CN111004245B

CN111004245B - 吡唑-嘧啶并咪唑类化合物、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN111004245B
Application number: CN201911269082.9A
Authority: CN
Inventors: 郑友广; 孟龙; 裴鑫; 姜萍; 张务奇; 安琳; 黄统辉
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2022-01-07
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: CN111004245A

Abstract

本发明涉及一种吡唑‑嘧啶并咪唑类化合物、制备方法及其应用，属于药物化学和药物治疗学领域。本发明提供的式I所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备与肿瘤有关疾病的药物方面的应用。

Description

吡唑-嘧啶并咪唑类化合物、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一种吡唑-嘧啶并咪唑类化合物。本发明还涉及该类化合物的制备方法以及含有它们的药物组合。

背景技术

众所周知，目前肿瘤是发病率与死亡率极高的疾病之一，常用的治疗方式主要有手术切除、化疗、放疗以及一些综合措施。但是这些治疗方式无疑会对病人愈后的生活质量造成或多或少的影响。手术切除不能防止肿瘤的复发和转移；放射性治疗虽能根治多种肿瘤，也存在一定局限性，如治疗周期长；化疗作为一种全身性治疗方法，能够较大程度杀死患者体内的肿瘤细胞，但选择性差，以致产生全身副作用限制了其临床应用，因此提高化疗药的疗效对于肿瘤治疗意义重大。

市场上已经有许多抗肿瘤药物面市，给癌症患者带来了福音，但是，时至今日恶性肿瘤仍是难以克服的重大疾病。在我国，肿瘤发病率逐年攀升，以每年10％的速度增长，每一分钟就有6人被诊断为恶性肿瘤，5人死于癌症。而且，值得关注的是我国癌症发病人数约占世界发病的五分之一；癌症死亡人数约占全球总数的四分之一。我国最常见的癌症为肝癌(2014年发病人数为65.3万)、胃癌(40.5万)、肝癌(39.5万)及结肠直肠癌(25.3万)，另外乳腺癌仅在女性群体中发病人数就超过18.7万人。

综上所述，临床上虽有多种抗肿瘤药物，但由于抗肿瘤药物存在缺陷，如易产生耐药性、副作用大等，现有药物仍然不能满足治疗的需要，急需新型抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种吡唑-嘧啶并咪唑类化合物，对人慢性髓性白血病细胞K562和人结肠癌细胞HCT116抑制活性较好。

本发明的另一目的是提供一种上述化合物的制备方法。

本发明的第三目的是提供一种上述化合物在药物方面的用途。

本发明的技术方案如下：

式I所示的化合物、异构体，或其药学上可接受的盐，

其中，

R¹代表C₁-C₆烷基、取代C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、氰基、羟基、硝基或卤素，所述的取代C₁-C₆烷基可任意地由下述取代基单取代或多取代：羟基、硝基或卤素；

R²代表苯基、取代苯基、苯甲基、取代苯甲基、C₁-C₆烷基、取代C₁-C₆烷基、环丙基、取代环丙基、环丁基、取代环丁基、环戊基、取代环戊基、环己基或取代环己基，所述的取代苯基、取代苯甲基、取代C₁-C₆烷基、取代环丙基、取代环丁基、取代环戊基或取代环己基可任意地由下述取代基单取代或多取代：C₁-C₄烷氧基、氰基、羟基、硝基或卤素。

在一种优选方案中，R¹代表C₁-C₄烷基、取代C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、氰基、羟基、硝基、氟或溴，所述的取代C₁-C₄烷基可任意地由下述取代基单取代或多取代：羟基、硝基、氟、氯或溴。

在一种更优选方案中，R¹代表甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、氟、氯或溴。例如，R¹代表甲基、氟或溴。

在一种优选方案中，本发明提及的R²代表苯基、取代苯基、环丙基、取代环丙基、环戊基或取代环戊基，所述的取代苯基、取代环丙基或取代环戊基可任意地由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、氰基、羟基、硝基或氟、氯或溴。

