CZ20004240A3

CZ20004240A3 - Modulátory adenosinového receptorů A3

Info

Publication number: CZ20004240A3
Application number: CZ20004240A
Authority: CZ
Inventors: Pier Giovanni Baraldi; Pier Andrea Borea
Original assignee: King Pharmaceuticals Res & Dev
Priority date: 1999-09-15
Filing date: 1999-09-15
Publication date: 2001-05-16

Abstract

Sloučeniny vzorců I a II, kde R, R1, R2, R3 a A mají specifické významy, vykazují selektivní aktivitu agonisty vůči y adenosinovým receptorům A3. Tyto sloučeniny se mohou ' použít ve farmakologických kompozicích pro léčbu zdravotních poruch způsobených nadměrnou aktivací S, ► receptorů A3. Sloučeniny se mohou značit například 1 fluorescenčními nebo radioaktivními indikátory, které se j mohou použít pro stanovení in vivo nebo in vitro přítomnosti jj) nádorových buněk, které vykazují vysokou koncentraci adenosinových receptorů A3.

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká určitých derivátů pyrazolotriazolopyrimidinu, triazolotriazolopyrimidinu a imidazolotriazolopyrimidinu a jejich použití v lékařské praxi jako modulátorů adenosinových receptorů A₃.

_t Dosavadní stav techniky

Farmakologicky se charakterizovaly tři hlavní třídy adenosinových receptorů klasifikované jako A_iř A₂ a A₃. Receptory Ai jsou přes proteiny Gp spojeny s inhibicí adenylátcyklázy a rovněž se prokázalo, že souvisejí s dalšími systémy sekundárních messengerů (přenašečů) zahrnujícími inhibici nebo konverzi fosfoinozitu a aktivaci iontových kanálů. Receptory A₂ se dále dělí r.a podtypy A_2S a A_2b, na nichž adenosinoví agonisté aktivují adenylátcyklázu jednak s vysokou, jednak s nízkou afinitou. Sekvence receptoru A₃ byla nejdříve zjištěna v expresní knihovně cDNA krysích varlat a prokázalo se, že tato sekvence, v dalším

-............: -....... homologně klonovaná do j iných receptorů z expresní knihovny' $ cDNA z krysího mozku spojených s G-proteinem je novým .

funkčním adenošinovým receptorem.

Objev receptoru A₃ otevřel nové terapeutické obzory na p poli léků na.bázi purinu. Receptor A₃ zvláště zprostředkovává (spouští) zánětlivé procesy, hypotenzi a degranulaci žírných buněk. Tento receptor hraje zřejmě roli i v centrálním nervovém systému. Agonista XB-MECA selektivní pro A₃ vyvolává behaviorální deprese a při průběžném podávání chrání proti cerebrální ischémii.. Bylo též zjištěno, že agonisté selektivní pro A₃ při vysokých koncentracích vyvolávají v buňkách lidské leukémie HL-60 apoptózu. Tyto a jiné objevy učinily z receptoru A₃ slibný předmět zájmu terapeutů. Selektivní agonisté pro receptor A₃ <<

jsou považováni za možné účinné protizánětlivé působky nebo léky proti mozkové ischemii. V současné době se antagonist/ pro A₃ vyvíjejí jako antiastmatické, antidepresivní, antiar_/ytmické léky a léky proti Parkinsonové chorobě, £

ledvinových chorobám a léky usnadňující kognitivní funkce.

> Proto je cílem tohoto vynálezu poskytnout sloučeniny, jež jsou agonisty, parciálními agonisty a/nebo

I ·

Podstata vynálezu

Popisují se sloučeniny, jež jsou účinnými a selektivními modulátory receptorů A₃ s aktivitou antagonistů tohoto receptorů, a způsoby jejich přípravy.

Tyto sloučeniny mají následující obecný vzorec:

nebo • <i

ii?

přičemž:

A je imidazol, pyrazol nebo triazol:

R je -C(X)Ri, -C(X)-N(Ri)₂, C(X)OR_r, -C(X)SRi, -SO_nRi,

-SO_nORi, -SO_nSRi nebo SO_n-N(Ri)₂;

Ri je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkinyl, substituovaný alkinyl, aryl, i heteroaryl, heterocykl, nižší alkenyl, nižší alkanoyl, nebo v případě vazby na dusík a spojen s dusíkovým atomem tvoří azetidinový kruh nebo 5-6členný heteřocyklický kruh .obsahuj ící j eden nebo více heteroatomů · jako je K, C, S;— .........

R² je vodík, alkyl, alkenyl, alkinyl, substituovaný alkyl, substituovaný alkenyl, substituovaný alkinyl, aralkyl, substituovaný aralkyl, heteroaryl, substituovaný heteroaryl nebo aryl;

R³ je furan, pyrrol, thiofen, benzofuran, benzpyrrol, benzothiofen, poj»**) jaaXe- substituovaný jedním nebo více substituenty, jak jfcí^zde popsány pro substituované heteroarylové kruhy;

X je 0, S, nebo NR¹; n je 1 nebo 2;

jejich radioaktivně značené analogy, fluorescenčně značené analogy a jejich farmaceuticky přijatelné soli;

• ·

• · · · · · • · · · · *	• »'	• · •	•	• ·
* » · · · · «		• ·	•
• · · · • ♦· · ·· «·	• ··	• • ·	v	• · ·

Je výhodné, když R¹ je vodík; alkyl C1-C8; alkenyl C2C7; alkinyl C2-C7; cykloalkyl C3-C7; alkyl C1-C5 substituovaný jedním nebo více halogenovým atomem,

Í hydroxyskupinami, alkoxyskupinami C1-C4, cykloalkylem C3-C7 nebo skupinami -NR¹2, -C(O)NR¹2; aryl, substituovaný aryl, při čemž se substituce zvolí ze skupiny kterou tvoří alkoxy

Φ C1-C4, alkyl C1-C4, nitro, amino, kyano, haloalkyl C1-C4, haloalkoxy C1-C4, karboxy, karboxyamido; aralkyl C7-C10, ve kterém se arylový radikál může substituovat jedním nebo více substituenty uvedenými výše pro arylovou skupinu; skupina -(CH₂)m-Het, ve kterém je Het 5-6členný aromatický nebo nearomatický heterocyklický kruh obsahující jeden nebo více heteroatomů vybraných ze skupiny kterou tvoří N, 0, a S a m je celé číslo od 1 do 5.

Výhodné alkylové skupiny C1-C8 jsou methyl, ethyl, propyl, butyl a isopentyl. Příklady cykloalkylových skupin C3-C7 představují cyklopropyl, cyklopentyl a cyklohexyl. Příklady alkylových skupin C1-C5 substituovaných cykloalkylovými skupinami C3-C7 zahrnují cyklohexylmethyl, cyklopentylmethyl a 2-cyklopentylethyl. Příklady substituovaných alkylových skupin C1-C5 zahrnují 2hydroxyethyl, 2-methoxyethyl, trifluormethyl, 2-fluorethyl, č 2-chlorethyl, 3-aminopropyl, 2-(4-methyl-l-piperazin)ethyl,

2-(4-morfolinyl)ethyl, 2-aminokarbonylethyl, 2·ΐΒ_ dimethylaminoethyl, 3-dimethylaminopropyl. Aryl je výhodně | fenyl, popřípadě substituovaný Cl, F, methoxy-, nitro-, kyano-, methyl-, trifluormethyl- a difluormethoxyskupinami. Příklady pěti- až šestičlenných heterocyklických skupin obsahujících N, 0 a/nebo S zahrnují piperazinyl, morfolinyl, thiazolyl, pyrazolyl, pyridyl, furyl, thienyl, pyrrolyl, triazolyl, tetrazolyl. Příklady aralkylových skupin C7 až CIO zahrnují benzyl nebo fenethyl, popřípadě substituované jedním nebo více substituenty vybranými z Cl, F, methoxy, nitro, kyano, methyl, trifluormethyl a

0«· 0 0 difluormethoxyskupiny. Je výhodné, když je R1 vodík, alkyl Cl až C8, aryl nebo aralkyl C7 až CIO, pΰ'př(pfrdě substituovaný, nejraději halogeny. Je výhodné, když X je 0, R2 je alkyl C2 - C3 nebo substituovaný alkyl a R3 je furan.

Zvláště výhodné sloučeniny jsou takové, ve kterých R představuje fenethylová skupina, jejíž fenylový kruh je substituován jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny, kterou tvoří atomy chloru a fluoru, methoxy, nitro, kyano, methyl, trifluormethyl a difluormethoxyskupiny.

Možný význam A může být znázorněn následujícími' / Λ >

struktur/j i t

Těchto sloučenin lze užít při modulaci adenosinových receptorů A3 v savcích včetně lidí. Způsob užití spočívá v podávání účinného množství sloučeniny vzorce I postačujícího k moderování adenosinových receptorů A₃ v savcích. Aplikace těchto sloučenin se týká:

léčby hypertenze;

léčby zánětlivých procesů jako je revmatická artritida a lupénka;

léčby alergických poruch jako je senná rýma a alergická rhinitida;

•· ·· *· · 99 •999 9 9 99 · · • 9 9 9 9 9 · · 9 9 · · · 9 i · « ···· 99 99 C99 99 »99 degranulace žírných buněk; protinádorových činidel; léčby srdeční hypoxie a ochrany proti cerebrální ischemii;

diagnostických užití, například pro stanovení výskytu '' jednoho, nebo více z výše uvedených lékařských situací nebo pro výběrové testy za účelem stanovení účinnosti jiných sloučenin při vytváření vazby na receptor A₃ Ado (to znamená kompetiční inhibicí jak vyplývá z různých vazebných testů), které popisuje Jacobson a Van Rhee: Purinergic approaches to experimental therapy, Jacobson a Jarvis, vyd., Wiley, New York, 1997, s. 101-128; Mathot a další, Brit. J. Pharmacol. , sv. 116, s. 1957-1964 (1995); van der Wenden a další, J.Med. Chem., šv. 38, s. 4000-4006 (1995); a van Calenbergh,

J. Med, . Chem.', sv. 40, s. 3765-3772 (1997), jejichž sdělení jsou zde zahrnuta jako odkaz.

Těchto sloučenin lze též užít ve. způsobu plné nebo částečné inhibice adenylátcyklázy (A₃) v savcích včetně lidí. Způsob spočívá v podávání účinného množství sloučeniny vzorce I postačujícícho k plné nebo částečné inhibicí

-......- adenylátcyklázy v savcích. Sloučeniny mohou být značené a £ použity pro detekováni nádorových buněk obsahujících ligandy , adenosinu A3 v pacientovi nebo v buněčném vzorku tím způsobem, že se buňky přivedou do styku se značenou i sloučeninou tak, aby se sloučenina vázala na receptory A₃ a následným detekováním indikátoru.

’ Tyto sloučeniny se mohou aplikovat v chemické formulaci obsahující sloučeninu vzorce I a jeden nebo více masťový základ (excipient). Při přípravě těchto sloučenin se může vyjít z různých chemických meziproduktů.

Stručné popisy obrázků

Obrázek 1 je graf ukazující saturaci vazby [¹²⁵I ] AB-MECA (fmol/mg proteinu) na lidské receptory A3 exprimované v buňkách HEK 293 proti molární koncentraci [¹²⁵I]AB-MECA.

Obrázek 2 je graf ukazující saturaci vazby [¹²⁵I ] AB-MECA (fmol/mg proteinu) na lidské receptory A3 exprimované v buněčné linii JURKAT proti molární koncentraci [¹²⁵I]AB-MECA. Jak je z obrázku zřejmé, hustota detekovaných receptorů A₃byla v membránách buněk Jurkat při použití [¹²⁵I]AB-MECA přibližně 300 fmol/mg proteinu.

Obrázky 3 a 4 jsou grafy ukazující saturaci vazby tritiovaného analogu sloučeniny 47-5[[(4methoxyfenyl) amino] karbonyl] amino-8-pr.opyl-2- (2-furyl) pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinu (sloučenina 102) (fmol/mg proteinu) na receptory A₃ exprimované v buněčné linii JURKAT proti molární koncentraci, sloučeniny 102. Údaje v těchto obrázcích ukazují přítomnost adenosinových receptorů A₃ v lidských nádorových buňkách ve vysokých hustotách. Například v buňkách Jurkat bylo detekováno asi 1300 fmol/mg proteinu a v buňkách HL 60 bylo zjištěno 650 fmol/mg proteinu. Proto je sloučenina 102 mnohem citlivějším prostředkem pro detekování adenosinových receptorů A₃ než [¹²⁵I]AB-MECA. Tyto objevy usnadnily ____stanovení přítomnosti- receptorů'A₃ v mnohá lidských nádorech.

Tato přihláška popisuje sloučeniny použitelné jako účinné, přesto však selektivní modulátory adenosinových receptorů s aktivitou A₃ agonistů, v některých případech však A₃ antagonistů, a způsoby jejich přípravy a použití.

Sloučeniny se mohou použít při modulaci adenosinových receptorů A₃ savců včetně lidí. Tyto způsoby zahrnují podávání savcům účinného množství sloučeniny vzorce I postačující k moderování adenosinových receptorů A₃.

Sloučenin se může použít ve farmaceutické formulaci obsahující sloučeninu vzorce I a jedno nebo více vehikulum (excipient). Pro přípravu těchto sloučenin se může použít různých meziproduktů (výchozích látek).

· • ··· « · • · · · · ·

· 9 * · ·

Podle zde použité definice je sloučenina agonistou adenosinového receptorů A_x, je-li schopna plně inhibovat adenylátcyklázu (A₃) a vytěsnit [¹²⁵I]-AB-MECA v kompetičnim vazebném testu.

Podle zde použité definice je sloučenina parciálním agonistou adenosinového receptorů A_x, je-li schopna částečně inhibovat adenylátcyklázu (A₃) a vytěsnit [¹²⁵I ]-AB-MECA v kompetičnim vazebném testu.

Podle zde použité definice je sloučenina antagonistou adenosinového receptorů Αχ, je-li schopna bránit inhibici agonistou a vytěsnit [¹²⁵1]-AB-MECA v kompetičnim vazebném testu. ,

Podle zde použité definice je sloučenina selektivní pro receptor A₃, je-li poměr aktivity Αχ/Α₃ a A₂/A₃ větší než asi 50, výhodně je-li mezi 50 a 100 a nejvýhodněji, je-li větší než^lOO.

Podle zde použité definice se termín alkyl týká jédnomocných alkylových skupin s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklických, které výhodně mají od 1 do 20 uhlíkových atomů, výhodněji od 1 do 10 uhlíkových atomů

.....(nižší alkyl) a nejvýhodněji 1 až 6 uhlíků. Příklady pro tento termín jsou methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl,

W-butyl, iso-butyl, n-hexyl a podobně. Termíny alkylen a : nižší alkylen se týkají dvojmocných radikálů odpovídajících alkanů. Kromě toho, jade uváděné další radikály s jmény odvozenými od alkanů jako jsou alkoxyl, alkanoyl, alkenyl, cykloalkenyl a tak dále, označené jako nižší, mají uhlíkové atomy o deseti nebo méně uhlíkových atomech. V případech, kdy minimální počet uhlíků je větší než jedna, na příklad alkenyl (minimálně dva uhlíky) nebo cykloalkyl (minimálně tři uhlíky), se výrazem nižší rozumí alespoň nejmenší počet uhlíků.

Podle zde použité definice se termín substituovaný alkyl týká alkylové skupiny výhodně od 1 do 10 uhlíkových atomů (substituovaný nižší alkyl) s 1 až 5 substituenty a výhodně 1 až 3 substituenty, vybrané ze skupiny kterou tvoří alkoxy, substituované alkoxyskupiny, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, cykloalkenyl, substituovaný cykloalkenyl, acyl, acylamino, acyloxy, amino, substituovaný t aminoaminoacyl, aminoacyloxy, oxyacylamino, kyano, halogen, hydroxyl, keto, thioketo, karboxyl, karboxyalkyl, thiol, ^k thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, aryl, aryloxy, heteroaryl, heteroaryloxy, heterocykly, hydroxyamino, alkoxyamino, nitro, -SO-alkyl, -SO-substituovaný alkyl, -S0aryl, -SO-heteroaryl, -SO₂-alkyl, -S0₂-substituovaný alkyl,

-SO₂-aryl, -S0₂-heteroaryl, a mono- a dialkylamino, mono- á di-(substituovaný alkyl)amino, mono- a diarylamino, mono- a diheteroarylamino, mono- a diheterocyklamino a nesymetrické disubstituované aminy s různými substituenty ze skupiny, kterou tvoří alkyl, aryl, heteroaryl a heterocykly. Zde se užívá i jiných radikálů s prefixem substituovaný s předpokladem, že obsahují jeden nebo více výše uvedených , substituentů.

Podle zde použité definice se termín alkaryl týká - alkylové skupiny's arylovým substituentem. Vazbu & zprostředkuje alkyl. Aralkyl se týká arylové Skupiny s _t alkylovým substituentem, ve kterém vazbu zprostředkuje

3» arylova skupina.

< Podle zde použité definice se výraz alkoxy týká skupiny alkyl-O-, v níž alkyl odpovídá výše uvedené definici. Výhodné alkoxyskupiny představují například methoxy, ethoxy, n-propoxy, iso-propoxy, n-butoxy, terc.butoxy, sec.butoxy, n-pentoxy, n-hexoxy, 1,2dimethylbutoxy a podobně.

Podle zde použité definice se výraz alkenyl týká alkenylových skupin, jež výhodně mají 2 až 10 uhlíkových atomů a ještě raději 2 až 6 uhlíkových atomů a mají nejméně 1 a raději 1-2 nenasycených alkenylových vazeb. Výhodnými

• ··« · · « + + · 9 9 • 9 9 + 9 9+9

9 99 9 9 9 9 99 9 9'9 999 alkenylovými skupinami jsou ethenyl (-CH=CH₂) , n-propenyl (CH₂CH=CH₂) , iso-propenyl (-C (CH₃) =CH₂) a podobně.

Podle zde užité definice se termín alkinyl týká j. alkinylových skupin, jež výhodně mají 2 až 10 uhlíkových atomů a ještě raději 2 až 6 uhlíkových atomů a nejméně 1 a ⁴' výhodně 1-2 nenasycených alkinylových vazeb.

