RO114906B1 - Procedeu pentru producerea vaccinului virus varicela zoster (vzv) atenuat - Google Patents

Description

Prezenta Invenție se referă la un procedeu pentru prepararea unui vaccin de varicela zoster (VZV) atenuat,, utilizat în medicina umană.

Este cunoscut că virusul varicela zoster (VZV) produce vărsatul de vânt (varicelă) și zoster (zona zoster). Vărsatul de vânt este o boală puternic contagioasă care se întâlnește la persoane fără imunitate VZV. Mai mult de 90% din populație este expusă în timpul primelor două decade ale vieții. Boala este o amenințare severă pentru imunosupresanți și pentru adulți. în numeroase cazuri, VZV devine latent în celulele rădăcinii ganglionilor dorsali. Zonele zoster, o condiție de suferință cronică, se întâlnesc când VZV se reactivează din starea latentă.

Prevenirea, prin vaccinare, a vărsatului de vânt este un obiectiv dorit și are în vedere vaccinarea universală în copilărie cu un vaccin viu de varicela atenuat.

Din materialul din literatura de specialitate se cunoaște utilizarea de sucroză sau oricare dizaharid în obținerea vaccinului pentru tratarea varicelei. Astfel, celulele dezagregate sunt centrifugate la 400 r.p.m. timp de 15 minnute, iar supernatantul este utilizat ca vaccin după adăugarea de 5% zahăr, ca stabilizator.

în stadiul tehnicii este prezentat un procedeu de propagare a VZV în sisteme diverse de cultură celulară și folosirea drept vaccin viu atenuat a culturii libere VZV.

în literatura de specialitate se descrie producerea în celule embrionare primare de cobai a tulpinii Oka atenuată de VZV, corespunzătoare folosirii ca vaccin. Se cunosște, de asemenea, cultivarea unui mutant VZV sensibil la temperatură în celule WI-38 pentru folosire ca un vaccin stabilizat. Sunt cunoscute compoziții folositoare pentru menținerea de VZV viabil în diferite medii, precum SPGA.

Procedeul pentru prepararea vaccinului de varicela zoster (VZV) atenuat, în conformitate cu prezenta invenție, cuprinde următoarele etape: (a) cultivarea celulelor susceptibile de infecție VZV până la confluență și atingerea unui înalt grad de replicare celulară; (b) infectarea celulelor cultivate conform etapei (a) cât mai aproape posibil de punctul de confluență cu celulele infectate VZV având o multiplicitate a infecției practic cât mai ridicată; (c) menținerea culturii infectate VZV într-o stare de nutriție ridicată, timp de aproximativ 22..96 h și recoltarea la punctul de vârf al producției VZV infectat; (d) spălarea culturii infectate VZV cu o soluție fiziologică, eventual suplimentată cu un agent lizozomotropic; (e) recoltarea celulelor infectate prin îndepărtarea lichidului, adăugarea unui volum minim de stabilizare, raclarea și eliberarea chimică a celulelor și, opțional, congelarea celulelor eliberate infectate VZV la temperatura de -7D°C; (f) distrugerea celulelor infectate VZV până la eliberarea optimă de celule-asociat VZV și îndepărtarea resturilor celulare, pentru a asigura un preparat VZV lipsit de celule și (g) diluarea produsului din etapa (f) în stabilizator și introducerea produsului într-o unitate dizată pentru liofilizare și stocare la 4°C sau temperaturi mai joase, astfel încât în momentul utilizării ulterioare să fie disponibil nu mai puțin de circa 1000 PFU.

Celulele susceptibile de infecție VZV sunt MRC-5, WI-38 sau celule Vero.

Cultivarea celulelor cuprinde o fază de inițiere a culturii celulelor în EMBE, o fază de creștere a celulelor în mediul SRFE-2 suplimentat cu aproximativ 0,2 mg/ml lipide de soia, începând aproximativ la 3 zile de la inițierea culturii celulelor și o fază de preinfecție care cuprinde expunerea celulelor MRC-5 la 20...50 mM sucroză pentru aproximativ

24...96 h preinfecție. VZV atenuat este tulpina Oka a virusului varicela zoster iar temperatura de cultură este între aproximativ 30. ,.37°C. Cultivarea celulelor susceptibile la infecție VZV se face în cultură monostrat cu furnizarea unui dizaharid nemetabolizabil,

RO 114906 Bl care este sucroza la concentrație de 20...60 mM. MOI este aproximativ 1:25 și 1:625. Agentul lizozomotropic este clorură de amoniu între aproximativ 20...50 mM sau clorochină la aproximativ 230 mM, iar distrugerea celulelor infectate VZV eliberate se face prin omogenizare DOUNCE, peletarea resturilor și reținerea supernatantului, sc sonicarea peletelui și repeletare, iar în final combinarea și reținerea supernatantelor de la peletarea resturilor și repeletare.

Limitarea majoră pentru producerea unui vaccin VZV comercial este randamentul celule-libere-VZV din sistemele de cultură celulară cunoscute în domeniu. Randamentele de celule libere VZV sunt îmbunătățite prin aplicarea procedeului nou al acestei invenții, 55 printr-un factor de aproximativ 5...20 de ori.

Astfel, invenția de față este un procedeu de producere a unui vaccin viu atenuat, celule-libere-VZV cu un randament ridicat.

Metodele de cultură monostrat cunoscute în domeniu au de obicei, un randament de proximativ 80000 până la 160000 celule pe cm². 6C

Folosirea de culturi celulare monostrat pentru producerea de antigeni virali a fost limitată prin densitatea restrictivă, până la care aceste culturi monostrat pot fi crescute.

încercările de a crește densitățile culturii celulare au fost prin folosirea de vase de cultură prin perfuzie, utilizare pentru creșterea densităților de saturație până la aproximativ 1 x 106 celule pe cm². 6=

Invenția de față oderă un mijloc pentru creșterea randamentelor celulare, folosind în același timp sistemele de cultură celulară existente.

Această invenție asigură de asemenea un procedeu în care celulele atașate pot fi crescute la densități mult mai ridicate decât cele care au fost până acum posibile, permițând astfel randamente mai mari de virusuri cultivate pe monostraturi celulare 7o pentru producerea de vaccin.

Se dau în continuare 20 exemple de realizare în legătură cu fig. 1...5 care reprezintă:

-fig. 1, randament PFU VZV în mediu suplimentat cu sucroză;

-fig. 2, randamente antigen celule-libere-VZV 7 =

-fig. 3, stabilitatea VZV în stabilizator SPGA la -20°C sau 4°C;

-fig. 4, randamente PFU VZV atinse folosind diferite medii de cultură;

-fig. 5, efectul furnizării celule-asociate MOI asupra randamentelor celule-libere VZV.

Deci, acestă invenție se referă la o metodă de creștere a celulelor în cultură sc monostrat. Obiectul invenției este atingerea densității celulare crescute a culturii de celule atașate. Acest obiect este realizat prin utilizarea unui mediu de creștere îmbogățit, suplimentat cu o lipidă, la concentrații optimizate. Prin creșterea culturilor monostrat, conform aceste invenții, în noua compoziție de mediu-lipid a acestei invenții se permit creșteri substanțiale ale randamentelor de producere a unităților virale formatoare de 8 = plăci (PFU) sau de antigen viral. Astfel, prin aplicarea procedeului de cultură celulară al acestei invenții beneficiază virusul hepatitei A, virusul varicela zoster, virusul rubeolei, rotavirusul, virusul pojarului, virusul poliomielitei, virusul hionului și alte vaccinuri virale.

Un mediu preferat îmbogățit pentru utilizare în acest procedeu este SRFE-2 (care este cunoscut în domeniu). Alte medii echivalente sau cu modificări ușoare în compoziția 90 SRFE-2, sunt folosite în același mod cum s-a descris, și sunt extinderi ale acestei invenții.

RO 114906 Bl în avantajul acestei invenții pot fi folosite oricare dintre numeroasele suplimente lipidice cunoscute în domeniu. De exemplu, lipide bogate în colesterol, din ser de la bovine adulte, EX-CYTE lipid I sau lipid Endotoxină Very Low (VLE) care s-a găsit a fi benefice ca suplimente pentru îmbogățirea mediului. Un aditiv lipidic preferat este extractul lipidic de soia, disponibil în comerț. Acest material sau un material similar, este descris în literatura de specialitate ca un înlocuitor pentru ser, într-o cultură de limfocite B. Nu se face nici o sugestie aici și nu există nici o sugestie în literatură că suplimentul lipidic de soia ar fi util pentru suplimentarea unui mediu îmbogățit. Conform acestor surse, se intenționează folosirea lipidului ca un înlocuitor de ser în culturi în mediu minimal. Așa cum s-a folosit în această invenție, lipidul este un supliment în mediu îmbogățit. în plus, conform surselor publicate, lipidul este folosit la o concentrație de aproximativ 10...100 pg/ml. Conform invenției de față, lipidul este folosit optim la o concentrație care este de 2...3 ori mai mare decât concentrațiile sugerate în literatură sau de către fabricanți. Mai mult decât atât, așa cum se folosește în acestă invenție, suplimentul lipidic poate fi folosit mai degrabă în plus la, decât în locul suplimentului de ser.

în procedeul aceste invenții, într-un vas de cultură sunt însămânțate celule MCR-5, celule WI-38, celule Vero sau alte tipuri de celule utile pentru propagarea virusului.

Faza inițială de creștere celulară este condusă fie într-un mediu minimal cunoscut în domeniu cum ar fi EMEM sau EBME, sau într-un mediu îmbogățit cum ar fi mediul SRFE-2 fără suplimentare lipidică. De asemenea, în mod avantajos, se poate furniza aproximativ 10% ser fetal de vițel (FCS) un antibiotic precum neomicina (este adecvat în jur de 50 pg/ml) și L-glutamină (aproape 2 mM). Celulele sunt crescute la o temperatură permisivă pentru celulă și virus, de obicei în jur de 34...37°C și de preferință, la aproximativ 35°C, în funcție de virusul ce urmează a fi produs timp de câteva zile.