在一种更优选方案中，R²代表苯基、取代苯基、环丙基、环戊基，所述的取代苯基可任意地由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、氰基、羟基、硝基、氟、氯或溴。

在一种特别更优选方案中，R²代表苯基或取代苯基，所述的取代苯基可任意地由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、硝基、氟、氯或溴。

进一步地，在通式I所述化合物或其药学上可接受的盐中，所述化合物选自下列化合物：

更进一步地，通式I所述化合物进一步选自下列化合物：

本发明公开了一种通式I所示化合物的制备方法，以4-硝基吡唑-3-甲酸和取代的2-氨基苯乙酮为原料，经酯化反应、氨解反应、酰胺脱水反应、还原、delepine反应等反应步骤得到目标化合物，具体合成路线如下：

本发明进一步公开了一种更具体的通式I所示化合物的制备方法：

本发明提及的中间体或目标化合物均可按照常规分离技术加以纯化，并且根据需要将其转化为与可药用酸的加成盐。

除非另外说明，在说明书和权利要求中使用的以下术语具有下面讨论的含义：

“药学上可接受的盐”表示保留母体化合物的生物有效性和性质的那些盐。这类盐包括：

(1)与酸成盐，通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸的反应而得，无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亚硫酸和高氯酸等，有机酸包括乙酸、三氟乙酸、丙酸、丙烯酸、己酸、环戊烷丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、富马酸、马来酸、抗坏血酸、樟脑酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、γ-羟基丁酸、甲氧基苯甲酸、邻苯二甲酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、肉桂酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、天冬氨酸、硬脂酸、扁桃酸、琥珀酸、戊二酸或丙二酸等。

(2)存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子代替或者与有机碱配位化合所生成的盐，金属例子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺、奎宁等。

“药物组合物”指将本发明中的化合物中的一个或多个或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药与别的化学成分，例如药学上可接受的载体，混合。药物组合物的目的是促进给药给动物的过程。

“药用载体”或“药学上可接受的载体”指的是对有机体不引起明显的刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的药物组合物中的非活性成分，例如但不限于：碳酸钙、磷酸钙、各种糖(例如乳糖、甘露醇等)、淀粉、环糊精、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、丙烯酸聚合物或甲基丙烯酸聚合物、凝胶、水、聚乙二醇、丙二醇、乙二醇、蓖麻油或氢化蓖麻油或多乙氧基氢化蓖麻油、芝麻油、玉米油、花生油等。

“烷基”表示1-20个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团(本申请书中提到的数字范围，例如“1-20”，是指该基团，此时为烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括20个碳原子)。更优选的是，烷基是有1-10个碳原子的中等大小的烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。最好是，烷基为有1-8或1-6个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的。当是取代的烷基时，该取代基优选是一或多个，更优选1-3个，最优选1或2个取代基。

“羟基”表示-OH基团。

“硝基”表示-NO₂基团。

“氰基”表示-CN基团。

“烷氧基”表示-O-(未取代的烷基)和-O-(未取代的环烷基)。代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。

“卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯。

“卤代烷基”表示卤素取代的烷基，优选如上所定义的卤素取代的低级烷基，它被一个或多个相同或不同的卤原子取代，例如-CH₂Cl、-CF₃、-CH₂CF₃、-CH₂CCl₃等。

本发明提供了一种药物组合物，它以本发明的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。

本发明提供的吡唑-嘧啶并咪唑类化合物，可应用于制备与肿瘤有关疾病的药物方面。

采用本发明的技术方案，优势如下:

本发明提供的吡唑-嘧啶并咪唑类化合物，对人慢性髓性白血病细胞K562和人结肠癌细胞HCT116具有良好的抑制活性，可应用于制备与肿瘤有关疾病的药物方面。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明的吡唑-嘧啶并咪唑类化合物作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

实施例1化合物1的合成

500mL三颈瓶中加入4-硝基吡唑-3-甲酸(20g,127mmol)，用300mL乙醇溶解，0℃下用恒压滴液漏斗缓慢滴加氯化亚砜(11mL,140mmol)，全程控制内温＜5℃，加毕，反应液升至室温搅拌20h。反应结束后，利用旋转蒸发仪蒸干溶剂，烘干得白色固体22.8g，收率97％，TLC(PE:EA＝1:1,1d乙酸v/v)。