Podle zde užité definice se termín acyl týká skupin f' alkyl-C(O)-, substituované skupiny alkyl-C(O)-, cykloalkyl* C(O)-, substituované cykloalkyl-C(O)-, aryl-C(O)-, heteroaryl-C(O)- a heterocykl-C(O)-, kde alkyl, substituovaný alkyl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, aryl, heteroaryl a heterocykl odpovídají výše uvedeným definicím.

Podle zde použité definice se termín acylamino týká . skupiny -C(O)NRR, kde každé R je nezávisle vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, heteroaryl nebo heterocykl, kde alkyl, aryl, heteroaryl a heterocykl odpovídají výše uvedeným definicím.

Podle zde použité definice se termín aryl týká nenasycené aromatické karbocyklické skupiny s počtem uhlíků od 6 ďo 14 s jedním kruhem (například fenyl) nebo

A vícenásobně kondenzovanými kruhy (například naftyl nebo anthryl). Výhodné aryly představuje fenyl, naftyl a podobně. Pokud definice arylového substituentu nežádá něco jiného, lze takové arylové skupiny podle volby substituovat 1 až 5 substituenty a výhodně 1 až 3 substituenty vybranými ze ⁴ skupiny, kterou tvoří hydroxy, acyl, alkyl, alkoxy, alkenyl, alkinyl, substituovaný alkyl, substituovaný alkoxy, substituovaný alkenyl, substituovaný alkinyl, amino, substituovaný amino, aminoacyl, acyloxy, acylamino, alkaryl, aryl, aryloxy, azido, karboxyl, karboxylalkyl, kyano, halo, nitro, heteroaryl, heteroaryloxy, heterocykl, heterocykloxy, aminoacyloxy, oxyacylamino, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, thioaryloxy, thioheteroaryloxy, -SO-alkyl, -SO11

substituovaný alkyl, -SO-aryl, -SO-heteroaryl, -SO₂-alkyl, ~S0₂-substituovaný alkyl, -SO₂-aryl, -S0₂-heteroaryl, trihalomethyl. Výhodnými substituenty jsou alkyl,, alkoxy, . halo, kyano, nitro, trihalomethyl a thioalkoxy.

Podle zde použité definice se výraz cykloalkyl týká r cyklických alkylových skupin s 3 až 12 uhlíkovými atomy s jedním kruhem nebo více kondenzovanými kruhy. Tyto cykloalkylová skupiny zahrnují na příklad monocyklické struktury jako jsou cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklooktyl a podobně nebo polycyklické struktury jako je adamantyl a podobně.

Podle zde použité definice se termíny halo nebo halogen týkají fluoru, chloru, bromu a jodu jako substituentů a výhodné jsou buď fluor- nebo chlorsubstituenty.

Podle zde použité definice se výraz heteroaryl týká z aromatické karbocyklické skupiny s 1 až 15 uhlíkovými atomy á 1 až 4 heteroatomy vybranými ze skupiny, kterou tvoří kyslík, dusík, a síra v nejméně jednom kruhu (je-li zde více než jeden kruh).

Pokud definice nežádá něco jiného pro heteroarylový § substituent., tyto heteroarylové skupiny lze podle potřeby substituovat 1 až 5 substituenty a výhodně 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny, kterou tvoří hydroxyl, > acyl, alkyl, alkoxy, alkenyl, alkinyl, substituovaný alkyl, substituovaný alkoxy, substituovaný alkenyl, substituovaný '* alkinyl, amino, substituovaný amino, aminoacyl, acyloxy, acylamino, alkaryl, aryl, aryloxy, azido, karboxyl, karboxylalkyl, kyano, halo, nitro, heteroaryl, heteroaryloxy, heterocykl, heterocykloxy, aminoacyloxy, oxyacylamino, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, thioaryloxy, thioheteroaryloxy, -SO-alkyl, -SO-substituovaný alkyl, -SO-aryl, -SO-heteroaryl, -SO₂-alkyl, -S0₂substituovaný alkyl, -SO₂-aryl, -S0₂-heteroaryl a

trihalomethyl. Výhodnými substituenty jsou alkyl, alkoxy, halo, kyano, nitro, trihalomethyl a thioalkoxy. Takové heteroarylové skupiny mohou mít jediný kruh (například č pyridyl nebo furyl) nebo více kondenzovaných kruhů (například indolizinyl nebo benzothienyl).

J» Heterocykl nebo heterocyklický se týká jednomocné nasycené nebo nenasycené skupiny s jedním kruhem nebo více kondenzovanými kruhy mající 1 až 15 uhlíkových atomů a 1 až 4 heteroatomy vybrané ze skupiny kterou tvoří dusík, síra a kyslík vázané v kruhu.

Pokud definice pro heterocyklické substituenty nežádá jinak, takové heterocyklické skupiny se mohou podle volby substituovat jedním až 5 substituenty vybranými ze skupiny kterou tvoří alkyl, substituovaný alkyl, alkoxy, substituovaná alkoxyskupina, aryl, aryloxy, halo, nitro, heteroaryl, thiol, thioalkoxy, substituovaná thioalkoxyskupina, thioaryloxy, trihalomethyl a podobně. Takové heterocyklické skupiny mohou mít jeden kruh nebo více kondenzovaných kruhů.

Kterékoliv z výše uvedených skupin obsahujících jeden - nebo více substituentů se ovšem' týká výhrada, ' aby takové skupiny neobsahovaly žádný substituent nebo substituční uspořádání, jež by bylo sféricky nepraktické nebo preparačně obtížné.

Podle zde použité definice se výraz deriváty karboxylové kyseliny a deriváty sulfonové kyseliny týkají * skupin -C(X)Ri, -C (X)-N (RJ ₂, -C(X) ORi, -C(X)SRi, -SO_nRi,

-SOnORi, -SO_nSRi, nebo SO_n-N(Ri)₂, kde X je 0, S nebo NR¹, přičemž R¹ je vodík, alkyl, substituovaný alkyl nebo aryl a jejich aktivované deriváty jako anhydridy, estery a halidy jako chloridy, bromidy a jodidy, jež se mohou užít pro kondenzaci s deriváty karboxylové a sulfonové kyseliny na 5'-amin za pomoci standardních kondenzačních operací.

Výraz farmaceuticky přijatelné soli se týká ·· ·· · a* • ♦ · · · ·· a « aá • 4 «* · « 9 a « o ··· · a « a · 'a a '« • · · '· '· a a • ·· ·· «· ·»· farmaceuticky přijatelných solí sloučeniny vzorců ΙΑ, IB nebo IC, jejichž soli se odvozují od různých organických a anorganických opačně nabitých iontů dobře známých v oboru a zahrnují například sodík, draslík, vápník, hořčík, amonium, tetraalkylamonium a podobně; a pokud molekula obsahuje bazickou funkci, mohou se jako farmaceuticky přijatelné soli užít soli organických a anorganických kyselin jako hydrochlorid, hydrobromid, vinan, mesylát, octan, maleát, šťovan a podobně.

Výraz chránící skupina nebo blokující skupina se týká kterékoliv skupiny, jež ve vazbě na jednu nebo více hydroxylovou, aminovou nebo karboxylovou skupinu sloučenin (včetně jejich meziproduktů jako jsou amiríolaktamy, aminolaktony a podobně) zabraňuje, aby na těchto skupinách proběhla reakce, avšak je odstranitelná běžnými chemickými nebo enzymatickými způsoby za opětného vzniku hydroxylu, amino- nebo karboxyskupiny. Výhodnými odstranitelnými chránícími skupinami jsou konvenční substituenty jako je terc.butyloxykarbonyl (t-BOC), benzyloxykarbonyl (CBZ) a podobné, jež je možno odstranit za běžných podmínek, kompatibilních s povahou produktu.

Užívá se následujícč^h zkratek:

[¹²⁵I] AB-MECA = [¹²⁵I ] N6-(4-amino-3-jodbenzyl) adenosin-5'limet hyluronamid;

(R)-PIA = (R)-N⁶-(fenylisopropyljadenosin;

DMSO = dimethylsulfoxid;

I-AB-MECA = N⁶-( 4-amino-3-jodbenzyl) adenosin-5 '-limet hyluronamid;

IB-MECA = N⁶-(3-jodbenzyl)adenosin-5'-N-methyluronamid;

Ki = rovnovážná konstanta inhibice vazby;

NECA = 5'-N-ethylkarboxamidoadenosin;

THF = tetrahydrofuran;

Tris = tris(hydroxymethyl)aminomethan.

Příprava sloučenin

Pracovníky v oboru organické chemie není třeba přesvědčovat, že reaktivní a choulostivé funkční skupiny je třeba před některou reakcí nebo sledem reakcí chránit a teprve po dokončení poslední reakce vrátit do původní formy. Skupiny se obvykle chrání konverzí na relativně stabilní deriváty. Například hydroxyl lze konvertovat na éterovou skupinu a amin na amid nebo karbamát. Způsoby ochrany a zrušení ochrany známé též jako blokování a odblokování jsou v oboru dobře známy a široce praktikovány,viz T. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley, New York (1981), nebo Protective Groups in Organic Chemistry, Ed.

J.F. McOmie, Plenům Press, London, (1973).

Sloučeniny se obvykle připravují reakcí níže uvedené sloučeniny vzorce II s vhodným derivátem karboxylová kyseliny nebo sulfonové kyseliny provedenou známými způsoby.

π

Sloučeniny vzorce II se mohou připravit podle reakčních schémat I a II, kde R³ je furan.

νπ

I

9 9	,«	9 9 9	99	9 9 9
9(9	9	*9	9	4 «.
• ·	9 ·	9	9'	9	• '9	9
	9	9	. 9	i.·	•19	9	1 9
• 9 9			9 9	•9 9 9		99	'99

Činidla: A) triethylortoformiát; B) hydrazid 2-furoové kyseliny, 2-methoxyethanol; C) PhOPh, 260 °C; D) 10% HC1, pod zpětným chladičem; E) kyanamid, pTsOH, N/j methylpyrrolidon.

Schéma II ř

Činidla: F) hydrazid furoové kyseliny, difenylether; E) kyanamid, pTsOH, N-methylpyrrolidon.

Sloučeniny vzorce II se mohou připravit buď nepřímou cestou popsanou ve schématu I nebo přímou cestou popsanou ve ·· ·· ·· ·· • · φ φ · ♦ ·· · · · • · · · « · φ · η -7 ····♦···*·· / · ΦΦΦ·'·# ^ζ· « schématu II. Vhodnými výchozími látkami pro obě schémata jsou heterocyklické ortoaminonitrily vzorce III, obvykle připravované syntetickými způsoby známými z.literatury a uváděnými v knize E.C.Taylora a A.McKillopa (sv. 7 řady Advances in Organic Chemistry, vyd. Interscience, 1970) .

Ortho-aminonitrily III se přeměňují na odpovídající imidáty vzorce IV reakcí's nadbytkem ethylortoformiátu při teplotě varu pod zpětným chladičem, po dobu 8 až. 10 hodin. Touto reakcí se po odpaření ethylortoformiátu získají v podstatě čisté odpovídající imidáty IV vě vysokém výtěžku, jak lze doložit IR a ¹H NMR analýzou surových reakčních produktů-.—....... .........— -- ------------- - - - ...... ........... ~

I

E OEt

Imidáty vzorce IV se potom podrobí dvěma následným reakcím, jež umožňují získat tricyklické struktury vzorce VI ve vysokém výtěžku.

• φ

Μ . i

1«

Reakční sekvence zahrnuje: a) reakci s hydrazidem 2furoové kyseliny v 2-methoxyethanolovém roztoku při teplotě varu pod zpětným chladičem po dobu 8-10 hodin s cílem získat výchozí sloučeniny vzorce V; b) jejich tepelnou cyklizaci na odpovídající sloučeniny vzorce VI zahříváním v difenyléteru při teplotě 260 °C půl hodiny až hodinu.

Potom se tricyklické sloučeniny. VI hydrolyzují kyselinou chlorovodíkovou varem pod zpětným chladičem po dobu 1 až 3 hodin za vzniku triazolů VII, které, se posléze cyklizují s kyanamidem v N-methylpyrrolidonu pod zpětným chladičem a v přítomnosti para-toluensulfonové kyseliny na požadovanou sloučeninu II (schéma I). , ..

νπ π

V některých případech se mohou triazoly VII získat přímo zahříváním orto-aminonitrilu III s hydrazidem 2furoové kyseliny v difenyléteru. Triazoly VII se potom cyklizují jak je výše popsáno ve schématu II. V ·· ·· • · · · • ··· ♦ ·

'.···· · ·

následujících schématech III, IV a V se syntéza sloučenin vzorce II, v nichž A představuje triazolový kruh, popisuje podrobněj i.

Schema III

Syntéza derivátů 5-amino-7-substituovaného-2(2-furyl)1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinu conh₂ k₂co₃

R—N-< +

CN

DMSO // \

NCONH

N·

NH2

POCI3

DMF

N \

nh₂-cn pTs-OH

N—methylpyrrolidon ,160 C

Schéma IV

Syntéza derivátů 5-amino-8-substituovaného-2(2-furyl)1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinu

Me

( I

SOoN

CN

NaOH

CN O°C

^H2^S°⁴l_ÍOnc -15’C 'í

4.

Činidla: A) hydrazid furoové kyseliny, PhOPh; B) NH₂CN, pTsOH, N-methylpyrrolidon.

► · ·· *· * · · · * · • ··· · · ·

9 9 9 »··· ·· _t<

Schéma V

Syntéza derivátů 5-amino-9-substituovaného-2(2-furyl)-1,2,3triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinu

Me

S0₂n₃

CN <

CN

NaOH ^_0°C

H

RCI

NaH, 4 DMF 80 °C '*1

V

R

H₂SO₄ konc -15°C

·* ·· 44 · »· • 444 ΦΦΦ* φφφ •4* · · « · « • ··· 4 · · « « φ *

Nakonec reagují sloučeniny II obsahující 5-amin s karboxylovými kyselinami, sulfonovými kyselinami, aktivovanými karboxylovými kyselinami, aktivovanými sulfonovými kyselinami, thiokarboxylovými kyselinami, aktivovanými thiokarboxylovými kyselinami a podobně za ř ¹

V' vzniku požadovaných sloučenin. Aktivované karboxylové kyseliny zahrnují kyselé halidy, estery, anhydridy a jiné deriváty, o nichž je známo, že reagují s aminy za vzniku amidů. Aktivované kyseliny zahrnují sulfonylhalidy jako jsou sulfonylchloridy.

Ve všech případech však není nutné používat derivátů aktivovaných karboxylových a sulfonových kyselin. S aminy lze kondenzovat i samotné kyseliny za pomoci standardních kondenzačních způsobů, například s použitím dicyklohexyldiimidu (DCI) a dalších běžně používaných kondenzačních činidel. Vhodné podmínky pro kondenzaci jsou dobře známy pracovníkům v oboru syntézy peptidů.

Výše uvedených chemických operací lze užít pro přípravu 8-(ar)alkyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5c] pyrimidinů s 3-kyano-2-aminopyrazoly jako výchozími látkami. 3-Kyano-2-aminopyrazoly mohou reagovat s Ί alkylhalidem (RX) v polárním aprotickém rozpouštědle jako je dimethylformamid (DMF) s cílem dodat skupinu R na jeden z cyklicky vázaných dusíků. Výsledná sloučenina se může vařit g pod zpětným chladičem s triethylortoformiátem za vzniku iminethylesteru, který může zreagovat s hydrazidem kyseliny ‘•T ' furoové, výhodně za použití Dean-Starkova odlučovače pro azeotropickou eliminaci reakční vody, čímž vzniknou 8(ar)alkyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5c]pyrimidiny. Produkty se mohou čistit chromatograficky například v EtOAc/hexanu v poměru 1:1 pro použití v následných reakcích.

Produkt této reakce může reagovat s vhodnou kyselinou jako je HC1 při zahřívání pod zpětným chladičem, po kterém

34/.

·· ·« • * · <

·« následuje reakce s kyanamidem v rozpouštědle, jímž může být N-methylpyrrolidon za katalýzy p-toluensulfonovou kyselinou a při zvýšené teplotě za vzniku 5-amino-8-(ar)alkyl-2-(2 furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinů.

Tyto aminem substituované sloučeniny mohou reagovat s > vhodnými isokyanáty za vzniku sloučeniny na bázi močoviny, s aktivovanými karboxylovými kyselinami jako jsou halidy C sulfonových kyselin za vzniku sulfonamidů nebo s jinými deriváty aktivovaných karboxylových kyselin nebo sulfonových kyselin za vzniku dalších požadovaných sloučenin.

Sloučeniny typu triazoltriazolpyrimidinu se mohou připravit podobnými chemickými způsoby, ale výchozí látkou je vhodně substituovaný azid, který reakcí s H₂NC(O)CH₂CN poskytne primární heterocyklický kruh, načež následuje reakce amidové skupiny s dehydratačním činidlem jako je POC1₃ za vzniku nitrilu. Výsledný kyanoaminotriazol může podstoupit tytéž reakce jako výše uvedené 3-kyano-2aminopyrazoly za vzniku triazoltriazolpyrimidinu.

Syntéza radioaktivně značených analogů . ------ Sloučeniny se mohou značit kterýmkoliv vhodným t radioaktivním indikátorem. Příklady takových radioindikátorů představují ³H a ¹⁴C, ale může se použít jakýkoliv v podstatě netoxický radioaktivní indikátor běžně používaný ve jí farmakokinetických studiích. Způsoby vnesení radioaktivních indikátorů do organických sloučenin jsou odborníkům dobře známy.

Když jsou tyto sloučeniny 5[[(substituovaný fenyl)amino]karbonyl]amino-8(ar)alkyl-2-(2-furyl)pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinové sloučeniny nebo 5-amino-8-(ar)alkyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidinové sloučeniny, je vnesení tritiovaného indikátoru bez problémů.

V jednom provedení je vhodnou výchozí látkou

99 • · 9 « • · · · · • 999 · · · • 9 9 9 • 999 99 99 •9 • · • 99 9

9 9 99 • 9<9 • 9 9 9 9 • «99

999 99 999 sloučenina, v níž (ar)alkylová skupina má dvojnou vazbu v poloze 8. Potom může dvojná vazba reagovat s tritiem za přítomnosti vhodného katalyzátoru, na příklad paladia na uhlí nebo jiného známého hydrogenačního katalyzátoru.

