RS52072B - Priprema aphanizomenon flos aquae, ekstrakta i njegovih prečišćenih komponenata za lečenje neuroloških, neurodegenerativnih i poremećaja raspoloženja - Google Patents

Abstract

Upotreba ekstrakta od mikroalge Aphanizomenon Flos Aquae Aquae Ralfs ex Born. Et Flah. Var. flos aquae (AFA Klamath), u kojoj je ekstrakt pripremljen prema sledećim koracima:a) zamrzavanje sveže sakupljenih AFA algi i njihovo odmrzavanje, ili, ako je polazni materijal sušeni AFA prah, sonifikacija vodom razblaženog AFA praha da se razore ćelije;b) centrifugiranje produkta iz koraka a) da se izdvoji supernatant iz precipitata;c) sakupljanje supernatanta koji sadrži vodo-rastvorne komponente, za proizvodnju kompozicije za prevenciju, kontrolu ili lečenje jedne od sledećih neuroloških bolesti, stanja, disfunkcija ili poremećaja: Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, multiple skleroze, hiperaktivnostii poremećaja nedostatka pažnje (ADHD), autizma, depresije, nedostatak pamćenja i poremećaje raspoloženja.Prijava sadrži još 4 patentna zahteva.

Description

(0001) Ovaj pronalazak se odnosi na mikro algu Aphanizomenon FlosAquae Rolfsex Born. & Flah.

Var.flos aquae(AFA Klamath.). Preciznije, pronalazak obezbeđuje ekstrakte AFA Klamath alge korisne za prevenciju ili lečenje specifičnih neuroloških, neorodegenerativnih stanja ili bolesti.

Osnov pronalaska

(0002) Feniletilamin (PEA) je endogeni amin sintetisan dekarboksilacijom fenilalanina u dopaminergijskim

neuronima nigrostriatalnog sistema, i može delovati kao neuromodulator kateholaminske neurotransmisije u mozgu (1). Najvažnije dejstvo PEA je unapređenje neurotransmisije kateholamina. Poznato je da PEA stimuliše oslobađanje acetilholina kao i dopamina (2). Osim toga PEA povećava neurotransmisiju norepinefrina (NE) (6) a čak i neurotransmisiju seratonina.

(0003) Nedavno je bilo prikazano da PEA takođe može da deluje kao autonomni neurotransmiter, sa svojim

specifičnim neuronskim receptorima; i da deluje kao pravi neuromodulator, imajući takođe mogućnost da po potrebi oslabi neuro-transmisiju. (8)

(0004) Odatle potiče cela serija efekata: stimulacija pažnje i pamćenja; popravljanje raspoloženja, sa

značajnom antidepresantskom aktivnošću; podsticanje empatije a time i društvenosti, uključujući emocionalno i seksualno ponašanje; inhibiciju gladi; samanjenje potrebe za zloupotrebu supstanci i zavisnosti od droge.

(0005) Povezanost između PEA i emocionalnog raspoloženja je potvrđena studijama tokom kojih su kod

depresivnih bolesnika bili nađeni značajno niži nivoi PEA, merenog kao takvog ili preko njegovog metabolita PAA (fenilsirćetna kiselina) u plazmi ili urinu. (9)

(0006) Primećeno je da pacijenti sa Parkinsonovom bolesti imaju znatno niže nivoe PEA, merene direktno

u plazmi (12). Progresivno smanjenje neurotransmisije, naročito dopaminergijsko, kod ovih pacijenata, je povezano sa progresivnom degeneracijom dopaminergjskih neurona u crnoj masi( substantia n/gro).

(0007) Ovo smanjenje PEA nivoa ide uporedo sa porastom nivoa MAO-B kod Parkinson-pacijenata, jzbog

čega su lekovi koji se primenjuju kod Parkinsonove bolesti MAO-B inhibitori poput selegilina. (14) Šta više, jednom uneti PEA može lako da prođe kroz barijeru krv-mozak i da stimuliše oslobađanje dopamina iz nigrostriatalnog tkiva čak i u malim dozama. Ovo je važna osobina, pošto lek koji se trenutno koristi, selegilin, dok inhibira MAO-B i ponovno preuzimanje dopamina, ne utiče na njegovo oslobađanje iz nigrostriatalnog tkiva,i tako ne pomaže da se stvori više dopamina, što je ozbiljno ograničenje u patologiji poput Parkinsona, gde je baš stvaranje dopamina u velikoj meri ugroženo.

(0008) Alchajmerova bolest uključuje degeneraciju mehanizma produkcije i ponovnog preuzimanja

dopamina i progresivne destrukcije neurona strijatalnog polja, koja vremenom dovodi do malog broja dopaminergijskih neurona, a time i transmisije dopamina (15)

(0009) lako ne postoje jasni podaci o činjenici da je ADHD (Attention Deficit Hvperactivitv Disorder)

neuro-degenerativno oboljenje, neke studije su pokušale da dokažu da je neuronalna destrukcija glavni uzrok ADHD-a kod dece i odraslih. (19)

(0010) Što je najvažnije postoje dokazi prema kojima deca sa ADHD-om i smetnjama u učenju imaju

znatno niže nivoe PEA (21),pa tako i smanjenje u neuromodulaciji pažnje (dopamin) i sedacije (seratonin). Zato je izabrani lek za ADHD metilfenidat, sintetički derivat PEA, koji takođe deluje stimulisanjem veće produkcije PEA (22), a tako i dopamina i norepinefrina, dva neurotransmitera direktno uključena u etiologiju ADHD.

(0011) Dobro je poznata upotreba amfetamina za kontrolu gladi a time i težine. Njihova upotreba u ovoj

oblasti je uvek bila kotroverzna zbog njihovih sporednih efekata, koji, obzirom na njihovu toleranciju, imaju sklonost da vremenom postanu potencijalno vrlo ozbiljni. Ovo je potvrđeno činjenicom da su glavni lekovi koji se trenutno koriste za kontrolu gladi i težine dopaminergijski antidepresanti slični amfetaminu, poput venlafaksina i bupropiona. Ovi molekuli, kao svi amfetamini, su sintetički derivati PEA. Poslednji deluje kao snažan supresant apetita ukoliko je sprečena njegova degradacija od MAO-B enzima.

(0012) Monoaminoksidaze (MAO) A i B katalizuju degradaciju neuroaktivnih i vazoaktivnih amina u CNS i

perifernim tkivima. Naročito je MAO-B,s obzirom na njegov direktan i indirektan značaj za dopamineergijsku transmisiju, uključen u neurološke poremećaje gde je dopamin značajan, poput depresije i poremećaja raspoloženja, Parkinsonove i Alchajmerove bolesti. Zbog toga se MAO-B inhibitori upotrebljavaju u lečenju takvih neuroloških poremećaja. (26)

Opis pronalaska

[0013] Pronalazak je zasnovan na identifikaciji supstanci u mikroalgi Aphanizomenon Flos AquaeAquaeRalfs ex Born. 8t Flah. Var.flos aquae ( AFA Klamath), koieu kombinaciji ispoljavaju blagotvorne efekte na razne neurološke bolesti, stanja, disfunkcije ili poremećaje, uključujući neurodegenerativne bolesti to jest Alchajmerovu i Parkinsonovu bolest, multiplu sklerozu, hiperaktivnost i poremećaj nedostatka pažnje (ADHD), autizam, depresiju,nedostatak pamćenja i poremećaje raspoloženja. Naročito, bilo je pronađeno da AFA Klamath mikroalga, pored feniletilamina, koji je neuromodulator karakterisan dopaminergijskom i noradrenergičkom aktivnošću, sadrži specifične molekule koji su se, prilično iznenenađujuće, pokazali kao vrlo efektni inhibitori enzima monoaminoksidaze B (MAO-B), to jest: a) specifični AFA-fitohrom; b) AFA-fikobiliprotein kompleks koji sadrži fikobilizom formiran od C-fikocijanina (C-PC) i fikoeritrocijanina (PEC, uključujući njegovu hromoforu fikoviolobilin ili PVB) ("AFA-fikocijanine"); c) „mvcosporinelike amino acids" ili MAAs. Ovaj pronalazak je vrlo značajan, pošto bi PEA sadržan u algama, ukoliko ne bi bio zaštićen MAO-B inhibitorima, bio uništen odmah nakon gutanja od strane MAO-B enzima.

[0014] Isti molekuli koji deluju kao MAO-B selektivni inhibitori, takođe obavlajaju snažnu neuroprotektivnu ulogu, značajno poboljšavajući tako sposobnost ekstrakta da unapredi neurološko zdravlje.