实施例2化合物2的合成

250mL耐压瓶中加入化合物1(10g,54mmol)，用过量氨水150mL溶解，油浴锅升温至100℃回流5h。反应结束后，自然冷却至室温，析出白色固体，抽滤，得滤饼，滤液减压浓缩，共计得白色固体7.6g，收率91％，TLC(DCM:MeOH＝12:1,v/v)。

实施例3化合物3的合成

250mL茄形瓶中加入化合物2(15g,96mmol)，加入三氯氧磷150mL，油浴120℃回流反应8h。反应结束后，减压浓缩除去大部分的三氯氧磷，将残余物溶于300mL乙酸乙酯中，冰浴条件下，用2M NaOH溶液中和至弱碱性后，萃取，有机层依次用饱和NaHCO₃溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩得黄色粗品，柱层析分离纯化(PE:EA＝4:1)得到白色固体8.7g，收率65％，TLC(PE:EA＝2:1,v/v)。

实施例4化合物4的合成

在150mL茄形瓶中投入氯化亚锡二水合物₍45.13g,200mmol)，加入20mL浓盐酸溶解，室温搅拌下加入化合物3(5.52g,40mmol)，追加45mL乙酸乙酯，N₂保护，78℃回流反应0.5h。反应结束后，冰浴条件下，用6M NaOH溶液调PH至7，抽滤，滤液用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩得黄色固体3.8g，收率88％，TLC(PE:EA＝2:1,v/v)。

实施例5化合物5的合成

于500mL茄形瓶中，加入125mL蒸馏水和50mL DCM，充分搅拌下加入硫光气(2.04mL,26mmol)，化合物4(2.63g,24mmol)溶于75mL DCM后缓慢加至反应液中，加毕室温搅拌1h。反应结束后，静置分层，有机相依次用蒸馏水，饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩得黄色固体1.78g，收率48％，TLC(PE:EA＝2:1,v/v)。

实施例6化合物6a的合成

250mL茄形瓶中加入2-溴-4'-甲基苯乙酮(4.2g,20mmol)，用100mL氯仿溶解，然后加入六亚甲基四胺(3.08g,22mmol)，油浴升温至60℃搅拌5h后，冷却至室温，过滤，将收集的沉淀悬浮在100mL乙醇中，并加入10mL浓盐酸，油浴升温至85℃回流14h。反应结束后，抽滤，滤液减压浓缩，残余物以甲醇和乙酸乙酯(1:50,v/v)重结晶得白色固体2.5g，收率85％，TLC(DCM：MeOH＝10:1,v/v)。

实施例7化合物6b的合成

250mL茄形瓶中加入2-溴-4'-氟苯乙酮(4.3g,20mmol)，用100mL氯仿溶解，然后加入六亚甲基四胺(3.08g,22mmol)，油浴升温至60℃搅拌5h后，冷却至室温，过滤，将收集的沉淀悬浮在100mL乙醇中，并加入10mL浓盐酸，油浴升温至85℃回流14h。反应结束后，抽滤，滤液减压浓缩，残余物以甲醇和乙酸乙酯(1:50,v/v)重结晶得淡绿色固体2.2g，收率73％，TLC(DCM：MeOH＝10:1,v/v)。

实施例8化合物6c的合成

250mL茄形瓶中加入2,4'-二溴苯乙酮(5.5g,20mmol)，用100mL氯仿溶解，然后加入六亚甲基四胺(3.08g,22mmol)，油浴升温至60℃搅拌5h后，冷却至室温，过滤，将收集的沉淀悬浮在100mL乙醇中，并加入10mL浓盐酸，油浴升温至85℃回流14h。反应结束后，抽滤，滤液减压浓缩，残余物以甲醇和乙酸乙酯(1:50,v/v)重结晶得淡黄色固体2.9g，收率69％，TLC(DCM：MeOH＝10:1,v/v)。