*

Na příklad 5[[4-methoxyfenyl)amino]karbonyl]amino-85 (1,2-ditritiopropyl)-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin (sloučenina 102) se může připravit addici tritia na dvojnou vazbu 5[[(4— methoxyfenyl)amino]karbonyl]amino-8-l-propenyl-2-(2-furyl)pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinu (sloučenina 101). O sloučenině 102 se hovoří v dalším v souvislosti s výzkumem různé vazebné afinity na rakovinné buňky JURKAT.

Alternativně může být tritiový indikátor přítomen ve sloučeninách užívaných k reakci s 5-aminoskupinami za vzniku amidů, močoviny nebo jiné skupiny v poloze 5. Například mohou isokyanáty používané pro přípravu zde popisovaných 5, aminokarbonylaminových sloučenin obsahovat tritium nebo jiné radioaktivní indikátory a proto mohou být snadno vneseny do konečného produktu.

V jiném provedení se může radioaktivní indikátor vložit .....- do -molekuly- při uzavírání cyklického systému“.' Jak se uvádělo' i výše v souvislosti se syntézou sloučenin vzorce II, různé tricyklické sloučeniny vzorce VI se hydrolyzují HC1 za vzniku triazolů vzorce VII,jež se cyklizují kyanamidem pod ± zpětným chladičem v přítomnosti kyseliny p-toluensulfonové jak ukazuje schéma I. Je relativně schůdné vnést v tomto

V stupni do průběhu syntézy ¹⁴C radioaktivní indikátor za použití kyanamidu značeného ¹⁴C.

Jodované sloučeniny se mohou na příklad připravit vnesením radioaktivního jodu do aromatické sloučeniny použité k reakci s 5-aminoskupinou. Inkorporace jodu do aromatických kruhů je odborníkům dobře známa. Je snadné vložit atom jodu do aromatických sloučenin určených pro reakci s 5-aminoskupinou při přípravě zde popsaných

• · »

·· · sloučenin.

Proto lze snadno připravit vhodné radioaktivně značené analogy na základě standardních odborných schopností.

Syntéza fluorescenčně značených analogů

Stejně jako je tomu u radioaktivně značných sloučenin, syntéza fluorescenčně značených sloučenin je relativně snadná. Je výhodné, když jsou fluorescenčně značené skupiny na pozici R2, i když substituce pozice R3 je rovněž snadná. V jednom provedení obsahuje fluorescenční skupina furanový kruh, který se může vázat na pozici R3. Alternativně lze použít jiné aromatické kruhy. Fluorescenční indikátory jsou odborníkům dobře známé a mohou se dobře vázat na zde popisované sloučeniny za pomoci známých chemických postupů.

Způsoby použití sloučenin

Těchto sloučenin lze použít pro všechny indikace, kde se uplatňují agonisté a antagonisté receptoru A₃, včetně:

léčby hypertenze;

léčby zánětlivých poruch jako je revmatická artritida a 1upénka; - - - .................. ........

léčby alergických poruch jako je senná rýma a rinitida;

degranulace žírných buněk;

protinádorových činidel;

léčby srdeční hypoxie a ochrany proti mozkové ischémii, jak se popisuje na příklad ve stati: Jacobson, TIPS, květen 1998, s. 185-191, jejíž obsah je zde zahrnut jako odkaz.

Výhodné použití těchto sloučenin je při detekci a/nebo léčbě rakoviny. Jak sě níže popisuje, bylo prokázáno, že rakovinné buňky exprimují receptor A₃. Soudí se, že receptor A₃ chrání buňky před ischemickým poškozením, když nemají dostatečný přísun krve. Několik komerčně vyráběných léků i léků v současné době vyvíjených se zaměřuje na inhibici

exprese VEGF, jíž se přerušuje přívod krve do nádorových buněk. Agonismus adenosinových receptorů A₃ však může vykazovat ochranný efekt a bránit zániku rakovinných buněk v důsledku nedostatečného přívodu krve těmto buňkám. Podáním antagonistů těchto receptorů společně se sloučeninami s anti-VEGF účinkem nebo s jinými antiangiogenními sloučeninami však lze odříznout rakovinné buňky od přívodu nové krve a zbavit je ochrany před ischemickým.poškozením, kterou poskytují receptory A₃.

Tyto sloučeniny se mohou pacientům podávat kterýmikoliv lékařsky přijatelnými prostředky. Vhodné způsoby administrace zahrnují orální, rektální, zevní nebo parenterální (včetně subkutánní, intrámuskulární a nitrožilné) administraci, avšak přednost se dává.podávání orálnímu nebo parenterálnímu.

Potřebné množství sloučeniny, jež má být účinná jako modulátor adenosinového receptoru pochopitelně kolísá podle jednotlivého případu léčeného savce a je v praxi věcí úvahy lékaře nebo veterináře. Faktory, jež je třeba uvážit, zahrnují stav léčené choroby, způsob podávání, druh formulace, tělesnou hmotnost savce, tělesný povrch, věk, fyzickou kondici pacienta a druh podávané sloučeniny. Vhodná účinná látka se však pohybuje v rozmezí od asi 0,1 μg/kg až asi 10 mg/kg tělesné hmotnosti za den, výhodně v rozmezí od asi 1 mg/kg do asi 3 mg/kg za den.

Celková denní dávka může být podávána jako jediná dávka, více opakovaných dávek, na příklad dvakrát až šestkrát denně, nebo intravenózní infúze po zvolenou dobu. Dávkování nad a pod výše uvedené rozmezí je v rozsahu tohoto vynálezu a může se podávat pacientovi podle potřeby a přání. Na příklad pro savce hmotnosti 75 kg by denní dávka byla v rozmezí od asi 75 do asi 220 mg a typická dávka by byla asi 150 mg denně. Je-li indikováno více opakovaných dávek, může léčba sestávat ze tří dávek po 50 mg denně.

(ý

V jiném provedení se mohou radioaktivně značené sloučeniny podávat pacientovi za účelem zkušebního stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti rakovinných buněk exprimujících receptory A₃. Zde popsané sloučeniny s relativně vysokou afinitou k subtypu receptorů A₃ se výhodně podají pacientovi, a když se sloučeniny naváží na receptory A₃ přítomné v rakovinných buňkách, umístění sloučenin se zjistí podle umístění radioaktivně značených sloučenin. Odborníkům jsou dobře známy přístroje pro určení umístění a hustoty radioaktivně značených sloučenin.

Použití radioaktivně nebo fluorescenčně značených sloučenin v průběhu operace za účelem odstranění rakovinné tkáně může být rovněž výhodné. Chirurg často potřebuje zaručit'úplné odstranění rakovinné tkáně. Radioaktivně nebo fluorescenčně značené sloučeniny se mohou pacientovi podávat buď před operací nebo během ní a váží se na rakovinné buňky v organismu pacienta. Doba podávání je různá a závisí vedle jiných faktorů - na absorpci uvedené sloučeniny nádorovými buňkami a na umístění nádoru v těle pacienta. Chirurg potom má poměrně snadný úkol určit po odstranění nádoru případnou přítomnost reziduálních rakovinných buněk. Přítomnost reziduálních nádorových buněk se může stanovit měřením fluorescence nebo radioaktivity v místě operace za použití analytických přístrojů dobře známých odborníkům.

Detekce rakovinných buněk in vitro se může provést vnesením sloučenin do suspenze buněk v buněčné kultivační půdě, po němž následuje vazba sloučeniny na adenosinové receptory A₃ na rakovinných buňkách, a detekováním indikátorů.

Formulace

Výše popsané sloučeniny se mohou výhodně podávat ve formulaci obsahující aktivní sloučeninu, to znamená sloučeninu vzorce I, společně s nosičem přijatelným pro • ·

2θ ······ .. ··· způsob podávání. Odborníkům jsou známy vhodné a farmaceuticky přijatelné nosiče.

Sloučeniny mohou volitelně obsahovat další terapeuticky j aktivní přísady jako protivirová a protinádorová činidla, baktericidy, protizánětlivé prostředky, analgetika a ^¥ imunosupresory. Nosič musí být farmaceuticky přijatelný v tom smyslu, že je kompatibilní s ostatními přísadami C formulace a neškodí příjemci.

Formulace mohou obsahovat nosiče vhodné pro orální, rektální, zevní nebo parenterální (subkutánní, intrámuskulární a intravenózní) podávání. Výhodnými nosiči jsou nosiče vhodné pro orální nebo parenterální administraci.

Formulace vhodné pro parenterální administraci zpravidla zahrnují sterilní vodné preparáty aktivní sloučeniny, jež je pokud možno isotonická s krví příjemce. Tyto formulace mohou proto obsahovat destilovanou vodu, 5% dextrózu v destilované vodě nebo solance. Vhodné formulace též zahrnují koncentrované roztoky nebo pevné formulace obsahující sloučeninu vzorce I, která po zředění vhodným rozpouštědlem poskytne roztok vhodný pro výše zmíněnou parenterální administraci.

Pro enterální administraci se sloučenina může vnést do inertního nosiče v dávkovaných jednotkách jako jsou kapsle, i tobolky, pastilky nebo tabletky, z nichž každá obsahuje ./ předem stanovené množství aktivní sloučeniny; jako prášky a granule; nebo jako suspenze nebo roztok ve vodné kapalině nebo nevodné kapalině, na příklad jako sirup, elixír, emulze nebo kapky tekutého léku. Vhodnými nosiči mohou být škroby nebo cukry a navíc zahrnují maziva, ochucovadla, pojivá a další látky téže povahy.

Tableta se může připravit lisováním nebo tvarováním, nejlépe s jednou nebo více doplňkovou přísadou. Lisované tablety se mohou připravit lisováním ve vhodném stroji • · · • ·· · »· · · aktivní sloučeniny ve volně tekoucí formě jako je prášek nebo granule, podle volby ve směsi s doplňujícími přísadami jako jsou například pojivá, maziva, inertní ředidla, j povrchově aktivní a dispergační činidla. Tvarované tablety se mohou připravovat formováním ve vhodném stroji směsi

- aktivní sloučeniny v práškové formě s jakýmkoliv vhodným nosičem.

C

Syrup nebo suspenze se muže připravit přidáním aktivní sloučeniny ke koncentrovanému vodnému roztoku cukru, například sacharózy, k němuž se mohou rovněž přidat jakékoliv další přísady. Tyto doplňkové přísady mohou zahrnovat ochucovadlo, činidla pro zpomalení krystalizace cukru nebo činidlo pro zvýšení rozpustnosti kterékoliv další přísady jako je například vícemocný alkohol, kupříkladu glycerol nebo sorbit.

Sloučeniny se též mohou podávat místně zevní aplikací roztoku, masti, krému, gelu, omyvadla (kapalná léková forma k zevnímu použití) nebo polymerní materiál (na příklad Pluronic™, BASF), které se mohou připravit běžnými způsoby známými ve farmacii. Vedle roztoku, masti, krému, gelu, omyvadla nebo polymerní báze a aktivní přísady, takové ' formulace pro zevní použití mohou též obsahovat konzervační prostředky, vonné látky a přídavná aktivní farmaceutická '* činidla.

Formulace pro rektální podávání mohou mít podobu čípků s běžným nosičem, například kakaovým máslem nebo Witepsol * S55 (obchodní značka firmy Dynamite Nobel Chemical, Německo) jako bází čípku.

Alternativně se sloučenina může podávat ve formě liposomu nebo mikrokuliček (nebo mikročástic) . Způsoby přípravy liposomů a mikrokuliček pro administraci pacientovi jsou odborníkům dobře známy. Patent USA č. 4,789.734, jehož obsah je zde zahrnut ve formě odkazu, popisuje způsoby opouzdření biologických materiálů v liposomech. Materiál se c ·

v podstatě rozpustil ve vodném roztoku, přidaly se příslušné fosfolipidy a lipidy (společně s povrchově aktivními prostředky v případě potřeby) a materiál se v potřebné míře

- dialyzoval nebo zpracoval ultrazvukem. Přehled

'.ř známých způsobů podává: G. Gregoriadis, kapitola 14, * Liposomes, Drug Carriers in Biology and Medicine, S. 287341, (Academie Press, 1979). Mikrokuličky z polymerů nebo

I proteinu 3sou odborníkům dobře známy a lze je připravit podle přání pro průchod gastrointestinálním traktem přímo do krevního řečiště. Alternativně se po vnesení aktivní sloučeniny mohou mikrokuličky nebo jejich kompozity implantovat pro pomalé uvolňování v časovém rozmezí od dní až více měsíců. Viz na příklad patenty USA.č. 4,906.474, 4,925.673 a 3,625.214, jejichž obsahy jsou zde zahrnuty ve formě odkazů.

Výhodné mikročástice jsou mikročástice připravené z / biodegradovatelných polymerů jako j.e polyglykolid, polylaktid a jejich kopolymery. Odborníci mohou snadno stanovit vhodný systém nosičů v závislosti na různých faktorech jako je potřebná rychlost uvolňování léku a potřebné dávkování.

Formulace se mohou běžně prezentovat ve formě jednotkového dávkování a lze je připravit kterýmkoliv ze *

způsobů známých ve farmacii. Všechny způsoby zahrnují stupeň ,ř kombinace aktivní sloučeniny s nosičem představovaným jedním nebo více doplňkovými přísadami. Všeobecně se formulace « připravují intimním spojením aktivní sloučeniny s kapalným nosičem nebo jemně dezintegrovaným pevným nosičem a následným tvarováním produktu do žádané jednotkové dávkovači formy v případě potřeby.

Kromě výše uvedených přísad mohou formulace navíc obsahovat jednu nebo více volitelných doplňkových přísad používaných ve farmaceutických formulacích, na příklad ředidla, pufry, vonné látky, pojivá, povrchově aktivní • ·

prostředky, zahušťovadla, maziva, suspendačni činidla, konzervační prostředky (včetně antioxidantů) a podobně.

Aktivita sloučenin se může snadno stanovit zcela rutinními experimentálními způsoby za pomoci následujících zkoušek.

Stanovení stupně aktivity sloučenin

-Zkoušky- vazby na adenosinový receptor Aj a A_2A u krys

Přípravy membrán:

Krysí samci Wistar hmotnosti 200-250 g se dekapitují a celý mozek se oddělí na led (mimo mozkový kmen, corpus striatum a malý mozek). Tkáň mozku se dezintegruje v Polytronu (stupeň 5) ve 20 objemech Tris HC1 koncentrace 50 mM při pH 7,4. Homogenát se potom odstřeďuje 10 minut při 48 000 g a vzniklé granule se resuspendují v Tris-HCl obsahujícím 2 IU/ml adenosindeaminázy typ VI od Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo., USA. Po 30 minutách inkubace při teplotě 37 °C se membrány odstředí a granule se skladují při -70 °C. Tkáně corpus striatum se homogenizují polytronem ve 25 objemech pufru Tris HC1 koncentrace 50 mM obsahujícího 10 mM MgCl₂ při pH 7,4. Potom se může homogenát odstřeďovat 10 minut při 48 000 g při 4 °C a resuspendo.vat v pufru Tris HC1 obsahujícím 2 IU/ml adenosindeaminázy. Po 30 minutách inkubace při 37 °C se membrány odstředí a granule se skladují při -70 °C.

Testy vazby radiollgandu

Vazba [³H]-DPCPX (1,3-dipropyl-8-cyklopentylxanthin) na membrány krysího mozku se může v podstatě provést způsobem, který již dříve popsal Bruns a další v Proč. Nati. Acad.

Sci, sv. 77, s. 5547-5551, 1980. Vytěsňovací pokusy se mohou provést v 0,25 ml pufru obsahujícího 1 nM [³H]-DPCPX, 100 μΐ zředěných membrán z krysího mozku (100 μρ proteinu na zkoušku) a nejméně 6-8 různých koncentrací testovaných sloučenin. Nespecifická vazba se může stanovit v přítomnosti 10 μΜ CHA (N⁶ cyklokohexyladenosin) a vždy se jedná o < 10 % celkové vazby. Inkubační doby jsou typicky 120 minut při 25 °C.

Vazba [³H]-SCH 58261 (5-amino-7-(2-fenylethyl)-2-(2furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin) na membrány sťriátum corpus (100 pg proteinu na zkouš ku) se může provést způsoby popsanými ve stati: Zocchi a další, J.

Pharm. and Exper. Ther., sv, 276; s. 398-404 (1996). Při kompetičních studiích by se mělo použít nejméně 6-8 různých koncentrací testovaných sloučenin. Nespecifická vazba se * může stanovit v přítomnosti 50 μΜ NECA (5'-(Nethylkarboxamido)adenosin). Inkubační doba je při 25 °C typicky 60 minut.

Vázaná a volná radioaktivita se může rozdělit filtrací testované směsi přes filtr ze skleněných vláken Whatman GF/B za pomoci Brandelova sběrače buněk (Gaithersburg, MD, USA). Inkubační směs se může zředit 3 ml ledového inkubačního _ pufru, rychle., sfiltrovat za sníženého tlaku, načež se filtr------------třikrát promyje 3 ml inkubačního pufru. Radioaktivita vázaná na filtr se změří na příklad spektrometrií gama s kapalným scintilátorem. Koncentrace proteinu se stanoví na příklad způsobem Bio-Rad (Bradford, Anal. Biochem., sv. 72; s. 248 (1976) s bovinním albuminem jako referenčním standardem.

Vazebný test na humánně klonovaném adenosinovém receptoru A₃

Vazebný test receptoru

Vazebný test se může provést způsoby popsanými Salvátorem a dalšími, Proč. Nati. Acad. Sci., sv. 90; s. 10365-10369 (1993). Při saturačních studiích se alikvot membrán z buněk HEK-293 (8 mg proteinu/ml), na nichž se provedla transfekce humánním rekombinantním adenosinovým • · · receptorem A₃ (Research Biochemical International, Natick, MA, USA) se inkubuje s 10-12 rozdílnými koncentracemi [¹²⁵I] AB-MECA v koncentračním rozmezí 0,1-5 nM. Experimenty s kompeticí se provedou dvojmo v konečném objemu 100 μΐ ve zkumavkách obsahujících 0,3 nM (¹²⁵I) AB-MECA, 50 mM pufru Tris HC1, 10 mM MgCl₂, 20 μΐ zředěných membrán (12,4 mg proteinu/ml) a nejméně 6-8 různých koncentracích testovaných

........... .....iigandů při' pH 7,4 .........................