[0015] Prema tome pronalazak obezbeđuje upotrebu za proizvodnju kompozicije za prevenciju, kontrolu ili lečenje gore pomenutih neuroloških bolesti, stanja, disfunkcija ili poremećaja, od AFA Klamath ekstrakta obogaćenog aktivnim komponentama, koji je pripremljen prema sledećim koracima: a) zamrzavanje sveže sakupljenih AFA algi i njihovo odmrzavanje, ili ako je polazni materijal sušeni AFA prah, sonifikacija vodom razblaženog AFA praha da se razore ćelije; b) centrifugiranje produkta iz koraka a) da se izdvoji supernatant (zadržavajući većinu citoplazmatičnog dela) iz precipitata (zadržavajući većinu celijskog zida);

c) sakupljanje supernatanta koji sadrži vodo-rastvorne komponente.

[0016] Rezultujući produkt je ekstrakt (naznačen kao "Bazni ekstrakt") koji koncentruje PEA kao i druge

sinergijske molekule kao što su AFA fitohrom, AFA-fikocijanini, i MAAs. Na primer, dok Klamath mikroalga ima prirodni sadržaj PEA koji se kreće od 2 do 4 mg/g, Bazni Ekstrakt povećava ovu koncentraciju do nivoa od 9 do 11 mg/g (HPLC analiza).

[0017] Ekstrakt se može dalje prečistiti propuštanjem kroz ultra-filtracioni sistem, prvenstveno kroz membranu sa MWCO (molekular vveight cut-off) od 30.000 Daltona. Ultrafiltracioni retentat (EkstraktA) sadrži kao osnovne komponente i AFA-fikocijanine (mol. težina= 121.000) i AFA-fitohrom (mol. težina 480.000). Zanimljivo, iako MAAs imaju molekulsku težinu znatno ispod upotrebljenog MWCO, retentat takođe povećava koncentraciju MAAs.

[0018] Baznom ekstraktu dobijenom u koracima a) do c) t.j. bez ultrafiltracije se obično daje prednost, pošto sadrži odgovarajuće količine PEA, AFA-fitohroma, AFA-PC i MAAs. Osim toga, ovaj Bazni ekstrakt takođe uključuje supstance kao što su hlorofil i karoteni, koje čak i u smanjenom procentu, doprinose njegovim antioksidativnim i anti-inflamatornim svojstvima.

[0019] Uočena inhibicija monoaminoksidaze-B je naročito značajna pošto omogućava da se poveća dopaminergijska transmisija i minimizira katabolizam PEA. Što je najznačajnije, i fitohrom i AFA-fikocijanin pokazuju reverzibilnu i mešovitu MAO-B inhibiciju, dok je MAO-B inhibicija pomoću MAAs kompetitivna i reverzibilna; dakle, sva tri molekula osiguravaju visoku efikasnost u fiziološkim uslovima i nemaju sporedne efekte.

[0020] U drugom pogledu, pronalazak je usmeren ka nutricionoj ili farmaceutskoj kompoziciji koja sadrži AFA Klamath ekstrakt za upotrebu kako je gore opisano. U poželjnoj primeni, nutricione kompozicije su dijetetski suplementi u obliku tableta, kapsula, napitaka; u sledećoj poželjnoj primeni farmaceutske kompozicije su u obliku tableta, kapsula, vrećica, sirupa, supozitorija, viala i ointmenta za upotrebu u prevenciji ili lečenju neuroloških ili neurodegenerativnih bolesti ili stanja naznačenih gore. AFA Klamath tečni ekstrakti za upotrebu prema pronalasku mogu biti upotrebljeni kao takvi ili mogu biti osušeni metodama kao što su: sušenje zamrzavanjem, sušenje raspršivanjem ili slično.

[0021] Doza aktivnog sastojka će zavisiti od nameravane upotrebe kompozicije, bilo kao dodatka ishrani ili kao farmaceutskog preparata. Efektivna količina svake komponente će generalno uzevši biti u sledećim granicama: PEA= 0.1-100 mg, poželjno 5-30 mg; fitohrom= 0.1-1 000 mg, poželjno 0.8-1 0 mg; MAAs= 0.1-1000 mg, poželjno 10-100; fikocijanini= 1-2500 mg, poželjno 50-1000 mg.

Detaljan opis pronalaska

Identifikacija " AFA- fitohroma", jedinstvenog fitohroma tipičnog za Klamath alge

[0022] Fitohromi su fotoreceptori, pigmenti koje biljke koriste da detektuju svetlost i koji su osetljivi u crvenoj i daleko crvenoj oblasti vidljivog spektra. Oni vrše mnogo različitih funkcija kod biljaka, uključujući regulaciju cvetanja (kroz cirkadijalni ritam), klijanje i sintezu hlorofila. Ovo poslednje je posebno značajno u vezi sa AFA algama, pošto prisustvo ovog jedinstvenog tipa fitohroma u AFA algama može biti objašnjeno nedostatkom drugog fikobiliproteina, koji druge cijanobakterije obično koriste da dopune C-fikocijanin u procesu fotosinteze, t.j. alofikocijanina. Dok je mesto alofikocijanina u Klamath algi preuzeto od fikoeritrocijanina ili PEC (vidi dole), izgleda da sam PEC nije dovoljan, naročito ako se uzme u obzir da Klamath alge žive u ne-tropskom okruženju koje iziskuje visoku efikasnost sakupljanja svetlosti, pa tako AFA alge svoje veće potrebe izgleda popunjavaju pomoću fitohroma.

[0023] AFA-fitohrom koji ima posebnu strukturu, je ovde opisan prvi put. Tokom godina, u biljkama su pronađeni različiti tipovi fitohroma, koji ne samo da imaju različite gene fitohroma (3 u pirinču i 6 u kukuruzu, na primer), već najčešće imaju značajno različite proteinske komponente i strukturu. Ono što ih sve čini fitohromima je to što svi koriste isti biliprotein, zvani fitohromobilin, kao hromoforu koja apsorbuje svetlost. Ova hromofora je slična fikocijaninskoj hromofori fikocijanobilinu, i karakteriše je jedan bilin molekul koji se sastoji od otvorenog lanca sa četiri prstena pirola (tetrapiroli). Osobito, u svom Prnormalnom stanju ovaj biliprotein apsorbuje svetio sa maksimumom na 650-670 nm, pri čemu kada je bio aktiviran crvenim svetlom transformisao se u Pfrsa maksimumom apsorbance na 730 nm.

[0024] Prvi otkriveni cijanobakterijski fitohrom iz" Synechocystis"- a,pokazao je malu sličnost u strukturi sa biljnim fitohromima. Ipak, biliprotein" Synechocystis"- ase obično smatra fitohromom pošto je crveno/daleko crveno reverzibilni hromoprotein. (48)

Prečišćavanje i karakterizacija AFA fitohroma

[0025] AFA-fitohrom kao hromoforu ima biliprotein koji apsorbuje svetio u crvenom/ daleko crvenoM spektru. Da bi utvrdili njegovu strukturu i aktivnost prečistili smo fitohrome prema sledećem protokolu:

- Suspendovati 1 g ekstrakta u 10 ml 1 K-fosfatnog pufera, pH 7.0

- Vorteksovati dva puta po 1 min sa polovinom njihove zapremine

- Inkubirati ćelije tokom 35' sa 2% Triton X 100

- Centrifugirati na 28000 rpm 16-18h

- Sakupiti supernatant na saharoznom gradijentu gustine

- Centrifugirati gradijent koristeći swing-out rotore na 150000 g tokom 12 h

- Čuvati na-20'C.

[0026] Fitohrom odgovara lizatnoj traci intenzivno narandžaste boje, koja je vidljiva na otprilike 1 M saharoze, dok je fikobilizom na oko 0.75 M. Ovaj odnos dve trake takođe daje pouzdanu indikaciju o molekulskoj težini fitohroma prisutnog u algi, koja je oko četvorostruke vrednosti za trimerni AFA-PC: s obzirom da je ova poslednja iznosila 121 Kd, možemo preliminarno utvrditi MW AFA- fitohroma na otprilike 480Kd (Slika 22)

[0027] Testiran na svojstva apsorpcije svetlosti, fitohrom pokazuje da apsorbuje svetlost sa dva pika na 672 nM i 694 nM, koji odgovaraju respektivno Pr(apsorbuje crveno svetio) i Pfr(apsorbuje daleko-crveno svetio) formama u stanju ekvilibrijuma (Slika 23).

[0028] Što se tiče količine fitohroma sadržanog u AFA, naša prva procena daje sledeći preliminarni rezultat: 2 mg/gr (ili 0.2% DW). Što se tiče ekstrakta, koncentracija raste do oko 0.5% u Baznom Ekstraktu, i oko 1 % u Ekstraktu B. Ovo su niske koncentracije, a ipak antioksidativna/antinflamatorna potentnost ovog molekula je tako velika da i vrlo male količine mogu proizvesti vrlo značajne efekte.

