7.22 (br. s.

IH), 4.68 (s, 2H). 3.49 (q, 2H), 1.10 (t. 3H) ppm.

Intermedijer 17A

4-amino-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-f| [1,2,4|-

triazin-7-karbaldehid

[0154|

[0155]Pod atmosferom argona. 714 mg (čistoća 85%. 2.03 mmol) Intermedijera 16A, 946 mg (2,84 mmol) Intermedijera 6A i 160 mg (0.2 mmol) (2'-aminobifenil-2-il)(hloro)paladijum-dicikloheksil(2\4^6'4riizopropilbifenil-2-il)fosfina (1:1: vidi S. L. Buchwald et al., J. Am. Chem. Soc, 132 (40), 14073-14075 (2010)) se suspenzuju u 15,5 ml THF. Zatim se dodaju 15,5 ml degasiranog 0,5 M vod. rastvora kalijum fosfata i smeša se mesa pri 50°C tokom 16 h. Nakon dodavanja vode. smeša se ekstrahira sa etil acetatom, te se kombinovane organske faze osuše preko magnezijum sulfata i upare pod smanjenim pritiskom. Ostatak se prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu (100 g) sa 10-50% etil acetat/cikloheksan kao eluensom.

Prinos: 452 mg (75% čisto prema HPLC. 42% od teor.)

LC-MS (postupak 5): Rt = 2,38 min; MS (ESIpoz): m/z = 397 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-dr,): 5 = 10.50 (s. IH), 8.42 (br. s. IH), 8.21 (s, IH). 7.43 (s.

IH), 7.33 (s. IH), 6.87 (s, IH), 6.07 (br. s, IH), 4.63 (s. 2H). 3.96 (s. 3H), 3.40 (q. 2H). 2.46 (s.3H), 1.02 (t.3H) ppm.

Intermedijer 18A

(4-amino-5,7-dibromopirolo[2,l-f|[l,2,4|triazin-6-il)metanol

[0156]

[0157]Rastvor Intermedijera 8A (5 g, 30,4 mmol) u THF (100 ml) se tretira sa 1.3-dibromo-5.5-dimetilhidantoinom (9,58 g, 33,5 mmol) i meša pri st tokom 2 h. Talog se ođfiltrira i osušiin vacuoda se dobije 6.60 g (64% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt= 0.56 min: MS (ESIpoz): m/z = 321/323/325 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz. DMSO-dfl): 5 = 8.23 (br. s, 1H). 7.96 (s. 1H). 6.94 (br. s. 1H), 5.09 (br. s, IH), 4.43 (s,2H)ppm.

Intermedijer 19A

(4-amino-5-bromopirolo|2,l-f]|l,2,4]triazin-6-il)metanol

[0158]

[0159]Suspenzija Intermedijera 18A (3,7 g. 11,5 mmol) u THF (800 ml) se greje uz mešanje do potpunog rastvaranja. Smeša se zatim ohladi na -78°C i kapajući se doda 1,6 M rastvorn-butillitijuma u heksanima (20 ml. 32,1 mmol). Nakon 5 min. doda se daljnja porcija 1,6 M rastvora n-butillitijuma (1,5 ml, 2,29 mmol). Nastala smeša se meša pri -78°C tokom 5 min, zatim zagasi sa metanolom (5 ml) i zagreje na st. Reakciona smeša se razblaži sa zas. vod. rastvorom amonijum hlorida, zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata, zas. vod. rastvorom natrijum hlorida i etil acetatom. Nakon razdvajanja faza. organski sloj se ispere sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida. Kombinovane vodene faze se ponovo ekstrahiraju sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se ponovo isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida. osuše preko magnezijum sulfata i upare da se dobije 2,87 g sirovog produkta koji se koristi u naknadnim koracima bez daljnjeg prečišćavanja.

LC-MS (postupak 3): R, = 1.73 min; MS (ESIpoz): m/z - 243/245 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.41-7.89 (br. s. IH). 7.82 <s. IH). 7.66 (s, IH). 7.13-6.48 (br. s, IH), 5.11 (t, IH), 4.45 (d. 2H) ppm.

Intermedijer 20A

[4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-f][l,2,4|triazin-6-il]metanol

[0160]

[01611Suspenzija Intermedijera 19A (70% čistoća, 2.52 g. 7.26 mmol). Intermedijera 6A (3.63 g, 10,9 mmol) i cezijum ftuorida (5,51 g, 36,3 mmol) u THF/voda smeši (10: l; 80 ml) se degasira pod argonom. Doda se 4-(di-/f/7-butilfosfino)-A?..V-dimetilanilin-dihloropaladijum (2:1; 176 mg, 0,248 mmol), te se nastala smeša ponovo degasira i meša pri 50°C tokom 16 h.

Reakciona smeša se zatim ispere sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida i organski sloj se razdvoji, osuši preko magnezijum sulfata, profiltruje i upari. Ostatak se suspenzuje u metanolu te se nastala čvrsta supstanca ođfiltrira i osušiin vucuoda se dobije 1,97 g (90% čistoća, 72% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0.85 min; MS (ESIpoz): m/z = 340 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d,,): 5 = 7.91 (s, IH). 7.5-8.1 (br. s. IH). 7.72 (s. IH). 7.35 (s, IH). 7.30 (s, IH). 6.84 (s, IH), 5.5-6.0 (br. s, IH). 5.06 (t, IH), 4.49 (d. 2H). 3.95 (s. 3H), 2.45 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 21A

6-(metoksimetiI)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)pirolo[2,l-f|[I,2,4|triazin-4-amin

[0162]

(0163]Rastvor Intermedijera 20A (400 mg, 1,17 mmol) u dihlorometanu (12 ml) se tretira sa tionil hloridom (128 ul, 1,76 mmol) i meša pri st tokom 15 min. Nakon evaporisanja. ostatak se rastvori u metanolu (12 ml) i tretira sa DIPEA (409 ul. 2,35 mmol). Smeša se reiluksuje preko noći i zatim ponovo upari. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/metanol 98:2 —> 95:5) dobije se 388 mg (93% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): R, = 1.00 min; MS (ESIpoz): m/z = 355 (M+Hf 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 7.93 (s, IH). 7.82 (s, IH). 7.35 (s, IH). 7.31 (s. IH), 6.84 (s, IH). 4.38 (s, 2H), 3.95 (s. 3H), 3.22 (s, 3H), 2.45 (s, 3H) ppm.Intermedijer 22A6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metiI-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-f|[l,2,4|triazin-4-amin [0164| [0165jIntermedijer 20A (200 mg, 587 p.mol) u dihlorometanu (5 ml) se tretira sa tionil hloridom (64 \ x\. 881 umol) i meša pri st tokom 15 min. Nakon evaporisanja. ostatak se refluksuje u etanoiu (5 ml) tokom 1 h, zatim tretira sa DIPEA (204 ul. 1,17 mmol) i ponovo refluksuje preko noći. Reakciona smeša se upari i sirovi produkt se prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/metanol 98:2 —>■ 95:5) čime se dobije 202 mg (90% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 5): Rt= 2,32 min; MS (ESIpoz): m/z = 369 (M+H)<+>'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 8.31-7.59 (br. s. IH), 7.93 (s, IH). 7.81 (s. IH), 7.35 (s, IH), 7.30 (s, IH), 6.84 (s, IH), 6.20-5.50 (br. s, IH). 4.41 (s. 2H). 3.95 (s. 3H). 3.41 (q, 2H). 2.45 (s,3H). 1.08 (t, 3H) ppm.Intermedijer 23Afer/-butil 4-{|4-amino-6-(hidroksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo-[2,l-f|[l,2,4|triazin-7-il|metil}piperazin-l-karboksiIat 10166]

[0167]Rastvor Intermedijera 20A (9,5 g, 27,9 mmol) u sirćetnoj kiselini (136,8 ml) se tretira satert- bu\\\piperazin-l-karboksilatom (6.24 g, 33.49 mmol) i 37% vod. rastvorom formaldehida (2,5 ml, 33.49 mmol). Smeša se meša pri 60°C tokom 2.5 h. Nakon evaporisanja, ostatak se rastvori u etil acetatu i smeša se ispere dvaput sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata. osuši preko natrijum sulfata i upari. Ostatak se triturira u kipućem etanolu (100 ml). Čvrsta supstanca se ođfiltrira te ispere sa etanolom i dietiletrom čime se dobije 9,70 g (58% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,88 min; MS (ESIpoz): m/z = 539 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, CDCb): 8 = 7.94 (s. IH), 7.13-7.35 (m, 2H. preklapanje sa CHCb vrhom), 6.67 (s, IH), 5.86 (br. s. IH), 5.54 (br. s, 2H), 4.68 (s. 2H). 4.08 (s, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.45 (br. s. 4H), 2.59-2.48 (m. 7H), 1.45 (s, 9H) ppm.

intermedijer 24A

tert- butil4-({4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-6-|(2-metoksi-2-

oksoetoksi)-metil]pirolo|2,l-f][l,2,4]triazin-7-il}metil)piperazin-l-karboksilat

[0168]

[0169]Rastvor Intermedijera 23A (300 mg, 556 umol) u dihlorometanu (12 ml) se tretira sa tionil hloridom (81 ul, LI1 mmol) i meša pri st tokom 15 min. Nakon evaporisanja. ostatak se rastvori u sveže destilovanom metilglikolatu (2,5 ml) i tretira sa DIPEA (485 ul. 2.78 mmol). Smeša se meša pri 70°C tokom 2 h, zatim ponovo upari i višak metilglikolata se ukloni destilovanjem. Prečišćavanjem ostatka kolonskom hromatografijom na silikagelu (cikloheksan/etil acetat 1:5) dobije se 136 mg (33% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt = 0,88 min; MS (ESIpoz): m/z = 611 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 7.99 (s. IH), 7.39 (s, IH). 7.31 (s, IH). 6.85 (s. IH). 4.58 (s, 2H). 4.11 (s, 2H). 3.96 (s. 3H). 3.93 (s. 2H). 3.57 (s. 3H), 3.30-3.24 (m, 4H). 2.45-2.38 (m, 7H), 1.39 (s, 9H) ppm.

Intermedijer 25A

fer/-butil 4-{(4-amino-6-formil-5-(7-metoksi-5-metiI-l-benzotiofen-2-il)piroIo|2,l-f][l,2,4]-triazin-7-iI]metil}piperazin-l-karboksiIat

(01701

|0171]Rastvor Intermedijera 23A (300 mg, 556 p.mol) u dihlorometanu (4,2 ml) se tretira sa Des-Martinovim perjodinanom (l,l,l-triacetoksi-l.l-dihidro-l,2-benzjodoksol-3(l//)-on; 307 mg, 724 umol) i meša pri st tokom 2 h. Reakciona smeša se zagasi sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i zas. vod. rastvorom natrijum tiosulfata (1:1) te meša pri st tokom 30 min. Vodeni sloj se ekstrahira tri puta sa dihlorometanom, te se kombinovani organski slojevi osuše preko magnezijum sulfata i upare. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (cikloheksan/etil acetat 1:1 —► 100% etil acetat) dobije se 273 mg (87% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,87 min; MS (ESIpoz): m/z = 537 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-dfl): 8 = 10.02 (s. IH). 8.44-8.1 8 (br. s, IH). 8.08 (s. IH). 7.51 (s, IH). 7.32 (s, IH), 6.88 (s, IH), 6.01-5.74 (br. s. 1 H), 4.16 (s, 2H). 3.96 (s, 3H), 3.30-3.22 (m, 4H), 2.48-2.40 (m, 7H), 1.38 (s, 9H) ppm.

Intermedijer 26A

4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo|2,l-fj-(l,2,4]triazin-6-karbaldehid bis(formijat)

101721

|0173|Rastvor Intermedijera 23A (80 mg, 148 umol) u THF (3,9 ml) se tretira sa Des-Martinovim perjodinanom (l,l.l-triacetoksi-I,l-đihidro-l,2-benzjođoksoI-3(l//)-on; 94 mg, 222 umol) i meša pri st tokom 30 min. Reakciona smeša se zagasi sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i zas. vod. rastvorom natrijum tiosulfata (1:1). Vodeni sloj se ekstrahira tri puta sa etil acetatom i kombinovani organski slojevi se osuše preko magnezijum sulfata i upare. Ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1.4-đioksanu (4 ml) i meša pri st tokom 1 h. Nakon evaporisanja, ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8, gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) čime se dobije 34 mg (52% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2); R, = 0.78 min; MS (ESIpoz); m/z = 437 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz. DMSO-d(>): 6 = 10.02 (s. IH). 8.29 (br. s. 2H). 8.09 (s. IH), 7.50 (s.

IH), 7.33 (s, IH), 6.88 (s, IH), 4.17 (s, 2H), 3.96 (s. 3H). 2.90-2.81 (m.4H). 2.63-2.56 (m, 4H). 2.46 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 27A

terl-butil 4-({4-amino-5-(7-metoksi-5-metiI-l-benzotiofen-2-il)-6-|(3-oksopiperazin-l-iI)-metil|pirolo|2,l-f|[l,2,4|triazin-7-il}metil)piperazin-l-karboksilat

[01741

[0175]Rastvor Intermedijera 25A (185 mg, 344^mol) u THF (4.6 ml) se tretira sa 2-oksopiperazinom (344 mg, 3,4 mmol), natrijum triacetoksiborohidridom (365 mg, 1,7 mmol) i sirćetnom kiselinom (39 ul, 689 jamol). Nastala smeša se meša pri st tokom 2 h, zatim adsorbuje na dijatomejsku zemlju i prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan —» dihlorometan/metanol 100:8) Čime se dobije 221 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 0,77 min; MS (ESIpoz): mz - 621 (M+Hf.

Intermedijer 28A

AZ-etiletanaminijum 4-amino-7-{[4-(^r/-butoksikarbonil)piperazin-l-il]karbonil}-5-(7-

metoksi-5-metil-l-benzotiofcn-2-il)piroio[2,]-f)[l,2,4Jtriazin-6-karboksilat

[0176]

[0177|Rastvor Intermedijera 25A (70 mg, 130 umol) u THF/voda (10:1. 4.85 ml) se tretira sa 2 M rastvorom 2-metil-2-butena u THF (521 ul. 1.04 mmol) i natrijum dihidrogenfosfata

(107 mg, 783 umol) te meša pri st tokom 5 min. Doda se natrijum hlorit (70 mg, 783 umol) i nastala smeša se meša pri st preko noći. Nakon razblaženja sa vodom, vodena faza se ekstrahira tri puta sa etil acetatom. Kombinovani organski slojevi se osuše preko natrijum sulfata i upare, te se ostatak prečisti preparativnom RP-HPLC (XBridge Cl8. gradijent 5-50% acetonitril/voda + 0,05% dietilamin) čime se dobije 18 mg (21% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 1): R, = 1,14 min: MS (ESIpoz): m/z = 567 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-dft):inter al.5 = 8.26-7.89 (br. s, IH), 7.94 (s. IH). 7.33 (s. IH), 7.28 (s, IH). 6.83 (s, IH), 5.64-5.33 (br. s. IH), 3.95 (s. 311). 2.80 (q. 4H). 2.45 (s, 3H). 1.40 (s. 9H), 1.09 (t, 6H)ppm.

Intermedijer29A

tert- butil4-{[4-amino-6-(azidometil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo-[2,I-f][l,2,4|triazin-7-il]metil}piperazin-l-karboksilat

|0178)

|0179jRastvor Intermedijera 23A (150 mg, 0,278 mmol) u dihlorometanu (7.5 ml) se tretira sa tionil hloridom (40 ul, 0,56 mmol) i meša pri st tokom 15 min. Nakon evaporisanja. ostatak se rastvori u DMF (6 ml) te tretira sa natrijum azidom (362 mg, 5,57 mmol) i natrijum jodidom (208 mg, 1.39 mmol). Smeša se zagrejava do 80°C tokom 1 h, zatim razblaži sa vodom i ekstrahira tri puta sa etil acetatom. Kombinovani organski slojevi se isperu sa vodom i sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, osuše preko magnezijum sulfata i upare. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (cikloheksan/etil acetat 98:2 —> 100% etil acetat) dobije se 95,8 mg (57% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): Rt= 0.99 min; MS (ESIpoz): m/z = 564 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 8.20-7.80 (br. s, IH). 8.01 (s. IH), 7.39 (s. IH). 7.33 (s, IH), 6.86 (s. IH), 6.05-5.55 (br. s. IH). 4.50 (s. 211), 3.96 (s. 3H), 3.94 (s. 2H). 3.32-3.25 (m, 4H). 2.45 (s. 3H), 2.43-2.36 (m. 4H), 1.39 (s. 9H) ppm.

Intermedijer 30A

tert- butil 4-{[6-(acetamidometil)-4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo-

|2,l-fj[l,2,4]triazin-7-il]metil}piperazin-l-karboksilat

|0180j

[01811Smeša Intermedijera 29A (320 mg. 567 umoi), 10% Pd/C (320 mg) i anhidrida sirćetne kiseline (106 (il. 1,13 mmol) u metanolu (32 ml) se meša tokom 90 min pod 1 atm vodonika pri st. Smeša se zatim profiltruje kroz dijatomejsku zemlju i filtrat se upari. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (cikloheksan/etil acetat 1:1 — > 100% etil acetat) dobije se 440 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0.91 min; MS (ESIpoz): m/z - 580 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 8.02-7.97 (m. 2H), 7.38 (s. IH). 7.31 (s. IH). 6.85 (s, IH). 4.27 (br. d, 2H). 3.95 (s. 3H). 3.89 (s. 2H). 3.31-3.24 (m. 4H). 2.45 (s. 3H). 2.43-2.36 (m, 4H), 1.74 (s, 3H), 1.39 (s, 9H) ppm.

Intermedijer 31A

7-[(4-acetilpiperazin-l-iI)metiIj-4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo-I2,l-fJ[l,2,41triazin-6-karbaldehid

[0182]

[0183]Rastvor Primera 55 (678 mg, čistoća 89%, 1,26 mmol) u dihlorometanu (4 ml) koji sadrži molekulska sita (4A) se tretira sa Des-Martinovim perjodinanom (1,1,1-triacetoksi- l.l-dihidro-l,2-benzjodoksol-3(l//)-on: 623 mg, 1,47 mmol) i meša pri st tokom 5 min. Reakciona smeša se zatim ađsorbuje na dijatomejsku zemlju i prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu (gradijent 30-100% etil acetat/cikloheksan, zatim 0-10% metanol/dihlorometan) čime se dobije 449 mg (49% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 0,70 min; MS (ESIpoz): m/z = 479 (M+H)<+>.

Intermedijer 32A

4-{[4-amino-6-(azidometiI)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-f][l,2,4|-

triazin-7-il] metil} piperazin-2-on

[0184] J0185|Rastvor Primera 13 (59 mg. 130 umol) u dihlorometanu (3,5 ml) se tretira sa tionil hloridom (19 ul, 261 umol) i meša pri st tokom 15 min. Nakon evaporisanja. ostatak se rastvori u DMF (2,8 ml) te tretira sa natrijum jodidom (97 mg, 652 umol) i natrijum azidom (169 mg, 2,6 mmol). Smeša se meša pri 80°C tokom 1 h. Nakon razblaženja sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, vodena faza se ekstrahira četiri puta sa etil acetatom, te se kombinovani organski slojevi osuše preko magnezijum sulfata i upare. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/metanol 98:2— >90:10) dobije se 35 mg (56% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 5): R, = 2,04 min; MS (ESIpoz): m/z = 478 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-de): 5 = 8.02 (s. IH). 7.75 (br. s, IH), 7.41 (s, IH), 7.33 (s, IH). 6.86 (s. IH), 4.51 (s, 2H), 4.01 (s, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.16-3.08 (m, 2H), 3.04-2.98 (m. 2H). 2.65-2.58 (m. 2H), 2.45 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 33 A

4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(morfolin-4-ilmetil)pirolo[2,l-fj-[ 1,2,41 triazin-6-karbaIdeh id

[0186]

[0187]Rastvor Primera 50 (710 mg, čistoća 70%, 1.13 mmol) u dihlorometanu (5 ml) koji sadrži molekulska sita (4A) se tretira sa Des-Martinovim perjodinanom (1,1.1-triacetoksi-1.1-đihidro-1,2-benzjodoksoI-3(l//)-on; 623 mg. 1.47 mmol) i meša pri st tokom 5 min. Reakciona smeša se zatim ađsorbuje na dijatomejsku zemlju i prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu (gradijent 30-100% etil acetat/cikloheksan) čime se dobije 386 mg (72% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,76 min; MS (ESIpoz): m/z = 438 (M+Hf.

Intermedijer 34A

(4-amino-7-bromopirolo[2,l-f] [l,2,4|triazin-6-il)metanol

(0188|

[0189]Rastvor 1,3-dibromo-5,5-dimefilhidantoina (87 mg. 0.305 mmol) u THF (1 ml) se doda kapajući u rastvor Intermedijera 8A (100 mg, 0.609 mmol) u THF (4 ml) i metanolu (2 ml) pri -78°C. Smeša se meša pri -78°C tokom 16 h. zatim razblaži sa vodom i ekstrahira sa etil acetatom. Kombinovani organski slojevi se isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, osuše preko magnezijum sulfata i upare. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan</>metanol 20:1 — 10:1) dobije se 55 mg (32% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 3): Rt = 1,71 min; MS (ESIpoz): m/z = 243/245 (M+H)<+>

1 H-NMR (400 MHz, DMSO-đf,): 8 = 7.74-7.94 (m, 3H). 7.04 (s. IH), 5.12 (t. IH), 4.48 (d, 2H) ppm.

Intermedijer 35 A

7-bromo-6-({[fer/-butiI(dimetiI)silil[oksi}metil)piroIo[2,l-f|[l,2,4]triazin-4-amin

[0190|

[0191]Rastvor Intermedijera 34A (885 mg, 3.64 mmol) u DMF (11 ml) se tretira salerf-butildimetilsilil hloridom (823 mg, 5,46 mmol) i imidazolom (743 mg, 10.92 mmol). te meša pri st tokom 2 h. Reakciona smeša se kombinuje sa reakcionom smešom od 100 mg testnog izvođenja, razblaži sa vodom i ekstrahira dvaput sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se isperu sa vodom i zas. vod. rastvorom natrijum hlorida. osuše preko magnezijum sulfata i upare. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (cikioheksati'etil acetat 2:1 —» 100% etil acetat) dobije se 1.36 g (93% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): R, = 1,13 min: MS (ESIpoz):m/z= 357/359 (M+H)<+>'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 7.98-7.68 (m, 3H). 7.04 (s. IH), 4.68 (s, 2H). 0.89 (s. 9H), 0.09 (s, 6H) ppm.

Intermedijer 36A

4-amino-6-({|/^/-/-butil{dimetil)silil|oksi}metil)pirolo|2,l-f||l,2,4]triazin-7-karbonitril

[0192J

|0193]Pod argonom, smeša Intermedijera 35A (880 mg, 2,46 mmol), [U'-bis(difenilfosfino)-ferocen]dihloropaladijum(II)-dihlorometan kompleksa [PdCb(dppf) x DCM] (120 mg, 0,148 mmol), bis(dibenzilidenaceton)paladijuma |Pd(dba);| (135 mg, 0.148 mmol). cink cijanida (578 mg, 4.92 mmol). cinka u prahu (64 mg, 0.985 mmol) i cink acetata (180 mg, 0.985 mmol) u degasiranom DMF/voda (100:1. 9.2 ml) se meša pri 160°C preko noći. Reakciona smeša se zatim kombinuje sa reakcionom smešom od 100 mg testnog izvođenja i kombinovane smeše se adsorbuju na dijatomejsku zemlju, profiltruju preko još jednog sloja dijatomejske zemlje i eluišu sater/-butilmetil etrom. Filtrat se ispere sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i vodeni sloj se ponovo ekstrahira tri puta sa/t7'/-butilmetil etrom. Kombinovane organske faze se osuše preko natrijum sulfata i upare. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (cikloheksan/etil acetat 1:1) dobije se 453 mg (44% od teor.) jedinjenja iz naslova,

LC-MS (postupak 2): R, = 1,09 min; MS (ESIpoz): m/z = 304 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 8.22-8.35 (m, 2H). 8.06 (s. IH). 6.95 (s. 1H). 4.83 (s. 2H), 0.91 (s, 9H), 0.11 (s. 6H) ppm.

Intermedijer37A

4-amino-5-bromo-6-({[/*?/-/-butil(dimetiI)silil|oksi}metiI)pirolo|2,l-f][l,2,4]triazin-7-

karbonitril

|0194|

|0195jRastvor 1.3-đibromo-5.5-dimetilhidantoina {621 mg. 2.17 mmol) u THF {20 ml) se doda kapajući u rastvor Intermedijera 36A (1,1 g, 3,62 mmol) u THF (80 ml) pri -50°C. Nastala smeša se polako zagreje na st, meša tokom 2 h te zatim zagasi sa 10% vod. rastvorom natrijum tiosulfata i zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata. Vodena faza se ekstrahira tri puta sa etil acetatom. Čvrsta supstanca koja taloži iz etil acetatnog rastvora se ođfiltrira i ispere sa etil acetatom, čime se dobije 508 mg (100% čistoća. 36% od teor.) kao prvi prinos jedinjenja iz naslova. Preostali filtrat se osuši preko natrijum sulfata i upari. Ostatak se istaloži iz DMSO te ispere sa DMSO i etil acetatom čime se dobije daljnjih 498 mg (85% čistoća, 26% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 5): R, = 2.70 min; MS (ESIpoz):m/z =382/384 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 6 = 8.10 (s. IH). 4.76 (s. 2H), 0.90 (s. 9H). 0.12 (s. 6H) ppm.

Intermedijer 38A

4-amino-6-({[^r/-butil(dimetil)sililjoksi}metiI)-5-(7-metoksi-5-metiI-l-benzotiofen-2-il)-pirolo [2,l-f][l,2,4jtriazin-7-karbonitril

|0196j

[0197)Pod argonom, rastvor Intermedijera 37A (459 mg, 1.29 mmol) u degasiranom THF (14.8 ml) se doda u (2'-aminobifenil-2-il)(hloro)paladijum-dicikloheksiI(2'.4'.6'-triizopropilbifenil-2-il)-fosfin (1:1; 152 mg, 0.19 mmol; vidi S. L. Buchwald et al.. J. Am.

Chem. Soc. 132 (40), 14073-14075 (2010)) i Intermedijer 6A (647 mg, 1.94 mmol). Degasirani 0,5 M vod. rastvor kalijum fosfata (5,1 ml) se doda kapajući i nastala smeša se meša pri 60°C tokom 2 h. Reakciona smeša se zatim kombinuje sa reakcionim smešama prethodnih 70 mg. 90 mg i 500 mg testnih izvođenja i upari. Prečišćavanjem ostatka kolonskom hromatografijom na silikagelu (cikloheksan/etil acetat 3:1 —► 100% etil acetat) dobije se 1,0 g (58% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R( = 1,49 min; MS (ESIpoz): m/z = 480 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-dfi): 8 = 8.57-8.35 (br. s. IH), 8.18 (s, IH), 7.41 (s. IH), 7.30 (s, IH), 6.86 (s, IH), 6.28-6.03 (br. s, IH), 4.74 (s, 2H), 3.95 (s, 3H). 2.44 (s, 3H). 0.83 (s, 9H). 0.00 (s. 6H) ppm.

Intermedijer 39A

4-amino-6-formil-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)piroIo|2,l-fj|l,2,4|triazin-7-

karbonitril

(0198]

(0199|Rastvor Primera 68 (250 mg, 0,684 mmol) u dihlorometanu (5 ml) se tretira sa Des-Martinovim perjodinanom (1.1,1-triacetoksi-1.1-dihidro-1.2-benzjodokso!-3(l//)-on: 377 mg. 0.889 mmol) i meša pri st tokom 1 h. Reakciona smeša se kombinuje sa reakcionom smešom od 50 mg testnog izvođenja, zagasi sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i zas. vod. rastvorom natrijum tiosulfata (1:1) te meša pri st tokom 30 min. Vodena faza se ekstrahira tri puta sa etil acetatom te se kombinovane organske faze osuše preko natrijum sulfata i upare. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (cikloheksan/25% etil acetat —* 100% etil acetat) dobije se 102 mg (24% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): Rt= 1,02 min; MS (ESIpoz): m/z = 364 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-đ6): 8 = 9.86 (s. IH). 8.78 (br. s. ! H). 8.30 (s, IH). 7.62 (s. IH). 7.36 (s, IH), 6.91 (s, IH), 6.51 (br. s, 1H), 3.97 (s. 3H), 2.46 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 40A

4-amino-6-(azidometil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)piroIo|2,l-f]|l,2,4jtriazin-7-karbonitril

(02001

[0201JRastvor Primera 68 (100 mg. 273 umol) u dihlorometanu (5 ml) se tretira sa tionil hloridom (39 ul, 547 umol) i meša pri st tokom 15 min. Nakon evaporisanja. ostatak se rastvori u DMF (6 ml) te tretira sa natrijum jodidom (205 mg. 1.36 mmol) i natrijum azidom (355 mg, 5,47 mmol). Smeša se meša pri 80°C preko noći, zatim razblaži sa vodom i ekstrahira tri puta sa etil acetatom. Kombinovani organski slojevi se isperu sa vodom, nakon čega sledi zas. vod. rastvor natrijum hlorida, osuše preko natrijum sulfata i upare čime se dobije 91 mg sirovog produkta koji se koristi u sledećem koraku bez daljnjeg prečišćavanja.

LC-MS (postupak 2): R, = 1,13 min; MS (ESIpoz): m/z = 391 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): d = 8.65-8.45 (br. s. IH). 8.23 (s. IH). 7.46 (s. IH). 7.34 (s.

IH). 6.88 (s, IH), 6.41-6.10 (br. s, IH). 4.57 (s. 2H). 3.96 (s. 3H). 2.46 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 41A

5,7-dibromo-6-({[/er/-butil(dimetiI)silil|oksi}metiI)pirolo[2,l-f][l,2,4|triazin-4-amin

[0202)

[0203]Rastvor Intermedijera 18A (2 g, 6.21 mmol) u DMF (20 ml) se tretira sa imidazolom (846 mg, 12,4 mmol) i/er/-butildimetilsilil hloridom (1.12 g, 7.45 mmol) i meša pri st tokom 20 h. Reakciona smeša se zatim razblaži sa vodom (200 ml) i meša pri st tokom daljnjih 2 h. Filtrovanjem čvrste supstance dobije se 2,46 g (88% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 1,37 min; MS (ESIpoz): m/z = 437 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz. DMSO-d6): § = 8.49-8.05 (br. s. IH), 7.96 (s, III). 7.15-6.76 (br. s, IH). 4.64 (s, 2H), 0.87 (s, 9H), 0.09 (s, 6H) ppm.