č Doba inkubace byla 60 minut při 37 °C podle výsledků dřívějších pokusů s její délkou. Volná a vázaná radioaktivita se rozdělila filtrací zkoušeného vzorku přes filtry ze skleněných vláken Whatman GF/B za pomoci sběrače buněk Brandel. Nespecifická vazba byla definována jako vazba v přítomnosti 50 μΜ R-PIA a představovala asi 30 % celkové vazby. Inkubovahá směs se zředila 3 ml ledového inkubačního pufru, rychle vakuově sfiltrovala a filtr se třikrát promyl 3 ml inkubačního pufru. Radioaktivita vázaná na filtru se stanovila Beckmannovým počítačem 5500 B gama. Koncentrace proteinu se stanovila způsobem Bio-Rad (3) s bovinním albuminem jako referenčním standardem. ...................

Rozbor výsledků

J Hodnoty inhibiční konstanty vazby Ki se mohou vypočítat z hodnot pro IC₅₀ podle rovnice Chenga a Prusoffa Ki = ť

IC₅₀/l+[C*]/K_D* , kde [C*] je koncentrace radioligandu a K_D* její disociační konstanta, jak se uvádí v: Cheng and Prusoff, Biochem. Pharmacol., sv. 22; s. 3099-3108 (1973).

Pro počítačovou analýzu saturačních a inhibičních experimentů se může použít počítačový program LIGAND pro konstrukci vážené nelineární regresní křivky metodou nejmenších čtverců (Munson and Rodbard, Anal. Biochem., sv. 107, s. 220-239 (1990)). Tyto údaje se typicky znázorňují geometricky se spolehlivostí 95 nebo 99 % v závorkách.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou míněny jako ilustrace jednotlivých aspektů vynálezu, ale nemají se považovat za í ...

jejich omezení. Symboly a konvenční znaky použité v těchto příkladech by podle přání přihlašovatele měly být $

konzistentní se symboly a konvenčními znaky používanými v f současné mezinárodní chemické literatuře, například Journal of American Chemical Society (J. Ám. Chem. Soc.) a Tetrahedron.

PŘÍKLAD 1

Příprava 8-(ar)alkyl-2- (2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidinů (sloučeniny 18-25)

8-(Ar)alkyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidiny se připravily syntézní strategií, kterou ukazuje následující schéma VI.

Schéma VI. Obecné postupy přípravy 8-(ar)alkyl-2-(2-furyl)pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinu (18-25)

.......Činidla: a)NaH, DMF, RX; b) HC(OEt)3, ref1ux; c) hydrazid 2* furoové kyseliny, MeO(CH₂)₂OH; d) Ph₂O; 260 °C, fleš.ová chromatografie

10-17

18-25

Při přípravě sloučenin 18-25 reagoval roztok 1 (10 mmol) ve 40 ml DMF ochlazený na 0 °C s NaH (60% v oleji, 12 'Si mmol) přidávaným během 10 minut v několika dávkách. Po 45 _¥ minutách se přidal vhodný (ar)alkylhalid (12 mmol) a reakčni směs se nechala ohřát na 25 °C a míchala se 3-5 hodin ¹ (TLC:EtOAc v poměru 1:1). Reakce se ukončila přidáním vody (80 ml) a vodná vrstva se extrahovala EtOAc (5x25 ml). Organické vrstvy se opětovně spojily, vysušily (Na₂SO₄) , sfiltrovaly a zahustily za sníženého tlaku, čímž se získal . alkylovaný pyrazol (2-9) jako nerozdělitelná směs N¹ a N²izomerů v poměru asi 1:4. Tato směs N¹ a N²-substituovaných. 4-kyano-5-aminopyrazolů (2-9) se potom rozpustila v triethylortoformiátu (60 ml) a roztok se zahříval pod zpětným chladičem v atmosféře dusíku 8 hodin. Potom se rozpouštědlo vakuově odstranilo a olej ovitý zbytek tvořený směsí imidátů (10-17) se rozpustil v methoxyethanolu (50 ml) a přidal se hydrazid kyseliny 2-furoové (13 mmol). Směs se zahřívala pod zpětným chladičem 5-10 hodin, potom se po -ochlazení odstranilo rozpouštědlo zasnízeného tlaku a * cyklizoval se tmavý olejovitý zbytek v difenyléteru (50 ml) při 260 °C s využitím způsobu Dean-Stark pro azeotropickou * eliminaci reakčni vody. Po 1,5 hodinách se směs vlila do . hexanu (300 ml) a ochladila. Sraženina se sfiltrovala a přečistila chromatograficky (EtOAc/hexan v poměru 1:1). Takto se získal hlavní produkt (18-25) alkylovaný na N⁸ v dobrém celkovém výtěžku.

Podle tohoto obecně platného způsobu se připravily následující sloučeniny:

8-Methyl-2- (2-furyl) -pyrazolo [ 4,3-e] 1,2,4-triazolo [1,5c] pyrimidin (18)

Výtěžek 45 %; žlutá pevná látka, teplota tání 155-156 °C

(EtOAc - petroléter); IR (KBr): 1615, 1510 cm b ¹H NMR (DMSO d₆) 8 4,1 (s,lH); 6,32 (m, 1H) ; 7,25 (m, 1H) ; 8,06 (m, 1H) ;

8,86 (s, 1H), 9,38 (s,lH).

8-Ethyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c] pyrimidin (19)

Výtěžek 50 %; světle žlutá pevná látka, teplota tání 188-189 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr) : 1620, 1500 cm'¹; ^XH NMR (DMSO d₆) δ 1,67 (t, 2H, J=7); 4,53 (q, 2H,J=7); 6,59 (m,lH); 7,23 (m,lH); 7,64 (s, 1H); 8,34 (s,lH); 9,10 (s,

1H) .

8-Propyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2, 4-triazolo[1,5c] pyrimidin (20)

Výtěžek 60 %; žlutá pevná látka, teplota tání 189-190 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 1600, 1505 cm'¹; ^XH NMR (DMSO

d₆) δ 0,98	(t,	2H, J=7) ;	2,03-2,10	(m, 2H);	4,41 (q,	2H,
J=7), 6,60	(m,	1H); 7,24	(m, 1H) ;	7,64 (s,	1H); 8,32	(s,
1H); 9,10	(s,	1H) .

8-Butyl-2- (2-furyl) -pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5cjpyrimídin (21)

Výtěžek 50 %; světle žlutá pevná látka, teplota tání 245-247 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 1610, 1500 cm'¹; ^XH NMR (DMSO d₆) δ 0,9 (m, 3H) ; 1,3 (m, 2H) ; 1,9 (m, 2H) ; 4,5 (t,

2H, J=7,2); 6,2 (m, 1H); 7,3 (m, 1H); 8,9 (s, 1H); 9,4 (s, 1H) .

8-Isopentyl-2- (2-furyl) -pyrazolo[4,3-e]1,2, 4-triazolo [1,5cjpyrimidin (22)

Výtěžek 54 %; světle žlutá pevná látka, teplota tání 235-237 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 1635, 1510, 1450 cm'¹; ^XH NMR (DMSO d₆) δ 1,0 (d, 6H, J=6,2); 1,5-1,9 (m, 3H) , 4,6 (t,

2Η, J=7,4); 6,6 (m, 1Η); 7,3 (m, 1H); 7,7 (m, 1H); 8,8(s, 1H) ; 9,1 (s, 1H).

8-(2-Isopentenyl)-2-(2-furyl) -pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo [1,5-c] pyrimidin (23)

Výtěžek 48 %; žlutá pevná látka, teplota tání 210-212 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 1625, 1500, 1430 cm¹; ^ΧΗ NMR (DMSO d₆) δ 1,79 (s, 3H); 1,87 (s, 3H);.......5,05 (d, 2H, J=6) ;

5,55-5,63 (m, 1H); 6,60 (m, 1H); 7,24 (m, 1H); 7,64 (s, 1H), 8,34 (s, 1H); 9,10 (s, 1H).

8-2-Fenylethy1-2-(2-furyl) -pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin (24)

Výtěžek 56 %; teplota tání 268-270 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 1660, 1510, 1450 cm'¹; ^JH NMR (DMSO dg) δ 3,32 (t, 2H, J=6,7); 4,72 (t, 2H, J=6,7); 6,73 (s, 1H); 7,23 (m, 5H) ; 7,95 (s, 1H); 8,8(s, 1H) ; 9,41 (s, 1H) .

Rozbor: (Ci₈Hi₄N₆O) C, Η, N.

8-(3-Fenylpropyl)-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1>2,4triazolo[1,5-cJpyrimidin (25)

Výtěžek 63 %; žlutá pevná látka, teplota tání 165-166 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 1630, 1500, 1440 cm'¹; ^XH NMR (DMSO d₆) δ 2,34-2,48 (m, 2H); 2,67 (t, 3H, J=7,5); 4,43 (t, 2H, J=7,5), 6,61 (m, 1H); 7,16-7,32 (m, 6H); 7,64 (d, 1H, J=2); 8,29(s, 1H); 9,02 (s, 1H).

PŘÍKLAD 2

Příprava 5-amino-8-(ar)alkyl-2-(2-furyl) -pyrazolo[4,3-e]

1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinů (sloučeniny 33-40)

5-amino-8-(ar)alkyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidiny se mohou připravit podle syntézní strategie zřejmé ze schématu VII.

··· • ·

Schéma VII: Obecné postupy při přípravě 5-amino-8-(ar)alkyl2- (2-furyl) -pyrazolo[4,3-e] 1,2,4-triazolo[1,5-c] pyrimidinů (33—40).

Reagenty: a) HC1, reflux b) NH₂CN, l-methyl-2-pyrrolidon, pTsOH, 140 °C.

Při přípravě sloučenin 33-40 se roztok směsi triazolpyrimidinu (18-25) (10 mmol) ve vodném HC1 (50 ml) zahříval pod zpětným chladičem 3 hodiny. Potom se roztok......

ochladil a neutralizoval nasyceným roztokem NaHCO₃ při 0 °C. Sloučeniny (26-33) se extrahovaly EtOAc (3x20 ml), organické vrstvy se vysušily Na₂SO₄ a odpařily pod vakuem. Získaný surový amin (26-33) se rozpustil v N-methylpyrrolidonu (40 ml), přidal se kyanamid (60 mmmol·) a p-toluensulfonová kyselina (15 mmol) a směs se zahřívala při 160 °C 4 hodiny. Potom se opět přidal kyanamid (60 mmol) a roztok se zahříval přes noc. Potom se roztok rozpustil v EtOAc (80 ml) a sraženina (nadbytek kyanamidu) se odfiltroval; filtrát se zahustil pod sníženým tlakem a promyl vodou (3x30 ml). Organická vrstva se vysušila (Na₂SO₄) a odpařila pod vakuem. Zbytek se přečistil chromatograficky (EtOAc/petroléter v poměru 2:1) a cílový produkt (34-41) se získal jako pevná látka.

Podle tohoto obecného schématu se připravily následující .sloučeniny:

5-amino-8-methyl-2- (2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin (34)

Výtěžek 53 %; žlutá pevná látka, teplota tání 167-168 °C

(EtOAc 7 petroléter) ;	IR	(KBr):	3500-2950, 1680, 1645	, 1610,
1560, 1455 cm’¹; NMR	(DMSO d₆)	δ 4,12	(s, 3H); 6,70	(m,
1H) ; 6,99 (bs, 2H) ; 7,	18	(m, 1H)	; 7,81	(s, 1H), 8,42	(s,

1H) .

5-amino-8-ethyl-2- (2-furyl) -pyrazolo [ 4,3-e] 1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin (35)

Výtěžek 65 %; žlutá pevná látka, teplota tání 249-250 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 3430-2950, 1680, 1655, 1620,

1550, 1450 cm'	^x;	NMR	(DMSO d₆)	δ 1,46 (t, 2H,	J=7)	; 4,30
(d, 2H, J=7) ;	6,72	(m,	1H); 7,18	(m, 1H) ; 7,93	(bs,	2H) ;
7,93 (s, 1H),	8,62	(s,	1H) .

5-amino-8-propyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo [ 1,5-c]pyrimidin (36)

Výtěžek 57 %; světle žlutá pevná látka, teplota tání 209-210 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 3400-2900, 1660, 1645, 1610, 1545, 1430 cm'¹; ^XH NMR (DMSO d₆) δ 0,83 (t, 2H, J=7); 1,81-1,91 (m, 2H); 4,22 (d, 2H, J=7); 6,71 (m, 1H) ; 7,19 (m, 1H); 7,63 (bs, 2H), 7,93 (s, 1H), 8,61 (5, 1H).

5-amino-8-butyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo [ 1,5-c]pyrimidin (37)

Výtěžek 47 %; bílá pevná látka, teplota tání 200-203 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 3500-2900, 1685, 1640, 1620, 1550, 1450 cm’¹; NMR (DMSO d₆) δ 0,9 (t, 3H) ; 1,2 (m, 2H) ;

·«	a · a	•	« a ·	·· • a	• ·
• ·	•
• ·	•	• ·	•	•	a a a
• ··	•	a '··	•	• ·· ·	a a • ·	« ·

1,8 (m, 2H); 4,2 (t, 2H); 6,7 (m, 1H); 7,2 (m, 2H), 7,6 (s, 1H) , 8,6 (s, 1H) .

5-amino-8-isopentyl-2- (2-furyl) -pyrazolo [ 4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin (38)

Výtěžek 60 %; bělavá pevná látka, teplota tání 212-213 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 3500-2850, 1670, 1650, 1615, ~7Γ5ΈΌ77Τ4;5ΈΤοπύ'¹; ¹H NMR (CDC1₃) δ~079j6 (d, 6H, J= 6, 4 ) ;

(m, 1H); 1,86 (m, 2H); 4,32 (t, 2H, J=6,4); 6,58 (m, 1H);

S

6,72 (bs, 2H); 7,21 (d, 1H, J=4,2); 7,63 (d, 1H, J=l,2);

8,10 (s, 1H) .

5-amino-8-(2-isopentenyl)-2-(2-furyl) -pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo [1,5-c]pyrimidin (39)

Výtěžek 58 .%; bledě žlutá pevná látka, teplota tání 178-179 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 3520-2950, 1665, 1640, 1610, 1555, 1450 cm'¹; ^XH NMR (CDC1₃) δ 1,74 (s, 3H) ; 1,77 (s, 3H); 4,87 (d, 2H, J=7); 5,43-5,46 (m, 1H); 6,72 (m, 1H); 7,18 (m, 1H); 7,62 (bs, 2H); 7,93 (s, 1H), 8,55 (s, 1H).

5-amino-8-(2-fenylethyl)-2-(2-furyl) -pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin (40)

Výtěžek 45 %; bílá pevná látka, teplota tání 183-185 °C '9 (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 3500-2900, 1670, 1645, 1620, ^A _ 1530, 1455 cm'¹; ^XH NMR (DMSO d₆) δ 3,21 (t, 2H, J=6,4); 4,53 (t, 2H, J=6,4); 6,7 (s, 1H); 7,1-7,4 (m, 6H); 7,65 (bs,

2H); 7,93 (s, 1H), 8,45 (s, 1H).

5-amino-8-(3-fenylpropyl)-2-(2-furyl) -pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin (41)

Výtěžek 57 %; žlutá pevná látka, teplota tání 168-170 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 3510-2950, 1665, 1640, 1615, 1520, 1455 cm'¹; ^XH NMR (DMSO d₆) δ 2,14-2,21 (m, 2H) ; 2,54 ••v • ·

(t, 2H, J=7); 4,29 (t, 2H, J=6,4); 6,71 (s, 1H) ; 7,14-7,32 (ms, 6H); 7,64 (bs, 2H); 7,93 (s, 1H); 8,64 (s, 1H) .

PŘÍKLAD 3

Příprava 5[[(substituovaný fenyl)amino]karbonyl]amino-8(ar)alkyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5c]pyrimidinu (sloučeniny 42-57)

5[[(substituovaný fenyl)amino]karbonyl]amino-8(ar)alkyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5c]pyrimidiny se mohou připravit syntézní strategií, kterou ukazuje schéma VIII.

--->>

THF, reflux, 12 h

i

Schéma VIII: Obecné postupy při přípravě 5-[[(substituovaný fenyl)amino]karbonyl]amino-8-(ar)alkyl-2-(2-furyl) pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinu (42-57)

Při přípravě sloučenin 42-57 se vhodná aminosloučenina (34-41) (10 mmol) rozpustila v čerstvě nadestilované THF (15

Λ ιγΐ) a přidal se vhodný isokyanát (13 mmol) . Směs se 18 hodin zahřívala v argonové atmosféře pod zpětným chladičem. Potom se rozpouštědlo odtáhlo za sníženého tlaku a zbytek se přečistil flešovou chromatografií (EtOAc-petroléter v poměru 4:6), čímž se získala cílová sloučenina 42-57. Tímto obecně platným způsobem se připravily následující sloučeniny:

·· ·< <· • · · » 9 9 ♦ · · · ♦ ♦ · · 9 · · · • · · · • · · · 0 0 0-9

5-[ [ (3-Chlorfenyl) amino]karbonyl]amino-8-methyl-2- (2-furyl) pyrazolo [4,3-e] 1,2,4-triazolo[1,5-c] pyrimidin (42)

Výtěžek 98 %; bledě žlutá pevná látka, teplota tání 142-145 °C (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3210-2930, 1660, 1630,

1610, 1500 cm'¹; ^XH NMR (CDC1₃) δ 4,21 (s, 3H) ; 6,60 (m, IH) ,

7,11 (d, IH, J=8) ; 7,13-7,28 (m, 2H); 7,55 (d, IH, J=8),

7,65 (s, IH); 7,7 8 (d, IH, J=2); 8,22 (s, IH); 8,61 (bs, IH) ; 11,24 (bs, IH) .