Antioksidativna aktivnost

[0029] Prečišćeni AFA-fitohrom se pokazao kao vrlo snažan antioksidant. U stvari, u apsolutnom smislu, to je najjači molekul do sada pronađen u Klamath algi. Inkubacija od 2 časa, uzoraka ljudske plazme sa oksidansom CuCI2na 100 uM izaziva povišene nivoe malondialdehida (MDA), kasnijeg međuprodukta lipidne peroksidacije merenog pomoću spektrometra na 535 nm nakon reakcije sa tiobarbiturnom kiselinom (TBA test). Kada je plazma inkubirana 2 časa na 37°C sa CuCI2100 uM zajedno sa rastućim količinama AFA-fitohroma (2-16 nM) ekstrahovanim iz AFA alge, primećeno je vrlo jako, dozno zavisno, smanjenje nivoa MDA (Slika 24). U stvari, skoro cela inhibicija lipoperoksidacije je postignuta sa MDA nivoima bliskim kontrolnim, sa samo 16 nM AFA fitohroma. Što je značajno, IC50 od 3.6 nM je 45 puta manji od onog koji je dobijen za PCB. Fitohrom je glavni odgovoran za antioksidativne i neuroprotektivne efekte Baznog ekstrakta, koji su veći od efekata AFA-PC-a.

Ekstrakcija, prečišćavanje i kvantifikacija MAAs

[0030] Testirali smo prisustvo MAAs u cijanofitiAphanizomenon flos- aquaeiz jezera Klamath, opšte poznatoj kao Klamath alga. Prema našem saznanju, postoji samo skorašnji izveštaj o pojavi MAAs u nekojAphanizomenonvrsti (47); Međutim, taj izveštaj identifikuje samo porfiru kao prisutnu MAAs, dok naše istraživanje pokazuje prisustvo dve MAAs, Porfire i Shinorine. Sa druge strane, u odnosu na celokupnu literaturu o algama, dok većina do danas opisanih cijanobakterija sadrže shinorine kao primarnu MAAs, pronašli smo retku pojavu porfire-334 kao primarne MAA uAphanizomenon flos- aquaekao dodatak shinorini.

[0031]MAAs su ekstrahovane kako je ranije prikazano. (29) Ukratko, 20 mg AFA praha ili 20 mg. vodenog ekstrakta su ekstrahovani u 2 ml 20% (v/v) vodenog rastvora metanola (HPLC grade) inkubiranjem u vodenom kupatilu na 45'C u toku 2.5 h. Posle centrifugiranja (5000 g; GS-15R Centrifuge, Beckman, Palo Alto, USA), supernatant je uparen do suvog i ponovo rastvoren u 2 m1100% metanola, vorteksovan 2-3 min i centrifugiran na 10000 g 10 min. Supernatant je uparen a ekstrakt ponovo rastvoren u istoj zapremini 0.2% sirćetne kiseline za analizu na HPLC ili u 200 ul fosfatnog pufera (PBS) za procenu antioksidativnih svojstava. Uzorci su bili filtrirani kroz špric filtere sa veličinom pora 0.2 pm (VWR International, Milan, Italv) pre nego što su bili podvrgnuti HPLC analizi, ili testu antioksidativnih svojstava (vidi dole).

[0032] MAAs Klamath alge imaju apsorpcioni maksimum na 334 nm. Dalje prečišćavanje MAAs je izvršeno pomoću HPLC sistema (Jasco Corporation, Tokvo, Japan) opremljenog sa Alltima C18 kolonom i zaštitom (4.6 x 250 mm i.d., 5 pm packing, Alltech, Milan, Italv), prema literaturi (30). Talasna dužina za detekciju je bila 330 nm; mobilna faza je bila 0.2% sirćetna kiselina pri protoku od 1.0 ml min-<1>. Identifikacija MAAs je izvršena poređenjem apsorpcionog spektra i retencionih vremena sa standardima kao što suPorfiraiPterocladia sp.,koji su uglavnom sadržali porfiru-334, shinorine i palitin, i koji su bili obezbeđeni Ijubaznošću Dr Manfred Klischa, Friedrich-Alexander-Universitat, Erlangen, Germanv. Apsorpcioni spektri uzoraka bili su mereni od 200 do 800 nm na "single-beam" spektrofotometru (DU 640, Beckman, Palo Alto, USA). Sirovi spektri su prebačeni na kompjuter i matematički obrađeni za analizu pikova MAAs.

[0033] MAAs su bile delimično prečišćene iz AFA uzorka i iz ranije opisanog vodenog ekstrakta. Ekstrakcija uzoraka sa 20% metanolom na 45"C u toku 2.5 h rezultirala je u izraženom piku na 334 nm (MAAs); čak i ako su male količine fotosintetičkih pigmenata (kao što je fikocijanin na 620 nm) takođe ekstrahovane ovom procedurom (vidi Sliku 1, isprekidana linija). MAA uzorci su dalje bili tretirani sa 100% metanolom u cilju uklanjanja proteina i soli i na kraju sa 0.2% sirćetnom kiselinom da se uklone nepolarni fotosintetički pigmenti. Dobijene delimično prečišćene MAAs su imale apsorpcioni maksimum na 334 nm (Slika 1, puna linija).

[0034] Dalja analiza i prečišćavanje MAAs je izvedeno pomoću HPLC sa ciljem da se utvrdi da li su jedinjenja koja su apsorbovala na 334nm bile pojedinačne MAA ili smeša sa više od jedne MAAs. Hromatogram uzorka (Slika 2) pokazuje prisustvo dve MAAs sa retencionim vremenima od 4.2 (pik 1) i 7.6 min (pik 2) koje su bile identifikovane kao shinorine i porfira-334, respektivno. Porfira-334 je izgleda glavna MAA u AFA s obzirom da je shinorine bila prisutna samo u malim količinama (odnos pikova 1: 15).

[0035] UV spektar prečišćenih MAAs potvrdio je njihov apsorpcioni maksimum na 334 nm (Slika 3).

[0036] Uzimajući u obzir da su koeficijenti molarne ekstinkcije na 334 nm za shinorine i porfiru-334, 44700 i 42300 M-1 cm-<1>, respektivno, izračunali smo: a) za AFA alge, koncentracije od 0.49 mg g1 DW za shinorine i 7.09 mg g<1>DW za Portiru -334; tako da je ukupni MAAs sadržaj 0.76% algal DW;

b) Za Bazni ekstrakt, koncentracije od 17-21 mg MAAs (što je 1.7-2.1 % DW).

[0037] Ovo su značajni podaci, pošto ceo AFA sadrži visoke konstitutivne nivoe MAAs (0.76% DW), bliske

maksimalnim koncentracijama nađenim pod UV ekspozicijom, t.j. 0,84%. (31) Takođe smo pronašli da ekstrakt ima višu koncentraciju nego cele alge, dostižući nivoe koji su mnogo viši od maksimalnih potencijalnih koncentracija.

[0038] MAAs (shinorine i porfira-334) su strukturno prosti molekuli, sa molekulskom težinom 300. To omogućava da ovi vodorastvorni molekuli lako prelaze barijeru krv-mozak, potvrđujući njihovu sposobnost da izraze svoj

[0039] potencijal MAO-B inhibitora u oblasti gde je to najneophodnije, u mozgu.

Fikocijanini

[0040] Fikocijanini su prisutni u ekstraktu u koncentraciji od 8-10% (za kvantifikaciju, vidi dole). Fikocijanini su plavi pigmenti tipični za sve cijanobakterije ili plavo-zelene alge, iako sa posebnim karakteristikama za svaku specifičnu mikroalgu. (32) Što se tiče funkcionalnih i terapeutskih svojstava fikocijanina, istraživanja su najviše bila usmerena na one iz mikroalge Spirulina. Prečišćeni fikocijanini iz Spiruline su pokazali da poseduju antioksidativno (33) i anti-inflamatorno (34,35,36) delovanje na razne fiziološke sisteme kao što su: jetra (37), respiratorni sistem (38) i mozak (39, 40). Ova svojstva prečišćenog PC iz Spiruline generalno mogu biti pripisana i fikocijanini ma drugih algi, s obzirom na njihovu suštinsku sličnost. Ipak, mogu postojati razlike u fikocijaninima iz različitih vrsta mikroalgi koje mogu voditi do različite potentnosti u ispoljavanju gore opisanih funkcionalih i terapeutskih svojstava.

Strukturalno određivanje i specifične karakteristike fikobilizoma Klamath alge.

[0041] Uopšteno govoreći, u intaktnim cijanobakterijskim ćelijama fikocijanini (PC) su prisutni unutar fikobilizoma u funkcionalnom obliku (crB)6(41). Praćenjem razaranja ćelija, protein može biti pronađen u različitim stanjima agregacije (monomeri, dimeri, trimeri, heksameri) prema organizmu koji je analiziran. U slučaju Klamath alge, elektroforetska analiza PC-a, kako onog sadržanog u ekstraktu tako i onog prečišćenog iz samog ekstrakta, pokazala je da je protein pronađen uglavnom u formi trimera (aB)3, sa ukupnom molekulskom težinom od 121000. Monomer aB teži oko 40000 (18500 subjedinica a + 21900 subjedinica B). Za razliku od toga većina studija o prečišćenom FC iz Spiruline govori nam da je protein pronađen u Spirulini u obliku monomera aB sa molekulskom težinom od oko 37500, na taj način pokazujući različito stanje agregacije u odnosu na prečišćen PC iz AFA.