După ce s-au atașat clar celulele, și sunt viguroase în cultura monostrat, mediul minimal sau mediul îmbogățit se îndepărtează și se înlocuiește cu mediu îmbogățit proaspăt suplimentat cu o concentrație optimizată de lipid.

După o perioadă de creștere ulterioară, mediul poate fi din nou îndepărtat și înlocuit cu mediu îmbogățit proaspăt fără suplimentare lipidică. Furnizarea lipidului, după apropierea sau atingerea confluențelor celulelor, s-a găsit a fi contra-productivă diminuând randamentele celulare maxime.

Când celulele cultivate în monostrat trebuie să fie infectate cu un inocul viral, suplimentul lipidic se elimină și stocul de virus se introduce într-o rezervă proaspătă de mediu îmbogățit. Absența lipidului din această realimentare permite extinderea creșterii celulare, fără problema inducerii diminuării celulare prin lipid de felul celei menționate mai sus.

Ca urmare a procedeului descris mai sus se obțin creșteri substanțiale în randamentul celulelor și virusului. Astfel, pentru virusul varicela crescut pe celule MCR-5 se atinge o creștere substanțială în randamentul PFU VZV, prin comparație cu randamentele obținute când celulele MCR-5 sunt crescute în mediul minimal sau numai în mediul SRFE-2. în același mod, celule WI-38 care sunt utile pentru creșterea producției de virus varicela sau virusul rubeolei cresc până la densități substanțial mai mari când se cultivă conform acestui nou procedeu.

RO 114906 Bl

Așa cum s-a aplicat pentru producerea unui vaccin anume, noul procedeu al acestei invenții cuprinde propagarea VZV în cultură de celule și recoltarea VZV-ului rezultant în condiții care optimizează randamentul și stabilitatea virusului. Avantajele dezvăluite prin producția de VZV vor fi aplicabile la producerea de alte virusuri încapsulate, incluzând virusuri herpes altele decât VZV, pojarul, hionul sau rubeola.

Ultimul obiectiv al acestei invenții este de a asigura un procedeu care permite producerea eficientă de VZV pentru utilizare ca vaccin. Succesul procedeului este măsurat prin randamentul de celule-libere VZV atins în final prin optimizarea fiecărei etape a procedeului. Randamentul se determină prin titrul de infecțiozitate al preparatului final celule-libere VZV. Titrurile de infecțiozitate ale preparatelor virusului varicela zoster (VZV) s-au obținut printr-o procedură acoperire-agaroză sau acoperire cu lichid, așa cum s-a descris în literatura de specialitate. Pe scurt, această metodă implică cultivarea de celule MCR-5, care sunt suscceptibile la infecție VZV, la un stadiu de replicare activă, ce este, la un punct unde celulele sunt confluente, aproape 50...80%. Apoi, virusul este etalat pe monostratul de celule într-un volum minim, pentru a permite atașarea de celule și apoi se adaugă mediu suplimentar de creștere. După câteva zile de creștere, celulele sunt expuse la o colorare proteică și sunt numărate suprafețele clare, plăci. Astfel, pentru un volum cunoscut de inocul viral, numărul unităților care formează plăci (PFU) pe mililitru reprezintă o măsurătoare bună a randamentului virusului. Se poate calcula numărul total al PFU obținut de la orice preparat viral dat, multiplicând prin volumul total de celule-libere virus.

Din cauza variabilității în test, creșterea în PFU obținute prin orice procedeu anume și optimizarea se raportează ca un raport la câteva etape ale procedeului, mai puțin optimizate. Această raportare a creșterii a randamentului viral, anulează prin urmare orice variabilitate în cercetarea PFU ca atare. în sfârșit, etapele procedeului descris aici, au ca rezultat cumulat într-o creștere aproximativ de 16...20 ori în creșterile VZV care s-au atins folosind metode cunoscute în domeniu. Această creștere nu este raportată în literatură și ea reprezintă o contribuție însemnată pentru domeniul producerii de vaccin VZV.

Datorită faptului că cercetarea pe placă VZV necesită mult timp, ea nu este corespunzătoare în mod deosebit în controlul procedeului. 0 metodă ELISA antigen VZV rapidă, permite măsurarea cantităților de antigen VZV, pentru a asigura urmărirea creșterii virusului în timpul fabricării de vaccin varicela viu. în plus, acest test poate fi folosit pentru estimarea cantităților de antigen VZV în vaccinuri volumizate clarificate, sonicate și potențial pentru a măsura antigenul în fiole umplute cu vaccin liofilizat. Pe scurt, această cercetare este condusă prin incubarea de antigen VZV din probe de testat cu ser anti-VZV în soluție. Anticorpul liber care rămâne este lăsat să se lege la antigen VZV imobilizat pe plăci de microtitrare ELISA. Cantitatea de anticorp capabilă de legare la plăci este invers proporțională cu cantitatea de antigen din proba de testat. Anticorpul care se leagă la plăci este cuantificat prin reacționare cu anticorp anti-uman, legat de o enzimă și substrat corespunzător pentru a da un produs colorat care este cuantificat spectrofotometric.

Testările ELISA antigen VZV și placă VZV, în general ar furniza dare care să se coreleze, dar testul antigen VZV detectează atât VZV neviabil cât și viabil. Deoarece răspunsul imun generat de către VZV omorât nu s-a dovedit a fi la fel de eficient ca răspunsul la virusul viu atenuat, testarea pe placă este o testare critică pentru

140

145

150

155

160

165

170

175

180

RO 114906 Bl determinarea dozei de inocul viral pentru vaccinuri \J7\I. Cu toate acestea, testarea antigenului este valoroasă prin aceea că ea asigură o măsură a încărcării totale de antigen care trebuie administrată la un receptor de vaccin \ΓΖΜ, ea este mai rapidă decât testul PFU și de aceea permite urmărirea producției de VZV în procedeu și este corelată cel puțin la punctul de producție maximă PFU VZV asigurând estimarea momentului optim pentru recoltare.

Reușita procedeului acestei invenții este, în plus, mărită prin fiecare din următorii parametrii care sunt cuprinși în întinderea acestei invenții:

a. Cultivarea de celule susceptibile la infecție \J7\J, alese de la celule umane diploide, cum ar fi MCR-5, în cultură monostrat până la confluență, folosind volume mari de cultură sau mediu de cultură îmbogățit până la atingerea unui grad înalt al replicării celulare și furnizarea unui dizaharid nemetabolizabil, cum ar fi sucroză

Se poate folosi, pentru producere de VZV, oricare dintr-un număr de diferite sisteme de cultură cunoscute în domeniu, ca fiind utile pentru producerea de VZV. Astfel, au fost folosite pentru acest scop celule Vero, celule WI-38, celule MCR-5 și numeroase alte tipuri de celule. în prezenta invenție s-au folosit celule MRC-5 care sunt acceptabile pentru producția de vaccin, care se intenționează să se folosească la oameni. Nu este totuși de neconceput ca altă linie de celule, în afară de MCR-5, să poată mări randamentele de celule-libere VZV, dincolo de mărimea raportată aici sau dacă s-ar folosi altă linie celulară, deosebit de productivă, în afară de MCR-1. Pentru extindere, ca o asemenea linie celulară să fie adaptată pentru utilizare într-un procedeu curent, această invenție cuprinde aplicarea acestui produs la astfel de celule.

Compararea randamentelor celule-libere virus viu în monostrate celulare MRC-5 sub-confluente sau confluente incubate la 35°C și în atmosferă de 5% CC₂ în mediu EMEM (Mediu Eagles Esențial Minim] cu 2% sau 10% ser fetal de vițel (FCS) arată efectul confluenței celulare asupra unităților care formează placă (PFU] ale celulelor-libere VZV (vezi exemplul 2, tabelul 1 care vor fi prezentate în continuare).

Folosirea de celule monostratificate confluente dă o creștere de până la aproape

2...3 ori în PFU celule-libere/ml, față de randamentul atins prin infectarea monostraturilor sub-confluente când culturile sub-confluente sunt active proliferativ (10% ser) sau nu (2% ser). Prin urmare, confluența și nu celulele în proliferarea activă, apare a fi necesară în procedeul de producere de vaccin pentru mărirea randamentelor VZV.

Procentul de ser fetal prezent în timpul creșterii virale nu pare a avea efect major asupra randamentelor PFU celule-libere VZV. Astfel, de obicei, în timpul fazei de creștere celulară, FCS se asigură la aproape 10%, în timp ce în timpul fazelor de creștere virală a procedeului, FCS se asigură la aproape 2%, când se folosește pentru creștere celulară și cultură de virus un mediu minimal precum EMEM sau EBME sau un mediu precum SRFE-2.

în plus, față de FCS și mediu, de obicei la cultura celulară și mediu de creștere virală se adaugă un antibiotic precum 50 pg/ml neomicină și glutamină (aproximativ 2 mM).

7. Faza de inițiere a creșterii celulelor

Containere pentru culturi celulare (baloane, baloane rotative, sau echivalente funcționale ale acestor vase de cultură) sunt însămânțate cu MCR-5 sau alte celule diploide, astfel încât concentrația inițială a celulelor să fie aproximativ 10OOO și 40000 celule/cm². Celulele sunt alimentate cu mediu de creștere suplimentat cu aproximativ

RO 114906 Bl

10% ser fetal de vițel și în atmosferă de 5% C0₂ după care sunt incubate la aproape

30.. .37°C, și de preferință la 35°C. 230

Celulele pot fi crescute într-un volum atât cât este necesar pentru a acoperi complet celulele crescute în cultură staționară. Un raport al volumului față de suprafața zonei este de aproape 0,5 ml mediu de cultură pe cm² de suprafață de creștere. Când celulele sunt crescute în baloane rotative, pot fi corespunzătoare ca mărime cele de 125 ml pe 850 cm², dar sunt de preferat cele de aproximativ 425 ml/cm². 235

Pentru faza de inițiere a creșterii celulelor se poate folosi mediu minimal, cunoscut în domeniu pentru culturi celulare și care este disponibil comercial, precum mediu EMEM sau EBME (mediu Eagle de bază suplimentat cu săruri Earle], cu aproximativ 10% FCS. Alternativ, în avantajul acestei faze se poate folosi un mediu mai bogat. Mediul SRFE (care este cunoscut în domeniu) este un mediu bogat și poate fi folosit în mod avantajos 240 la această etapă; dar un mediu bogat nu este critic la acest stadiu al procedeului.