5-[ [ (4-Methoxyfenyl) amino]karbonyl]amino-8-methyl-2- (2furyl) -pyrazolo [4,3-e] 1,2,4-triazolo [1,5-c]pyrimidin (43) Výtěžek 99 %; žlutá pevná látka, teplota tání 193-195 °C (EtOAc - petroléter); IR (KBr): 3200-2900, 1664, 1625, 1600, 1500 cm¹; NMR (CDC1₃) δ 3,81 (s, 3H) ; 4,20 (s, 3H) ; 6,61 (m, IH) ; 6,85 (d, 2H, J=9); 7,26 (m, IH) ; 7,55 (d, 2H, J=9),

7,65 (s, IH); 8,21 (s, IH); 8,59 (bs, IH); 10,96 (bs, IH).

5-[ [ (3-Chlorfenyl) amino]karbonyl]amino-8-ethyl-2- (2-furyl) pyrazolo [4,3-e] 1,2,4-triazolo[1,5-c] pyrimidin __(44)__

Výtěžek 98 %; bledě žlutá pevná látka, teplota tání 204-205 °C (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3220-2930, 1660, 1620,

1600, 1500 cm¹; ^XH NMR (CDC1₃) δ 1,71 (t, 3H, J=7); 4,50 (q, 2H, J=7), 6,67 (m, IH); 7,20 (d, IH, J=8); 7,31 (m, IH),

7,61 (d, IH, J=8); 7,70 (s, IH), 7,84(s, IH), 8,30 (s, IH); 8,67 (bs, IH); 11,30 (bs, IH).

5-[ [ (4-Methoxy fenyl) amino]karbonyl]amino-8-ethyl-2- (2furyl) -pyrazolo [ 4,3-e] 1,2, 4-triazolo [ 1,5-c] pyrimidin (45) Výtěžek 99 %; světle žlutá pevná látka, teplota tání 200-201 °C (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3250-2950, 1665, 1620, 1610, 1520 cm¹; ^ΧΗ NMR (CDC1₃) δ 1,71 (t, 3H, J=7); 3,85 (s, 3H); 4,49 (s, 3H) ; 6,65 (m, IH) ; 6,88 (d, 2H, J=9) , 7,26 (m, z

·· «·	9	9 9
• · Φ · ·	9 9	• 99
··· · 9 ·	9	9 9 9
9 · ·	9	9 9
• ·« 9 9	999	9 9 «

1H); 7,58 (d, 2H, J=9); 7,69 (s, 1H); 8,28 (s, 1H); 8,63 (bs, 1H); 10,99 (bs, 1H).

5-[ [ (3-Chlorfenyl)amino]karbonyl ]amino-8-propyl-2- (2-furyl) pyrazolo[4,3-e]1,2, 4-triazolo[1,5-c]pyrimidin (46)

Výtěžek 95 %; bílá pevná látka, teplota tání 138-139 °C (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3210-2920, 1655, 1615, 1600,

1510 cm’¹; H NMR (CDC1₃) δ 1,71 (t, 3H, J=7); 2,04 (m, 2H)

4,36(q, 2H, J=7) , 6,62 (m, 1H); 7,12 (d, 1H, J=8); 7,27 (m, 1H), 7,56 (d, 1H, J=8); 7,66 (s, 1H); 7,80(s, 1H); 8,24 (s, 1H); 8,62 (bs, 1H); 11,08 (bs, 1H) .

5-[ [ (4-Methoxyfenyl) amino] karbonyl] amino-8-propyl-2- (2furyl) -pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin (47) Výtěžek 98 %; světle žlutá pevná látka, teplota tání 146-148 °C (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3230-2950, 1660, 1620,

1600, 1530 cm¹; ^XH NMR (CDC1₃) δ 0,98 (t, 3H, J=7); 2,042,08 (m, 2H); 3,82 (s, 3H); 4,35 (t, 2H, J=7); 6,61 (m, 1H); 6,89 (d, 2H, J=9) , 7,25 (m, 1H); 7,56 (d, 2H, J=9); 7,65 (s, 1H); 8,23 (s, 1H); 8,59 (bs, 1H); 10,95 (bs, 1H).

5-[[(3-Chlorfenyl)amino]karbonyl]amino-8-butyl-2-(2-furyl)pyrazolo[4,3-e]1,2, 4-triazolo[1,5-c]pyrimidin (48) ň

Výtěžek 97 %; bílá pevná látka, teplota tání 210-212 °C 6 (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3240-2970, 1650, 1610, 1510 cm¹; ^XH NMR (CDC1₃) δ 1,00 (t, 3H, J=7) ; 1,39-1,41 (m, 2H) ⁵¹ 1, 99-2,03 (m, 2H) ; 4,41(q, 2H, J=7) , 6,63 (m, 1H) ; 7,14 (d,

1H, J=8); 7,29 (m, 1H), 7,56 (d, 1H, J=8); 7,67 (s, 1H); 7,80(s, 1H); 8,25 (s, 1H); 8,63 (bs, 1H); 11,26 (bs, 1H).

5-[ [ (4-Methoxyfenyl) amino]karbonyl]amino-8-butyl-2- (2furyl) -pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin (49) Výtěžek 96 %; bílá pevná látka, teplota tání 197-198 °C ·· ·« ·» · ·· *··· ♦ · té φφφ • · · «· · · · < Μ» « · Φ t Φ φ « • · · ® Φ φ «

ΦΦΦΦ φφ φ» _ΙΒ( *φ _# (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3250-2960, 1665, 1610, 1600, 1520 cm'¹; NMR (CDC1₃) δ 0,98 (t, 3H, J=7); 1,38-1,42 (m, 2H); 2,02-2,05 (m, 2H); 3,82 (s, 3H); 4,39 (t, 2H, J=7);

6,63 (m, ÍH); 6,92 (d, 2H, J=9), 7,25 (m, ÍH); 7,57 (d, 2H, J=9); 7,67 (s, ÍH); 8,23 (s, ÍH); 8,60 (bs, ÍH); 10,95 (bs, ÍH) .

5-[[(3-Chlorfenyl)amino]karbonyl]amino—8—isopenty1-2- (2furyl) -pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin (50) Výtěžek 97 %; bledě žlutá pevná látka, teplota tání 199-200 °C (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3230-2950, 1655, 1600,

1510 cm¹; ^ΧΗ NMR (CDC1₃) δ 1,01 (d, 6H, J=7,5); 1,49-1,51 (m, ÍH) 1,88-2,03 (m, 2H); 4,42(t, 2H, J=7); 6,62 (m, ÍH),

7,13 (d, ÍH, J=8); 7,34 (m, ÍH), 7,57 (d, ÍH, J=8); 7,67 (s, ÍH); 7,80(s, ÍH); 8,24 (s, ÍH); 8,63 (bs, ÍH); 11,25 (bs,

ÍH) .

5-[ [ (4-Methoxyfenyl)amino]karbonyl]amino-8-isopentyl-2- (2furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c] pyrimidin (51) Výtěžek 98 %; bílá pevná látka, teplota tání 192-193 °C (Et₂O -petroléter); IR (KBr): 3230-2970, 1660, 1615, 1600, 1500 cm'¹; NMR (CDC1₃) δ 0,99 (d, 6H, J=7,5); 1,58 - 1,22 (m, ÍH); 1,87-1,97 (m, 2H); 3,82 (s, 3H) ; 4,40 (t, 2H,J=7); 6,62 (m, ÍH); 6,91 (d, 2H, J=9), 7,23 (m, ÍH); 7,58 (d, 2H, J=9); 7,66 (s, ÍH); 8,23 (s, ÍH); 8,59 (bs, ÍH); 10,94 (bs, ÍH) .

5-[[(3-Chlorfenyl)amino]karbonyl]amino-8-(2-isopentenyl)-2( 2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin (52) Výtěžek 99 %; bílá pevná látka, teplota tání 204-205 °C (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3245-2960, 1650, 1600, 1510 cm’¹; ^XH NMR (CDC1₃) δ 1,84 (s, 3H) ; 1,88 (s, 3H) 5,01 (d,

2H, J=8); 5,57 (m, ÍH); 6,62'(m, ÍH); 7,12 (d, ÍH, J=8);

·· • »9 • · ···· ·· *· • e • ι « · • » · • · ··· ·· * · · • · • · • · ·· ·

7,29 (m, 1H), 7,56 (d, 1H, J=8); 7,66 (s, 1H); 7,80(s, 1H); 8,26 (s, 1H); 8,60 (bs, 1H); 11,26 (bs, 1H).

5-f [ (4-Methoxyfenyl) amino]karbonyl]amino-8- (2-isopentenyl) 2- (2-f uryl) -pyrazolo [4,3-e] 1,2, 4-triazolo [ 1,5-c]pyrimidin (53)

Výtěžek 96 %; bledě žlutá pevná látka, teplota tání 198-199 °C (Et₂Opetroléter) ; IR (KBr) : 3235-2950, 1665, 1620,

1600,	, 1510 cm	-¹; ^XH	NMR	(CDCI3) δ	1,83	(s, 3H); 1,87	(s, 3H);
3,81	(s, 3H);	4,97	(d,	2H, J=7);	5,57	(m, 1H); 6,61	(m, 1H) ;
6, 93	(d, 2H,	J=9) ,	7,24	(m, 1H) ;	7,54	(d, 2H, J=9);	7,66 (s,
1H) ;	8,25 (s,	1H) ;	8,58	(bs, 1H)	; 10,	96 (bs, 1H).

5-[ [ (3-Chlorfenyl) amino] karbonyl ] amino-8- (2-fenylethyl) -2(2-furyl) -pyrazolo [ 4,3-e] 1,2 , 4-triazolo [ 1,5-c] pyrimidin (54) Výtěžek 98 %; bílá pevná látka, teplota tání 186-187 °C (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3250-2970, 1660, 1610,· 1515 cm'¹; ^XH NMR (CDC1₃) δ 3,33 (t, 2H, J=7) ; 4,62 (t, 2H, J=7) ;

6.60 (m, 1H); 7,19-7,35 (m, 7H); 7,57 (d, 1H, J=8); 7,61 (s, 1H); 7,81 (s, 1H); 7,89 (s, 1H); 8,63 (bs, 1H); 11,27 (bs,

1H) .........

5-[ [ (4-Methoxyfenyl) amino]karbonyl]amino-8- (2-fenylethyl) -2(2-f uryl) -pyrazolo [4,3-e] 1,2, 4-triazolo[ 1,5-c]pyrimidin (55) Výtěžek 99 %; bílá pevná látka, teplota tání 180-181 °C (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3245-2960, 1660, 1615, 1600, 1500 cm'¹; ^ΧΗ NMR (CDC1₃) δ 3,42 (t, 2H, J=7) ; 3,82 (s, 3H) ;

4.60 (t, 2H, J=7); 6,60 (m, 1H) ; 6,93 (d, 2H, J=9) ; 7,09 (m, 2H); 7,20-7,28 (m, 4H); 7,56 (d, 2H, J=8); 7,60 (s, 1H);

7,89 (s, 1H); 8,59 (bs, 1H); 10,96 (bs, 1H).

5-[[(3-Chlorfenyl)amino]karbonyl]amino-8-(3-fenylpropyl)-2(2-f uryl) -pyrazolo [4,3-e]l,2, 4-triazolo [ 1,5-c]pyrimidin (56)

-ý.

Výtěžek 99 %; bledě žlutá pevná látka, teplota táni 183-184 °C (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3245-2960, 1665, 1610,

1515 cm'¹; NMR (CDC1₃) δ 2,46 (m, 2H) ; 2,73 (t, 2H, J=7); 4,43 (t, 2H, J=7); 6,66 (m, 1H); 7,19-7,40 (m, 8H); 7,59 (d, 1H, J=8); 7,64 (s, 1H); 7,85 (m, 1H) ; 8,25 (s, 1H); 8,67 (bs, 1H); 11,30 (bs, 1H).

5- [ [ (A ~^Me thoxy fen yl) amino ] karbony 1 ] amino - 8- (3-f enylpropyl) 2-(2-furyl) -pyrazolo[4,3-e]l,2,4-triazolo[l,5-c] pyrimidin (57)

Výtěžek 98 %; bílá pevná látka, teplota tání 174-175 °C (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3240-2950, 1665, 1615, 1600, 1510 cm'¹; ^ΣΗ NMR (CDC1₃) δ 2,46 (m, 2H) ; 2,73 (t, 2H, J=7); 4,42 (t, 2H, J=7); 6,67 (m, 1H); 6,96 (d, 2H, J=9); 7,227,41 (m, 6H); 7,60 (d, 2H, J=8); 7,64 (s, 1H) ; 8,25 (s, 1H);

8,65 (bs, 1H); 11,16 (bs, 1H) .

PŘÍKLAD 4

Příprava 5-[(benzyl)karbonyl]amino-8-(ar)alkyl)-2-(2-furyl)pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinu (sloučeniny 58-59)

5-[(Benzyl)karbonyl]amino-8-(ar)alkyl)-2-(2-furyl·)pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidiny·se mohou připravit syntézní strategií, kterou ukazuje následující schéma IX.

Schéma IX: obecné postupy přípravy 5[(benzyl)karbonyl]amino-8-(ar)alkyl)-2-(2-furyl)pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinu (58-59)

Při přípravě sloučenin 58-59 se vhodné aminosloučeniny (38 nebo 41) rozpustily v čerstvě nadestilované THF (15 ml) a přidal se vhodný kyselý halid (13 mmol) a triethylamin (13 mmol). Směs se v atmosféře argonu zahřívala pod zpětným chladičem 18 hodin. Potom se rozpouštědlo odstranilo za sníženého tlaku a a zbytek se rozpustil v EtOAc (30 ml) a dvakrát promyl vodou (15 ml). Organická fáze se vysušila pomocí Na₂SO₄ a zahustila za sníženého tlaku. Zbytek se přečistil flešovou chromatografií (EtOAc-petroléter v poměru 4:6) a získala sse cílová sloučenina 48, 58. Tímto obecným způsobem se připravily následující sloučeniny.

38,41 58,59 'i .r

5-[((Benzyl) karbonyl ]amino-8-isopentyl-2-(2-furyl)pyrazolo [4,3-e]l,2,4-triazolo [ 1,5-c]pyrimidin (58)

Výtěžek 85 %; světle žlutá pevná látka, teplota tání 144-145 °C (Et₂O - petroléter); IR (KBr) : 3255-2 930, 1673, 1620,...........

1610, 1520 cm'¹; ^XH NMR (CDC1₃) δ 0,98 (d, 6H, J=7,5), 1,60 (m, 1H); 1,91 (m, 1H); 4,40 (t, 2H, J=7); 4,53 (s, 2H); 6,60 (m, 1H); 7,18 (m, 1H); 7,26-7,39 (m, 5H) ; 7,64 (s, 1H); 8,22 (S, 1H); 9,ll(bs, 1H).

5-[ (Benzyl) karbonyl]amino-8- (3-fenylpropyl) -2- (2-furyl) pyrazolo [4,3-eJ 1,2,4-triazolo [1,5-c]pyrimidin (59)

Výtěžek 95 %; světle žlutá pevná látka, teplota tání 116-117 °C (Et₂O - petroléter); IR (KBr): 3250-2900, 1675, 1625, 1600, 1500 cm'¹; ^ΤΗ NMR (CDC1₃) δ 2,39 (m, 2H) ; 2,67 (t, 2H, J=7); 4,37 (t, 2H, J=7); 4,53 (s, 2H) ; 6,61 (m, 1H); 7,167,43 (m, 11H); 7,65 (s, 1H) ; 7,64 (s, 1H) ; 8,19 (s, 1H) ;

9, 12 (bs, 1H) .

PŘÍKLAD 5

Příprava 1-substituovaných 4--kyano-5-aminopyrazolů

Způsoby popsanými v J. Org. Chem., 1956, sv. 21, s. 1240; J. Am. Chem. Soc., 1956, sv. 78, s. 784 a podle zde ^£f uvedených odkazů lze připravit následující sloučeniny, přičemž se vychází z komerčního ( Ϊ

.......- - etnoxymethylenmalonodinitrilu a na N1 substituováných hydrazinů, jež jsou rovněž komerčně dostupné:

•«í

1-methyl-4-kyano-5-aminopyrazol l-n-butyl-4-kyano-5-aminopyrazol

1-isopentyl-4-kyano-5-aminopyrazol

1-(2-cyklopentyl)ethyl-4-kyano-5-aminopyrazol l-hydroxyethyl-4-kyano-5-aminopyrazol l-fenyl-4-kyano-5-aminopyrazol

1-terc.butyl-4-kyano-5-aminopyrazol

1-fenylethy1-4-kyano-5-aminopyrazol

1-(2-chlorfenyl)-4-kyano-5-aminopyrazol

Tyto sloučeniny se mohou užít jako meziprodukty pro přípravu pyrazolotriazolopyrimidinových sloučenin podle vynálezu.

PŘÍKLAD 6

Příprava 1-substituovaných 4-kyano-3-aminopyrazolů t Vycházeje z 4-kyano-5-aminopyrazolu připraveného způsobem popsaným v Chem. Pharm. Bull., 1970, sv. 18, s.

2353 nebo v J. Heterocyclic Chem. 1979, sv. 16, s. 1113 se mohou připravit 4-kyano-3-aminopyrazoly substituované v poloze 1 přímou alkylací odpovídajícím alkylhalidem v dimethylformamidu za teploty 80 °C pod dobu 2 hodin v přítomnosti bezvodého uhličitanu draselného. Z reakční směsi Obsahující dva izomery alkylované v polohách NI a N2 v poměru asi 1:2 se může izomer N2 izolovat jedinou krystalizací nebo kolonovou chromatografií na silikagelu s í\ • · · · • · použitím směsí ethylacetátu a petroléteru jako elučního činidla. Za pomoci těchto procedur byly připraveny následující sloučeniny:

l-methyl-4-kyano-3-aminopyrazol l-butyl-4-kyano-3-aminopyrazol « l-benzyl-4-kyano-3-aminopyrazol l-isopentyl-4-kyano-3-aminopyrazol

............ 1 -fenylethyl-4-kyano-3-aminopyrazol . ....... .......... . . . . . .

* Tyto sloučeniny se mohou použít jako meziprodukty pro přípravu zde popsaných pyrazolotriazolopyrimidinových sloučenin.

PŘÍKLAD 7

Příprava fenylethyl-4-kyano-3-aminopyrazolů

a) K suspenzi bezvodého uhličitanu draselného (30 mmol) v DMF (50 ml) se přidá 3-amino-4-kyanopyrazol (20 mmol) a zahřívá 30 minut na teplotu 80 °C. K suspenzi se přidá fenylethylbromid (25 mmol) a zahřívá se 2 hodiny na 80 °C.

