RO121030B1

RO121030B1 - Derivaţi triazolopirimidinici ca modulatori ai receptorului pentru adenozină a3

Info

Publication number: RO121030B1
Application number: ROA200001172A
Authority: RO
Inventors: Pier Giovanni Baraldi; Pier Andrea Borea
Original assignee: Medco Research Inc.
Priority date: 1998-09-16
Filing date: 1999-09-15
Publication date: 2006-11-30
Also published as: KR20010089154A; LU90687B1; YU83600A; GB2353527A; ID28100A; ATA904399A; GB2353527B; SE522578C2; HUP0102589A2; CH692132A5; TR200003461T2; AU6248299A; CA2332007A1; IL156851A; SE0003984L; NZ509149A; ES2204262B1; NO20005508L; CA2332007C; WO2000015231A8

Abstract

Prezenta invenţie se referă la compuşii cu formulele I sau II: în care R, R1, R2, R3 şi A au semnificaţiile date în descriere şi care au activitate agonistă selectivă faţă de receptorul A3 adenozinic. Aceşti compuşi pot fi utilizaţi într-o compoziţie farmaceutică, pentru tratarea bolilor cauzate de activarea excesivă a receptorului A3, sau pot fi utilizaţi într-o aplicaţie de diagnosticare, pentru determinarea legării relative a altor compuşi la receptorul A3. Compuşii pot fi marcaţi, spre exemplu cu markerii fluorescenţi sau radioactivi, iar markerii pot fi utilizaţi pentru determinarea in vivo sau in vitro a prezenţei celulelor tumorale care posedă o concentraţie ridicată de receptori A3 adenozinici.

Description

Prezenta invenție se referă la unii derivați pirazolo-triazolo-pirimidinici, triazolotriazolo-pirimidinici și imidazolo-triazolo-pirimidinici, și la utilizarea lor în practica medicală, ca modulatori ai receptorilor A₃ pentru adenozină.

Au fost caracterizate, din punct de vedere farmacologic, trei clase principale de receptori adenozinici, clasificați ca A,, A₂ și A₃. Receptorii A! sunt cuplați cu inhibarea adenilat ciclazei prin proteinele Gi și, de asemenea, s-a arătat că se cuplează și cu alte sisteme mesagere secundare, incluzând inhibarea sau stimularea turnoverului fosfoinozitolului și activarea canalelor ionice. Receptorii A_z sunt, în continuare, divizați în două subtipuri: A_1a și la care agoniștii adenozinici activează adenilat ciclaza, cu afinitate ridicată și, respectiv, cu afinitate scăzută. Secvența receptorului A₃ a fost identificată prima oară într-o bibliotecă de cDNA din testicule de șobolan, iar această secvență, donată ulterior prin omologie cu alți receptori dintr-o bibliotecă de cDNA din creier de șobolan, cuplați cu proteina G, s-a dovedit a corespunde unui receptor adenozinic nou, funcțional.

Descoperirea receptorului A₃ a deschis noi perspective terapeutice în domeniul purinelor. în particular, receptorul A₃ mediază procesele inflamatorii, hipotensive și de granulare a celulelor mastice. Aparent, acest receptor are, de asemenea, un rol în sistemul nervos central. Agonistul IB-MECA selectiv pentru A3 induce depresia comportamentală și prin administrare cronică protejează împotriva ischemiei cerebrale. De asemenea, s-a găsit că agoniștii selectivi pentru A₃, în concentrații ridicate, induc apoptoza în celulele leucemice umane HL-60. Acestea, precum și alte descoperiri au făcut din receptorul A₃ o țintă terapeutică promițătoare. Antagoniștii selectivi pentru receptorul A₃ sunt considerați, fie potențiali agenți antiinflamatori, fie posibili agenți antiischemici. Recent, antagoniștii lui A₃ au constituit obiectul elaborării de medicamente antiasmatice, antidepresive, antiaritmice, protectoare renale, antiparkinsoniene și de amplificare cognitivă.

Se cunosc derivați triazolopirimidinici care au în moleculă grupări amino nesubstituite în poziția 5, care acționează ca modelatori ai receptorului A₂ (WO 95/01356).

De aceea, un obiect al prezentei invenții îl constituie furnizarea de compuși și de metode de preparare și de utilizare ale acestora, care sunt agoniști, parțial agoniști și/sau antagoniști ai receptorului A₃ pentru adenozină.

Sunt descriși compuși utili ca modulatori puternici, chiar selectivi ai receptorului A₃pentru adenozină, cu activitate de antagoniști ai acestui receptor, precum și metode de preparare și utilizare ale acestora.

Prezenta invenție se referă la compușii cu următoarea formulă generală:

RO 121030 Β1 sau

în care:

A este imidazol, pirazol sau triazol;

Reste-C(X)R₁,C(X)-N(R₁)₂,-C(X)OR₁,-C(X)SR_l,-SO_nR_1l-SO_nOR_l,-SOnSR_lsauSO_n- 15 NțRJ,;

R, este hidrogen, alchil, alchil substituit, alchenil, alchenil substituit, alchinil, alchinil 17 substituit, arii, heteroaril, heterociclu, alchenil inferior, alcanoil inferior sau, dacă este legat de un atom de azot, atunci, luat împreună cu atomul de azot formează un inel azetidinicsau 19 un inel heterociclic din 5...6 membri, conținând unul sau mai mulți heteroatomi, cum ar fi N, O, S: 21

R₂ este hidrogen, alchil, alchenil, alchinil, alchil substituit, alchenil substituit, alchinil substituit, aralchil, aralchil substituit, heteroaril, heteroaril substituit sau arii; 23

R₃ este furan, pirol, tiofen, benzofuran, benzipirol, benzotiofen, substituit opțional cu unul sau mai mulți substituenți, așa cum s-a descris aici, pentru inelele heteroarilice 25 substituite;

X este O, S sau NR¹; 27 n este 1 sau 2;

analogi radiomarcați ai acestora, analogi marcați fluorescent ai acestora și săruri ale 29 acestora, acceptabile din punct de vedere farmaceutic.

Un alt obiect al prezentei invenții este o metodă de tratare a hipertensiunii, inflama- 31 țiilor, reacțiilor alergice, degranulării celulelor mastice, a tumorilor și hipoxiei cardiace și de protecție împotriva ischemiei cerebrale, metodă constând în administrarea unei cantități efi- 33 ciente dintr-un compus cu formulele menționate, la un pacient care are nevoie de un asemenea tratament. 35

De asemenea, invenția are ca obiect și metoda de determinare la un pacient, a prezenței celulelor tumorale care posedă o concentrație mare de receptori A₃ adenozinici, 37 metodă constând în:

a) administrarea unui compus definit cu formulele de mai sus, la pacient, metodă care 39 include un marker care poate fi detectat după legarea compusului de celulele tumorale;

b) legarea compusului la celulele tumorale; 41

c) detectarea markerului.

Un alt obiect al prezentei invenții se referă la o metodă de determinare într-o probă 43 celulară, a prezenței celulelor tumorale care posedă o concentrație mare de receptori A₃adenozinici, metodă constând în: 45

a) prepararea unei suspensii din celulele respective, într-un mediu de cultură celulară;

b) administrarea la celulele respective, a unui compus definit cu formulele de mai sus, 47 care include un marker detectabil după legarea compusului de celulele tumorale;

RO 121030 Β1

c) legarea compusului de celulele tumorale;

d) detectarea markerului.

Invenția are ca obiect și o metodă de determinare a prezenței celulelor tumorale rămase după îndepărtarea chirurgicală a unei tumori, metodă constând în:

a) administrarea la pacient, înainte, după sau în timpul îndepărtării chirurgicale a unei tumori, a unui compus definit cu formulele de mai sus, care include un marker, care poate fi detectat după legarea compusului de celulele tumorale reziduale;

b) legarea compusului la celulele tumorale reziduale;

c) detectarea markerului.

în compușii definiți cu formulele de mai sus, de preferință, R¹ este hidrogen; alchil cu C, până la C8; alchenil cu C2 până la C7, alchinil cu C2până la C7; cicloalchil cu C3 până la C7; alchil cu C, până la C5 substituit cu unul sau mai mulți atomi de halogen, grupări hidroxi, alcoxi cu C4 până la C4, cicloalchil cu C3 până la C7 sau grupări cu formulele-N(R¹ )2,C(O)N(R¹)₂; arii, arii substituit, în care substituția este selecționată din grupul alcătuit din alcoxi cu C, până la C₄, alchil cu C., până la C₄, nitro, amino, ciano, haloalchil cu C₄ până la C₄, haloalcoxi cu C₄ până la C₄, carboxi, carboxiamido; aralchil cu C₇ până la C₁₀, în care partea arilică poate fi substituită cu unul sau mai mulți din substituenții indicați mai sus, pentru grupul arii; o grupare cu formula-(CH₂)m-Het, în care Het este un inel heterociclic aromatic sau nearomatic cu 5...6 membri, conținând unul sau mai mulți heteroatomi selectați din grupul alcătuit din N, O și S, iar m este un număr întreg de la 1 la 5.

Grupările alchil cu C₄ până la C₈ preferate sunt: metil, etil, propil, butii și izopentil. Exemple de grupări cicloalchil cu C₃-C₇ includ: ciclopropil, ciclopentil și ciclohexil. Exemple de grupări alchil cu C^Cg, substituite cu grupări cicloalchil cu C₃-C₇, includ: ciclohexilmetil, ciclopentilmetil și 2-ciclopentiletil. Exemple de grupări alchil cu C^Cg substituite includ: 2hidroxietil, 2-metoxietil, trifluormetil, 2-fluoretil, 2-cloretil, 3-aminopropil, 2-(4-metil-1-piperazin)etil, 2-(4-morfolinil)etil, 2-aminocarboniletil, 2-dimetilaminoetil, 3-dimetilaminopropil. Arilul este de preferință fenil, opțional substituit cu CI, F, grupări metoxi, nitro, ciano, metil, trifluormetil, difluormetoxi. Exemple de grupări heterociclice cu 5...6 membri, conținând N, O și/sau S, includ: piperazinil, morfolinil, tiazolil, pirazolil, piridil, furii, tienil, pirolil, triazolil, tetrazolil. Exemple de grupări aralchil cu C₇-C₁₀ conțin benzii sau fenetil substituite opțional cu unul sau mai mulți substituenți selecționați dintre: CI, F, metoxi, nitro, cian, metil, trifluormetil și difluometoxi. De preferință, R¹ este hidrogen, alchil cu C,-C₈, arii sau aralchil cu C₇-C₁₀, opțional substituite, de preferință, cu atomi de halogen. De preferință, X este O, R₂ este alchil sau alchil substituit cu C₂-₃, iar R₃ este furan.

Compuși preferați, în mod deosebit, sunt cei în care R este o grupare fenetil, în care inelul fenil este substituit cu unul sau mai mulți substituenți aleși din grupul alcătuit din: atomi de clor, fluor, grupări metoxi, nitro, cian, metil, trifluormetil și difluormetoxi.

Posibilele semnificații ale lui A pot fi reprezentate prin următoarele formule structurale:

Ț-τ' N R^Z		R—	Ar- JL l R
	R '^Ν-ΪΓ	. ^R~\X

RO 121030 Β1

Compușii pot fi utilizați într-o metodă pentru modularea receptorilor A₃ adenozinici la 1 un mamifer, inclusiv la om. Metodele implică administrarea unei cantități eficiente dintr-un compus cu formula I, suficientă pentru a modera receptorii A₃ adenozinici la un mamifer. 3 Utilizările compușilor includ:

- tratarea hipertensiunii;5

- tratarea tulburărilor inflamatorii, cum ar fi artrita reumatoidă și psoriazisul;

- tratarea tulburărilor alergice, cum ar fi febra fânului (guturaiul) și rinitele alergice; 7

- degranularea celulelor mastice;

- agenți antitumorali;9

- tratarea hipoxiei cardiace; și

- protecția împotriva ischemiei cerebrale;11

- utilizări în diagnosticare, spre exemplu, pentru a determina prezența uneia sau a mai multora dintre stările medicale descrise mai sus, sau într-un test de screening, pentru 13 a determina eficacitatea altor compuși pentru legarea de receptorul Ado A₃ (adică, prin inhibarea competitivă, așa cum s-a determinat prin diferite teste de legare), așa cum este des- 15 cris în Jacobson și Van Rhee, Purinergic approaches to experimental therapy, Jacobson și Jarvis, ed., Wiley, New York, 1997, pp. 101-128; Mathot et al., Brit. J. Pharmacol. 116:1957- 17

1964 (1995); Van der Wenden și colab., J. Med. Chem. 38: 4000-4006 (1995); și van Calenberg, J. Med. Chem. 40:3765-3772 (1997), ale căror conținuturi sunt încorporate aici 19 ca referințe.

Compușii pot fi utilizați, de asemenea, într-o metodă pentru inhibarea parțială sau 21 completă a adenilat ciclazei (A₃) la un mamifer, inclusiv la om. Metodele implică administrarea unei cantități eficiente dintr-un compus cu formula I, suficientă pentru inhibarea completă 23 sau parțială a adenilat ciclazei la mamifere. De asemenea, compușii pot fi marcați și utilizați pentru detectarea prezenței celulelor tumorale conținând liganzi A₃ pentru adenozină, la un 25 pacient sau într-o probă celulară, prin: punerea în contact a celulelor cu compusul marcat, permițând compusului să se lege de receptorii A₃ și detectarea prezenței markerului. 27

Compușii pot fi utilizați într-o formulare farmaceutică, care include un compus cu formula I și unul sau mai mulți excipienți. Pentru prepararea compușilor, pot fi utilizați diverși 29 intermediari chimici.

- fig. 1 este un grafic reprezentând curba de saturare a reacției de legare a lui 31 [¹²⁵I]AB-MECA (fmol/mg proteină) de receptorii A₃ umani exprimați în celulele HEK 293, în funcție de concentrația molară a lui [^12SI]AB-MECA. 33

- fig. 2 este un grafic reprezentând curba de saturare a reacției de legare a lui [¹²⁵I]AB-MECA (fmol/mg proteină) de receptorii A3 umani exprimați în linia celulară JURKAT, 35 în funcție de concentrația molară a lui [¹²⁵I]AB-MECA. Așa cum reiese din figură, densitatea receptorului A3 detectată a fost de aproximativ 300 fmol/mg proteină în membranele celulelor 37

Jurkat care utilizează [¹²⁵I]AB-MECA.

- fig. 3 și 4 sunt grafice care reprezintă saturarea legării unui analog tritiat al com- 39 pusului 47-5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-propil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină (compusul 102) (fmol/mg proteină) de receptorii A₃ umani exprimați 41 în linia celulară JURKAT, în funcție de concentrația molară a compusului 102. Datele din aceste figuri indică prezența receptorilor A₃ adenozinici în celulele tumorale umane, în 43 densități ridicate. Spre exemplu, s-au detectat aproximativ 1300 fmol/mg proteină în celulele Jurkat și 650 fmol/mg proteină în celulele HL60. De aceea, compusul 102 este un instrument 45 mult mai sensibil pentru detectarea receptorilor A₃adenozinici decât [¹²⁵I]AB-MECA. Aceste constatări au facilitat determinarea prezenței receptorilor A₃ în multe tumori umane. 47

RO 121030 Β1

Prezenta cerere de brevet de invenție face cunoscuți compuși utili ca modulatori puternici, chiar selectivi, ai receptorilor pentru adenozină, cu activitate de agoniști de A₃ și, în unele cazuri, de antagonist! de A₃, precum și metode de preparare și utilizare ale acestora.

Compușii pot fi utilizați într-o metodă de modulare a receptorilor A₃ adenozinici la un mamifer, inclusiv la om. Metodele implică administrarea unei cantități eficiente dintr-un compus cu formula I, suficientă pentru a modera receptorii A₃ adenozinici ai mamiferului.

Compușii potfi utilizați într-o formulare farmaceutică care include un compus cu formula I și unul sau mai mulți excipienți. Pentru prepararea compușilor pot fi utilizați diverși intermediari chimici.

Definiții

Așa cum s-a utilizat aici, un compus este un agonist al unui receptor A! adenozinic, dacă este capabil să inhibe complet adenilat ciclaza (A₃) și dacă este capabil să înlocuiască [¹²⁵I]-AB-MECA într-un test de legare competitivă.

Așa cum a fost utilizat aici, un compus este un agonist parțial al unui receptor A₃adenozinic, dacă este capabil să inhibe parțial adenilat ciclaza (A₃) și dacă este capabil să înlocuiască [¹²⁵I]-AB-MECA într-un test de legare competitivă.

Așa cum a fost utilizat aici, un compus este un antagonist al unui receptor A₃adenozinic, dacă este capabil să prevină inhibarea datorată unui agonist și dacă este capabil să înlocuiască [¹²⁵I]-AB-MECA într-un test de legare competitivă.

Așa cum a fost utilizat aici, un compus este selectiv pentru receptorul A₃dacă raportul dintre activitatea A/Aj și A₂/A₃ este mai mare de 50, preferabil, între 50 și 100 și, mai preferabil, mai mare de 100.

Așa cum a fost utilizat aici, termenul alchil” se referă la grupări alchilice monovalente liniare, ramificate sau ciclice, având, de preferință, de la 1 la 20 atomi de carbon, mai preferabil 1 ...10 atomi de carbon (“alchil inferior”) și, cel mai convenabil, 1...6 atomi de carbon. Acest termen este exemplificat prin grupări cum ar fi metil, etil, n-propil, izopropil,butil, izobutil, n-hexil și alții asemănători. Termenii “alchilen” și “alchilen inferior” se referă la radicali bivalenți ai aleanului corespunzător. Mai mult, așa cum au fost utilizate aici, alte resturi având denumirile derivate din alcani, cum arfi: alcoxil, alcanoil, alchenil, cicloalchenil etc., când sunt modificate prin “inferior”, au lanțuri carbonice de 10 sau mai puțini atomi de carbon. în acele cazuri în care numărul minim de atomi de carbon este mai mare de 1, spre exemplu, alchenil (minimum 2 atomi de carbon) și cicloalchil (minimum 3 atomi de carbon), trebuie înțeles că “inferior’’ înseamnă cel puțin numărul minim de atomi de carbon.