[0042]Hromatografska analiza fikobilizoma iz AFA je takođe pokazala da kao i kod drugih vrsta cijanobakterija, a subjedinica PC-a vezuje prostetičku grupu, dok B subjedinica vezuje dve. Prostetička grupa ili hromofora je nazvana fikocijanobilin (PCB) i odgovorna je i za plavu boju proteina i za njegovu antioksidativnu moć(42).

[0043]Suštinska razlika između AFA i Spiruline počiva na različitoj strukturi fikobilizoma. Nasuprot Spirulini, fikobilizomi u AFA Klamath ne sadrže pigment alofikocijanin, već samo c-fikocijanin, strukturnu komponentu koja nedostaje kod Spiruline, t.j. fikoeritrocijanin (PEC). FEC je fotosintetički pigment koji je do sada bio identifikovan samo u ograničenom broju vrsta cijanobakterija (43). PEC ima hemijsku strukturu vrlo sličnu onoj koju ima FC, sastoji od dve subjedinice a i B koje se povezuju da formiraju monomere i trimere. Ipak, dok svaki monomer PC-a vezuje 3 molekula PCB-a, PEC poseduje jedinstvenu karakteristiku vezivanja dva molekula PCB za subjedinicu B i jedan molekul fikoviolobilina (PVB) za a subjedinicu, koja je odgovorna za ljubičastu boju pigmenta.

[0044]Ovo je apsolutno prvi put da je fikobilizom Klamath alge definisan kao naročito konstituisan spajanjem c-fikocijanina i fikoeritrocijanina, i ova različita kvalitativna struktura fikobilizoma AFA Klamath alge dodaje sledeći odlučujući faktor za razlikovanje AFA od Spiruline.

[0045]Slika 4 potvrđuje ono što je bilo rečeno, poredeći komponente celijskih lizata iz AFA sa onima iz druge poznate cijanobakterije,SynechocystisPCC 6803. U obe cijanobakterije se mogu videti plave trake koje predstavljaju fikobilizome, ali kod AFA alge fikobilizomi pokazuju manju molekulsku masu, potvrđujući da su, nasuprot običnim mikroalgama poput Spiruline, u AFA fikobilizomima prisutni samo fikocijanini, ali ne i alofikocijanini. Osim toga, Slika pokazuje da je u AFA takođe prisutna svetio ljubičasta traka (pokazana strelicom) koja je tipična za fikoceritrocijanine, dokazujući tako njihovo prisustvo u fikobilizomu Klamath alge.

[0046]Da se produbi definicija, svaka plava traka je bila dalje analizirana pomoću HPLC-a povezanog sa masenim spektrometrom (RP-HPLC-ESI-MS). Zahvaljujući različitim retencionim vremenima proteini fikobilizoma su bili razdvojeni i identifikovani na osnovu njihovih molekulskih masa. Dobijeni rezultati su prikazani u sledećim tabelama. Prvo što vidimo je da dok je u "Synechocystis"-u (Tabela 1) prisutan i fikocijanin (cpcA na 28.2 min i cpcB na 28.9 min) i alofikocijanin (apcA na 30.7 min i apcB na 31.2 min), u AFA (Tabela 2) je prisutan samo fikocijanin (cpcA na 28.8 min i cpcB na 30.0 min). Drugo, u AFA je bio identifikovan protein sa molekulskom masom od 19469, koji nije prisutan uSynechocystisi koji odgovara beta subjedinici fikoeritrocijanina sa dva vezana bilina (pecB a 25.0 min).

[0047] Ova jedinstvena struktura je važan element da se objasni jače antioksidativno i antinflamatorno delovanje celog AFA-PC u odnosu na njegov PCB. Antioksidativna i antinflamatorna svojstva postaju značajna u ovom kontekstu ukoliko stvaraju jaku neuroprotekciju; Ceo PC je snažniji nego njegov PCB takođe u smislu neuroprotekcije, što jasno ukazuje da je druga aktivna komponenta pored PCB u fikobilizomu, t.j. PEC sa njegovim specifičnim PVB hromoforama, vrlo verovatno najaktivniji sastojak za poboljšanje zdravlja u AFA-PC. Da prečišćeni AFA-PC zaista sadrži ne samo C-PC sa njegovom PCB hromoforom, već i PEC i njegovu PVB hromoforu je evidentno ako se pogleda spektar ekstrakta nastalog prečišćavanjem (Slika 5). U stvari, maksimum apsorpcije C-PC je 620 nm, koji na spektru na Slici 5 pretstavlja vrh pika. Ali, poznato je da je apsorpcioni maksimum PEC na 566 nm za a-subjedinicu (fikoviolobilin ili PVB) i respektivno 593 nm i 639 nm za dva PCB-a iz B-subjedinice. Sve tri vrednosti su zaista uključene u pik zvonastog oblika koji čini spektrometrijski profil prečišćenog PC-a. U razmatranju čvrste teško raskidive veze, između C-PC i PEC u AFA algi, ovo potvrđuje da je pored C-PC-a, i PEC takođe neophodan deo prečišćenog PC ekstrakta. Iz toga proizilazi da je PC iz AFA značajno različit, strukturno i funkcionalno, od PC-a drugih cijanobakterija, uključujući i onaj iz Spiruline, na kojoj je rađena većina studija; i da se ova razlika sastoji u tome što imaju samo jedan uobičajeni deo t.j. C-PC, ali ne drugi; sa posledicom da, dok svojstva C-PC takođe mogu biti pripisana C-PC komponenti iz AFA-PC, svojstva celog PC iz AFA, koji je u njemu u obliku C-PC/PEC kompleksa (uključujući njegove hromofore PCB i PVB), se mogu pripisati isključivo njemu (kao i za bilo koji C-PC/PEC kompleks prisutan u nekoj drugoj mikroalgi).

Metodologija prečišćavanja ( Slika 5)

[0048] PC je bio prečišćen iz osušenog AFA ekstrakta kako sledi: suspendovati 500 mg ekstrakta u 50 ml 100 mM Na-fosfatnog pufera pH 7.4;

centrifugirati na 2500 rpm 10' na 4'C;

Prikupiti supernatant i dodati čvrsti amonijum sulfat do 50% zasićenja;

taložiti proteine 60 min na 4°C uz mešanje uzorka;

centrifugirati na 10,000 rpm tokom 30 min na 4°C;

odbaciti bezbojni supernatant i ponovo rastvoriti plavi precipitat u maloj zapremini od 5 mM Na

fosfat pufera Ph 7,4;

dijalizirati celu noć na 4'C sa istim puferom;

staviti dijalizirani PC u hidroksiapatit kolonu uravnotežena sa 5 mM Na-fosfat puferom pH 7.4; eluirati uzorak sa Na-fosfat puferom pH 7.0 rastuće jonske jačine (od 5 do 150 mM);

prikupiti frakcije i očitati apsorbanse na 620 nm i 280 nm pomoću spektrofotometra;

spojiti frakcije u kojima je Abs62o/AbS2so > 4 (indeks čistog PC);

taložiti PC sa amonijum sulfatom do 50% zasićenja 1sat na4°;

centrifugirati na 10,000 rpm 30' na 4°C;

odstraniti supernatant i ponovo suspendovati PC u 150 mM Na-fosfat puferu Ph 7.4;

dijalizirati sa istim puferom na 4"C;

prebaciti prečišćen PC u bocu i čuvati na tamnom mestu na +4°C ili -20'C.

Kvantifikacija fikocijanina

[0049] Za merenje molarne koncentracije čistog PC koristili smo njegov koeficijent molarne ekstinkcije e na 620 nm, koji za formu trimera (afS)3 iznosi 770000 M<1>cm<1>: To znači da rastvor 1 M PC-a na 620 nm ima vrednost apsorpcije 770000.

[0050]Za merenje koncentracije PC-a u ekstraktu, koristimo koeficijent specifične ekstinkcije E<1*>na 620 nm od 70 l g1cm-1. To znači da rastvor sa 1% PC-a (1 g/100 ml) na 620 nm apsorbuje 70. Na osnovu ovih proračuna, prosečan sadržaj PC-a u ekstraktu je 80-100 mg/g DW (8-10% DW).

Prečišćavanje PCB hromofore { Slika 6 )

[0051]

• Suspendovati 500 mg ekstrakta u 50 ml destilovane H20.

• Centrifugirati na 2500 rpm tokom 10' na 4°C.

• Dekantovati tamno plavi supernatant i istaložiti PC-a sa trihlorsirćetnom kiselinom 1 %.

• Inkubirati 1 h u mraku na 4°C, uz mešanje.