实施例9化合物7a的合成

150mL茄形瓶中，将化合物5(0.69g,4.6mmol)和化合物6a(0.75g,5.06mmol)悬浮在50mL DCM中，加入9mL的1M碳酸钠溶液，加毕，室温搅拌10min后油浴升温至45℃搅拌1h，然后冷却抽滤，滤饼转移至100mL的耐压管，悬浮于50mL的乙醇中，加热模块升温至88℃回流12h。反应结束后，冷却，抽滤得白色固体0.68g，收率52％，TLC(PE：EA＝1:1,v/v)。

实施例10化合物7b的合成

150mL茄形瓶中，将化合物5(0.6g,4mmol)和化合物6b(0.83g,4.4mmol)悬浮在40mL DCM中，加入8mL的1M碳酸钠溶液，加毕，室温搅拌10min后油浴升温至45℃搅拌1h，然后冷却抽滤，滤饼转移至100mL的耐压管，悬浮于40mL的乙醇中，加热模块升温至88℃回流12h。反应结束后，冷却，抽滤得白色固体0.65g，收率57％，TLC(PE：EA＝1:1,v/v)。

实施例11化合物7c的合成

150mL茄形瓶中，将化合物5(0.6g,4mmol)和化合物6c(0.93g,4.4mmol)悬浮在40mL DCM中，加入8mL的1M碳酸钠溶液，加毕，室温搅拌10min后油浴升温至45℃搅拌1h，然后冷却抽滤，滤饼转移至100mL的耐压管，悬浮于40mL的乙醇中，加热模块升温至88℃回流12h。反应结束后，冷却，抽滤得淡黄色固体0.8g，收率58％，TLC(PE：EA＝1:1,v/v)。

实施例12化合物8a的合成

50mL茄形瓶中，将化合物7a(0.37g,1.3mmol)悬浮于8mL POCl₃中并加入0.8mLDMF，N₂保护，油浴升温至70℃搅拌2h。反应结束后，减压浓缩除去三氯氧磷，将残余物溶于100mL乙酸乙酯中，冰浴条件下，用饱和碳酸氢钠溶液中和至弱碱性后，萃取，有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩得黄色粗品，柱层析分离纯化(PE:EA＝2:1)得到白色固体0.2g，收率53％，TLC(PE:EA＝1:1,v/v)。

实施例13化合物8b的合成

50mL茄形瓶中，将化合物7b(0.57g,2mmol)悬浮于12mL POCl₃中并加入1.2mLDMF，N₂保护，油浴升温至70℃搅拌2h。反应结束后，减压浓缩除去三氯氧磷，将残余物溶于150mL乙酸乙酯中，冰浴条件下，用饱和碳酸氢钠溶液中和至弱碱性后，萃取，有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩得黄色粗品，柱层析分离纯化(PE:EA＝2:1)得到淡黄色固体0.35g，收率61％，TLC(PE:EA＝1:1,v/v)。

实施例14化合物8c的合成

50mL茄形瓶中，将化合物7c(0.15g,0.4mmol)悬浮于3mL POCl₃中并加入0.3mLDMF，N₂保护，油浴升温至70℃搅拌1h。反应结束后，减压浓缩除去三氯氧磷，将残余物溶于50mL乙酸乙酯中，冰浴条件下，用饱和碳酸氢钠溶液中和至弱碱性后，萃取，有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩得黄色粗品，柱层析分离纯化(PE:EA＝2:1)得到类白色固体60mg，收率40％，TLC(PE:EA＝1:1,v/v)。