Așa cum a fost utilizat aici, termenul “alchil substituit” se referă la o grupare alchil cu, de preferință, de la 1 la 10 atomi de carbon (“alchil inferior substituit”), având 1...5 substituenți și, preferabil, 1 ...3 substituenți selectați din grupul constând din: alcoxi, alcoxi substituit, cicloalchil, cicloalchil substituit, cicloalchenil, cicloalchenil substituit, acil, acilamino, aciloxi, amino, amino substituit, aminoacil, aminoaciloxi, oxiacilamino, ciano, halogen, hidroxil, ceto, tioceto, carboxil, carboxilalchil, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi substituit, arii, ariloxi, heteroaril, heteroaril oxi, heterociclic, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alchil, -SO-alchil substituit, -SO-aril, -SO-heteroaril, -SO₂-alchil, -SO₂-alchil substituit, -SO₂-aril, -SO₂-heteroaril și monoși di-alchilamino, mono- și di-(alchil substituit)amino, mono- și d/-ahlamino, mono-și diheteroarilamino, mono- și c//-heterociclic amino și amine ^/-substituite nesimetrice, având substituenți diferiți, selectați dintre: alchil, arii, heteroaril și heterociclic. Așa cum au fost utilizate aici, alte părți având prefixul “substituit” tind să includă unul sau mai mulți dintre substituenții listați mai sus.

RO 121030 Β1

Așa cum a fost utilizat aici, termenul “alcaril” se referă la o grupare alchil cu un substi- 1 tuent arii. Legarea se face prin gruparea alchil. “Aralchil” se referă la o grupare ari) cu un substituent alchil, unde legarea se face prin gruparea arii. 3

Așa cum a fost utilizat aici, termenul “alcoxi” se referă la gruparea “alchil-O-“, unde alchilul este cel definit mai sus. Grupări alcoxi preferate includ, spre exemplu, metoxi, etoxi, 5 n-propoxi, /zo-propoxi, n-butoxi, tert-butoxi, sec-butoxi, n-pentoxi, n-hexoxi, 1,2-dimetilbutoxi și similari. 7

Așa cum a fost utilizat aici, termenul “alchenil” se referă la grupări alchenil având, de preferință, de la 2 la 10 atomi de carbon și, mai preferabil, 2...6 atomi de carbon și având cel 9 puțin 1 și, preferabil, 1 ...2 situsuri de nesaturare alchenilice. Grupări alchenil preferate includ: etenil (-CH=CH₂), n-propenil (-CH₂CH=CH₂), /zo-propenil 11 (-C(CH₃)=CH₂) și similari.

Așa cum a fost utilizat aici, termenul “alchinil” se referă la grupări alchinil având, de 13 preferință, de la 2 la 10 atomi de carbon și, mai preferabil, 2...6 atomi de carbon și având cel puțin 1 și, preferabil, 1...2 situsuri de nesaturare alchinilice. 15

Așa cum a fost utilizat aici, termenul “acil” se referă la grupările alchil-C(O)-, alchilC(O)-substituit, cicloalchil-C(O)-, cicloalchil-C(O)-substituit, aril-C(O)-, heteroaril-C(O)-și 17 heterociclic-C(O), unde alchil, alchil substituit, cicloalchil, cicloalchil substituit, arii, heteroaril și heterociclic sunt așa cum au fost definite aici. 19

Așa curn a fost utilizat aici, termenul “acilmino” se referă la gruparea -C(O)NRR, unde fiecare R este, în mod independent, hidrogen, alchil, alchil substituit, arii, heteroaril sau hete- 21 rociclic în care alchil, alchil substituit, arii, heteroaril și heterociclic sunt așa cum au fost definite aici. 23

Așa cum a fost utilizat aici, termenul “arii” se referă la o grupare carbociclică aromatică nesaturată cu 6...14 atomi de carbon, având un singur inel (de exemplu, fenil) sau inele 25 multiple condensate (de exemplu, naftil sau antril). Arili preferați includ: fenil, naftil și similari.

în afara constrângerilor date prin definiția pentru substituentul arilic, asemenea grupări arilice 27 pot fi substituite opțional cu 1...5 substituenți și, preferabil, cu 1...3 substituenți aleși din grupul alcătuit din: hidroxi, acil, alchil, alcoxi, alchenil, alchinil, alchil substituit, alcoxi substituit, 29 alchenil substituit, alchinil substituit, amino, amino substituit, aminoacil, aciloxi, acilamino, alcaril, arii, ariloxi, azido, carboxil, carboxilalchil, cian, halo, nitro, heteroaril, heteroariloxi, 31 heterociclic, heterociclooxi, aminoaciloxi, oxiacilamino, tioalcoxi, tioalcoxi substituit, tioariloxi, tioheteroariloxi, -SO-alchil, -SO-alchil substituit, -SO-aril, -SO-heteroaril, -SO₂-alchil, -SO₂- 33 alchil substituit, -SO₂-aril, -SO₂-heteroaril, trihalometil. Substituenții preferați includ alchil, alcoxi, halo, cian, nitro, trihalometil și tioalcoxi. 35

Așa cum a fost utilizat aici, termenul “cicloalchil” se referă la grupări alchil ciclice cu

3...12 atomi de carbon, având un singur inel ciclic sau inele multiple condensate. Asemenea 37 grupări cicloalchil includ, spre exemplu, structuri cu un singur ciclu, cum ar fi: ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, ciclooctil și similarii, sau structuri ciclice multiple, cum ar fi: adamatil și 39 similari.

Așa cum a fost utilizat aici, termenii “halo” sau “halogen” se referă la fluor, clor, brom 41 și iod, și sunt, de preferință, fie fluor, fie clor.

Așa cum a fost utilizat aici, termenul “heteroaril” se referă la o grupare carbociclică 43 aromatică cu 1...15 atomi de carbon și 1...4 heteroatomi selectați din grupul alcătuit din: oxigen, azot și sulf în cel puțin un inel (dacă există mai mult de un inel). 45

RO 121030 Β1 în afara constrângerilor date prin definiția pentru substituentul heteroaril, asemenea grupări heteroaril pot fi substituite opțional cu 1...5 substituenți și, de preferință, cu 1...3 substituenți selectați din grupul constând din: hidroxi, acil, alchil, alcoxi, alchenil, alchinil, alchil substituit, alcoxi substituit, alchenil substituit, alchinil substituit, amino, amino substituit, aminoacil, aciloxi, acilamino, alcaril, arii, ariloxi, azido, carboxil, carboxilalchil, ciano, halo, nitro, heteroaril, heteroariloxi, heterociclic, heterociclooxi, aminoaciloxi, oxiacilaminno, tioalcoxi, tioalcoxi substituit, tioariloxi, tioheteroariloxi, -SO-alchil, -SO-alchil substituit, -SOaril, -SO-heteroaril, -SO₂-alchil,-SO₂-alchil substituit, -SO₂-aril, -SO₂-heteroaril, și trihalometil. Substituenții preferați includ: alchil, alcoxi, halo, ciano, nitro, trihalometil și tioalcoxi. Astfel de grupări heteroaril pot avea un singur inel (de exemplu, piridil sau furii) sau inele multiple condensate (de exemplu, in-dolizinil sau benzotienil).

“Heterociclu sau “heterociclic” se referă la o grupare monovalentă saturată sau nesaturată, având un singur inel sau inele multiple condensate, cu 1 ...15 atomi de carbon și cu 1...4 heteroatomi selectați din grupul alcătuit din: azot, sulf și oxigen, în cadrul ciclului.

în afara constrângerilor date prin definiția pentru substituentul heterociclic, asemenea grupări heterociclice pot fi opțional substituite cu 1 ...5 substituenți selectați din grupul alcătuit din: alchil, alchil substituit, alcoxi, alcoxi substituit, arii, ariloxi, halo, nitro, heteroaril, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi substituit, tioariloxi, trihalometil și similari. Asemenea grupări heterociclice pot avea un singur inel sau inele multiple condensate.

Deoarece pentru oricare dintre grupările de mai sus, care conțin 1 sau mai mulți substituenți, se înțelege, desigur, că asemenea grupări nu conțin orice substituție sau schemă de substituție care să fie nepractică din punct de vedere steric și/sau nefezabilă din punct de vedere sintetic.

Așa cum au fost utilizați aici, “derivații acidului carboxilic” și “derivații acidului sulfonic” se referă la -Ο(Χ)Ρ_1:-Ο(Χ)-Ν(^)₂, -CțXJOR,, -C/XjSR^ -SOR,, -SO_nOR,, SO_nSR, sau -SO_nNțR,^, unde X este O, S sau NR¹, unde R¹ este hidrogen, alchil, alchil sau arii substituit și derivați activați ai acestora, cum ar fi: anhidride, esteri și halogenuri, cum ar fi: cloruri, bromuri și ioduri, care pot fi utilizate pentru cuplarea derivaților acidului carboxilic și ai acidului sulfonic la capătul 5'-amină, utilizând chimia de cuplare standard.

“Săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic” se referă la săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic, ale unui compus cu formulele IA, IB sau IC, săruri care sunt derivate dintr-o varietate de ioni organici și anorganici, bine cunoscuți în domeniu, și includ, sub formă de exemplu, numai, sodiu, potasiu, calciu, magneziu, amoniu, tetraalchilamoniu și similari; iar când molecula conține o funcționalitate de bază, săruri de acizi organici sau anorganici, cum arfi: clorură, bromură, tartrat, mesilat, acetat, maleat, oxalat și similari, pot fi utilizate drept sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

Termenul de “grupare de protecție” sau “grupare de blocare” se referă la orice grupare care, atunci când se leagă de una sau mai multe grupări hidroxil, amino sau carboxil ale compușilor (inclusiv ale intermediarilor acestora, cum ar fi aminolactamele, aminolactonele etc.), evită desfășurarea reacțiilor la aceste grupări, care grupări protectoare pot fi îndepărtate prin etape convenționale chimice sau enzimatice, pentru refacerea grupării hidroxil, amino sau carboxil. Grupări preferate de blocare pentru amino, îndepărtabile, includ substituenți convenționali, cum ar fi f-butioxicarbonil (f-BOC), benziloxicarbonil (CBZ) și similari, care pot fi îndepărtați în condiții convenționale, compatibile cu natura produsului.

RO 121030 Β1

Prescurtări1 în prezenta lucrare, sunt utilizate următoarele prescurtări:

- [¹²⁵I]AB-MECA, [¹²⁵l]N⁶-(4-amino-3-iodbenzil)adenozin-5'N-metiluronamidă;3

- (R)-PIA, (R)-N⁶-(fenilizopropil)adenozină;

- DMSO, dimetilsulfoxid;5

- I-AB-MECA, N⁶-(4-amino-3-iodbenzil)adenozin-5'-N-metiluronamidă;

- IB-MECA, N⁶-(3-iodbenzil)adenozin-5'-N-metiluronarnidă;7

- Ki, constantă de inhibiție de echilibru;

- NECA, 5'-N-etilcarboxamido adenozină;9

- THF, tetrahidrofuran;

- Tris, tris(hidroximetil)aminometan.11

Prepararea compușilor

Specialiștii în chimie organică vor recunoaște că grupările funcționale reactive și 13 (fragile) trebuie, adesea, să fie protejate înaintea unei anumite reacții și, apoi, readuse la forma lor originală, după desăvârșirea ultimei reacții. în mod obișnuit, grupările sunt protejate 15 prin convertirea lor într-un derivat relativ stabil. Spre exemplu, o grupare hidroxil poate fi transformată într-o grupare eterică, iar o grupare amino într-o amidă sau carbamat. Metode 17 de protejare și de deprotejare, cunoscute și ca metode de “blocare” și de “deblocare”, sunt bine cunoscute și mult practicate în domeniu, de exemplu, a se vedea: T. Green, Protective 19 Groupsin Organic Synthesis, John Wiley, New York (1981) sau Protective Groupsin Organic Chemistry, Ed., J.F.W. McOmie, Plenum Press, London (1973). 21

Compușii sunt preparați, de preferință, prin reacția unui compus cu formula II de mai jos, cu un derivat corespunzător al acidului carboxilic sau al acidului sulfonic, cu ajutorul 23 reacțiilor chimice cunoscute.

Π

Compușii cu formula II pot fi preparați folosind următoarele scheme I și II, ilustrate, 39 unde R³ este furan.

RO 121030 Β1

Schema I

Reactivi: A) trietil ortoformiat; B) hidrazida acidului 2-furoic, 2-metoxietanol; C) PhOPh, 260°C; D) HCI 10%, cu refluxare; E) cianamidă, pTsOH, N-metilpirolidonă.

RO 121030 Β1

Reactivi: F) hidrazida acidului furoic, difenil eter; E) cianamidă, pTsOH, N-metilpirolidonă. 29

Compușii cu formula 11 pot fi preparați fie printr-o cale indirectă, descrisă în schema I, fie printr-o cale directă, descrisă în Schema II. Materialele de plecare corespunzătoare pen- 31 tru ambele scheme sunt nitrilii orto-amino heterociclici cu formula III, preparați în general conform procedeelor sintetice cunoscute în literatură și raportate în cartea lui E. C. Taylor 33 și A. McKilIop (voi. 7, din seriile Advances in Organic Chemistry, Ed., Interscience, 1970).

CN

NH

Orto-amino nitrilii III sunt transformați în imidații corespunzători cu formula IV, prin 43 reacția cu un exces de etil ortoformiat, la temperatură de refluxare, timp de 8...10 h. Reacția conduce, după evaporarea etil ortoformiatului, la imidații IV corespunzători, substanțial puri, 45 cu un randament ridicat, așa cum se evidențiază prin analiza spectrului RMN (rezonanță magnetică nucleară) a ¹H în IR a produșilor de reacție bruți: 47

RO 121030 Β1

Imidații cu formula IV sunt supuși, apoi, unei secvențe de două reacții, care permit obținerea structurilor triciclice cu formula VI, la un randament ridicat:

VJ

Secvența de reacție include: a) reacția cu hidrazida acidului 2-furoic într-o soluție de 2-metoxietanol, la temperatura de reflux, timp de 8...10 h, pentru obținerea compușilor intermediari cu formula V; b) ciclizarea termică a celui din urmă, cu formarea compușilor corespunzători cu formula VI, prin încălzirea în difenil eter la temperatura de 260’C, timp de 0,5...1 h.

Compușii tricidici VI sunt apoi hidrolizați cu HCI la reflux, timp de 1 ...3 h, pentru a da triazolii VII, care, în final, sunt ciclizați în compușii II doriți, cu cianamidăîn N-metil pirolidonă la reflux și în prezența acidului para-toluensulfonic (Schema I).

în unele cazuri, triazolii VII pot fi obținuți prin încălzirea directă în difenil eter, a ortoamino nitrilul III cu hidrazida acidului 2-furoic. Triazolii VII sunt apoi ciclizați, așa cum s-a descris mai sus, în schema II. în următoarele scheme III, IV și V, sunt raportate mai detaliat sintezele compușilor cu formula II, în care A este un inel triazolic.

RO 121030 Β1

Schema III

Sinteza derivaților 5-amino-7-substituit-2(2-furil)-1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo 3 [1,5-c]pirimidinici r-n₃ + conh₂

CN

K ₃

DMSO

N^^CONH < T /

R

V

POCIj

DMF.'O'C

RO 121030 Β1

Schema IV

Sinteza derivaților 5-amino-8-substituit-2(2-furil)-1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5cjpirimidinici

NaOH

O V

XCN nhso₂c₇h₇

HoSOa * conc.

-15’C

RC1

K2CO3, OMF ao c

Reactivi: A) hidrazida acidului furoic, PhOPh, 260°C; B) NH₂CN, pTsOH, Nmetilpirolidonă.

RO 121030 Β1

Schema V

Sinteza derivaților 5-amino-9-substituit-2(2-furil)-1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo[ 1,5- 3 cjpirimidinici

NaOH

O ’C

H

CN

NHSOjCyHy

R

H2SO4 conc.

-15*C

Reactivi: A) hidrazida acidului furoic, PhOPh, 260“C; B) NH₂CN, pTsOH, N-metilpirolidonă. 33 în final, compușii II, conținând 5-amino, sunt reacționați cu acizi carboxilici, acizi sulfonici, acizi carboxilici activați, acizi sulfonici activați, acizi tiocarboxilici, acizi tiocarboxilici 35 activați și similari, pentru a forma compușii doriți.

Acizii carboxilici activați includ halogenuri, esteri, anhidride și alți derivați cunoscuți 37 că reacționează cu aminele pentru a forma amide. Acizii sulfonici activați includ halogenurile sulfonilice, cum ar fi sulfonil clorurile. 39

Nu este necesar în toate cazurile să se utilizeze derivați ai acizilor carboxilici și sulfonici activați. Acizii înșiși pot fi cuplați cu aminele, utilizând metode chimice de cuplare 41 standard, spre exemplu, utilizând diciclohexil diimida (DCI) și alți agenți de cuplare folosiți în mod uzual. Condițiile de cuplare adecvate, pentru formarea legăturilor amidice, sunt bine 43 cunoscute de către specialiștii din domeniul sintezei peptidelor.

în general, chimia de mai sus poate fi utilizată pentru prepararea 8-(Ar)alchil-2-(2- 45 furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinelor atunci când se folosesc ca materiale de plecare 3-cian-2-aminopirazoli. 3-cian-2-amino-pirazolii pot să reacționeze cu o halogenură 47 alchilică (RX) într-un solvent aprotic polar, cum ar fi dimetil formamida (DMF) pentru a furniza

RO 121030 Β1 o grupare R pe unul dintre atomii de azot ai ciclului. Compusul rezultat poate fi refluxat cu trietil ortoformiat, pentru a furniza un ester imino etilic, care poate să reacționeze cu hidrazida furoică, preferabil prin utilizarea unei trape Dean-Stark pentru eliminarea azeotropă a apei produse în reacție, în scopul formării 8-(Ar)alchil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5cjpirimidinelor. Pentru utilizarea în reacțiile chimice ulterioare, produșii pot fi purificați prin cromatografie, spre exemplu, în (EtOAc/hexan 1:1).