Po ochlazení na teplotu místnosti se směs pod vakuem odpaří do sucha, výsledný zbytek se převede do destilované vody

......... (100 ml) a extrahuje ethylacetátem (3 x 50 ml) . Spojené ‘ organické extrakty se susi nad bezvodým síranem sodným a pod vakuem se odpaří do sucha. Výsledné reziduum sestává ze směsi l-fenylethyl-4-kyano-5-aminopyrazolu (20 .%) a 1» fenylethyl-4-kyano-3-aminopyrazolu (60 %) v poměru 1:3, která se může použít jako taková v příkladu 9 nebo zpracovat ^u v chromatografické koloně na silikagelu a se směsí ethylacetát/hexan jako elučním činidlem a vznikne jednak l-fenylethyl-4-kyano-5-aminopyrazol s teplotou tání 172-173 °C; výtěžek 20 %; NMR (DMSO-d₆) : 3,04 (t, 2H); 4,12 (t,

2H) ; 5,85 (sb, 2H); 7,21-7,30 (m, 5H); 7,41 (s, 1H), jednak l-p-fenylethyl-4-kyano-3-aminopyrazol, teplota tání 98-100 °C, výtěžek 60 %; NMR (CDC1₃) : 3,07; (t, 2H) ; 4,10 (t,

2H); 4,23 (sb, 2H); 7,17 (s, 1H); 7,0-7,28 (m, 5H).

.·

b) Roztok l-p-fenylethyl-4-kyano-5-aminopyrazolu (20 mmol) v triethylortoformiátu (40 ml) se 8 hodin zahříval pod zpětným chladičem v atmosféře dusíku. Nadbytečný ortoformiát se pod vakuem odpařil do sucha a reziduální žlutý olej se rozpustil v ethylétheru a perkoloval na silikagelu za vzniku odpovídájícícho iminoéteru (výtěžek 87 %). Po odpaření orthoformiátu je zbytek prakticky čistý a přímo se použije v následujícím- stupni. Roztok'iminoéteru (20 mmol) a * hydražidu furoové kyseliny (2,5 g, 22 mmol) v 2-methoxyethanolu (50 ml) se zahříval pod zpětným chladičem 5 až 10 hodin. Po ochlazení se roztok ochladil do sucha na olej ovitý zbytek, který se tepelně cyklizoval v difenyléteru (50 ml) za použití Dean-Starkova přístroje, kterým se azeotropicky odstraňovala reakcí vzniklá voda. Po 1,5 hodinách se reakční směs kontrolovala chromatografií TLC s použitím směsi ethylacetát/petroléter v poměru 2:1 a pokud už nebyla výchozí látka přítomná, směs se ochladila a přidal se hexan. Získaný precipitát se ochladil a překrystalizoval za vzniku 7-(β-fenylethyl)-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidinu, teplota tání 174-175 °C, výtěžek 20 %, ^ΤΗ NMR (DMSO-d6): 3,23 (t, 2H); 4,74 (t, 2H); 6,75 (s, ÍH) ; 7,14-7,17 (m, 5H); 7,28 (s, ÍH); 7,98 (s, ÍH); 8,53 (s, 1E); 9,56 (s, ÍH).

Podobným způsobem se připravil 8-(β-fenylethyl)-2-(2furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin z 1-β* fenylethyl-4-kyano-3-aminopyrazolu; teplota tání 268-270 °C, (600 A) NMR (DMSO-d6):3,32 (t, 2H); 4,72 (t, 2H); 6,73 (s, ÍH), 7,23 (m, 5H); 7,95 (s, ÍH); 8,8 (s, 1H); 9,41 (s,

ÍH) .

c) Suspenze produktu stupně b) (10 mmol) v 10 % HC1 (5,0 ml) se za míchání zahřívá pod zpětným chladičem 3 hodiny. Po ochlazení se roztok zalkalizuje koncentrovaným hydroxidem amonným při 0 °C a výsledný precipitát se sfiltruje nebo extrahuje ethylacetátem (3x100 ml), vysuší a odpaří ve vakuu do sucha za vzniku odpovídajícího l-(p-fenylethyl)-4-[3(2furyl)-1,2,4-triazol-5-yl]-5-aminopyrazolu s teplotou tání 175-176 °C; ^ΧΗ NMR (DMSO-d6): 3,15 (t, 2H); 4,48 (t, 2H); 5,78 (s, 1H); 6,37 (s, 1H); 6,68 (s, 1H); 7,1 (s, 1H); 7,277,28 (m, 5H); 7,82 (s, 1H); 14,51 (sb, 2H); podobným způsobem se získá- 1- (β-fenylethyl) -4-[3 (2-furyl)-1,2,4------triazol-5-yl]-3-aminopyrazol, teplota tání 205-206 °C;

NMR (DMSO-d6): 3,12 (t, 2H); 4,46 (t, 2H), 5,75 (s, 1H); 14,41 (sb, 2H).

d) Kyanamid (60 mmol) se přidá k suspenzi aminu ze stupně c) (10 molů) v N-methylpyrrolidonu (40 ml), pak následuje p-toluensulfonová kyselina (15 mmol). Směs se za stálého míchání zahřívá na 160 °C. Po 4 hodinách se přidá další dávka kyanamidu (60 mmol) a zahřívání pokračuje přes noc. Potom se do směsi přidá horká voda (200 ml) a sraženina se sfiltruje, promyje vodou a překrystalizuje z ethanolu za vzniku odpovídajícího 5-amino-7-(β-fenylethyl)-2-(2-furyl)pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinu, teplota tání 225-226 °C; ^XH NMR (DMSO-d6): 3,21 (t, 2H); 4,51 (t,

2H); 6,65 (s, 1H); 7,1-7,44 (m, 5H, atom a 1H); 7,78 (s,

1H); 7,89 (sb, 2H); 8,07 (s, 1H).

Podobně byl získán 5-amino-8-(β-fenylethyl)-2-(2furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin, teplota tání 212-213 °C; ^rH NMR (DMSO-d6): 3,21 (t, 2H);

4,53 (t, 2H); 6,7 (s, 1H); 7,1-7,4 (m, 5H, atom a 1H); 7,65 (sb, 2H); 7,93 (s, 1H); 8,45 (s, 1H).

PŘÍKLAD 8

Příprava 4-kyano-5-amino-l,2,3-triazolů

K suspenzi uhličitanu draselného (0,23 mol) v DMSO (70 ml) se postupně přidá kyanacetamid (70 mmol) a pfluorbenzylazid (54,5 mmol). Výsledný roztok se míchá 1 hodinu při pokojové teplotě a potom se vlije do velkého objemu vody (1,5 1). Oddělená pevná fáze se sfiltruje, promyje vodou a vysuší v peci při 70 °C a poskytne l-(pfluorbenzyl)-4-karbamid-5-amino-l,2,3-triazol ve výtěžku 96,1 %; teplota tání je 198-199 °C; ^ΣΗ NMR (DMSO-d₆) : 7,5-7,1 (m, 6H) ; 6, A... (s, 2H) ; 5,4 (s,.....2H)—K suspenzi amidu (0,005 mol) v DMF (5 ml) se za míchání a po ochlazení na 0 °C přidá fosforoxychlorid (0,01 mol). Výsledný roztok se míchá 5 minut při 0 °C, 10 minut při 25 °C a 15 minut při 80 °C. Po ochlazení na pokojovou teplotu se přidá 5 ml IN HC1 a směs se zahřívá 5 minut pod zpětným chladičem. 1-(p-fluorbenzyl)4-karbamid-5-amino-l,2,3-triazol se oddělí od ochlazeného roztoku (výtěžek 90 %); teplota tání je 185-186 °C; NMR (DMSO-dg): 7,3-7,0 (m, 6H); 5,5 (s, 2H); IR (KBr); 3400,

3220, 2220, 1655 cm’¹.

Analogicky se připravily následující sloučeniny:

1- nebo 2-benzyl-4-kyano-5-amino-l,2,3-triazol

1- nebo 2-(o-fluorbenzyl)-4-kyano-5-amino-l,2,3-triazol

......Γ- nebo 2-(p-fluorbenzyl)-4-kyano-5-amino-l,2,3-triazol — nebo 2-butyl-4-kyano-5-amino-l,2,3-triazol 1- nebo 2-isopentyl-4-kyano-5-amino-l,2,3-triazol 1- nebo 2-(2-methoxyethyl)-4-kyano-5-amino-l,2,3-triazol 1- nebo 2-heptyl-4-kyano-5-amino-l,2,3-triazol 1- nebo 2-oktyl-4-kyano-5-amino-l, 2,3-triazol i

Tyto sloučeniny se mohou použít jako meziprodukty při přípravě triazolotriazolopyrimidinových sloučenin podle vynálezu.

PŘÍKLAD 9

Příprava ethoxymethylenamino-heterocyklů

Příprava ethoxymethylenamino-heterocyklů vzorce IV se děje refluxováním příslušného orto-aminonitrilu

9

s ethylortoformiátem. Jako příklad lze uvést přípravu 4kyano-5-(ethoxymethylenamino)-1-butylpyrazolu. Roztok 4kyano-5-amino-l-butylpyrazolu (20 mmol) v triethylortoformiátu (40 ml) se zahřívá 8 hodin do teploty refluxu v atmosféře dusíku. Nadbytek ortoformiátu se odpaří * do sucha za sníženého tlaku a reziduální žlutý olej se rozpustí v ethyléteru a eluuje přes silikagel, čímž se získá čistá sloučenina ve výtěžku 87 %. V mnoha’případech je.......

zbytek získaný po odpaření ortoformiátu v podstatě čistý a použije se jako takový v následujícím stupni, IR (nujol): 3140, 2240, 1640 cm¹ ; NMR (CDC1₃) : 8,4(s, 1H) ; 7,9 (s, 1H); 4,5 (t, 2H); 4,3 (q, 2H); 1,8 (m, 2H); 1,5 (m, 2H); 1,5 (m, 2H); 1,4 (b, 3H); 0,9 (t, M).

PŘÍKLAD 10

Cyklizace ethoxymethylenamino-heterocyklů

Roztok ethoxymethylenamino-heterocyklu (20 mmol) a hydrazidu 2-furoové kyseliny (2,5 g, 22 mmol) ve 2 methoxyethanolu (50 ml) se zahřívá pod zpětným chladičem 5 až 10 hodin. Po ochlazení se roztok odpaří do sucha a získá se reziduální olej, který se podrobí tepelné cyklizaci v difenyléteru (50 ε· ml) za pomoci kádinky s kulatým dnem spojené s přístrojem

Deana a Starka pro azeotropické odstraňování vody vznikající během reakce. V proměnlivých periodách od 3 do 5 hodin se reakční směs chromatograficky kontroluje způsobem TLC » (ethylacetát/petroléther v poměru 2:1) a když zmizí veškerá výchozí látka, směs se ochladí a přidá se hexan. Výsledná sraženina se sfiltruje a překrystalizuje z vhodného rozpouštědla. V některých případech se od roztoku oddělí viskózní olej, který se potom dekantuje a následně extrahuje. Potom se olejovitý zbytek chromatografuje na silikagelu se směsmi ethylacetát/petroléter jako elučním činidlem a získá se tricyklická sloučenina VI.

Jako příklad se.uvádějí analytické a spektroskopické • ·

vlastnosti některých sloučenin připravených těmito způsoby:

7- butyl-2(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5cjpyrimidin. ^XH NMR (DMSO-d₆) : 9,6 (s, 1H) ; 8,6 (s, 1H) ; 8,0 (m, 1H); 7,4 (m, 1H); 6,7 (m, 1H); 4,5 (t, 2H); 1,9 (m, 2H);

1,3 (m, 2H); 0,9 (t, 3H).

8- butyl-2(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5- .....

c]pyrimidin. ^rH NMR (DMSO-d₆) : 9,4 (s, 1H); 8,9 (s, 1H); 8,0 (m, 1H) ; 7,3 (m, 1H), 6,2 (m, 1H); 4,5 (t, 2H); 1,9 (m, 2H); 0,9 (m, 3H). Ve spektru 2D-NMR (NOESY) vykazuje signál N-CH₂rezonující na 4,5 zkřížené píky se signálem C9-H rezonujícím na 8,9.

7- isopentyl-2(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5c]pyrimidin. ^XH NMR (CDC1₃) : 9,1 (s, 1H); 8,8 (s, 1H); 7,7 (m, 1H); 7,3 (m, 1H); 6,6 (m, 1H) ; 4,6 (t, 2H); 1,18-1,7 (m, 3H); 1,0 (d, 6H).

8- isopentyl-2(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5cjpyrimidin. 9,1 (s, 1H) ; 8,8 (s, 1H) ; 7,7 (m, 1H) ; 7,3 (m, 1H) ; 6,6 (m, 1H) ; 4,6 (t, 2H) ; 1,9-1,5 (m, 3H) ; 1,0 (d, 6H) .

Tímtéž způsobem se mohou připravit následující sloučeniny:

7- methyl-2(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5c]pyrimidin

8- methy1-2(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5c]pyrimidin

7-(2-chlorfenyl)-2(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin

7-fenylethyl-2(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5c]pyrimidin

7-terc.butyl-2(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,555

c]pyrimidin

7- (2-cyklopentyl)ethyl-2(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin

8- benzyl-2(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5c]pyrimidin

7-benzyl-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-l,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin

- (2 - f 1 uo rben z y 1) - 2 (2 - f uryl·) -1,2, -3-t r i a z o 1 o [5, -4 - e ] -1,2,4triazolo [ 1,5-c]pyrimidin

7-(4-fluorbenzyl)-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin

7-butyl-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5, 4-e]-1,2,4-triazolo[1, c]pyrimidin

7-isopentyl-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5, 4-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin

7-(2-methoxy)ethyl-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-l,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin

7-heptyl-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin

7- oktyl-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5, 4-e]-1,2,4-triazolo[1, c]pyrimidin

8- benzyl-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin

8-(2-fluorbenzyl)-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin

8-(4-fluorbenzyl)-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-l,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin

8-butyl-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5, 4-e]-1,2,4-triazolo[1, c]pyrimidin

8-isopentyl-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-1,2,4triazolo[l,5-c]pyrimidin

8-hexyl-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-1,2,4-triazolo[1, c]pyrimidin

8-heptyl-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-l,2,456 triazolo[1,5-c]pyrimidin

8- oktyl-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-1,2,4-triazolo[1,5c]pyrimidin

9- benzyl-2(2-furyl)-1,2,3-triazolo[4,5-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin *' 9- (2-fluorbenzyl) -2 (2-furyl) -1,2,3-triazolo[4,5-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin $

9-(4-fluorbenzyl)-2 (2-furyl)-1,2,3-triazolo[4,5-e]-1,2,4g triazolo[1,5-c]pyrimidin

Tyto sloučeniny se mohou použít jako meziprodukty při přípravě triazolotriazolopyrimidinů a pyrazolotriazolopyrimidinů podle vynálezu.

PŘÍKLAD 11

Příprava 5-amino-7-[ar(alkyl)]-2-(2-furyl) -pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinů

K suspenzi aminů podle vzorce VII (10 mmol) v Nmethylpyrrolidonu (40 ml) se přidá kyanamid (60 mmol) a následně p-toluensulfonová kyselina (15 mmol). Směs se zahřívá na 160 °C za míchání na magnetickém míchadle. Po 4

V' hodinách se přidá druhá dávka kyanamidu (60 mmol) a zahřívání pokračuje přes noc. Potom se ke směsi přidá horká voda (200 ml) a vysrážená pevná fáze se sfiltruje, promyje f* vodou a překrystalizuje z ethanolu. Když už nedochází ke srážení, roztok se extrahuje ethylacetátem (4x100 ml), extrakty se promyji solankou (2x50 ml), vysuší a odpařují ve vakuu do sucha. Potom se zbytek chromatografuje v koloně se silikagelem a promývá ethylacetátem.

V dalším se podávají analytická a spektroskopická data některých sloučenin připravených tímto způsobem:

5-amino-7-butyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin. Teplota tání 157-158 °C. ¹H NMR ·· (DMSO-dg) : 8,1 (s, 1H) ; 8,0 (s, 2H); 7,9 (m, 1H); 7,2 (m, 1H); 6,7 (m, 1H); 4,2 (t, 2H); 1,9 (m, 2H); 1,5 (m, 2H); 0,9 (t, 3H).

5-amino-8-butyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin. Teplota tání 183-185 °C. ¹H NMR (DMSO-d₆): 8,6 (s, 1H) ; 8,0 (s, 1H) ; 7,6 (s, 2H) ; 7,2 (m,

1H); 6,7 (m, 1H); 4,2 (t, 2H); 1,8 (m, 2H); 1,2 (m, 2H); 0,9 (t, 3H) .

5-amino-7-benzyl-2-(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin. Teplota tání 295-297 °C. ^XH NMR (DMSO-d₆) : 8,5 (s, 2H) ; 8,0 (s, 1H) ; 7,3 (m, 6H) ; 6,7 (m,

1H); 5,7 (s, 2H).

5-amino-7-o-fluorbenzyl-2-(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin. Teplota tání 310-312 °C. ^XH NMR (DMSO-de) : 8,5 (s, 2H) ; 8,0 (s, 1H) ; 7,3 (m, 5H); 6, 8 (m, 1H); 5,75 (s, 2H).

5-amino-7-methyl-2-(2-furylj-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin. Teplota tání 210-213 °C.

5-amino-7-terc.butyl-2-(2-furyl·)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin. Teplota tání 238-240 °C.

5-amino-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5c]pyrimidin. Teplota tání 248-250 °C.

5-amino-7-(2-hydroxyethyl)-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin. Teplota tání 258-260 °C.

5-amino-7-fenyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-l,2,4triazolofl,5-c]pyrimidin. Teplota tání 295-297 °C.

··

5-amino-7-isopentyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin. Teplota tání 208-210 °C.

5-amino-8-isopentyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2, 4triazolo[1,5-c]pyrimidin. Teplota tání 200-203 °C.

5-amino-7-fenethyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin. Teplota tání 225 °C.

5-amino-7-benzyloxyethyl-2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin.