• Centrifugirati na 10000 rpm 30' na 4" C.

• Prikupiti pelet koji sadrži PC i oprati 3 puta metanolom.

• Ponovo rastvoriti pelet u 10 ml metanolu sa 1 mg/ml HgCI2.

• Inkubirati tokom 20 h na 42<*>C u mraku da se oslobodi PCB iz PC.

• Centrifugirati na 2500 rpm 10'da se uklone proteini.

• Supernatantu koji sadrži PCB dodati B-merkaptoetanol (1 u1/ml) da se istaloži HgCI2.

• Inkubirati na -20°C tokom 24 h.

• Centrifugirati na 10000 rpm 30' na 4°C da se ukloni beli precipitat.

• Dodati supernatantu 10 ml metilen hlorid/butanola (2: 1, v/v).

• Oprati sa 20 ml destilovane H20 i centrifugirati na 3000 rpm 10'.

• Ukloniti gornju fazu, pokupiti donji deo koji sadrži PCB.

• Oprati PCB u 15 ml H20 3 puta.

• Osušiti pod azotom i čuvati na -20° C.

PROCENA MAO- B INHIBICIJE AFA KLAMATH EKSTRAKTA I NJEGOVIH KONSTITUTIVNIH AKTIVNIH SASTOJAKA

FITOHROMA, FIKOCIJANINA I MAAs

[0052] Testirali smo MAO-B inhibitornu aktivnost Baznog Ekstrakta pomoću tačno određenog supstrata benzilamina (1mM). Test je bio izveden pomoću spektrofotometra na 30°C na talasnoj dužini od 250 nm, preinkubiranjem MAO-B (2 ug/ml) sa različitim koncentracijama vodorastvornih i u mastima rastvornin komponenata Baznog Ekstrakta, dobijenog u koracima a) do c) gore opisanim (početna koncentracija 10

mg/ml). Vodorastvomom komponentom obogaćen ekstrakt bio je pripremljen ponovnim rastvaranjem vodenog ekstrakta u vodi i sakupljanjem supernatanta nakon centrifugiranja. Lipofilnom komponentom obogaćen rastvorivi ekstrakt je dobijen ponovnim rastvaranjem ekstrakta u acetonu; nakon toga je supernatant bio osušen, a pelet ponovo rastvoren u DM50, rastvaraču kompatibilnom sa dozom MAO-B.

[0053] Kako je prikazano na Slici 7 A, vodorastvorna frakcija inhibira MAO-B na način zavisan od doze, dok lipofilna frakcija ne inhibira enzim. Vodorastvorna frakcija AFA Baznog Ekstrakta je potentni selektivni MAO-B inhibitor, sa IC«, od 6.9 uL. Njegova MAO-B selektivnost je 4 (IC„ MAO-B/IC«, MAO-A> 4,05) (Slika 7B).

[0054] Lineweaver-Burk dijagram na Slici 8 pokazuje da je inhibicija reverzibilna i mešovitog tipa u odnosu na kompeticiju, sa smanjenjem Vm„ i povećanjem Michaelis-Menten Kmkonstante. Crtanjem grafika nagib-koncentracija vodorastvorne frakcije AFA ekstrakta, dobijena je konstanta inhibicije K, od 1uL. U poređenju sa vodorastvomom frakcijom Baznog ekstrakta, ova niska Kivrednost ukazuje na veliki afinitet ka MAO-B enzimu.

[0055] Činjenica da je inhibicija ekstrakta reverzibilna znači da on obavlja fiziološku aktivnost verovatno bez sporednih efekata. Što se tiče mešovite kompeticije, vrlo je verovatno da ekstrakt zbog složene prirode, sadrži razne funkcionalne molekule, neke kompetitivne i druge nekompetitivne. Osnovne aktivne komponente ekstrakta su AFA-fitohrom (0,5% DW); fikocijanini (8-10% DW); i MAAs ili "mycosporine-like aminoacids" (1.7-2.1% DW), koje smo ispitivali pojedinačno kao MAO-B inhibitore.

MAO- B inhibicija fikocijaninima

[0056] Ispitivanje je bilo izvedeno pomoću spektrofotometra na 30° C sa talasnom dužinom od 250 nm, korišćenjem benzilamina kao supstrata, preinkubiranjem MAO-B sa različitim koncentracijama prečišćenog PC-a iz AFA (0.5-4 uM). Kako je prikazano na Slici 9, AFA-PC izaziva dozno-zavisno opadanje MAO-B aktivnosti, sa\ C„od 1 ,44pM. MAO-B selektivnost AFA-PC-a je viša od 3.5 (IC50MAO-B/IC50MAO-A>3.5).

[0057] Lineweaver-Burk dijagram na Slici 10 pokazuje kao i sa ekstraktom, reverzibilnu inhibiciju mešovitog tipa (kompetitivna i nekompetitivna) sa promenom vrednosti i V™*i Km.

[0058] Crtanjem grafika nagib-koncentracija PC-a dobijamo vrednost konstante inhibicije Ki, koja je ovde 1.06 uM. Konstanta inhibicije je mera afiniteta inhibitora ka enzimu: visoka Kiukazuje na mali afinitet ka enzimu i obratno. U ovom slučaju, niska vrednost K ukazuje na veliki afinitet AFA PC prema MAO-B.

MAO- B inhibicija pomoću MAAs

[0059] Aktivnost MAO-B na benzilamin supstratu je bila procenjena u odnosu na rastuće koncentracije MAAs (0.5-8 uM), prethodno prečišćenih iz Baznog Ekstrakta sa 20% metanolom. Slika 11 pokazuje dozno-zavisnu MAO-B inhibiciju pomoću MAAs, sa IC«, od 1.98 uM. MAO-B selektivnost MAAs je viša od 2 (IC50MAO-B/ICsoMAO-A >2,02).

[0060] Linev/eaver-Burk dijagram (Slika 12) pokazuje da je inhibicija reverzibilna i kompetitivna, sa porastom Kmali bez promene Vm«. To znači da MAAs, zahvaljujući svojoj hemiskoj strukturi konkurišu sa supstratom za vezu na aktivnom mestu enzima. Crtanjem grafika nagib-koncentracija MAAs (Slika 13) dobijamo vrednosti za konstantu inhibicije Ki, koja iznosi 0.585 uM, što predstavlja vrlo veliki stepen afiniteta ka enzimu.

MAO- B inhibicija AFA fitohromima

[0061] Ispitivanje je bilo izvedeno pomoću spektrofotometra na 30° C i talasnoj dužini od 250 nm, sa benzilaminom kao supstratom, preinkubiranjem MAO-B sa različitim koncentracijama prečišćenog AFA fitohroma (8.3 - 66.4 nM). Kako je prikazano na Slici 15, AFAfitohromi prouzrokuju dozno zavisno sniženje MAO-B aktivnosti, sa IC» od samo 20.2 nM.

[0062] Linevveaver-Burk dijagram na Slici 16 pokazuje, kao i sa ekstraktom, da je inhibicija reverzibilna mešovitog tipa (kompetitivna i nekompetitivna) sa promenom obe vrednosti i V™« i Km.

[0063] Crtanjem grafika nagib-koncentracija AFA fitohroma dobijamo vrednost konstante inhibicije Ki, koja je ovde 10,48 nM. Konstanta inhibicije je mera afiniteta inhibitora ka enzimu: visok Kiukazuje na nizak afinitet ka enzimu i obratno. U ovom slučaju, izuzetno niska Kivrednost ukazuje na veoma veliki afinitet AFA fitohroma prema MAO-B.

[0064] Kompetitivno i reverzibilno delovanje MAAs čini ove molekule veoma moćnim u inhibiciji MAO-B. Zaista, kompetitivni reverzibilni karakter MAO-B inhibicije osigurava istovremeno visoku efikasnost i fiziološku aktivnost bez sporednih efekata. U tom smislu, MAAs sadržane u ekstraktu, takođe, zbog svoje

molekulske težine i mogućnosti da lako pređu krvno-moždanu barijeru, predstavljaju odlučujuću komponentu, čak iin vivo,za stvaranje terapeutskih efekata koji potiču od MAO-B inhibicije.

[0065] Čak i više nego MAAs, fitohrom je dokazano najmoćniji MAO-B inhibitor od svih do sad poznatih supstanci. Njegov vrlo veliki afinitet prema MAO-B enzimima, i njegova efektivna inhibicija u dozama od nekoliko nanomola, čini ovaj molekul ne samo perfektnim terapeutskim agensom, već faktorom koji čini se, obezbeđuje najvažniji doprinos visokoj neurološkoj delotvornosti AFA ekstrakta.