Produsul acestei reacții poate să reacționeze cu un acid adecvat, cum ar fi HCI, la reflux, urmat de reacția cu cianamidă într-un solvent, cum ar fi N-metil pirolidona cu acid para-toluensulfonic catalitic la temperaturi ridicate, pentru a forma 5-amino-8-(Ar)alchil-2-(2furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]piri mid inele.

Acești compuși amino-substituiți pot să reacționeze cu izocianați adecvați, pentru a forma compuși ureici, cu acizi carboxilici activați, cum ar fi hidracizii, pentru a forma amide, cu acizi sulfonici activați, cum ar fi halogenurile acizilor sulfonici, pentru a forma sulfonamide, sau cu alți derivați reactivi ai acizilor carboxilici sau sulfonici, pentru a forma alți compuși doriți.

Compușii triazolo-triazolo-pirimidinici pot fi peparați cu ajutorul reacțiilor chimice similare, dar plecând de la o azidă funcționalizată corespunzător și pusă să reacționeze cu H₂NC(O)CH₂CN, pentru a forma inelul heterociclic inițial, urmată de reacția grupării amidice cu un agent de deshidratare, cum arfi POCI₃, pentru a forma un nitril. Ciano-aminotriazolul rezultat poate să fie supus reacției în aceeași manieră ca și 3-ciano-2-aminopirazolii discutați mai sus, pentru a prepara triazolo-triazolo-pirimidinele.

Sinteza analogilor radiomarcați

Compușii pot fi marcați cu orice radiomarker potrivit. Exemple de radiomarkeri potriviți includ ³H și ¹⁴C, dar poate fi utilizat orice radiomarker substanțial netoxic, folosit în mod obișnuitîn studiile farmacocinetice. Modalitățile de încorporare a radiomarkerilorîn compușii organici sunt bine cunoscute de către specialiștii din domeniu.

Când compușii sunt compuși 5-[[fenil substituit)amino]carbonil]amino-8-(ar)alchil-2-(2furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinici sau compuși 5-amino-8-(Ar)alchil-2-(2furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinici, încorporarea unui marker tritiu este, de departe, cea mai directă.

într-o aplicație practică, o materie primă potrivită este un compus în care gruparea (ar)alchil din poziția 8-include o dublă legătură. Legătura dublă poate fi supusă reacției cu tritiu, în prezența unui catalizator adecvat, spre exemplu, paladiu pe cărbune vegetal, sau a altor catalizatori de hidrogenare cunoscuți.

Spre exemplu, 5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-(1,2-ditritio-propil)-2-(2-furil)pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina (compusul 102) poate fi preparată prin adăugarea de tritiu peste legătura dublă a 5-[[(4-metoxi-fenil)amino]carbonil]amino-8-1propenil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinei (compusul 101). Compusul 102 este discutat mai jos, în raport cu diferitele studii de afinitate a legării pe celulele canceroase JURKAT.

Alternativ, markerul tritiu poate fi prezent pe compușii utilizați să reacționeze cu gruparea 5-amino, pentru a forma grupări amidice, ureice sau altele în poziția 5-. Spre exemplu, izocianații utilizați pentru prepararea compușilor 5-aminocarbonilamino descriși aici pot include un tritiu sau alți radiomarkeri și, ca urmare, pot fi ușor încorporați în produsul final.

într-o altă aplicație practică, radiomarkerul poate fi încorporat în moleculă, în timp ce sistemul ciclic este pus împreună cu acesta. Așa cum s-a discutat mai sus în legătură cu sinteza compușilor cu formula II, diverși compuși triciclici cu formula VI sunt hidrolizați cu HCI, pentru a da triazolii cu formula VII, care sunt ciclizați cu cianamidă la refluxare, în prezența acidului para-toluensulfonic, așa cum s-a arătat în schema I. Este relativ direct să se încorporeze un marker ¹⁴C în această etapă din sinteză, utilizând cianamidă marcată cu ¹⁴C.

RO 121030 Β1

Compușii iodurați pot fi preparați, spre exemplu, prin încorporarea unui iod radioactiv 1 în compusul aromatic utilizat pentru a reacționa cu gruparea 5-amină. încorporarea iodului în inelele aromatice este bine cunoscută specialiștilor din domeniu. Este ușor să se încor- 3 poreze un atom de iod în compușii aromatici utilizați pentru a reacționa cu gruparea 5-amină în scopul preparării compușilor descriși aici. 5 în consecință, utilizând nu mai mult decât cunoștințele din domeniu, pot fi preparați rapid analogi radiomarcați adecvați. 7

Sinteza analogilor marcați fluorescent

Ca și în cazul compușilor radiomarcați, sinteza compușilor marcați fluorescent este 9 relativ directă. De preferință, grupările fluorescente sunt prezente în poziția R₂, deși este fezabilă, de asemenea, și substituția în poziția R₃. în una dintre aplicații, gruparea(ile) 11 fluorescentă(e) include un inel furanic care poate fi atașat la poziția R₃. Alternativ, pot fi utilizate alte inele aromatice. Sunt bine cunoscuți specialiștilor din domeniu markerii 13 fluorescenți, iar aceștia pot fi rapid atașați la compușii descriși aici, utilizând reacții chimice cunoscute. 15

Metode de utilizare a compușilor

Compușii pot fi utilizați în toate Indicațiile pentru agoniștii și antagoniștii receptorului 17 A₃, incluzând:

- tratarea hipertensiunii;19

- tratarea tulburărilor alergice, cum ar fi febra fânului (guturaiul) și rinitele alergice; 21

- degranularea celulelor mastice;

- agenți antitumorali;23

- tratarea hipoxiei cardiace; și

- protecția împotriva ischemiei cerebrale;25 așa cum a fost descris, spre exemplu, în Jacobson, TIPS May 1998, pp. 185-191, al cărei conținut este încorporat aici ca referință.27

O întrebuințare preferată a acestor compuși este în detectarea și/sau tratamentul cancerului. Așa cum s-a discutat mai jos, s-a arătat că celulele tumorale exprimă receptorul 29 A₃. Se crede că receptorul A₃ protejează celulele de lezarea ischemică, atunci când acestea nu primesc un aport adecvat de sânge. Câteva medicamente disponibile comercial, precum 31 și medicamente aflate în curs de elaborare sunt puse în aplicare încet, pentru inhibarea exprimării VEGF care stopează aportul de sânge spre celulele tumorale. Cu toate acestea, 33 agonismul receptorilor A₃ adenozinici poate realiza un efect protector, oprind moartea celulelor tumorale, în timp ce celulele nu primesc un aport adecvat de sânge. Prin administrarea 35 antagoniștilor acestor receptori, împreună cu compuși anti-VEGF sau cu alți compuși antiangiogenici, celulele tumorale pot fi izolate de un nou aport de sânge, pierzând protecția față 37 de prejudiciul ischemic pe care îl produce agonismul receptorilor A₃.

Compușii pot fi administrați unui pacient prin orice modalitate acceptabilă medical. 39 Mijloace adecvate de administrare includ administrarea orală, rectală, topică sau parenterală (incluzând adminstrarea subcutanată, intramusculară și intravenoasă), deși sunt preferate 41 administrarea orală sau parenterală.

Cantitatea de compus necesară, pentru ca acesta să fie eficient ca modulator al unui 43 receptor adenozinic, va varia, desigur, în funcție de individul mamifer care trebuie tratat, și va fi, în ultimă instanță, la latitudinea medicului sau a veterinarului. Factorii care trebuie luați 45 în considerare includ starea de boală care trebuie tratată, calea de administrare, natura formulării, greutatea corporală a mamiferului, aria suprafeței, vârsta și starea generală, și 47 compusul particular care trebuie administrat. Cu toate acestea, o doză eficientă corespunzătoare este din domeniul de la aproximativ 0,1 ng/kg până la aproximativ 10 mg/kg 49 greutate corporală per zi, de preferință, din domeniul de la aproximativ 1 până la aproximativ 3 mg/kg per zi. 51

RO 121030 Β1

Doza zilnică totală poate fi administrată ca doză unică, doze multiple, de exemplu, de 2...6 ori pe zi, sau prin infuzie intravenoasă pe o durată aleasă. Dozările peste sau sub gama citată mai sus fac parte din domeniul prezentei invenții și potfi administrate pacientului individual, dacă dorește sau dacă este necesar. Spre exemplu, pentru un mamifer de 75 de kg, o gamă de dozare este de aproximativ 75 până la aproximativ 220 mg per zi, iar o doză tipică va fi de aproximativ 150 mg per zi. Dacă sunt indicate doze multiple, tratamentul ar putea fi, tipic, de 50 mg dintr-un compus, administrate de 3 ori pe zi.

într-o altă aplicație practică, compușii radiomarcați potfi administrați unui pacient, în scopul efectuării unui test de determinare a prezenței sau absenței celulelor tumorale canceroase care exprimă receptorii Aj. Compușii descriși aici ca având o afinitate relativ ridicată pentru subtipul de receptor A₃, sunt administrați avantajos unui pacient, iar după ce compușii s-au legat de receptorii A₃ prezenți în celulele tumorale, localizarea compușilor poate fi determinată prin determinarea localizării compușilor radiomarcați. Procedee de determinare a localizării și a densității compușilor radiomarcați sunt bine cunoscute specialiștilor din domeniu.

De asemenea, poate fi avantajoasă utilizarea compușilor radiomarcați și/sau fluorescent marcați în timpul operațiilor chirurgicale pentru îndepărtarea țesutului canceros. Adesea, chirurgii trebuie să se asigure de completa îndepărtare a țesutului canceros. Compușii radiomarcați sau fluorescent marcați pot fi administrați unui pacient, fie înainte, fie în timpul intervenției chirurgicale și se vor lega de celulele canceroase prezente în pacient. Timpul de administrare va varia în funcție de, printre alți factori, preluarea compusului particular de către celulele tumorale particulare și de localizarea tumorii în corp. Astfel, chirurgul are un test relativ direct pentru determinarea prezenței celulelor canceroase reziduale după îndepărtarea tumorii. Prezența celulelor tumorale reziduale poate fi determinată prin măsurarea fluorescenței sau a radioactivității la situsul operativ cu ajutorul procedeelor analitice bine cunoscute de către specialiștii din domeniu.

Detectarea celulelor canceroase in vitro poate fi efectuată prin administrarea compușilor la o suspensie de celule în mediul de cultură celular, permiterea compusului să se lege de receptorii A₃ adenozinici de pe celulele canceroase și detectarea markerului.

Formulări

Compușii descriși mai sus sunt administrați, de preferință, într-o formulare care include un compus activ, adică un compus cu formula I, împreună cu un purtător acceptabil pentru modul de administrare. Sunt cunoscuți de către specialiștii din domeniu purtătorii acceptabili din punct de vedere farmaceutic, adecvați.

Opțional, compozițiile potinclude și alți ingredienți activi din punct de vedere terapeutic, cum ar fi: agenții antivirali, antitumorali, antibacterieni, antiinflamatori, analgezicele și imunosupresoarele. Purtătorul trebuie să fie acceptabil din punct de vedere farmaceutic, în sensul de a fi compatibil cu ceilalți ingredienți ai formulării și nu vătămători pentru acceptorul acestuia.

Formulările pot include purtători adecvați administrării orale, rectale, topice sau parenterale (inclusiv, subcutanate, intramusculare și intravenoase). Sunt preferați purtătorii potriviți pentru administrarea orală sau parenterală.

Formulările potrivite pentru administrarea parenterală includ, în mod convenabil, preparatul apos steril al compusului activ, care este, de preferință, izotonic cu sângele primitorului. Așadar, asemenea formulări pot conține, în mod convenabil, apă distilată, dextroză 5% în apă distilată sau salină. Formulările utile includ, de asemenea, soluții concentrate sau solide conținând compusul cu formula I, care, prin diluție cu un solvent corespunzător, dau o soluție adecvată pentru administrarea parenterală de mai sus.

RO 121030 Β1

Pentru administrarea enterală, compusul poate fi încorporat într-un purtător inert, în 1 unități mici, cum ar fi: capsule, cașete, tablete sau pastile, fiecare dintre acestea conținând o cantitate predeterminată din compusul activ sub formă de pulbere sau granule; sau de 3 suspensie sau soluție într-un lichid apos sau neapos, spre exemplu, un sirop, un elixir, o emulsie sau un lichid. Purtători adecvați pot fi amidonurile sau zaharurile și includ lubrifianți, 5 aromatizanți, lianți și alte materiale de aceeași natură.

O tabletă poate fi fabricată prin comprimare sau turnare în forme, opțional cu unul sau 7 mai mulți ingrediente suplimentare. Tabletele comprimate pot fi preparate prin comprimarea, într-o mașină corespunzătoare, a compusului activ într-o formă fără curgere, exemplu., 9 pulbere sau granule, opțional amestecat cu ingrediente, de exemplu, lianți, lubrifianți, diluanți inerți, agenți activi de suprafață sau de dispersare. Tabletele turnate în forme pot fi obținute 11 prin turnarea în forme, într-o mașină corespunzătoare, a amestecului format din compusul activ, pulverizat, cu orice purtător potrivit. 13

Un sirop sau o suspensie pot fi obținute prin adăugarea compusului activ la o soluție apoasă concentrată a unui glucid, de exemplu, sucroza, la care se pot adăuga, de aseme- 15 nea, orice ingrediente. Astfel de ingrediente pot include aromatizanți, un agent pentru întârzierea cristalizării zahărului sau un agent de mărire a solubilității oricărui alt ingredient, de 17 exemplu, un alcool polihidroxilic, spre exemplu, glicerol sau sorbitol.

De asemenea, compușii pot fi administrați local, prin aplicarea topică a unei soluții, 19 alifii, creme, gel, loțiuni sau material polimeric (spre exemplu, Pluronic™, BASF), care pot fi preparați prin metodele convenționale, cunoscute în domeniul farmaceutic. în afara soluției, 21 alifiei, cremei, gelului, loțiunii sau bazei polimerice și a ingredientului activ, astfel de formulări topice pot conține, de asemenea, antiseptice, parfumuri și agenți farmaceutici activi, 23 suplimentari.

Formulările pentru administrarea rectală pot fi prezentate sub formă de supozitoare 25 cu un purtător convențional, de exemplu, untul de cacao sau Witepsol S55 (Marcă înregistrată Dynamite Nobel Chemical, Germany), pe o bază de supozitor. 27

Alternativ, compusul poate fi administrat în lipozomi sau microsfere (sau microparticule). Metodele pentru prepararea lipozomilor și a microsferelor destinate administrării la 29 un pacient sunt bine cunoscute de către specialiștii din domeniu. Brevetul US 4789734, al cărui conținut este încorporat aici ca referință, descrie metode pentru încapsularea materia- 31 lelor biologice în lipozomi. în esență, materialul este dizolvat într-o soluție apoasă, se adaugă fosfolipidele și lipidele adecvate, împreună cu agenții de suprafață, dacă este nevoie, iar 33 materialul este dializat sau sonicat, dacă este necesar. O trecere în revistă a metodelor cunoscute este furnizată de G. Gregoriadis, Chapter 14, “Liposomes”, Drug Carriers in Biology 35 and Medicine, pp. 287-341 (Academic Press, 1979). Microsferele formate din polimeri sau proteine sunt bine cunoscute specialiștilor din domeniu și pot fi proiectate pentru trecerea 37 prin tractul gastrointestinal direct în circuitul sanguin. Alternativ, compusul poate fi încorporat, iar microsferele sau compoziția de microsfere pot fi implantate pentru eliberarea lentă, într-o 39 perioadă de timp cuprinsă între zile și luni. A se vedea, spre exemplu, brevetele US 4906474, 4925673 și 3625214, ale căror conținuturi sunt încorporate aici ca referințe. 41

Microparticulele preferate sunt cele preparate din polimeri biodegradabili, cum ar fi poliglicolide, polilactide și copolimeri ai acestora. Specialiștii din domeniu pot determina rapid 43 un sistem purtător corespunzător, în funcție de diferiți factori, incluzând viteza dorită de eliberare a medicamentului și dozarea dorită. 45

Formulările pot fi prezentate comod, sub formă de dozare unitară și pot fi preparate prin una dintre metodele bine cunoscute în domeniul farmaceutic. Toate metodele includ 47 etapa de aducere a compusului activ în asociere cu un purtător, care constituie unul sau mai

RO 121030 Β1 multe ingrediente. în general, formulările sunt preparate prin aducerea uniformă și intimă a compusului activ în asociere cu un purtător lichid sau cu un purtător solid fin divizat și apoi, dacă este necesar, aranjarea produsului într-o formă de dozare unitară dorită.

în afara ingredientelor menționate mai sus, formulările mai pot include și unul sau mai multe ingrediente utilizate în domeniul formulărilor farmaceutice, de exemplu, diluanți, tampoane, agenți aromatizanți, lianți, agenți activi de suprafață, agenți de îngroșare, lubrifianți, agenți de suspendare, conservanți (incluzând antioxidanți) și similari.

Determinarea gradului de activitate pentru compuși

Activitatea compușilor poate fi determinată rapid, utilizând nu mai mult decât experimentarea de rutină, cu ajutorul oricăruia dintre testele următoare.

Testul de legare la receptorii adenozinici A₁ și A^ extrași din șobolan

Obținerea membranelor

Șobolani masculi Wistar (200...250 g) pot fi decapitați, iar creierul întreg (mai puțin materia albă, striatul și cerebelul) este disecat pe gheață. Țesuturile de creier pot fi dezintegrate într-un Polytron (poziția 5) în 20 de volume de tampon 50 mM Tris-HCI, pH=7,4. Apoi, omogenizatul poate fi centrifugat la 48.000 g, timp de 10 min, iar depozitul resuspendat în Tris-HCI, conținând 2 Ul/ml adenozin deaminază de tip VI (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo., USA). După 30 min de incubare la 37°C, membranele pot fi centrifugate, iar depozitele păstrate la -70°C. Țesuturile striate pot fi omogenizate cu un Polytron în 25 volume de tampon 50 mM Tris-HCI, conținând 10 mM MgCI₂, pH=7,4. Apoi, omogenatul poate fi centrifugat la 48.000 g, timp de 10 min la 4°C și resuspendat în tampon Tris-HCI, conținând 2 Ul/ml adenozin deaminază. După 30 min de incubare la 37°C, membranele pot fi centrifugate, iar depozitul păstrat la -70°C.