实施例15化合物M-1的合成

38mL耐压瓶中，投入化合物8a(0.14g,0.5mmol)和对甲氧基苯胺(0.092g,0.75mmol)，再加入5mL正丁醇，加热模块升温至130℃搅拌3h。反应结束后，冷却，抽滤，滤饼用蒸馏水超声洗涤三次后再抽滤，滤饼用乙醇重结晶得白色固体85mg，收率46％，TLC(DCM:MeOH＝60:1,v/v)。mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.03(s,1H),8.74(s,1H),7.98(s,1H),7.83(d,J＝8.1Hz,2H),7.63(d,J＝9.0Hz,2H),7.29(d,J＝8.0Hz,2H),6.96(d,J＝9.0Hz,2H),3.74(s,3H),2.33(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ156.00(s),142.87(s),140.53(s),137.79(s),132.59(s),130.92(s),130.06(s),128.57(s),126.01(s),125.74(s),123.74(s),114.44(s),107.50(s),55.77(s),21.36(s)；HR-MS(m/z)calculated forC₂₁H₁₈N₆O[M+H]⁺:371.1620,found:371.1612.

实施例16化合物M-2的合成

合成方法参照实施例15。

mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.45(s,1H),8.80(s,1H),8.11–8.08(m,2H),7.84(d,J＝8.1Hz,2H),7.78(dd,J₁＝8.0,J₂＝5.2Hz,1H),7.43(t,J＝9.1Hz,1H),7.29(d,J＝8.0Hz,2H),2.33(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ153.50(d,J＝242.2Hz),,142.14(s),139.44(s),138.17(s),137.19(s),131.49(s),130.10(s),125.85(s),122.42(s),121.38(d,J＝6.8Hz),119.52(d,J＝18.4Hz),117.19(s),108.00(s),21.41(s)；HR-MS(m/z)calculated for C₂₀H₁₄ClFN₆[M+H]⁺:393.1031,found:393.1024.

实施例17化合物M-3的合成

38mL耐压瓶中，投入化合物8a(0.28mg,1mmol)和环丙胺(0.2mL,2mmol)，再加入10mL正丁醇，加热模块升温至130℃搅拌8h。反应结束后，减压浓缩，残余物用乙酸乙酯稀释后，依次用饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩得棕红色粗品，柱层析分离纯化(PE:EA＝2:1)得到白色固体0.16g，收率48％，TLC(PE:EA＝1:1,v/v)。mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.42(d,J＝16Hz,1H),8.12(s,1H),7.89(s,1H),7.76(d,J＝7.9Hz,2H),7.48(d,J＝20Hz,1H),7.26(d,J＝6.3Hz,2H),2.87(s,1H),2.31(s,3H),0.85–0.70(m,2H),0.67–0.53(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ143.60(s),137.74(s),133.53(s),132.74(s),125.80(s),120.69(s),107.23(s),106.78(s),24.75(s),21.37(s),6.93(s)；HR-MS(m/z)calculated for C₁₇H₁₆N₆[M+H]⁺:305.1515,found:305.1510.

实施例18化合物M-4的合成

合成方法参照实施例17。

mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.61(s,1H),8.13–7.86(m,1H),7.84–7.71(m,2H),7.36–7.15(m,2H),7.00(s,1H),4.36(s,1H),2.31(s,3H),2.13–1.87(m,2H),1.84–1.67(m,2H),1.67–1.41(m,4H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ142.56(s),137.53(s),132.61(s),131.23(s),129.96(s),125.67(s),120.35(s),107.12(s),53.48(s),32.74(s),24.15(s),21.37(s)；HR-MS(m/z)calculated for C₁₉H₂₀N₆[M+H]⁺:333.1828,found:333.1821.

实施例19化合物M-5的合成

合成方法参照实施例15。

mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.30(s,1H),9.23(s,1H),8.26(s,1H),8.24(s,2H),8.18(dd,J₁＝9.6,J₂＝2.2Hz,2H),7.85(d,J＝8.0Hz,2H),7.29(d,J＝8.0Hz,2H),2.32(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ146.57(s),141.99(s),138.70(s),138.48(s),138.30(s),131.64(s),130.15(s),128.64(s),125.96(s),125.29(s),119.73(s),109.39(s),21.43(s)；HR-MS(m/z)calculated for C₂₀H₁₅N₇O₂[M+H]⁺:386.1365,found:386.1359.