Intermedijer 42A

2-[4-amino-5-bromo-6-({[/er/-butil(dimetiI)siliI[oksi}metil)pirolo[2,I-f]J1,2,4Jtriazin-7-H]-propan-2-ol

(0204)

(0205)P°d argonom, rastvor Intermedijera 41A (1 g. 2,29 mmol) u THF (40 ml) se ohladi na -78°C i tretira sa 1.6 M rastvorom metillitijuma u dietiletru (1.5 ml, 2.40 mmol). Nakon mešanja tokom 10 min pri -78°C, doda se 1,6 M rastvor n-buti I litijuma u heksanima (1.58 ml. 2,52 mmol) i mešanje se nastavi tokom 10 min. Doda se aceton (1,68 ml, 22.92 mmol) i nastala smeša se polako zagreje na st te meša pri st tokom 18 h. Reakcija se zatim zagasi sa vodom i vodena faza se ekstrahira dvaput sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, osuše preko magnezijum sulfata i upare. Prečišćavanje fleš hromatografijom na silikagelu (cikloheksan/etil acetat 2:1) dobije se 306 mg (30% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 1,39 min; MS (ESIpoz): m/z - 415/417 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-oV,): 5 = 8.23-7.85 (br. s. IH), 7.89 (s. IH), 7.05-6.82 (br. s. IH), 5.49 (s, IH), 4.88 (s, 2H), 1.66 (s, 6H), 0.87 (s, 9H), 0.08 (s. 6H) ppm.

Intermedijer 43A

2-|4-amino-5-bromo-6-(hidroksimetiI)pirolo[2,l-i]|l,2,4|triazin-7-il]propan-2-ol

[0206]

[0207]Rastvor Intermedijera 42A (304 mg, 0,732 mmol) u THF (15 ml) se tretira sa 1 M rastvorom tetra-/?-butilamonijum fluorida u THF (768 ul. 768fimoi) i meša pri st tokom 2 min. Reakciona smeša se razblaži sa acetonitrilom (20 ml), zatim upari i ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-30% acetonitril/0.2% vod. TFA). Produkt tako dobiven se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE, PL-HCO3MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 180 mg (67% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,55 min; MS (ESIpoz): m/z = 301/303 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 6 = 8.21-7.90 (m, IH), 7.87 (s. IH). 7.09-6.60 (br. s. IH), 5.90 (br. s, IH), 5.03 (br. s, IH). 4.63 (s. 2H), 1.66 (s, 6H) ppm.

Intermedijer 44A

4-amino-7-(2-hidroksipropan-2-il)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-f]-[ 1,2,4]triazin-6-karbaldehid

[0208]

[0209]Rastvor Primera 73 (135 mg. Čistoća 89%, 302 umol) u dihlorometanu (7 ml) se tretira sa Des-Martinovim perjodinanom (1,1.1 -triacetoksi- i, 1 -dihidro-1,2-benzjodoksol-3( l//)-on; 166 mg, 392 umol) i meša pri st tokom 70 min. Reakciona smeša se kombinuje sa reakcionom smešom od 18 mg (45 umol) testnog izvođenja te zagasi sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i zas. vod. rastvorom natrijum tiosultata (1:1). Vodena faza se ekstrahira tri puta sa dihlorometanom. Kombinovane organske faze se isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, osuše preko magnezijum sulfata i upare čime se dobije 143 mg (čistoća 77%, 92% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 1,08 min; MS (ESIpoz): m/z = 397 (M+Hf.

intermedijer 45A

6-({[^-butil(dimetiI)silil]oksi}metil)pirolo(2,l-f|[l,2,4]triazin-4-amin

[0210]

[0211]Rastvor 1,5 g (9,14 mmol) Intermedijera 8A u 15 ml suvog DMF se tretira sa 1.65 g (10,96 mmol)/e/V-butildimetilsilil hlorida i 1.24 g (18,27 mmol) imidazola te meša pri st preko noći. Reakciona smeša se izlije u 250 ml vode i meša tokom 5 min. Nastali talog se ođfiltrira i osušiin vacuopri 45°C. Prinos: 2.28 g (90% od teor.).

LC-MS (postupak 5): R, = 2,12 min; MS (ESIpoz): m/z = 279 (M+Hf.

Intermedijer46A 6-({[fcr^butil(dimetil)silil)oksi}metil)-7-hloropirolo|2,l-f|[l,2,4jtriazin-4-amin

[0212]

[0213] Rastvor 2 g (7,18 mmol) Intermedijera 45A u 20 ml THF se tretira sa 893 mg (6,47 mmol) .V-hlorosukcinimida u 6 porcija tokom 60 min pri -10°C. Mešanje se nastavi tokom 15 min pri -10°C, zatim se smeša ostavi da se zagreje na st. Dodaju se dodatnih 192 mg (1,44 mmol) .V-hlorosukcinimida pri st i mešanje se nastavi preko noći. Približno jedna desetina reakcione smeše se upari do suva i ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) čime se dobije 94 mg (4%od teor.) jedinjenja iz naslova. Veći deo reakcione smeše se ađsorbuje na siiikagel i podvrgne hromatografiji na silikagelu sa izoheksan/etil acetat 5-66% kao eluensom. čime se dobije 899 mg (40% od teor.) jedinjenja iz naslova. Ukupni prinos: 993 mg (44% od teor.).

LC-MS (postupak 5): R, = 2,45 min; MS (ESIpoz):m/z= 313 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSCmL.): 8 = 7.69-8.04 (m, 3H), 7.0 (s. IH). 4.70 (s. 2H), 0.88 (s, 9H), 0.08 (s, 6H) ppm.

Intermedijer47A

5-bromo-6-({[/£'rr-butil(dimetil)silil|oksi}metil)-7-hloropirolo|2,l-fJ|l,2,4jtriazin-4-amin

]0214]

[0215]Rastvor 890 mg (2,85 mmol) Intermedijera 46A u 20 ml DMF se tretira sa 506 mg (2.85 mmol)/V-bromosukcinimida u porcijama tokom 1 h pri -10°C. Mešanje se nastavi tokom 3 h pri -I0°C i zatim preko noći pri st. Doda se voda (200 ml) i smeša se meša tokom 2 h. Istaložena čvrsta supstanca se ođfiltrira. ispere sa vodom i osušiin vacuopri 45°C. Prinos: 997 mg (89% od teor.). LC-MS (postupak 5): Rt= 2,82 min: MS (ESIpoz): m/z = 391/393/395 (M+Hf 'H-NMR(400 MHz, DMSO-4): 5 = 8.32 (br. s. IH), 7.97 (s. IH), 6.97 (br. s, IH), 4.66 (s. 2H), 0.87 (s, 9H). 0.09 (s. 6H) ppm.

Intermedijer 48A

6-({|/^-butiI(dimetiI)siIil]oksi}metil)-7-h!oro-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-pi rolo [ 2,1 -fj [ 1,2,4] triazi n-4-am in

I0216|

[0217]Pod atmosferom argona, boca se napuni sa 800 mg (2.04 mmol ) Intermedijera 47A, 680 mg (2,04 mmol) Intermedijera 6A, 80 mg (0,1 mmol) (2'-arninobifenil-2-il)(hloro)-paladijum-dicikloheksil(2',4',6'-triizopropilbifenil-2-iI)fosfina (1:1; vidi S. L. Buchvvald et al.. J. Am. Chem. Soc. 132 (40), 14073-14075 (2010)) i 1.3 g (6,13 mmol) kalijum fosfata. Zatim se dodaju 30 ml degasirane 1,4-dioksan/voda smeše (5:1) i rastvor se meša pri 70°C tokom 1 h. Dodaju se daljnjih 680 mg (2.04 mmol) Intermedijera 6A i 32 mg (0,04 mmol) (2'-amino-bifenil-2-il)(hloro)paladijum-dicikloheksil(2\4',6'-triizopropilbifenil-2-il)fosfina (1:1) i mešanje pri 70°C se nastavi tokom dodatnih 1 h. Ovaj postupak se ponovi tri puta dok se početni materijal ne potroši (kontrola pomoću LC-MS). Sa poslednjom porcijom reagensa, takođe se dodaju 1,6 ml 5 M vod. rastvora natrijum hiđroksida da se postigne pH vrednost od 8-9. Na kraju reakcionog perioda, dodaju se 30 ml vode i 5 M vod. mravlje kiseline (pH 3-4) usled čega se odvoji uljasta supstanca. Deo ove uljaste supstance se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina). Dve frakcije jedinjenja iz naslova se dobiju: 103 mg čvrste supstance (89% čistoća sa LC-MS. 9% od teor.) i 23 mg čvrste supstance (100% čistoća sa LC-MS. 2% od teor.). Ostatak uljaste supstance i supernatant se razblaže sa vodom, podese na pH 8-9 sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i ekstrahiraju tri puta sa dihlorometanom. Kombinovane organske faze se isperu sa vodom, osuše i upare pod smanjenim pritiskom, čime se dobije 2.1 g uljaste supstance. Ovaj materijal se prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu sa dihlorometanom/0-5% metanol kao eluensom da se dobije daljnjih 709 mg (43% čistoća sa LC-MS, 31% od teor.) jedinjenja iz naslova. Ukupni prinos: 42% od teor.

LC-MS (postupak 2): R, = 1,57 min; MS (ESIpoz): m/z = 489 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d*): 8 - 8.08 (s, IH). 7.43 (s. IH). 7.32 (s. IH), 6.88 (s, IH), 4.66 (s, 2H), 3.98 (s, 3H), 2.47 (s, 3H), 0.84 (s. 911). -0.03 (s, 6H) ppm.

Intermedijer 49A

4-amino-7-hloro-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo|2,I-fj[l,2,4]triazin-6-

karbaldehid

10218]

[0219]U suspenziju 166 mg (0,44 mmol) Primera 79 i molekulskih sita (3A) u 3 ml dihlorometana dodaju se 207 mg (0,49 mmol) Des-Martin perjodinana (1.1,1-triacetoksi-l .1 - dihidro-l,2-benzjodoksol-3(l//)-on) pri 0-5°C. Smeša se meša tokom 10 min pri ovoj temperaturi, zatim se dodaju daljnjih 56 mg (0,13 mmol) Des-Martin perjodinana. te se mešanje nastavi tokom 1 5 min pri 5°C i 10 min pri ambijentalnoj temperaturi. Nakon toga, smeša se ađsorbuje na dijatomejsku zemlju i prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu sa dihlorometanom/ 0-10% metanol kao eluensom. Prinos: 100 mg čvrste supstance (92,7% čisto prema LC-MS. 56% od teor.).

LC-MS (postupak 2): Rt = 1.08 min; MS (ESIpoz): m/z = 373 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-dc): 8 = 9.90 (s, IH), 8.46 (br. s. IH), 8.15 (s, IH). 7.54 (s. IH). 7.34 (s. IH). 6.89 (s, IH), 6.07(br. s. IH), 3.96 (s, 3H). 2.46 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 50A7-hloro-6-(hlorometil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo|2,l-f|[l,2,4|-

triazin-4-amin

[0220)

[0221]Jedinjenje iz naslova se izoluje kao nusprodukt u pripremi Primera 79 (vidi ispod). Prinos: 9,2 mg (10% od teor.).

LC-MS (postupak 3): R, = 2,98 min; MS (ESIpoz): m/z = 393/395 (M+H)<+>.

Intermedijer 51A

6-({[/err-butil(dimetil)silil]oksi}metiI)-7-metiIpirolo[2,l-il[l,2,4]triazin-4-amin

[0222]

[0223]U rastvor 3 g (8,4 mmol) Intermedijera 35A u 60 ml 1,4-dioksana pod atmosferom argona dodaju se 171 mg (0,21 mmol) PdChtdppf) x DCM i zatim kapajući tokom 10 min 16,8 ml 2 M rastvora dimetilcinka u toluenu (uzrokujući porast temperature od 22°C do 31 °C). Mešanje se nastavi prvo tokom 10 min pri ambijentalnoj temperaturi, zatim tokom 13 h pri 90°C. Nakon toga, voda (10 ml) se doda u reakcionu smešu pri st i suspenzija se meša tokom 1 h. Smeša se upari pod smanjenim pritiskom, te se ostatak rastvori u vodi i etil acetatu i meša tokom dodatnih 1 h. Talog se ođfiltrira i odbaci, faze se razdvoje i vodeni sloj se ekstrahira dvaput sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se osuše i upare čime se dobije 2,45 g (92% čistoća sa LC-MS. 92% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 5): R, = 2.18 min; MS (ESIpoz): m/z = 293 (M+H)'

'H-NMR (400 MHz, DMSO-đ„): 8 = 7.98-7.78 (m, 3H). 7.04 (s, IH). 4.68 (s. 2H). 0.89 (s. 9H), 0.09 (s. 6H) ppm.

Intermedijer52 A

(4-amino-7-metilpiroloJ2,l-f][l,2,4[triazin-6-il)metanoI

[0224j

Postupak 1:

[0225JU rastvor 100 mg (0,28 mmol) Intermedijera 35A u 2 ml 1,4-dioksana pod atmosferom argona dodaju se 6 mg (0,01 mmol) PdCh(dppf) x DCM i zatim kapajući tokom 10 min 0,56 ml 2 M rastvora dimetilcinka u toluenu. Smeša se meša pri 90°C preko noći, zatim upari, te se ostatak tretira sa acetonitrilom i 5 M vod. mravljom kiselinom. Talog se ođfiltrira, filtrat se upari i ostatak se rastvori u DMSO/acetonitril i prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina). Prinos: 33 mg (66% od teor.).

'H-NMR (400 MHz. DMSO-dh): 8 = 7,79 (s, IH). 7.47 (br. s. 2H), 6.80 (s, IH). 4.84 (t. IH). 4.49 (d, 2H). 2.36 (s, 3H) ppm.

Postupak 2;

[0226]Pod atmosferom argona, mikrotalasni reakcioni sud se napuni sa 750 mg (3.1 mmol) Intermedijera 34A, 515 p.1 (3.7 mmol) trimetilboroksina. 786 mg (3.7 mmol) kalijum fosfata i 73 mg (0,09 mmol) (2'-aminobifenil-2-il)(hloro)paladijum-dicikloheksil(2'.4'.6'-triizopropil-bifenil-2-il)fosfina (1:1; vidi S. L. Buchvvald et al., J. Am. Chem. Soc. 132 (40). 14073-14075

(2010)). Zatim se dodaju 13 ml degasirane 1,4-dioksan/voda smeše (5:1), sud se zatvori i smeša se zagrejavado 140°C tokom 20 min u mikrotalasnoj pećnici (4 bara, 50 vata). Dodaju se daljnjih 50 mg (2'-aminobifenil-2-iI)(hloro)paladijum-dicikloheksil(2'.4'.6'-triizopropilbifenil-2-il)-fosfina (1:1) i smeša se ponovo greje do 140°C tokom 20 min u mikrotalasnoj pećnici. Doda se još jedna porci ja od 515 uJ trimetilboroksina i sud se ponovo greje do 140°C tokom 20 min. Potonji postupak se ponovi još dva puta sa periodima grejanja od 30 min svaki dok LC-MS ne pokaže kako su preostale samo male količine početnog materijala. Smeša se profiltruje preko dijatomejske zemlje, ispere sa 1,4-dioksanom i kombinovani filtrati se upare do suva. Ovaj ostatak se kombinuje sa pređašnjih 100 mg testnog izvođenja i prečisti preparativnom RP-HPLC (XBridge Cl8, gradijent 5-42% acetonitril/0,05% vod. rastvor amonijum hidroksida). Prinos: 238 mg (38% od teor.). LC-MS (postupak 5): R, = 0,51 min; MS (ESIneg): m/z = 177 (M-H)" 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d,.): 8 = 7.79 (s. IH). 7.48 (br. s. 211). 6.80 (s, IH), 4.84 (t, IH). 4.49 (d, 2H). 2.36 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 53A

(4-amino-5-bromo-7-metilpirolo|2,l-f|[l,2,4Jtriazin-6-il)metanol

|0227]

[0228|Rastvor 245 mg (1,38 mmol) Intermedijera 52A u 8,8 ml DMF se tretira sa 288 mg (L62 mmol) A<f->bromosukcinimida u porcijama tokom 2 h pri -10°C. Mešanje se nastavi pri - 10°C tokom 30 min i zatim tokom 2 h pri ambijentalnoj temperaturi. Smeša se izlije u 50 ml vode i ekstrahira sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se osuše i upare. Ostatak se podvrgne fleš hromatografiji na silikagelu sa dihlorometan/0-15% metanoi kao eluensom. Prinos: 148 mg (42% od teor.).

LC-MS (postupak 4): R, = 0,42 min; MS (ESIpoz): m/z = 257/259 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 7.85 (s. IH), 6.14-8.22 (broad, 2H), 4.88 (t, IH). 4.45 (d, 2H). 2.43 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 54A

4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-metiIpiroIo[2,l-f|[l,2,4]triazin-6-

karbaldehid

|0229|

(0230)U suspenziju 175 mg (0,49 mmol) Primera 75 i molekulskih sita (3A) u 3,5 ml dihlorometana dodaju se 230 mg (0,54 mmol) Des-Martin perjodinana (1,1,1-triacetoksi-1.1-dihidro-l,2-benzjodoksoI-3(l//)-on) pri 0-5<c>C. Smeša se meša tokom 5 min pri ovoj temperaturi, nakon čega sledi 30 min pri st. Nakon toga. smeša se ađsorbuje na dijatomejsku zemlju i prečisti fleš hromatografijom na silikagelu sa izoheksan/10-100% etil acetat kao eluensom. Prinos: 139 mg čvrste supstance (79% od teor.).

LC-MS (postupak 5): R, = 2.34 min; MS (ESIpoz): m/z = 353 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d„): 5 = 9.93 (s, IH), 8.06 (s, 1 H). 7.50 (s, 1 H), 7.33 (s, 1 H), 6.88 (s, III), 3.96 (s, 3H), 2.71 (s, 3H). 2.46 (s. 3H) ppm.

Intermedijer 55A

fer/-butil4- [(4-amino-6-metilpirolo ]2J-f](I,2,4|triazin-7-il)metil]piperazin-l-karboksilat

|0231]

J0232]Rastvor 6-metilpirolo[2,l-f][L2,4]triazin-4-amina (500 mg, 3.3 mmol: priprema opisana u PCT int. pat. apl. WO 2007/056170) u sirćetnoj kiselini (8 ml) se tretira sa 37% vod. rastvorom formaldehida (328 jal. 4.04 mmol) i/w/-butilpiperazin-l-karboksilatom (754 mg, 4.04 mmol). Smeša se meša pri 60°C preko noći. Nakon evaporisanja, ostatak se rastvori u etil acetatu i ispere sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata. Vodeni sloj se ekstrahira dvaput sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se osuše preko magnezijum sulfata i upare Čime se dobije 1,2 g sirovog produkta koji se koristi u sledećem koraku bez daljnjeg prečišćavanja.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,56 min; MS (ESIpoz): m/z = 347( M+ H f

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 7.79 (s, IH). 7.51 (br. s. 2H). 6.67 (s. IH). 3.76 (br. s. 2H), 3.29-3.17 (m, 4H). 2.36-2.29 (m, 4H). 2.22 (s, 3H), 1.37 (s, 9H) ppm.

intermedijer 56A

/^r/-butil4-[(4-amino-5-bromo-6-metilpirolo|2,l-f]|l,2,4|triazin-7-il)metiI]piperazin-l-karboksilat

[0233]

[0234]Rastvor Intermedijera 55A (1,17 g, 3,37 mmol) u THF (20 ml) se ohladi na -60°C i

tretira sa l,3-dibromo-5.5-dimetilhidantoinom (5.78 mg, 2,02 mmol). Smeša se meša tokom 4 h pri -60°C do -20°C. Nakon toga, reakciona smeša se zagasi sa 10% vod. rastvorom natrijum tiosulfata. Većina THF rastvarača se upari pri čemu se istaloži čvrsta supstanca. Filtracijom i rekristalisanjem iz acetona dobije se 862 mg (59% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,66 min; MS (ESIpoz): m/z = 425/427 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.29-7.62 (br. s, IH), 7.85 (s, 1H), 7.17-6.44 (br. s, IH). 3.80 (s, 2H), 3.29-3.22 (m, 4H). 2.37-2.27 (m. 4H), 2.16 (s, 3H). 1.37 (s, 9H) ppm.

Intermedijer 57A

ter/-butil 4-{[4-amino-5-(7-metoksi-5-metiI-1-benzotiofen-2-il)-6-metilpirolo (2,1-f](l,2,4|-triazin-7-iI|nietil}piperazin-l-karboksilat

[0235]

[0236JRastvor Intermedijera 56A (100 mg, 235 umol) u degasiranom 1,4-dioksanu (3 ml ) se tretira sa Intermedijerom 6A (93 mg, 282 umol), dicikloheksil(2'.6'-dimetoksibifenil-2-il)fosfinom (S-Phos; 9,6 mg, 23 umol) i paladijum diacetatom (2,6 mg, 11 umol). Doda se degasirani 3 M vod. rastvor kalijum fosfata (588 ul) i nastala smeša se meša pri 60°C tokom 1 h. Doda se daljnja porcija Intermedijera 6A (78 mg, 235 jumol) i mešanje pri 60°C se nastavi preko noći. Reakciona smeša se zagasi sa 2 M vod. rastvorom natrijum hidroksida i vodena faza se ekstrahira sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, osuše preko magnezijum sulfata i upare. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (cikloheksan/etil acetat 3:2) dobije se 82 mg (62% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt= 0,97 min; MS (ESIpoz): m/z = 523 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-dft): 8 = 7.94 (s. IH), 7.34 (s. IH). 7.30 (s, IH). 6.84 (s. IH). 3.95 (s, 3H). 3.84 (s, 2H), 3.30-3.23 (m, 4H. preklapanje sa vrhom vode). 2.45 (s. 3H). 2.42-2.33 (m. 4H), 2.19 (s. 311). 1.39 (s. 9H) ppm.

Intermedijer 58A

tert- butil4-[(4-amino-6-hloropirolo[2,l-f|[l,2,4)triazin-7-il)metil)piperazin-l-karboksilat

102371

[0238jSledeći postupak za Intermedijer 55A, 4 g (23.7 mmol) 6-hloropirolo[2.1-f][l,2,4]triazin-4-amina (priprema opisana u PCT int. pat. apl. WO 2007/064883) reaguju da se dobije 11.2 g jedinjenja iz naslova kao sirovi materijal koji se koristi u sledećem koraku bez daljnjeg prečišćavanja.

LC-MS (postupak 5): R, = 0.74 min; MS (ESIpoz): m/z = 367 (M+H)+

Uzorak od 67 mg odgovarajuće formijat soli, to7-butil 4-[(4-amino-6-hloropirolo|2.1-fj-[1.2,4]triazin-7-il)metil]piperazin-l-karboksilat formijata. se izoluje nakon preparativne RP-HPLC (Reprosil Cl 8, gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) 100 mg sirovog materijala dobijenog iznad.

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d„):inter al.5-8.14 (s, IH), 7.91 (s, IH), 7.83 (br. s. 2H). 6.95 (s, IH), 3.80 (s, 2H). 3.17 (s, 2H), 2.38 (br. s. 4H), 1.37 (s, 9H) ppm.

Intermedijer 59A

terf-butil4-|(4-amino-5-bromo-6-hIoropiroIo[2,l-f|[I,2,4jtriazin-7-iI)metil|piperazin-l-karboksilat

[0239]

[0240]Sledeći postupak za Intermedijer 56A. 11 g (30 mmol) Intermedijera 58A reaguju da se dobije 1.17 g (9% od teor.) jedinjenja iz naslova nakon fleš hromatografije na silikagelu (dihlorometan/metanol 10:1) i naknadne preparativne RP-HPLC (Daizo Cl8, gradijent 40-65% acetonitril/voda).

LC-MS (postupak 2): Ri= 0,74 min; MS (ESIpoz): m/z = 445/447/449 (M+H)"

'H-NMR (400 MHz, DMSO-da):inter al.5 = 7.96 (s. II1), 3.84 (s, 2H). 2.37 (br. s. 4H). 1.37 (s, 9H) ppm.

Intermedijer 60A

/<?r/-butil 4-{[4-amino-6-hloro-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-f] 11,2,4]-triazin-7-il]metiI}piperazin-l-karboksilat

[02411

[0242]Pod atmosferom argona, boca se napuni sa 140 mg (0.31 mmol) Intermedijera 59A. 102 mg (0,46 mmol) Intermedijera 5A. 16 mg (0.02 mmol) PdCh(dppf) x DCM i 122 mg (1,15 mmol) natrijum karbonata. Nakon dodavanja 3 ml degasiranog 1.2-dimetoksietan/voda (3:1), suspenzija se meša pri 60°C tokom 2.5 h. Dodaju se daljnje porcije Intermedijera 5 A (50 mg, 0,23 mmol) i PdCb(dppf) x DCM (8 mg. 0.03 mmol) i mešanje se nastavi pri 40°C tokom 2,5 h. Potonji postupak se ponovi još jednom dok se početni materijal ne potroši. Zatim se reakciona smeša delimično upari pod smanjenim pritiskom, doda se voda i smeša se ekstrahira sa dihlorometanom. Kombinovane organske faze se isperu sa vodom i zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, osuše i upare pod smanjenim pritiskom. Ostatak (322 mg) se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina) da se dobije 49 mg smeše jedinjenja iz naslova i Boc-deprotektovanog derivata, 6-hloro-5-(7-metoksi-5-metil-l-bcnzotiofcn-2-il)-7-(pipcrazin-1 -ilmetil)pirolo[2.1 - f][l ,2,4]triazin-4-amina. Ova smeša se koristi kao takva u sledećem reakcionom koraku (vidi Primer 85). LC-MS (postupak 2): Rt- 1,00 min: MS (ESIpoz): m/z = 543 (M+H)<+>i R, = 0,81 min: MS (ESI-pos): m/z = 443 (M+H)<+>.

Intermedijer 61A

4- {[4-amino-6-(metoksimetiI)pirolo[2,l-f|[l,2,4]triazin-7-il|metil}piperazin-2-on

10243]

|0244)Rastvor Intermedijera 10A (5 g, 28.1 mmol) i piperazin-2-ona (3.09 g, 30.9 mmol) u sirćetnoj kiselini (85 ml) se tretira sa 37% vod. rastvorom fotrnaldehida (3.15 ml. 42.1 mmol) i meša pri 60°C tokom 16 h. Isparljive supstance se upare pod smanjenim pritiskom, te se ostatak rastvori u metanolu i ađsorbuje na dijatomejsku zemlju. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (5-10% metanol/dihlorometan) dobije se 3,91 g (46% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 3): Rt = 1,68 min; MS (ESIpoz): m/z = 291 (M+Hf.

intermedijer 62A

4-{|4-amino-5-bromo-6-(metoksimetil)pirolo|2,l-f|[l,2,4]triazin-7-il|metil}piperazin-2-

on

[0245)

|0246)Rastvor Intermedijera 61A (3.9 g. 13,4 mmol) u DMF (50 ml) se ohladi na 0°C i tretira sa rastvorom A'-bromosukcinimida (2.63 g. 14.8 mmol) u DMF (6 ml). Smeša se meša pri 0°C tokom 1 h. Zatim se rastvarač upari, te se ostatak rastvori u metanolu i ađsorbuje na dijatomejsku zemlju. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (5-10% metanol/dihlorometan) dobije se 1.99 g (39% od teor. ) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 3): R, = 1.86 min; MS (ESIpoz): m/z = 369/371 (M+Hf

'H-NMR(400 MHz, DMSO-d6): 6 = 7.96-8.23 (br. s. IH), 7.90 (s. IH). 7.71 (s. IH). 6.72-6.98 (br. s, IH), 4.45 (s. 2H), 3.91 (s, 2H), 3.27 (s. 3H). 3.07 (br. s. 2H), 2.96 (s. 2H). 2.56 (br. s, 2H) ppm.

Intermedijer 63A

7-(hlorometil)-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-f|-[l,2,4]triazin-4-amin hidrohlorid

[0247]

[0248]Suspenzija Primera 86 (1 g, 2,51 mmol) u toluenu (60 ml) se tretira kapajući sa tionil hloridom (1,83 ml, 25,1 mmol) i smeša se meša pri st preko noći. Isparljive supstance se upare pod smanjenim pritiskom. Ostatak se tri puta upari zajedno sa toluenom pod smanjenim pritiskom čime se dobije 0,85 g (74% od teor.) jedinjenja iz naslova koje se koristi neposredno za sledeći korak bez daljnjeg prečišćavanja.

Intermedijer 64A

4-amino-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-1 -benzotiofen-2-il)pirolo12,1 -f][1,2,4]-triazin-7-karboksilna kiselina

|0249]

(0250]Suspenzija Intermedijera 17A (5 g, 12,6 mmol) u THF/voda (10:1, 220 ml) se tretira sa 2 M rastvorom 2-metil-2-butena u THF (31,5 ml, 63,1 mmol) i sa natrijum dihiđrogenfosfatom (6,96 g, 50.4 mmol). Smeša se meša pri st tokom 5 min. Zatim se doda natrijum hlorit (4.56 g?50,44 mmol) i nastala smeša se meša pri st tokom 20 h. Suspenzija se profiltruje i nastala čvrsta supstanca se ispere sa vodom čime se dobije 4.24 g (74% od teor.) jedinjenja iz naslova koji se koristi u sledećem koraku bez daljnjeg prečišćavanja.

LC-MS (postupak 4): R, = 1.06 min; MS (BSIpoz): m/z = 413 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 13.22 (br. s, IH). 8.53-8.00 (br. s. IH). 8.14 (s. IH), 7.41 (s, IH), 7.33 (s, IH), 6.86 (s, IH), 6.28-5.65 (br. s. 1H). 4.61 (s. 2H), 3.96 (s. 3H). 3.36 (q, 2H), 2.46 (s, 3H). 1.01 (t. 3H) ppm.

Intermedijer 65A

5,7-dimetoksi-1 -benzotiofen

|0251|

[0252]U rastvor l-benzotiofen-5,7-dio!a (1.16 g, 6,98 mmol) u acetonu (20 ml) pod argonom dodaju se kalijum karbonat (2,89 g, 20,9 mmol) i jodometan (912 ul, 14.6 mmol). Nastala smeša se meša pod refluksom tokom 18 h. Nakon hlađenja na st, smeša se tretira sa 7 M rastvorom amonijaka u metanolu (10 ml) tokom 30 min i zatim ađsorbuje na silikagel. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (cikloheksan/etil acetat 40:1) dobije se 0,52 g (32% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 1,02 min; MS (ESIpoz): m/z = 195 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMS0-d6): 5 = 7.69 (d. IH), 7.35 (d, IH), 7.02 (d, IH), 6.57 (d, IH). 3.92 (s, 3H), 3.81 (s, 3H) ppm.