Testul de legare cu ligand radiomarcat

Legarea [³H]-DPCPX (1,3-dipropil-8-ciclopentilxantină) la membranele de creier de șobolan poate fi realizată, în esență, conform metodei descrise anterior de Bruns etal., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 5547-5551, 1980. Experimentele de dezlocuire pot fi efectuate în 0,25 ml de tampon conținând 1 nM de [³H]-DPCPX, 100 pl de membrane diluate de creier de șobolan (100 pg de proteină/test) și cel puțin 6...8 concentrații diferite din compușii examinați. Legarea nespecifică poate fi determinată în prezența a 10 nM de CHA (N⁶ciclohexiladenozină), iar aceasta este întotdeauna < 10% din legarea totală. Timpii de incubare sunt în mod caracteristic 120 min, la 25°C.

Legarea [³H]-SCH 58261 (5-amino-7-(2-feniletil)-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină la membranele striate de șobolan (100 pg de proteină/test) poate fi efectuată conform metodelor descrise în Zocchi și colab., J. Pharm. and Exper. Ther. 276; 398-404 (1996). în studiile de competiție trebuie utilizate cel puțin 6...8 concentrații diferite din compușii examinați. Legarea nespecifică poate fi determinată în prezența a 50 (pM NECA (5'-(N-etilcarboxamido)adenozină). Timpul de incubare este în mod caracteristic 60 min, la 25°C.

Radioactivitatea legată și cea liberă pot fi separate prin filtrarea amestecului de testat pe filtre din fibră de sticlă Whatman GF/B, utilizând un recoltator de celule, Brandel (Gaithersburg, MD, USA). Amestecul de incubare poate fi diluat cu 3 ml tampon de incubare răcit pe gheață, filtrat rapid sub vid, iar filtrul poate fi spălat de 3 ori cu 3 ml din tamponul de incubare. Radioactivitatea legată pe filtru poate fi măsurată, spre exemplu, prin spectrometrie de scintilație lichidă. Concentrația proteică poate fi determinată, spre exemplu, conform metodei Bio-Rad (Bradford, Anal. Biochem. 72:248 (1976)) cu albumină bovină ca standard de referință.

RO 121030 Β1

Testul de legare la receptorul adenozinic A₃ (extras) din clone umane 1

Testele de legare la receptor

Testele de legare pot fi efectuate conform metodelor descrise de Salvatore și colab., 3 în Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10365-10369, (1993). în studiile de saturare, o parte alicotă de membrane (8 mg proteină/ml) de celulele HEK-293 transfectate cu receptorul adenozinic A₃ 5 recombinant uman (Research Biochemical Internațional, Natick, MA, USA) poate fi incubat cu 10...12 concentrații diferite de [¹²⁵I]AB-MECA din domeniul 0,1...5 nM. Experimentele de 7 competiție pot fi realizate în duplicat, într-un volum final de 100 pl, în tuburi de testare conținând 0,3 nM de [¹²⁵I]AB-MECA, 50 mM tampon Tris-HCI, 10 mM MgCI₂, pH=7,4 și 20 μΙ 9 membrane diluate (12,4 mg proteină/ml) și cel puțin 6...8 concentrații diferite din liganzii examinați. 11

Timpul de incubare a fost de 60 min, la 37’C, în conformitate cu rezultatele experimenteler anterioare în funcție de timp. Radioactivitatea legată și cea liberă au fost separate 13 prin filtrarea amestecului test pe filtre din fibră de sticlă Whatman GF/B, utilizând o mașină Brandel de recoltat celule (Gaithersburg, MD, USA). Legarea nespecifică a fost definită ca 15 legarea în prezența a 50 μΜ de R-PIA și a fost aproximativ 30% din legarea totală. Amestecul de incubare poate fi diluat cu 3 ml tampon de incubare răcit pe gheață, filtrat rapid 17 sub vid, iar filtrul a fost spălat de 3 ori cu 3 ml din tamponul de incubare. Radioactivitatea legată pe filtru a fost numărată într-un contor Beckman gamma 5500B γ. Concentrația 19 proteică poate fi determinată conform metodei Bio-Rad (3), cu albumina bovină ca standard de referință. 21

Analiza datelor

Valorile constantei de inhibare a legării, Kj, pot fi calculate din valorile IC₅₀, în con- 23 formitate cu ecuația lui Cheng și Prusoff (Cheng and Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22:30993108 (1973)), Kj = IC₅₀/(1+[C*]/Kd*), unde [C*j este concentrația radioligandului, iar K_D* 25 constanta sa de disociere.

Pentru analiza pe calculator a experimentelor de saturare și de inhibare, se poate uti- 27 liza un program adecvat (soft încărcat pe hard disk-ul calculatorului), LIGAND, care calculează curba prin metoda neliniară a celor mai mici pătrate (Munson și Rodbard, Anal. 29 Biochem. 107: 220-239 (1990)). Datele sunt exprimate în mod caracteristic ca medie geometrică, cu limitele de încredere de 95 sau 99%, în paranteze. 31

Exemple

Următoarele exemple ilustrează aspecte ale acestei invenții, dar nu trebuie luate 33 drept limitări. Simbolurile și convențiile utilizate în aceste exemple tind să fie în concordanță cu cele utilizate în literatura chimică internațională contemporană, spre exemplu: Journal of 35 the American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.) și Tetrahedron.

Exemplul 1. Prepararea 8-(Ar)alchil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]piri- 37 midinelor (compușii 18...25)

8-(Ar)alchil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e] 1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinele au fost preparate 39 conform strategiei de sinteză prezentată în următoarea schemă VI.

în prepararea compușilor 18...25, o soluție de 1 (10 mmoli) în 40 ml de DMF, răcită 41 la 0°C, a fost tratată cu NaH (60% în ulei, 12 mmoli), în câteva porțiuni, peste 10 min. După 45 min, a fost adăugată halogenura de (ar)alchil (12 mmoli), iar amestecul de reacție a fost 43 lăsat să se încălzească la 25°C și a fost agitat timp de 3...5 h (CSS:EtOAc 1:1). Reacția a fost stinsă prin adăugare de H₂O (80 ml), iar stratul apos a fost extras cu EtOAc (5 x 25 ml). 45

Straturile organice au fost recombinate, uscate (pe Na₂SO₄), filtrate și concentrate la presiune redusă, pentru producerea pirazolului alchilat (2-9) ca amestec inseparabil de 47 izomeri N¹ și N² (în raport de aproximativ 1:4).

RO 121030 Β1

Schema VI. Procedee generale pentru prepararea 8-(Ar)alchil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinelor (compușii 18...25)

Reactivi a) NaH, DMF, RX; b) HC(OEt)₃, la reflux; c) Hidrazida 2-furoică,

MeO(CH₂)₂OH; d) Ph₂O, 260’C, cromatografie frontală

10-17

18-25

Apoi, acest amestec de N¹ și N²-substituit-4-ciano-5-amino pirazoli (2-9) a fost dizolvat în trietil ortoformiat (60 ml), iar soluția a fost refluxată sub atmosferă de azot, timp de 8 h. Solventul a fost apoi îndepărtat sub vid, iar reziduul uleios, alcătuit din amestecul de imidați (10-17), a fost dizolvat în 2-metoxietanol (50 ml) și s-a adăugat hidrazida acidului 2-furoic (13 mmoli). Amestecul a fost refluxat timp de 5...10 h, apoi, după răcire, solventul a fost îndepărtat sub presiune redusă , iar reziduul uleios brun a fost ciclizat ulterior, prin oricare altă purificare în difenil eter (50 ml) la 260°C, cu ajutorul unei trape Dean Stark, pentru eliminarea azeotropă a apei produse în reacție. După 1,5 h, amestecul a fost turnat în hexan (300 ml) și răcit. Precipitatul a fost filtrat și purificat prin cromatografie (EtOAc/hexan 1:1). în acest fel, produsul principal (N⁸ alchilat) (18-25) a fost obținut cu un randament bun.

Urmând acest procedeu general, au fost preparați următorii compuși:

8-Metil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină (18), randament 45%; solid galben, punct de topire 155...156°C (EtOAc-eterde petrol); IR(KBr): 1615,1510 cm'¹; ¹H RMN (DMSO d_e); δ 4,1 (s, 1H); 6,32 (m, 1H); 7,25 (m, 1H); 8,06 (m, 1H); 8,86 (s, 1H); 9,38 (s, 1H).

8-Etil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină (19), randament 50%; solid galben pal, punct de topire 188...189°C (EtOAc-eterde petrol); IR(KBr): 1620,1500 cm' ¹; ¹H RMN (DMSO d₆);5 1,67 (t, 2H, J = 7); 4,53 (q, 2H, J = 7); 6,59 (m, 1H);7,23(m, 1H);7,64(s, 1H);8,34(s, 1 H);9,10(s, 1H).

8-Propil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pi rimidină (20), randament 60%; solid galben, p.t. 189-190°C (EtOAc-eter de petrol); IR (KBr): 1600, 1505 cm'¹; ¹H RMN (DMSO d₆); δ 0,98 (t, 2H, J = 7); 2,03-2,10 (m, 2H); 4,41 (q, 2H, J =7); 6,60 (m, 1H); 7,24 (m, 1H); 7,64 (s, 1H); 8,32 (s, 1H);9,10(s, 1H).

RO 121030 Β1

8-Butil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină (21), randament 50%; solid galben pal, punct de topire 245...247°C (EtOAc-eterde petrol); IR(KBr): 1610,1500 cm ¹; ¹H RMN (DMSO d₈); δ 0,9 (m, 3H); 1,3 (m, 2H); 1,9 (m, 2H); 4,5 (t, 2H, J = 7,2); 6,2 (m, 1H); 7,3 (m, 1H); 8,0 (m, 1H); 8,9 (s, 1H);9,4(s, 1H).

8-lzopentil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină (22), randament 54%; solid galben pal, punct de topire 235...237’C (EtOAc-eter de petrol); IR (KBr): 1635, 1510,1450 cm¹; Ή RMN (DMSO d₆); δ 1,0 (d, 6H, J = 6,2); 1,5-1,9 (m, 3H); 4,6 (t, 2H, J =

7.4) ; 6,6 (m, 1H); 7,3 (m, 1H); 7,7 (m, 1H); 8,8 (s, 1 H);9,1 (s, 1H).

8-(2-lzopentenil)-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină (23), randament 48%; solid galben, punct de topire 21O...212°C (EtOAc-eterde petrol); IR (KBr): 1625, 1500, 1430 cm¹; ¹H RMN (DMSO d₆); δ 1,79 (s, 3H); 1,87 (s, 3H); 5,05 (d, 2H, J = 6); 5,555,63 (m, 1H); 6,60 (m, 1H); 7,24 (m, 1H); 7,64 (s, 1H);8,34(s, 1H); 9,10 (s, 1H).

8-(2-Feniletil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină (24), randament 56%; punct de topire 268...270°C (EtOAc-eter de petrol); IR (KBr): 1660,1510,1450 cm’¹; ¹H RMN (DMSO d₆); δ 3,32 (t, 2H, J = 6,7); 4,72 (t, 2H, J = 6,7); 6,73 (s, 1H); 7,23 (m, 5H); 7,95 (s, 1H); 8,8 (s, 1H); 9,41 (s, 1H). Anal. (C₁₈H₁₄N₆O) C, Η, N.

8-lzopentil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină (25), randament 63%; solid galben, punct de topire 165...166°C (EtOAc-eterde petrol); IR (KBr): 1630,1500, 1440 cm'¹; ¹H RMN (DMSO d₈); 8 2,34-2,48 (m, 2H); 2,67 (t, 3H, J = 7,5); 4,43 (t, 2H, J =

7.5) ; 6,61 (m, 1H); 7,16-7,32 (m, 6H); 7,64 (d, 1H, J = 2);8,29(s, 1 H);9,02(s, 1H).

Exemplul 2. Prepararea 5-amino-8-(ar)alchil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-tri-azolo [1,5-c]pirimidinelor (compușii 33...40)

5-amino-8-(ar)alchil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinele pot fi preparate conform strategiei de sinteză, prezentate în următoarea schemă VII.

Schema VII. Procedee generale pentru prepararea 5-amino-8-(ar)alchil-2-(2-furil)pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinelor (33...40) 35

Reactivi: a) HCI, la reflux; b) NH₂CN, 1-metil-2-pirolidonă, pTsOH, 140°C.

Pentru prepararea compușilor 33...40, a fost refluxată, timp de 3 h, o soluție de 37 amestec de triazolo-pirimidină (18-25) (10 mmoli) în HCI 10% (50 ml). Apoi, soluția a fost răcită și neutralizată cu o soluție saturată de NaHCO₃ la 0°C. Compușii (26...33) au fost 39 extrași cu EtOAc (3 x 20 ml), straturile organice au fost uscate cu Na₂SO₄ și evaporate sub vid. Amina brută obținută (26...33) a fost dizolvată în N-metil pirolidonă (40 ml), apoi s-a 41 adăugat cianamidă (60 mmoli) și acid p-toluensulfonic (15 mmoli), iar amestecul a fost încălzit la 160°C, timp de 4 h. S-a adăugat din nou cianamidă (60 mmoli), iar soluția a fost 43 încălzită peste noapte. Apoi, soluția a fost diluată cu EtOAc (80 ml), iar precipitatul (excesul de cianamidă) a fost filtrat; filtratul a fost concentrat sub vid și spălat cu apă (3 x 30 ml). 45

Stratul organic a fost uscat (pe Na₂SO₄) și evaporat sub vid. Reziduul a fost purificat prin cromatografie (în EtOAc/eter de petrol 2:1), pentru obținerea produsului dorit (34...41) sub 47 formă solidă.

RO 121030 Β1

Urmând acest procedeu general, au fost preparați următorii compuși:

5-mino-8-metil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină (34), randament 53%; solid galben, punct de topire 167...168’C (EtOAc-eter de petrol); IR(KBr): 3500,2950, 1680, 1645,1610,1560,1455 cm'¹; ¹H RMN (DMSOd₆); δ: 4,12 (s, 3H); 6,70 (m, 1H); 6,99 (bs, 2H), 7,18 (m, 1H); 7,81 (s, 1H); 8,42 (s, 1H).

5-amino-8-etil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină (35), randament 65%; solid galben, punct de topire 249...250°C (EtOAc-eter de petrol); IR (KBr): 3430-2950, 1680, 1655, 1620, 1550, 1450 cm’¹; ¹H RMN (DMSO d_e); δ 1,46(t, 2H, J = 7);4,30(d, 2H, J = 7); 6,72 (m, 1H);7,18(m, 1H);7,93 (bs, 2H); 7,93 (s, 1H); 8,62 (s, 1H).

5-amino-8-propil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-cJpirimidină (36), randament 57%; solid galben pal, punct de topire 209...210°C (EtOAc-eter de petrol); IR (KBr): 3400-2900,1660,1645,1610, 1545,1430 cm'¹; ¹H RMN (DMSO d_e); δ 0,83 (t, 2H, J = 7); 1,81-1,91 (m, 2H); 4,22 (d, 2H, J = 7); 6,71 (m, 1H); 7,19 (m, 1H); 7,63 (bs, 2H); 7,93 (s, 1H); 8,61 (5, 1H).

5-amino-8-butil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină (37), randament 47%; solid alb, punct de topire 200...203“C (EtOAc-eter de petrol); IR (KBr): 3500-2900, 1685, 1640,1620, 1550, 1450 cm¹; ¹H RMN (DMSO d₆); δ 0,9 (t, 3H); 1,2 (m, 2H); 1,8 (m, 2H); 4,2 (t, 2H); 6,7 (m, 2H); 7,2 (m, 2H); 7,6 (s, 1H);8,0(s, 1H); 8,6 (s, 1H).

5-amino-8-izopentil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-cJpiri midină (38), randament 60%; solid albicios, punct de topire 212...213°C (EtOAc-eter de petrol); IR (KBr): 3500-2850, 1670, 1650, 1615, 1560, 1455 cm¹; ¹H RMN (CDCI₃): δ 0,96 (d, 6H, J = 6,4); 1,59 (m, 1H); 1,86 (m, 2H); 4,32 (t, 2H, J = 6,4); 6,58 (m, 1H); 6,72 (bs, 2H); 7,21 (d, 1H, J = 4,2); 7,63 (d, 1H, J = 1,2); 8,10 (s, 1H).

5-amino-8-(2-izopentenil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c] pirimidină (39), randament 58%; solid galben pal, punct de topire 178...179°C (EtOAc-eter de petrol); IR (KBr): 3520-2950,1665,1640,1610,1555,1450 cm’¹; ¹H RMN (CDCI₃): δ: 1,74 (s, 3H); 1,77 (s, 3H); 4,87 (d, 2H, J = 7); 5,43-5,46 (m, 1H); 6,72 (m, 1H); 7,18 (m, 1H); 7,62 (bs, 2H); 7,93 (s, 1H); 8,55 (s, 1H).

5-amino-8-(2-feniletil)-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c] pirimidină (40), randament 45%; solid alb, punct de topire 183...185°C (EtOAc-eter de petrol); IR (KBr): 3500-2900,1670,1645,1620,1530,1455 cnT¹; ¹H RMN (DMSO d₆): δ 3,21 (t, 2H, J = 6,4);

4.53 (t, 2H, J = 6,4); 6,7 (s, 1H); 7,1-7,4 (m, 6H); 7,65 (bs, 2H);7,93(s, 1 H);8,45(s, 1H).