2. Faza de creștere a celulelor

Este critic, ca nutriția sufcientă să fie furnizată în această fază a procedeului pentru a asigura creșterea celulelor până la confluență masivă. Aceasta se poate obține prin furnizarea unui volum mare de mediu minimal sau a unui volum mai mic de mediu 245 bogat. Celulele sunt crescute la aproximativ 3O...37°C și de preferință, la aproximativ

32.. .35°C.

După ce se lasă o perioadă de timp corespunzătoare pentru atașarea celulelor și creștere celulară, celulele se pot realimenta prin îndepărtarea și înlocuirea mediului și prin continuarea incubării. Mediu se poate îndepărta prin aspirație sau decantare, sau 250 orice alt mijloc astfel încât integritatea monostratului celular să nu fie compromisă. Pentru celulele MCR-5 lansate în cultură, cum s-a descris mai sus, realimentarea poate avea loc aproximativ la 72 h după introducerea celulelor în vasul de cultură.

Volumul mediului de cultură înlocuit poate fi același cu volumul folosit pentru faza de inițiere a culturii celulare. Totuși, de preferință, se asigură un volum mai mare decât 255 cel folosit în timpul fazei de inițiere a creșterii celulare. Aceasta este deosebit de important când celulele sunt cultivate într-un mediu minimal cum ar fi EMEM sau EMBE plus FCS. Un volum de cultură mare reprezintă unul din modurile prin care se asigură ca celulele să primească o nutriție adecvată.

Necesitatea unui volum mare se poate reduce când mediul furnizat, pentru faza 2 60 de creștere, este un mediu bogat. Un mediu preferat în mod deosebit pentru acest scop este SRFE-2. Utilizarea unui mediu bogat la acest stadiu, mai degrabă decât unul minimal, sporește mult densitatea monostratului celular de confluență. Sporirea densității celulare duce la o mărire a randamentului de VZV care se obține de la o cultură celulară crescută într-un mediu îmbogățit. Astfel, folosirea mediului îmbogățit în timpul fazei de 265 creștere celulară a dat o creștere de până la aproximativ 2...4 ori în randamentul final VZV, față de cel atins când celulele cresc la acest stadiu într-un mediu minimal.

într-un mod preferat de realizare, mediul SRFE-2 se suplimentează cu lipid. Oricare dintre numeroasele suplimente lipidice este util. Astfel, s-au găsit a fi benefice, ca suplimente pentru mediu bogat sau mediu minimal, lipidele bogate în colesterol din 220 serul adult bovin, EXCYTE lipid I sau endotoxină foarte joasă (VLE). Lipidul de soia, accesibil comercial s-a dovedit a fi un foarte bun supliment când s-a asigurat la aproximativ 0,2 mg/ml. Densități celulare de aproape 500000 celule/cm² s-au atins folosind mediu SRFE-2 plus lipid și FCS. S-au obținut randamente VZV sporite când lipidul

RO 114906 Bl s-a asigurat, indiferent dacă creșterea celulelor se face într-un mediu minimal sau întrunul îmbogățit. Materialul disponibil comercial este furnizat ca stoc 20 mg/ml lipid, 1OO mg/ml albumină serică bovină. Acest material este folosit convenabil, la o diluție finală de 1:100. Randamentul VZV final s-a mărit de aproape 9 ori față de randamentul VZV de la mediul EMEM singur și de aproximativ 3,3 ori față de mediul SRFE-2 singur, când mediul SRFE-2 s-a suplimentat cu aproximativ 0,2 mg/ml lipid de soia în timpul fazei de creștere celulară.

3. Faza de preinfecție

S-a descoperit că randamentul final de VZV poate fi sporit în continuare când celulele cultivate sunt expuse la un dizaharid nemetabolizabil, lipsit de toxicitate, la o concentrație optimă, înaintea infecției VZV. 0 realizare deosebit de reușită s-a obținut asigurând aproximativ 20...60 mM sucroză, la aproximativ 72 h după ce s-au introdus celulele în vasul de cultură și, de preferință, la aproximativ 24 până la 96 h înaintea infecției culturii cu VZV. Ca o problemă practică, prevederea a aproximativ 50 mM sucroză în mediul de realimentare al etapei 2 (de mai sus) îndeplinește aceste criterii și reduce numărul de manipulări sterile necesare pentru a realiza efectiv acest lucru și previne etapele concurente.

Alte zaharide, incluzând lactoza, celobioza și maltoza sporesc de asemenea, randamentul VZV final, dar este preferată sucroză. Monozaharidele testate, precum fructoza și riboza nu sporesc randamentul VZV (riboza poate fi chiar toxică). Se pare că dizaharidele sunt concentrate în lizozomii celulelor în creștere, stimulându-i să formeze vacuole (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Acest efect al dizaharidelor asupra randamentului VZV poate fi datorat atenuării distrugerii lizozomale de VZV.

Pe lângă dizaharide, se poate aștepta ca tri- și tetrazaharidele să aibă efecte benefice, după cum a fost remarcat în literatura de specialitate. Vacuolizarea este identică când aceste zaharuri superioare sau sucroză s-au alimentat la macrofage, atât timp cât zaharurile nu au fost metabolizate de către celule.

b. Infectarea celulelor cultivate conform etapei (a) cât mai aproape posibil de punctul de confluență cu celule infectate VZV cu o multiplicare ridicată a infecției din punct de vedere practic

S-a găsit, prin experimente repetate, că în mediu celulele au permis o așteptare de 48 h după ce s-a obținut confluența, randamentul este de numai 50% de PFU/ml VZV, comparativ cu randamentul obținut când s-au infectat cu celule VZV proaspăt confluente.

Astfel, este important momentul introducerii inoculului VZV, care trebuie să coincidă cât mai strict posibil cu ajungerea celulelor la confluență. Din păcate, confluența este un parametru care variază în funcție de tipul mediului, tipul de celulă care este cultivat și alte condiții de cultură folosite. Pentru celule MCR-5 lansate în cultură, conform etapei (a)(1) de mai sus, celulele sunt de obicei infectate la punctul de atingere a confluenței.

Virusul varicela-zoster (VZV) este de preferință, tulpina Oka a virusului atenuat descris în Brevetul US 3985615 care este depozitat la ATCC. Acest virus este adaptat să crească în culturi de celule embrionare de cobai și culturi celulare de fibroblaste pulmonare umane diploide (de exemplu, celule MCR-5).

RO 114906 Bl

Un stoc de celule viabile infectate cu varicela se poate prepara prin infectarea 320 celulelor MCR-5 la un MOI de aproximativ 1:125 și menținerea celulelor infectate pentru a permite replicarea virală, tripsinizarea celulor și utilizarea imediată a celulelor eliberate imediat ca inocul de lucru sau stocarea pentru folosința ulterioară și cuantificarea PFU prin congelarea lentă cu un crioprotector precum DMSO sau glicerol la aproximativ 10⁷ celule/ml. Stocul de celule infectate VZV congelate poate fi dezghețat și adăugat la o 325 cultură de celule confluente, pentru inițierea infecției VZV.

Alternativ, celulele infectate VZV pot fi liofilizate conform metodei descrise în literatura de specialitate și care permite stocarea timp îndelungat la 4°C a inocului liofilizat. De asemenea, este posibil să se folosească celule-libere VZV drept inocul, dar datorită pierderii de virus la recoltare, este preferată folosirea unui inocul celule-legate. 330

Altă posibilitate pentru producerea stocului de virus infectat pentru însămânțare, este de a iniția creșterea de la celule pentru producerea de virus de însămânțat înaintea producerii celulelor cultivate pentru cultură. La momentul infecției celulelor pentru însămânțare cu celule infectate VZV, lansarea producției celulelor se poatre iniția astfel încât să se obțină confluența în același timp în care virusul pentru însămânțat atinge 335 titruri VZV maxime. Mai puțin optim, dar mai convenabil, se pot lansa în cultură în același timp celule pentru însămânțare și celule pentru producție, cu un volum mic de mediu de cultură (aproximativ 125 ml pe 850 cm^a-balon rotativ). După 2...3 zile de creștere în baloanele pentru producția de inocul VZV, cresc în volum mărit până la aproximativ 425 ml, sau se realimentează cu mediu bogat, pentru permiterea ajungerii la confluență. 34c Producerea de celule se lasă, relativ inactivă, într-un volum mic de mediu minimal (care include aproximativ 10% FCS) până la aproape două zile înainte de a se lua în lucru, când celulele de însămânțat se infectează cu alte celule infectate VZV. în acest moment se mărește volumul de celule pentru producție până la aproximativ 425 ml sau se realimentează cu mediu bogat, cum ar fi SRFE-2 plus o cantitate optimă de lipid de soia 345 și ser fetal de vițel. Celulele pentru producție se cultivă apoi până la confluență viguroasă. Două zile după realimentarea celulelor pentru producție, celulele de lucru pentru însămânțare, acum la confluență, se infectează cu celule infectate VZV la un MDI de 1:125 sau mai ridicat, și replicarea VZV se lasă să continue pentru două până la trei zile. în același timp s-a ajuns la maximul de producere VZV în celulele pentru însămânțat 350 și s-a atins confluența la celulele pentru producție. După aceea, celulele de însămânțat se recoltează și se adaugă la celulele pentru producție.

Indiferent de durata timpului pentru producerea de sămânță, la un moment corespunzător după infecția VZV, mediul este aspirat de la cultura de sămânță infectată VZV, sămânța infectată VZV se recoltează prin tripsinizare (aproximativ 0,25% tripsină) 355 sau alte mijloace nedistrugătoare și culturile de celule de producție se infectează la un MOI cunoscut.