[0066] Treba dodati da se neki od razloga koji se odnose na MAAs i fitohrome mogu primeniti i na karakterističnoin vivoponašanje fikocijanina. Znamo da PC generiše neuroprotektivne efekte u mozguin vivo,tako da su u stanju da pređu krvno-moždanu barijeru. (44) To znači da su i oni u stanju da ostvarein vivosvoju MAOB inhibitomu aktivnost u mozgu. Molekulska težina hromofore je zaista samo 700, što nije mnogo više od Molekulske težine MAAs. Isto važi i za hromoforu fitohroma, fitohromobilin, strukturno sličnu fikocijanobilinu.

[0067] Na posletku, aktivnost MAO-B inhibicije ekstrakta i njegovih aktivnih komponenti, AFA fitohroma, AFA-PC i MAAs, je izuzetno značajna, budući da se i molekuli i ekstrakt postavljaju na najviši nivo aktivnosti, jednak ili veći od farmakoloških supstanci, i dosta superiorniji od bilo kog ispitanog prirodnog molekula, što je prikazano u sledećoj tabeli (45):

[0068] Kao što je prikazano u tabeli, samo fikocijanini i MAAs imaju IC50nešto veći od 1 uM, dakle vrlo blizak onom koji ima Deprenil (0.31 uM), a desetine puta niži od ICso drugih molekula koji su razmatrani. AFA fitohrom, s druge strane, ima IC5o 15 puta manji od Deprenila. Isto važi i za konstantu inhibicije Kjkoja je mera afiniteta inhibitora ka enzimu. AFA-fikocijanini imaju Kjoko 1 uM, kao i Non Harmanovi alkaloidi kafe i duvana (ali naravno bez ijednog problema povezanog sa ove dve supstance). Sa druge strane, MAAs i AFA fitohromi su jedini molekuli, zajedno sa Deprenilom, koji imaju Kjniži od 1 uM, odnosno vrlo veliki afinitet prema MAO-B. U stvari, AFA fitohrom je jedini prirodni molekul, pored Selegilin/Deprenila, čiji Kjje reda nekoliko nanomola. Ipak, postoji suštinska razlika između Selegilin/Deprenila i molekula AFA ekstrakta: prvi je ireverzibilni inhibitor, stoga karakterisan potencijalnim sporednim efektima; dok su AFA Klamath MAO-B inhibirajući molekuli svi reverzibilni, karakterisani fiziološkom aktivnošću, bez problema povezanih sa sintetičkim molekulima.

[0069] Slika 14 grafički prikazuje MAO-B inhibitomu aktivnost tri molekula AFA u odnosu na Deprenil. S obzirom na sinergiju sva tri molekula u Baznom ekstraktu (i drugim AFA ekstraktima), ukupna MAO-B inhititorna aktivnost Baznog ekstrakta je jako velika. Nešto što postaje naročito značajno uzimajući u obzir i veliku količinu PEA prisutnu u njemu. Ako poredimo Bazni ekstrakt sa deprenilom na osnovu njegovog sadržaja PC-a, dobijamo da Bazni ekstrakt dostiže IC5o pri dozi PC-a od samo 0,05 uM, što bi ukazivalo na 7.5 puta višu potentnost od Deprenila (i desetine puta višu nego kod prirodnih supstanci). Ovo ima smisla u svetlu potentnosti fitohroma sadržanih u Baznom Ekstraktu: u stvari 7.5 puta je prošek između inhibitorne potentnosti PC-a i MAAs, što je neznatno niže od Deprenila, i od moći fitohroma, koja je 15 puta veća (Slika 17). Ovo takođe pokazuje da je potentnost ekstrakta u odnosu na prečišćeni AFA-PC viša uglavnom zbog fitohroma.

[0070]Pored toga, ekstrakt i dalje zadržava prednost pošto je prirodna supstanca koja deluje fiziološki, i čija MAO-B inhibicija je reverzibilna i uglavnom konkurentna, pa otuda i bez sporednih efekata potencijalno povezanih sa ireverzibilnim molekulima kao što su Deprenil i druge sintetičke supstance. (46)

[0071]Još jedna prednost ekstrakta je njegov visok sadržaj feni leti lami na, moćnog dopaminergijskog neuro-modulatora koji deluje u totalnoj sinergiji sa drugim molekulima, sinergijsku aktivnost ovako možemo da rezimiramo: Feniletilamin ili PEA ima dvostruku dopaminergijsku aktivnost, pošto stimuliše oslobađanje dopamina iz nigrostriatalnog tkiva, i pošto inhibira post-sinaptičko ponovno preuzimanje dopamina; Fitohrom, MAAs i fikocijanini, kao snažni MAO-B inhibitori, takođe povećavaju dopaminergijsku transmisiju utoliko što smanjena aktivnost MAO-B podrazumeva duži život neuroamina, uključujući

dopamin;

Fitohrom, MAAs i fikocijanini, kao MAO-B inhibitori, takođe prolongiraju život i aktivnost feniletilamina, koji je i sam objekat deaminacione aktivnosti MAO-B enzima, sa stvaranjem besprekornog kruga dalje podrške dopaminergijske transmisije i aktivnosti i uopšte

neuromodulacije proizvedene od PEA kao posledicom.

Konačno, moćna antioksidativna i anti-inflamatorna aktivnost fikocijanina, zajedno sa njihovom, ili mogućnošću njihovih hromofora da pređu krvno-moždanu barijeru, kao i izuzetno visoka antioksidativna aktivnost fitohroma i slabija ali značajna antioksidativna aktivnost MAAs, stvara neuroprotekciju koja štiti različite aktivne molekule i uopšte, besprekoran neurološki ciklus koji oni čine, od bilo kog oksidativnog i inflamatornog oštećenja.

NEUROPROTEKCIJA

[0072]Ispitivali smo neuroprotektivne osobine AFA ekstrakta, specifičnog AFA-PC i njegove hromofore PCB, isto kao i MAAs na neurotoksični efekat glutamata.

[0073] Glutamat je glavni ekscitatorni neurotransmiter u centralnom nervnom sistemu sisara, ali prekomerna stimulacija njegovog NMOA podtipa receptora u neuronima aktivira masivnu intracelularnu akumulaciju Ca<2>+, dovodeći do umiranja ćelija. Pored toga intramitohondrialna Ca<2>+ akumulacija, nakon stimulacije NMOA receptora, kratkotrajno povećava slobodni Ca<2>+ u citosolu aktivirajući neuronalnu isoformu "azot oksid sintaze" (NOS) (49), enzima koji gradi azot-oksid (NO) ili, uglavnom u primarnim neuronima, reakcioni produkt njegovog superoksida (0<2>), peroksinitrit (0N00-).

[0074]Izlaganje neurona glutamatu je izvedeno prema malo izmenjenoj metodi (50): medijum kulture je uklonjen i neuroni su bili isprani jednom sa predgrejanim na 37°C, puferovanim Henkovim rastvorom (5.26 mM KCI, 0.43 mM KH2H2P04, 132.4 mM NaCI, 4.09 mM NaHCOj, 0.33mM Na2HP0<, 20 mM glukoze, 2 mM CaCI2, i 20 mM HEPES. pH 7.4) i pre-inkubirani u otsustvu ili u prisustvu nekoliko koncentracija AFA ekstrakta (1-50 nM), PC (10-1000 nM), PCB (10-1000 nM) i MAA (1-10 uM) u predgrejanom 37°C puferovanom Henkovom rastvoru. Nakon 30 min od preinkubacije, L-glutamat je dodat iz koncentrovanog rastvora do konačne naznačene koncentracije 100 uM plus 10 uM glicina. Neuroni su bili inkubirani na 37°C tokom 15 min, pufer je izvučen, zamenjen sa DMEM i ćelije su bile inkubirane na 37°C narednih 24sata u odsustvu efektora.

[0075]Apoptoza je procenjena bojenjem jezgara ćelija sa DAPI (50), membran-permeablnom fluorescentnom bojom koja vezuje DNA i omogućava kvantifikaciju apoptotičkih neurona, t,j, neurona koji pokazuju fragmentisana ili kondenzovana jezgra. Ukratko, 24 h nakon izlaganja glutamatu, neuronske kulture su oprane u toplom PBS (37°C) i fiksirani sa4%(wt/vol) paraformaldehidom u PBS tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Nakon što su bile isprane sa PBS, ćelije su bile izložene 3 uM DAPI 10 min na sobnoj temperaturi u mračnoj prostoriji a zatim su isprane dva puta sa PBS. Ćelije su bile obeležene za hromatinsku kondenzaciju fluorescentnom mikroskopijom, pomoću fluorescin filtera (330-380 ekscitacija;

30X uvećanje). Ukupna i apoptotička jezgra su prebrajana. U svim slučajevima, oko 600-1.000 ćelija po velu je bilo prebrajano od strane operatora koji nije bio upoznat sa svim detaljima eksperimenta. Merenja individualnih kultura su izvedena u duplikatu i rezultati su izraženi kao srednja vrednost S.E.M. za naznačeni broj preparata kultura. Statistička analiza rezultata je izvedena Kruskal-Wallis testom i testom najmanje značajne razlike više setova rezultata. U svim slučajevima, p-0.05 je bilo smatrano značajnim.