5-amino-8-(3-fenilpropil)-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c] pirimidină (41), randament 57%; solid galben, punct de topire 168...170°C (EtOAc-eter de petrol); IR (KBr): 3510-2950, 1665, 1640, 1615, 1520,1455 cm’¹; ¹H RMN (DMSO d₆); δ: 2,14-2,21 (m, 2H);

2.54 (t, 2H, J = 7); 4,29 (t, 2H, J = 6,4); 6,71 (s, 1H); 7,14-7,32 (m, 6H); 7,64 (bs, 2H); 7.93 (s, 1H); 8,64 (s, 1H ).

Exemplul 3. Prepararea 5-[[(fenil substituit)amino]carbonil]amino-8-(ar)alchil-2-(2furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinelor (compușii 42. ..57)

5-[[(fenil substituit)amino]carbonil]amino-8-(ar)alchil-2-(2-furil)-pirazolo [4,3-e]

1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinele pot fi preparate conform strategiei de sinteză, prezentate în următoarea schemă VIII.

Pentru prepararea compușilor42...57, compusul amino adecvat (34...41) (10 mmoli) a fost dizolvat în THF proaspăt distilat (15 ml) și s-a adăugat izocianatul corespunzător (13 mmoli). Amestecul a fost refluxat sub atmosferă de argon, timp de 18 h. Apoi s-a îndepărtat solventul sub vid, iar reziduul a fost purificat prin cromatografie rapidă (cu EtOAc-eter de petrol 4-6), pentru obținerea compușilor doriți, 42...57.

RO 121030 Β1

THF, reflux, 12 h”*

42-57

Schema VIII. Procedee generale pentru prepararea 5-[[(fenil substi-tuit) amino] carbonil]amino-8-(ar)alchil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-cjpirimidinelor (compușii 42...57)

Respectând acest procedeu general, au fost preparați următorii compuși:

5-[[(3-clorfenil)amino]carbonil]amino-8-metil-2-(2-fuhl)-pirazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină (42) randament 98%; solid galben pal, punct de topire 142...145”C (Et₂-eterde petrol); IR (KBr):3210-2930, 1660, 1630, 1610,1500 cm’¹; ¹H RMN (CDCI₃); δ; 4,21 (s, 3H); 6,60(m, 1H); 7,11 (d, 1H, J = 8); 7,13-7,28 (m, 2H); 7,55 (d, 1H, J = 8); 7,65 (s, 1 H);7,78 (d, 1H, J = 2); 8,22 (s, 1H ); 8,61 (bs, 1H); 11,24 (bs, 1H).

5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-metil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină (43), randament 99%; solid galben, punct de topire 193...195°C (Et₂O-eterde petrol); IR (KBr):3200-2900, 1664, 1625, 1600, 1500 cm’¹; ¹H RMN (CDCI₃); δ:

3,81 (s, 3H); 4,20(s, 3H); 6,61 (m, 1H); 6,85 (d, 2H, J = 9); 7,26 (m, 1H); 7,55 (d, 2H, J= 9); 7,65 (s, 1H); 8,21 (s, 1H ); 8,59 (bs, 1H); 10,96 (bs, 1H).

5-[[(3-clorfenil)amino]carbonil]amino-8-etil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5cjpirimidină (44), randament 98%; solid galben pal, punct de topire 2O4...2O5’C (Et₂O-eter de petrol); IR (KBr): 3220-2930, 1660, 1620, 1600, 1500 cm'¹; ¹H RMN (CDCI₃); δ: 1,71 (t, 3H, J = 7); 4,50 (q, 2H, J = 7); 6,67 (m, 1H); 7,20 (d, 1H, J = 8); 7,31 (m, 1H); 7,61 (d, 1H, J = 8);-7,70 (s, 1H); 7,84 (s, 1H ); 8,30 (s, 1H); 8,67 (bs, 1H); 11,30 (bs, 1H).

5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-etil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină (45), randament 99%; solid galben pal, punct de topire 200...201°C (Et₂O-eter de petrol); IR (KBr): 3250-2950,1665,1620,1610,1520 cm¹; ¹H RMN (CDCI₃); δ: 1,71 (t, 3H, J = 7); 3,85 (s, 3H); 4,49 (s, 3H); 6,65 (m, 1H); 6,88 (d, 2H, J = 9);7,26(m, 1H); 7,58 (d, 2H, J = 9); 7,69 (s, 1H ); 8,28 (s, 1H); 8,63 (bs, 1H);10,99 (bs, 1H).

5-[[(3-clorfenil)amino]carbonil]amino-8-propil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină (46), randament 95%; solid alb, punct de topire 138...139’C (Et₂Oeterde petrol); IR (KBr): 3210-2920,1655,1615,1600,1510 cm¹; Ή RMN (CDCI3); δ: 1,71 (t, 3H, J = 7); 2,04 (m, 2H); 4,36 (q, 2H, J = 7); 6,62 (m, 1H); 7,12 (d, 1H, J = 8);7,27(m, 1H); 7,56 (d, 1H, J = 8); 7,66 (s, 1H ); 7,80 (s, 1H); 8,24 (s, 1 H);8,62 (bs, 1H); 11,08 (bs, 1H).

5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-propil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină (47), randament 98%; solid galben pal, punct de topire 146...148”C (Et₂O-eterde petrol); IR (KBr): 3230-2950, 1660,1620, 1600, 1530 cm'¹; ¹H RMN (CDCI₃); δ: 0,98 (t, 3H, J = 7); 2,04-2,08 (m, 2H); 3,82 (s, 3H); 4,35 (t, 2H, J = 7); 6,61 (m, 1H); 6,89 (d, 2H, J = 9); 7,25 (m, 1H); 7,56 (d, 2H, J = 9); 7,65 (s, 1H); 8,23 (s, 1H); 8,59 (bs, 1H); 10,95 (bs, 1H).

21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47

RO 121030 Β1

5-[[(3-clorfenil)amino]carbonil]amino-8-butil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină (48), randament 97%; solid alb, punct de topire 21O...212°C (Et₂Oeterde petrol); IR (KBr):3240-2970,1650,1610,1510 cm¹; ¹H RMN (CDCI₃); δ; 1,00 (t, 3H,J = 7); 1,39-1,41 (m, 2H); 1,99-2,03 (m, 2H); 4,41 (q, 2H, J = 7); 6,63 (m,1H); 7,14 (d, 1H, J = 8); 7,29 (m, 1H); 7,56 (d, 1H, J = 8); 7,67 (s, 1 H);7,80 (s, 1H); 8,25 (s, 1H); 8,63 (bs, 1H); 11,26 (bs, 1H).

5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-butil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină (49), randament 96%; solid alb, punct de topire 197...198°C (Et₂Oeterde petrol); IR (KBr):3250-2960,1665,1610,1600,1520 cm’¹; ¹H RMN (CDCI₃); δ: 0,98 (t, 3H,J = 7); 1,38-1,42 (m, 2H); 2,02-2,05 (m, 2H); 3,82 (s, 3H); 4,39 (t, 2H, J= 7); 6,63 (m, 1H); 6,92 (d, 2H, J = 9); 7,25 (m, 1H); 7,57 (d, 2H, J = 9); 7,67(8,1H); 8,23 (s. 1H); 8,60 (bs, 1H); 10,95 (bs, 1H).

5-[[(3-clorfenil)amino]carbonil]amino-8-izopentil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină (50), randament 97%; solid galben pal, punct de topire 199...200C (Et₂O-eterde petrol); IR (KBr): 3230-2950,1655,1600,1510 cm¹; ¹H RMN (CDCI₃); δ: 1,01 (d, 6H, J = 7,5); 1,49-1,51 (m, 1H); 1,88-2,03 (m, 2H); 4,42 (t, 2H, J = 7); 6,62 (m, 1H); 7,13 (d, 1H, J = 8); 7,34 (m, 1H); 7,57 (d, 1H, J = 8); 7,67 (s, 1H); 7,80 (s, 1H); 8,24 (s, 1H); 8,63 (bs, 1H); 11,25 (bs, 1H).

5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-isopentil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină (51), randament 98%; solid alb, punct de topire 192...193°C (Et₂Oeter de petrol); IR (KBr): 3230-2970,1660,1615,1600,1500 cm¹; ¹H RMN (CDCI₃); δ: 0,99 (d, 6H, J = 7,5); 1,58-1,22 (m, 1H); 1,87-1,97 (m, 2H); 3,82 (s, 3H); 4,40 (t, 2H, J = 7); 6,62 (m, 1H); 6,91 (d, 2H, J = 9); 7,23 (m, 1H); 7,58 (d, 2H, J = 9); 7,66 (s, 1H); 8,23 (s, 1H); 8,59 (bs, 1H); 10,94 (bs, 1H).

5-[[(3-clorfenil)amino]carbonil]amino-8-(2-izopentenil)-2-(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină (52), randament 99%; solid alb, punct de topire 2O4...2O5°C (Et₂Oeter de petrol); IR(KBr):3245-2960,1650,1600,1510 cm*¹; ¹H RMN (CDCI₃); δ: 1,84 (s, 3H); 1,88(s, 3H); 5,01 (d, 2H, J = 8); 5,57 (m, 1H); 6,62 (m, 1H); 7,12 (d, 1H, J = 8); 7,29(m, 1H); 7,56 (d, 1H, J = 8); 7,66 (s, 1H); 7,80 (s, 1H); 8,26 (s, 1H); 8,60 (bs,1H); 11,26 (bs, 1H).

5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-(2-izopentenil)-2-(2-furil)-pirazolo-[4,3-

e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină (53), randament 96%; solid galben pal, punct de topire

198...199°C (Et₂O-eter de petrol); IR (KBr): 3235-2950, 1665, 1620, 1600, 1500 cm'¹; ¹H RMN (CDCI₃); δ: 1,83 (s, 3H); 1,87 (s, 3H); 3,81 (s, 3H); 4,97 (d, 2H, J = 7); 5,57 (m, 1H); 6,61 (m, 1H); 6,93 (d, 2H, J-9); 7,24 (m. 1H); 7,54 (d, 2H, J = 9); 7,66 (s, 1H); 8,25 (s, 1H); 8,58 (bs, 1H); 10,96 (bs, 1H).

5-[[(3-clorfenil)amino]carbonil]amino-8-(2-feniletil)-2-(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină (54), randament 98%; solid alb, punct de topire 186...187°C (Et₂Oeterde petrol); IR (KBr): 3250-2970,1660,1610,1515 cm’¹; Ή RMN (CDCI₃); δ: 3,33 (t, 2H, J = 7); 4,62 (t, 2H, J = 7); 6,60 (m, 1H); 7,19-7,35 (m, 7H); 7,57 (d, 1H, J = 8); 7,61 (s, 1H);

7,81 (s, 1H); 7,89 (s, 1H); 8,63 (bs, 1H); 11,27 (bs, 1H).

5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-(2-feniletil)-2-(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidină (55), randament 99%; solid alb, punct de topire 180...181 °C (Et₂Oeterde petrol); IR (KBr): 3245-2960,1660,1615,1600,1500 cm'¹; ¹H RMN (CDCI3); δ: 3,42 (t, 2H, J = 7); 3,82 (s, 3H); 4,60 (t, 2H, J = 7); 6,60 (m, 1H); 6,93 (d, 2H, J = 9); 7,09 (m, 2H); 7,20-7,28 (m, 4H); 7,56 (d, 2H, J = 8); 7,60 (s, 1H); 7,89 (s, 1H); 8,59 (bs, 1H); 10,96 (bs, 1H).

RO 121030 Β1

5-[[(3-clorfenil)amino]carbonil]amino-8-(3-fenilpropil)-2-(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]1,2,4- 1 triazolo[1,5-c]pirimidină (56), randament 99%; solid galben pal, punct de topire 183...184’C (Et₂O-eterde petrol); IR (KBr): 3245-2960,1665,1610,1515 cm’¹; ¹H RMN (CDCI₃); δ: 2,46 3 (m, 2H); 2,73 (t, 2H, J = 7); 4,43 (t, 2H, J = 7); 6,66 (m, 1H); 7,19-7,40 (m, 8H); 7,59 (d, 1H, J = 8); 7,64 (s, 1H); 7,85 (m, 1H); 8,25 (s, 1H); 8,67 (bs, 1H); 11,30(bs, 1H).5

5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-(3-fenilpropil)-2-(2-furil)-pirazolo-[4,3-

e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină (57), randament 98%; solid alb, punct de topire 174...175'C7 (Et₂O-eterde petrol); IR (KBr): 3240-2950, 1665, 1615, 1600, 1510 cm’¹; ¹H RMN (CDCI₃); δ: 2,46 (m, 2H); 2,73 (t, 2H, J = 7); 4,42 (t, 2H, J = 7); 6,67 (m, 1H); 6,96 (d, 2H, J = 9); 7,22-9

7,41 (m, 6H); 7,60 (d, 2H, J = 8); 7,64 (s, 1H); 8,25 (s, 1H); 8,65 (bs, 1H); 11,16 (bs, 1H).

Exemplul 4. Prepararea 5-[(benzil)carbonil]amino-8-(ar)alchil-2-(2-furil)-pira-zolo[4,3-11

e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinei (compușii 58...59)

5-[[benzil)carbonil]amino-8-(Ar)alchil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-13 cjpirimidinele pot fi preparate în conformitate cu strategia de sinteză, prezentată în următoarea schemă IX.15

Pentru prepararea compușilor 58...59, compusul amino corespunzător (38 sau 41) (10 mmoli) a fost dizolvat în THF proaspăt distilat (15 ml) și s-au adăugat hidracidul 17 corespunzător (13 mmoli) și trietilamină (13 mmoli). Amestecul a fost refluxatîn atmosferă de argon, timp de 18 h. Apoi, solventul a fost îndepărtat sub vid, iar reziduul a fost dizolvat 19 în EtOAc (30 ml) și spălat de 2 ori cu apă (15 ml). Faza organică a fost uscată pe Na₂SO₄și concentrată sub vid. Reziduul a fost purificat prin cromatografie rapidă (în EtOAc-eter de 21 petrol 4:6), pentru obținerea compușilor doriți, 48, 58.

Schema IX. Procedee generale pentru prepararea 5-[(benzil)carbonil]amino-8(ar)alchil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinei (58-59)37

Urmând acest procedeu general, au fost preparați următorii compuși:

5-[(benzil)carbonil]amino-8-isopentil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo-[1,5-39

c]pirimidină (58), randament 85%; solid galben pal, punct de topire 144...145°C (Et₂O-eterde petrol); IR (KBr): 3255-2930,1673,1620,1610, 1520 cm”¹; ¹H RMN (CDCI₃); 6; 0,98 (d, 6H,41

J = 7,5); 1,60 (m, 1H); 1,91 (m, 1H); 4,40 (t, 2H, J = 7); 4,53 (s, 2H); 6,60 (m, 1H); 7,18 (m, 1H); 7,26-7,39 (m, 5H); 7,64 (s, 1H); 8,22 (s, 1H); 9,11 (bs, 1H).43

5-[(benzil)carbonil]amino-8-(3-fenilpropil)-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5cjpirimidină (59), randament 95%; solid galben pal, punct de topire 116...117°C (Et₂O-eter 45 de petrol); IR (KBr): 3250-2900, 1675, 1625, 1600, 1500 cm’¹; ¹H RMN (CDCI₃): δ 2,39 (m, 2H); 2,67 (t, 2H, J = 7); 4,37 (t, 2H, J = 7); 4,53 (s, 2H); 6,61 (m, 1H); 7,16-7,43 (m, 47

11H);7,65(s, 1H); 7,64 (s, 1H);8,19(s, 1H);9,12(bs, 1H).

RO 121030 Β1

Exemplul 5. Prepararea 1-substituit-4-ciano-5-aminopirazolilor

Conform procedeelor descrise în J. Org. Chem. 1956, 21,1240; J. Am. Chem. Soc.

1956,78,784 și a referințelor citate aici, următorii compuși sunt preparați plecând de la etoximetilen malonodinitrilul disponibil comercial și de la N¹-substituit-hidrazine, care sunt, de asemenea, disponibile comercial:

-metil-4-ciano-5-aminopirazol;

1-n-butil-4-ciano-5-aminopirazol;

1-izopentil-4-ciano-5-aminopirazol;

1-(2-ciclopentil)etil-4-ciano-5-aminopirazol; 1-hidroxietil-4-ciano-5-aminoplrazol;

-fenil-4-ciano-5-aminopirazol;

1-terț-butil-4-ciano-5-aminopirazol;

1-feniletil-4-ciano-5-aminopirazol;

1-(2-clorfenil)-4-ciano-5-aminopirazol.

Acești compuși pot fi utilizați ca intermediari pentru prepararea compușilor pirazolotriazolo-pirimidinici, așa cum s-a descris aici.

Exemplul 6. Prepararea 1-substituit-4-ciano-3-aminopirazolilor

Plecând de la 4-ciano-5-aminopirazol, preparat conform procedeului raportat în Chem. Pharm. Bull. 1970, 18, 2353 sau în J. Heterocyclic Chem. 1979, 16, 1113, 1substituit-4-ciano-3-aminopirazolii potfi preparați prin alchilarea directă cu alchil halogenura corespunzătoare în dimetil formamidă la 80’C, timp de 1...2 h, în prezență de carbonat de potasiu anhidru. Din amestecul de reacție conținând cei doi izomeri alchilați în pozițiile N1 și N2, în raport de aproximativ 1:2, izomerul N2 poate fi izolat printr-o singură cristalizare sau cromatografie pe coloană cu silicagel și eluție cu amestecuri de acetat de etil și eter de petrol. Utilizând aceste procedee, au fost preparați următorii compuși:

1-metil-4-ciano-3-aminopirazol;

1-butil-4-ciano-3-aminopirazol;

1-benzil-4-ciano-3-aminopirazol;

1-izopentil-4-ciano-3-aminopirazol;

1-feniletil-4-ciano-3-aminopirazol.