5-amino-7-(β-(4-isobutylfenylethyl))-2-(2-furyl)pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin. Teplota tání 207-210 °C.

Tyto sloučeniny mohou reakcí s vhodným derivátem kyseliny nebo sulfonové kyseliny vytvořit sloučeniny vzorce I podle vynálezu.

PŘÍKLAD 12

Příprava substituovaných-4-karboxamido-5-amino-l,2,3triazolů p-Fluorbenzylazid (15,1 g, 0,1 mol) a kyanacetamid (10,8 g, 0,13 mol) se v tomto pořadí přidají k suspenzi práškovaného uhličitanu draselného (57,5 g, 0,42 mol) v dimethylsulfoxidu (150 ml). Směs se 1 hodinu míchá při pokojové teplotě. Směs se vlije do 3 litrů vody a separovaná pevná fáze se sfiltruje a důkladně promyje vodou a získá se 22,47 g (výtěžek 96 %) 1-p-fluorbenzyl-4-karboxamid-5-amino1,2, 3-triazolu. Teplota tání je 198-199 °C; ^TH NMR (DMSO-d₆) :

7,5-7,1 (lm, 6H); 6,4 (s, 2H); 5,4 (s, 2H).

·· «V ·· * • 0 0 0 ·· · · * • 0 0 0 · * f»00 0 0 0 · • ♦ · · ·

0000 00 ·· 0··

Analogicky se získá 2-fluor-6-chlorbenzyl-4-karboxamid1,2,3-triazol; teplota tání je 230-231 °C; ¹H NMR (DMSO-de): 5,40 (s, 2H); 6,52 (sb, 2H); 7,12-7,45 (m, 5H)

3-fluorbenzyl-4-karboxamid-5-amino-l,2,3-triazol; teplota tání je 211-211 °C; ^XH NMR (DMSO-d₆) : 5,46 (s, 2H); 6,47 (sb, 2H); 7,00-7,52 (m, 6H)

2-fluorbenzyl-4-karboxamid-5-amino-l,2,3-triazol; teplota tání je 195-197 °C;

1- (β-fenylethyl)-4-karboxamid-5-amino-l,2,3-triazol; teplota tání je 181-183 °C; ^XH NMR (DMSO-dg) : 3,04 (t, 2H) ; 4,35 (t, 2H); 6,30 (sb, 2H); 7,20-7,47 (m, 7H).

PŘÍKLAD 13

Příprava substituovaných-4-kyano-5-amino-l, 2,3-triazolů

K suspenzi l-p-fluořbenzyl-4-karboxamid-5-amino-l,2,3triazolu (23,4 g> 0,1 mol) v DMF (100 ml), míchané magnetickým míchadlem při 0 °C se přidá 20,8 ml (0,2 mol) POCI3. Roztok se míchá 5 hodin při 0 °C, 10 hodin při pokojové teplotě a konečně 15 hodin při 80 °C. Po ochlazení se přidá IN HC1 (100 ml) a výsledný roztok se zahřívá pod chladičem 5 hodin; po ochlazení se vysráží 1,5-pfluorbenzyl-4-kyano-5-amino-l,2,3-triazol (18,54 g, 90 %).

f Teplota tání 185-186 °C; ^XH NMR (DMSO-d₆) : 7,3-7,0 (m, 6H) ;

5,5 (s, 2H); IR (Kbr): 3400, 3220, 2220, 1655 cm'¹.

Analogicky se získají následující sloučeniny:

2- fluor-6-chlorbenzyl-4-kyano-5-amino-l,2,3-triazol; Teplota tání 181-185 °C; ^XH NMR (DMSO-d₆) : 5,40 (s, 2H); 7,26-7,50 (m, 5H)

3-fluorbenzyl-4-kyano-5-amino-l,2,3-triazol; Teplota tání ·· ·· ·· ·· « « · · » · • · · · · ·«· · φ · • · · ♦

Φ·* · »· ··

4Τ · ··· ’Ρ η

i 'Λ

195-197 °C; ¹Η NMR (DMSO-d₆) : 5,44 (s, 2Η); 7,00-7,43 (m, 6H)

2-fluorbenzyl-4-kyano-5-amino-l,2,3-triazol; Teplota tání 195-197 ° C.

1-(β-fenylethyl)-4-kyano-5-amino-l,2,3-triazol; Teplota tání 149-150 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆) : 3,04 (t, 2H) ; 4,36 (t, 2H) ;

7,03 (sb, 2H); 7,23-7,28 (m, 5H).

PŘÍKLAD 14

Příprava substituovaných-4[3(2-furyl)-1,2,4-triazol-5-yl]-5

-amino-1,2,3-triazolů

Suspenze 1-p-fluorbenzyl-4-kyano-5-amino-l,2,3-triazolu (20 mmol) a hydrazidu 2-furoové kyseliny (22 mmol) v difenyléteru (30 ml) se míchá a zahřívá do varu pod zpětným chladičem (260 °C) za pomoci přístroje Dean-Starka až do vymizení výchozí sloučeniny (kontrola chromatografií TLC, 1-2 hodiny). Po ochlazení se směs zředí petroléterem a výsledný precipitát se buď sfiltruje nebo oddělí dekantací a chromatografuje v koloně se silikagelem při použití ethylacetátu a petroléteru v poměru 2:1.

l-p-Fluorbenzyl-4[3(2-furyl)-1,2,4-triazol-5-yl]-5-amino1,2,3-triazol; teplota tání 266-268 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆) :

14,5 (S,1H); 7,8 (s, 1H) ; 7,4-7,1 (m, 5H) ; 6,6 (s, 1H) ; 6,5 (s, 2H); 5,5 (s, 2H).

Analogicky se připraví 1-(β-fenylethyl)-4[3-(2-furyl)-1,2,4triazol-5-yl]-5-amino-l,2,3-triazol; (výtěžek 50 %); teplota tání 200-202 °C; ^XH NMR (DMSO-d₅) : 3,07 (t, 2H); 4,16 (t,

2H); 5,50 (sb, 2H) ; 6,61 (s, 1H) ; 6,69 (s, 1H) ; 7,2-7,4 (m, 5H); 7,78 (s, 1H); 13,8 (sb, 1H).

··· · ··

PŘÍKLAD 15

Příprava 5-amino-7-substituovaných-2- (2-furyl) -1,2,3triazolo [5,4-e] -1,2,4-triazolo [1,5-c]pyrimidinů

K suspenzi 1-p-fluorbenzyl-4[3(2-furyl) 1,2,4-triazol-5yl]-5-amino-l,2,3-triazolu (0,325 g, 1 mmol) v Nmethylpyrrolidonu (4 ml) se přidá kyanamid (6 mmol) a pak ptoluensulfonová kyselina (1,5 mmol). Směs se zahřívá na 160 °C za míchání na magnetickém míchadle. Po 4 hodinách se přidá další dávka kyanamidu (6 mmol) a zahřívání pokračuje přes noc. Potom se ke směsi přidá horká voda (20 ml) a vysrážená pevná fáze se sfiltruje, promyje vodou a překrystalizuje z ethanolu. Když nedochází k vysrážení, roztok se extrahuje ethylacetátem (4x10 ml), extrakty se promyjí solankou (2x5 ml), vysuší a vakuově odpaří do sucha. Zbytek se zpracuje chromatograficky v koloně naplněné silikagelem a eluuje ethylacetátem za vzniku 105 mg (30% výtěžek) 5-amino-7-p-fluorbenzyl-2-(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinu; teplota tání 266268 °C; ^!H NMR (DMSO-d₆) : 8,5 (sb, 2H) ; 7,95 (s, IH) ; 7,4-7,1 (m, 6H); 6,7 (s, IH); 5,7 (s, 2H).

Analogicky se získaly:

5-amino-7-o-fluorbenzyl-2-(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin; teplota tání 310 °C.

5-amino-7-benzyl-2-(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e]-l,2,4triazolo[1,5-c]pyrimidin; teplota tání 295-297 °C.

5-amino-7-(2-fluor-6-chlorbenzyl)-2-(2-furyl)-1,2,3triazolo[5,4-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin; teplota tání 218-220 °C; NMR (DMSO-d₆) : 8,51 (sb', 2H) ; 7,98 (s, IH) ; 7,55-7,28 (m, 4H); 6,77 (m, IH); 5,73 (s, 2H).

5-amino-7-m-fluorbenzyl-2-(2-furyl)1,2,3-triazolo[5,4-e]62

·· ·· • · · 9	•	• * 4	• • 9	•	« « 4	• 4 ·
• 4 4 4 4	•	9	•	4 4	4	•
• · 4 4 4 4 « 4	•	9 • 4	9 444	•	• 4 4	4 4 4 4

1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin; teplota tání 280-283 °C; ^XH NMR (DMSO-d₆) : 8,45 (bs, 2H) ; 7,98 (s, 1H) ; 7,4-7,1 (m, 5H); 6,76 (s, 1H); 5,75 (s, 2H).

5-amino-7-(β-fenylethyl)-2-(2-furyl)-1,2,3-triazolo[5,4-e] 1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidin; teplota tání 269-271 °C; ¹H NMR (DMSO-dg): 8,4 (sb, 2H) ; 7,98 (s, 1H); 7,3-7,15 (m, 6H) ; 6,8 (s, 1H); 4,71 (t, 2H); 3,31 (t, 2H).

PŘÍKLAD 16

Další sloučeniny

S využitím výše popsaných chemických způsobů se připravily další následující sloučeniny:

·<?· i*

/

Slouč.č.	R	R¹
60	H	H
61	H	4-MeO-Ph-NHCO
62	H	3-Cl-Ph-NHCO
63	t-C₄H9	H
64	t —C₄Hg	4-MeO-Ph-NHCO
65	t — C₄Hg	3-Cl-Ph-NHCO
66	ch₃	Ph-NHCO
67	ch₃	4-SO₃H-Ph-NHCO

• · · · · j>

• 9

68	ch₃	3,4-Cl₂-Ph-NHCO
69	ch₃	3,4-(OCH₂-O)-Ph-NHCO
⁷⁰	ch₃	4- (NO₂) -Ph-NHCO
71	ch₃	4- (CH₃) -Ph-NHCO
72	ch₃	Ph- (CH₂) -CO
73	c₂h₅	Ph-NHCO
74	c₂h₅	4-SO₃H-Ph-NHCO
75	c₂h₅	3,4-Cl₂-Ph-NHCO
76	c₂h₅	3,4- (OCH₂-O)-Ph-NHCO
77	c₂h₅	4-(NO₂)-Ph-NHCO
78	C2H5	4-(CH₃)-Ph-NHCO
79	c₂h₅	. Ph-(CH₂)-CO
. 80	, n-C₃H₇	Ph-NHCO
' 81 '	n-C₃H₇	'4-SO₃H-Ph-NHCÓ
82	n-C₃H₇	3,4-Cl₂-Ph-NHCO
83	n-C₃H₇	3,4-(OCH₂-O)-Ph-NHCO
84	n-C₃H₇	4-(NO₂)-Ph-NHCO
85	n-C₃H₇	4-(CH₃)-Ph-NHCO
86	n-C₃H₇	. Ph-(CH₂)~CO
. .,. 67 . .	- - ·. - - n-CzjHq....... · · - · -.....-	..........Ph-NHCO -..........
88	n-C₄H9	4-SO₃H-Ph-NHCO
89	n-C₄Hg	3,4-Cl₂-Ph-NHCO
90	n-C₄H₉	3,4- (OCH₂-O)-Ph-NHCO.
91	n—C4H9	4-(NO₂) -Ph-NHCO
92	n-C₄H₉	4- (CH₃) -Ph-NHCO
93	2-(α-naftyl)ethyl	Ph-(CH₂)-CO
94	2-(α-naftyl)ethyl	H
95	2-(α-naftyl)ethyl	4-MeO-Ph-NHCO
96	2-(α-naftyl)ethyl	3-Cl-Ph-NHCO
97	2-(2,4,5- tribromfenyl)ethyl	H

98	2-(2,4,5- tribromfenyl)ethyl	4 MeO-Ph-NHCO
99	2-(2,4,5- tribromfenyl)ethyl	3-Cl-Ph-NHCO
100	2-propen-1-yl	4 MeO-Ph-NHCO

ff

PŘÍKLAD 17

Vyhodnocení biologické aktivity sloučenin

Několik výše popsaných sloučenin se zkoušelo z hlediska afinity ke krysím receptorům A_x a A_2a a lidskému receptoru A₃za pomoci následujících testů.

Test vazby na krysí adenosinový receptor Αχ a A_2a

Krysí samci Wistar hmotnosti 200-250 g se dekapiťovali a celý mozek a corpus striatum se oddělily na led. Tkáně se dezintegtrovaly 30 sec v polytronovém homogenátoru nastaveném na stupeň 5 v 25 objemech 50 mM Tris HC1 obsahujících 10 mM MgCl₂ při pH 7,4. Homogenát se odstřeďoval 10 min při 48 000 g a granule se resuspendovaly v témže pufru obsahujícím 2 IU/ml adenosindeaminázy. Po 30 minutách inkubace při 37 °C se membrány odstředily a granule se skladovaly při -80 °C. Před zmražením se oddělil alikvot homogenátu pro proteinový test s bovinním albuminem jako referenčním standardem. Vazebné testy se prováděly jednak s krysím mozkem jednak s membránami corpus striatum v přítomnosti 10 mM MgCl₂ při 25 °C. Všechny roztokové pufry byly nastaveny na konstantní pH 7,4.

Vytěsňovací experimenty se prováděly v 500 μΐ pufru Tris HC1 obsahujícím 1 nM selektivního ligandu pro adenosinový receptor A_x [³H]CHA(N6-cyklohexyladenosin) a membrány krysího mozku (150-200 μg proteinu na test).

Vytěsňovací experimenty se prováděly v 500 μΐ pufru Tris

HC1 obsahujícím 10 mM MgCl₂, 0,2 nM selektivního ligandu pro adenosinový receptor A_2a [³H]SCH58261 (5-amino-7-(2fenylethyl)-2(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5c]pyrimidin) a membrány krysího corpus striatum (80-100 μρ proteinu na jeden test) . Pro stanovení hodnot IC₅₀ (kde IC₅₀ ' je koncentrace inhibitoru schopná vytěsnit 50 % značeného ₄ ligandu) se přidává zkušební sloučenina třikrát ke vzorkům pro vazebný test v minimálně šesti různých koncentracích. p Oddělení vázaného od volného radioaktivního ligandu se provedlo rychlou filtrací přes Whatmanovy filtry GF/B (se skleněnými vlákny), které se třikrát promyly. ledovým pufrem. Radioaktivita vázaná na filtr se měřila scintilační spektrometrií po přidání 5 ml Aquassure. Nespecifická vazba se definovala jako vazba v přítomnosti jednak 10 μΜ R-PIA (N⁶-(fenylisopropyl)adenosin), jednak 10 ;μΜ NECA (5'-(Nethylkarboxamid)ádenosin) a vždy představovala 10 % veškeré vazby. Inkubační doba byla v rozmezí od 150 min při 0 °C do minut při 30 °C podle výsledků dřivějšího.pokusného zjišťování vhodné doby. Hodnoty Ki se vypočítaly z rovnice

Cheng-Prusoff. Všechny údaje z vazebných testů se analyzovaly pomocí počítačového programu LIGAND pro X.

konstrukci nelineární regresní křivky.

Vazebné testy s lidským klonovaným adenosinovým receptorem

A3

Pro vazebné testy se použil alikvot membrán (8 mg %

proteinu/ml) z buněk HEK-293 transfikovaných rekombinantním lidským adenosinovým receptorem A₃. Obrázek 1 ukazuje typickou saturaci buněk HEK-293 indikátorem [¹²⁵I]B-MECA (N6(4-amino-3-jodbenzyl)-5 '- (N-methylkarbamoyl)adenosin) . Inhibiční experimenty se provedly dvakrát v konečném objemu 100 μΐ ve zkumavce obsahující 0,3 nM [¹²⁵I]AB-MECA, 50 nM pufru Tris HC1, 10 mM MgCl₂ při pH 7,4, 20 μΐ zředěných • · •9 membrán (12,4 mg proteinu/ml) a nejméně 6 až 8 různých koncentrací typických antagonistů adenosinových receptorů. Nespecifická vazba se definovala v přítomnosti 50 μΜ R-PIA a představovala asi 30 % všech vazeb. Inkubační doba byla 60 minut při 37 °C podle výsledků dřívějšího pokusného zjišťování správné doby. Vázaná a volná radioaktivita se oddělila filtrací testované směsi přes Whatmanovy filtry GF/B (se skleněnými vlákny) za pomoci Brandelova sběrače buněk.

Výsledky a diskuse

Sloučeniny 34-59 se zkoušely vazebnými testy s radioaktivními ligandy na afinitu k adenosinovým receptorům Αχ a A_2a v krysím mozku a k lidskému receptorů A₃ a v tabulce 1 jsou shrnuty výsledky.

Údaje ukazují, že sloučeniny bez objemných skupin v poloze NI (sloučeniny 38,40 a 41) vykazují velkou afinitu k adenosinovým receptorům A_2a při nízké selektivitě vůči Αχ a nízké afinitě k lidskému adenosinovému receptorů subtypu A₃, a že sloučeniny se substituovaným fenylkarbamoylovým řetězcem v poloze N₅ vykazují afinitu v nanomolární oblasti k subtypu adenosinového receptorů hA₃ při různých stupních selektivity vůči subtypům receptorů Αχ a A_2a. Zvláště 4methoxyfenykarbamoylová skupina (sloučeniny 51, 55 a 57) vnáší větší afinitu asi o tři řády ve srovnání s 3chlorfenylkarbamoylovou skupinou (sloučeniny 50, 54 a 56).

Zavedení řetězců s různými sterickými vlastnostmi v poloze N⁸ umožňuje konstruovat deriváty s vysokou účinností vůči lidským adenosinovým receptorům A₃ a s lepší selektivitou k subtypům receptorů Αχ a A_2a.