[0076] Ovim testom sa gluatamatom pokazali smo po prvi put neuroprotektivnu sposobnost AFA Baznog Ekstrakta, AFA-PC, njegovih PCB i MAAs. Kako je prikazano Slikom 18, dodavanje glutamata kultivisanim neuronskim ćelijama je povisilo nivo apoptoza na procenat od 22.9% + 3 n =4(p< 0.05); dok je istovremeno dodavanje AFA Baznog Ekstrakta stvorilo vrlo visoku zaštitu protiv glutamatne toksičnosti, snižavajući nivo apoptoza ispod kontrolnog nivoa od (6.3% ±1 p> 0.05) već i pri tako maloj količini ekstrakta od 1 nM (rezultati su srednje vrednosti + SEM za 3 do 8 različitih ćelijskih kultura. # Značajno se razlikuju u poređenju sa kontrolnom grupom (p<0.05);<*>Značajno se razlikuju u poređenju sa glutamatnom kontrolom (p<0.05). Što se tiče zaštite koju pružaju MAAs, one takođe snižavaju nivo apoptoza ispod kontrolnog nivoa, sa većom dozom od 1 uM (Slika 19) rezultati su srednje vrednosti ± SEM za 3 do 8 različitih ćelijskih kultura. # Značajno se razlikuju u poređenju sa kontrolnom grupomp (p<0.05);<*>Značajno se razlikuju u poređenju sa glutamatnom kontrolom (p<0.05).). Što se tiče AFA-PC i PCB, vidimo da je njihova inhibicija apoptoza vrlo slična: Njihovo dodavanje ćeliskoj kulturi snižava stepen apoptoza ispod kontrolnog sa dozama od approximately 10 nM (Slike 20 i 21- rezultati su srednje vrednosti ± SEM za 3 do 8 različitih ćelijskih kultura. # Značajno se razlikuju u poređenju sa kontrolnom grupom (p<0.05);<*>Značajno se razlikuju u poređenju sa glutamatnom kontrolom (p<O.05).

[0077] Stepen inhibicije AFA-PC-a je otprilike jednak onom koji ima PCB. Ovo je donekle iznenađujuće, s obzirom da bi PCB, po svoj prilici njegov najaktivniji sastojak, jednom prečišćen i tako više koncentrovan, trebalo da bude znatno jači od celog molekula čija je aktivna komponenta. Činjenica da ima praktično istu potentnost znači da u ćelom PC postoje drugi faktori koji ustvari mogu biti čak potentniji nego sam PCB. Znamo da je ceo PC sastavljen, pored C-PC i njegove PCB hromofore, od PEC, koji uključuje kao njegove hromofore i PCB i PVB (fikoviolobilin). Prema tome, možemo pretpostaviti da je faktor koji pravi značajnu razliku u potentnosti između prečišćenog PCB-a i celog PC, baš PEC komponenta, posebno njegova PVB hromofora, za koju se pretpostavlja da je vrlo jak antioksidant.

[0078] U smislu neuroprotekcije, MAAs izgleda da igraju ulogu, ali znatno manju nego PC i PCB. U Međutim, najpotentniji neuroprotektant je nesumnjivo ceo AFA ekstrakt, koji je u stanju da u potpunosti inhibira ćelijsku apoptozu sa samo 1 nM (nanomolom). To je 10-tostruka potentnost PC-a i PCB-a. Ovo svakako može da se objasni sinergijom više različitih antioksidativnih faktora prisutnih u ćelom AFA ekstraktu; ali, pošto smo gore videli da je AFA-fitohrom do sada verovatno najjači antioksidant koji je u stanju da gotovo u potpunosti inhibira obrazovanje MDA (kasniji sporedni proizvod lipidne peroksidacije) sa samo 16 nanomola, vrlo je verovatno da je AFA-fitohrom najvažniji faktor za objašnjenje veće potentnosti Baznog Ekstrakta. Stoga možemo zaključiti da su AFA-fitohromi, pojedini, kao i svi fitohromi, važni neuroprotektivni agensi.

LITERATURA

[0079] 1. Zhou G. et al., Platelet monoamine oxidase B and plasma ft-phenylethylamine in Parkinson's disease, in J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2001; 70:229-231, 229. 2. Ispida K. et al., fS-phenylethylamine stimulates striatal acetylcoline release through activation of the AMPAglutamatergic pathway, in Bioi Pharm Bul/ 2005 Sep.; 28(9):1626-9. 3. Barroso N., Rodriguez M., Action of (i-phenylethylamine and retated amines on nigrostriatal dopamine neurotransmission, in European Journal of Pharmacologv, 297 (1996), 195-203,200. 4. Dyck L. E., Release of monoamines from striatal Slices by. phenelzine and —phenylethylamine, in Prag Neuropsychopharmacol Bioi Psvchiatrv, 1983,7:797-800; Philips SR, Robson A.M., In vivo release of endogenous dopamine from rat caudate nucleus by phenylethylamine, in Neuropharmacology 1983, 22:1297-1301; Raitieri m., et al., Effect of sympathomimetic amines on the synaptosomal transport of noradrenaline, dopamine and 5-hydroxytryptamine, in Eur J Pharmacol1977, 41 :133-143. 5. Janssen P.A.J, et al., Does phenylethylamine act as an endogenous amphetamine in some patients?, in International Journal of Neuropsychopharmacology 1999, 2: 229-240, 232. 6. Paterson I.A. et al., 2-phenylethylamine: a modulator of catecholamine transmission in the mammalian

central nervous svstem?, in Journal of Neurochemistrv (1990),55:1827-1837.

7. Sa belli H.C., Javaid I.J., Phenylethylamine Modulation of Affect: Therapeutic and Diagnostic Implications, in Journal of Neuropsychiatry (1995),7(1 ):6-14,7. 8. Mauro Federici et al., Trače Amines Depress Gabab Response In Dopaminergic Neurons By Inhibiting Girk Channels, in Molecular Pharmac-ology Fast Forvvard. Published on January 11, 2005 as doi:10.1124/mol. 104.007427. 9. Gusovsky F. et al., A high pressare liquid chromatography method for plasma phenylacetic acid, a putative marker for depressive disorders, in Anal Biochem, 1985 Feb. 15; 145(1 ):101 -5. In this study, the depressed patients had a PM level in the plasma of 327.64 +/- 45.44 ng/ml, against the 536.18 +/- 54.99 ng/ml. of the control group. In another study, in the urine of the depressed patients was found and average PM of 66 +/- 23 mg/die, against the 104 +/23 mg/die of non depressed patients. See Sa belli HC. et al., Urinary phenylacetic acid in panic disorder with and vvithout depression, in Acta Psychiatr Scand 1990 Jul;82(1): 14-6. 10. Szabo A. et al., Phenylethylamine, a possible link to the antidepressant effects of exerdse?, in Br J Sports Med 2001 Oct; 35(5):342-3. 11. Sa belli H et al., Sustained antidepressant effect of PEA replacement, in J Neuropsychiatry Clin Neurosci, 8(2): 168-71.

12. Miura Y., Plasma beta-phenylethylamine in Parkinson's disease, in Kurume Med J 2000;47(4):267-72.

13. Ibid.,

14. Ebadi M. et al., Neuroprotective actions of selegiline, in J Neurosci Res 2002 Feb 1 ;67(3):285-289.

15. Kemppainen N. et al., Different pattern of reduction of striatal dopamine reuptake sites in Alzheimer's disease and ageing, in J Neural Transm 2001;108(7):827-36.