Exemplul 7. Prepararea feniletil-4-ciano-3-aminopirazolilor

a) Se adaugă o suspensie de carbonat de potasiu anhidru (30 mmoli) în DMF (50 ml) la 3-amino-4-ciano-pirazol (20 mmoli), încălzind pană la o temperatură de 80°C, timp de 30 min. Suspensia este adăugată la bromură de fenetil (25 mmoli) și este încălzită la 80°C, timp de 2 h. După răcire la temperatura camerei, amestecul este evaporat la sec, sub vid, iar reziduul rezultat este reluat cu apă distilată (100 ml) și extras cu acetat de etil (3 x 50 ml). Extractele organice, reunite, sunt uscate pe sulfat de sodiu anhidru și evaporate la sec, sub vid. Reziduul rezultat constă dintr-un amestec 1:3 de 1 -feniletil-4-ciano-5-aminopirazol (20%) și 1 -feniletil-4-ciano-3-aminopirazol (60%), care poate fi utilizat ca în exemplul 9 sau cromatografiat pe coloană de silicagel și eluat cu un amestec de acetat de etil/hexan, pentru a da 1-feniletil-4-ciano-5-aminopirazol cu punct de topire 172...173°C; (20%); ¹H-RMN (DMSO-d6); δ :3,04 (t, 2H); 4,12 (t, 2H); 5,85 (sb, 2H); 7,21-7,30 (m, 5H); 7,41 (s, 1H); 1 -p-feniletil-4ciano-3-aminopirazol cu punct de topire 98...100°C (60%); ¹H-RMN (CDCI3): 3,07 (t, 2H); 4,10 (t, 2H); 4,23 (sb, 2H); 7,17 (s, 1H); 7,00-7,28 (m, 5H).

RO 121030 Β1

b) O soluție de 1-p-feniletil-4-ciano-5-aminopirazol (20 mmoli) în trietilortoformiat 1 (40 ml) a fost refluxată sub atmosferă de azot, timp de 8 h. Excesul de ortoformiat a fost evaporat la sec, sub vid, iar reziduul uleios galben a fost dizolvat în eter etilic și percolat pe 3 silicagel, pentru a da iminoeterul corespunzător (cu randament 87%). Reziduul obținut după evaporarea ortoformiatului este practic pur și este utilizat direct în următoarea etapă. O 5 soluție de iminoeter (20 mmoli) și de hidrazidă a acidului 2-furoic (2,5 g, 22 mmoli) în 2metoxietanol (50 ml) a fost refluxat, timp de 5...10 h. După răcire, soluția este evaporată la 7 sec, pentru a da un reziduu uleios, care este supus ciclizării termice în difenileter (50 ml), utilizând un aparat Dean-Stark, așa încât apa formată în timpul reacției să fie îndepărtată 9 azeotropic. După 1,5 h, reacția este verificată prin CSS (cromatografie în strat subțire în acetat de etil: eter de petrol 2:1), iar apoi, compusul inițial este complet absent, amestecul 11 este răcit și i se adaugă hexan. Precipitatul rezultat este filtrat și cristalizat, pentru a se obține 7-(P-feniletil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina cu punct de topire 13

174.. .175°C (20%); ¹H-RMN (DMSO-d₆): 3,23 (t, 2H); 4,74 (t, 2H); 6,75 (s, 1H); 7,14-7,17 (m,

5H); 7,28 (s, 1H); 7,98 (s, 1H); 8,53 (s, 1H); 9,56 (s,1H).15 în mod similar, plecând de la 1-P-feniletil-4-ciano-3-aminopirazol, s-a preparat 8-(βfeniletil-2(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina, cu punct de topire 268...270°C17 (60%);¹H-RMN (DMSO-d₆): 3,32 (t, 2H); 4,72 (t, 2H); 6,73 (s, 1H); 7,23 (m, 5H); 7,95 (s, 1H);

8,8 (s, 1H), 9,41 (s, 1H).19

c) O suspensie de produs din etapa b) (10 mmoli) în HC110% (5,0 ml) este refluxată sub agitare, timp de 3 h. După răcire, soluția este alcalinizată cu hidroxid de amoniu 21 concentrat la 0°C, iar precipitatul rezultat este filtrat sau extras cu acetat de etil (3 x 100 ml), uscat și evaporat la sec, sub vid, pentru a se obține 1 -(P-feniletil)-4-[3(2-furil)-1,2,4-triazol-5- 23 il]-5-aminopirazolul corespunzător, cu punct de topire 175...176°C; ¹H-RMN (DMSO-d₆): 3,15 (t, 2H); 4,48 (t, 2H); 5,78 (s, 1H); 6,37 (s, 1H); 6,68 (s, 1H); 7,1 (s, 1H), 7,27-7,28 (m, 5H);25

7,82 (s, 1H); 14,51 (sb, 2H); într-un mod similar, s-a obținut 1-(P-feniletil)-4-[3(2-furil)-1,2,4triazol-5-il]-3-aminopirazolul, cu p.t. 205-206’C; ¹H-RMN (DMSO-d₆): 3,12 (t, 2H); 4,46 (t,27

2H); 5,75 (s, 1H); 14,41 (sb, 2H).

d) Se adaugă cianamidă (60 mmoli) la o suspensie de amină din etapa c) (10 mmoli 29 în N-metilpirolidonă (40 ml), urmată de acid p-toluensulfonic (15 mmoli). Amestecul este încălzit la 160°C, sub agitare. După 4 h, s-a adăugat o a doua porțiune de cianamidă (6031 mmoli), iar încălzirea s-a continuat peste noapte. Apoi, amestecul este tratat cu apă fiartă (200 ml), iar precipitatul este filtrat, spălat cu apă și cristalizat din etanol, pentru a da 5-33 amino-7-(P-feniletil-2(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina corespunzătoare, cu punct de topire 225...226°C. ¹H-RMN (DMSO-d₆): 3,21 (t, 2H); 4,51 (t, 2H); 6,65 (s, 1H);35

7,1-7,44 (m, 5H, atom și 1H); 7,78 (s, 1H); 7,89 (sb, 2H), 8,07 (s, 1H).

în mod similar, s-a obținut 5-amino-8-(P-feniletil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4- 37 triazolo[1,5-c]pirimidina, cu punct de topire 212...213°C. ¹H-RMN (DMSO-d₆): 3,21 (t, 2H);

4,53 (t, 2H); 6,7 (s, 1H); 7,1-7,4 (m, 5H, atom și 1H); 7,65 (sb, 2H); 7,93 (s, 1H);8,45(s, 1H).39

Exemplul 8. Prepararea 4-ciano-5-amino-1,2,3-triazolilor

O suspensie de carbonat de potasiu (0,23 moli) în DMSO (70 ml) s-a adăugat ulterior,41 împreună cu cianacetamidă (70 mmoli) și cu p-fluorbenzilazidă (54,5 mmoli). Soluția rezultată este agitată la temperatura camerei, timp de o oră, iar apoi turnată într-un volum mare 43 de apă (1,5 I). Solidul separat este filtrat, spălat cu apă și uscat în cuptor la 70°C, pentru a da 1-(p-fluorbenzil)-4-carboxamido-5-amino-1,2,3-triazol (randament 961%). Punct de topire 45

198.. .199°C; Ή-RMN (DMSO-d₆): 7,5-7,1 (m, 6H); 6,4 (s, 2H); 5,4 (s, 2H). Se adaugă o suspensie amidică (0,005 moli), agitată și răcită la 0°C, în DMF (5 ml), împreună cu oxiclorură 47 de fosfor (0,01 moli). Soluția rezultată este agitată, timp de 5 min, la 0°C, 10 min, la 25°C și

RO 121030 Β1 min, la 80°C. După răcire la temperatura camerei, se adaugă 5 ml de NHCI, iar amestecul este refluxat, timp de 5 min. Din soluția răcită, se separă 1-(p-fluorbenzil)-4-ciano-5-amino-

1.2.3- triazolul (cu un randament de 90%). Punct de topire 185...186°C; ¹H-RMN (DMSO-d₆):

7.3- 7,0 (m, 6H); 5,5 (s, 2H); IR (KBr): 3400, 3220, 2220, 1655 cm”.

în mod analog, au fost preparați următorii compuși:

1-sau 2-benzil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol;

1-sau 2-(o-fluorbenzil)-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol;

1-sau 2-(p-fluorbenzii-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol;

1-sau 2-butil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol;

1-sau 2-izopentil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol;

1-sau 2-(2-metoxietil)-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol;

1-sau 2-heptil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol;

-sau 2-octil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol.

Acești compuși pot fi utilizați drept intermediari pentru prepararea compușilor triazolotriazolo-pirimidinici, așa cum s-a descris aici.

Exemplul 9. Prepararea heterociclurilor etoximetilenamino

Prepararea heterociclurilor etoximetilenamino cu formula IV este realizată prin refluxarea respectivului orto-aminonitril cu etil ortoformiat. Ca exemplu, este raportată prepararea 4-ciano-5-(etoximetilenamino)-1-butilpirazol. O soluție de 4-ciano-5-amino-1-butilpirazol (20 mmoli) în trietil ortoformiat (40 ml) este încălzită până la temperatura de reflux, sub atmosferă de azot, timp de 8 h. Excesul de ortoformiat este evaporat la sec, sub vid, iar uleiul rezidual galben este dizolvat în eter etilic și eluat pe silicagel, pentru obținerea compusului pur (cu randament de 87%). în multe cazuri, reziduul obținut după evaporarea ortoformiatului este substanțial pur și este utilizat ca în etapa ulterioară. IR (nujol): 3140, 2240,1640 cm”. Ή-RMN (CDCI₃): 8,4 (s, 1H); 7,9 (s, 1H); 4,5 (t, 2H); 4,3 (q, 2H); 1,8 (m, 2H); 1,5 (m, 2H); 1,4 (t, 3H); 0,9 (t, M).

Exemplul 10. Ciclizarea heterociclurilor etoximetilenamino

O soluție formată din heterociclul etoximetilenamino (20 mmoli) și hidrazida acidului

2-furoic (2,5 g, 22 mmoli) în 2-metoxietanol (50 ml) este refluxată, timp de 5...10 h. După răcire, soluția este evaporată la sec, pentru obținerea unui ulei rezidual care este supus ciclizării termice în difenil eter (50 ml), utilizând un flacon cu fund rotund, montat la un aparat Dean-Stark, pentru îndepărtarea azeotropă a apei formate în timpul reacției. După ce se variază timpul de reacție (3 la 5 h), reacția este verificată prin CSS (în acetat de etiketer de petrol 2:1), iar după dispariția completă a produsului inițial, amestecul este răcit și i se adaugă hexan. Precipitatul rezultat este filtrat și cristalizat din solventul corespunzător. în unele cazuri, din soluție se separă un ulei vâscos, care este apoi decantat și extras ulterior. Reziduul uleios este, apoi, cromatografiat pe silicagel, eluat cu amestecuri de acetat de etil/eter de petrol, pentru a da compusul triciclic VI.

Cu titlu de exemple, sunt raportate caracteristicile analitice și spectroscopice ale câtorva compuși preparați prin aceste procedee:

7- butil-2(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina. ¹H-RMN (DMSO-d₆): 9,6 (s, 1H); 8,6 (s, 1H); 8,0 (m, 1H); 7,4 (m, 1H); 6,7 (m, 1H); 4,5 (t, 2H); 1,9 (m, 2H); 1,3 (m, 2H); 0,9 (t, 3H).

8- butil-2(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina.

¹H-RMN (DMSO-d₆): 9,4 (s, 1H); 8,9 (s, 1H); 8,0 (m, 1H); 7,3 (m, 1H); 6,2 (m, 1H); 4,5 (t, 2H); 1,9 (m, 2H); 1,0 (m, 2H); 0,9 (m, 3H). în spectrul 2D-RMN (NOESY), semnalul pentru N-CH₂, având rezonanță la 4,5, arată maxime care se întretaie cu semnalul pentru C9-H cu rezonanță la 8,9.

RO 121030 Β1

7- izopentil-2(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina.1 ¹H-RMN (CDCI₃): 9,1 (s, 1H); 8,8 (s, 1H); 7,7 (m, 1H); 7,3 (m, 1H); 6,6 (m, 1H); 4,6 (t, 2H); 1,18-1,7 (m, 3H); 1,0 (d, 6H).3

8- izopentil-2(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina.

¹H-RMN (CDCI3): 9,1 (s, 1H); 8,8 (s, 1H); 7,7 (m, 1H); 7,3 (m, 1H); 6,6 (m, 1H); 4,6 (t, 2H);5

1,9-1,5 (m, 3H); 1,0 (d, 6H).

Urmând acest procedeu, au fost preparați următorii compuși:7

7- metil-2(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina;

8- metil-2(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimid ina;9

7-(2-clorfenil)-2(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina;

7-feniletil-2(2-fu ril )-pirazolo-[4,3-e] 1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina;11

7-terț-butil-2(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina;

7- (2-ciclopentil )eti l-2(2-furil )-pi raze lo-[4,3-e] 1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina;13

8- benzil-2(2-furil)-pirazolo-[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina;

7-benzil-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina;15

7-(2-fluorbenzil)-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina;

7-(4-fluorbenzil)-2(2-furil)-1,2,3-thazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina;17

7-butil-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina 7-isopentil-2(2furi l)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]piri midina;19

7-(2-metoxi)etil-2(2-furil)-1,2,3-triazo1o-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5c]pirimidina;

7-hepti l-2(2-fu ril)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimiclina;21

7- octil-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pi rimid ina;

8- benzil-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidi na;23

8-(2-fluorbenzil)-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina;

8-(4-fluorbenzil)-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina;25

8-butil-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e] 1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina;

8-izopentil-2(2-furil )-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirim idina;27

8-hexil-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,6-o]pirimidina;

8-heptil-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]piri midina;29

8- octil-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina;

9- benzil-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidi na;31

9-(2-fluorbenzil)-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimid ina;

9-(4-fluorbenzil)-2(2-furil)-1,2,3-triazolo-[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina.33

Acești compuși pot fi utilizați ca intermediari pentru prepararea triazolo-triazolopirimidinelor și a pirazolo-triazolo-pirimidinelor, așa cum a fost descris aici.35

Exemplul 11. Prepararea 5-amino-7-[aralchil]-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]-1,2,4-tri-azol [1,5-c]pirimidinelor37

Unei suspensii de amină cu formula VII (10 mmoli) în N-metil-pirolidonă (40 ml), i se adaugă cianamidă (60 mmoli), urmată de acid p-toluensulfonic (15 mmoli). Amestecul este 39 încălzit la 160°C, cu agitare magnetică. După 4 h, se adaugă o a doua porțiune de cianamidă (60 mmoli), iar încălzirea este continuată peste noapte. Amestecul este tratat apoi cu apă 41 fierbinte (100 ml), iar precipitatul solid este filtrat, spălat cu apă și cristalizat din etanol. Dacă nu are loc precipitarea, soluția este extrasă cu acetat de etil (4 x 100 ml), extractele sunt 43 spălate cu saramură (2 x 50 ml), uscate și evaporate la sec, sub vid. Apoi, reziduul este cromatografiat pe o coloană de silicagel, eluată cu acetat de etil. 45 în continuare, sunt raportate datele analitice și spectroscopice ale câtorva compuși preparați prin acest procedeu: 47

5-amino-7-butil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină.

RO 121030 Β1

Punct de topire 157...158Ό; ’H-RMN (DMSO-d₆): 8,1 (s, 1H); 8,0 (s, 2H); 7,9 (m, 1H); 7,2 (m, 1H); 6,7 (m, 1H); 4,2 (t, 2H); 1,9 (m, 2H); 1,5 (m, 2H); 0,9 (t, 3H).

5-amino-8-butil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină.

Punct de topire 183...185Ό; ’H-RMN (DMSO-d₆): 8,6 (s, 1H); 8,0 (s, 1H); 7,6 (s, 2H); 7,2 (m, 1H); 6,7 (m, 1H); 4,2 (t, 2H); 1,8 (m, 2H); 1,2 (m, 2H); 0,9 (t, 3H).

5-amino-7-benzil-2-(2-furil)1,2,3-triazolo[5,4-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimid ină. Punct de topire 295...297^PC; Ή-RMN (DMSO-d₆): 8,5 (s, 2H); 8,0 (s, 1H); 7,3 (m, 6H); 6,7 (m, 1H);5,7(s, 2H).

5-amino-7-o-fluor-benzil-2-(2-furil)1,2,3-triazolo[5,4-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimid i nă. Punct de topire 31O...312°C; ’H-RMN (DMSO-d₆): 8,5 (s, 2H); 8,0 (s, 1H); 7,3 (m, 5H); 6,8 (s,1H); 5,75 (s,2H).

5-amino-7-metil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină. Punct de topire 210...213’C.

5-amino-7-tert-butil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-cjpirmidină. Punct de topire 238,..240”C.

5-amino-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină. Punct de topire

248.. .250’0.

5-amino-7-(2-hidroxietil)-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimid ină. Punct de topire 258...260“C.

5-amino-7-fenil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină. Punct de topire 295...297Ό.

5-amino-7-izopentil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină. Punct de topire 208...210°C.

5-amino-8-izopentil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-cjpirimidină. Punct de topire 200...203’0.

5-amino-7-fenetil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină. Punct de topire 225°C.

5-amino-7-benziloxietil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidină.

5-amino-7-[p-(4-izobutilfenetil)]-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5cjpirimidină. Punct de topire 207...210’C.

Acești compuși pot să reacționeze cu un acid corespunzător sau cu un derivat al acidului sulfonic, pentru a se ajunge la compușii cu formula I din această invenție.

Exemplul 12. Prepararea 4-substituit-carboxamido-5-amino-1,2,3-triazolilor p-fluorbenzilazida (15,1 g, 0,1 moli) și cianacetamida (10,8 g, 0,13 moli) sunt adăugate, în această ordine, la o suspensie sub formă de pulbere, de carbonat de potasiu (57,5 g, 0,42 moli) în dimetilsulfoxid (150 ml). Amestecul este agitat la temperatura camerei, timp de o oră. Amestecul este turnat în 3 I de apă, iar solidul care se separă este filtrat și spălat riguros cu apă, pentru a da 22,47 g (96%) de 1-p-fluorbenzil-4-carboxamido-5-amino-1,2,3triazol. Punct de topire 198...199Ό; ’H-RMN (DMSO-de): 7,5-7,1 (m, 6H); 6,4 (s, 2H); 5,4 (s, 2H).