Intermedijer 66A

(5,7-dimetoksi-l -benzotiofen-2-il)boronska kiselina

[0253]

[0254]Pod atmosferom argona. 1,6 M rastvor n-butillitijuma u heksanu (1,84 ml. 2,95 mmol) se doda kapajući u rastvor Intermedijera 65A (520 mg, 2,68 mmol) u suvom THF (5 ml) pri - 70°C. Nakon 1 h pri -70°C, doda se triizopropil borat (742 ul. 3.21 mmol) i smeša se meša tokom 16 h dok se polako zagrejava na st. Dodaju se dihlorometan i zas. vod. rastvor amonijum hlorida, te se pH vrednost podesi na 6 dodavanjem 1 M hlorovodonične kiseline. Organska faza se razdvoji i vodena faza se ekstrahira sa dihlorometanom. Kombinovane organske faze se osuše sa magnezijum sulfatom, profiltruju i upare. Nastali ostatak se prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu (prvo eluiranjem sa dihlorometan/metanol 40:1. zatim metanolom, na kraju metanol/4 M hlorovodonik u 1,4-dioksanu 10:1) čime se dobije 631 mg (71% čistoća, 71% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): Rt= 0,83 min; MS (ESIpoz): m/z = 239 (M+Hf.

Intermedijer 67A

4-amino-6-(hlorometil)pirolo [2,1-f] [l,2,4]triazin-7-karbaIdehid

[0255J

[0256]Intermedijer 67A se izoluje kao nusprodukt sinteze Intermedijera 11A nakon kolonske hromatografije na silikagelu (dihlorometan/aceton 8:2 —> 7:3).

LC-MS (postupak 2): Rt= 0.6 min; MS (ESIpoz): m/z = 211/213 (M+Hf.

Intermedijer 68A

4-amino-6-[(3-oksopiperazin-l-il)metil|pirolo(2,l-f]|l,2,4|triazin-7-karbaldehid

|0257|

[0258] Rastvor Intermedijera 67A (11,03 g, 52.4 mmol) i 2-oksopiperazina (6.82 g. 68,1 mmol) u 331 ml DMF se tretira pri st sa DIPEA (13,7 ml. 78,6 mmol) i meša preko noći. Talog se ođfiltrira, ispere sa DMF i dietiletrom, te zatim osušiin vacuoda se dobije 11.64 g jedinjenja iz naslova (89% čistoća, 72% od teor.).

LC-MS (postupak 7): R, = 1,30 min; MS (ESIpoz): m/z = 275 (M<+>Hf.

Intermedijer 69A

4-{[4-amino-7-(hidroksimetiI)pirolo[2,l-fj[l,2,4)triazin-6-il]metil}piperazin-2-on [0259J

[0260]U rastvor Intermedijera 68A (10.17 g, 89% čistoća. 33.01 mmol) u 1 M hloro vod oničnoj kiselini (370 ml) i metanolu (370 ml) pri st se doda cink u prahu (12,1 g, 185 mmol), te se smeša meša pri st tokom 18 h. Doda se silikagel (100 g) i isparljive supstance se upare pod smanjenim pritiskom. Ostatak se suspenzuje u metanolu. isparljive supstance se ponovo upare pod smanjenim pritiskom i ostatak se osušiin vacuo.Čvrsta supstanca se podvrgne kolonskoj hromatografij i na silikagelu (gradijent đihlorometan/7 M amonijak u metanolu 10:1 —»-3:1) da se dobije 6.39 g jedinjenja iz naslova (60% od teor.). LC-MS (postupak 8): Rt = 1,12 min; MS (ESIpoz): m/z = 277 (M+Hf 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 6 = 7.83 (s. IH). 7.76 (br. s, IH), 7.64 (br. s. 2H). 6.83 (s. IH), 5.01 (br. s. IH), 4.74 (s, 2H), 3.64 (br. s. 2H). 3.14 (br. s. 2H). 2.95 (br. s, 2H). 2.58 (br. s, 2H) ppm.

Intermedijer 70A

4-{[4-amino-5-bromo-7-(hidroksimetil)pirolo[2,l-f)[l,2,4]triazin-6-iljmetil}piperazin-2-

on trifluoroacetat

|0261|

[0262|Suspenzija Intermedijera 69A (1 g) u metanol/voda (10:1. 33 ml) se tretira sa

trifluorosirćetnom kiselinom (0,56 ml, 7,24 mmol) da rezultuje bistrim rastvorom. Rastvor A-bromosukcinimida (708 mg, 3,98 mmol) u metanolu (30 ml) se doda kapajući pri 0°C i smeša se meša pri 0°C tokom 1 h. Formirani talog se ođfiltrira i osušiin vacuoda se dobije 700 mg jedinjenja iz naslova (41% od teor.).

LC-MS (postupak 7): R, = 1.38 min; MS (ESIpoz): m/z = 355/357 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, D20): 8 = 7.90 (s, IH). 5.00 (s. 211). 4.44 (s. 211). 3.85 (s. 2H), 3.58 (br. t, 2H), 3.50 (br. t, 2H) ppm.

Priprema Primera:

Primer 1

4-{(4-amino-6-(metoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metiI-l-benzotiofen-2-il)piroIo|2,l-f|-[l,2,4]triazin-7-ilJmetiI}piperazin-2-on

[0263]

Postupak 1:

[0264)Rastvor Intermedijera 13A (3 g. 7,84 mmol) u metanolu (87 ml) se tretira sa sirćetnom kiselinom (0,898 ml, 15.68 mmol), 2-oksopiperazinom (1,17 g, 11.76 mmol) i natrijum triacetoksiborohiđridom (4,98 g, 23,53 mmol). Smeša se meša pri st tokom 4,5 h. Dodaju se daljnje porcije 2-oksopiperazina (392 mg, 3,9 mmol) i natrijum triacetoksiborohidrida (3,3 g. 15,68 mmol), te se nastala smeša meša pri 60°C preko noći. Nakon evaporisanja, ostatak se rastvori u zas. vod. rastvoru natrijum hidrogenkarbonata i ekstrahira sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se osuše preko natrijum sulfata i upare, te se ostatak prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/metanol 40:1 —* 10:1). Produkt tako dobiven se triturira u metanolu i ođfiltrira čime se dobije 540 mg (14% od teor.) jedinjenja iz naslova. Metanolna matična tečnost se upari i ostatak prečisti dvostrukom RP-HPLC (Reprosil Cl 8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1 % vod. mravlja kiselina). Frakcije koje sadrže čisti produkt se kombinuju i neutrališu sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata. Acetonitrilni rastvarač se upari i vodena faza se ekstrahira sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se osuše preko natrijum sulfata i upare čime se dobije 395 mg (13% od teor.) kao druga sarža jedinjenja iz naslova.

Postupak 2:

|0265JRastvor Intermedijera 21A (291 mg, 0.82 mmol) u sirćetnoj kiselini (2.9 ml) se tretira sa 37% vod. rastvorom formalđehida (104 ul 1.39 mmol) i 2-oksopiperazinom (139 mg. 1,39 mmol). Smeša se meša pri 60°C tokom 3 h i zatim upari. Prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosii Cl 8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina) dobije se 184 mg (44% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): Ri= 0,77 min; MS (ESIpoz): m/z = 467 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d*): 5 = 8.00 (s. IH). 7.73 (br. s. IH). 7.37 (s. 1H), 7.31 (s, IH). 6.84 (s, IH), 4.41 (s, 2H), 3.97 (s, 2H). 3.96 (s. 3H). 3.20 (s. 3H). 3.15-3.08 (br. s. 2H), 3.01 (s, 2H), 2.64 (br. t, 2H). 2.45 (s, 3H) ppm.

Primer 2

4-{[4-amino-6-(metoksimetiI)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo(2,l-fj-11,2,4]triazin-7-il]metil}piperazin-2-on dihidroblorid

|0266|

]0267|Rastvor Primera 1 (100 mg, 214 umol) u 1,4-dioksanu (2 ml) se tretira sa 4 M rastvorom hlorovodonika u 1,4-dioksanu (2 ml. 8 mmol). Rastvarač se upari ostavljajući 130 mg (kvanl.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,79 min; MS (ESIpoz): m/z = 467 (M+Hf

'H-NMR(400 MHz, DMSO-dć): 6 = 8.39 (br. s. IH), 8.31-8.53 (br. s, IH), 8.17 (s, IH). 7.38 (s, IH), 7.34 (s, IH), 6.87 (s, IH). 6.21-6.42 (br. s, IH), 4.81 (br. s. 2H), 4.52 (br. s, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.57 (s. 2H), 3.32-3.72 (m, 4H), 3.26 (s. 3H), 2.46 (s. 3H) ppm.

Primer 3

(3/f )-3-( {14-amino-6-(metoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-1 -benzotiofen-2-i l)piro lo 12,1 -f | - |l,2,4|triazin-7-il]metil}amino)pirolidin-2-on dihidrohlorid

[0268]

|0269|Rastvor Intermedijera 13A (520 mg, 1.36 mmol) u metanolu (15 ml) i sirćetnoj kiselini (156 (il, 2,7 mmol) se tretira sa (/?)-3-aminopirolidin-2-onom (503 mg, 5.0 mmol) i triacetoksiborohidridom (1,06 g, 5,0 mmol). Smeša se meša pri st preko noći i zatim upari. Prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina) i liofilizovanjem produkta tako dobivenog iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu dobije se 272 mg (36% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): R, = 0,70 min; MS (ESIpoz): m/z = 467 (M+H)<+>'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): d = 9.62 (br. s, IH), 9.46 (br. s. IH). 8.56-8.22 (br. s. IH), 8.44 (s, IH), 8.19 (s, IH). 7.38 (s. IH). 7.34 (s, IH). 6.87 (s. 1 H), 6.54-6.12 (br. s, IH), 4.89-4.65 (m, 2H), 4.58-4.46 (m. 2H), 4.17-4.07 (br. s, IH. preklapanje sa vrhom vode). 3.96 (s. 3H). 3.36-3.16 (m, 2H). 3.25 (s, 3H). 2.48-2.39 (m. IH). 2.46 (s. 3H), 2.23-2.06 (m. IH) ppm.Primer 4(3^)-3-({[4-amino-6-(metoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo|2,I-f|-[l,2,4|triazin-7-il|metil}amino)pirolidin-2-on[02701

[02711Rastvor Intermedijera 13A (2,0 g, 5.2 mmol) u metanolu (58 ml) i sirćetnoj kiselini (0.6 ml) se tretira sa (7?)-3-aminopiroIidin-2-onom (785 mg, 7.8 mmol) i triacetoksiborohidridom (3,32 g, 15,6 mmol ). Smeša se meša pri st preko noći. Nakon toga, reakciona smeša se razblaži sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i ekstrahira tri puta sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se osuše preko natrijum sulfata i upare. Ostatak se prečisti dvostrukom kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/metanol 40:1 do 10:1) da se dobije 957 mg (37% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): Rt= 0,72 min; MS (ESIpoz): m/z = 467 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d„): 5 = 8.01 (s, IH), 7.75 (s, IH). 7.35 (s. IH). 7.31 (s. IH). 6.85 (s, IH), 4.46-4.34 (m, 2H), 4.24-4.02 (m, 2H), 3.96 (s. 3H). 3.24-3.04 (m. 3H). 3.21 (s, 3H). 2.45 (s, 3H), 2.40-2.27 (m, IH). 1.80-1.65 (m. IH) ppm.

Primer 5

4-{[4-amino-6-(etoksimetiI)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)pirolo[2,l-f)|| 1,2,4]-triazin-7-il| metil} piperazin-2-on

[0272]

Postupak 1:

[0273]Rastvor Intermedijera 17A (2 g. 5,05 mmol) u THF (100 ml) se tretira pri 0°C sa 2-oksopiperazinom (1,01 g, 10.1 mmol), natrijum triacetoksiborohidridom (1.07 g. 5.04 mmol) i sirćetnom kiselinom (0,29 ml. 5,04 mmol). Nastala smeša se mesa pri 0°C tokom 30 min. Četiri dodatne porcije natrijum triacetoksiborohidrida (1,07 g, 5,04 mmol) i sirćetne kiseline (0,29 ml, 5,04 mmol) dodaju se svakih 30 minuta, te se nastala smeša meša tokom daljnjih 30 min pri 0°C, zatim tokom 25 min pri 35°C i na kraju pri st preko noći. Reakcija se zagasi sa 10% vod. rastvorom natrijum hlorida i ekstrahira dvaput sa etil acetatom. Kombinovani organski slojevi se upare. Ostatak se prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/ metanol 95:5 —» 90:10) Čime se dobije 360 mg (17% od teor.) jedinjenja opisanog u Primeru 86 (vidi ispod) i 1.82 g jedinjenja iz naslova u zasebnim frakcijama. Produkt iz naslova tako dobiven se suspenzuje u etanolu (20 ml), refluksuje tokom 2 h i zatim ohladi na 15°C. Čvrsta supstanca se ođfiltrira i ispere sa etanolom, čime se dobije 1.63 g (67% od teor. ) Čistog jedinjenja iz naslova.

Postupak 2:

|0274|Rastvor Primera 13 (930 mg, 1.9 mmol) u dihlorometanu (18 ml) se tretira sa tionil hloridom (210 ul, 2,8 mmol) i meša pri st tokom 15 min. Nakon evaporisanja. ostatak se rastvori u etanolu (18 ml) i tretira sa DIPEA (670 ul 3.8 mmol). Smeša se meša pri 70°C tokom 2 h i zatim upari. Ostatak se prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/metanol 98:2 —» 90:10). Produkt tako dobiven se triturira u acetonitril/dietiletar smeši i profiltruje. Filtrat se upari i ostatak se ponovo prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/rnetanol 98:2 —<■ 90:10). Ponovo, produkt tako dobiven se triturira u acetonitril/dietiletar i profiltruje. Ovaj postupak se ponovi još jedanput. Tri šarže čvrstih supstanci dobijenih na ovaj način se kombinuju, trituriraju još jednom u acetonitril/dietiletar i na kraju odfiltriraju. čime se dobije 600 mg (62% od teor.) jedinjenja iz naslova.

Postupak 3:

[0275]Rastvor Intermedijera 22A (720 mg. čistoća 89%. 1.74 mmol) u sirćetnoj kiselini (10 ml) se meša sa piperazin-2-onom (261 mg, 2.61 mmol) pri 60°C. Ovome se doda 37% vod. rastvor formaldehida (260 ul, 3,48 mmol) u tri porcije nakon 0. 3 i 12 h, odnosno i smeša se meša pri 60°C tokom ukupno 24 h. Zatim se isparljive supstance uklone pod smanjenim pritiskom i ostatak se razdeli između etil acetata i zas. vod. rastvora natrijum hidrogenkarbonata. Organska faza se ispere sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida. osuši sa magnezijum sulfatom i upari. Ostatak se rastvori u smeši metanola i dihlorometana. ađsorbuje na dijatomejsku zemlju, osušiin vacuoi prečisti fleš hromatografijom na silikagelu (gradijent 0-6% metanol/dihlorometan). Frakcije produkla se kombinuju. upare i ponovo prečiste preparativnom RP-HPLC (Reprosil C18, gradijent 30-50% acetonitri 1/0.2% vod. TFA). Frakcije produkta se ponovo kombinuju, razblaže sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i ekstrahiraju sa etil acetatom. Organska faza se ispere sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, osuši sa magnezijum sulfatom i upari čime se dobije 281 mg (31% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,86 min; MS (ESIpoz): m/z = 481 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d*): 6 = 8.01 (s. IH). 7.8-8.05 (br. s. IH). 7.74 (br. s, IH). 7.38 (s, IH). 7.31 (s, IH), 6.85 (s. IH), 5.6-5.9 (br. s, IH). 4.45 (s, 2H). 3.97 (s. 2H), 3.94 (s. 3H), 3.41 (q, 2H), 3.09-3.13 (m, 2H), 3.02 (s, 211), 2.63-2.69 (br. s, 2H), 2.45 (s. 3H). 1.07 (t. 3H) ppm.

Primer 6

4-{[4-amino-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)pirolo|2,l-fI|l,2,4|-triazin-7-iI] metil} piperazin-2-on dihidrohlorid

[0276]

[0277]Rastvor Intermedijera 17A (60 mg. čistoća 69%. 104 umol) u metanolu (6 ml) se tretira sa 2-oksopiperazinom (22 mg, 209 umol), natrijum cijanoborohidridom (33 mg, 522 mmol) i sirćetnom kiselinom (12 ul, 209 umol). Smeša se meša pri 60°C tokom 16 h i zatim profiltruje. Filtrat i ostatak se prečiste zasebno preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 40-60% acetonitril/0,2% vod. TFA). Frakcije produkta se kombinuju. razblaže sa 1 M hlorovodoničnom kiselinom (3 ml) i upare do suva, čime se dobije 46 mg (79% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,87 min; MS (ESIpoz): m/z = 481 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.37 (br. s. IH). 8.31 (br. s. IH). 8.14 (s. IH). 7.38 (s.

IH), 7.33 (s, IH), 6.87 (s, IH), 6.13 (br. s. IH), 4.80 (br. s, 2H). 4.52 (s. 2H). 3.96 (s, 3H). 3.86 (br. s, 2H). 3.36-3.51 (m, 5H), 2.46 (s, 3H), 1.11 (t. 3H) ppm.

Primer 7

(3i?)-3-({[4-amino-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-meti!-l-benzotiofen-2-il)pirolo|2,l-f|-[l,2,4]triazin-7-il]metil}amino)piroIidin-2-on dihidrohlorid

f0278|

[0279JRastvor Intermedijera 17A (60 mg, čistoća 69%, 104 umol) u metanolu (3 ml) se tretira sa (/?)-3-aminopiroIidin-2-onom (22 mg, 209 umol). natrijum cijanoborohidridom (33 mg, 522 umol) i sirćetnom kiselinom (12 ul, 209 umol). Smeša se meša pri 60°C tokom 4 h i zatim profiltruje. Filtrat se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 40-60% acetonitril/ 0,2% vod. TFA). Frakcije produkta se kombinuju, razbiaže sa 1 M hlorovodoničnom kiselinom i upare do suva. čime se dobije 46 mg (79% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 0,74 min; MS (ESIpoz): m/z = 481 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 9.58-9.75 (m, IH), 9.33-9.54 (m, IH), 8.44 (s, IH), 8.27-8.71 (br. s, IH), 8.19 (s, IH), 7.38 (s. IH), 7.34 (s, IH). 6.87 (s. IH). 6.18-6.48 (br. s, IH). 4.68-4.87 (m, 2H), 4.49-4.62 (q. 2H). 3.96 (s. 3H), 3.45 (q. 2H). 3.18-3.35 (m. 2H). 2.46 (s. 4H), 2.08-2.22 (m, IH), 1.10 (t, 311) ppm.

Primer 8

(3/f)-3-({|4-amino-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)piroIo|2,I-f]-|l,2,4]triazin-7-iI)metil} amino)pirolidin-2-on

[0280]

[0281]Rastvor Intermedijera 17A (226 mg, čistoća 75%, 428 umol) u metanolu (4 ml) se tretira sa (/?)-3-aminopirolidin-2-onom (85 mg, 855 umol), natrijum cijanoborohidridom (134 mg, 2,14 mmol) i sirćetnom kiselinom (49 ul, 855 umol). Smeša se meša pri st tokom 1.5 h. Nakon toga, smeša se direktno razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 40-60% acetonitri 1/0,2% vod. TFA). Frakcije produkta se kombinuju, razblaže sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i ekstrahiraju sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida. osuše preko magnezijum sulfata i upare do suva čime se dobije 180 mg (88% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): Rt= 0,74 min; MS (ESIpoz): m/z = 481 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-đ6): 5 = 8.00 (s. IH), 7.76 (s. IH). 7.8-8.1 (br. s. IH). 7.35 (s, IH), 7.31 (s, IH), 6.84 (s. IH), 5.6-5.9 (br. s, IH). 4.39-4.49 (m. 2H). 4.04-4.23 (m, 2H). 3.96 (s. 3H).3.41 (q.2H), 3.05-3.23 (m,3H). 2.45 (s. 3H). 2.3 1-2.40 (m. IH). 1.68-1.79 (m, IH). 1.08 (t, 311) ppm.

Primer 9

A^-n^amino-ć-tetoksimetiO-S-fT-metoksi-S-metil-l-benzotiofen-I-iOpirolo^J-fl-[l,2,4]triazin-7-il]metil}glicinamid dihidrohlorid

[0282]

[0283]Rastvor Intermedijera 17A (60 mg. čistoća 69%, 104 umol) u metanolu (3 ml) se tretira sa glicinamid hidrohloridom (23 mg, 209 umol). natrijum cijanoborohidridom (32 mg, 522 mmol) i sirćetnom kiselinom (12 ul, 209 umol). Smeša se meša pri 60°C tokom 16 h. Nakon filtrovanja, filtrat se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 20-40% acetonitril/0,2% vod. TFA). Frakcije produkta se kombinuju, razblaže sa 1 M hlorovodoničnom kiselinom, upare do suva i kombinuju sa ostatkom iz filtracionog koraka. Ovaj materijal se ponovo prečisti dvostrukom preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8, gradijent 20-40% acetonitril/0,2% vod. TFA). Frakcije produkta se ponovo kombinuju. razblaže sa 1 M hlorovodoničnom kiselinom i upare do suva čime se dobije 7.4 mg (13% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,80 min; MS (ESIpoz): m/z = 455 (M+H)<T>

'H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): 5 = 9.33 (br. s, 2H). 9.05 (br. s. IH). 8.31 (s. IH), 7.93 (br. s, IH). 7.58 (br.s, IH), 7.40 (s. IH), 7.35 (s, IH). 7.05 (br. s. IH), 6.88 (s, IH).4.65 (br. ni. 2H), 4.56 (s, 2H), 3.96 (s. 3H), 3.74 (br. m, 2H), 3.46 (q, 2H). 2.46 (s. 3H), 1.10 (t, 3H) ppm.

Primer 10

6-(etoksimetiI)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(morfolin-4-ilmetil)pirolo-|2,l-f) 11,2,4] triazin-4-am in

|0284]

(0285]Rastvor Intermedijera 17A (55 mg, čistoća 73%, 101 umol) u metanolu (3 ml) se tretira sa morfolinom (18 mg, 202 umol), natrijum cijanoborohidridom (19 mg, 303 mmol ) i sirćetnom kiselinom (18 ul, 304 pmol). Smeša se meša pri 60°C tokom 18 h. Dodaju se daljnje količine mortblina (18 mg, 202 u.mol), natrijum đjanoborohidrida (19 mg. 303 mmol) i sirćetne kiseline (18 ul, 304 umol) i mešanje pri 60°C se nastavi tokom dodatnih 3 h. Nastala smeša se razblaži sa THF da se rastvore taloži i razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 20-40% acetonitril/0,2% vod. TFA). Frakcije produkta se kombinuju i upare do suva. Ostatak se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE, PL-HCO3MP-smola). Uložak se eiuira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 32 mg (68% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,78 min; MS (ESIpoz): m/z = 468 (M+HT

'H-NMR (400 MHz. DMSO-d„): 5 = 7.98 (s. IH). 7.9 (br. s. IH), 7.37 (s, IH). 7.31 (s. IH), 6.84 (s, IH), 5.75 (br. s, IH), 4.45 (s. 2H). 3.95 (s. 3H). 3.88 (s. 211). 3.51-3.56 (m, 411), 3.40 (q, 2H), 2.4-2.5 (m, 4H), 2.45 (s. 3H), 1.06 (t, 3H) ppm.

Primer11

l.(4.{[4-amino-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metiI-l-benzotiofen-2-iI)pirolo|2,l-fl-|l,2,4]triazin-7-il)metil}pi<p>erazin-l-il)etanon dihidrohlorid

[0286]

[0287|Rastvor Intermedijera 17A (130 mg, 0.328 mmol) u metanolu (8 ml) se tretira saN-acetilpiperazinom (63 mg, 0.492 mmol), natrijum cijanoborohidridom (103 mg, 1,63 mmol) i sirćetnom kiselinom (37 ul, 0.655 mmol). Smeša se meša pri 60°C tokom 3 h. Zatim se kombinuje sa reakcionom smešom od 30 mg testnog izvođenja, upari i prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina). Produkt tako dobiven se liofilizuje iz 1.4-dioksana, zatim rastvori u etil acetatu i ispere sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata. Organski sloj se osuši preko magnezijum sulfata, upari i ponovo liofilizuje iz 1,4-dioksana. Ponovnim prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina), nakon čega sledi dvostruka kolonska hromatografija na silikagelu (dihlorometan/metanol 98:2 —> 4:1) i liofilizovanje iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu, dobije se 49 mg (18% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): R, = 0.82 min; MS (ESIpoz): m/z = 509 (M+Hf'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): imer al.5 = 8.65-8.26 (br. s. I H). 8.17 (s. IH), 7.38 (s, IH). 7.34 (s, IH), 6.87 (s, IH), 6.53-6.05 (br. s, IH). 4.75 (br. s, 2H), 4.56 (br. s, 2H), 3.96 (s, 3H). 3.45 (q, 2H, preklapanje sa vrhom vode), 2.46 (s, 3H). 2.03 (s. 3H), 1.09 (t. 3H) ppm. Primer 12 |4-amino-5-(7-metoksi-5-metiI-l -benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-1 -ilmetil)pirolo|2,1 -f|-[l,2,4|triazin-6-iIlmetanol bis(formijat) [02881

[0289]Rastvor Interniedijera 23A (95 mg. 152 umol) u 4 M rastvoru hlorovođonika u 1,4-dioksanu (3.7 ml) se meša pri st tokom 2 h. Nakon evaporisanja, ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina) čime se dobije 44 mg (62% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt= 0,63 min; MS (ESIpoz): m/z = 439 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-dt,): 5 = 8.28 (br. s. 211). 7.98 (s. IH). 7.37 (s. IH). 7.3! (s, IH). 6.85 (s, 1H), 4.50 (s, 2H, preklapanje sa vrhom vode). 3.98 (s, 2H, preklapanje sa vrhom vode), 3.95 (s, 3H, preklapanje sa vrhom vode), 2.95-2.84 (m, 4H ). 2.61-2.55 (m, 4H. preklapanje sa DMSO vrhom), 2.45 (s, 3H) ppm.

Primer 13

4-{[4-amino-6-(hidroksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo(2,l-f] [ 1,2,4]-triazin-7-il | metil} piperazin-2-on

|0290]

[02911Rastvor Intermedijera 20A (1.34 g, 3,96 mmol) u sirćetnoj kiselini (13.9 ml) se tretira sa 37% vod. rastvorom lormaldehida (501 ul, 6,6 mmol) i 2-oksopiperazinom (670 mg, 6.6 mmol). Smeša se meša pri 50°C tokom 2 h i zatim upari. Prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/metano] 98:2 —*■ 90:10) dobije se 942 mg (49% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt= 0,67 min; MS (ESIpoz): m/z = 453 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-dA): 5 = 7.99 (s. IH), 7.76 (br. s, IH), 7.39 (s. IH). 7.31 (s. IH). 6.84 (s, IH), 4.51 (s, 2H). 4.03 (br. s. 2H), 3.95 (s, 3H), 3.18-3.13 (m. 2H). 3.07-2.98 (m. 2H), 2.72-2.60 (m, 2H), 2.45 (s, 3H) ppm.

Primer 14

7- {[(35)-3-amino-3-metilpirolidin-l-il|metil}-6-(metoksimetiI)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-fj[l,2,4]triazin-4-amin trihidrohlorid

[0292J

[0293]Rastvor Intermedijera 21A (100 mg, 0.28 mmol) u sirćetnoj kiselini (1 ml) se tretira sa 37% vod. rastvorom formaldehida (25 ul. 0,33 mmol) itert- butil[(3/>)-3-metilpirolidin-3-iljkarbamata (Yoshida et a)., Chem. Pharm. Buli. 1996, 44 (7). 1376-1386; 67 mg, 0.33 mmol). Smeša se meša pri st tokom 3 h i zatim upari. Ostatak se razblaži sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata, te se doda čvrsti kalijum karbonat dok se ne prestane stvarati gas. Vodena faza se ekstrahira tri puta sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se osuše preko natrijum sulfata i upare. Ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (2 ml) i meša pri st tokom 2 h. Nakon evaporisanja, ostatak se prečisti dvostrukom preparativnom RP-HPLC (prvo Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina; zatim Shield RP18, gradijent 5-50% metanol + 0,1% vod. TFA/0.1% vod. TFA). Produkt tako dobiven se liofilizuje iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu čime se dobije 14 mg (8% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0.67 min; MS (ESIpoz): m/z = 467 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6):inter al.S = 8.50-8.22 (br. s. 1H), 8.14 (s. IH), 7.36 (s, 1H). 7.34 (s, IH), 6.87 (s, IH), 6.36-6.01 (br. s, 1 H), 4.88 (br. s, 2Hj, 4.56 (br. s, 2H), 3.96 (s, 3H, preklapanje sa vrhom vode), 3.26 (s, 3H), 2.46 (s, 3Hj, 1.52 (s, 3H) ppm.

Primer 15

7-{[(35)-3-amino-3-metilpirolidin-l-il|metil}-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo (2,1 -f] 11,2,4] triazin-4-am i n

|0294]

[0295]Rastvor Intermedijera 17A (100 mg, 271 umol) u sirćetnoj kiselini (1 ml) se tretira sa 37% vod. rastvorom formaldehida (24 ul, 326 umol) itert- butil[(3S)-3-metilpiroliđin-3-il]karbamatom (Yoshida et al., Chem. Pharm. Buli. 1996, 44 (7). 1376-1386; 65 mg, 326 umol). Smeša se meša pri 60°C tokom 4 h. Zatim se dodaju daljnje količine 37% vod. rastvora formaldehida (10 ul. 136 jimol) itert- butil[(31S<T>)-3-metilpirolidin-3-il]karbamata (27 mg, 136 pmol), te se mešanje pri 60°C nastavi preko noći . Nakon evaporisanja. ostatak se razdeli između etil acetata i zas. vod. rastvora natrijum hidrogenkarbonata. Doda se čvrsti kalijum karbonat dok se ne prestane stvarati gas. Vodena faza se ekstrahira tri puta sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se osuše preko natrijum sulfata, upare i prečiste preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina). Produkt tako dobiven se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (2 ml) i meša pri st tokom 1 h. Nakon evaporisanja, ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8, gradijent 10-95% acetonitril/0,1 % vod. mravlja kiselina) čime se dobije 24 mg (18% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): Rt= 0,70 min: MS (ESIpoz): m/z = 481 (M'll)

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d<,):inter al.5 = 8.19 (s, IH). 7.38 (s, IH), 7.34 (s. IH), 6.87 (s.

IH), 4.90 (br. s. 2H), 3.96 (s, 3H), 3.46 (q. 3H), 2.46 (s, 3H), 1.54 (s. 3H), 1.14-1.05 (m. 3H) ppm.