Obrázek 1 ukazuje saturační křivku indikátoru [¹²⁵I]ABMECA k adenosinovému receptorů A₃ a linearita vloženého Scatchardova diagramu v daných experimentálních podmínkách dokazuje přítomnost jediné třídy vazebných míst s hodnotou « · • · φ · φφφ'· · ·' · φ φ · φφ · · * • · · · ♦ » · · · · · ζ- -7 · ··♦···

Ό / ♦···«< ·ν · · · ·

K_D 0,9 ± 0,01 ηΜ a hodnotou Bmax 62 ± 1 fmol/mg proteinu (n=3).

r

S'

I fO c

Γ—

LO

I

LQ (>

LQ

Ο

ΙΌ

Γ—

I ^ί¹ *» ο

'ίΤ

5'

O

• · · ♦ · · · · '· »

ÍI»» «φ ·* ·· ·· *·· col <£>| oo

CO vo oo

LT) oo c

-r-í c

<u >υ 3 O »—I co fO

4->

-H c

•H

Ψ4 '(0 c

X <D

N <0 >

ΓΟ <

x(0

CM <

m χ

»—I <

•Η

CM

Μ •H

Ο

Ο ο

ο rd

Λ κτ tQ m

-ςΤ

Λ

C0 ο

ο «» ο


vd	σ	co
Γ-	co	0
tQ	co
CO	1—1	0
A

		0
0 r-	k0 LQ	0 0 0	vd CO σι	CO O
	0	0 vd	CM CM	O
		Λ


1—1	vd	CM
r-	ΟΊ	CM
tQ	CM	«.
co	t—1	O

Λ

LQ

CM »w ο

+1 m

<ο

ΓLQ tQ

ΜΟ k0

I σ

οο +1

CM lQ

Lf) <0

*.

Ο

CO

CM κ

CM

CO

CM <0

CM m

+1 m

o oo rd

CO

OJ co

I <0

CM

LQ

CM

	vd		CM		σ		CO			V0
O ,-1	O	CM CM	O	σ r-	Γ- ΟΟ	00 CM	s* 0	σ o	CO	10
s. 0	1 σι o	O	1 O CM	tQ co	1 k0 Γ-	O	1 LQ CM	CM	i—I C0	l CM OO
	s.		K		ΟΟ					LQ

Ο

Ο i~d

Λ

O

O o

o vd

V

Π3 -2 <—I 3 X Π3 E-<

«-H <

Lt

X υ

<D

O

4-1 a

<1) υ

ω

M x

υ '^Ί >

o c

•H

W

O c

<D

Ό <U cd >υ o

to o

o w

I x

Oj

I

O

Φ i

o

CM

CM m vd ΟΞ

O

OO cd co

X o

co

O	LQ	CO Ú0 K	o
O	CM	0
O		vd	o
O		1	0
rd A	i—1	KT 00	vd A
		σ

tQ

O to

σ
r-		1
LQ	σ	>£>	CM
LQ	o	r-	CM
1	*»		*.
L0	LQ	<0	sr
k0	σ	00	0
tQ			vd

o o

vd

A σι σ>

>

CM σ

οο σ>

CM

I τ—I οι <0

CM <0

CO LQ OJ CM s I o

cm i-1 *» σ

σ» <0

CM σ>

οο οο cm σι i co vd rd CM U0 CM

I

ΓO

O o

X

Oi

I vd o

I

CO

O

I

X

Oj

I

O

Φ s

i

O o

I

X

Oj

I vd u

I

CO co CM

CM

CM	CM	CM	2
2	2	2	C_)
O	O	O	X
m	1-1	m
2	2	2	C—)
U	O	υ	2

O

LQ	LQ	^r	L0
co		•'tr	CO

CH3CH2CH2 4-Me0-Ph-NHC0 >10000 1993 0,29 >34482 6872

Γ—

»··· ·β .fr·

CM			CM
O O O K	I-1 LQ <3Ί	CO CM rd	O O O	o LD Λ	LO r—	co co
o			O

Γo o

o o

CM

Γ σι r~

NT 'št*

CO

LD OJ r~ A

	Ch 'tr	00 o	co CM
LQ CO	rd CO	r- sr	X rd	CO CM	kO «—1	kO CO
Γ- CM	i co <o	i—1	1 CM CM	CO t—1	1 Γ- ΟΟ	kO CM
			K.		K.
	CM		rd		o
	—-		—r·		i—1

	Γ-	Γ—
LO		CM		UO
O		X				co
00	r-1	CM	uo	uo
CM	00	CM	kD		rd	rd
1	K	1	*.	1	CM	1
CO	ch	rd	CM	CM	rd	CM
co	rd	kO		σ»		O
Lf)		v				rd
CM				ΟΊ		—
—		rd		CO


i—1				Lf)

LO σ

σ i—l ϊΡ OM

<Ti

<r>

σο

co

00

O r—

O I

co <3)

LO c~d

CO <30

co rd I

oo LO

o

o o

O o

co co

O

co ’ύ’

o

1 oo m

co rd

1 LO CM

kO rd

1 ’χΓ CM

o

i

o rd A

CM co

1 LO CM

o

1 U0 LO

*.

CM

LO

/\

O

CO

o o

	Γ-	CM	uo	Γ— Cd	rd
<o r—1	'tr CM	CM 00	v) sr rd 1	Ch	i—1 rd	co rd	«*. CO rd	rd	CM Γ— rd	o o o
*» CM	Ch K	CM t—1	1 00 ,—l	*k rd	1 rd kD -Ch	L—t rd	1 co	uo rd	CM co . co.	o J—i A

			rd				kO		i—1

o o

X

I

X

CL.

o a>

I šT o

υ x

z

I

X

I

I—I o

I co ac o

υ x

z i

Λ

Oj

I

O

Φ i

vp

O o

x z

i

X

Oj

I rd o

I co co σ

ΓLO co I co co r—i co o

O

Cl x

o i

x

Oj

	04 X	Cl X	Cl X	Cl X
Cl	Cl	Cl	u	o	o	o
X	x	X	1	1	I	I
o	u	u	Cl	Cl	Cl	Cl
1	1	1	X	X	X	X
Cl	Cl	Cl	U	O	o	O
x	X	X	1	1	1	1
o	o	o	Csl	Cl	Cl	Cl
1	1	1	X	X	X	X
xa	xa	xa	o	o	o	o
Oj	Oj	Oj	1	1	1	l
			X	X	X	X
			X	X	X	X

o	U0		rM	r-	kO	Ch
	uo	uo	^r	LíO	uo	uo

co šP 1—I i

CM šP j—l •v

ΟΊ

CO g

<D x

o

TS

-<1) *o o

Oj co

Π3

Ή

N

X

CO

N >

Φ >O

Oj +J

O £

TS o

x *· ·· k · · * • · · ««C( «ι

Tyto údaje ukazují, že substituenty s malým řetězcem (C1-C3) v poloze 8 zde popsaných 5- [[ (substituovaný fenyl)amino]karbonyl]amino-8-(ar)alkyl-2-(2-furyl)pyrazolo[3,4-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pyrimidinových sloučenin, zejména methylové, ethylové a propylové skupiny jsou výhodnější než velké řetězce jako jsou pentylové nebo hexylové skupiny. Především sloučeniny 45 a 47, 8-methyl-, 8-ethyl- a 8-propylderiváty 5-(4methoxyfenyl)substituovaných sloučenin vykázaly nejvyšší afinitu a selektivitu a soudí se, že ze všech dosud syntetizovaných sloučenin mají nejvyšší afinitu a selektivitu k adenosinovému receptoru A₃ pro lidský subtyp (hA₃) .

Methylové, ethylové a propylové řetězce mohou být substituovány fenylovými nebo substituovanými fenylovými skupinami a přesto si zachovávají dosti vysokou afinitu a selektivitu k subtypu receptoru A₃, ale tato afinita je snížena desetinásobně nebo stonásobně. Sloučenina s βfenylethylovým řetězcem na N⁸ a 4-MeO-fenylkarbamoylovým řetězcem v poloze Ň⁵ (sloučenina 55) vykázala poměrně dobré hodnoty afinity a selektivity (KihA₃=l,47 nM, rAi/hA₃=872, rA_2A/hA₃=951) .

> Vzdor relativně velkým pentylovým skupinám přítomným ve sloučeninách 50 a 51, vykazují tyto sloučeniny poměrně vysokou afinitu k subtypu adenosinového receptoru A₃ (81,10 respektive 29,57 nm), i když selektivita klesla asi desetiaž stonásobně.

Dřívější výzkum ukázal, že afinita 5-amino-8-(ar)alkyl2-(2-furyl)-pyrazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5c]pyrimidinových sloučenin k subtypu adenosinového receptoru A₂ měla sklon stoupat s objemem skupiny v poloze 8. Zdá se, že v případě afinity zde popsaných sloučenin k subtypu receptoru A₃ je tomu naopak. Substituenty Cl až C3 zřejmě «'·

♦ · «·	• *	·'♦' ·	• M
• · · ·	♦	9	«>
• · · · .«	ě		• 9	»
• «	'9 ».	• * · ·	«'·	•	• ··

vykazují ideální sterické a lipofilní charakteristiky pro interakci se subtypem receptorů A₃.

PŘÍKLAD 18

Vazebné experimenty s radioaktivně značenou sloučeninou.

Na různých liniích nádorových buněk se provedla řada vazebných experimentů za použití 0,5 nM [¹²⁵I]-ABMECA, přičemž nespecifické vazby se stanovily na buněčných membránách buněčných linií v přítomnosti 50 μΜ R-PIA nebo 200 μΜ NECA. Specifické vazby se určily odečtením nespecifických vazeb od veškerých vazeb. Buněčné linie byly HL 60, NB4, SKN-MC, SKNBe2C, SKN-SH a JURKAT. Výsledky vazebných experimentů ukazuje následující tabulka 2.

ft?

*$»

Tabulka 2

Buněčné linie	Veškeré vazby	Nespecifické vazby	Specifické vazby (cpm)	% specifické vazby
HL 60	3484	2791	693	20
NB4	3377	2740	637	19
SKN-MC	7528	6220	1308	17
SKN-Be2C	6000	..... 4 535 . .	......1415.....	.......24......-
SKN-SH	2671	2580	91	3
JURKAT	7599	4753	2846	38

Výsledky jsou ukázány v grafické podobě na obrázku 2.

Buněčné linie Jurkat zřejmě dávaly ze zkoušených buněčných linií nej lepší výsledky. Saturační pokus se prováděl s buněčnými liniemi JURKAT při 37 °C a inkubační době 1 hod., za použití [¹²⁵I]-ABMECA (0,125-1,5 ηΜ) , přičemž se nespecifická vazba měřila za pomoci RPIA (50 μΜ). Kd (nM) bylo 4 a Bmax (fmol/mg proteinu) bylo 290. I tyto výsledky jsou ukázány na obrázku 2.

Jiný pokus měl prokázat, zda je přítomen receptor Αχ. Vytěsňovací test se prováděl při 0 °C po dobu 150 minut na

buňkách JURKAT za použití [³H]DPCPX, a specifického antagonisty pro Al (0,5 nM) a nespecifická vazba se stanovila pomocí R-PIA (50 μΜ). Celková vazba byla 13208, ,h nespecifická vazba byla 2997 a specifická vazba byla 10211 (77 %). Pozorovala se tedy značná vazba na Αχ.

** Následující pokusy byly popsány poprvé: charakterizace receptorů A₃ v některých liniích lidských nádorových buněk

A jako HL60, promyelocytová lidská leukemie a Jurkat, lidská ς leukemie T-buněk, a to za použití zde popsaného nového selektivního antagonisty (sloučenina 102). Při těchto pokusech se membrány (0,5 mg proteinu/ml) z buněk Jurkat a HL60 inkubovaly v 10-12 různých koncentracích sloučeniny 102 v rozmezí od 0,2 do 15 nM pro buňky Jurkat a 0,1 do 10 nM ;pro buňky HL60. Obrázek 3 ukazuje saturační křivku vazby sloučeniny 102 na adenosinové receptory A₃ v buněčných membránách Jurkat a linearita vloženého Scatchardova diagramu dokazuje přítomnost jediné třídy vazebných míst s hodnotou Kd 1,9 ± 0,2 nM a hodnotou Bmax 1,30 ± 0,03 fmol/mg proteinu (n=3). Obrázek 4 ukazuje saturační křivku vazby sloučeniny 102 na adenosinové receptory A₃ v buněčných membránách HL 60 a linearita vloženého Scatchardova diagramu dokazuje přítomnost jediné třídy vazebných míst s hodnotou Kd 1,2 ± 0,1 nM a hodnotou Bmax 626 ± 42 fmol/mg proteinu (n=3).

* Tyto výsledky dokazují, že mnohé buněčné linie obsahují relativně velké množství adenosinových receptorů. Protože je známo, že sloučenina 102 se váže na receptory A₃ s velkou afinitou a selektivitou, je pravděpodobné, že v nádorových buňkách je výskyt receptorů A₃ poměrně značný.

PŘÍKLAD 19

Farmaceutické formulace (A) Transdermální systém - pro 1000 náplastí

Složky	Množství
Aktivní sloučenina	100 g
Silikonová kapalina	450 g
Koloidní oxid křemičitý	2g

(B) Tablety pro orální aplikaci - pro 1000 tablet

Složky	Množství
Aktivní sloučenina	.50 g
Škrob	50 g
Stearát hořečnatý	5 g

Aktivní sloučenina a škrob se granulují ve směsi s vodou a usuší. K vysušeným granulím se přidá stearát hořečnatý a směs se dobře smíchá. Promíchaná směs se lisuje do . tablet._ ............ ........................ ...................

(C) Injekce - pro 1000 ampulí po 1 ml.

í i£

Složky	Množství
Aktivní sloučenina	10 g
Pufry	Potřebné množství
Propylenglykol	400 mg
Voda pro injekce	Potřebné množství do 1000 ml

Aktivní sloučenina a pufry se rozpustí v propylenglykolu při asi 50 °C. Voda pro injekce se za míchání přidá a výsledný roztok se sfiltruje, plní do ampulí, uzavře a sterilizuje v autoklávu.

i (D) Kontinuální injekce - pro 1000 ml

Složky	Množství
Aktivní sloučenina	10 g
Pufry	Potřebné množství
Voda pro injekce	Potřebné množství do 1000 ml

Odborníkům je zřejmé, že i při pouhé rutinní experimentální práci mohou nalézt mnoho provedení rovnocenných se zde popsanými provedeními vynálezu. Taková provedení považujeme za pokrytá následujícími nároky.

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY t&

V r*

7, kde

A je imidazol, pyrazol nebo triazol:

R je -C(X)Ri, -C(X)-N(Ri)₂, C(X)OR_lz -C(X)SR_1z -SO_nRi,

-SO_nOR_lř -SO_nSRi nebo SO_n-N(R!)₂;

Ri je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, alkenyl, substituovaný alkenyl, alkinyl, substituovaný alkinyl, aryl, heteroaryl, heterocyklický zbytek, nižší alkenyl, nižší alkanoyl, nebo je-li Ri vázán na dusík, tvoří spolu s dusíkovým atomem azetidinový kruh nebo 5- nebo 6členný heterocyklický kruh obsahující jeden nebo více heteroatomů jako je N, 0, S;

4 R2 je vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aralkyl, substituovaný aralkyl, heteroaryl, substituovaný heteroaryl nebo aryl;

R3 je furan, pyrrol, thiofen, benzofuran, benzopyrrol, benzothiofen, přičemž tytyo zbytky jsou popřípadě substituovány jedním nebo více substituenty vybranými ze skupiny, kterou tvoří hydroxyl, acyl, popřípadě substituovaný alkyl, alkoxy, alkenyl nebo. alkinyl, amino, substituovaný amino, aminoacyl, acyloxy, acylamino, alkaryl, aryl, aryloxy, azido, karboxyl, karboxylalkyl, kyano, halogen, nitro, heteroaryl, heteroaryloxy, heterocyklus, heterocykloxy, aminoacyloxy, oxyacylamino, thioalkoxy, substituovaný thioalkoxy, thioaryloxy, thioheteroaryloxy, -SO-alkyl, -SO-substituovaný alkyl, -SO-aryl, -SOheteroaryl, -S0₂-alkyl, S0₂-substituovaný alkyl, -S0₂-aryl, -S0₂-heteroaryl a trihalogcnmcthyl;' i/ X je 0, S nebo NR¹;

' n je 1 nebo 2;

u a její farmaceuticky přijatelné soli.

<

í
2. Sloučenina podle nároku 1, kde význam R je zvolen ze skupiny, kterou tvoří močoviny, amidy, thiomočoviny, thioamidy a sulfonamidy.
3. Sloučenina podle nároku 1, Ri znamená vodík, alkyl, alkenyl nebo aryl.
4. Sloučenina podle nároku 1, kde R₂ znamená vodík, alkyl, alkenyl nebo aryl.

5. Sloučenina podle nároku 1, kde r₃ je f.uran. 6. Sloučenina podle nároku 1, kde X je kyslík. 7 . Sloučenina podle nároku 1, kde A je triazolový kruh 8. Sloučenina podle nároku 1, kde A je pyrazolový kruh
9. Použití sloučeniny podle nároku 1 k výrobě léčiva k léčbě hypertenze, zánětů, alergických reakcí, degranulace žírných buněk, nádorů a srdeční hypoxie, a k prevenci mozkové ischémie.
10. Použití podle nároku 9 sloučeniny, kde význam R je zvolen ze skupiny, kterou tvoří močoviny, amidy, thiomočoviny, thioamidy a sulfonamidy.
11. Použití podle nároku 9 sloučeniny, kde Ri znamená vodík, alkyl, alkenyl nebo aryl.
12. Použití podle nároku 9 sloučeniny, kde R₂ znamená vodík, alkyl, alkenyl nebo aryl.
13. Použití podle nároku 9 sloučeniny, kde X je kyslík.
14. Použití podle nároku 9 sloučeniny, kde A znamená pyrazolový kruh.
15. Použití podle nároku 9 sloučeniny, kde A znamená triazolový kruh.
16. Použití podle nároku 9 pro léčbu srdeční hypoxie a mozkové ischémie.

···· ·*
17. Způsob stanovení přítomnosti nádorových buněk s vysokou koncentrací adenosinových receptorů A₃ v buněčném vzorku, vyznačující se tím, že:

a) se připraví buněčná suspenze v kultivačním médiu,

b) k buňkám se přidá sloučenina podle nároku 1 obsahující indikátor, který lze po navázání sloučeniny na nádorové buňky detekovat;

c) vyčká se vazby sloučeniny na nádorové buňky a

d) detekuje se indikátor.