în mod analog, se obțin și următorii compuși:

2- fluor-6-clorbenzil-4-carboxamido-5-amino-1,2,3-triazol. Punct de topire

230.. .231 °C; ’H-RMN (DMSO-d_e): 5,40 (s, 2H); 6,52 (sb, 2H); 7,12-7,45 (m, 5H).

3- fluorbenzil-4-carboxamido-5-amino-1,2,3-triazol. Punct de topire 211...211’0; ’HRMN (DMSO-d₆): 5,46 (s, 2H); 6,47 (sb, 2H); 7,00-7,52 (m, 6H).

2-fluorbenzil-4-carboxamido-5-amino-1,2,3-triazol. Punct de topire 195...197’C.

1-(p-feniletil)-4-carboxamido-5-amino-1,2,3-triazol. Punct de topire 181.,.183°C; ’HRMN (DMSO-d₆): 3,04 (t, 2H); 4,35 (t, 2H); 6,30 (sb, 2H); 7,20-7,47 (m, 7H).

RO 121030 Β1

Exemplul 13. Prepararea 4-substituit-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazolHor 1

O suspensie de 1-p-fluorbenzil-4-carboxamido-5-amino-1,2,3-triazol (23,4 g, 0,1 moli) în DMF (100 ml), agitată magnetic la 0°C, este amestecată cu 20,8 ml (0,2 moli) de POCI₃. 3 Soluția este agitată, timp de 5 h, la 0°C, 10 h, la temperatura camerei și, în final, 15 h, la 80°C. După răcire, la aceasta se adaugă HCI 1N (100 ml), iar soluția rezultată este refluxată, 5 timp de 5 h; după răcire, precipită 1,5 p-fluorbenzil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol (18,54 g, 90%). Punct de topire 185...186°C; ¹H-RMN (DMSO-d₆): 7,3-7,0 (m, 6H); 5,5 (s, 2H); IR 7 (KBr): 3400, 3220, 2220, 1655 cm¹.

în mod analog, s-au obținut următorii compuși:9

2- fluor-6-clorbenzil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol; punct de topire 181...185°C; ¹H-

RMN (DMSO-d₆): 5,40 (s, 2H); 7,26-7,50 (m, 5H).11

3- fluorbenzil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol·, punct de topire 195...197°C; ¹H-RMN (DMSO-d₆): 5,44 (s, 2H); 7,00-7,43 (m, 6H).13

2-fluorbenzil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol; punct de topire 195...197’C.

1-(p-feniletil)-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol; punct de topire 149...150°C; ¹H-RMN 15 (DMSO-de): 3,04 (t, 2H); 4,36 (t, 2H); 7,03 (sb, 2H); 7,23-7,28 (m, 5H).

Exemplul 14. Prepararea 4-substituit [3(2-furil)-1,2,4-triazol-5-il]-5-amino-1,2,3-tria-17 zolilor

O suspensie de 1 -p-fluorbenzil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol (20 mmoli) și hidrazida19 acidului 2-furoic (22 mmoli) în difenileter (30 ml) este agitată și încălzită la reflux (260’C), cu un aparat Dean-Stark, până la dispariția compusului inițial (CSS, 1...2 h). După răcire, 21 amestecul este diluat cu eter de petrol, iar precipitatul rezultat este, fie filtrat, fie separat prin decantare și cromatografiat pe o coloană de silicagel, eluată cu acetat: eter de petrol 2:1. 23

1-p-fluorbenzil-4[3(2-furil)-1,2,4-triazol-5-il]-5-amino-1,2,3-triazol; punct de topire

266.. .268“C; ¹H-RMN (DMSO-d₆): 14,5 (s, 1H); 7,8 (s, 1H); 7,4-7,1 (m, 5H); 6,6 (s,25

1H);6,5(s,2H);5,5(s,2H).

în mod analog, au fost obținuți următorii compuși: 1 -(P-feniletil)-4[3(2-furil)-1,2,4-27 triazol-5-il]-5-amino-1,2,3-triazol (50%); P.t. 200-202“C; ¹H-RMN (DMSO-d₆): 3,07 (t, 2H);

4,16 (t, 2H); 5,50 (sb, 2H); 6,61 (s, 1H);6,95(s, 1H); 7,2-7,4 (m, 5H); 7,78 (s, 1H); 13,8 (sb, 29 1H).

Exemplul 15: Prepararea 5-amino-7-substituit-2-(2-furil)-1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-31 triazolo[ 1,5-c]pirimidinelor

O suspensie de 1 -p-fluorbenzil-4[3(2-furil)-1,2,4-triazol-5-il]-5-amino-1,2,3-triazol33 (0,325 g, 1 mmol) în N-metil-pirolidonă (4 ml) este amestecată împreună cu cianamidă (6 mmoli), urmată de acid p-toluensulfonic (1,5 mmoli). Amestecul este încălzit la 160°C, cu agi-35 tare magnetică. După 4 h, se adaugă o a doua porțiune de cianamidă (6 mmoli), iar încălzirea este continuată peste noapte. Amestecul este tratat apoi cu apă fierbinte (20 ml), iar 37 precipitatul solid este filtrat, spălat cu apă și cristalizat din etanol. Dacă precipitarea nu are loc, soluția este extrasă cu acetat de etil (4x10 ml), extractele sunt spălate cu saramură 39 (2x5 ml), uscate și evaporate la sec, sub vid. Apoi, reziduul este cromatografiat pe o coloană de silicagel, eluat cu acetat de etil, pentru a da 105 mg (randament 30%) de 5-amino-7-p- 41 fluor-benzil-2-(2-furil)-1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5c]pirimidina cu punct de topire

266.. .268°C; ¹H-RMN (DMSO-d_a): 8,5 (sb, 2H); 7,95 (s, 1H); 7,4-7,1 (m, 6H); 6,7 (s, 1H); 5,743 (s, 2H).în mod analog, au fost obținuți:45

5-amino-7-o-fluorbenzil-2-(2-furil)-1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pi rimid ina;

punct de topire 310“C.47

5-amino-7-benzil-2-(2-furil)-1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina; punct de topire 295...297°C.49

RO 121030 Β1

5-amino-7-(2-fluor-6-clorbenzil)-2-(2-furil)-1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c] pirimidina cu punct de topire 218...220°C; ¹H-RMN (DMSO-d₆): 8,51 (sb¹, 2H); 7,98 (s, 1H); 7,55-7,28 (m, 4H); 6,77 (m, 1H); 5,73 (s, 2H).

5-amino-7-(m-fluorbenzil)-2-(2-furil)-1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo[ 1,5-c]pi ri mid i na cu punct de topire 28O...283'C; ¹H-RMN (DMSO-d₆): 8,45 (bs, 2H); 7,98 (s, 1H); 7,4-7,1 (m, 5H); 6,76 (s, 1H); 5,75 (s, 2H).

5-amino-7-(P-feniletil)-2-(2-furil)-1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidina cu punct de topire 269...271 °C; ¹H-RMN (DMSO-d₆): 8,4 (sb, 2H); 7,98 (s, 1H); 7,3-7,15 (m, 6H); 6,8 (s,.1H); 4,71 (t, 2H); 3,31 (t, 2H).

Exemplul 16. Alți compuși

Utilizând chimismul descris mai sus, au fost preparați următorii compuși suplimentari:

Compus nr.	R	R¹
60	H	H
61	H	4-MeO-Ph-NHCO
62	H	3-CI-Ph-NHCO
63	t-C₄H₉	H
64	f-C₄H₉	4-MeO-Ph-NHCO
65	f-C₄H₉	3-CI-Ph-NHCO
66	ch₃	Ph-NHCO
67	ch₃	4-SO₃H-Ph-NHCO
68	ch₃	3,4-C₂-Ph-NHCO
69	ch₃	3,4-(OCH₂-O)-Ph-NHCO
70	ch₃	4-(NO₂)-Ph-NHCO
71	ch₃	4-(CH₃)-Ph-NHCO
72	ch₃	Ph-(CH₂)-CO
73	c₂h₅	Ph-NHCO
74	c₂h₅	4-SO₃H-Ph-NHCO
75	C₂H_s	3,4-CI₂-Pb-NHCO

RO 121030 Β1

Tabel (continuare) 1

Compus nr.	R	R¹
76	C₂H₅	3,4-(OCH₂-O)-Pb-NHCO
77	c₂h₅	4-(NO₂)-Ph-NHCO
78	c₂h₅	4-(CH₃)-Ph-NHCO
79	c₂h₅	Ph-(CH₂)-CO
80	n-C₃H₇	Ph-NHCO
81	n-C₃H₇	4-SO₃H-Ph-NHCO
82	n-C₃H₇	3,4-CI₂-Ph-NHCO
83	n-C₃H₇	3,4-(OCH₂-O)-Ph-NHCO
84	n-C₃H?	4-(NO₂)-Ph-NHCO
85	n-C₃H₇	4-(CH₃)-Ph-NHCO
86	n-C₃H₇	Ph-(CH₂)-CO
87	r7-C₄Hg	Ph-NHCO
88	n-C₄H₉	4-SO₃H-Ph-NHCO
89	/7-C₄H₉	3,4-CI₂-Ph-NHCO
90	n-C₄Hg	3,4-(OCH₂-O)-Ph-NHCO
91	f)-C₄Hg	4-(NO₂)-Ph-NHCO
92	/7-C4H9	4-(CH₃)-Ph-NHCO
93	2-(a-naftil)etil	Ph-(CH₂)-CO
94	2-(a-naftil)etil	H
95	2-(a-naftil)etil	4-MeO-Ph-NHCO
96	2-(a-naftil)etil	3-CI-Ph-NHCO
97	2-(2,4,5-tribrom-fenil)etil	H
98	2-(2,4,5-tribrom-fenil)etil	4-MeO-Ph-NHCO
99	2-(2,4,5-tribrom-fenil)etil	3-CI-Ph-NHCO
100	2-propen-1-il	4-MeO-Ph-NHCO

Exemplul 17. Evaluarea activității biologice a compușilor 29

Câțiva dintre compușii descriși mai sus au fost testați din punct de vedere al afinității lor pentru receptorii A, și de șobolan și A₃ umani, utilizând următoarele teste. 31

Testul de legare la receptorii adenozinici A, și A_2A de la șobolan

Șobolani Wistar masculi (200...250 g) au fost decapitați, iar creierul întreg și striatul 33 au fost disecați pe gheață. Țesuturile au fost dezintegrate într-un omogenizator Polytron, la poziția 5, timp de 30 s, în 25 de volume de tampon Tris-HCI 50 mM, pH=7,4, conținând 35

RO 121030 Β1 mM de MgCI₂. Omogenizatul a fost centrifugat la 48.000 g, timp de 10 min, iar depozitul a fost resuspendat în același tampon, conținând 2 Ul/ml adenozin deaminază. După 30 min de incubare la 37°C, membranele au fost centrifugate, iar depozitele păstrate la -80’C. Anterior înghețării, a fost prelevată o parte alicotă din omogenizat, pentru determinarea proteinei, utilizând albumină bovină drept standard de referință. Testele de legare au fost efectuate pe membrane de creier și, respectiv, de mușchi striat de șobolan, în prezență de 10 mM de MgCI₂, la 25°C. Toate soluțiile tampon au fost ajustate pentru menținerea unul pH constant de 7,4.

Experimentele de dezlocuire au fost efectuate în 500 pL de tampon Tris-HCI, conținând 1 nM din ligandul selectiv al receptorului A, adenozinic-[³H]-CHA(N⁶-ciclohexiladenozină) și membrane ale creierului de șobolan (150...200 pg de proteină/test).

Experimentele de dezlocuire au fost efectuate în 500 pL de tampon Tris-HCI, conținând 10 mM de MgCI₂, 0,2 nM din ligandul selectiv al receptorului A₂ a adenozinic[³H]SCH58261 (5-amino-7-(2-feniletil)-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]-1,2,4-tiazolo[1,5-c]pirimidină) și membrane de mușchi striat de șobolan (80... 100 ng de proteină/test). Pentru determinarea valorilor IC₅₀ (unde IC₅₀ este concentrația de inhibitor care dezlocuiește 50% din ligandul marcat), compusul de testat a fost adăugat în triplicat la probele testului de legare, într-un număr de minimum 6 concentrații diferite. Separarea radioligandului legat de cel liber poate fi realizată prin filtrarea rapidă pe filtre Whatman GF/B, care au fost spălate de 3 ori cu tamponul răcit pe gheață. Radioactivitatea legată pe filtru a fost măsurată prin spectrometrie de scintilație, după adăugarea de 5 ml de Aquassure. Legarea nespecifică a fost definită ca legarea în prezența a 10 pM R-PIA(N⁶-fenilisopropiladenozină)și, respectiv, a 10 pM NECA (5'-(N-etilcarboxamido)ade-nozină) și a fost întotdeauna 10% din legarea totală. Timpul de incubare a fost cuprins în domeniul 150 min, la 0°C, până la 75 min, la 30’C, în conformitate cu rezultatele experimentelor anterioare în funcție de timp. Valorile Ki au fost calculate din ecuația lui Cheng & Prusoff. Toate datele de legare au fost analizate cu ajutorul programului LIGAND pe calculator, utilizând curbele de regresie neliniară.

Testele de legare la receptorul adenozinic A₃ (extras) din clone umane

O probă alicot din preparatul membranar (8 mg proteină/ml) al celulelor HEK-293 transfectate cu receptorul adenozinic A₃ uman recombinant a fost utilizat pentru testele de legare. Fig. 1 arată o saturare tipică a celulelor HEK-293 în [¹²⁵I]AB-MECA (N⁶-(4-amino-3iodbenzil)-5'-(N-metilcarbamoil)adenozină). Experimentele de inhibiție au fost realizate în duplicat, într-un volum final de 100 p, în tuburi de testare conținând 0,3 nM de [¹²⁵I]ABMECA, 50 nM tampon Tris-HCI, 10 mM MgCI₂, pH=7,4, 20 pL membrane diluate (12,4 mg proteină/ml) și cel puțin 6...8 concentrații diferite din antagoniștii tipici ai receptorului pentru adenozină. Legarea nespecifică a fost definită în prezența a 50 nM de R-PIA și a fost de aproximativ 30% din legarea totală. Timpul de incubare a fost de 60 min, la 37°C, în conformitate cu rezultatele experimenteleor anterioare în funcție de timp. Radioactivitatea legată și cea liberă au fost separate prin filtrarea amestecului test pe filtre din fibră de sticlă Whatman GF/B, utilizând un recoltatorde celule Brandel.

Rezultate și discuții

Compușii 34...59 au fost testați cu ajutorul testelor de legare a ligandului, în legătură cu afinitatea lor pentru receptorii Ai și A^din creier de șobolan și pentru receptorul A₃ uman, iar rezultatele sunt redate în tabelul 1.

RO 121030 Β1

Datele demonstrează că compușii lipsiți de grupări voluminoase (compușii 38,40 și 1 41) în poziția N⁵ prezintă afinitate mare pentru receptorii adenozinici A^, cu selectivitate redusă față de A, și cu afinitate scăzută la subtipul A3 al receptorului adenozinic uman și că 3 compușii cu o catenă fenil carbamoil substituită în poziția N⁵ posedă afinitate pentru subtipul A3 al receptorului adenozinic uman de ordinul nanomolar, cu diferite grade de selectivitate 5 față de subtipurile A₁ și A^ ale receptorului adenozinic. în particular, partea 4-metoxifenilcarbamoil (compușii 51, 55 și 57) conferă afinitate mai mare, cu aproximativ 3 ordine de 7 magnitudine față de partea 3-clorfenilcarbamoil (compușii 50, 54 și 56).

Introducerea în poziția N⁸, de catene cu caracteristici sferice diferite, permite proiec- 9 tarea de derivați cu putere mare asupra receptorului adenozinic A₃ și cu o selectivitate mai bună față de subtipurile A, și A^ ale receptorului. 11

Fig. 1 reprezintă o curbă de saturare în [¹²⁵I]AB-MECA a receptorului A₃ adenozinic, iar liniaritatea diagramei Scatchard din anexă este indicatorul, în condițiile noastre experi- 13 mentale, al prezenței unei singure clase de situsuri de legare cu valoarea Kd de 0,9 ± 0,01 nM și cu valoarea B_max de 62 ± 1 fmol/mg proteină (n = 3). 15

RO 121030 Β1

CO < C ă s

I 80 I___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

0,05

>100,000

>45,454

0,003

>35,714

1,339

0,03

6,872

co 0 0 CM Λ

0,003

2,163

664

0,001

0

co < £

O b-

CD 0

0,000

0 ω

CO O-

>35,714

5> CM

CM CM_

CM 00

228

CN O

993

020

007

0

’T

O

o r“ A

CM CM

o

CO Λ

co’

0

CN

0

co

o

0

UD CN

636)

V o

0,25)

-3,79

0,32)

,9-2,31)

646)

0,32]

0,52)

0 CN-

0,34]

0,86)

-1,32

-32,4

Q H

S9-

,09-

,20-

376

,25-

1 CM 00

bCM

s. ’φ

1 0

,26-

,65-

N· CM O

•^T σ>

UD

5j~

O

co

O

0

o

0

2-

CN

<” -C

CD θ'

557

o

CM °ί

o b-

00 CN

2,09

613

0) CM

O)

109

0 CO-

0 b*

63 (

b0

o

0

o

O

0’

V“

0

0“

^7

σ>

co

CN

CM

co co

σ>

CO

N-

00

co

σ>

00

O

-**>·

cm

o

0

b-

CD

0

c kr

00 co Ή

co 1 CM 0 oo~

o o o o

0,000

9,84-12

ΟΟΟΌ

,621-2

6,14-21

,658-2

0,000

5,84-4,:

563-74

414-59

1,03-1,·

332-42

CN

CM

y—

0

IO (0

Λ

0 τ^-

Λ

ω c»

23 (

CO σ>

V

0 CN.

649

498

0 CM-

376

o

»“

b-

o

CO

cm

CM

σ>

CM CM_

ω

0

b*

00

co

CN

0

0 b-

—

_—.