Primer 16

l-(4-{|4-amino-6-(metoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-fj-|l,2,4)triazin-7-il]metil}piperazin-l-il)etanon dihitlrohlorid

[02961

[0297]Rastvor Intermedijera 21A (50 mg. 141 umol) u sirćetnoj kiselini (1 ml) se tretira sa 37% vod. rastvorom formaldehida (4,6 ul. 169 umol) i iV-acetiipiperazinom (21,6 mg, 169 umol). Smeša se meša pri 75°C tokom 3 h. Nakon evaporisanja, ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina). Liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu dobije se 34 mg (39% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 5): R, = 1.78 min: MS (ESIpoz): m/z = 495 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz. DMSO-d*):inter al.8 = 8.70-8.35 (br. s. IH). 8.18 (s, IH), 7.37 (s. IH). 7.34 (s, IH). 6.86 (s. IH), 6.61-6.19 (br. s. IH). 4.74 (br. s. 2H). 4.54 (br. s. 2H). 3.96 (s. 3H). 3.25 (s, 3H). 2.46 (s, 3H). 2.03 (s. 3H) ppm.

Primer17

6-(metoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo-12,1 -fj [ 1,2,4]triazin-4-amin formijat

[0298]

[0299]Rastvor Intermedijera 23A (110 mg, 204 umol) u dihlorometanu (2,2 ml) se tretira sa tionil hloridom (29 jul, 408 umol) i meša pri st tokom 15 min. Nakon evaporisanja. ostatak se rastvori u metanolu (2,2 ml) i tretira sa DIPEA (39 ul. 224 umol). Smeša se meša pri 70°C tokom 1 h i zatim upari. Ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1.4-dioksanu (2.2 ml) i meša pri st tokom 2 h. Evaporisanjem i prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) dobije se 44,9 mg (46% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt = 0,73 min; MS (ESIpoz): m/z = 453 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 8.28 (br. s. 1H), 8.00 (s, IH), 7.35 (s. 1H). 7.31 (s. 1H). 6.85 (s, IH), 4.41 (s, 2H), 4.00-3.90 (m. 5H). 3.00-2.90 (m, 4H). 2.65-2.56 (m. 4H). 2.45 (s. 3H) ppm.

Primer 18

6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo-[2,l-f][l,2,4]triazin-4-amin

[03001

[0301]Rastvor Intermedijera 23A (80 mg. 317 umol) u dihlorometanu (2 ml) se tretira sa tionil hloridom (22 u.1. 297 umol) i mesa pri st tokom 15 min. Nakon evaporisanja. ostatak se rastvori u etanolu (2 ml) i tretira sa DIPEA (28 ul, 163 umol). Smeša se meša pri 70°C tokom 1 h i zatim upari. Ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (2 ml) i meša pri st tokom 1 h. Evaporisanjem i prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8, gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) dobije se 35 mg (50% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,82 min; MS (ESIpoz): m/z = 467 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d*):inter al.5 = 8.09 (br. s, IH). 7.36 (s, IH), 7.32 (s, 1H), 6.86 (s, IH). 4.50 (br. s, 2H). 3.96 (s, 3H). 3.42 (q, 2H, preklapanje sa vrhom vode), 2.45 (s. 3H). 1.05 (t, 3 H) ppm.

Primer 19

6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metiI-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo-12,l-f]|l,2,4]triazin-4-amin dihidrohlorid

[0302|

[0303]Rastvor Primera 18 (50 mg, 107 umol) u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (1 ml) se meša pri st tokom 15 min. Nakon evaporisanja. dobiju se 55 mg (93% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 0,74 min; MS (ESIpoz): m/z = 467 (M+H)<+>

<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-dh):inter al.6 = 8.18 (s, 1H). 7.37 (s. IH). 7.34 (s. 1H). 6.87 (s. IH), 4.76 (br. s, 2H), 4.60 (br. s, 2H), 3.96 (s. 3H). 3.45 (q, 2H), 2.46 (s, 3H), 1.09 (t. 3H) ppm.

Primer 20

l-(4-{[4-aniino-6-(etoksimetiI)-5-{7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)pirolo|2,l-f]-[l,2,4]triazin-7-iI]metil}piperazin-l-ii)etanon

[0304]

[0305]Rastvor Primera 18 (70 mg, 150 umol) u dihlorometanu (2 ml) i THF (0,8 ml) se tretira sa acetil hloridom (21 (il, 300 umol) i natrijum karbonatom (127 mg, 1.2 mmol). Smeša se meša pri st preko noći. Nakon evaporisanja, ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina) čime se dobije 27 mg (31% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 0,77 min; MS (ESIpoz): m/z = 509 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d*): 8 = 7.98 (s, IH), 7.37 (s. IH). 7.31 (s. IH). 6.84 (s. IH). 4.45 (s, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.92 (s, 2H), 3.45-3.36 (m, 6H), 2.48-2.38 (m. 7H. preklapanje sa DMSO vrhom), 1.97 (s. 3H), 1.06 (t, 3H) ppm.

Primer 21

4-({4-amino-6-[(2-hidroksietoksi)metil]-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)piroIo-[2,l-fj[l,2,4jtriazin-7-il}metil)piperazin-2-on formijat

[0306]

[0307]Rastvor Primera 13 (60 mg, 132 umol) u dihlorometanu (2 ml) se tretira sa tionil hloridom (14 ?i), 198 umol). Smeša se meša pri st tokom 15 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u etilen glikolu (500 ul) i meša pri 100°C tokom 90 min. Prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina) dobije se 34 mg (47% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,69 min; MS (ESIpoz): m/z = 497 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-de): 8= 8.14 (s, IH), 8.00 (s, IH), 7.74(br. s. IH), 7.42 (s, IH). 7.31 (s. IH). 6.84 (s. IH). 4.49 (s, 2H), 3.99 (s, 2H). 3.96 (s. 3H). 3.50-3.43 (m. 2H). 3.42-3.36 (m, 2H, preklapanje sa vrhom vode). 3.15-3.07 (m. 2H). 3.03 (s. 2H). 2.69-2.61<m, 2H), 2.45 (s, 3H) ppm.

Primer 22

2-{[4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo[2,l-f|-[l,2,4]triazin-6-iI]metoksi}etanol dihidrohlorid

|0308]

{0309]Rastvor Intermedijera 23A (100 mg, 185 pmol) u dihlorometanu (4 ml) se tretira sa tionil hloridom (27 ul. 371 umol). Smeša se meša pri st tokom 20 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u etilen glikol/THF (2:1, 1.5 ml) i meša pri 100°C tokom 2 h. Nakon evaporisanja. ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina), nakon čega sledi kolonska hromatografija na silikagelu (dihlorometan/metanol + 0,1% vod. amonijak 98:2 —► 90:10). Liofiiizovanjem iz 4 IVI rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu dobije se 67 mg (64% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): R, = 0,66 min: MS (ESIpoz): m/z = 483 (M+H)' 'H-NMR (400 MHz, DMSO-dh): 8 = 8.16 (s. IH). 7.49 (s, IH). 7.43 (s, IH). 6.98 (s. 111), 4.86 (s, 2H), 4.69 (s, 2H). 4.03 (s, 3H), 3.81-3.49 (m. 12H). 2.50 (s. 3H) ppm. Primer 23 6-(butoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-iImetil)pirolo-[2,1 -f] [ 1,2,4Jtriazin-4-amin formi,jat j0310| |0311(Rastvor Intermedijera 23A (100 mg, 185 umol) u dihlorometanu (2 ml) se tretira sa tionil hloridom (27 ul, 371 (.imol). Smeša se meša pri st tokom 15 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u 1-butanolu (2 ml) i zagrejava na 70°C tokom 1 h. Nakon evaporisanja, ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1.4-dioksanu (2 ml ) i meša pri st tokom 2 h. Evaporisanjem i prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) dobije se 22 mg (24% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): R, = 0,82 min; MS (ESIpoz): m/z = 495 (M+Hf 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d*): 5 = 8.29 (s. IH), 7.99 (s, IH). 7.35 (s. IH), 7.29 (s, IH). 6.84 (s, IH). 4.43 (s, 2H), 3.95 (s. 3H). 3.92 (s. 2H). 3.35 (t. 2H). 2.90-2.79 (m. 4H). 2.45 (s, 3H), 1.47-1.37 (m, 2H), 1.31-1.18 (m, 2H), 0.80 (t. 3H) ppm. Primer 24 5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)-6-(propoksimetiI)pirolo-|2,l-f| (l,2,4]triazin-4-amin bis(formijat) [0312J

[0313]Rastvor Intermedijera 23A (100 mg. 185 umol) u dihlorometanu (2 ml) se tretira sa

tionil hloridom (27 ul, 371 umol). Smeša se meša pri st tokom 15 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u 1-propanolu (2 ml), tretira sa DIPEA (48 ul, 278 jimol) i meša pri st tokom 1 h. Nakon evaporisanja, ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1.4-dioksanu (2 ml) i meša pri st tokom 2 h. Evaporisanjem i prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina) dobije se 15 mg 116% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt = 0,78 min; MS (ESIpoz): m/z = 481 (M+H)

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 8.26 (br. s, 2H), 7.98 (s. IH). 7.36 (s, IH), 7.30 (s. IH), 6.84 (s, IH). 4.44 (s, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.92 (s. 2H). 3.32 (t. 2H). 2.87-2.79 (m. 4H), 1.52-1.39 (m, 2H), 0.81 (t, 3H) ppm.

Primer 25

6-[(cikIopropiImetoksi)metiI)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmeti])pirolo(2,l-f|[l,2,4]triazin-4-amin bis(formijat)

(0314|

(0315)Rastvor Intermedijera 23A (100 mg. 185 umol) u dihlorometanu (2 ml) se tretira sa tionil hloridom (27 ul, 371 umol). Smeša se meša pri st tokom 15 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u ciklopropilmetanolu (2 ml), tretira sa DIPEA (48 ul, 278 umol) i meša pri 70°C tokom 2 h. Nakon evaporisanja, ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (2 ml) i meša pri st tokom 2 h. Evaporisanjem i prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina) dobije se 29 mg (30% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt = 0,78 min; MS (ESIpoz): m/z = 493 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.28 (br. s, 2H). 7.99 (s. 1H), 7.37 (s. 1H). 7.30 (s, 1H), 6.84 (s, IH), 4.45 (s, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.93 (s. 2H), 3.21 (d, 2H). 2.95-2.83 (m, 4H). 2.61-2.56 (m, 4H), 2.45 (s, 3H), 1.01-0.91 (m, IH). 0.46-0.37 (m, 2H). 0.15-0.08 (m, 2H) ppm.

Primer 26

6-[(cikIobutiloksi)metil|-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetiI)pirolo[2,l-f|[l,2,4|triazin-4-amin

[0316]

[0317]Rastvor Intermedijera 23A (85 mg, 157 umol) u dihlorometanu (1.7 ml) se tretira sa tionil hloridom (23 ul, 315 umol). Smeša se meša pri st tokom 15 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u ciklobutanolu (1,7 ml), tretira sa DIPEA (41 ul. 236 umol) i meša pri 70°C tokom 2 h. Nakon evaporisanja, ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1.4-dioksanu (1,7 ml) i meša pri st tokom 2 h. Evaporisanjem i prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil C18, gradijent 10-95% aeetonitri 1/0,1% vod. mravlja kiselina) dobije se 23 mg (28% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt= 0.82 min; MS (ESIpoz): m/z = 493 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-dA): 5 = 8.01 (s, IH). 7.37 (s, 1H), 7.32 (s. IH). 6.85 (s. 1H). 4.37 (s, 2H). 4.06-3.86 (m, 6H). 3.14-2.97 (m, 4H), 2.80-2.62 (m, 4H), 2.45 (s. 3H). 2.10-1.96 (m, 2H), 1.83-1.69 (m, 2H). 1.65-1.52 (m. IH). 1.49-1.33 (m, IH) ppm.

Primer 27

6-(izopropoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)-piroIo|2,l-f|[l,2,4]triazin-4-amin formijat

|03181

[0319]Rastvor Intermedijera 23A (65 mg, 120 umol) u dihlorometanu (1.3 ml) se tretira sa tionil hloridom (17 ul, 241 umol). Smeša se meša pri st tokom 15 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u 2-propanolu (1,3 ml), tretira sa DIPEA (23 ul. 132 umol) i meša pri 70°C tokom 1 h. Doda se još DIPEA (23 jul, 132 jiinol) i smeša se ponovo meša pri 70°C tokom l h. Zatim se doda još jedna porcija DIPEA (63 pl. 362 prnol) i mešanje se nastavi pri 90°C tokom 3 h. Nakon evaporisanja. ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1.4-dioksanu (1,3 ml) i meša pri st tokom 2 h. Evaporisanjem i prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil C18, gradijent 10-95% acetonitri 1/0,1% vod. mravlja kiselina) dobije se 23 mg (34% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 0.74 min; MS (ESIpoz): m/z = 481 (M+H)'

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 8.30 (s, IH), 7.98 (s, IH), 7.37 (s. IH), 7.30 (s. IH), 6.84 (s, IH). 4.43 (s, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.90 (s. 2H). 3.57 (m. III. preklapanje sa vrhom vode), 2.88-2.78 (m, 4H), 2.45 (s, 3H). 1.04 (d, 6H) ppm.

Primer 28

6-[(2-metoksietoksi)metil|-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-il-metil)pirolo[2,1 -f] [ 1,2,41triazin-4-amin formijat

[0320|

[0321JRastvor Intermedijera 23A f 100 mg, 185 umol) u dihlorometanu (2 ml) se tretira sa tionil hloridom (27ul,371 umol). Smeša se mešapri st tokom 15 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u 2-metoksietanolu (2 ml), tretira sa DIPEA (35ul.204 umol) i meša pri 70°C tokom 1 h. Nakon evaporisanja, ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (2 ml) i meša pri st tokom 2 h. Evaporisanjem i prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil C18, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina) dobije se 50 mg (50% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,75 min; MS (ESIpoz): m/z = 497 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.26 (br. s. 1 H). 7.99 (s. IH), 7.39 (s, IH), 7.30 (s. IH). 6.84 (s, IH), 4.48 (s, 2H), 3.95 (s, 3H). 3.94 (s. 2H), 3.52-3.46 (m, 2H, preklapanje sa vrhom vode). 3.44-3.37 (m, 2H, preklapanje sa vrhom vode), 3.20 (s, 3H), 2.94-2.84 (m, 4H), 2.61-2.54 (m, 4H, preklapanje sa DMSO vrhom). 2.45 (s. 3H) ppm.

Primer 29

5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)-6-|(2,2,2-trifluoroetoksi)-metiljpirolo [2,1 -f|[l,2,4[triazin-4-amin formijat

[0322j

[0323|Rastvor Intermedijera 23A (100 mg, 185 umol) u dihlorometanu (2 ml) se tretira sa tionil hloridom (27 ul, 371 pmol). Smeša se meša pri st tokom 15 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u 2.2,2-trifluoroetanolu (2 ml), tretira sa DIPEA (35 ul. 204 umol) i meša pri 70°C tokom 1 h. Doda se još DIPEA (35 ul. 204 umol) i mešanje se nastavi pri st tokom 1 h. Nakon evaporisanja, ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (2 ml) i meša pri st tokom 2 h. Evaporisanjem i prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil C18, gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravi ja kiselina) dobije se 23 mg (23% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,79 min: MS (ESIpoz): m/z = 521 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-dh): 5 = 8.28 (br. s. IH). 8.00 (s. IH). 7.37 (s. IH), 7.30 (s. IH), 6.85 (s, IH). 4.66 (s. 2H), 4.08 (q, 2H). 3.95 (s. 3H). 3.92 (s. 2H). 2.85-2.75 (m. 411). 2.45 (s. 3H) ppm.

Primer 30

6-I(2-aminoetoksi)metil|-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)-pirolo(2,1 -f] 11,2,4]triazin-4-amin trihidrohlorid

[0324]

|0325|Rastvor Intermedijera 23A (150 mg, 278 umol) u dihlorometanu (5 ml) se tretira sa tionil hloridom (40 jul, 556 jimol). Smeša se meša pri st tokom 15 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u THF (0,5 mL) i tretira sa/er/-butil (2-hidroksietil)karbamatom (1 ml) i DIPEA (242 ul, 1.39 mmol). Smeša se meša pri 100°C preko noći. Nakon evaporisanja. ostatak se rastvori u 1,4-dioksanu (10 ml), tretira sa 4 M rastvorom hlorovodonika u 1,4-dioksanu (10 ml) i meša pri st tokom 1 h. Isparljive supstance se uklone pod smanjenim pritiskom i ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonilri 1/0.1% vod. mravlja kiselina). Daljnjim prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Shield RP18, 25% acetonitril/75% 0.01% vod. TFA). nakon čega sledi liofilizovanje iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu dobije se 10 mg (6% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt= 0,58 min: MS (ESIpoz): m/z = 482 (M+HT

'H-NMR (400 MHz, D20): 8 = 8.12 (s. IH). 7.50 (s, IH). 7.44 (s. IH). 6.99 (s. IH). 4.61 (s. 2H), 4.04 (s. 3H). 3.88-3.80 (m, I H), 3.70-3.60 (m, 3H). 3.52-3.46 (m, 411). 3.40-3.34 (m. 4H), 3.07 (t. 2H), 2.51 (s, 3H) ppm.

Primer 31

Metil {[4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo-J2,l-f|[l,2,4]triazin-6-il]metoksi}acetat

|0326J

[0327)Rastvor Intermedijera 23A (50 mg, 92 umol) u dihlorometanu (2 mi) se tretira sa tionil hloridom (13 ul, 186 umol). Smeša se meša pri st tokom 15 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u metilglikolatu (1 ml), tretira sa DIPEA (80 ul. 464 umol) i meša pri 70°C tokom 2 h. Nakon evaporisanja, ostatak se rastvori u dihlorometanu (1.6 ml), tretira sa trifluorosirćetnom kiselinom (400 ul. 5,19 mmol) i meša pri st tokom 1 h. Zatim se smeša upari i ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. TFA). Frakcije koje sadrže jedinjenje iz naslova se neutrališu sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i upare. Ostatak se rastvori u vodi i smeša se ekstrahira tri puta sa dihlorometanom. Kombinovane organske faze se osuše preko natrijum sulfata i upare čime se dobije 21 mg (43% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt= 0,72 min; MS (ESIpoz): m/z = 511 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d*): 5 = 7.99 (s. IH). 7.39 (s. 1H). 7.31 (s. 1II). 6.85 (s. IH). 4.59 (s. 2H), 4.11 (s, 2H), 3.95 (s. 3H). 3.90 (s, 2H), 3.57 (s, 3H). 2.81-2.69 (m. 4H). 2.48-2.39 (m. 7H) ppm.

Primer 32

{|4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo|2,l-f|-[1,2,4]triazin-6-il|metoksijsirćetna kiselina

(0328]

[0329]Rastvor Intermedijera 24A (200 mg, 327 umol) u THF (14 ml) se tretira sa 2,5 M vod. rastvorom litijum hidroksida (16 ml) i meša pri 80°C tokom 2 h. Smeša se zatim kombinuje sa reakcionom smešom od 27 mg testnog izvođenja. Vodena faza se ekstrahira dvaput sa THF i kombinovane organske faze se upare. Ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (2 ml) i meša pri st tokom 3 h. Nakon evaporisanja, ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. TFA). Liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu i ponovnim prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (XBridge Cl8. gradijent 5-95% acetonitril/0.1% vod. rastvor amonijum hidroksida) dobije se 13 mg (7% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): R, = 0.69 min; MS (ESIpoz): m/z = 497 (M+Hf 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.00 (s, IH), 7.38 (s, IH). 7.30 (s. IH). 6.84 (s, IH). 4.54 (s, 211). 4.08 (s. 2H). 3.95 (s. 3H). 3.79 (s. 211). 2.99-2.89 (m, 4H). 2.73-2.63 (m. 4H). 2.44 (s,3H) ppm. Primer 33 2-{[4-amino-5-(7-metoksi-5-metiI-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetiI)pirolo|2,l-fj-[l,2,4jtriazin-6-il]metoksi}acetamid|0330]

[0331] Intermedijer 24A (200 mg, 327 umol) se tretira sa 7 M rastvorom amonijaka u metanolu (10 ml) i meša pri st preko noći. Smeša se zatim kombinuje sa reakcionom smešom od 20 mg testnog izvođenja i rastvarači se upare. Ostatak se tretira sa 4 M rastvorom hlorovodonika u 1,4-dioksanu (2 ml) i meša pri st tokom 2 h. Evaporisanjem i naknadnim prečišćavanjima preparativnom RP-HPLC (prvo Reprosil Cl 8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. TFA; zatim XBridge Cl8, gradijent 5-95% acetonitril/0.1% vod. rastvor amonijum hidroksida) dobije se 5.5 mg (3% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0.69 min; MS (ESIpoz): m/z - 496 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.14-7.59 (br. s. 1H), 7.99 (s, IH). 7.39 (s. IH), 7.35-7.22 (m, 3H). 6.85 (s, IH), 4.54 (s, 2H). 3.95 (s, 3H). 3.90 (s. 2H), 3.79 (s. 2H). 2.73-2.66 (m, 4H). 2.45 (s, 3H), 2.43-2.35 (m. 4H) ppm.

Primer 34

2-({7-[(4-acetilpiperazin-l-il)metil|-4-amino-5-(7-metoksi-5-metiI-I-benzotiofen-2-il)-pirolo|2,l-f)[l12,4]triazin-6-il}metoksi)acetamid

|0332)

J0333)Rastvor Primera 33 (105 mg, 68% čistoća, 144 umol) u THF/dihlorometan (1:2.5. 3.9 ml) se tretira sa natrijum karbonatom (179 mg. 1.6 mmol) i meša pri st tokom 30 min. Doda se acetil hlorid (30 ul, 424 umol) i nastala smeša se meša pri st tokom 30 min. zatim zagasi sa metanolom (2 ml) i upari. Prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) dobije se 30 mg (85% čistoća, 34% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 5): R, = 1,67 min; MS (ESIpoz): m/z = 538 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d,,): 5 = 7.99 (s, IH), 7.40 (s. 1H). 7.33-7.19 (m. 3H). 6.85 (s.

IH), 4.55 (s. 211), 3.96 (s, 5H), 3.80 (s. 2H). 3.43-3.36<m. 4H), 2.47-2.38 (m. 7H), 1.97 (s, 3H) ppm.

Primer 35

5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)-6-(phenoksimetil)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo-|2,l-f||l,2,4|triazin-4-amin bis(formijat)

|0334|

[0335}Rastvor Intermedijera 23A f 100 mg. 185 umol) u dihlorometanu (2 ml) se tretira sa tionil hloridom (27 ul, 371 umol). Smeša se meša pri st tokom 15 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u THF (2 ml), tretira sa fenolom (174 mg, 1.85 mmol) i DIPEA (48 pl, 278 u,mol), te meša pri 70°C tokom 2 h. Dodaju se daljnje količine fenola (174 mg, 1,85 mmol) i DIPEA (64 ul, 371 pmol) i mešanje se nastavi pri 70°C preko noći. Nakon evaporisanja. ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (2 ml) i meša pri st tokom 2 h. Evaporisanjem i prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) dobije se 8 mg (8% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): R, = 0,84 min; MS (ESIpoz): m/z = 515 (M+H)<1>'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 8.26 (s, 2H), 8.02 (s, 1 H), 7.36 (s. 1H). 7.30-7.22 (m. 3H). 6.99-6.89 (m, 3H), 6.81 (m, IH). 5.04 (s. 2H), 3.93 (s, 5H), 2.78-2.71 (m, 4H), 2.42 (s, 3H) ppm. Primer 36 5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-6-[(metiIamino)metilj-7-(piperazin-l-ilmetiI)-pirolo[2,l-f|[l,2,4]triazin-4-amin trihidrohlorid [0336J

|0337jIntermedijer 25A (150 mg, 279 umol) u THF (3 ml) se tretira sa sirćetnom kiselinom (32 ul, 559 umol). 2 M rastvorom metilamina u THF (698 ul, 1.39 mmol) i natrijum triacetoksiborohidridom (296 mg, 1.39 mmol). Smeša se meša pri 60°C tokom 2 h i zatim upari. Ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1.4-dioksanu (1,87 ml) i meša pri st tokom 2 h. Nakon evaporisanja, ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. TFA). Liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu dobije se 79 mg (49% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,56 min; MS (ESIpoz): m/z = 452 (M+H)<*>

'H-NMR (400 MHz, D20): 6 = 8.17 (s, IH). 7.57 (s. IH), 7.46 (s. IH), 7.01 (s. 111), 4.52 (s. 2H), 4.46 (s. 2H). 4.04 (s. 3H), 3.48-3.39 (m. 4H). 3.25-3.15 (m. 4H). 2.59 (s. 3H). 2.51 (s. 3H) ppm.

Primer 37

6-|(dimetilamino)metil|-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmctiI)-pirolo[2,l-fj[l,2,4|triazin-4-amin trihidrohlorid

[0338)

|0339|Rastvor Intermedijera 25A (150 mg, 279 umol) u THF (3 ml) se tretira sa sirćetnom kiselinom (32 ul, 559 umol), 2 M rastvorom di meti lami na u THF (698 ul, 1.39 mmol) i natrijum triacetoksiborohidridom (296 mg, 1,39 mmol). Smeša se meša pri 60°C tokom 2 h i zatim upari. Ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1.4-dioksanu (1.88 ml) i meša pri st tokom 2 h. Nakon evaporisanja, ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. TFA). Liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu dobije se 83 mg (50% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 4): R, = 0,50 min; MS (ESIpoz): m/z = 466 (M+H)' 'H-NMR (400 MHz. D20): 5 = 8.17 (s. IH). 7.57 (s. IH). 7.45 (s, IH), 7.01 (s, IH). 4.57 (s. 2H), 4.50 (s, 2H), 4.04 (s, 3H), 3.47-3.36 (m. 4H), 3.21-3.12 (m, 4H). 2.80 (s. 6H). 2.51 (s. 3H) ppm. Primer 38 6-|(etilamino)metill-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(pipera7in-l-ilmetil)-pirolo[2,l-f|[l,2,4]triazin-4-amin trihidrohlorid [0340| [03411Rastvor Intermedijera 25A (60 mg. 111,8 umol) u THF (1 ml) se tretira sa 2 M rastvorom etilamina u THF (83 ul. 167 umol). natrijum triacetoksiborohidridom (118 mg, 559 umol) i sirćetnom kiselinom (83 u], 167 umol). Smeša se meša pri 60°C tokom 90 min. Dodaju se daljnje količine 2 M rastvora etilamina (83 ul. 167 umol) i natrijum triacetoksiborohidrida (71 mg, 335 umol). te se mešanje pri 60°C nastavi tokom dodatna 2 h. Nakon evaporisanja. ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (3 ml) i meša pri st preko noći. Smeša se upari i ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) i liofilizuje iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu. Ponovnim prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Sunlire Cl8. 20% acetonitri 1/80% 0.02% vod. TFA) i ponovnim liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1.4-dioksanu dobije se 19 mg (29% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): R, = 0,56 min; MS (ESIpoz): m/z = 466 (M+Hf 'H-NMR (400 MHz, DjO): 6 = 8.14 (s. IH). 7.56 (s. IH). 7.45 (s. III). 7.01 (s. IH). 4.45 (s. 4H), 4.04 (s, 3H), 3.45-3.32 (m, 4H). 3.18-3.05 (m, 4H). 2.99 (q. 2H), 2.51 (s. 3H). 1.10 (t. 3H) ppm. Primer 392-(}|4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo[2,l-f]-[l,2,4jtriazin-6-il|metil}amino)etanol trihidrohlorid |0342|

[0343]Rastvor Intermedijera 25A (150 mg, 279 umol) u THF (3 ml) se tretira sa 2-aminoetanolom (84 u.1, 1,39 mmol), natrijum triacetoksiborohidridom (296 mg, 1,39 mmol) i sirćetnom kiselinom (32 ul, 559 pmol). Smeša se meša pri 60°C tokom 2 h i zatim upari. Ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (1,87 ml) i meša pri st tokom 2 h. Nakon evaporisanja, ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. TFA). Liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu dobije se 140 mg (80% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt - 0,54 min: MS (ESIpoz): m/z = 482 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DiO): 8 = 8.15 (s, III), 7.56 (s. IH). 7.45 (s. IH). 7.00 (s, IH). 4.47 (s. 2H). 4.37 (s. 2H), 4.04 (s, 3H), 3.79-3.71 (m. 2H), 3.42-3.34 (m. 4H), 3.19-3.12 (m. 2H). 3.06-2.97 (m. 4H), 2.51 (s, 3H) ppm.

Opšti postupak za reakcije reduktivne aminacije sa Intermedijerom 25A ( OPI) :

[0344J 0,1 M rastvor Intermedijera 25A u THF se tretira sa 5 ekv. odnosne aminske komponente. 5 ekv. natrijum triacetoksiborohidrida i 2 ekv. sirćetne kiseline. Nastala smeša se meša pri 60°C tokom 2 h i zatim upari. 0,15 M rastvor ostatka tako dobivenog u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu se meša pri st tokom 1-2 h. Nakon evaporisanja. ostatak se prečisti kako je opisano ispod. Primer 40 rac-l-{|4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo-(2,l-f][l,2,4]triazin-6-iljmetil}piperidin-3-ol trihidrohlorid [0345|

[0346JPrema OPI. Intermedijer 25A (150 mg, 279 umol) reaguje sa 3-hidroksipiperidinom (141 mg, 1,39 mmol). Prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. TFA) i liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu dobije se 178 mg (kvant.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,54 min; MS (ESIpoz): m/z = 522 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, D20); 5 = 8.16 (s. IH), 7.55 (s. IH). 7.45 (s. IH). 7.01 (s, 111), 4.66-4.16(m. 5H), 4.04 (s, 3H). 3.55-2.71 (m, 1 IH), 2.51 (s.3H). 1.96-1.42 (m.4H). 1.64-1.50 (m, IH) ppm.

Primer 41

l-{|4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)-7-(piperazin-l-ilmetil)piroIo|2,l-f]-[l,2,4]triazin-6-il|metil}piperidin-4-ol trihidrohlorid

[0347[

[0348JPrema OPI, Intermedijer 25A (150 mg. 279 umol) reaguje sa 4-hidroksipiperidinom (141 mg, 1,39 mmol). Prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. TFA) i liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu dobije se 162 mg (91% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 0,48 min; MS (ESIpoz): m/z - 522 (M - H)

'H-NMR (400 MHz. D20): 5 = 8.16 (s, IH), 7.58 (br. s. IH), 7.46 (s. IH). 7.01 (s. IH), 4.67-4.48 (m, 4H), 4.04 (s, 4H), 3.59-2.78 (m. 12H). 2.51 (s, 3H). 2.14-1.38 (m, 4H) ppm.

Primer 42

rac-l-{[4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-I-ilmetil)pirolo-

|2,l-f][l,2,4|triazin-6-il|metil}pirolidin-3-ol trihidrohlorid

[0349]

(0350)Prema OPI. Intermedijer 25A (150 mg. 279 umol) reaguje sa 3-hiđroksipirolidinom (113 ul. 1.39 mmol). Prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. TFA) i liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu dobije se 148 mg (85% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 0.46 min; MS (ESIpoz): m/z = 508 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, D20): S = 8.18 (s. IH), 7.58 (s, IH). 7.46 (s, IH), 7.01 (s, IH). 4.71-4.30 (m. 5H), 4.04 (s, 3H), 3.70-2.95 (m. 12H), 2.51 (s. 311). 2.32-2.14 (m, IH). 2.03-1.87 (m, 1H) ppm.