în literatura de specialitate s-a remarcat importanța unui MOI ridicat pentru randament VZV bun, dar nu s-a făcut o comparație strictă cu infecția la un MOI scăzut. Invenția de față face cu precizie o astfel de comparație. 360

Celulele sunt infectate cu VZV, prin îndepărtarea mediului de creștere din culturile de celule și inocularea lui cu mediu proaspăt care conține o cantitate cunoscută de celule infectate VZV, preparată cum s-a descris mai sus. Stocul de virus este titrat de preferință pentru PFU varicela și celule receptoare sunt numărate pentru a permite cuantificarea multiplicității infecției (MOI). MOI, sunt exprimate ca raportul celulelor 365

RO 114906 Bl infectate VZV din inocul la numărul de celule monostratificate neinfectate din cultură. Astfel, un MOI de 1:10 este ridicat, în timp ce 1:625 este scăzut. Este de dorit un MOI ridicat, dar ca problemă practică, se pot obține randamente VZV bune cu un MOI scăzut, până la 1:125.

MOI sunt între 1:7 și 1:625, iar randamentele între aproximativ 5OOOOO PFU/ml la MOI ridicat și mai jos de 1OOOOO PFU/ml la ultimul MOI (vezi Tabel 3 de la exemplul 5). Un MOI mai ridicat necesită un timp mai scurt de incubare pentru a atinge vârful PFU și dă un randament mai mare. Astfel, un PFU final într-un domeniu de aproximativ 5 ori mai mare se poate atinge în funcție de MOI și momentul recoltării.

c. Menținerea culturii infectate VZV într-o stare de nutriție ridicată timp de aproximativ 22...96 h și recoltarea la punctul de vârf al producerii VZV

Cultivarea celulelor infectate VZV se continuă pentru aproximativ 22 până la 96 h după infecție. Este critic ca la acest stadiu de creștere a virusului să se mențină o nutriție adecvată. Se asigură fie un volum mare pentru cultură dintr-un mediu minimal precum EMEM plus aproximativ 2...10% FCS, sau este de dorit un volum mai mic de mediu bogat. Cel mai bine se asigură mediu SRFE-2 plus 2...10% FCS, fără adăugare de supliment lipidic. S-a remarcat că lipidul reduce randamentul VZV, dacă se include la acest stadiu.

în timpul de 22...96 h după infectarea culturii, VZV se replică în celulele care au fost infectate și infectează și celulele alăturate. Totuși, celulele infectate mai demult nu vor da PFU-uri celule-libere recuperabile. Curba creșterii VZV și declinul ulterior pot fi rapide. De aceea, aprecierea corectă a momentului recoltării este un parametru critic pentru maximizarea randamentului de VZV infecțios și se poate reproduce cu precizie prin menținerea unui control strict al introducerii MOI, nutriției și timpului de producție. Suplimentar se poate folosi antigenul VZV ELISA, pentru optimizarea timpului de recoltare ca producție VZV infecțioasă corelat cu producerea antigenului VZM, cel puțin până la punctul când virusul începe să moară (vezi fig. 5).

Pentru celulele MCR-5 infectate VZ>J, recoltate la aproximativ 72 de h postinfecție, unde fiecare din etapele anterioare a fost optimizată ( crește în mediu bogat și expunerea preinfecție a celulelor la 50 mM sucroză timp de 72 h] randamentul final al celulelor-libere VZV a fost crescut aproximativ de 16 ori față de randamentul obținut în mediu minimal și recoltare virală la 48 h și chiar mai mult decât atunci când recoltarea este la 96 h (vezi exemplul 8, fig. 1). Producția de VZV în aceleași condiții optimizate a fost numai de 4 ori peste randamentul mediului minimal când virusul s-a recoltat la 48 h postinfecție, dar a fost încă mult îmbunătățit față de randamentul în mediu minimal la 96 h. Astfel, producția de virus este mult mai mare și moartea virusului este mult mai redusă în mediu bogat, neexistând un declin al producției virale peste timp. De asemenea, MOI mai puțin critic în mediu bogat.

d. Spălarea culturii infectate VZV cu o soluție fiziologică care conține optimal un agent lizozomotropic, precum clorură de amoniu sau clorochină, înainte de recoltarea celulelor infectate VZV

Pentru a îndepărta serul, lipidul și resturile celulare din cultură, cultura monostrat se spală cu un tampon fiziologic care nu provoacă liza celulelor. Pentru acest scop este acceptabil fosfatul salin tamponat (PBS). Celulele se pot spăla de câteva ori și soluția se spălare se decantează, se aspiră sau se îndepărtează prin oricare alte mijloace, astfel încât să nu fie compromisă integritatea monostratului.

RO 114906 Bl

Dacă celulele se eliberează chimic din vasul de creștere, ele se vor concentra prin centrifugare și tamponul fiziologic se înlocuiește cu o soluție de stabilizare.

Asigurarea de clorură de amoniu sau clorochină înainte de recoltarea celulelor îmbunătățește producțiile finale de VZV. în literatura de specialitate s-a folosit clorură de 415 amoniu pentru controlul pH-ului intern al endozomilor celulari infectați și virusuri consumând aparent aceeași cantitate din viața lor intercelulară. Mecanismul posibil al creșterii producției VZV, după expunerea celulelor la agenți lizozomotropici, este legat de inducerea unui mediu endozomal mai puțin sever. Aprovizionarea celulelor înainte de infecție cu dizaharide netoxice și nemetabolizabile, cum ar fi sucroză și expunerea 420 celulelor la clorură de amoniu sau clorochină prin urmare poate să acționeze prin mecanisme similare. în orice caz, observația s-a confirmat empiric, și anume că producțiile VZV finale se măresc când se furnizează clorură de amoniu la o concentrație finală între 1...1O mM și cel mai bine între 20...50 mM, și de preferință la aproximativ 4°C, timp de aproximativ 25...50 min, înaintea distrugerii celulei. Un al doilea agent 425 lizozomotropic, clorochină, la o concentrație de aproximativ 230 M, crește în mod asemănător recuperarea de PFU/ml VZV.

e. Recoltarea celulelor infectate VZV într-un volum minim de soluție stabilizatoare și, fie distrugerea imediată a celulelor, fie congelarea lor prin distrugere ulterioară

După ce s-au spălat celulele infectate VZV, ele se pot recolta prin radare, dacă 43: vasul de creștere o permite, sau prin detașarea chimică a celulelor. Eliberarea enzimatică a celulelor este mai puțin de dorit, enzimă reziduală putând să diminueze producția virală după distrugerea celulelor. Așa cum s-a notat mai sus, dacă celulele se eliberează în mediu fiziologic salin, celulele se concetrează prin centrifugare și mediul fiziologic salin se înlocuiește cu un volum minim de soluție de stabilizare a VZV. Un volum 435 corespunzător față de aria suprafeței de creștere a celulelor este de aproximativ 40 ml de stabilizator pe 850 cm².

în domeniu sunt cunoscuți stabilizatori virali. Astfel, se sugerează stabilizare cu 5% sucroză în fosfat salin tamponat, în timp ce alte lucrări recomandă stabilizatorii mai complecși precum SPGA. 440

După resuspendarea celulelor infectate VZV într-o soluție de stabilizare, celulele pot fi distruse imediat, sau în eventualitatea că s-au preparat cantități mari de VZV, se pot congela la -70°C pentru prelucrarea ulterioară. Producția de VZV pe cm² de celule crescute va fi ușor mai mare dacă celulele se distrug imediat, dar etapa de congelare de obicei nu implică o pierdere de mai mult de 10% din producția obținută prin 445 prelucrare imediată.

f. Distrugerea celulelor infectate VZV pentru eliberarea optimă a celulelor-asociate VZV și îndepărtarea resturilor pentru a furniza un preparat celule-libere VZV

Așa cum s-a descris mai sus, de preferință mediul de cultură se îndepărtează de la celule înaintea distrugerii acestora și se înlocuiește cu un volum minim de stabilizator 450 VZV în care celule sunt raclate sau eliberate în alt mod. Suspensia de celule se răcește până la O...4°C și celulele se distrug apoi printr-un mijloc corespunzător cum ar fi sonicarea, omogenizare DOUNCE, alte tipuri de tăieri care sunt mai accesibile decât DOUNCE sau o combinație a acestor tehnici.

în prezenta invenție s-a specificat că numai sonicarea nu poate asigura cea mai 455 bună recuperare a celulelor-libere VZV. De fapt, randamentul VZV este mult mărit când distrugerea celulelor se face folosind omogenizarea DOUNCE ca etapă inițială de

RO 114906 Bl distrugere, urmată de centrifugare și reținerea supernatantului ca supernatant I, după care sonicarea peletei și centrifugare pentru obținerea supernatantului II. Randamentul obținut prin combinarea supernatantului I și II a fost de patru ori mai bun decât atunci când s-a folosit ca tehnică de distrugere doar sonicarea.

După distrugerea celulară, îndepărtarea resturilor celulare se realizează prin centrifugare, filtrare, sau oricare alte mijloace cunoscute în domeniu pentru îndepărtarea resturilor celulare astfel încât să se păstreze VZV fără alterări. Preparatul celule-libere virus se diluează apoi cu soluția de stabilizare și se subdivide pentru utilizare ca vaccin. De preferință, pentru păstrare un timp îndelungat, VZV se liofilizează printr-una dintre metodele cunoscute în domeniu.