16. Knoll J., (-)Deprenyl (Selegiline): past, present and future, in Neurobiology (Bp) 2000;8(2):179-99.

17. Knoll J., The pharmacological basis of the beneficial effects of (-)deprenyl (selegiline) in Parkinson's and Alzheimer's diseases, in J Neural Transm Suppl 1993;40:69-91. 18. Rimbau V., et al., Protective effects of C-phycocyanin against kainic acid-induced neuronal damage in rat hippocampus, in Neurosci Lett 1999 Dec 3;276(2):75-8. In this study phycocyanins have been used from the microalga Spirulina. The phycocyan ins from Klamath algae are different and endov/ed with a higher antioxidant activity. See Benedetti S., Scoglio S., Canestrari F., et al., Antioxydant properties of a novel phycocyanin extract from the blue-green alga Aphanizomenon Flos Aquae, in Life Sciences, 75 (2004): 2353-2362. 19. Svvanson J. et al., Cognitive neuroscience of attention deficit hyperactivity disorder and hyperkinetic disorder, in Curr Opin Neurobiol. 1998 Apr;8(2):263-71. 20. Citazione solo di Benedetti et al. LifeScience; O menzione del parallelo brevetto? Attendere l'anno provisional in attesa di effettuare studi sulla neuroprotezione? 21. Kusaga A., Decreased beta-phenylethylamine in urine of children with attention deficit hyperactivity disorder and autistic disorder, in No To Hattatsu 2002 May; 34(3):243-8; Matsuishi T, Yamashita Y, Neurochemical and neurotransmitter studies in patients with learning disabilities, in No To Hattatsu 1999 May;31 (3):245-8. 22. Kusaga A. et al., Increased urine phenylethylamine after methvlphenidate treatment in children vvith ADHD, in Ann Neurol 2002 Sep;52(3):372-4. 23. Jain AK,. Et al., Bupropion SR vs. placebo for weight loss in obese patients vvith depressive symptoms, in Obes Res. 2002 Oct;10(10):1049-56. 24. Rudolph et al., A randomized, placebo-controlled, dose-response trial of venlafaxine hydrochloride in the treat-ment of major depression, in J Clin Psychiatry (1998); 59(3): 116-22. 25. PEA is a lipid-soluble molecule quite subject to be damaged by heat. This means that drving methods using high temperatures, such a freeze drying, usually have lower concentration of PEA. The highest content of PEA is found in the algae dried vvith the Refractance WindoW® method. It is from this type of algae that the Basic Extract is realized. 26. Yamada M. et al., Clinical Pharmacology of MAO Inhibitors: Safety and Future, in Neurotoxicology 2004; 25: 215-21 ; Youdim M., et al., Therapeutic Applications of Selective and Non-Selective Inhibitors of Monoamine Oxidase A and B that do not Cause Significant Tyramine Potentiation, in Neurotoxicology 2004;25:243-50. 27. Groniger A et al., Photoprotective compounds in cyanobacteria, phvtoplankton and macroalgae-a database, in J Photochem Photobiol B. 2000 Nov;58(2-3): 115-22. 28. Suh HJ et al., Mycosporine glycine protects biological systems against photodynamic damage by quenching singlet oxygen vvith a high efficiency, in Photochem Photobiol. 2003 Aug;78(2): 1 09-13. 29. Groniger A et al., Photoprotective compounds in cyanobacteria, phytoplankton and macroalgae-a

database, in J Photochem Photobiol B. 2000 Nov;58{2-3): 115-22.

30. Sinha RP et al., Induction of mvcosporine-like amino acids (MAAs) in cvanobacteria by solar ultraviolet-B radiation,

in J Photochem Photobiol B. 2001 Jul; 60(2-3): 129-35.

31. Garcia-Pichel F et al., Occurrence of UV-Absorbing, Mvcosporine-Like Compounds among Cvanobacterial Isolates and an Estimate of Their Screening Capacity, in Appl Environ Microbiol. 1993 Jan;59(1):163-169.

32. Glazer A.N., Phycobiliproteins, in Methods Enzymol, 1988, 167: 291-303.

33. Bhat V.B., et al., C-phycocya.nin: a potent peroxyl radical scavenger in vivo and in vitro, in Biochem Biophys Res Commun., 2000; 275(1):20-25; Romay, C. et al., Antioxidant and antinflammatory properties of C-phycocyanin from blue-green algae, in Inflamm Res, 1998, Jan.; 47(1): 36-41. 34. Reddy C.M., et al., Selective Inhi-ition of cyclooxygenase-2 by C-phycocyanin, in Biochem Biophys Res Commun. 2000; 277(3): 599-603. 35. Gonzales R., et al., Anti-inflammatory activity of phycocyanin extract in acetic acid induced colitis in rats, in Pharmacol Res, 1999; 39(1): 55-9. 36. Gonzales R., et al., Anti-inflammatory activity of phycocyanin extract in acetic acid induced colitis in rats, in Pharmacol Res, 1999; 39(1): 55-9. 37. Vadiraja BB. et al., Hepatoprotective effect of C-phycocyanin:protection for carbon tetrachloride and R-(+)-pule-gone-mediated hepatotoxicty in rats, in Biochem Biophys Res Commun, 1998; 249(2):428-31. 38. Romay C, et al., Phycocyanin extract reduces leukotriene B4 levels in arachidonic induced mouse-ear inti ammation test, in J Pharm Pharmacol. 1999,51 (5):641-42. Come e noto, illeucotriene B4 e uno dei fattori principalmente responsabili di patologie respiratorie quali asma e allergie. 39. Rimbau V., et al., Protective effects of C-phycocyanin against kainic acid-induced neuronal damage in rat hippocampus, in Neurosci Lett 1999, 276(2):75-8. 40. Rimbau V. et al., C-phycocyanin protects cerebellar granule cells from low potassium/serum deprivation-induced apoptosis, in Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2001; 364(2): 96-104.

41. Glazer A.N., Phycobilisomes, in Methods Enzymol1988, 167;304-312.

42. Hirata T., et al., Antioxidant avtivities of phycocyanobil in prepared from Spirulina platensis, in J Appl Phyco12000,12:435- 439.43. Fuglistaller P., et al., Isolation and characterization of phycoerythrocyanin and chromatic adptation of the thermophilic cyanobacterium Mastigocladus laminosus, in Arch Microbiol1981, 129:268-274. 44. Rimbau V., et al., Protective effects of C-phycocyanin against kainic acid-induced neuronal damage in rat hippocampus, in Neurosci Lett 1999, 276(2):75-8. 45. The data in this table are drawn from the follov/ing studies: Magvar K. et al., Pharmacological aspects of (-)-de-prenyl, in Curr Med Chem, 2004 Aug, 11 (15):2017-31; Hou et al., Monoamine oxidase B (MAO-B) inhibition by active principles from Uncaria rhyncophylla, in Journal of Ethnopharmacology 100 (2005) 216-220; HerraizT, Chaparro C, Human monoamine oxidase is inhibited by tobacco smoke: B-carboline alkaloids act as potent and revesible inhibitors, in Biochemical and Biophysical Research Communications 326 (2005) 378-386; Kong LD et al., Inihibition MAO-A and B by some plant-derived alkaloids, phenols and anthraquinones, in Journal of Ethnopharmacology 91 (2004) 351-355. 46. Yoshida S. et al., Fluorinated phenylcyđopropylamines. Part 3: Inhibition of monoamine oxidase A and B, in Bioorganic a Medicinal Chemistry 12 (2004) 2645-2652. 47. Torres A. et al., Porphyra-334, a potential natural source for UVA protective sunscreens, in Photochem. Photobiol. Sci. 5 (2006) 432-435. 48. Hughes J, Lamparter T., Prokaryotes and Phytochrome. The Connection to Chromophores and Signaling, in Plant Physiology, December 1999, Vol. 121, pp. 1059-1068. 49. Garthvvaite et al., Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests role as unutarcelijski messenger in brain, in Nature. 1988 Nov 24;336(6197):385-8. 50. Delgado-Esteban M. et al., D-Glucose prevents glutathione oxidation and mitohondrial damage after glutamate receptor stimulation in rat cortical primary neurone, in J Neurochem. 2000 Oct;75(4): 1618-24.

Claims (5)

1. Upotreba ekstrakta od mikroalge Aphanizomenon Flos AquaeAquaeRalfs ex Born. & Flah. Var.flos aquae ( AFA Klamath),u kojoj je ekstrakt pripremljen prema sledećim koracima: a) zamrzavanje sveže sakupljenih AFA algi i njihovo odmrzavanje, ili, ako je polazni materijal sušeni AFA prah, sonifikacija vodom razblaženog AFA praha da se razore ćelije; b) centrifugiranje produkta iz koraka a) da se izdvoji supernatant iz precipitata; c) sakupljanje supernatanta koji sadrži vodo-rastvorne komponente, za proizvodnju kompozicije za prevenciju, kontrolu ili lečenje jedne od sledećih neuroloških bolesti, stanja, disfunkcija ili poremećaja: Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, multiple skleroze, hiperaktivnosti i poremećaja nedostatka pažnje (ADHD), autizma, depresije, nedostatak pamćenja i poremećaje raspoloženja.

2. Upotreba prema zahtevu 1, u kojoj pomenuti ekstrakt sadrži sledeće komponente mikroalge Aphanizome-non Flos AquaeAquaeRalfs ex Born. & Flah. Var.flos aquae ( AFA Klamath) :C-Fikocijanin/fikoeritrocijaninski kompleks (C-PC/PEG), njihove pojedinačne hromofore fikocijanobilin (PCB) i fikoviolobilin (PVB), AFA fitohrom, mikosporinu slične amino-kiseline (MAAs) i feniletilamin (PEA).

3. Upotreba prema zahtevu 1, u kojoj je AFA Klamath ekstrakt dalje prečišćen izlaganjem pomenutog supernatanta ultra-filtraciji korišćenjem ultrafiltracione membrane sa MWCO od 30,000 Daltona.

4. Upotreba prema zahtevu 1, u kojoj je navedena kompozicija pogodna za ljudsku primenu.

5. Upotreba prema zahtevu 1, u kojoj je ekstrakt je formulisan sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili ekscipijentima.