Primer 43

6-[(dietilamino)metil|-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)-piroIo[2,l-f||l,2,4|triazin-4-amin trihidrohlorid

10351]

J0352|Prema OPI, Intermedijer 25A (150 mg, 279 umol) reaguje sa dietilaminom (144 ul, 1.39 mmol). Prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/ 0.1% vod. TFA) i liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1.4-dioksanu dobije se 127 mg (69% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,55 min; MS (ESIpoz): m/z = 494 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, D20): 5 = 8.19 (s. 111). 7.61 (s. IH). 7.47 (s. IH). 7.01 (s. IH), 4.59 (s, 2H), 4.51 (s, 2H), 4.04 (s, 3H), 3.47-3.35 (m. 4H). 3.29-3.00 (m. 8H). 2.51 (s. 3H). 1.07 (t, 6H) ppm.

Primer 44

6-l(ciklobutiIamino)metil|-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)-7-(piperazin-l-ilmetil)piroIo[2,l-f|[l,2,4|triazin-4-amin trihidrohlorid

[0353J

[0354JPrema OPI, Intermedijer 25A (150 mg, 279 umol) reaguje sa ciklobutilaminom (119 ul, 1.39 mmol). Prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. TFA) i liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1.4-dioksanu dobije se 127 mg (72% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,58 min; MS (ESIpoz): m/z = 492 (M+H)'

'H-NMR (400 MHz, D20): 5 = 8.16 (s. IH). 7.59 (s, IH), 7.47 (s. IH). 7.00 (s. IH). 4.40 (s. 2H), 4.37 (s, 2H), 4.04 (s, 3FI), 3.69-3.58 (m. IH). 3.44-3.33 (m. 4H), 3.21-3.12 (m, 411). 2.51 (s, 3H), 2.02-1.87 (m. 4H). 1.81-1.62 (m, 2H) ppm.

Primer 45

5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)-6-(pirolidin-l-ilmetil)-pirolo|2,l-f||l,2,4]triazin-4-amin trihidrohlorid

103551

[0356]Prema OPI, Intermedijer 25A (150 mg. 279 umol) reaguje sa pirolidinom (116 ul. 1.39 mmol). Prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. TFA) i liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1.4-dioksanu dobije se 112 mg (64% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,54 min; MS (ESIpoz): m/z = 492 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, D20): 8 = 8.19 (s. IH). 7.60 (s. IH), 7.46 (s, IH). 7.01 (s. IH), 4.70-4.61 (m. 4H), 4.04 (s, 3H), 3.55-3.40 (m, 611). 3.35-3.26 (m. 411). 3.02-2.87 (m, 211). 2.51 (s. 3H). 1.97-1.83 (m, 4H)ppm.

Primer 46

6-|(ciklopropilamino)metil|-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo|2,l-f][l,2,4|triazin-4-amin trihidrohlorid

[0357]

[0358]Prema OPI, Intermedijer 25A (200 mg. 372 umol) reaguje sa ciklopropilaminom (129 ul, 1,86 mmol). Prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. TFA) i liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1.4-dioksanu dobije se 140 mg (62% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 5): R, = 1,42 min; MS (ESIpoz): m/z = 478 (M+H)'

'H-NMR (400 MHz, D20): 5 = 8.16 (s, IH). 7.56 (s. IH), 7.46 (s. IH). 7.01 (s. IH). 4.57 (s. 2H), 4.47 (s. 2H). 4.04 (s. 3H), 3.46-3.34 (m. 4H). 3.19-3.07 (m. 4H). 2.61-2.54 (m. IH). 2.51 (s, 3H), 0.75-0.64 (m, 4H) ppm.

Primer 47

6-{|(ciklopropilmetil)amino]metil}-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo |2,I-f| [l,2,4|triazin-4-amin trihidrohlorid

|0359]

[0360]Prema OPI, Intermedijer 25A (200 mg, 372 umol) reaguje sa ciklopropilmetilaminom (161 ul. 1,86 mmol). Prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. TFA) i liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1.4-dioksanu dobije se 163 mg (69% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0.60 min; MS (ESIpoz): m/z = 492 (M H)

1 H-NMR (400 MHz, D20): 5 = 8.14 (s, IH). 7.57 (s. IH). 7.45 (s. 1H). 7.00 (s, 1H), 4.50 (s. 2H), 4.44 (s. 2H), 4.04 (s, 3H). 3.42-3.34 (m. 4H). 3.16-3.07 (m. 4H). 2.86 (d, 2H). 2.50 (s. 3H). 0.89-0.76 (m, IH), 0.55-0.45 (m. 2H), 0.23-0.14 (m. 2H) ppm.Primer 48A</->{[4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-1-iImetiI)pirolo[2,l-f]-[l,2,4]triazin-6-il|metil}glicin trihidrohlorid [0361|

[0362|Rastvor Intermedijera 25A (161 mg. 300 umol) u THF (3.2 ml) se tretira sa2-aminosirćetnom kiselinom (112 mg, 1.5 mmol). natrijum triacetoksiborohidridom (317 mg.

1.5 mmol) i sirćetnom kiselinom (34 ul. 600 umol). Nastala smeša se meša pri 60°C tokom 2 h i zatim upari. Ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. TFA). Produkt tako dobiven se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1.4-dioksanu (2 ml) i meša pri st tokom 1 h. Nakon evaporisanja. ostatak se prečisti

preparativnom RP-HPLC (Reprosil C18. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. TFA). Naknadnim liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1.4-dioksanu dobije se 18 mg (9% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R( = 0.63 min; MS (ESIpoz):m/z =496 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz. D20): 8 = 8.14 (s. IH), 7.54 (s. IH). 7.45 (s. IH). 6.99 (s, IH). 4.42 (s. 2H), 4.36 (s. 2H). 4.03 (s. 3H). 3.64 (s. 2H). 3.42-3.33 (m, 4H>, 3.07-2.96 (m. 4H), 2.50 (s, 3H) ppm.

Primer 49

4-{|4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo-|2,l-f|

[l,2,4|triazin-6-il|metil]piperazin-2-on trihidrohlorid

[0363]

|0364|Rastvor Intermedijera 27A (220 mg, 354 umol) u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (2 ml) se meša pri st tokom 2 h. Zatim, smeša se upari ostavljajući 235 mg sirovog produkta koji se koristi u sledećem koraku bez daljnjeg prečišćavanja.

LC-MS (postupak 4): R, = 0,60 min: MS (ESIpoz): m/z = 521 (M+Hf.

Primer 50

|4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(morfolin-4-iImetiI)piroIo-[2,I-f) [ 1,2,4] triazin-6-il] metanol

[0365]

[0366]Rastvor Intermedijera 20A (500 mg, čistoća 87%. 1.28 mmol) i 4-metilenmorfolin-4-ijum hlorida (347 mg, 2,56 mmol) u DMF (28 ml) se meša pri 70°C tokom 1,5 h. Smeša se razblaži sa etil acetatom i ispere sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i zas. vod. rastvorom natrijum hlorida. Organski sloj se osuši sa magnezijum sulfatom i upari pod smanjenim pritiskom, čime se dobije 710 mg (čistoća 78%. 99% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R( = 0.65 min; MS (ESIpoz): m/z = 440 (M+Hf.

Primer 51

(35r)-3-({|4-aniino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-ii)-7-(morfolin-4-ilmetil)-pirolo[2,l-f||l,2,4]triazin-6-il|metil}amino)pirolidin-2-on

103671

)0368]Rastvor Intermedijera 33A (65 mg, 149 umol) u metanolu (2 ml) se tretira sa (J,S')-3-aminopirolidin-2-onom (45 mg, 446 umol). natrijum cijanoborohidridom (47 mg, 743 umol) i sirćetnom kiselinom (26 ul, 446 umol). Nakon mešanja pri 60°C tokom 16 h. nastala smeša se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 20-40% aeetonitri 1/0.2% vod. TFA). Produkt tako dobiven se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE, PL-HCO3MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 49 mg (63% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt = 0,71 min; MS (ESIpoz): m/z = 522 (M+H )4

'H-NMR (400 MHz, DMSO-đ„): 8 = 7.96 (s. IH). 7.66 (s. IH). 7.5-8.1 (br. s. III), 7.44 (s.

IH). 7.31 (s, IH), 6.84 (s. IH). 5.4-6.0 (br. s. IH), 3.95 (s, 3H). 3.91 (s, 2H). 3.75 (d. 2H). 3.50-3.66 (m, 4H), 3.06-3.19 (m, 3H). 2.94-3.05 (m, IH), 2.61 (t. IH). 2.45 (t, 3H). 2.38-2.44 (m,4H). 1.89-1.99 (m. IH), 1.49-1.60 (m. IH) ppm.

Primer 52

4-{[4-amino-5-(7-metoksi-5-metiI-l-benzotiofen-2-il)-7-(morfolin-4-ilmetil)pirolo-(2,l-

fj [ 1,2,4] triazin-6-il] metil} piperazin-2-on

|0369]

(0370|Rastvor Intermedijera 33A (65 mg, 149 umol) u metanolu (2 ml) se tretira sa 2-oksopiperazinom (45 mg, 446 pmol), natrijum cijanoborohidridom (47 mg, 743 umol) i sirćetnom kiselinom (26 ul, 446 umol). Nakon mešanja pri 60°C tokom 16 h. nastala smeša se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 20-40% acetonitril/0.2% vod. TLA). Produkt tako dobiven se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE, PL-HCCh MP-smola). Uložak se eluira sa metanoiom i filtrat se upari čime se dobije 41 mg (53% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,70 min; MS (ESIpoz): m/z = 522 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 7.97 (s. IH), 7.67 (br. s. IH). 7.55-8.05 (br. s. IH). 7.38 (s. IH), 7.30 (s. IH). 6.84 (s, IH), 5.29-5.88 (br. s, IH), 3.95 (s. 3H). 3.92 (s. 2H), 3.58 (s. 2H), 3.51-3.56 (m, 4H), 3.00-3.06 (m. 2H). 2.85 (s, 2H). 2.45 (s. 3H). 2.43-2.48 (m. 5H) ppm.

Primer 53

rac-l-({[4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(morfolin-4-ilmetiI)pirolo-

|2,l-f)[l,2,4|triazin-6-il]metil}amino)propan-2-ol

|03711

[0372)Rastvor Intermedijera 33A (64 mg, 146 umol) u metanolu (2 ml) se tretira sarae-1-amino-propan-2-olom (33 mg, 439 umol), natrijum cijanoborohidridom (46 mg, 731 (.imol) i sirćetnom kiselinom (25 ul, 439 umol). Nakon mešanja pri 60°C tokom 16 h. nastala smeša se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 20-40% acetonitril/0,2% vod. TFA). Produkt tako dobiven se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE. PL-HCCh MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 42 mg (57% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 5): R, = 1,63 min; MS (ESIpoz): m/z = 497 (M+H)<T>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 7.96 (s. IH), 7.47-7.92 (br. s. 1 H). 7.39 (s. IH), 7.30 (s, IH), 6.84 (s, IH), 5.36-5.92 (br. s, IH), 4.36 (d, IH). 3.95 (s. 3H). 3.90 (s. 2H). 3.64-3.75 (m. 2H), 3.49-3.61 (m, 5H), 2.45 (s. 3H), 2.39-2.47 (m. 4H). 2.31-2.38 (m. 211). 0.97 (d, 3H) ppm.

Primer 54

l-({|4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(morfolin-4-ilmetil)pirolo-[2,l-f][l,2,4|triazin-6-il]metiI}amino)-2-metiIpropan-2-ol

|03731

[0374] Rastvor Intermedijera 33A (80 mg, 183 umol) u metanolu (2 ml) se tretira sa 1-amino-2-metilpropan-2-olom (34 mg, 274 umol), natrijum cijanoborohidridom (57 mg, 914 umol) i sirćetnom kiselinom (21 ul. 366 umol). Nakon mešanja pri 60°C tokom 16 h. nastala smeša se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 20-40% acetonitril/0,2% vod. TFA). Produkt tako dobiven se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE, PL-HCCb MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i fiitrat se upari čime se dobije 29 mg (31% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,65 min: MS (ESIpoz): m/z = 511 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 7.96 (s, 1H), 7.50-8.02 (br. s. IH). 7.42 (s. 1H). 7.28 (s.

IH), 6.84 (s, IH). 5.4-6.0 (br. s. IH), 4.11 (s, IH), 3.95 (s. 311). 3.90 (s, 211). 3.70 (d. 211). 3.51-3.58 (m. 4H), 2.45 (s, 3H). 2.39-2.46 (m. 4H). 2.33 (d. 2H), 1.83-1.92 (m. IH). 1.03 (s. 6H) ppm.

Primer 55

l-(4-{[4-amino-6-(hidroksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo|2,l-fl-11,2,4]triazin-7-il jmetil} piperazin-1 -il)etanon

[0375]

[0376]Rastvor Intermedijera 20A (345 mg, 1.01 mmol) u sirćetnoj kiselini (5 ml) se tretira sa 37% vod. rastvorom formaldehida (91 u.1, 1,22 mmol) i 1-acetilpiperazinom (160 mg, 1,22 mmol). Smeša se meša pri 60°C tokom 6 h i zatim upari. Ostatak se rastvori u smeši THF/1 M vod. rastvor litijum hidroksida (1:1. 10 ml) i meša pri st tokom 2 h. Smeša se zatim kombinuje sa reakcionom smešom od 100 mg testnog izvođenja i doda se zas. vod. rastvor amonijum hlorida. Smeša se ekstrahira sa etil acetatom i organska faza se ispere sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, osuši preko magnezijum sulfata i upari pod smanjenim pritiskom čime se dobije 678 mg (čistoća 87%, 94% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt= 0,71 min; MS (ESIpoz): m/z = 481 (M+H)<4>.

Primer 56

(3/f)-3-|({7-|(4-acetiIpiperazin-l-il)metil]-4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-

il)pirolo[2,l-fj|l,2,4|triazin-6-il}metil)amino|pirolidin-2-on

(0377)

|0378]Rastvor Intermedijera 31A (80 mg, 167 umol) u metanolu (1.4 ml) se tretira sa (3R)-3-aminopirolidin-2-onom (21 mg, 251 umol), natrijum cijanoborohidridom (52 mg, 836 umol) i sirćetnom kiselinom (19 u.1, 334 umol). Nakon mešanja pri 60°C tokom 16 h. nastala smeša se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 20-40% acetonitril/0,2% vod. TFA). Produkt tako dobiven se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE, PL-HCO3 MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 46 mg (49% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,70 min; MS (ESIpoz): m/z = 563 (M~Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 - 8.42 (s, IH), 8.05 (s. IH). 7.93-8.24 (br. s. IH). 7.51 (s.

IH), 7.34 (s. IH), 6.88 (s, IH). 5.75-6.07 (br. s, IH). 4.21-4.37 (m, 2H). 4.19 <s. 2H). 4.10 (t. IH). 3.96 (s. 3H). 3.56-3.66 (m, 2H). 3.44-3.54 (m. 4H). 3.11-3.27 (m. 411). 2.47 (s. 4H). 2.16-2.25 (m, IH), 2.00 (s, 3H). 1.86-1.95 (m. IH) ppm.

Primer57

l-(4-{|4-amino-6-{[(2-hidroksi-2-metilpropil)amino|metil}-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzo-tiofen-2-il)pirolo[2,l-f] [ 1,2,4| triazin-7-il jmetil} piperazin-1 -il)etanon

[0379]

[0380]Rastvor Intermedijera 31A (80 mg. 183 umol) u metanolu (2 ml) se tretira sa 1-amino-2-metilpropan-2-olom (31 mg, 251 umol), natrijum ci janoborohidridom (53 mg, 836Umol) i sirćetnom kiselinom (19 ul, 334 umol). Nakon mešanja pri 60°C tokom 16 h, nastala smeša se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8, gradijent 20-40% acetonitril/0,2% vod. TFA). Produkt tako dobiven se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE, PL-HCO3MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 29 mg (31% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt= 0,71 min; MS (ESIpoz): m/z = 552 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d„): § = 7.96 (s, IH), 7.59-8.02 (br. s. IH). 7.42 (s. IH). 7.28 (s.

IH). 6.84 (s. IH), 5.45-5.93 (br. s. IH), 4.13 (br. s. IH). 3.95 (s. 3H), 3.93 (s. 2H). 3.71 (s. 2H). 3.37-3.44 (m. 4H). 2.45 (s. 3H), 2.32-2.43 (m. 6H). 1.97 (s. 3H), 1.03 (s, 6H) ppm.

Primer 58

4-({4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)-6-[(3-oksopiperazin-l-H)metiljpiroIo-[2,l-f}(l,2,4|triazin-7-iI}mctiI)piperazin-l-karbaIdehid formijat

|0381|

(0382|Anhidrid sirćetne kiseline (498 ul. 5,17 mmol) i mravlja kiselina (237 ul, 6.28 mmol) se mešaju prvo 2 h pri 50°C i zatim preko noći pri st. Nakon toga. smeša se razblaži sa dihlorometanom (5,1 ml) i 1.16 ml ovog rastvora se dodaju u rastvor Primera 49 (233 mg, 370 umol) u piridinu (89 ul). Nakon mešanja pri st tokom 2 h. smeša sc razblaži sa metanolom i zatim upari. Ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina) čime se dobije 77 mg (35% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 0,62 min; MS (ESIpoz): m/z = 549 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz. DMSO-df,):inter al.& = 8.14 (s. IH). 7.97 (s, 2H). 7.67 (s. IH). 7.38 (s.

IH). 7.30 (s, IH), 6.84 (s, IH), 3.96 (s. 2H), 3.95 (s. 3H). 3.58 (s. 2H). 3.04 (br. t. 2H). 2.86 (s, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.42 (br. t. 2H) ppm.

Primer 59

4-({7-|(4-acetilpiperazin-l-il)metil|-4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-bcnzotiofen-2-il)-pirolo[2,I-f|(l,2,4jtriazin-6-il}metil)piperazin-2-on

[0383]

[0384]Suspenzija Primera 49 (310 mg. 522 umol) u dihlorometan/THF (2.5:1. 9,64 ml) se tretira sa natrijum karbonatom (442 mg. 4.17 mmol) i meša pri st tokom 30 min. Doda se acetil hlorid (74 ul, 1,04 mmol) i nastala smeša se meša pri st tokom 2 h. Nakon zagasivanja sa metanolom. smeša se upari i ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) čime se dobije 133 mg (45% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0.69 min; MS (ESIpoz): m/z = 563 (M+H)<1>

'H-NMR (400 MHz, metanol-dt): & = 7.89 (s. IH). 7.30 (s, IH), 7.28 (s. IH). 6.79 (s. 111), 4.13 (s, 2H). 3.98 (s. 3H), 3.74 (s, 2H), 3.59 (t, 2H). 3.54 (t. 2H). 3.18 (t, 2H). 3.02 (s. 2H). 2.68-2.55 (ni, 6H). 2.48 (s, 3H), 2.08 (s, 3H) ppm.

Primer 60

Metil 4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-1-ilkarbonil)pirolo-

|2,l-fj[l,2,4]triazin-6-karboksiIat bis(formijat)

[0385]

[0386|U rastvor Intermedijera 28A (15 mg, 26 pmoi) u THF/metanol smeši (5:1. 180 ul). ohlađen na 0°C. doda sc (trimetilsilil)diazometan (2 M rastvor u heksanu, 15 ul. 32 umol). Nastala smeša se polako zagreje na st tokom 30 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1.4-dioksanu (0,5 mL) i meša pri st tokom 1 h. Nakon evaporisanja. ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina) čime se dobije 4.8 mg (35% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,66 min; MS (ESIpoz): m/z = 481 (M H)'

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6):inter alS = 8.17 (s. 2H), 8.38-8.23 (br. s. IH). 8.04 (s. IH). 7.43 (s, IH), 7.31 (s, IH), 6.86 (s. IH), 5.71-5.58 (br. s, IH), 3.96 (s. 3H), 3.60 (s, 3H, preklapanje sa vrhom vode), 2.46 (s. 3H) ppm.

Primer 61

5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-6-(I3 -oksazol-5-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo-|2,l-f]|l,2,4Jtriazin-4-amin trihidrohlorid

10387]

[0388jRastvor Intermedijera 25A (100 mg, 0,19 mmol) u metanolu (3.33 ml) se tretira sa (4-toluensulfonil)metilizocijanidom (36 mg, 0,19 mmol) i kalijum karbonatom (25 mg. 186 umol). Smeša se refluksuje tokom 6 h. Zatim se kombinuje sa reakcionim smešama od tri 30 mg testna izvođenja i upari. Ostatak se rastvori u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1,4-dioksanu (10 ml) i meša pri st tokom 2 h. Nakon evaporisanja. ostatak se prečisti dvostrukom preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. TFA). Daljnjim prečišćavanjem kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/metanol 5:1 sa 0,5% vod. amonijak) i liofilizovanjem iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu dobije se 75 mg (34% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 0.69 min; MS (ESIpoz): m/z = 476 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d*):inter al.6 = 8.40 (s, 1H), 8.20 (s. i H). 7.46 (s, IH). 7.35 (s.

IH), 6.96 (s. IH). 6.89 (s. IH). 3.95 (s, 3H), 2.46 (s. 3H) ppm.

Primer 62

6-(aminometil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-1-ilmetil)pirolo-[2,l-f][l,2,4[triazin-4-amin trihidrohlorid

[0389|

[0390|Suspenzija Intermedijera 29A (76 mg, 134 umol) i 10% Pd/C (60 mg) u 0,5 M rastvoru hlorovodonika u metanolu (20 ml) se meša pri st tokom 3 h pod 1 atm vodonika. Smeša se zatim profiltruje kroz dijatomejsku zemlju, filtrat se upari i ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. TFA). Produkt tako dobiven se liofilizuje iz 4 M rastvora hlorovodonika u 1,4-dioksanu čime se dobije 34 mg (46% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,55 min; MS (ESIpoz): m/z = 438 (M+H)'

'H-NMR (400 MHz, DMSO-oV):inter al.5 = 8.24 (br. s, 3H), 8.12 (s. 1H). 7.52 (s. 1H). 7.34 (s, IH). 6.89 (s, IH), 3.96 (s. 3H). 3.76-3.63 (m. IH), 3.52-3.42 (m, IH), 2.47 (s. 3H) ppm.

Primer 63

A<f->{|4-amino-5-(7-metoksi-5-metiI-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo-|2,l-f)[l,2,4|Criazin-6-il]melil}acetamid bis(trifluoroacetat)

|0391|

|0392)Rastvor Intermedijera 30A (210 mg, 362 umol) u dihlorometanu (26 ml) se tretira sa trifluorosirćetnom kiselinom (5.2 ml) i meša pri st tokom 1 h. Nakon evaporisanja pri st, ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% aeetonitril/0.1% vod. TFA) čime se dobije 163 mg (63% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 3): Rt= 2,42 min; MS (ESIpoz): m/z = 480 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz. DMSO-d*):inter al. d =9.00-8.75 (br. s, 1H). 8.30-8.16 (br. s. IH). 8.08 (s. IH). 7.38 (s, IH). 7.33 (s, IH). 6.87 (s, IH). 4.32 (br. d. 2H). 3.96 (s. 3H). 3.40-2.98 (m. 8H). 2.46 (s. 3H), 1.77 (s, 3H) ppm.

Primer 64

^-{^-amino-S^T-metoksi-S-metil-l-benzotiofen^-iO-T-fpiperazin-l-ilmetiOpirolo-^,!-f] 11,2,41triazin-6-il|metil}acetamid dihidrohlorid

|0393|

(0394]Rastvor Intermedijera 30A (80 mg. 0.14 mmol) u dihlorometanu (10 ml) i trifluorosirćetnoj kiselini (2 ml) se meša pri st tokom 1 h i zatim upari. Prečišćavanjem preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina) i liofilizovanjem iz smeše metanola i 4 M rastvora hlorovodonika u 1.4-dioksanu dobije se 39 mg (50% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 5): Rt= 1.56 min; MS (ESIpoz): m/z = 480 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz. DMSO-dć):inter al.6 = 8. i 2 (s, 1H), 7.38 (s. 1H), 7.33 (s. 1H). 6.87 (s, 1H). 4.37 (br. d. 2H). 3.96 (s, 3H), 3.85-3.20 (m. 8H. preklapanje sa vrhom vode). 2.46 (s. 3H), 1.76 (s, 3H)ppm.

Primer 65

jV-({4-amino-7-((4-formilpiperazin-I-iI)metil|-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-pirolo[2,l-f|(l,2,4|triazin-6-il}metil)acetamid formijat

[0395]

[0396]Anhidrid sirćetne kiseline (304 ul, 3,16 mmol) i mravlja kiselina (145 ul. 3,16 mmol) se mešaju prvo 2 h pri 50°C i zatim preko noći pri st. Nakon toga, smeša se razblaži sa dihlorometanom (3.1 ml) i 663 ul ovog rastvora dodaju se u rastvor Primera 63 (160 mg, 226 umol) u piridinu (54 ul). Smeša se meša pri st tokom 2 h, zatim razblaži sa metanolom (1 ml) i mešanje se nastavi pri 40°C tokom dodatnih 2 h. Nakon evaporisanja. ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) čime se dobije 74 mg (61% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 0,65 min; MS (ESIpoz):m/z= 508 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.13 (s, IH). 8.06-7.89 (m. 3H). 7.38 (s. IH), 7.31 (s.

IH). 6.85 (s, IH), 4.28 (d, 2H), 4.01-3.88 (m. 5H), 2.47-2.34 (m, 7H), 1.75 (s. 3H) ppm.

Primer 66

A</->({7-[(4-acetilpiperazin-l-iI)metiI]-4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)-pirolo|2,l-f|[l,2,4|triazin-6-il}metil)aeetamid

[0397]

[0398|Rastvor Primera 63 (110 mg, 229 umol) i acetil hlorida (32 ul. 458 umol) u THF/ dihlorometan (1:2, 3 ml) se tretira sa natrijum karbonatom (194 mg. 1.83 mmol) i meša pri st preko noći. Zatim se smeša razblaži sa metanolom (2 ml) i vodom (1 ml), te meša pri st tokom 1 h. Nakon evaporisanja, ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina). Liofilizovanjem iz 1.4-dioksana i ponovnim prečišćavanjemm kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/metanol 50:1 —+ 100% metanol) dobije se 35 mg (28% od teor.) jedinjenja iz. naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,70 min; MS (ESIpoz): m/z = 522 (M+H)"

'H-NMR (400 MHz. DMSO-d6): 8 = 8.04-7.98 (m. 2H). 7.38 (s, 1H), 7.31 (s. IH). 6.85 (s.

IH), 4.27 (d, 2H), 3.95 (s. 3H), 3.91 (s. 2H), 3.44-3.36 (m. 4H), 2.48-2.35 (m. 7H). 1.98 (s. 3H), 1.75 (s. 3H) ppm.

Primer 67

/V-({4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-[(3-oksopiperazin-l-il)metil|-pirolo[2,l-f|[l,2,4|triazin-6-iI}metil)acetamid

[0399J

[0400JSuspenzija Intermedijera 32A (35 mg, 73 pmol) u metanolu (4.1 ml) se tretira sa anhidridom sirćetne kiseline (13 ul. 146 umol) i 10% Pd/C (41 mg), te meša pri st tokom I h pod 1 atm vodonika. Filtracijom preko dijatomejske zemlje i evaporisanjem filtrata dobije se 30 mg (79% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 5): Ri= 1,65 min; MS (ESIpoz): m/z = 494 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-cU): 5 = 7.99 (s, 2H), 7.75 (br. s. IH), 7.39 (s, IH), 7.31 (s, IH), 6.85 (s, IH). 4.27 (s. IH), 4.26 (s, IH), 3.95 (s. 511). 3.19-3.08 (m. 2H). 3.05-2.96 (m. 211). 2.66-2.57 (m, 2H), 2.45 (s, 3H). 1.72 (s. 3H) ppm.

Primer 68

4-amino-6-(hidroksimetiI)-5-(7-metoksi-5-metiI-l -benzotiofen-2-il)pirolo|2,l -f]( 1,2,4|-

triazin-7-karbonitril

104011

[0402|Rastvor Intermedijera 38A (1 g, 2.08 mmol) u THF (10 ml) se tretira sa 1 M rastvorom tetra-M-butilamonijum fluorida u TFIF (12 ml, 12 mmol). Smeša se meša pri st preko noći i zatim upari. Ostatak se rastvori u vodi i ekstrahira tri puta sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se osuše preko magnezijum sulfata i upare. Ostatak se triturira u/f/V-butil metil etru i čvrsta supstanca sc ođfiltrira čime se dobije 680 mg (78% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0.95 min; MS (ESIpoz): m/z = 366 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz. DMSO-d6): 5 = 8.61-8.29 (br. s, IH). 8.18 (s, IH). 7.43 (s, IH). 7.32 (s.

IH). 6.87 (s, IH), 6.32-6.03 (br. s, IH). 5.46 (t. IH), 4.55 (d, 2H), 3.96 (s, 3H). 2.45 (s, 3H) ppm.

Primer 69

4-amino-6-(metoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-I-benzotiofen-2-il)piroIo|2,l-f|[l,2,4Jtriazin-74iarbonitriI

104031

[0404] Rastvor Primera 68 (60 mg. 164 umol) u dihlorometanu (5 ml) se tretira sa tionil hloridom (18 ul, 246 umol). Smeša se meša pri st tokom 15 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u metanolu (2 ml) i tretira sa DIPEA (57 ul. 328 umol). Smeša se meša prvo 2 h pri 60°C, zatim refluksuje preko noći i na kraju zagrejava do 150°C tokom 30 min u mikrotalasnom uređaju. Nakon toga, smeša se upari i ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. TFA). Produkt tako dobiven se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE. PL-HCO3MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 18 mg (28% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): Ri= 1.12 min; MS (ESIpoz): m/z = 379 (M II)

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d*): 6 = 8.61-8.40 (br. s. 1 Hl, 8.21 (s. 1H), 7.42 (s, 1H). 7.33 (s.

IH). 6.87 (s. IH), 6.34-6.09 (br. s. IH). 4.47 (s. 2H). 3.96 (s, 311). 3.26 (s. 3H), 2.45 (s, 3H) ppm.