Se prezintă mai jos pe scurt, creșterile aproximative ale producției potențiale în urma optimizărilor etapelor acestui procedeu, comparativ cu producția VZV prin creșterea celulelor în mediu minimal:

de câte ori creste PFU

Etapa procedeului

Mediu/suplimente:

1.	MOI	2-5
2.	Confluența celulelor	2-3
3.	Mediu SRFE-2 + lichid	2-3
4.	Sucroză în fază de preinfecție	2-5
5.	Volum optimal de mediu	1-2

Creșterea potențialului net pentru combinația mediu/suplimente de stabilizare și optimizarea condițiilor de infecție:

Creștere observată pentru combinarea lui 3, 4 și 5 în baloane rotative

6. Combinarea tăiere/sonicare pentru eliberarea de celule-legate VZV

Creștere potențială totală față de procedeul neoptimizat >8

1,5 >18

Utilitatea acestui procedeu pentru producția de vaccin:

S-a demonstrat utilitatea folosirii ca vaccin a preparatului celule-libere VZV în prevenirea vărsatului de vânt. Această utilitate a fost dovedită de numeroase studii clinice, și asemenea probe fac parte de acum din stadiul tehnicii în domeniu. Astfel, contribuția extraordinară pe care această invenție o face în domeniu, este aceea că ea asigură un procedeu de înaltă eficiență pentru creșterea randamentului de producere de VZV viu, atenuat. Virusul preparat conform acestei invenții poate fi formulat ca un vaccin conform metodelor cunoscute în domeniu, și se poate administra conform regimurilor de acum stabilite. De exemplu, produsul celule-libere VZV viu, atenuat al acestei invenții poate fi diluat într-un stabilizator, introdus în sticle, liofilizat în unități dozate și depozitat la aproximativ 4°C sau temperaturi mai joase, fiind disponibilă în momentul utilizării o doză de circa 1DOD PFU. Vaccinul VZV, produs conform procedeului acestei invenții, poate fi folosit în formulări de unități dozate pentru a fi inoculat la oameni în vederea inducerii de răspunsuri imune protectoare împotriva infecției prin tulpini virulente ale VZV.

RO 114906 Bl

De preferință, la minim, o doză de circa 2ODO PFU/ml (1000 PFU/ 0,5 ml doză) se administrează subcutanat sau intramuscular. S-au administrat doze mai mari, cum ar fi un total de 15000 până la 20000 PFU și acestea sunt acceptabile. 505

Prin asigurarea unui procedeu optimizat pentru producerea unui virus VZV atenuat, această invenție face posibil să se aplice ceea ce este cunoscut în domeniu pentru a formula un vaccin pentru susținerea de răspunsuri imune anti-VZV în prevenirea vărsatului de vânt.

Exemplul 1. Test pentru determinarea randamentului VZV 510

Titrurile de infectivitate ale preparatelor de virus varicela zoster (VZV) s-au estimat folosind procedura acoperire agroză sau acoperirea cu lichid așa cum este descrisă în literatura de specialitate. Testarea se realizează după cum urmează:

Se însămânțează celule MCR-5 în plăci de culturi de țesuturi de 60 mm, la 6 x 10⁵ celule în 5 ml volume de mediu BME (mediu Eagle de bază cu soluție echilibrată de 515 săruri Hanks) cu 100 mg/l galactoză, 50 pg/ml neomicină, 2 mM L-glutamină care sunt incubate la 35°Cîn atmosferă 5% C0₂. După incubare, timp de 24...48 h, celulele au atins confluența în proporție de 50...80%. Mediul de creștere se îndepărtează prin aspirare și celulele se infectează cu 100 pl de soluție VZV diluată într-un diluant viral corespunzător cum ar fi tampon SPGA sau mediu lichid de menținere (LMM). Tamponul 52c SPGA conține 7,5% (g/v) sucroză, 11 mM fosfat de potasiu, 0,1% (g/v) glutamat de sodiu și 1% albumină serică umană. Se lasă să se atașeze virusul 1 oră sau mai mult la 35°C și într-o atmosferă de 5% C0₂. Culturile de celule infectate VZV sunt acoperite apoi cu 5 ml mediu de agaroză de acoperire (ADM) sau mediu lichid de menținere (LMM).

Mediul de agaroză de acoperire este un amestec de două soluții; mediu lichid de 525 acoperire (LOM) și soluție de acoperire, de agaroză. LOM conține mediul esențial minimal cu sărurile Earle (MEM), 2% ser fetal de vițel inactivat termic, 50 pg/ml sulfat de neomicină și 2 mM L-glutamină. Soluția de agaroză se prepară prin încălzirea a 4,5 g de agaroză, la temperatură scăzută de gelificare în 100 ml MEM timp de 15 min la 121°C și lăsarea soluției la răcit până la 45°C. AOM se prepară prin amestecarea unui 530 volum de soluție de agaroză cu 4 volume concentrate de 1,25 ori LOM la 45°C. Plăcile se răcesc până la 23...25°C, pentru a permite solidificarea AOM. Culturile sunt incubate pentru dezvoltarea plăcii. După 6...7 zile, plăcile care au adăugat LOM se acoperă cu 5 ml de fosfat salin tamponat (PBS) și se trece o pipetă Pasteur de jur împrejur pentru a elibera și îndepărta agaroza. Mediul se aspiră de pe plăcile care au primit LMM și plăcile 535 se vizualizează prin colorarea celulelor cu o soluție 0,2% (g/v) de Coomassie Blue R-250 în etanol - 1% acid acetic. Plăcile numărate au în mediu 4...5 replicate pe placă și s-au exprimat ca unități care formează plăci/ml (PFU/ml).

Din cauza valabilității potențiale în testare, creșterile de randament VZV sunt raportate relativ la condițiile neoptimizate testate în condiții identice. 540

Exemplul 2. Randament VZV ca o funcție a confluenței celulare la infecție S-au cultivat celule MCR-5 la 4 x 10⁶ celule/150 cm² și s-au lăsat să crească timp de trei zile în săruri Earle suplimentate cu mediu de bază Eagle (EBME) în prezență de 10% ser fetal de vițel (FCS). După atingerea densității celulare de subconfluență de circa 12 x 10⁶ celule/150 cm², celulele s-au realimentat cu mediu proaspăt EBME 545 suplimentat cu 10 sau 20% FCS. La acest punct, celulele subconfluente s-au lăsat să crească în continuare în prezență sau absență de infecție VZV (MDI 1:25), și s-a urmărit creșterea în densitatea celulară și randamentele virusului după 48 h. S-a găsit că celule

RO 114906 Bl neinfectate în 2% FCS au crescut în densitate cu numai 33%, iar celulele cu 10% FCS au crescut cu 92%. Celulele din culturile infectate nu au crescut ca număr. Așa cum s-a arătat în tabelul 1 care urmează, randamentele virusului de la celulele subconfluente nu au fost afectate în ceea ce privește capacitatea de replicație celulară în culturi, indiferent dacă mediul a fost suplimentat minimal (2% FCS) sau maximal (10% FCS).

Alte celule s-au cultivat două zile în plus, în 10% FCS până la aproximativ 20 x 1O^B celule/150 cm² per balon (o condiție de confluență), și apoi s-au realimentat cu mediu proaspăt EBME suplimentat cu 2% sau 10% FCS și infectate cu VZV (MOI 1:125) sau lăsate neinfectate. Creșterea în densitatea celulară și randamentele virusului s-au urmărit după 48 de h. S-a găsit că celulele neinfectate din 2% FCS nu au crescut în densitate iar cele din 10% FCS cu crescut numai până la circa 15%. Astfel, nici una dintre condiții nu a fost capabilă de mai multă replicare celulară. Randamentele virusului în 2% sau 1 □% FCS au fost similare și ambele au crescut de aproximativ 3 ori față de randamentul de la celulele infectate la subconfluență (vezi tabelul 1). Astfel, s-a stabilit pentru randamente optimale de celule-libere VZV folosirea preferențială de celule monostrat de curând confluente opuse celulelor monostrat subconfluente în replicare activă.

Tabelul 7

Starea monostratului celular la infecție	% FCS în timpul creșterii virusului	Celule-libere PFU/ml	Potențial de re-plicare celulară în timpul creșterii virusului
Experiment
A	B
Sub-confluență	2 10	44000 33000	30000 27000	33% 92%
Confluență de	2	119000	117000	0%
curând	10	123000	100000	15%

Exemplul 3. Comparația randamentului VZV de la culturi de celule de curând confluențe și culturi de celule confluente Îmbătrânite

S-au însămânțat baloane rotative (850 cm²) cu celule MCR-5 la o concentrație de aproximativ 26500 celule/cm². Toate celulele au crescut în mediu EBME conținând 10% (v/v) ser fetal de vițel (FCS₁₀) într-o atmosferă 5% C0₂ la 35°C. Baloanele s-au împărțit în două grupuri, în funcție de momemntul infecției cu VZV. Grupul I de celule a crescut timp de 5 zile, moment la care monostratele celulare au devenit confluente. La acest momemnt s-a îndepărtat mediul și celulele s-au infectat cu celule-asociate VZV la un MOI de 1:125, suspendate în EMEM + 2% FCS. S-a adăugat mediu suplimentar, și celulele s-au incubat pentru alte 48 de h. Grupul II de celule s-a menținut suplimentar 48 h înaintea infecției la un MOI = 1:125.

Producerea de VZV de către grupurile I și II de celule s-a determinat după cum urmează: s-a îndepărtat mediul din baloanele rotative și celulele s-au clătit cu fosfat salin tamponat, s-au raclat cu bile de sticlă în volume egale de stabilizator și s-au răcit la 4°C. Suspensiile reci de celule s-au distrus prin sonicare. Resturile celulare s-au îndepărtat de virus prin centrifugare la viteză redusă (325 x g timp de 10 min] și supernatantul viral

RO 114906 Bl s-a păstrat. Producerea VZV s-a măsurat prin testarea plăcii. Așa cum se arată în tabelul 2, s-a obținut o creștere în randament de aproape 2 ori când s-au infectat cu VZV monostraturi celulare confluente de curând.

Tabelul 2 595

Condiție	Experiment 1 PFU/ml	Experiment 2 PFU/ml
Confluență de curând	121000	190000
Confluență îmbătrânită	82000	85000

Exemplul 4. Efectul volumului culturii asupra randamentului PFU/ml VZV eco

S-au însămânțat în baloane rotative de 850 cm² celule MCR-5 (10 milioane) în 125 ml volume de mediu EBME, 10% FCS, 50 pg/ml neomicină și 2 mM L-glutamină și s-au incubat la 35°C timp de trei zile. S-au adăugat 300 ml de mediu proaspăt și culturile s-au returnat pentru incubare la 35°C pentru 4 zile în plus. Mediul a fost apoi îndepărtat și înlocuit cu 125 sau 425 ml de EMEM, 2% FCS inactivat termic, 50 pg/ml 605 neomicină și 2 mM L-glutamină. S-au adăugat celulele MCR-5 infectate VZV (MOI circa 1:125), culturile s-au plasat în atmosferă de 5% C0₂ și s-au returnat pentru incubare la 35°C timp de 46 h. S-a îndepărtat mediul, celulele s-au spălat de 4 ori cu 100 ml volume de PBS și s-au raclat cu ajutorul bilelor de sticlă în 43 ml volume de stabilizator. Celulele s-au congelat la -70°C. Celulele-libere virus s-au preparat prin sonicare. Cantități de virus ei o infecțios în sonicate clarificate (prin centrifugare) s-au măsurat în cercetare pe plăci VZV.