CM

io

co

T—

σ>

CM

0

τ—

-34

O

in’

O T—

O

cm

00

o

CM

CN

0

-52

c

UD

o

co

5,76-

O

t—

1

0

s.

0

CO

CN

7,46-

5±

286

0,0

co 0-

O o’

CM 0-

b» O

0,0

00

CN Oi

0 CO-

CN 0

o

’T

2-

CM

<£

co

CO

V

Λ

CD

Λ

'—

0

ii

10

σ>

CD

CO

CN

O

0

b-

co

σ>

00

CO

0

o

co

0

0 o

CM

r—

CN

o

n

O

-NHC

HCO

-NHC

HCO

0 X z 1

HCO

NHC<

HCO

-NHC

'(£.

_c Q_

z

Ph

z

_C CL

Z

-C Q_

z

X. CL

o

-C 0.

O

n CL

0

x: ÎL

1 0

JZ 0_

0

Φ

1 ω

Φ

1 o

Φ s

1 0

Φ

O

Φ

X

4

0

X

4

co

X

4

0

X

^r

co

X

4

1 CN

CN X

X

0

PNI

0 1

0

CN T

tt

* o

X

-CH

X

o

0

OM

0

X

CM T—

CN X

X

CN X

CN I

CN X

X

CN X

0

ω

o

0

o

0.

o

co

CO

or.

±‘

X^J

X

X'

X

T

1'

X

T

X

T

T 0

:>

o

ω

o

0

ω

D

Q.

CO

CM

0

co

b^

0

b-

σ»

0

5—

E

CO

Μ^-

CO

*3·

co

CO

0

o

co co

ο οί

<Λ < _c Ίί •ί

ιη τ~

Μ^-

0,001

>338

9,8

0,0002

951

128

0,0002

>504

75

3,3

CO < -C <

20

4,6

0,01

179

25,4

0,0007

872

79

^r o o o

76,4

>234

2,8

_

Ο)

σ>

<ο

c»

CO

in

b-

6,0

00

2,4

CO

T

00 b-

CM co*

,80

CM CM*

UD in

??

C

5-9

ο

4-3

b* 1

3-3

1,22-1,

1

CM i CO

CM 1

Ύ CM

rr

£

σ>

CM

CO

co

CD

o

CM

00*

0θ“

CO

ο*

CM

o

in

K

o>

O

σ>

2.

2

b*

£i

---

CM

---

y.

oi

V

co

<

ο

b-

r-.

b-

UD

co

in

t^- CM

▼“

τ—

οο

m

00

CM

co

00

co

ν’

Τ“

00

σ>*

r**

T-

co

CD

CM*

00

CM

T“

CM*

rf

__

CD

σ>

CM

UD

,39

θ7

54)

,54

T“ 0)

,59

68'

00

00 co

00

b· co

Τ-’

o

O

co*

365-43

,027

280-:

ώ οο

0,00

,363

3,53-

,225

,524

4 o

O O O

,025

<

Y

r”

CO

b» <χ

323

m

Λ

53 I

o b*

oo σ>

98 (

O) in

Λ

o o

400

Τ'

ΤΓ

O

co

CO

o

CM

CO’

P

co

CM

x~

74

CM

b-

S

23

b?

43

in rr

CM

72

O)

i C

1 ο

CM Ί-

,63-11

6-5,

2-4,

-2,4

1 00

1

co* 1

1 CM

00

bco 1

-

co

Ο

CM

cd

rf·

Y·

•Ț

CO

o

CO

ιη

00

co

T“

CO

οο

T“

0)

Q)

CO

τΓ

CO*

ο LD

373

,08

CO O)

44 (

2,16

82 (

049

CO

M- v-

Λ

345

co

Ο

CM

b*

CM

T“

in

τ-“

ud*

co*

V“

o

Ο

o X

o

u X

o

o X

o

ο

z

o

z

o

z

o

α:

χ ζ 1

CO

O-Ph-I

X z

Ph-I

-NH

Ph-I

-NH

O O

.C □.

CM X

-C Q_

O

.c CL

1 o

uz CL

CM T

1

ο

<D

l

Φ

1 o

Φ

I

o

ο

1 £

ș

o

s

Σ

o

1 _C

00

CL

X

4

co

X

4

co

X

4

co

CL

t CM

1 CM

-CH

CH

CM X

'cm X

1 CM X

CM T

CM X

CM I

CM χ

CM

ο

o

C>

o

α:

ο

Ο

X ο II

=CH

X o II

CM X

’cN X

CM X

’cM X

CM X

X

o

o 'cm

o

ο

<)

O

o

*CM

CM

1 CM

'cm

CM

_£Μ

_CSI

_ΓΜ

_CM

_cm

x

X

σ> X

cn X

co X

o 1

ο

o

O

_C £L

.ΣΖ CL

.C. CL

X 0.

-C £L

.C 0-

uz ύ_

ω

□

CX

ο

οο

ο

co

CM

O

rn

54

b-

co

CD

t

LD

UD

οο

m

UD

rf

m

’T

UD

ο

RO 121030 Β1

Datele demonstrează că substituenții cu catenă mică (C1-3) din poziția a 8-a a compușilor 5-[[(fenil substituit)amino]carbonil]amino-8-(ar)alchil-2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pirimidinici descriși în prezenta lucrare, în particular, grupările metil, etil și propil, sunt preferate catenelor mai mari, cum arfi: grupările pentil și hexil. în particular, compușii 45 și 47, compușii substituiți 8-metil, 8-etil și 8-propil, 5-(4-metoxifenil) au prezentat cea mai mare afinitate și selectivitate și, într-adevăr, se presupune că au cea mai mare afinitate și selectivitate pentru subtipul (hA₃) al receptorului adenozinic A₃ uman, dintre toți compușii sintetizați vreodată.

Catenele metil, etil și propil potfi substituite cu fenil sau cu grupări fenil substituite și tot manifestă afinitate și selectivitate destul de ridicate pentru subtipul A₃ al receptorului adenozinic, dar afinitatea este redusă cu un factor cuprins între 10 și 100. Cu toate acestea, compusul cu o catenă β-feniletil la poziția N⁸ și cu o catenă 4-MeO-fenilcarbamoil în poziția N⁵ (compusul 55) a prezentat o valoare relativ bună în ceea ce privește afinitatea și selectivitatea (KihA₃ = 1,47 nM, r At / hA₃ = 872, r A_2A / h A₃ = 951).

Chiar cu grupările pentil, relativ mari, prezente în compușii 50 și 51, compușii manifestă o afinitate relativ ridicată pentru subtipul A₃ al receptorului adenozinic (81,10 și, respectiv, 29,57 nm), deși selectivitatea scade cu un factor de aproximativ 10...100.

Studiile anterioare au demonstrat că afinitatea compușilor 5-amino-8-(ar)alchil-2-(2furil)-pirazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinici pentru subtipul A₃al receptorului adenozinic a avut tendința de a crește odată cu mărimea grupării din poziția 8. Se pare că tendința inversă este adevărată în cazul afinității compușilor descriși aici pentru subtipul A₃ al receptorului adenozinic. Substituenții C^ par să reprezinte caracteristicile sterice și lipofilice ideale pentru interacția cu subtipul A₃ al receptorului adenozinic.

Exemplul 18. Experimentele de legare cu un compus radiomarcat

Au fost efectuate o serie de experimente de legare pe diferite linii celulare tumorale, utilizând 0,5 nM [¹²⁵I]-AB-MECA, cu legare nespecifică, determinată în prezența a 50 pM RPIAsau 200 μΜ NECA, pe membranele celulare ale liniilor celulare. Legarea specifică a fost determinată prin scăderea legării nespecifice din legarea totală. Liniile celulare au fost: HL 60, NB4, SKN-MC, SKN-Be2C, SKN-SH și liniile celulare JURKAT. Rezultatele experimentelor de legare sunt prezentate mai jos, în tabelul 2.

Tabelul 2

Linii celulare	Legare totală	Legare nespecifică	Legare specifică (cpm)	Legare specifică procentuală
HL60	3484	2791	693	20
NB4	3377	2740	637	19
SKN-MC	7528	6220	1308	17
SKN-Be2C	6000	4585	1415	24
SKN-SH	2671	2580	91	3
JURKAT	7599	4753	2846	38

Rezultatele sunt prezentate sub formă grafică în fig. 2.

Se pare că liniile celulare JURKAT dau cele mai bune rezultate dintre toate liniile celulare testate. A fost efectuat un experiment de saturare, utilizând liniile celulare JURKAT la 37°C, cu o perioadă de incubare de o oră, utilizând [¹²⁵I]-AB-MECA (0,125-1,5 nM), cu legarea nespecifică măsurată cu ajutorul R-PIA (50 uM). Kd (nM) a fost 4, iar B_max (fmol/mg proteină) a fost 290. Rezultatele sunt prezentate, de asemenea, în fig. 2.

RO 121030 Β1

A fost efectuat un alt test, pentru a determina dacă receptorul A, a fost prezent. Un 1 test de dizlocare a fost efectuat la 0°C, timp de 150 min, pe celule Jurkat, utilizând [³H] DPCPX, un antagonist specific al lui A, (0,5 nM), cu legarea nespecifică determinată cu aju- 3 torul R-PIA(50 uM). Legarea totală a fost 13208, legarea nespecifică a fost 2997, iar legarea specifică a fost 10211 (77%). în consecință, s-a observat un grad mare de legare la A_r 5

Următoarele experimente au descris pentru prima dată caracterizarea receptorilor A₃ din câteva linii celulare tumorale, cum ar fi HL 60 - o leucemie la om promielociticăși Jurkat- 7 o leucemie la om cu celule T, utilizând noul antagonist selectiv (compusul 102), descris aici.

în aceste studii au fost incubate membrane (0,5 mg proteină/ml) ale celulelor Jurkat și HL 9 60, împreună cu 10...12 concentrații diferite din compusul 102, cuprinse între 0,2 și 15 nM pentru celulele Jurkat și, respectiv, 0,1...10 nM pentru celulele HL 60. Fig. 3 reprezintă o 11 curbă de saturare a legării compusului 102 la receptorii adenozinici A₃ din membranele celulare Jurkat, iar liniaritatea dreptei Scatchard din anexă este indicatorul prezenței unei 13 singure clase de situsuri de legare cu valoarea Kd de 1,9 ± 0,2 nM și o valoare B_max de 1,30 ± 0,03 pmoli/mg proteină (n = 3). Fig. 4 arată o curbă de saturare a legării compusului 102 15 la receptorii adenozinici A₃ din membranele celulare HL 60, iar liniaritatea dreptei Scatchard din anexă este indicatorul prezenței unei singure clase de situsuri de legare, cu o valoare Kd 17 de 1,2 ± 0,1 nM și o valoare B_maxde 626 ± 42 fmoli/mg proteină (n = 3).

Aceste rezultate arată că multe linii celulare conțin un număr relativ mare de receptori 19 adenozinici. Deoarece este cunoscut faptul că compusul 102 se leagă de receptorii A₃ cu o mare afinitate și selectivitate, este de presupus că există o prezență relativ mare a 21 receptorilor A₃ în celulele tumorale.

Exemplul 19. Formulări farmaceutice 23 (A) Sistemul transdermic pentru 1.000 de plasturi

Ingrediente	Cantitate
Compus activ	100 g
Fluid siliconic	450 g
Dioxid de siliciu coloidal	2g

(B) Tableta orală pentru 1.000 de tablete 31

Ingrediente	Cantitate
Compus activ	50 g
Amidon	50 g
Stearat de magneziu	5g

Compusul activ, împreună cu amidonul sunt granulați cu apă și uscați. Granulelor uscate li se adaugă stearat de magneziu, iar amestecul este amestecat riguros. Amestecul 39 combinat este comprimat în tablete.

RO 121030 Β1 (C) Injecție pentru 1.000 de fiole de 1 ml

Ingrediente	Cantitate
Compus activ	10 g
Agenți de tamponare	q.s.(quantum satis)
Propilenglicol	400 g
Apă (pentru injecție)	până la 1.000 ml

Compusul activ și agenții de tamponare sunt dizolvați în propilenglicol, la aproximativ 50°C. Apoi, este adăugată cu agitare apa pentru injecție, iar soluția rezultată este filtrată, încărcată în sticluțe care sunt închise ermetic și sterilizate prin autoclavare.

(D) Injecție continuă (perfuzie) pentru 1.000 ml

Ingrediente	Cantitate
Compus activ	10g
Agenți de tamponare	q.s.
Apă pentru injecție	până la 1.000 ml

Specialiștii din domeniu vor recunoaște sau vor fi capabili să se convingă, utilizând nu mai mult decât experimentarea de rutină, mulți echivalenți ai aplicațiilor practice, specifice, ale invenției, descrise aici. Se intenționează ca asemenea echivalenți să fie cuprinși în următoarele revendicări.

Claims

1. Compus cu formula structurală generală:

RO 121030 Β1 sau în care:

A este imidazol, pirazol sau triazol;

R este -C(X)R_1f CțXj-NțR,^, -CÎXJOR,, -CfXJSR,, -SonOR, -SC^SR,, sau SO^NfR^;

R, este hidrogen, alchil, alchil substituit, alchenil, alchenil substituit, alchinil, alchinil substituit, arii, heteroaril, heterociclu, alchenil inferior, alcanoil inferior sau, dacă este legat de un atom de azot, atunci, luat împreună cu atomul de azot formează un inel azetidinic sau un inel heterociclic din 5...6 membri, conținând unul sau mai mulți heteroatomi, cum ar fi N, O, S:

R₂ este hidrogen, alchil, alchil substituit, aralchil, aralchil substituit, heteroaril, heteroaril substituit sau arii;

R₃ este furan, pirol, tiofen, benzofuran, benzipirol, benzotiofen, substituit opțional cu unul sau mai mulți substituenți, selectați din grupul alcătuit din: hidroxi, acil, alchil, alcoxi, alchenil, alchinil, alchil substituit, alcoxi substituit, alchenil substituit, alchinil substituit, amino, amino substituit, aminoacil, aciloxi, acilamino, alcaril, arii, ariloxi, azido, carboxil, carboxilalchil, ciano, halo, nitro, heteroaril, heteroariloxi, heterociclic, heterociclooxi, aminoaciloxi, oxiacilaminno, tioalcoxi, tioalcoxi substituit, tioariloxi, tioheteroariloxi, -SO-alchil, -SO-alchil substituit, -SO-aril, -SO-heteroaril, -SO₂-alchil,-SO₂-alchil substituit, -SO₂-aril, -SO₂-heteroaril, și trihalometil.

X este O, S sau NR¹;

n este 1 sau 2;

și săruri ale acestora, acceptabile farmaceutic.

2. Compus conform revendicării 1, în care R este selectat din grupul alcătuit din derivați disubstituiți simetrici ai ureei, ai tioureei, amide, tioamide și sulfonamide.

3. Compus conform revendicării 1, în care R este selectat din grupul alcătuit din hidrogen, alchil, alchenil și arii.

4. Compus conform revendicării 1, în care R₂ este selectat din grupul alcătuit din hidrogen, alchil, alchenil și arii.

5. Compus conform revendicării 1, în care R₃ este furan.

6. Compus conform revendicării 1, în care X este O.

7. Compus conform revendicării 1, în care A este un inel triazolic.

8. Compus conform revendicării 1, în care A este un inel pirazolic.

9. Metodă de tratare a hipertensiunii, inflamațiilor, reacțiilor alergice, degranulării celulelor mastice, a tumorilor și hipoxiei cardiace și de protecție împotriva ischemiei cerebrale, care constă în administrarea, la un pacient care are nevoie de un asemenea tratament, a unei cantități eficiente dintr-un compus definit în revendicarea 1.

RO 121030 Β1

10. Metodă conform revendicării 9, în care R este selectat din grupul alcătuit din derivați disubstituiți simetrici ai ureei, ai tioureei, amide, tioamide și sulfonamide.

11. Metodă conform revendicării 9, în care R¹ este selectat din grupul alcătuit din hidrogen, alchil, alchenil și arii.

12. Metodă conform revendicării 9, în care R² este selectat din grupul alcătuit din hidrogen, alchil, alchenil și arii.

13. Metodă conform revendicării 9, în care X este O.

14. Metodă conform revendicării 9, în care A este un inel pirazolic.

15. Metodă conform revendicării 9, în care A este un inel triazolic.

16. Metodă conform revendicării 9, în care boala care trebuie tratată este selectată din grupul constând din hipoxie cardiacă și ischemie cerebrală.

17. Metodă de determinare la un pacient, a prezenței celulelor tumorale care posedă o concentrație mare de receptori A₃ adenozinici, care constă în:

a) administrarea la un pacient a unui compus definit în revendicarea 1, care include un marker care poate fi detectat după legarea compusului de celulele tumorale,

b) legarea compusului la celulele tumorale;

c) detectarea markerului.

18. Metodă de determinare într-o probă celulară, a prezenței celulelor tumorale care posedă o concentrație mare de receptori A₃ adenozinici, care constă în:

a) prepararea unei suspensii din celulele respective, într-un mediu de cultură celular;

b) administrarea la celulele respective, a unui compus definit în revendicarea 1, care include un marker detectabil după legarea compusului de celulele tumorale;

c) legarea compusului la celulele tumorale;

d) detectarea markerului.

19. Metodă de determinare a prezenței celulelor tumorale rămase după îndepărtarea chirurgicală a unei tumori, care constă în:

a) administrarea la pacient, înainte, după sau în timpul îndepărtării chirurgicale, a unei tumori, a unui compus definit în revendicarea 1, care include un marker care poate fi detectat după legarea compusului de celulele tumorale reziduale;

b) legarea compusului la celulele tumorale reziduale;

c) detectarea markerului.