Primer 70

4-amino-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metiLl-benzotiofen-2-il)pirolo(2,l-f][l,2,4|-

triazin-7-karbonitril

[0405|

[0406|Rastvor Primera 68 (60 mg. 164 umol) u dihlorometanu (5 ml) se tretira sa tionil hloridom (18 ul, 246 umol). Smeša se meša pri st tokom 15 min i zatim upari. Ostatak se rastvori u etanolu (2 ml) i tretira sa DIPEA (57 ul, 328 umol). Smeša se meša pri 60°C preko noći i zatim zagrejava do 150°C tokom 30 min u mikrotalasnom uređaju. Nakon toga. smeša se upari i ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. TFA). Produkt tako dobiven se rastvori u etanolu (2 ml) i ponovo zagrejava do 150°C tokom 30 min u mikrotalasnoj pećnici. Doda se DIPEA (57 ul. 328 umol) i zagrejavanje do 150°C u mikrotalasnoj pećnici se nastavi tokom daljnjih 30 min. Nakon evaporisanja. ostatak se prečisti kolonskom hromatografijom na silikagelu (dihlorometan/ metanol 95:5) čime se dobije 16 mg (23% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): Rt = 1,18 min; MS (ESIpoz): m/z = 393 (M-H)

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d(1): 8 = 8.61-8.38 (br. s. 1H), 8.20 (s. 1H), 7.42 (s. 1H). 7.33 (s.

IH). 6.87 (s. IH), 6.33-6.08 (br. s. IH). 4.51 (s. 2H). 3.96 (s. 3H). 3.45 (q, 2H). 2.45 (s. 3H), 1.10 (t,3H) ppm.

Primer 71

4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-6-[(3-oksopiperazin-l-il)mctil|pirolo|2,l-f)[l,2,4|triazin-7-karbonitril

(0407|

[0408|Rastvor Intermedijera 39A (20 mg. 55 umol) u THF (0.73 ml) se tretira sa sirćetnom kiselinom (6 ul, 110 umol), 2-oksopiperazinom (27 mg. 275 umol) i natrijum triacetoksiborohidridom (58 mg. 275 umol). Nakon mešanja pri st tokom 3 h, dodaju se daljnje količne THF (1 ml), sirćetne kiseline (6 ul. 110 umol). 2-oksopiperazina (27 mg. 275

umol) i natrijum triacetoksiborohidrida (58 mg, 275 umol) i mešanje pri st se nastavi preko noći. Nakon evaporisanja, ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. TFA). Produkt tako dobiven se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE. PL-HCCh MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 13 mg (52% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0.86 min; MS (F:SIpoz): m/z = 447 (M-H)

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.60-8.31 (br. s. IH). 8.19 (s. IH). 7.74 (s. IH). 7.44 (s.

IH). 7.33 (s. IH), 6.87 (s. IH). 6.25-5.98 (br. s. 111). 3.96 (s. 3H). 3.62 (s. 2H), 3.13-3.07 (m, 2H), 2.91 (s. 211). 2.45 (s. 3H) ppm.

Primer72

jV, /V-{|4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)pirolo[2,l-f|[l,2,4jtriazin-6,7-

diil]bis(metilen)}diacetamid

[0409]

[0410]Suspenzija Intermedijera 40A (sirovo. 85 mg), 10% Pd/C (115 mg) i anhidrida sirćetne kiseline (40 ul. 435 umol) u metanolu (12 ml) se meša pri st pod 1 atm vodonika. Nakon 4 h, dodaju se daljnje količine 10% Pd/C (115 mg) i anhidrida sirćetne kiseline (40 ul. 435 umol). te se mešanje pri st pod 1 atm vodonika nastavi tokom 2 h. Nastala smeša se profiltruje kroz dijatomejsku zemlju, filtrat se upari i ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. TFA). Produkt tako dobiven se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE, PL-HCO:, MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 18 mg (18% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Ri= 0,73 min; MS (ESIpoz): m/z = 452 (M+H)'

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.29 (br. t. IH). 8.04 (br. t. IH). 8.00 (s. IH), 7.34 (s, IH). 7.31 (s, IH), 6.85 (s, IH), 4.58 (d. 2H). 4.26 (d. 211). 3.95 (s. 3H), 2.45 (s, 3H). 1.81 (s. 3H), 1.74 (s. 3H)ppm.

Primer 73

2-|4-amino-6-(hidroksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l -benzotiofen-2-il)pirolo[2,1 -f] 11,2,4]-triazin-7-iI]propan-2-ol

|0411]

[0412]Boca koja sadrži suspenziju Intermedijera 43A (180 mg. 598 prnol). Intermedijera 6A (299 mg, 897 jamol) i cezijum fluorida(454 mg. 2.99 mmol) u THF/voda(10:l. 11 ml) se degasira pod smanjenim pritiskom i zatim ponovo napuni sa argonom. Doda se 4-(di-/e/v-butilfostlno)-/V'.A''-dimetilanilin-dihloropaladijum (2:1: 13 mg. 18 umol). Nastala smeša se ponovo degasira i meša pod argonom pri 50°C tokom 16 h. Nakon toga, reakciona smeša se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 30-50% acetonitril/0.2% vod. TFA). Frakcije produkta se razblaže sa 7 M rastvorom amonijaka u metanolu i zatim koncentrišu pod smanjenim pritiskom. Talog se ođfiltrira. ispere sa vodom i osušiin vacuočime se dobije 99 mg (42% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,89 min; MS (ESIpoz): m/z = 399 (M+H)<4>

'H-NMR (400 MHz. DMSO-ć*): S = 7.96<s, IH), 7.51-8.02 (br. s, IH). 7.37 (s. IH). 7.31 (s. 1 H), 6.86 (s. IH), 5.99 (s, IH), 5.23-5.82 (br. s, 1 H), 5.04 (t, IH). 4.53 (d. 2H). 3.96 (s, 3H), 2.45 (s. 3H). 1.73 (s. 6H) ppm.

Primer 74

4-{{4-amino-7-(2-hidroksipropan-2-il)-5-(7-metoksi-5-metii-1-benzotiofen-2-iI)pirolo-[2,1 -f] f 1,2,4] triazin-6-il] metil}piperazin-2-on

[0413)

[0414]Rastvor Intermedijera 44A (50 mg. 73% Čistoća. 92 umol) u metanolu (4 ml) se tretira sa 2-oksopiperazinom (28 mg. 276 umol). natrijum cijanoborohidridom (23 mg. 368 umol) i sirćetnom kiselinom (21 pl, 368 pmol). Smeša se meša prvo 18 h pri 60°C i zatim 3 dana pri st. Nakon toga, smeša se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 20-40% acetoni tri 1/0.2% vod. TFA). Frakcije produkta se razblaže sa 7 M rastvorom amonijaka u metanolu i upare pod smanjenim pritiskom. Ostatak se rastvori u etil acetatu i ispere sa vodom. Organska faza se osuši sa natrijum sulfata i koncentriše pod smanjenim pritiskom. Ostatak se rastvori u 1,4-dioksan i liofilizuje Čime se dobi je 24 mg (52% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 5): R, = 1,85 min; MS (ESIpoz): m/z = 481 (M-Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-df)): 5 = 7.99 (s, IH). 7.73-8.01 (br. s. IH). 7.41 (s. IH). 7.33 (s, IH), 6.87 (s, IH), 5.2-5.7 (br. s, IH). 3.95 (s, 3H), 3.57 (s, 2H), 3.14 (br. s. 2H), 2.60 (br. s, 4H). 2.46 (s, 3H), 1.70 (br. s, 6H) ppm.

Primer 75

|4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-metilpirolo[2,l-f||l,2,4|triazin-6-il|-metanol

[0415]

[0416]Pod atmosferom argona, boca se napuni sa 165 mg (0.64 mmol) Intermedijera 53A. 143 mg (0,64 mmol) Intermedijera 5A. 25 mg (0,03 mmol) (2'-aminobifenil-2-il)(hIoro)paladijum-dicikloheksil(2\4'.6'-triizopropilbifenil-2-il)fosfina (1:1; vidi S. L. Buchvvald et al.. J. Am. Chem. Soc. 132 (40). 14073-14075 (2010)) i 409 mg (1.93 mmol) kalijum fosfata. Zatim se dodaju 7 ml degasirane smeše 1,4-dioksana i vode (5:1). te se rastvor meša pri 70°C tokom 1 h. Dodaju se još jedna porcija Intermedijera 5A (142 mg, 0,64 mmol) i (2'-aminobifenil-2-il)(hloro)paladijum-dicikloheksil(2'.4'.6'-triizopropilbifenil-2-il)fosfina (10 mg, 0,012 mmol), te se mešanje nastavi tokom 1 h. Nakon toga. reakciona smeša se delimično upari pod smanjenim pritiskom, doda se voda i smeša se ekstrahira sa etil acetatom. Kombinovane organske faze se upare pod smanjenim pritiskom i ostatak se triturira sa acetonitrilom. Talog se ođfiltrira i osušiin vacuočime se dobi je 180 mg (92% čistoća sa LC-MS. 73% od teor.) jedinjenja iz naslova. Druga sarža se dobije iz filtrata (41 mg, 18% od teor.) preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina). Ukupni prinos: 91% od teor.

LC-MS (postupak 5): Rt = 1,92 min; MS (ESIpoz): m/z = 355 < VI I I)

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 7.95 (s, IH). 7.35 (s. IH). 7.30 (s. IH). 6.83 (s. IH). 4.82 (t. IH). 4.44 (d, 2H). 3.95 (s, 3H), 2.45 (s. 3H) ppm.

Primer 76

4-{14-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-metilpirolo|2,l-f||l,2,4]triazin-6-

iI|metil}piperazin-2-on

|0417|

|0418JSuspenzija 55 mg (0,16 mmol) Intermedijera 54A u THF (1.5 ml) se tretira sa 78 mg (0,78 mmol) piperazin-2-ona, 18 ul (0.31 mmol) sirćetne kiseline i 166 mg (0,78 mmol) triacetoksiborohidrida. Smeša se meša pri ambijentalnoj temperaturi preko noći. Zatim se dodaju 1.5 ml vode i većina THF rastvarača se upari pod smanjenim pritiskom. Preostala smeša se razblaži sa još vode i istaložena čvrsta supstanca se ođfiltrira, te osuši (35 mg). Ovaj materijal se dalje prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina). Frakcije produkta se podese na pH 9 sa čvrstim kalijum karbonatom i delimično koncentrišu pod smanjenim pritiskom. Istaložena čvrsta supstanca se ođfiltrira i osuši pri 45°Cin vacuoda se dobije 16 mg (24% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 5): R, = 1.74 min: MS (ESIpoz):m/z= 437 (M+H)'

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 7.95 (s. IH), 7.66 (br. s, IH). 7.35 (s, IH). 7.30 (s. IH). 6.83 (s, IH). 3.95 (s. 3H), 3.50 (s, 2H). 3.05 (m, 211). 2.84 (s. 2H), 2.45 (m. 511) ppm.

Primer77

l-({[4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)-7-metilpirolo|2,l-f||t,2,4|triazin-6-il|metil}amino)-2-metilpropan-2-ol formijat

[0419]

[0420]Suspenzija 55 mg (0,16 mmol) Intermedijera 54A u THF (1,5 ml) se tretira sa 98 mg (0,78 mmol) l-amino-2-metilpropan-2-ol hidrohlorida, 39 mg (0,47 mmol) natrijum acetata i 166 mg (0.78 mmol) natrijum triacetoksiborohidrida. Smeša se meša pri ambijentalnoj temperaturi preko noći. Zatim se doda 1.5 ml vode i smeša se upari pod smanjenim pritiskom. Ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) da se dobije 38 mg (52% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 5): Rt = 1.68 min; MS (ESIpoz): m/z = 426 (M'H)

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 6 = 8.19 (s, IH), 7.94 (s, IH). 7.38 (s. IH). 7.29 (s. IH). 6.84 (s. 1H). 3.95 (s, 3H). 2.45 (s. 3H), 2.34 (s. 211). i .02 (s. 6H) ppm.

Primer 78

l-({|4-amino-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-metiIpirolo|2,l-fI|l,2,4Jtriazin-6-il|metil}amino)-2-metilpropan-2-ol

10421]

[0422]Rastvor 29 mg (0,06 mmol) Primera 77 u 3 ml metanola se propusti kroz Stratospheres SPE PL-HCCbMP-smola uložak, prethodno kondicionisan sa 2 ml metanola. Uložak se ispere sa 4 ml metanola i eluat se upari da se dobije 21,5 mg (82% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): Rt = 0,68 min; MS (ESIpoz): m/z - 426 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 6 = 7.94 (s, IH), 7.37 (s, IH). 7.28 (s. IH). 6.83 (s. IH). 4.07 (s, IH). 3.95 (s, 3H), 3.63-3.75 (m. 2H). 2.45 (s. 3H). 2.32 (m, 3H), 1.42-1.56 (m, IH), 1.02 (s, 6H) ppm.

Primer 79

|4-amino-7-hIoro-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)piroIo[2,l-f|[(l,2,4[triazin-6-

il]-metanol

[0423[

[0424| Rastvor Intermedijera 48A (117 mg, 0,24 mmol) u 5 ml THF se tretira sa 5 ml konc. hlorovodonične kiseline i meša pri ambijentalnoj temperaturi preko noći. Zatim se dodaju 12 ml 5 M vod. rastvora natrijum hidroksida. kao i etil acetat, slojevi se razdvoje i vodeni sloj se ekstrahira dvaput sa etil acetatom. Kombinovane organske laže se isperu sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida. osuše i upare. Ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8, gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) da se dobije 30 mg (34% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): R, = 0,90 min; MS (ESIpoz): m/z = 375 (M+Hf 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 8.04 (s. IH). 7.43 (s. IH). 7.32 (s. 111). 6.85 (s, IH). 5.02 (t. IH). 4.43 (d, 2H), 3.96 (s, 3H), 2.45 (s. 3H) ppm. 9.2 mg (10% od teor.) 7-hioro-6-(hIorometil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-pirolo[2.1-f|[1.2,4]triazin-4-amin se izoluju kao nusprodukt (upor. Intermedijer 50A). Primer 80 4-{l4-amino-7-hloro-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-iI)pirolo[2,l-f|[1,2,4|triazin-6-il]metil}piperazin-2-on[0425|

[0426]Jedinjenje iz naslova se pripremi prema postupku za Primer 76 počevši od 40 mg (0.11 mmol) Intermedijera 49A. Prinos: 27 mg (55% od teor.).

LC-MS (postupak 2): R, = 0,86 min; MS (ESIpoz): m/z = 457 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 8.05 (s. 1H), 7.68 (br. s. IH), 7.44 (s, 1H). 7.31 (s, 1H). 6.85 (s, IH), 3.96 (s, 3H), 3.52 (s, 2H). 3.05 (br. s, 2H). 2.86 (s. 2H). 2.45 (s. 3H) ppm.

Primer 81

l-({[4-amino-7-hloro-5-(7-metoksi-5-metil4-benzotiofen-2-il)pirolol24-flll,2,4]triazin-6-il|metil}amino)-2-metilpropan-2-oI formijat

[0427|

[0428JJedinjenje iz naslova se pripremi prema postupku za Primer 77 počevši od 40 mg (0,11 mmol) Intermedijera 49A. Prinos: 24 mg (45% od teor.).

LC-MS (postupak 2): R, = 0.73 min; MS (ESIpoz): m/z = 446 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz. DMSO-d6): 8 = 8.15 (s. IH). 8.04 (s, IH), 7.45 (s, IH), 7.30 (s. 1H), 6.85 (s,IH),3.96 (s, 3H), 3.73 (s, 2H), 2.45 (s, 3H). 2.32 (s. 2H). 1.00 (s, 6H) ppm.

Primer 82

l-({[4-amino-7-hloro-5-(7-metoksi-5-meUl-l-benzodofen-2-il)pirolo[2,1-f]Jl,2,4|triazin-6-il[metil}amino)-2-metilpropan-2-ol

[04291

[0430]Jedinjenje iz naslova se pripremi iz Primera 81 prema postupku za Primer 78. LC-MS (postupak 2): R, = 0,72 min; MS (ESIpoz): m/z = 446 (M+H)<1>

'H-NMR (400 MHz. DMSO-d6): 5 = 8.04 (s. IH). 7.45 (s. IH), 7.30 (s. IH), 6.85 (s. IH), 4.09 (br. s. IH). 3.95 (s,3H), 3.71 (s, 2H), 2.45 (s. 3H).2.31 (s.2H). 1.44-1.64 (m, IH). 1.00 (s, 6H) ppm.

Primer 83

7-hIoro-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-f][l,2,4|-

triazin-4-amin

[0431]

[0432|8,2 mg (0,02 mmol) Intermedijera 50A se suspenzuje u 1 ml etanola, tretira sa 41 u!

(0,11 mmol) 2,68 M rastvora natrijum etanolata u etanolu i refluksuje tokom 1 min. Bistri rastvor se zatim upari i sirovi produkt se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil C18, gradijent 10-95% acetonitril/0,1% vod. mravlja kiselina) da se dobije 5 mg (56% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): Rt = 1,25 min; MS (ESIpoz): m/z = 402 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.06 (s, IH), 7.40 (s. IH), 7.32 (s. lH).6.86(s, IH). 4.40 (s, 2H). 3.96 (s. 3H). 3.40 (q. 2H), 2.45 (s. 3H). 1.06 (t. 3H) ppm.

Primer 84

5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-6-metil-7-(piperazin-l-ilmetil)piroIo|2,l-fj-[l,2,4|triazin-4-amin formi jat

[0433]

[0434|Rastvor Intermedijera 57A (100 mg. 191 umol) u 4 M rastvoru hlorovodonika u 1.4-dioksanu (2 ml) se meša pri st tokom 3 h i zatim upari. Prečišćavanjem dvostrukom preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. mravlja kiselina) dobije se 71 mg (67% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,81 min; MS (ESIpoz): m/z = 423 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, CDCb): 5 = 8.46 (br. s, IH). 7.89 (s. 1 H). 7.27 (s. IH. preklapanje sa CHCb vrhom). 7.18 (s, IH). 6.67 (s, IH). 4.01 (s. 3H), 3.97 (s. 2H). 3.18-3.09 (m. 4H). 2.82-2.73 (m, 4H), 2.50 (s. 3H). 2.24 (s. 3H) ppm.

Primer 85

6-hIoro-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)-7-(piperazin-l-ilmetil)pirolo[2,l-f|-[ 1,2,4] triazin-4-amin trihidrohlorid

[0435]

[0436]Intermedijer 60A (65 mg, 0,12 mmol) se meša u 1 ml 4 M rastvora hlorovodonika u 1 .4-dioksanu tokom 2 h pri st. Suspenzija se upari do suva i sirovi produkt se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 10-95% acetonitril/0.1% vod. hlorovodonična kiselina) čime se dobije 49 mg (74% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt= 0,81 min; MS (ESIpoz): m/z = 443 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-dft):inter al.5 = 9.56 (br. s, IH). 8.45 (br. s. IH). 8.19 (s. IH). 7.44 (s, IH), 7.36 (s, IH), 6.89 (s, IH), 6.30 (br. s, IH), 4.63 (br. s. IH), 3.40 (br. s. 8H). 2.46 (s, 3H) ppm.

Primer 86

|4-amino-6-(etoksimetiI)-5-(7-metoksi-5-metiI-l-benzotiofen-2-il)pirolo|2,I-f]|l,2,4|-

triazin-7-il|metanoI

|0437)

[0438]Jedinjenje iz naslova (360 mg) se dobije kao nusprodukt u pripremi Primera 5 postupkom pripreme I.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,99 min; MS (ESIpoz):m/z= 399 ( M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-uV): 6 = 8.09-7.72 (br. s. IH). 7.99 (s, IH). 7.35 (s. IH). 7.31 (s, IH), 6.84(s, IH). 6.05-5.48 (br. s. IH). 5.04 (br. s, IH). 4.81 (d, 2H). 4.47 (s. 2H). 3.96 (s, 3H), 3.39 (q, 3H), 2.45 (s, 3H). 1.05 (t, 3H) ppm.

Primer 87

l-{[4-amino-6-(ctoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)piroIo|2,l-fl|I,2,4jtriazin-7-i) ] metil} i midazoHd in-2-on

[0439J

[0440]Suspenzija Intermedijera 63A (100 mg. 0.221 mmol) u THF (5 ml) se tretira sa imidazolidin-2-onom (57 mg, 0,662 mmol) i A'.A-diizopropiletilaminom (153 ul. 0.926 mmol) i smeša se zagrejava do 150°C tokom 90 min u mikrotalasnoj pećnici. Nakon toga. reakciona smeša se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 40-60% acetonitril/0,2% vod. trifluorosirćetna kiselina). Produkt tako dobiven se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE. PL-HCCb MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari. Produkt se prečisti još jednom preparativnom tankoslojnom hromatografijom preko silikagela (cikloheksan/etil acetat 3:1) čime se dobije 24 mg (22% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0,99 min: MS (ESIpoz): m/z = 467 (M+H)

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.21-7.65 (br. s. IH), 7.99 (s, IH). 7.36 (s, IH). 7.31 (s, IH), 6.84 (s. IH), 6.38 (s, IH), 6.04-5.56 (br. s. 1H), 4.65 (s. 211), 4.46 (s, 2H). 3.95 (s, 3H). 3.38 (q, 2H), 3.31-3.10 (m, 4H), 2.45 (s. 3H), 1.06 (t. 3H) ppm.

Primer 88

4-{[4-amino-5-(7-metoksi-l-benzotiofen-2-il)-6-(metoksimetil)pirolo[2,l-f]|l,2,4]triazin-7-iI]metil}piperazin-2-on

[0441|

[0442JU rastvor Intermedijera 62A (72,6 mg, 197 umol), (7-metoksi-l-benzotiofen-2-il)boronske kiseline (45 mg, 216 umol) i cezijum fluorida (149 mg, 983 umol) u degasiranom THF/voda (10:1. 2.2 ml) pod argonom se doda (2'-aminobifenil-2-il)(hloro)paladijum-dicikloheksil(2'.4,,6'-triizo-propilbifenil-2-il)fosfin (1:1; 7.7 mg, 9,8 umol: vidi S. L. Buchvvald et al.. J. Am. Chem. Soc. 132 (40), 14073-14075 (2010)). Nastala smeša se ponovo degasira i meša pod argonom pri 60°C tokom 3 h. Nakon toga, smeša se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8. gradijent 20-40% acetonitril/0.1% vod. TFA). Frakcije produkta se kombinuju i upare do suva. Ostatak se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE, PL-HCOj MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 31 mg (35% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): R, = 0,71 min; MS (ESIpoz): m/z = 453 (M+Hf 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d*): 5 = 8.00 (s. IH). 7.72 (s. IH). 7.61-8.23 (br. s. IH). 7.51 (d, IH). 7.46 (s, IH). 7.40 (t, IH), 6.99 (d, IH). 5.57-6.11 (br. s. IH), 4.42 (s, 2H). 3.98 (s. 5H), 3.20 (s. 3H), 3.11 (br. m, 2H), 3.01 (s. 2H), 2.62-2.67 (m. 211) ppm. Primer 89 4-{[4-amino-6-(metoksimetil)-5-(5-metil-l-benzotiofen-2-il)piroIo|2,l-fj[l,2,4|triazin-7-il|metil}piperazin-2-on |0443]

[0444]U rastvor Intermedijera 62A (50 mg, 135 umol), (5-metil-l-benzotiofen-2-il)boronske kiseline (28,6 mg, 149 umol) i cezijum fluorida (103 mg, 677 umol) u degasiranom THF/voda (10:1, 4,4 ml) pod argonom se doda (2'-aminobifenil-2-iI)(hloro)paladijum-dicikloheksil(2'.4',6'-triizopropilbifenil-2-il)fosfin (1:1: 5.3 mg, 6.8 umol; vidi S. L. Buchwald et al.. J. Am. Chem. Soc. 132 (40). 14073-14075 (2010)). Nastala smeša se ponovo degasira i meša pod argonom pri 60°C tokom 16 h. Nakon toga, smeša se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 30-50% acetonitril/0.1% vod. TFA). Frakcije produkta se kombinuju i upare do suva. Ostatak se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (StratoSpheres SPE, PL-HCO3MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 27 mg (45% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): R, = 0,79 min; MS (ESIpoz): m/z = 437 (M-H)

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.00 (s. III), 7.89 (d, 1II). 7.73 (s. III), 7.71 (s. III). 7.58-8.18 (br. s, IH), 7.40 (s, IH), 7.24 (dd. IH), 5.58-6.03 (m, IH), 4.42 (s, 2H), 3.97 (s, 2H), 3.21 (s. 3H), 3.11 (br. t. 2H). 3.01 (s. 2H). 2.64 (t. 2H). 2.44 (s, 3H) ppm.

Primer 90

1-[4-amino-6-(etoksimetiI)-5-(7-metoksi-5-metil-I-benzotiofen-2-il)pirolo[2,1-f| [ 1,2,4]-triazin-7-il] etanol

[0445]

[0446]Pod argonom, 1 M rastvor metiImagnezijum bromida u THF (630 ul. 630 umol) se doda kapajući pri st u rastvor Intermedijera 17A (100 mg, 252 mol) u THF (10 ml). Smeša se meša pri st tokom 3 h i zatim tretira sa još jednom porcijom metilmagnezijum bromida u THF (177 ul. 177 pmol). Reakciona smeša se meša tokom daljnjih 16 h. zatim zagasi sa zas. vod. rastvorom amonijum hlorida i ekstrahira sa etil acetatom. Kombinovani organski slojevi se isperu sa rastvorom soli, osuše sa magnezijum sulfatom, profil truju i upare. Ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 40-60% acetonitril/0.1% vod. TFA). Frakcije produkta se razblaže sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i ekstrahiraju sa etil acetatom. Organska faza se ispere sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida. osuši sa magnezijum sulfatom, profiltruje i upari čime se dobije 39 mg (36% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 1,07 min; MS (ESIpoz):m/z= 413 (M+Hf

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 7.95 (s. IH). 7.56-8.07 (br. s. IH). 7.35 (s. IH). 7.31 (s.

IH), 6.84 (s, IH). 5.46-5.54 (m, IH), 5.37-5.95 (br. s. IH), 5.26 (d. IH). 4.67 (d. IH), 4.38 (d, IH), 3.95 (s, 3H), 3.38 (q. 2H). 2.45 (s. 3H). 1.52 (d. 3H). 1.05 (t. 3H) ppm.

Primer 91

[4-amino-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-1-benzotiofen-2-il)piroIo[2,l-f||l,2,4]-triazin-7-iI](ciklopropil)metanoI

I0447J

[0448)Pod argonom, 0.5 M rastvor ciklopropilmagnezijum bromida u THF (1,26 ml. 630 umol) se doda kapajući pri st u rastvor Intermedijera 17A (100 mg. 252 umol) u THF (5 ml). Smeša se meša pri st tokom 1 h, zatim zagasi sa zas. vod. rastvorom amonijum hlorida i ekstrahira sa etil acetatom. Kombinovani organski slojevi se isperu sa rastvorom soli. osuše sa magnezijum sulfatom, profiltruju i upare. Ostatak se prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 50-70% acetonitril/0.1% vod. TFA). Frakcije produkta se razblaže sa zas. vod. rastvorom natrijum hidrogenkarbonata i ekstrahiraju sa etil acetatom. Organska faza se ispere sa zas. vod. rastvorom natrijum hlorida, osuši sa magnezijum sulfatom, profiltruje i upari čime se dobije 10 mg (10% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt = 1,13 min; MS (ESIpoz): m/z = 439 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 7.94 (s. IH). 7.68-8.04 (br. s. IH). 7.36 (s. IH). 7.31 (s.

IH), 6.84 (s. IH), 5.47-5.89 (br. s. IH), 5.30 (d. 1H), 4.64 (d, IH), 4.59-4.67 (m. 1H). 4.39 (d. IH), 3.96 (s, 3H). 3.38 (q. 2H), 2.45 (s, 3H). 1.54-1.64 (m. IH). 1.04 (t, 3H), 0.51-0.59 (m. IH), 0.40-0.47 (m. IH). 0.28-0.38 (m, 2H) ppm.

Primer 92

(35)-3-({(4-amino-6-(metoksimetil)-5-(7-m [l,2,4]triazin-7-il] metil} amino)pirolidin-2-on

(0449|

[0450]Suspenzija Intermedijera 13A (100 mg. 0.233 mmol) u THF {2 ml) se tretira sa( S)- 3-aminopirolidin-2-onom (35 mg, 0.349 mmol), natrijum triacetoksiborohidridom (148 mg, 0.698 mmol) i sirćetnom kiselinom (26,6 ul, 0,465 mmol). Nastala smeša se meša pri st tokom 3 h i zatim direktno prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 40-60% acetonitril/0,2% vod. trifluorosirćetna kiselina). Frakcije produkta se kombinuju i upare do suva. Ostatak se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE, PL-HCO3MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 56 mg (51% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): Rt = 0,72 min; MS (ESIpoz):m/z= 467 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 = 8.01 (s. IH). 7.76 (s. IH). 7.35 (s. IH). 7.31 (s. IH). 6.85 (s, IH), 4.48 (d, 2H), 4.43 (d, 2H), 4.24-4.02 (m. 211), 3.96 (s. 311), 3.26-2.99 (m. 611), 2.45 (s, 3H), 2.40-2.27 (m, IH), 1.82-1.64 (m, 1H) ppm.

Primer 93

(35)-3-({[4-amino-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-mctil-l-benzotiofen-2-il)pirolo|2,I-f]-[1,2,4]triazin-7-il]metil} amino)pirolidin-2-on

[0451]

(0452]Suspenzija Intermedijera 17A (100 mg. 0.252 mmol) u THF (2 mi) se tretira sa (.S>3-aminopirolidin-2-onom (38 mg, 378 pmol). natrijum triacetoksiborohiđridom (i60 mg, 757 jimol) i sirćetnom kiselinom (30 ul, 504 pmol). Nastala smeša se meša pri st tokom 3 h i zatim direktno prečisti preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 30-50% acetonitril/0,2% vod. trifluorosirćetna kiselina). Frakcije produkta se kombinuju i upare do suva. Ostatak se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE. PL-HCOjMP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 84 mg (69% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 4): R, = 0,75 min; MS (ESIpoz): m/z = 481 (M+H)'

'H-NMR (400 MHz. DMSO-dc): 5 = 8.00 (s. 111). 7.75 (s. HI). 7.67-8.11 (br. s. 111). 7.35 (s.

IH), 7.31 (s, IH), 6.85 (s. 1H). 5.5-6.0 (br. s. I H). 4.44 (q, 211). 4.14-4.21 (m. 1H). 4.02-4.11 (m, IH). 3.38-3.45 (q. 2H), 3.16-3.24 (m. IH), 3.05-3.16<m. 2H). 2.45 (s, 3H). 2.31-2.40 (m. IH), 1.67-1.79(m. IH), 1.08 (t.3H)ppm.

Opšti postupak za pripremu Primera 94- 105 u Tabeli I:

|0453]0.13 M suspenzije Intermedijera 17A u THF se tretira sa 1.5 ekv. odnosne aminske komponente. 3 ekv. natrijum triacetoksiborohidrida i 1.5 ekv. sirćetne kiseline. Nastala smeša se meša pri 60°C tokom 3-20 h. Nakon toga. prečišćavanje se izvodi prema navedenim postupcima.