Rezultate:

Volume de mediu (ml) PFU/ml* VZV 615

125 55000; 45000

425 152000; 103000 * rezultate de la culturi duplicat

Concluzie: Folosirea de volume mari de mediu are ca rezultat o creștere de circa 620 2 ori a randamentelor de VZV infecțios din culturi de celule MCR-5.

Exemplul 5. Efectul MOI asupra randamentului PFU/ml VZV

S-au însămânțat în baloane rotative cu celule MCR-5 și s-au crescut până la confluență. S-a îndepărtat mediul de creștere și celulele s-au infectat cu VZV, la diferite MOI. Producția de VZV de către culturile de celule infectate s-a determinat folosind 62 5 cercetarea de placă prin recoltare periodică și cercetate ca în exemplul 1. Așa cum se prezintă în tabelul 3 și în fig. 5, recuperarea de celule libere VZV infecțios a fost mai mare și s-a atins într-o perioadă de incubare mai scurtă când s-au folosit MOI-uri mai ridicate. Nivelurile de antigen maxime s-au atins de asemenea cu un MOI mai ridicat. La un MOI foarte jos cum ar fi 1:625, producerea de antigen este întârziată și suboptimală. 630

RO 114906 Bl

Tabelul 3

Efectul de inițiere celulă-asociată MOI asupra randamentelor celule-libere VZV din culturi monostrat MCR-5

MOI Titru celulă-liberă VZV (PFU/ml) x 1O'³

Momentul recoltării h 37 h h 60 h

1:25	100	450	50	nd
1:125	nd	150	325	100
1:625	nd	nd	100	90

Exemplul 6. Creșterea stabilității VZV într-un stabilizator la -2O°C

Culturi de celule infectate s-au sonicat în SPGA, și s-au spălat cu fosfat salin tamponat. Celule-legate virus au fost apoi eliberate prin sonicare și resturile celulare s-au îndepărtat prin centrifugare. Concentrația de virus, fără celule, s-a ajustat la o concentrație cunoscută PFU/ml și s-au liofilizat alicoți de virus în stabilizator și s-au depozitat la 4°C sau -2O°C. La intervale de 1 lună, față de un total de 14 luni, s-au reconstituit probele și s-a determinat titrul PFU/ml care rămân. Rezultatele acestui experiment sunt ilustrate în fig. 3. Este evident avantajul substanțial obținut pentru stabilitatea VZV prin stocare la -2O°C mai degrabă decât la 4°C.

Exemplul 7. Efectul asupra randamentului final VZV a cantității și momentului adăugării sucrozei în timpul fazei de preinfecție a creșterii celulelor

1. Faza de inițiere a creșterii celulelor:

Celule MCR-5 (5 ml) s-au lansat în cultură la o concentrație de 120000 celule/ml, (600000 celule în total) pe plăci de 60 mm în mediu EBME care conține 10% FCS, 50 pg/ml neomicină, 2 mM L-glutamină și s-au incubat la 35°C în 5% C0₂.

2. Creșterea celulelor/faza de preinfecție:

Celulele au fost confluente la a treia zi după inițierea culturii. Mediul de inițiere s-a aspirat de pe 48 de plăci și s-a înlocuit cu 8 ml volume mediu de creștere conținând fie EBME sau SRFE-2 suplimentat cu 10% FCS, 50 pg/ml neomicină, 2 mM L-glutamină și 0,2 mg/ml lipide de soia/1 mg/ml BSA cu sau fără 50 mM sucroză. După adăugare de mediu de creștere propaspăt, celulele s-au incubat încă trei zile în atmosferă de 5% C0₂.

3. Infecția VZV:

S-a îndepărtat apoi mediul și s-a înlocuit cu 8 ml de EMEM în locul ABME și SRFE2 în locul lui SRFE-2, plus lipide de soia. S-a redus cantitatea de FCS până la 2% la toate plăcile, iar celelalte suplimente (neomicină, glutamina și sucroza) au rămas ca în timpul fazei de creștere. Fiecare placă a primit apoi 333 pl dintr-o diluție 1:16 de celule infectate VZV (47000 PFU/ml] în EMEM, 2% FCS, neomicină și glutamină.

RO 114906 Bl

S-a lăsat VZV să se replice la 35°C sub 5% C0₂, timp de două zile și apoi s-au îndepărtat mediile de la două plăci din fiecare condiție diferită. Celulele s-au spălat de 4 67 5 ori cu PBS. Celulele s-au raclat în 1,2 ml/placă stabilizator răcit pe gheață. Recolta de la plăcile duplicat s-a strâns în tuburi conice de centrifugă de 50 ml și s-a înghețat la 7O°C.

S-a repetat aceiași procedură precum cea descrisă în paragraful anterior pentru două plăci de la fiecare condiție, a treia, a patra și a cincea zi postinfecție VZV și recolta 68 c strânsă la fiecare set de două plăci s-a păstrat la -7O°C.

Fiecare recoltă de celule preparată, așa cum s-a descris mai sus, a fost dezghețată ulterior, sonicată pe gheață timp de 30 de secunde per tub și s-a clarificat prin centrifugare la 1000 x g, timp de 10 min la 4°C. S-au luat alicoți din supernatante pentru testare de placă. Rezultatele testului de placă efectuate cum s-a descris în 68 5 exemplul 1, sunt prezentate în fig. 1.

Datele prezentate în fig. 1 confirmă câteva concluzii:

1. Incubarea celulelor preinfectate cu 50 mM sucroză este foarte favorabilă pentru randamentul final VZV. în fiecare mediu, EMEM sau SRFE-2, randamentele VZV au fost mai ridicate când celulele s-au tratat cu sucroză înainte de infecție. La 72 h după 69C infecție, randamentul VZV în celuele crescute în SRFE-2, expuse la sucroză au mărit de aproape 16 ori randamentul VZV măsurat în PFU decât au făcut-o celulele din mediul minimal fără sucroză.

2. Asigurarea mediului bogat (SRFE-2 plus lipide de soia în timpul creșterii și SRFE- în timpul creșterii virale) este benefică pentru randamentul VZV, dar în conjuncție cu 6 95 efectul sucrozei permite un ordin al mărimii mai mare pentru VZV ce va fi produs. Astfel, mediul bogat pare a acționa sinergie cu efectul sucrozei.

3. Momentul recoltării VZV este foarte important. Chiar în condițiile de cultură optimizată, SRFE-2 și sucroză etc, maximul de randament VZV nu s-a atins la 48 de h postinfecție. La acest punct s-a atins o creștere de numai 4 ori față de randamentul în 7oc mediul minimal. Cu toate acestea, la 72 de h postinfecție, există o creștere în randamentul VZV de circa 16 ori.

în experimente separate, randamentul VZV nu a fost mărit la fel de mult dacă 50 mM sucroză s-au adăugat la momentul infecției în loc de 72 h înaintea infecției, aceasta indicând importanța unei faze lungi de pre finfecție pentru acumularea intracelulară de 7 05 sucroză. Noi am găsit de asemenea, că adăugarea de 25 mM sau 100 mM sucroză a fost mai puțin benefică decât adăugarea a 50 mM sucroză. Aceleași concentrații aproximativ sunt aplicabile pentru lactoză, celobioză și maltoză.

Exemplul 8. Efectele multiplicării parametrilor procedeului asupra randamentului

VZV 7iS-a făcut un experiment în balon rotativ pentru determinarea efectelor diverselor schimbări de procedeu (mediul de cultură, suplimentare cu sucroză, adăugare de NH₄CI ca stabilizator, distrugere DOUNCE sau prin sonicare pentru eliberarea virusului de celule] asupra randamentelor PFU ale VZV lipsit de celule. Culturile s-au inițiat la 80 x10³

RO 114906 Bl celule/ml x 125 ml EBME, 10% FCS pe balon rotativ. Acestea s-au corectat la 425 ml cu EBME sau s-au realimentat cu SRFE-2 + mediu de lipide de soia și s-au infectat cu sămânță de lucru VZV în 125 (“volum scăzut”) sau 425 (“volum crescut”) ml mediu EMEM sau SRFE (fără lipide de soia). Momentul pentru aceste schimbări de mediu/infecție au fost precum cele descrise în exemplul 7. La diferite momente înaintea infecției (96 sau 24 h înaintea infecției, sau la momentul infecției), s-a adăugat sucroză (suc) până la 50 mM.

Culturile care au primit sucroză înainte de infecție au primit de asemenea sucroză în mediul de infecție cu virus. Toate culturile s-au infectat la un MOI aproximativ 1:15 cu celule infectate VZV în culturi EMEM care s-au recoltat la 46 h postinfecție în stabilizator conținând 20 mM NH₄CI (N), sau nici un supliment. Toate probele s-au înghețat la -7O°C și virusul a fost eliberat ulterior de celule prin sonicare sau omogenizare DOUNCE. Toate probele s-au clarificat prin centrifugare la 1000 x g, timp de 10 min.

Rezultatele PFU atinse pentru probele sonicate au permis următoarele concluzii:

1. Folosirea de volum “ridicat” de mediu EMEM a crescut PFU VZV de 2 ori. Cu SRFE apare, și în alte experimente, că randamentele PFU optimale sunt atinse aproape de volumul “scăzut” de mediu. în unele cazuri, randamentele la volume “ridicate” de mediu sunt reduse.