实施例20化合物F-1的合成

合成方法参照实施例15。

mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.04(s,1H),8.76(s,1H),7.98–7.94(m,2H),7.64–7.61(m,2H),7.32(t,J＝8.9Hz,2H),6.97–6.95(m,2H),3.74(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ162.39(d,J＝244.5Hz),156.01(s),142.03(s),140.40(s),132.57(s),130.43(d,J＝2.8Hz),127.77(d,J＝8.0Hz),123.77(s),116.43(d,J＝21.6Hz),114.43(s),107.82(s),55.76(s),48.96(s)；HR-MS(m/z)calculated for C₂₀H₁₅FN₆O[M+H]⁺:375.1370,found:375.1364.

实施例21化合物F-2的合成

合成方法参照实施例15。

mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.59(s,1H),8.96(s,1H),8.17–8.09(m,2H),8.02–7.91(m,2H),7.80(ddd,J₁＝9.0Hz,J₂＝4.2Hz,J₃＝2.7Hz,1H),7.56–7.35(m,2H),7.35–7.26(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ162.53(d,J＝244.9Hz),153.51(d,J＝242.1Hz),141.02(s),139.47(s),138.91(s),137.17(d,J＝2.2Hz),131.51(s),129.50(s),128.62(s),127.91(d,J＝8.3Hz),121.42(d,J＝6.8Hz),119.52(d,J＝18.4Hz),117.29(d,J＝21.8Hz),116.51(d,J＝21.6Hz),108.55(s)；HR-MS(m/z)calculated forC₁₉H₁₁ClF₂N₆[M+H]⁺:397.0780,found:397.0774.

实施例22化合物F-3的合成

合成方法参照实施例17。

mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.44(d,J＝19.2Hz,1H),8.12(s,1H),7.91(s,1H),7.88(d,J＝8.6Hz,2H),7.48(d,J＝19.9Hz,1H),7.29(dd,J₁＝15.8,J₂＝8.7Hz,2H),2.93–2.81(m,1H),0.84–0.73(m,2H),0.66–0.56(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ162.35(d,J＝244.4Hz),143.59(s),133.61(s),132.74(s),130.49(d,J＝14.6Hz),127.72(d,J＝8.0Hz),120.73(s),116.42(d,J＝21.4Hz),107.61(s),107.12(s),24.75(s),6.94(s)；HR-MS(m/z)calculated for C₁₆H₁₃FN₆[M+H]⁺:309.1264,found:309.1256.

实施例23化合物F-4的合成

合成方法参照实施例17。

mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.69–8.54(m,1H),8.05(d,J＝1.6Hz,1H),7.91(dd,J₁＝8.2Hz,J₂＝5.7Hz,2H),7.83(d,J＝1.5Hz,1H),7.38–7.22(m,2H),6.99(dd,J₁＝20.7Hz,J₂＝6.5Hz,1H),4.45–4.27(m,1H),2.11–1.94(m,2H),1.81–1.69(m,2H),1.66–1.49(m,4H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ162.34(d,J＝244.6Hz),142.69(s),141.90(s),129.97(s),127.75(d,J＝7.8Hz),116.30(d,J＝21.6Hz),107.59(s),53.50(s),32.62(s),24.01(s)；HR-MS(m/z)calculated for C₁₈H₁₇FN₆[M+H]⁺:337.1577,found:337.1570.

实施例24化合物F-5的合成

合成方法参照实施例15。

mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.93(s,1H),8.85(s,1H),8.31–8.22(m,2H),8.18(s,1H),8.06(d,J＝7.9Hz,2H),7.99(d,J＝5.5Hz,2H),7.33(t,J＝7.7Hz,2H)；HR-MS(m/z)calculated for C₁₉H₁₂FN₇O₂[M+H]⁺:390.1115,found:390.1108.

实施例25化合物B-1的合成

合成方法参照实施例15。

mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.65(s,1H),9.26(s,1H),8.07(s,1H),7.88(d,J＝8.5Hz,2H),7.76–7.63(m,4H),6.97(d,J＝9.0Hz,2H),3.74(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ156.43(s),140.67(s),138.94(s),132.59(s),131.85(s),131.50(s),131.25(s),129.10(s),127.87(s),124.19(s),122.05(s),114.52(s),110.02(s),55.81(s)；HR-MS(m/z)calculated for C₂₀H₁₅BrN₆O[M+H]⁺:435.0569,found:435.0564.