Primer 106 4-amino-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-I-benzotiofen-2-il)-A<f->((3/f)-2-oksopirolidin-3-illpirolo[2,l-fj[l,2,4]triazin-7-karhoksamid 104541

(04551Rastvor kojeg se meša Intermedijera 64A {50 mg. 121 umol) u DMF {2 ml) se tretira pri st sa A'-[( l//-benzotriazol-l-iloksi)(dimetilamino)rnetilen]-.¥-metilmetanaminijum tetrafluoroboratom (TBTU) (43 mg, 133 umol) i DIPEA (53 ul, 303 umol). Nakon 15 min. doda se (3/f)-3-aminopirolidin-2-on (24 mg. 242 umol) i nastala smeša se meša pri st tokom daljnjih 2 h. Nakon toga, smeša se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 30-50% acetonitril/0,2% vod. trifluorosirćetna kiselina). Frakcije produkta se kombinuju i upare do suva. Ostatak se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE, PL-HCO?MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 36 mg (60% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): R, = 0.91 min; MS (ESIpoz): m/z = 495 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-de): 6 = 9.50 (d. IH). 8.21-8.45 (br. s. IH), 8.17 (s, IH), 7.97 (s, IH). 7.41 (s, IH). 7.33 (s, IH), 6.86 (s. IH). 5.84-6.09 (br. s. IH), 4.74 (dd, 2H). 4.47-4.56 (m, IH), 3.96 (s, 3H), 3.37 (q, 2H). 3.22-3.29 (m, 2H). 2.54-2.61 (m, IH). 2.46 (s. 3H). 1.90-2.03 (m. IH), 1.00 (t, 3H) ppm.

Primer 107

4-{[4-amino-6-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo|2,l-f)[ 1,2,4]-triazin-7-il]karbonil}piperazin-2-on

[0456]

[0457|Rastvor kojeg se meša Intermedijera 64A (50 mg, 121 umol) u DMF (2 ml) se tretira pri st sa TBTU (43 mg, 133 umol) i DIPEA (53 ul, 303 umol). Nakon 15 min. doda se piperazin-2-on (24 mg. 242 umol) i nastala smeša se meša pri st tokom daljnjih 16 h. Nakon toga, smeša se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl 8, gradijent 40-60% acetonitril/0,2% vod. trifluorosirćetna kiselina). Frakcije produkta se kombinuju i upare do suva. Ostatak se rastvori u metanolu i profiltruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE. PL-HCOi MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 45 mg (68% od teor.) jedinjenja iz naslova.

LC-MS (postupak 2): Rt = 0,92 min; MS (ESIpoz):m/z= 495 (M H)

'H-NMR (400 MHz. DMSO-d6): 6 = 8.14 (br. s. IH), 7.99-8.01 (m. IH), 7.9-8.3 (br. s. IH). 7.41 (d, IH), 7.32 (s, IH), 6.86 (s, IH), 5.78-6.05 (br. s. IH). 4.30-4.49 (m. 2H). 4.13-4.23 (m, IH), 4.03-4.10 (m, IH). 3.96 (s, 3H), 3.76-3.87 (m, IH), 3.57-3.74 (m, IH). 3.35-3.43 (m, 2H), 3.14-3.25 (m, IH), 2.45 (s, 3H). 0.96-1.05 (m. 3H) ppm.

Opšti postupak za pripremu Primera 108- 123 u Tabeli 11:

[0458]0,13 M rastvor Intermedijera 64A u DMF se tretira sa 1.1 ekv. TBTU i 2,5 ekv. DIPEA. te meša pri st tokom 15 min. Dodaju se 2 ekv. odnosnog amina i nastala smeša se meša pri st tokom daljnjih 18 h. Nakon toga, prečišćavanje se izvodi prema navedenim postupcima.

Primer 124

4-{[4-amino-5-(5,7-dimetoksi-l-benzotiofen-2-il)-6-(metoksimetil)pirolo(2,1-f|(l,2,4|-triazin-7-il|metil}piperazin-2-on

(0459]

[0460]U rastvor Intermedijera 62A (100 mg, 271 umol). Intermedijera 66A (77 mg, 325 umol) i cezijum fluorida (206 mg, 1.35 mmol) u degasiranom THF/voda (10:1; 5 ml) pod argonom se doda (2'-aminobifenil-2-il)(hloro)paladijum-dicikloheksil(2'.4',6'-triizopropilbifenil-2-il)fosfin (1:1; 42,6 mg, 54 umol; vidi S. L. Buchvvald et al., J. Am. Chem. Soc. 132 (40), 14073-14075 (2010)). Nastala smeša se ponovo degasira i meša pod argonom pri 60°C tokom 6 h. Zatim se doda još jedna porcija Intermedijera 66A (39 mg, 162 umol) i mešanje pri 60°C se nastavi tokom 10 h. Nakon toga, reakciona smeša se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 30-50% acetonitril/0.1% vod. TFA). Frakcije produkta se kombinuju i upare do suva. Ostatak se rastvori u metanolu i protiItruje kroz uložak za izmenu anjona (Stratospheres SPE, PL-HCO3MP-smola). Uložak se eluira sa metanolom i filtrat se upari čime se dobije 40 mg (28% od teor.) jedinjenja iz naslova. LC-MS (postupak 2): Rt= 0,78 min; MS (ESIpoz):m/z= 483 (M+H)<+>

'H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): 5 = 7.99 (s, IH), 7.68 (br. s, IH). 7.49-8.17 (br. s. IH). 7.37 (s, IH). 7.05 (d. IH), 6.63 (d, IH), 5.5-6.0 (br. s, IH), 4.42 (s. 2H), 3.97 (s, 2H). 3.94 (s. 3H), 3.84 (s. 3H), 3.20 (s, 3H). 3.09-3.14 (m. 211), 3.01 (s, 2H), 2.62-2.67 (m. 2H) ppm.

Primer 125

4-{[4-amino-7-(hidroksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)piroIo|2,l-f)[l,2,4|-triazin-6-iI|metil}piperazin-2-on

[0461)

[0462|U suspenziju Intermedijera 70A (700 mg. 1,49 mmol). Intermedijera 5A (497 mg. 2.24 mmol) i cezijum fluorida (1,36 g, 8,95 mmol) u degasiranom THF/voda (2:1. 90 ml) pod argonom se doda (2'-aminobifenil-2-il)(h!oro)paladijum-dicikloheksil(2',4'.6<f->triizopropilbifenil-2-il)fosfin (1:1; 117 mg, 0,149 mmol; vidi S. L. Buchvvald et al., J. Am. Chem. Soc. 132 (40), 14073-14075 (2010)). Nastala smeša se ponovo degasira i meša pod argonom pri 60°C preko noći. Dodaju se još jedna porcija Intermedijera 5 A (231 mg, 1.04 mmol) i (2'-aminobifenil-2-il)-(hloro)paIadijum-dicikloheksil(2'.4',6'-triizopropilbifenil-2-il)fosfina (1:1; 117 mg, 0.149 mmol). te se mešanje nastavi pri 60°C tokom 3 h. Talog se ođfiltrira. ispere sa THF i osušiin vacuo.Čvrsta supstanca se suspenzuje u smeši DMF i 1 M vod. trifluorosirćetne kiseline, te profiltruje. Filtrat se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 20-40% acetonitril/0,2% vod. trifluorosirćetna kiselina). Frakcije produkta se kombinuju i zatim alkalizuju dodavanjem zas. vod. rastvora natrijum bikarbonata. Rastvor se ekstrahira sa etil acetatom, te se organski sloj ispere sa rastvorom soli, osuši preko magnezijum sulfata i upari da se dobije 88 mg jedinjenja iz naslova (13% od teor.).

LC-MS (postupak 2): R, = 0,70 min; MS (ESIpoz):m/z= 453 (M+H)<4>

'H-NMR (400 MHz. DMSO-d6):inter al. & =7.6-8.0 (br. s. IH). 7.98 (s. IH). 7.71 (s. IH). 7.37 (s. IH), 7.31 (s, IH), 6.84 (s, IH), 5.4-5.8 (br. s. IH), 5.19 (t. IH), 4.85 (d, 2H), 3.95 (s. 3H), 3.58 (s, 2H). 3.04 (br. m, 2H). 2.88 (s. 2H). 2.45 (s. 3H) ppm.

Primer 126

4-{[4-amino-7-(metoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-f|-[ 1,2,4) triazin-6-il] metil} piperazin-2-on

[0463)

[0464)Suspenzija Primera 125 (88 mg. 194 umol) u dihlorometanu (5 ml) se tretira sa tionil hloridom (29 ul. 389 umol) i smeša se meša pri st tokom 65 min. Doda se još jedna porcija tionil hlorida (29 ul, 389 umol) i mešanje se nastavi tokom 1.5 h. Zatim se doda višak metanola, nakon čega sledi dodavanje kapajući 5.4 M rastvora natrijum metilata u metanolu (84 mg, 1.56 mmol) dok se ne dostigne pH 8. Nakon mešanja tokom 3 dana. isparljive supstance se upare pod smanjenim pritiskom i ostatak se razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8, gradijent 20-40% acetonitril/0,2% vod. trifluorosirćetna kiselina). Frakcije produkta se upare da se dobije 19 mg jedinjenja iz naslova (21% od teor. ).

LC-MS (postupak 2): R, = 0,77 min; MS (ESIpoz): m/z = 466 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz. DMSO-d6): 5 = 7.99 (s, IH). 7.75-8.11 (br. s, IH). 7.68 (s. IH). 7.38 (s.

IH), 7.31 (s. IH), 6.84 (s. IH), 5.51-5.82 (m. IH). 4.77 (s, 211). 3.95 (s. 3H). 3.55 (s. 2H), 3.31 (s, 3H), 3.04 (br. s, 2H). 2.85 (s. 2H), 2.42-2.48 (m, 5H) ppm.

Primer 127

4-{[4-amino-7-(etoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-f][|l,2,4jtriazin-6-il]metil}piperazin-2-on

[0465]

[0466]Suspenzija Primera 125 (100 mg. 221 umol) u dihlorometanu (10 ml) se tretira sa tionil hloridom (161 ul, 2,21 mmol) i smeša se meša pri st tokom 30 min. Doda se etanol i isparljive supstance se upare pod smanjenim pritiskom. Ostatak se rastvori u etanolu (10 ml), doda se natrijum etilat (30 mg, 442 umol) i smeša se meša pri st tokom 1 h. Smeša se zatim direktno razdvoji preparativnom RP-HPLC (Reprosil Cl8. gradijent 20-40% acetonitril/0,2% vod. trifluorosirćetna kiselina). Frakcije produkta se kombinuju i alkalizuju dodavanjem zas. vod. rastvor natrijum bikarbonata. Rastvor se ekstrahira sa etil acetatom. te se organski sloj ispere sa rastvorom soli, osuši preko magnezijum sulfata i upari da se dobije 57 mg jedinjenja iz naslova (54% od teor.).

LC-MS (postupak 2): Ri= 0.85 min; MS (ESIpoz): m/z = 480 (M+H)<+>

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 = 7.99 (s, IH), 7.75-8.09 (br. s, I H). 7.64-7.71 (m, 1II). 7.38 (s. IH). 7.31 (s, IH), 6.84 (s, IH), 5.38-5.91 (br. s, I H), 4.81 (s, 2H), 3.95 (s. 3H), 3.49-3.59 (m, 4H), 2.99-3.08 (m, 2H), 2.86 (s, 2H), 1.12 (t. 3H) ppm.

B.Evaluacija biološke aktivnosti

Skraćenice i akronimi:

[0467]

Ahx 6-aminoheksanska kiselina

ATP adenozin trifosfat

BSA goveđi serumski albumin

CREB na element odgovora na cAMP vezajući protein

DMSO dimetilsulfoksid

EDTA etilendiamintetrasirćetna kiselina

EGTAetilenglikol-bis(2-aminoetiletar)-A/. jV. h", A?'-tetrasirćetnakiselina

FBS fetalni goveđi serum

FGF faktor rasta fibroblasta

FGFR receptor za faktor rasta fibroblasta

GFP zeleni fluorescentni protein

GST glutation S-transferaza

HEPES 4-(2-hidroksietil)piperazin-l-etansulfonska kiselina

HRTF homogena vremenski razložena fluorescencija

MOPS 3-(Af-morfolino)propansulfonska kiselina

mTOR meta za rapamicin sisara

PBS fosfatom puferovani rastvor soli

PI3K fosfatidilinozitol 3-kinaza

RTK receptorska tirozin kinaza

SNP polimorfizam jednog nukleotida

TR-FRET vremenski razložen fluorescentno rezonantni energetski transfer

VEGF vaskularni endotelni faktor rasta

VEGFR receptor vaskularnog endotelnog faktora rasta

[0468j Demonstracija aktivnosti jedinjenja ovog pronalaska može da se postigne krozin vitro, ex vivoiin vivoeseje koji su dobro poznati u struci. Na primer. da se pokaže aktivnost jedinjenja ovog pronalaska, sledeći eseji mogu da se koriste.

B-l. FGFR- 1 kinazni esej pri visokom ATP

[0469] FGFR-1 inhibitorna aktivnost pri visokoj koncentraciji ATP jedinjenja ovog pronalaska nakon njihove prethodne inkubacije sa FGFR-1 se kvantilikuje koristeći na TR-FRET bazirani FGFR-1 esej pri visokom ATP kako je opisano u sledećim odel jcima:

[0470) Rekombinantni tagovani FGFR-1 fuzioni protein [fuzija glutation-S-transferaze (GST)

(N-terminalno), His6-taga, mesta cepanja za trombin i intracelulamog dela humanog FGFR-1 od amino kiseline G400 do R800 kao u GenBank unosu NM_015850]. eksprimisan u SF9 ćelijama insekta koristeći bakulovirusni ekspresijski sistem i prećićen putem glutation-

agarozne afinitetne hromatografije. se nabavi od Proqinase (proizvod br. 0101 -0000-1) i koristi kao enzim. Kao supstrat za reakciju kinaze. koristi se biotinilovani peptid biotin-Ahx-AAEEEYFFLFAKKK (C-terminus u amidnom obliku) koji može da se nabavi, npr. od Biosvntan (Berlin-Buch, Nemačka).

[0471]Uobičajeno, testna jedinjenja se testiraju na istoj mi kroti tarskoj ploči pri 11 različitih koncentracija u rasponu od 20 uM do 0.1 nM (npr. 20 pM, 5,9 uM. 1.7 uM. 0.51 uM, 0,15 u.M. 44 nM, 13 nM, 3.8 nM, 1,1 nM. 0,33 nM i 0,1 nM) u duplikatima za svaku koncentraciju. Serija razblaženja se pripremi zasebno pre eseja kao 100 puta koncentrisani stok rastvori u DMSO: tačne koncentracije mogu da variraju zavisno o korišćenoj pipeti. Za esej, 50 ni svakog stok rastvora testnog jedinjenja u DMSO se pipetuje u crnu mikrotitarsku ploču niske zapremine sa 384 udubine (Greiner Bio-One, Frickenhausen. Nemačka). Doda se 2 pl rastvora iznad pomenutog FGFR-1 fuzionog proteina u vodenom puferu za esej [8 mM MOPS pH 7,0, 10 mM magnezijum acetat, 1,0 mM ditiotreitol. 0,05% (vv/v) goveđi serumski albumin (BSA). 0.07% (v/v) Tween-20. 0.2 mM EDTA] i smeša se inkubira tokom 15 min pri 22°C da se omogući prethodno vezanje testnog jedinjenja na enzim. Zatim, reakcija kinaze se otpočne dodavanjem 3 ul rastvora adenozin trifosfata (ATP, 3.3 mM; Finalna koncentracija u 5 ul zapremine eseja = 2 mM) i supstrata (0.16 uM; finalna koncentracija u 5 ul zapremine eseja = 0.1 pM) u pufer eseja, te se nastala smeša inkubira tokom reakcionog vremena od 15 min pri 22°C. Koncentracija FGFR-1 fuzionog proteina se podesi zavisno od aktivnosti enzimske šarže i prikladno se odabere kako bi esej bio u linearnom rasponu (tipične koncentracije su u rasponu od 0,05 pg/ml). Reakcija se zaustavi dodavanjem 5 ul rastvora FITRF detekcionih reagensa [25 nM streptavidin-XL665 (Cis Biointemational) i 1 nM PT66-Eu-helata, helatom evropijuma obeleženog anti-fosfotirozin antitela (Perkin-EImer; umesto toga može da se koristi PT66-Tb-kriptat od Cis Biointemational), u vodenom EDTA rastvoru (50 mM EDTA, 0.1% (w/v) BSA u 50 mM HEPES/NaOH pl l 7,5)j.

[0472]Nastala smeša se inkubira tokom 1 h pri 22°C da se omogući formiranje kompleksa između fosforilisanog biotinilovanog peptida i detekcionih reagensa. Nakon toga. količina fosforilisanog supstrata se evaluira merenjem energetskog transfera rezonancom od Eu-helata do streptavidin-XL665. Za ovo. emisije fluorescencije pri 620 nm i 665 nm nakon ekscitacije pri 350 nm se izmere u TR-FRET čitaču [npr. Rubvstar (BMG Labtechnologies, Offenburg. Nemačka) ili Viewlux (Perkin-EImer)]. Razmer emisija pri 665 nm i pri 620 nm se uzme kao mera za količinu fosforilisanog supstrata. Podaci se normalizuju (enzimska reakcija bez inhibitora = 0% inhibisanja. sve ostale komponente eseja ali bez enzima = 100% inhibisanja) i ICso vrednosti se izračunaj u 4-parametarskim fitovanjem koristeći program institucije.

|0473| IC5o vrednosti ovog eseja za pojedina jedinjenja pronalaska su navedene u Tabeli 1A ispod:

|0474| Odabrani 8-amino-]-(benzotiofen-2-il)imidazo[].5-a|pirazin derivati i srodna jedinjenja za koje se smatralo da prestavljaju najbližu pređašnju struku (vidi int. pat. apl. WO 2007/061737-A2 i primerna jedinjenja opisana u tome) se sintetizuju sledeći objavljene postupke i takođe testiraju u FGFR-1 eseju uz visoki ATP za svrhe poređenja. ICso vrednosti koje su dobijene za ova jedinjenja su navedene u Tabeli 1B ispod:

(0475| ICsovrednosti specifikovane u Tabeli 1A i 1B pokazuju kako su jedinjenja ovog pronalaska oko pet do hiljadu puta snažnija u inhibisanju aktivnosti FGFR-1 kinaze od odabranih jedinjenja pređašnje struke.

B-2, Esej FGFR- 3 kinaze

[0476| FGFR-3 inhibitorna aktivnost jedinjenja ovog pronalaska nakon njihove prethodne inkubacije sa FGFR-3 se kvantifikuje koristeći na TR-FRET bazirani FGFR-3 esej kako je opisano u sledećim odeljcima: |0477| Rekombinantni tagovani FGFR-3 fuzioni protein [fuzija glutation-S-transferaze (GST)

(N-terminall<y>). His6-taga. mesta cepanja za trombin i intracelulamog dela humanog FGFR-3 od amino kiseline R397 do T806 kao u NCBI/Protein unosu NP0O0133.1 J, eksprimisan SF9 ćelijama insekta koristeći bakulovirusni ekspresijski sistem i prečišćen putem glutation-S-transferaza afinitetne hromatografije, nabavi se od Proqinase (proizvod br. 1068-0000-1) i koristi kao enzim. Kao supstrat za reakciju kinaze, koristi se biotinilovani peptid biotin-Ahx-AAEEEYFFLFAKKK (C-terminus u amidnom obliku) koji može da se nabavi, npr. od Biosvntan (Berlin-Buch, Nemačka).

[0478] Uobičajeno, testna jedinjenja se testiraju na istoj mikrotitarskoj ploči pri 11 različitih koncentracija u rasponu od 20 uM do 0.1 nM (npr. 20 uM, 5.9 uM. 1.7 uM. 0.51 uM. 0,15 uM, 44 nM, 13 nM, 3,8 nM, 1.1 nM. 0,33 nM i 0.1 nM) u duplikatima za svaku reakciju. Serija razblaženja se pripremi zasebno pre eseja kao 100 puta koncentrisani stok rastvori u DMSO; tačne koncentracije mogu da variraju zavisno od korišćene pipete. Za esej. 50 ni svakog stok rastvora testnog jedinjenja u DMSO se pipetuje u crnu mikrotitarsku ploču niske zapremine sa 384 udubine (Greiner Bio-One, Frickenhausen. Nemačka). Doda se 2 ul rastvora iznad pomenutog FGFR-3 fuzionog proteina u vodenom puferu za esej [8 mM MOPS pFl 7,0. 10 mM magnezijum acetat. 1.0 mM ditiotreitol, 0.05% (w/v) goveđi serumski albumin (BSA). 0,07% (v/v) Tween-2(). 0.2 mM EDTAJ i smeša se inkubira tokom 15 min pri 22°C da se omogući prethodno vezanje testnog jedinjenja na enzim. Zatim, reakcija kinaze se otpočne dodavanjem 3 ul rastvora adenozin trifosfata (ATP. 16.7 uM; finalna koncentracija u 5 ul zapremine eseja = 10 pM) i supstrata (0.8 pM; finalna koncentracija u 5 ul zapremine eseja = 0.5 pM) u pufer eseja, te se nastala smeša inkubira tokom reakcionog vremena od 60 min pri 22°C. Koncentracija FGFR-3 fuzionog proteina se podesi zavisno od aktivnosti enzimske šarže i prikladno se odabere kako bi esej bio u linearnom rasponu (tipične koncentracije su u rasponu od 0,03 pg/ml). Reakcija se zaustavi dodavanjem 5 pl rastvora HTRF detekcionih reagensa [100 nM streptavidin-XL665 (Cis Biointemational) i 1 nM PT66-Tb-kriptata, kriptatom terbijuma obeleženog anti-fosfotirozin antitela (Cis Biointemational; umesto toga može da se koristi PT66-Eu-helat od Perkin-EImer). u vodenom EDTA rastvoru (50 mM EDTA, 0,1% (w/v) BSA u 50 mM HEPES/NaOH pH 7,5)].

[0479] Nastala smeša se inkubira tokom 1 h pri 22°C da se omogući formiranje kompleksa između fosforilisanog biotinilovanog peptida i detekcionih reagensa. Nakon toga. količina fosforilisanog supstrata se evaluira merenjem energetskog transfera rezonancom od Tb-helata do streptavidin-XL665. Za ovo, emisije fluorescencije pri 620 nm i 665 nm nakon ekscitacije pri 350 nm se izmere u TR-FRET čitaču [npr. Rubvstar (BMG I.abtechnologies. Offenburg. Nemačka) ili Vievvlux (Perkin-EImer)]. Razmer emisija pri 665 nm i pri 620 nm se uzme kao mera za količinu fosforilisanog supstrata. Podaci se normalizuju (enzimska reakcija bez inhibitora = 0% inhibisanja, sve ostale komponente eseja ali bez enzima = 100% inhibisanja) i ICsn vrednosti se izračunaju 4-parametarskim fitovanjem koristeći program institucije.

[0480] IC.sovrednosti ovog eseja za pojedina jedinjenja pronalaska su navedene u Tabeli 2A ispod:

|0481|Odabrani 8-amino-l-(benzotiofen-2-il)imidazo[l,5-alpirazin derivati i srodna jedinjenja za koje se smatralo da prestavljaju najbližu pređašnju struku (vidi int. pat. apl. WO 2007/061737-A2 i primerna jedinjenja opisana u tome) se sintetizuju sledeći objavljene postupke i takođe testiraju u FGFR-3 eseju za svrhe poređenja. IC>ovrednosti koje su dobijene za ova jedinjenja su navedene u Tabeli 2B ispod:

[0482]ICjo vrednosti specifikovane u Tabeli 2A i 2B pokazuju kako su jedinjenja ovog pronalaska oko tri do hiljadu puta snažnija u inhibisanju aktivnosti FGFR-3 kinaze od odabranih jedinjenja pređašnje struke.

B-3.Esej FGFR- 4 kinaze uz visoki ATP

|0483|FGFR-4 inhibitorna aktivnost pri visokoj koncentraciji ATP jedinjenja ovog pronalaska nakon njihove prethodne inkubacije sa FGFR-4 se kvantifikuje koristeći na TR-FRET bazirani FGFR-4 esej pri visokom A TP kako je opisano u sledećim odeijcima:

[0484]Rekombinantni tagovani FGFR-4 fuzioni protein [fuzija glutation-S-transferaze (GST)

(N-terminalno). His6-taga. mesta cepanja za trombin i intracelulamog dela humane FGFR-4 od amino kiseline R391 do T802 kao u GenBank unosu NM 002011|. eksprimisan u SF9 ćelijama insekta koristeći bakulovirusni ekspresijski sistem i prečišćen putem glutation-agarozne atinitetne hromatografije, nabavi se od Proqinase (proizvod br. 0127-0000-3) i koristi kao enzim. Kao supstrat za reakciju kinaze, koristi se biotinilovani peptid biotin-Ahx-AAEEEYFFLFAKKK (C-terminus u amidnom obliku) koji može da se nabavi, npr. od Biosvntan (Berlin-Buch, Nemačka).

|0485|Uobičajeno, testna jedinjenja se testiraju na istoj mikrotitarskoj ploči pri 11 različitih koncentracija u rasponu od 20 uM do 0,1 nM (npr. 20 uM. 5.9 uM. 1.7 uM. 0.51 uM. 0.15 pM, 44 nM. 13 nM, 3.8 nM, 1,1 nM, 0,33 nM i 0.1 nM) u duplikatima za svaku reakciju.

Serija razblaženja se pripremi zasebno pre eseja kao 100 puta koncentrisani stok rastvori u DMSO; tačne koncentracije mogu da variraju zavisno od korišćene pipete. Za esej, 50 ni svakog stok rastvora testnog jedinjenja u DMSO se pipetuje u crnu mikrotitarsku ploču niske zapremine sa 384 udubine (Greiner Bio-One. Frickenhausen. Nemačka). Doda se 2 pl rastvora iznad pomenutog FGFR-4 fuzionog proteina u vodenom puferu za esej | 8 mM MOPS pH 7,0. 10 mM magnezijum acetat, 1.0 mM ditiotreitol, 0,05% (vv/v) goveđi serumski albumin (BSA). 0,07% (v/v) Tween-20, 0.2 mM EDTA] i smeša se inkubira tokom 15 min pri 22°C da se omogući prethodno vezanje testnog jedinjenja na enzim. Zatim, reakcija kinaze se otpočne dodavanjem 3 u! rastvora adenozin trifosfata (ATP. 3.3 mM; finalna koncentracija u 5 ul zapremine eseja = 2 mM) i supstrata (0.8 pM; finalna koncentracija u 5 pl zapremine eseja = 0.5 pM) u pufer eseja, te se nastala smeša inkubira tokom reakcionog vremena od 60 min pri 22°C. Koncentracija FGFR-4 fuzionog proteina se podesi zavisno od aktivnosti enzimske šaržc i prikladno sc odabere kako bi esej bio u linearnom rasponu (tipične koncentracije su u rasponu od 0.03 ug/ml). Reakcija se zaustavi dodavanjem 5 pl rastvora HTRF detekcionih reagensa (100 nM streptavidin-XL665 (Cis Biointemational) i 1 nM PT66-Tb-kriptata. kriptatom terbijuma obeleženog anti-fosfotirozin antitela (Cis Biointemational; umesto toga može da se koristi PT66-Eu-helat od Perkin-EImer). u vodenom EDTA rastvoru (50 mM EDTA. 0.1% (w/v) BSA u 50 mM HEPES/NaOH pH 7.5)].

|0486] Nastala smeša se inkubira tokom 1 h pri 22°C da se omogući formiranje kompleksa između fosforilisanog biotinilovanog peptiđa i detekcionih reagensa. Nakon toga. količina fosforilisanog supstrata se evaluira merenjem energetskog transfera rezonancom od Tb-helata do streptavidin-XL665. Za ovo, emisije fluorescencije pri 620 nm i 665 nm nakon ekscitacije pri 350 nm se izmere u TR-FRET čitaču [npr. Rubvstar (BMG Labtechnologies, Offenburg. Nemačka) ili Viewlux (Perkin-EImer)]. Razmer emisija pri 665 nm i pri 620 nm se uzme kao mera za količinu fosforilisanog supstrata. Podaci se normalizuju (enzimska reakcija bez inhibitora = 0% inhibisanja. sve ostale komponente eseja ali bez enzima = 100%> inhibisanja) i IC>o vrednosti se izračunaju 4-parametarskim fitovanjem koristeći program institucije.

B-4. Esej mTOR kinaze( za svrhe poređenja )

[0487] mTOR inhibiloma aktivnost jedinjenja ovog pronalaska se kvantilikuje koristeći na TR-FRET bazirani mTOR esej kako je opisano u sledećim odeljcima:[0488JRekombinantni fuzioni tagovani mTOR protein [glutation-.S'-transferaza (GST) fuzionisana na humani mTOR amino kiseline od 1360 do 2549], eksprimisan u ćelijama insekta i prečišćen glutation-sefaroznom afinitetnom hromatografijom. nabavi se od Invitrogen (kat. br. 4753) i koristi kao enzim. Kao supstrat za reakciju kinaze. koristi se rekombinantni fuzioni protein od GFP i 4E-BP1 (nabavljen od Invitrogen. kat. br. PV4759).

[0489|Testna jedinjenja se rastvore u DMSO da se naprave 10 mM stok rastvori. Ovi rastvori se prvo razblaže 10 puta sa 100% DMSO da se dobiju 1 mM rastvori u 100% DMSO. zatim razblaže 100 puta sa 50% DMSO da se dobiju 10 pM rastvori u 50% DMSO.

|0490|Za esej, 0.5 pl 10 pM rastvora testnog jedinjenja u 50% DMSO se pipetuje u crnu mikrotitarsku ploču niske zapremine sa 384 udubine (Greiner Bio-One. Frickenhausen. Nemačka). Doda se 2 pl rastvora iznad pomenutog mTOR fuzionog proteina u vodenom puferu za esej [50 mM HEPES/NaOH pH 7.5, 5 mM magnezijum hlorid. 1.0 mM ditiotreilol.

1 mM EGTA. 0.01% (v/v) Triton-X100. 0.01% (w/v) goveđi serumski albumin (BSA)| i smeša se inkubira tokom 15 min pri 22°C da se omogući prethodno vezanje testnog jedinjenja na enzim. Zatim, reakcija kinaze se otpočne dodavanjem 2,5 pl rastvora adenozin tri fosfata (ATP, 80<p>M; finalna koncentracija u 5 pl zapremine eseja - 40 pM) i supstrata (0.6 pM; finalna koncentracija u 5 pl zapremine eseja = 0.3 pM) u pufer eseja, te se nastala smeša inkubira tokom reakcionog vremena od 60 min pri 22°C. Koncentracija mTOR fuzionog proteina prikladno se odabere kako bi esej bio u linearnom rasponu (tipična finalna koncentracija u 5 pl zapremine eseja je 1,25 ng/<p>l). Reakcija se zaustavi dodavanjem 5 pl 30 mM EDTA (finalna koncentracija u 10 pl zapremine eseja = 15 mM) i 2 nM Tb-helatom obeleženog anti-4E-BPl [pT46] fosfospecifičnog antitela [Invitrogen kat. br. PV4755]

(finalna koncentracija u 10 pl zapremine eseja = 1 nM) u FRET puferu.