2. NH₄CI nu este critic pentru recuperări ridicate de PFU.

3. Sucroză a crescut randamentele PFU de 2 ori pentru EBME/EMEM și de 5 ori pentru culturi SRFE. Aici pare să fie un efect al momentului adăugării sucrozei asupra PFU. Pe de altă parte, a acestui experiment, randamentele PFU au fost 94 x 1O³ pentru culturi SRFE + soia/SRFE care nu au primit sucroză și 296 x 1O³, 427 x 10³ și 671 x 1O³ pentru culturi care au primit sucroză la infecție, 24 h înaintea infecției și respectiv, 96 h înaintea infecției.

4. Culturile tratate cu sucroză au prezentat efectele citopatice mai mici față de dublurile lor fără sucroză. în alt experiment, culturile tratate cu sucroză nu au prezentat încă efecte citopatice degenerative la o săptămână după infecție, în timp ce controalele fără sucroză au fost complet lizate. Prin urmare, este posibil ca celule tratate cu sucroză să acumuleze mai mult VZV (antigen și, în special, PFU) la timpi măriți de incubare (mai mult de 46 h recoltă de la experimentul în balon rotativ).

5. MOI nu s-a corectat în acest experiment pentru concentrații mai mari de celule la momentul infecției datorită creșterii celulelor în mediu SRFE. Astfel, s-au putut obține randamente PFU chiar mai mari, dacă acest parametru s-a optimizat.

Exemplul 9. Randamentul VZV fără celule, obținut prin tăiere mecanică, sonicare și o combinație a acestora

S-a realizat un experiment pe scară largă folosind multiple condiții diferite pentru producerea VZV similar experimentului definit în exemplul 8. în acest experiment a fost analizat un nou parametru și anume, modul de distrugere celulară. Rezultatele sunt prezentate mai jos comparând randamentul VZV lipsit de celule atins prin omogenizare DOUNCE și sonicări. Condițiile de cultură VZV raportate sunt pentru celule crescute în medii minimale (EBME/EMEM), sau nutriție înaltă (SRFE-2, plus lipide de soia/SRFE-2,

RO 114906 Bl plus 50 mM sucroză în faza de preinfecție], Celulele s-au crescut și s-au recoltat așa cum s-a descris în exemplul 8 și s-a determinat PFU/ml VZV prin testul descris în exemplul 1.

60

Tabelul 4

PFU/ml (x 103) fără celule
Condiția	DOUNCE	Paiet DOUNCE sonicare	Total	Numai sonicar e
EBME/EMEME	42	7	49	38
EBME/EMEM	64	4	66	46
SRFE-2 + sucroza	154	47	201	42

Din aceste date reiese clar că se poate obține o mărire substanțială a randamentului VZV când se combină tăierea mecanică cu distrugerea sonică a celulelor.

Exemplul 10. Aplicarea mediului SRFE-2 și a suplimentului lipidic de soia pentru 770 creșterea recuperării de vaccin varicela viu din celule MRC-5

S-au inoculat celule MCR-5 în baloane T de 25 cm² în EBME și s-au incubat timp de trei zile la 35°C. Mediul s-a îndepărtat și s-a înlocuit cu 12,5 ml de mediu EMEM proaspăt, sau mediu SRFE-2 cu 10% FCS, neomicină, glutamină, și fie lipide de soia sau o diluție de lipide de 1:200. Culturile s-au incubatîncă trei zile la 35°C. Apoi, mediile au 775 fost îndepărtate și celule au primit celule MCR-5 infectate VZV și 12,5 ml volume de ser fetal de vițel 2%, neomicină, glutamină în EMEM sau SRFE-2. Condiția de cultură indicată “SRFE-2, a primit SRFE-2 în timpul culturii celulelor și în timpul culturii virusului. Condiția “SRFE+soy” indică probele care primesc mediul SRFE-2 și o diluție 1:200 de lipide de soia în timpul culturii de lipide, dar doar mediul SRFE-2 în timpul culturii virusului. După cultură 7?c timp de 48 h s-au îndepărtat mediile, s-au clătit celulele de 4 ori cu 5 ml volume PBS și s-au raclat în 1,2 ml volume de stabilizator. Probele de la baloanele duplicat s-au strâns și s-au înghețat la -7O°C. După dezghețarea ulterioară, celulele s-au distrus prin sonicare, s-au clarificat prin centrifugare (1000 x g, timp de 10 min], și supernatantele s-au înghețat la -70°C pentru cercetarea ulterioară a titrurilor de infectivitate virală. 785 Rezultatele sunt prezentate în fig. 4.

Concluzii: Folsirea mediului SRFE-2 în loc de EMEM a avut ca rezultat o creștere de 2,5 ori în recuperare de virus varicela viu. Folosirea de mediu SRFE-2 suplimentat soia în timpul culturii celulare a permis o creștere suplimentară de 2,7 ori în recuperarea virusului pentru o creștere netă de 7 ori față de cea atinsă, folosind 79c procedeul creșterii virusului în EMEM.

Exemplul 11. ELISA, competitivă pentru cuantificarea antigenului VZV

Datorită faptului că cercetarea pe plăci VZV este consumatoare de timp, ea nu este corespunzătoare în mod deosebit pentru control în timpul procedeului. O ELISA rapidă, antigen VZV permite măsurarea cantităților de antigen VZV și facilitează 795

RO 114906 Bl urmărirea creșterii virusului în timpul fabricării de vaccin varicela viu. în plus, acest test se poate folosi pentru estimarea cantităților de antigen din vaccinurile volumizate, clarificate și sonicate, și de a măsura potențialul antigenului din fiole umplute cu vaccin liofilizat. Pe scurt, această testare este realizată prin incubarea antigenului din probe de 8oo antigen VZV de testat cu ser anti-VZVîn soluție. Anticorpul liber care rămâne este lăsat să se lege la antigen VZV imobilizat pe plăci de microtitrare ELISA. Cantitatea de anticorp capabilă să se lege la plăci este invers proporțională cantității de antigen din proba de testat. Anticorpul legat la plăci se cuantifică cu un anticorp anti-uman legat la o enzimă și un substrat corespunzător care furnizează un produs colorat care se cuantifică sos spectrofotometric.

Testările ELISA antigen VZV și testarea plăcii VZV vor asigura date corelative • generale dar se pare că testul antigen VZV detectează VZV neviabil la fel de bine ca și pe cel viu. Deoarece răspunsul imun generat de către VZV omorât nu s-a dovedit a fi la fel de eficient ca răspunsul la virusul viu atenuat, testul de placă este un test critic pentru 8io determinarea dozei de inocul viral pentru vaccinuri VZV. Cu toate acestea, testul antigenic este valoros de asemenea, prin aceea că el asigură o măsurare a cantității totale de antigen care urmează să fie administrat la un receptor de vaccin VZV.

Procedeura de testare’.

1. Plăci ELISA se acoperă cu glicoproteine (pg) de la celule MCR-5 infectate sau 815 neinfectate și apoi sunt acoperite cu 1% albumină serică bovină (fracțiunea V, A-9647,

0,1% NaN₃) pentru reducerea adsorbției de anticorpi nespecifici la plăci. Rânduri alternative sunt acoperite cu VZV sau antigen de control (adică rândurile A, C, E și G primesc pgVZV și rândurile B, D, F și H primesc antigen pg de la celule MCR-5 neinfectate].

0 2. Antigenul de testat clarificat (325G x g/minut) se diluează cu stabilizator în eprubete 12 x 75 ml sau în microeprubete. Se diluează 1:1 □ un preparat antigen viral standard (26 unități/ml antigen VZV prin test de pată punctiformă) și apoi în serie 1:1,25 ori pentru a asigura concentrații de antigen de 2,6, 2,1, 1,7, 1,3, 1,1, 0,9 unități/ml. Se pot include diluții suplimentare pentru a asigura G,7 și 0,5 unități/ml de 825 antigen. Această diluție se folosește pentru a genera o curbă standard pentru măsurarea cantităților de antigen în probele de testat.

3. Se diluează în stabilizator un ser uman anti-VZV până la de două ori diluția finală dorită.

4. Se distribuie în microeprubete 3GO pl de antigen diluat amestecat cu 3OG μΙ 830 ser anti-VZV diluat și se pun la incubat la 35°C, timp de 15...22 min. Se include un control uman anti-VZV și diluant (nici un antigen).

5. Se adaugă alicoți de 100 μΙ de la fiecare amestec ser-antigen la replicate de glicoproteină VZV (VZV pg) care acoperă godeurile și două la godeurile acoperite cu pgMCR-5 (4 godeuri de probă] (de exemplu, proba 1 în coloana 1, rândurile A, B, C și

835 D; proba 2 în coloana 2, rândurile A, B, C și D; etc).

6. Plăcile sunt incubate timp de 15±1 minut la 35°C pentru a permite anticorpului liber (necomplexat la antigenul din soluție) să se lege la antigenul viral imobilizat în plăci.

RO 114906 Bl

7. Anticorpul nelegat se îndepărtează prin spălare și godeurile primesc o fosfatază alcalină conjugată de IgG de capră anti-uman, pentru a detecta anticorpul uman legat.

8. După incubare timp de 15±1 min la 35°C conjugatul nelegat se îndepărtează 840 prin spălare. Conjugatul legat se detectează prin incubare timp de 15+1 min la 35°C cu substrat p-nitrofenilfosfat dizolvat în tampon dietanolamină.

9. După terminarea reacției substratului, prin adăugarea de 50 pl/godeu de 3M

NaDH, se cuantifică dezvoltarea de culoare (OD la 45 nm) folosind un spectometru pentru microplăci. 845

Calculele testului și interpretare

1. S-a făcut media valorilor MCR-5 pentru întreaga placă și s-a folosit pentru colectarea legării nespecifice a anticorpului primar sau conjugatului la extractele celulare neinfectate. Pentru a asigura valorile OD VZV-specifice (AOD) s-a scăzut media OD MCR- din mediile corespunzătoare ODVZV. 850

2. Generarea unei curbe standard pentru măsurarea cantităților de antigen:

Valorile AOD ale curbei standard s-au analizat față de concentrații cunoscute de antigen (unități VZV/ml).