实施例26化合物B-2的合成

合成方法参照实施例15。

mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.49(s,1H),8.94(s,1H),8.11–8.07(m,2H),7.89(s,1H),7.87(s,1H),7.81–7.74(m,1H),7.68(d,J＝8.4Hz,2H),7.43(t,J＝9.1Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ153.51(d,J＝246.3Hz),140.86(s),139.38(s),138.99(s),137.15(d,J＝2.9Hz),132.46(s),132.26(s),131.49(s),127.79(s),122.38(s),121.66(s),121.33(d,J＝6.8Hz),119.51(d,J＝18.5Hz),117.25(d,J＝21.7Hz),109.14(s)；HR-MS(m/z)calculated for C₁₉H₁₁BrClFN₆[M+H]⁺:456.9979,found:456.9974.

实施例27化合物B-3的合成

合成方法参照实施例17。

mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.52(d,J＝16.5Hz,1H),8.12(s,1H),7.89(s,1H),7.86–7.76(m,2H),7.72–7.58(m,2H),7.48(d,J＝20Hz,1H),2.96–2.78(m,1H),0.86–0.69(m,2H),0.67–0.55(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ143.57(s),133.19(s),132.42(s),127.67(s),121.24(s),108.25(s),107.80(s),24.76(s),6.93(s)；HR-MS(m/z)calculated for C₁₆H₁₃BrN₆[M+H]⁺:369.0463,found:369.0460.

实施例28化合物B-4的合成

合成方法参照实施例17。

mp＞240℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.69(s,1H),7.94(s,1H),7.86–7.80(m,2H),7.70–7.63(m,2H),7.01(d,J＝6.4Hz,1H),4.50–4.23(m,1H),2.07–1.95(m,2H),1.79–1.68(m,2H),1.64–1.54(m,4H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ142.51(s),141.59(s),133.23(s),132.41(s),127.67(s),121.19(s),108.24(s),53.51(s),32.73(s),24.14(s)；HR-MS(m/z)calculated for C₁₈H₁₇BrN₆[M+H]⁺:397.0776,found:397.0773.

实施例29下面是本发明的代表化合物的部分药理试验及结果：

1、检测化合物针对人肿瘤细胞体外增殖的影响

1.1实验方法

实验方法：

1)将细胞消化、计数，配制细胞悬液3.5×104个/ml，96孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞悬液；

2)96孔细胞培养板置于37℃，5％，CO₂培养箱中培养24小时；

3)用培养基稀释药物至所需工作液浓度，每孔加入100μl相应的含药培养基，同时设立阴性对照组；

4)96孔细胞培养板置于37℃，5％，CO₂培养箱中培养72小时；

5)将96孔板进行CCK-8染色，λ＝450nm，测定OD值；

a)每孔加入10μl CCK-8，在培养箱继续培养2-3小时；

b)摇床10分钟轻轻地混匀，去除96孔板中气泡；

c)λ＝450nm，酶标仪读出每孔的OD值，计算抑制率。

6)计算各组别抑制率。

样品浓度：10μM。根据抑制率，采用LOGIT法计算半数抑制浓度IC50。实验重复3次以上，数据表示为Mean±SD。

1.2数据处理

所有数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，使用SPSS 16.0软件进行统计分析。多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)。假设检验水准按α＝0.05判定，P<0.05表示差异有统计学意义。

1.3结果与讨论

在检测化合物对人肿瘤细胞体外增殖的影响实验中，选用人慢性髓性白血病细胞K562和人结肠癌细胞HCT116两种细胞进行活性检测，将处于对数期生长的癌细胞，接于96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，培养24h后，给药，设定给药浓度为10μM，在药物作用72h后，进行CCK-8染色，测定OD值，计算抑制率。结果如表1所示。