[04911Nastala smeša se inkubira tokom 1 h pri 22°C da se omogući formiranje kompleksa između fosforilisanog supstrata i Tb-helatom obeleženog antitela. Nakon toga, količina fosforilisanog supstrata se evaluira merenjem energetskog transfera rezonancom od Tb-helata do GFP. Za ovo. emisije fluorescencije pri 495 nm i 520 nm nakon ekscitacije pri 340 nm se izmere u Envision 2104 Multilabel čitaču (Perkin-EImer). Razmer emisija pri 520 nm i pri 495 nm se uzme kao mera za količinu fosforilisanog supstrata. Podaci se normalizuju (enzimska reakcija bez inhibitora = 0% inhibisanja, sve ostale komponente eseja ali bez enzima = 100% inhibisanja), te se izračunaj u bilo srednje vrednosti (ako je testirano u

replikatima pri pojedinačnoj koncentraciji) ili IC50vrednosti (pomoću 4-parametarskog fitovanja koristeći program institucije).

(0492] Srednje vrednosti inhibisanja pri 1 pM za pojedina jedinjenja ovog pronalaska su navedena u Tabeli 3 ispod:

( bez detekc. inhib. efekta =inhibitorni efekt nije detektabilan pri 1 pM ).

|0493|Podaci u Tabeli 3 pokazuju kako jedinjenja ovog pronalaska imaju samo slab. ako ikakav, inhibitorni efekt na mTOR kinazu za koji se ne smatra da pridonosi farmakološkoj aktivnosti uočenoj sa ovim jedinjenjima.

B-5.Inhibisanje faktorom rasta posredovane proliferacije ćelija

[0494)Humane endotelske ćelije umbilikalne vene (HUVEC) se nabave od Cellsistems (FC-0003) i uzgoje u Vasculife VEGF kompletnom medij umu (Cellsistems. LL-1020) koji sadrži 2% fetalnog goveđeg seruma (FBS) pri 37°C i 5% CO2. Ćelije se koriste za eseje proliferacije sve do 7. pasaže.

|0495)HUVEC ćelije se prikupe koristeći aceutase (PAA, LI 1-007) i vidided. u kolonama 2 do 12, pločica sa 96 udubina (Falcon MICROTEST pločica za kulturu tkiva sa 96 udubina i ravnim dnom. BD 353075 ili pCLEAR-PLATE. crna, sa 96 udubina. Greiner Bio-One. br. 655090) pri gustini ćelija od 2500 ćelija/udubini u 100 pl Vasculife VEGF kompletnog medij uma sa kolonom 1 koja ostaje prazna kao šlepa proba. Ćelije se ostave uz inkubaciju pri 37°C i 5% CO2tokom barem 6 h. Zatim se ćelije isperu jedanput sa PBS i gladuju preko noći u Vasculife osnovnom medijumu (Cellsistems. LM-0002) koji sadrži heparin. askorbat i L-glutamin (komponente Vasculife Life Factors kompleta. Cellsistems, LL-1020) kao i 0.2%

FBS.

[0496]Nakon približno 18 h, medij um za gladovan je se odbaci i ćeli je se izlože tokom 72 h na 9 uzastopnih log ili poiu-log koncentracija testnog jedinjenja u rasponu od 10 pM do 30 pM i na 5, 10 ili 20 ng/ml hFGF-2 (rekombinantni humani bazični FGF. R&D Svstems. 233-FB) u 100 pl medij uma za gladovanje. 10 mM stok rastvora testnih jedinjenja u DMSO se razblaže do 200 x finalne koncentracije u DMSO. što rezultuje u finalnoj koncentraciji DMSO od 0,5% u svim udubinama. Kontrole se sastoje od ćelija gajenih samo u medijumu za gladovanje i ćelija gajenih u medijumu za gladovanje koji sadrži hFGF-2 sa 0,5% DMSO. Da se utvrdi ćelijska proliferacija, doda se 5 pl Alamar Blue rastvora (Biosource. DALI 100) u svaku udubinu (1:20 razblaženje) i ćelije se ostave da se inkubiraju tokom daljnjih 4 h pri 37°C i 5% CO2pre merenja fluorescencije (eksc. 535 nm, em. 595 nm) sa Spectrafluor Plus Tečan čitačem ploča (XFLUOR4 verzija 4.20). U nekim eksperimentima, koristi se komplet za određivanje ATP (BIAFFIN GmbH, LBR-T100) prema uputstvima proizvođača. U svakom eksperimentu, uzorci se podvrgnu eseju u triplikatu i odrede se standardne devijacije. Program GraphPad Prism 5 se koristi za analizovanje podataka i dobi janje IC50vrednosti. Sva testna jedinjenja su podvrgnuta eseju 2 do 10 puta u nezavisnim eksperimentima, te su dobiveni slični rezultati.

[0497] Podaci navedeni u Tabeli 4 ispod predstavljaju IC50 vrednosti za reprezentativna jedinjenja pronalaska nastale iz odgovarajućih uprosečenih plCso vrednosti: (0498]Većina jedinjenja ovog pronalaska pokazuju od deset do sto puta smanjenu inhibitornu aktivnost u ovom eseju proliferacije kada se koristi vaskularni faktor rasta endotela (VEGF-Ai6> izoform) kao posredujući faktor rasta (umesto FGF-2), upućujući na značajnu selektivnost ovih jedinjenja za FGFR naprema VEGFR kinazama.

B-6.Humani modeli ksenografta i singenetskogtumora

|0499]Ispitani su različiti modeli tumora kako bi se profiliralo jedinjenja ovog pronalaskain vivo.Humane, pacovske ili mišje tumorske ćelije se gajein viiroi implantiraju u bilo imunodeifcijentne ili imunokompetentne miševe ili imunodeficijentne pacove. Tretiranje otpočne nakon nastanka tumora i životinje koje nose tumor se tretiraju sa supstancama različitim putevima (per os. intravenozno, intraperitonealno ili supkutano). Supstance se testiraju kao monoterapija ili u kombinacionoj terapiji sa drugim farmakološkim supstancama. Tretiranje životinja koje nose tumor sc provodi dok tumori ne dosegnu prosečnu veličinu od 120 mm<2>. Tumori se izmere u dve dimenzije koristeći merku i tumorska zapremina se izračuna prema formuli (dužina x širina<2>)/2. Efikasnost supstance se proceni na kraju eksperimenta koristeći T/K razmer [T = finalna težina tumora u tretiranoj grupi; K =

finalna težina tumora u kontrolnoj grupi]. Statistička značajnost efikasnosti između kontrolne i tretirane grupe se odredi koristeći ANOVA test varijance. Sva ispitivanja na životinjama se provedu prema nemačkim regulatornim smernicama.

C.Primeri koji se odnose na farmaceutske kompozicije

[0500]Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku mogu da se ilustruju kako sledi:

Sterilni i. v. rastvor:

|0501|5 mg/mL rastvor željenog jedinjenja pronalaska može da se napravi koristeći sterilnu, injektabilnu vodu i pH se podesi ako je neophodno. Rastvor se razblaži za prirnenu do 1-2 mg/mL sa sterilnom 5% dekstrozom i primenjuje se kao i.v. infuzija tokom približno 60 minuta.

Liofilizovani prah za i. v. prirnenu:

[0502 j Sterilni preparat može da se pripremi sa (i) 100-1000 mg željenog jedinjenja pronalaska kao liofilizovanog praha. (//) 32-327 mg/mL natrijum citrata i (///) 300-3000 mg dekstrana 40. Formulacija se rekonstituiše sa sterilnim, injektabilnim rastvorom soli ili 5% dekstrozom do koncentracije od 10 do 20 mg/mL. što se dalje razblaži sa rastvorom soli ili 5% dekstrozom do 0,2 do 0,4 mg/mL i primenjuje se bilo kao i.v. bolus ili i.v. infuzijom tokom 15-60 minuta.

Intramuskularna suspenzija:

[0503| Sledeći rastvor ili suspenzija mogu da se pripreme za intramuskularno injektiranje: |0504J 50 mg/mL željenog, u vodi nerastvornog jedinjenja pronalaska: 5 mg/mL natrijum karboksimetilceluloze; 4 mg/mL Tween 80; 9 mg/mL natrijum hlorida; 9 mg/mL benzil alkohola.

Kapsule sa čvrstim omotačem:

[0505| Veliki broj jediničnih kapsula se pripremi punjenjem standardnih dvodelnih čvrstih želatinskih kapsula svake sa 100 mg željenog jedinjenja pronalaska u prahu, 150 mg laktoze.

50 mg celuloze i 6 mg magnezijum stearata.

Meke želatinske kapsule:

J0506| Smeša željenog jedinjenja pronalaska u provarljivom ulju. poput sojinog ulja. ulja semenki pamuka ili maslinovog ulja, se pripremi i injektira pomoću istisne pumpe u topljeni želtin da formira meke želatinske kapsule koje sadrže 100 mg aktivnog sastojka. Kapsule se isperu i osuše. Željeno jedinjenje pronalaska može da se rastvori u smeši polietilen glikola. glicerina i sorbitola da se pripremi sa vodom mešljiva medicinska smeša.

Tablete:

[0507]Veliki broj tableta se pripremi konvencionalnim postupcima tako da jedinicu2a doziranje čini 100 mg željenog jedinjenja pronalaska. 0.2 mg koloidnog silicijum dioksida, 5 mg magnezijum stearata, 275 mg mikrokristalne celuloze. 11 mg škroba i 98.8 mg laktoze. Odgovarajuće vodene i nevodene obloge mogu da se nanesu kako bi se povećala palatabilnost. poboljšala elegancija i stabilnost ili odgodila apsorpcija.

Rastvor ili suspenzija za topikalnu prirnenu na oku ( kapi za oči) :

[0508] Sterilna formulacija može da se pripremi sa 100 mg željenog jedinjenja pronalaska kao liofilizovanog praha rekonstituisanog u 5 mL sterilnog rastvora soli. Kao konzervans, mogu da se koriste benzalkonijum hlorid. timerosal, fenilživa nitrat ili slično u rasponu od oko 0.001 % do 1 % težinski.

Claims (13)

1. Jedinjenje sa formulom (I) naznačeno time što R<1>je vodonik, hlor, metil ili metoksi. R2 je vodonik ili metoksi, uz uslov daje barem jedan od R<1>i R<2>različit od vodonika. G<1>predstavlja hlor. (Ci-Cj)-alkil. (Ct-C4)-alkoksikarbonil. 5-člani aza-heteroaril. ili grupu -CH2-OR:'. -CH2-NR<4>R<5>ili ~C{=0}-NR4R\ pri čemu R'je vodonik, (Ci-C4)-alkil, (Cj-C^-cikloalkil ili fenii. ( i)pomenuti (Ci-C,i)-alkil je proizvoljno supstituisan sa hidroksi. (O-Ci)-alkoksi. hidroksikarbonilom, (Ci-C4)-alkoksikarbonilom, amino. aminokarbonilom, mono-(Ci-C4)-alkilaminokarbonilom. di-(C 1-C4)-alkilaminokarbonilom. (C-i-CVO-cikloalkilom ili sa do tri atoma tluora. i (//)pomenuti (C^-CftJ-cikloalki! je proizvoljno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta koji su nezavisno izabrani iz grupe koju čine (Ci-CaJ-alkil. hidroksi i amino, i (//'/) pomenuti fenil je proizvoljno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta koji su nezavisno izabrani iz grupe koju čine tluor, hlor. brom. cijano, trifluormetil, trifluormetoksi. (Ci-C.4)-alkil i (Ci-C4)-alkoksi. R4 je vodonik ili (Ci-C4)-alkil. R3 je vodonik, (Ci-C4)-alkil, (Ci-C4)-alkilkarbonil. <CVC6)-cikloa!kil ili 4- do 6-člani heterocikloalkil. pri čemu ( i)pomenuti (Ci-C4)-alkil je proizvoljno supstituisan sa hidroksi. (C1-C4)-alkoksi, hidroksikarbonilom, (Ci-C4)-alkoksikarbonilom. aminokarbonilom. mono-(Ci-C4)-alkilaminokarbonilom. di-(Ci-C4)-alkilaminokarbonilom ili (CVCV)-cikloalkiIom. i (//)pomenuti (CVCtO-cikloaikil je proizvoljno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta koji su nezavisno izabrani iz grupe koju čine (Ci-C4)-alkil, hidroksi i amino, i(7/7)pomenuti 4- do 6-elani heterocikloalkil je proizvoljno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta koji su nezavisno izabrani iz grupe koju čine (O-C4)-alkil, hidroksi, okso i amino. R<6>je vodonik, (Ci-C4)-alkil, (CVCV)-cikIoalkil ili 4- do 6-člani heterocikloalkil, pri čemu (/) pomenuti (Ci-C4)-alkil je proizvoljno supstituisan sa hidroksi. (C1-C4)-alkoksi, hidroksikarbonil. (G-C4)-alkoksikarbonil. amino, aminokarbonil. mono-(Ci-Ca)-alkilaminokarbonilom. di-(Ci-C4)-alkilaminokarbonilom ili (C.i-CVO-cikloalkilom. i (//) pomenuti (C3-C.6)-cikloalkil je proizvoljno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta koji su nezavisno izabrani iz grupe koju čine (Ci-C-i)-alkil. hidroksi i amino, i (//;')pomenuti 4- do 6-člani heterocikloalkil je proizvoljno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta koji su nezavisno izabrani iz grupe koju čine (Ci-C4)-alkil. hidroksi, okso i amino, ili R<4>i R\ ili R<4>i R('. ponaosob, su povezani, te uzeti zajedno sa atomom azota na koji su oni vezani, grade monociklični, zasićeni 4- do 7-člani heterocikloalkilni prsten koji može sadržavati i drugi heteroatom u prstenu koji se bira od N(R<7>) i O. te koji može da bude supstituisan na atomima ugljenika u prstenu sa jednim ili dva supstituenta koji su nezavisno izabrani iz grupe koju čine (Ci-C4)-alkil, okso. hidroksi, amino i aminokarbonil, i pri čemu R7 je vodonik, (G-C4)-alkil. formil ili (Ci-C\i)-alkilkarbonil, i G<2>predstavlja hlor. cijano. (Ci-C4)-alkil. ili grupu -CR<SA>R<*B>-OH. - Clh-NRyRm, -C(=0)-NR"R<12>ili -CH2-OR<15>. pri čemu R<KA>i R<8B>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik. {Ci-C4)-alkil. eiklopropil i ciklobutil. R9 je vodonik ili (Ci-C4)-alkil. R10 je vodonik, (Cj-C4)-alkil, (Ci-C4)-alkilkarbonil. (0-Cft)-cikloalkil ili 4- do 6-člani heterocikloalkil. pri čemu (/) pomenuti (G-C4)-alkil je proizvoljno supstituisan sa hidroksi. amino. aminokarbonilom, mono-(Ci-C4)-aikilaminokarbonilom ili di-(Ci-C4)-alkilaminokarbonilom, i (//)pomenuti ( C3-Ce,)-cikloalkil je proizvoljno supstituisan sa jednini ili d va supstituenta koji su nezavisno izabrani iz grupe koju čine (G-C4)-alkil. hidroksi i amino, i (///) pomenuti 4- do 6-člani heterocikloalkil je proizvoljno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta koji su nezavisno izabrani iz grupe koju čine (Cj-C4)-alkil, hidroksi, okso i amino. R" je vodonik ili (Ci-C4)-alkil, R12 je vodonik, (Ci-C4)-alkil, (C3-Cf,)-cikloalkil ili 4- do 6-člani heterocikloalkil, pri čemu (7) pomenuti (Ci-C"4)-alkil je proizvoljno supstituisan sa hidroksi, amino, aminokarbonilom. mono-(Ci-C4)-alkilaminokarbonilom ili di-(Cj-C4)-alkilaminokarbonilom, i (//)pomenuti (C3-C6)-cikloalkil je proizvoljno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta koji su nezavisno izabrani iz grupe koju čine (CVC4)-alkil. hidroksi i amino, i (///)pomenuti 4- do 6-člani heterocikloalkil je proizvoljno supstituisan sa jednim ili dva supstituenta koji su nezavisno izabrani iz grupe koju čine (G-C4)-alkil. hidroksi. okso i amino. ili R<9>i R<1>", ili R<11>i R<12>, ponaosob, su povezani, te uzeti zajedno sa atomom azota na koji su oni vezani, grade monociklični, zasićeni 4- do 7-člani heterocikloalkilni prsten koji može sadržavati i drugi heteroatom u prstenu koji se bira od N(R<L>'). O. S i S(0)2, te koji može da bude supstituisan na atomima ugljenika iz prstena sa do tri supstituenata koji su nezavisno izabrani iz grupe koju čine fluor, (G-CVj-alkil. okso. hidroksi. amino i aminokarbonil, i pri čemu Ru je vodonik, (Ci-d)-alkil, (O-Cf^-cikloalkil, formil ili (C1-C4)-alkilkarbonil, i R,<5>je(Ci-C4)-alkil, uz uslov da G<1>nije hlor kada G2 je hlor ili cijano, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, hidral i/ili solvat.

2. Jedinjenje sa formulom (I) prema zahtevu 1, naznačenolime što R<1>je hlor, metil ili metoksi, R2 je vodonik ili metoksi, G<1>predstavlja hlor. (Ci-CO-alkil, (Ci-GJ-aikoksikarbonil ili 5-člani aza-heteroaril koji je izabran iz grupe koju čine pirazolil, imidazolil, oksazolil. izoksazolil i oksadiazolil, ili predstavlja grupu -("I l.-OR' ili -CH2-NR4R\ pri Čemu R3 je vodonik, (Ci-Oj-alki! ili (CVGO-cikloalkil. gde je pomenuti (Ci-C4)-alkil proizvoljno supstituisan sa hidroksi. (G-C4)-alkoksi, hidroksikarbonilom. (C]-C4)-alkoksikarbonilom, amino, aminokarbonilom, (C;,-C(,)-cikloalkilom ili sa do tri atoma fluora. R4 je vodonik ili (Ci-C4)-alkil, R5 je vodonik, (Ci-C4)-alkil. <C]-C4)-alkilkarbonil. (C3-C6)-cikloalkil ili 5- ili 6-člani heterocikloalkil, pri čemu (/) pomenuti (Ci-C4)-alkil je proizvoljno supstituisan sa hidroksi. hidroksikarbonilom ili (C;i-C6)-cikloalkilom. i (/V) pomenuti 5- ili 6-člani heterocikloalkil je proizvoljno supstituisan sa okso. ili R<4>i R<J>su povezani, te uzeti zajedno sa atomom azota na koji su oni vezani, grade monociklični, zasićeni 4- do 6-člani heterocikloalkilni prsten koji može sadržavati i drugi heteroatom u prstenu koji se bira od N(R') i O. te koji može da bude supstituisan na atomu ugljenika iz prstena sa okso ili hidroksi, te pri čemu R<7>je vodonik ili (Ci-CO-alkil. i G<2>predstavlja hlor, cijano, (G-C4)-alkil, ili grupu -CR8ARKB-OH, -CH2-NR<g>R<10>, -C(=0)-NR<M>R<12>ili -CH2-OR15. pri čemu R<8A>i R<Xi5>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine vodonik. (CVC-O-aikil i eiklopropil, R9 je vodonik ili metil, R10 je vodonik, (Ct-Ci)-alkil, (Ci-CaJ-alkilkarbonil, (CVCVKikloalkil ili 5- ili 6-člani heterocikloalkil, pri čemu (i) pomenuti (Ci-Caj-alkil je proizvoljno supstituisan sa hidroksi ili aminokarbonilom, i (//)pomenuti 5- ili 6-člani heterocikloalkil je proizvoljno supstituisan sa okso, R" je vodonik ili metil, R12 je vodonik, (G-CO-alkil, (Cj-CV,)-cikloalkil ili 5- ili 6-člani heterocikloalkil, pri čemu (Opomenuti (G-CO-alkil je proizvoljno supstituisan sa hidroksi. i (;7) pomenuti 5- ili 6-ćlani heterocikloalkil je proizvoljno supstituisan sa okso. ili Rg i R'°, ili R" i R<12>, ponaosob, se spajaju, te uzeti zajedno sa atomom azota na koji su oni vezani, grade monociklični. zasićeni 4- do 6-člani heterocikloalkilni prsten koji može sadržavati i drugi heteroatom u prstenu koji se bira od N(R<L>'). O, S i 8(0)2, te koji može da bude supstituisan na atomima ugljenika iz prstena sa do tri supstituenata koji su nezavisno izabrani iz grupe koju Čine fluor, (Ci-GO-alkil, okso. hidroksi. amino i aminokarbonil. te pri čemu R<1>'je vodonik. (Ci-CO-alkil. eiklopropil. ciklobutil. formil ili (C1-C4)-alkilkarbonil. i R<15>je metil ili etil. uz uslov da G<1>nije hlor kada Cr je hlor ili cijano. ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. hidrat i/ili solvat.

3. Jedinjenje sa formulom (I) prema zahtevu 1 ili 2. naznačeno time što R<1>je metil. R2 je metoksi, G<1>predstavlja metil, oksazol-5-il ili grupu -CH2-OR3 ili -CH2-NR4R\ pri čemu R3 je vodonik, (G-C4)-alkil. eiklopropil ili ciklobutil. gde je pomenuti (G-C4)-alkil proizvoljno supstituisan sa hidroksi. metoksi. etoksi. hidroksikarbonilom. metoksikarbonilom. etoksikarbonilom. amino, aminokarbonilom, cikiopropilom, ciklobutil ili sa do tri atoma fluora. R4 je vodonik, metil ili etil. R> je vodonik, (Ci-Ci)-alkil, acetil, eiklopropil. ciklobutil ili 2-oksopirolidin-3-il, pri čemu pomenuti (Ci-C4)-alkil je proizvoljno supstituisan sa hidroksi, hidroksikarbonilom, cikiopropilom ili cikiobutilom. ili R<4>i R^ su povezani, te uzeti zajedno sa atomom azota na koji su oni vezani, grade monociklični, zasićeni 5- ili 6-člani heterocikloalkilni prsten koji može sadržavati i drugi heteroatom u prstenu koji se bira od NH i O. te koji može da bude supstituisan na atomu ugljenika iz prstena sa okso ili hidroksi, i G<2>predstavlja metil ili grupu -CRSARHIJ-OH, -CH2-NR"R<1>(<1>ili -C(=0)-NR"R<12>pri čemu R<SA>i R<SB>su neovisno vodonik ili metil. R<q>je vodonik, R10 je vodonik, (G-C4)-alkil, acetil, eiklopropil. ciklobutil ili 2-oksopirolidin-3-ii, pri Čemu pomenuti (Ci-G)-alkil je proizvoljno supstituisan sa hidroksi ili aminokarbonilom. R11 je vodonik ili metil. R12 je vodonik. (Ci-G)-alkil. eiklopropil. ciklobutil ili 2-oksopirolidin-3-il. pri čemu pomenuti (Ci-Ci)-aikil je proizvoljno supstituisan sa hidroksi, ili R9 i R<10>, ili R11 i R<12>. ponaosob, su povezani, te uzeti zajedno sa atomom azota na koji su oni vezani, grade monociklični. zasićeni 4- do 6-člani heterocikloalkilni prsten koji može sadržavati i drugi heteroatom u prstenu koji se bira od N(R<13>), O i S(0)2, i koji može da bude supstituisan na atomima ugljenika iz prstena sa do tri supstituenata koji su nezavisno izabrani iz grupe koju čine fluor, metil, okso. hidroksi, amino i aminokarbonil. te pri čemu R13 je vodonik, formil ili acetil, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, hidrat i/ili solvat.

4. Jedinjenje sa formulom (I) prema zahtevu 1, 2 ili 3, naznačeno time što R<1>je metil, R2 je metoksi, G<1>predstavlja grupu -CH2-OR<J>, pri čemu R<3>je (Ci-Caj-alkil proizvoljno supstituisan sa hidroksi. amino ili aminokarbonilom, i G<2>predstavlja grupu -CrT-NR^R10 ili -C(=0)-NR' 'R12 pri čemu R9 je vodonik, R10 je 2-oksopirolidin-3-il. ili R<9>i R<10>su povezani, te uzeti zajedno sa atomom azota na koji su oni vezani. grade piperazin-l-il, 3-oksopiperazin-l-il ili 4-acetilpiperazin-l-il prsten. R" je vodonik, R12 je 2-oksopirolidin-3-il, ili R<11>i R<12>su povezani, te uzeti zajedno sa atomom azota na koji su oni vezani, grade 3-hidroksiazetidin-l-il, 4-hidroksipiperidin-l-il ili 3-okso-piperazin-l-ii prsten, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. hidrat i/ili solvat.

5. Jedinjenje naznačeno time da je 4-{ [4-amino-6-(metoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,l-f]|'l,2,4j-triazin-7-il]metil}piperazin-2-on prema zahtevu 1 do 4. ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. hidrat ili solvat.

6. Jedinjenje naznačeno time da je 4-{ [4-amino-6-(metoksimetil)-5-(7-metoksi-5-metil-l-benzotiofen-2-il)pirolo[2,1 -f}-[l .2,4J-triazin-7-il]metil j piperazin-2-on prema zahtevu 1 do 5,

7. Postupak za pripremanje jedinjenja sa formulom (I) kako je definisano u zahtevima 1 do 6,naznačen timešto [A] 6-supstituirani 4-aminopirolo[2,l-fj[ 1,2.4jtriazin sa formulom (II) pri čemu R3 ima značenje definisano u zahtevu 1 do 4. prvo reaguje sa formaldehidom i aminom sa formulom (111) pri čemu R9 i Rl() imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4, u prisustvu kiseline da se dobije jedinjenje sa formulom (IV) pri čemu R<3>, R9 i R<10>imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. zatim se provodi bromovanje u jedinjenje sa formulom (V) pri čemu R<3>.R9 i R<10>i<m>aju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. i provodi se naknadno spajanje sa benzotiofen-2-il boronatom sa formulom (VI) pri čemu R<1>i R<2>imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. i R'4 predstavlja vodonik ili (G-CO-alkil, ili oba R14 ostatka su vezana zajedno tako da grade -(CH2)2-, -C(CH3)2-C(CH3)2-, -(CH2)3-, -CH2-C(CH3)2-CH2- ili - C(=0)-CH2-N(CH3)-CH2-C(=0)-most. u prisustvu paladijum katalizatora i baze da se dobije ciljano jedinjenje sa formulom (I-A) pri Čemu R<1>. R<2>. R<3>. R<9>iR10imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4, ili [B] 6-supstituirani 4-aminopirolo[2.l-f][1.2.4]triazin sa formulom (II) pri čemu R<3>ima značenje definisano u zahtevu 1 do 4. prvo formiluje sa A/A'-dimetilformamiđom u prisustvu fosforil hlorida u aldehid sa formulom (VII) pri čemu R<3>ima značenje definisano u zahtevu 1 do 4. zatim se provodi bromovanje u jedinjenje sa formulom (VIII) pri čemu R<3>ima značenje definisano u zahtevu 1 do 4. i naknadno se spaja sa benzotiofen-2-il boronatom sa formulom (VI) pri čemuR<1>,R<2>i R14 imaju gore definisana značenja. u prisustvu paladijum katalizatora i baze da se dobije jedinjenje sa formulom (IX) pri čemu R<1>. R<2>i R<3>imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. koje zatim je ili [B-l] reaguje sa aminom sa formulom (III) pri čemu R i R imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. u prisustvu kiseline i redukcionog sredstva da se dobije ciljano jedinjenje sa formulom (I-A) pri čemuR<1>.R<2>, R<J>, R<9>i R<i0>imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. ili [B-2] oksidira u karboksilnu kiselinu sa formulom (X) pri čemu R<1>, R2 i R<3>imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. i konačno se veže sa aminom sa formulom (XI) pri čemu R" i R<12>imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4, u prisustvu kondenzacionog agensa da se dobije ciljano jedinjenje sa formulom (I-B) pri čemu R<1>, R<2>. R<3>. R" i R<12>imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. ili |C] 6-supstituirani 4-amino-5-brompiroioj2(l-f][l,2,4]triazin sa formulom (XII) se prvo spaja sa benzotiofen-2-il boronatom sa formulom (VI) pri čemu R<1>,R2 i R<14>imaju gore definisana značenja. u prisustvu paladijum katalizatora i baze da se dobije jedinjenje sa formulom (XIII) pri čemu R' i R2 imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. i zatim reaguje sa formaldehidom i aminom sa formulom (III) pri Čemu R<l>) i R<10>imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. u prisustvu kiseline da se dobije jedinjenje sa formulom (I-C) pri čemu R<1.>R<2.>R<9>iRl(limaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. koji se zatim ili [C-l] oksidira u aldehid sa formulom (XIV) pri čemu R<1>, R<2.>R<9><i>R<10>imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. i tretira se sa aminom sa formulom (XV) pri čemu R2 i R<5>imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. u prisustvu kiseline i redukcionog sredstva da se dobije ciljano jedinjenje sa formulom (I-D) pri čemu R<1>, R<2>. R<4>, R<?>, R<9>i R<KI>imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. ili [C-21 pretvara u odgovarajući 6-(halometil) derivat sa formulom (XVI) pri čemuR1,R<2>,R<9>i R<UI>imaju značenja definisana u zahtevu 1 do 4. i X je hlor, brom ili jod. i tretira se sa alkoholom sa formulom (XVII) pri čemu R<5A>ima značenje od R<3>kako je navedeno u zahtevu 1 do 4. osim za vodonik. u prisustvu baze da se dobije ciljano jedinjenje sa formulom (I-E) pri čemu R',R2, R<3A>. R<g>i R<!>" imaju gore definisana značenja, te po zatim izboru sledi, gde je to prikladno. (/) separacija tako dobivenih jedinjenja sa formulom (I) u njihove odgovarajuće enantiomere i/ili điastereomere. i/ili (//) konverzija jedinjenja sa formulom (1) u njihove odgovarajuće hidrate, solvate. soli i/ili hidrate ili solvate soli tretiranjem sa odgovarajućim rastvaraćima i/ili kiselinama ili bazama.

8. Jedinjenje kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 6 naznačeno time što je za lečenje i/ili sprečavanje bolesti.

9. Jedinjenje kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 6 naznačeno time što je za korišćenje u postupku za lečenje i/ili sprečavanje kancera i tumorskih bolesti.

10. Korišćenje jedinjenja kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 6 naznačeno time daje za proizvodnju farmaceutske kompozicije za lečenje i/ili sprečavanje kancera i tumorskih bolesti.

11.Farmaceutska kompozicija naznačena time što obuhvata jedinjenje kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 6 i jednu ili više farmaceutski prihvatljivih pomoćnih supstanci.

12. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11 naznačena time što dodatno obuhvata jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa.

13. Farmaceutska kompozicija kako je definisana u zahtevu 11 ili 12 naznačenalime što je za lečenje i/ili sprečavanje kancera i tumorskih bolesti.