表1目标化合物对K562和HCT116的单浓度抑制率

由表1可知：化合物浓度在10μM条件下对K562肿瘤细胞和HCT116肿瘤细胞增殖抑制作用表现出一定的选择性，对HCT116细胞的抑制活性多数不太理想，与阳性对照药相差较大，而对K562细胞株的抑制活性相对较好。与阳性对照药AT9283相比，化合物M-2对K562细胞表现出显著的细胞增殖抑制作用，10μM浓度下的抑制率为83.94％，超过阳性对照药AT9283(80.53％)。而化合物M-5、F-1、F-2、B-2对K562细胞同样表现出较好的抑制活性，10μM浓度下的抑制率分别为61.34％、60.43％、48.33％和58.97％。

选取对K562细胞单浓度抑制率较高的化合物M-2、M-5、F-1、F-2、B-2测定其对肿瘤细胞生长的半数抑制浓度(IC₅₀)，每个药物浓度设置3个复孔，测试结果如表2所示。

表2化合物对K562的抑制活性

由表2可知：所测化合物对K562细胞具有较好的细胞增殖抑制活性，其IC₅₀值在5.597-11.724μM范围内，其中化合物M-2对K562细胞的抑制活性最好，IC₅₀＝5.597±0.020μM。化合物B-2的抑制活性也比较可观，IC₅₀＝8.081±0.010μM。

2、Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞凋亡

1)将对数生长期的细胞消化接种到六孔板中，次日，待细胞贴壁后，根据组别设置加入相应的含药培养基，同时设立阴性对照组(不加药物，只加DMSO)；药物作用72h后，用0.25％胰酶(不含EDTA)消化收集细胞；用PBS洗涤细胞二次(离心1000rpm，5min)收集5×10⁵细胞；

2)加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；

3)加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀；

4)室温、避光、反应5-15min；用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。

结果表3所示。

表3

由表3可知：化合物M-2在10μmmol时，可诱导细胞凋亡。其他化合物如M-1、M-5、F-1、F-2、和B-2等也具有类似的实验效果。

3、PI单染法检测细胞周期

1)将对数生长期的细胞消化接种到六孔板中，次日，待细胞贴壁后，根据组别加药；

2)作用72h后，用0.25％胰酶(不含EDTA)消化收集细胞；

3)用PBS洗涤细胞二次(离心1000rpm，5min)收集5×105细胞；

4)制备的单细胞悬液用体积分数为70％乙醇固定2小时(或过夜)，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液(如需要，细胞悬液用200目筛网过滤一次)；

5)加100μL RNase A 37℃水浴30min；

6)再加入400μL PI染色混匀，4℃避光30min；

7)上机检测，记录激发波长488nm处红色荧光。

结果表4所示。

表4

由表4可知：随着化合物M-2浓度的增加，细胞有丝分裂被阻滞在S期。其他化合物如M-1、M-5、F-1、F-2、和B-2等也具有类似的实验效果。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，

2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R¹代表C₁-C₄烷基、取代C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、氰基、羟基、硝基、氟或溴，所述的取代C₁-C₄烷基可任意地由下述取代基单取代或多取代：羟基、硝基、氟、氯或溴。

3.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R¹代表甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、氟、氯或溴。

4.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R²代表苯基、取代苯基、环丙基、取代环丙基、环戊基或取代环戊基，所述的取代苯基、取代环丙基或取代环戊基可任意地由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、氰基、羟基、硝基或氟、氯或溴。

5.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R²代表苯基、取代苯基、环丙基、环戊基，所述的取代苯基可任意地由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、氰基、羟基、硝基、氟、氯或溴。

6.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R²代表苯基或取代苯基，所述的取代苯基可任意地由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、硝基、氟、氯或溴。

7.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中述化合物选自：

8.根据权利要求7所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中述化合物选自：

9.一种如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，

10.一种药物组合物，它以权利要求1、2、3、4、5、6、7或8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。

11.权利要求1、2、3、4、5、6、7或8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备与肿瘤有关疾病的药物方面的应用。