Datele sunt integrate într-un program grafic corespunzător (care este cunoscut în domeniu), se identifică porțiunea liniară a curbei (trebuie să includă cel puțin 4 puncte) 855 și se obține “formula liniei nimerite” (Y=a+bx).

3. Calcularea cantităților de antigen ale probelor de testat:

Valorile pentru a și b sunt date prin formula liniei nimerite și y (AOD) este cunoscut. Rămâne necunoscută valoarea x care reprezintă unități/ml de antigen care pot fi calculate apoi și corectate prin diluarea probei pentru obținerea concentrației 8 60 antigenului al probei nediluate. Un exemplu de calcul general este după cum urmează:

Probă antigen dilutie	Diluție	AOD	unități/ml antigen din formula lineară	unități/ml corecție pentru
A	1:2	Y	X=(y-a)/b

(X)* (factor de diluție)

Concentrația de antigen raportată este cea obținută cu cel puțin proba diluată care asigură o valoare AOD din porțiunea lineară a curbei standard.

Exemplul 12. ELISA antigen VZVși comparație cu randament VZV PFU evo

Probele de VZV fără celule obținute în exemplul 7 pentru care randamentul PFU/ml este prezentat în fig. 1, s-au testat conform ELISA antigen VZV prezentate în exemplul 11. Rezultatele acestui test sunt prezentate în fig. 2.

Este de remarcat că antigenul VZV continuă să crească la 96 h chiar, cu toate că, conform datelor din fig. 1 PFU/ml este în scădere. De asemenea, este de remarcat 875 că nivelul antigen VZV în SRFE-2 plus soia și sucroză este de aproape 16 ori peste nivelul în EMEM (fig. 2), existând încă VZV fără celule viabil generator PFU (fig. 1). Din această comparație se pare că efectul sucrozei are o contribuție majoră la menținerea VZV-ului viabil, la 72 h după infecție.

RO 114906 Bl

880

885

890

895

Exemplul 13. Mărirea creșterii celulare MCR-5 folosind mediu SRFE-2 și un supliment lipid de soia

S-au inoculat celule MCR-5 în baloane-T de 25 cm² cu 53QOO celule/ml în 12,5 volume de EBME, 10% FCS, 50 pg/ml neomicină și 2 mM glutamină și s-au incubat la 35°C. După 2...3 zile, mediul s-a îndepărtat și s-au înlocuit (schimb 2) cu 12,5 ml de mediu proaspăt sau mediu SRFE-2 conținând 10% FCS, 50 pg/ml neomicină și 2 mM glutamină și diferite cantități de lipide de soia. Lipidul de soia nediluat a conținut 20 mg/ml lipid și 100 mg/ml albumină serică bovină.

Mediile s-au îndepărtat la 6 zile după plantarea inițială a celulelor și s-au înlocuit cu volume de 12,5 ml de 2% FCS, 50 pg/ml neomicină și 2 mM glutamină în EMEM sau mediu SRFE-2 suplimentat cu diferite cantități de lipide de soia. Celulele s-au desprins din baloanele selectate prin tratament cu tripsină și celulele s-au numărat într-un hemocitometru. Numărătorile celulelor s-au determinat pentru culturile care rămân după două zile suplimentare de cultură la 35°C și rezultatele sunt prezentate pe scurt în tabelul 5.

Tabel 5

900

905

Folosirea mediului SRFE și lipidelor de soia pentru sporirea densităților de celule MCR-5

Mediu	Experiment 1	Experiment 2
EMEM (E)	2,3	1,5
SRFE (S)	4,0	3,8
S + 1:100 soia	ND	7,6
S + 1:200 soia	7,9	7,6
S + 1:500 soia	5,9	3,7
S + 1:2000 soia	5,0	3,8

910

Mediul schimb 1 = mediu înlocuit cu mediul indicat suplimentat cu 10% FCS, 2-3 zile după plantarea celulelor

Mediul schimb 2 = mediu înlocuit cu mediul indicat suplimentat cu 2% FCS, 6 zile după plantarea celulelor ND = nedeterminat

Concluzii: Folosirea mediului SRFE-2 fără un supliment lipidic are ca rezultat o creștere de aproximativ 2 ori a numărului de celule față de cel atins doar cu mediul EMEM. Randamentele celulare au crescut în continuare în stil dependent de doză prin suplimentarea mediului cu lipide soia. Randamentele celulare maxime s-au atins folosind combinarea mediului SRFE-2 cu aproape 200...400 pg/ml lipid.

Exemplul 14. Creșterea de celule WI-38 conform procedeului acestei invenții

S-au inoculat celule WI-38 în baloane-T de 25 cm² la 53000 celule/ml în 12,5 volume de EBME, 10% FCS, 50 pg/ml neomicină și 2 mM glutamină și s-au incubat la 35°C. După 2 zile, mediul s-a îndepărtat și s-a înlocuit cu 12,5 ml de mediu SRFE-2

915

RO 114906 Bl suplimentat cu 50 pg/ml neomicină, 2 mM L-glutamină și o diluție 1:200 de lipid de 920 soia. Controalele au primit mediu fără supliment lipidic. După 5 zile de cultură la 35°C, mediul s-a îndepărtat, celulele s-au disociat din baloane prin tratament tripsinic și s-au numărat într-un hemocitometru. Baloanele care au rămas s-au menținut încă 3 zile înainte de a se număra celulele. Rezultatele pe scurt, sunt cele care urmează:

5

Tabel 6

Linie Lipid Celule/balon x 10⁶ după celulară supliment 5 zile 8 zile

1	-		4,2		4,8
		+		9,5		10,2
2	-		4,1		4,9
		+		9,3		12,5

Concluzie: Suplimentarea mediului de cultură bogat cu lipid de soia crește randamentul celulelor WI-38 de aproape 2 ori. Folosirea acestei linii celulare pentru producere de VZV este de așteptat să producă similar cu folosirea celulelor MCR-5. 94c

Exemplul 15. Procedura pentru evaluarea sporirii creșterii celulelor MCP-5

S-au cultivat celule MCR-5 în baloane-T de 25 cm² la aproape 53000 celule/ml în 12,5 volume de mediu de bază Eagle cu săruri Earle (EBME), 10% FCS, 50 pg/ml sulfat de neomicină (neo) și 2 mM glutamină (Gin). Culturile s-au incubat la 35°C timp de 3 zile, timp în care monostratele de celule sunt de obicei circa 50...75% confluente. 945 Mediul se îndepărtează și se înlocuiește cu 10 până la 12,5 ml volume de 10% FCS, 50 pg/ml neomicină și 2 mM Gin (±) lipide de soia sau de alt fel, în mediu SRFE-2 și culturile se repun la incubat la 35°C. Numărătorile de celule s-au determinat la diferite momente prin tripsinizarea celulelor (2,5 ml volume de soluție 0,25% citrat de tripsină) și s-au numărat într-un hemocitometru. Viabilitatea celulară s-a urmărit prin excludere celulară 95c de 0,2% Tripan blue. Numărătorile de celule s-au folosit pentru a deriva o concentrație de celule care este corectată în schimb pentru volumul total de suspensie celulară pentru obținerea randamentului celulelor/balon. în unele experimente, culturile s-au schimbat în mediu cu 2% FCS la 3...4 zile după înlocuirea mediului și numărătorile de celule s-au determinat după o incubare suplimentară de două zile. 955

Exemplul 16. Efectul expunerii prelungite a celulelor cultivate la suplimente lipidice S-au cultivat celule MCR-5 în baloane T 25, s-au alimentat după 3 zile (prima realimentare) și numărătorile celulelor s-au detrminat după o creștere suplimentară de 3 zile. Baloanele T 25 s-au lăsat în plus să continue creșterea prin realimentarea ± lipidică (a ll-a realimentare) și s-au lăsat să crească încă 2 zile. Celulele s-au recuperat 960 cu tripsină. Randamentele au fost 2,6 x 10⁶ pentru celulele cultivate în EBME și crescute în EMEM, în timp ce pentru celulele crescute în SRFE-2 plus 1:100 diluție de lipide de soia au atins 6,6 x 10⁶ și 7,7 x 10⁶. Celulele crescute suplimentar 2 zile au dat 2,76 x 10⁶ pentru celulele crescute EBME/EMEM, în timp ce EBME/SRFE-2 fără suplimentare lipidică au dat 9,2 x 10⁶ și 7,88 x 1Cf celule/balon T 25. Celulele crescute 9 65 EBME/SRFE-2 + 1:100 lipide de soia au dat doar 2,48 și 2,28 x 10⁶ celule. Aceste date

RO 114906 Bl indică faptul că expunerea prelungită (circa 5 zile după cea de-a ll-a realimentare) la configurații lipidice ridicate poate eventual să ducă la reducerea randamentelor celulare, probabil datorită morții celulelor. Astfel, în general, celulele sunt realimentate cu mediu

0 bogat din care lipsește suplimentarea lipidică. Această schimbare, la un mediu bogat lipsit de lipide, este deosebit de importantă când se inițiează faza de creștere virală, deoarece lipidul poate fi toxic pentru creșterea virală sau continuă viabilitatea celulelor în prezența atacului viral violent.

Exemplul 17. Efectele a diferite concentrații lipidice asupra creșterii celulare în 975 medii bogate și minimale

Urmând în principal aceeași procedură și schemă cantitativă de realimentare/celule descrise ca în exemplul 16 pentru cultura MCR-5, s-au atins ' următoarele randamente celulare (notă: + și - după mediu arată prezența sau absența cantității indicate, în mg/ml de lipid de soia (sl.) Suplimentat în mediu de a doua

0 realimentare):

Mediu	Totalul baloanelor T 25
MCR-5 randament x 106
Zile după a doua realimentare
3	5
EBME/EMEM (3 experimente)	4,3; 2,46; 1,52	2,94; 3,50
EBME/SRFE-2	3,80
EBME/SRFE-2 -0,4 sl		13,69; 11,09
EBME/SRFE-2 +0,2 sl	11,7	11,65
EBME/SRFE-2 -0,2 sl	5,10	8,51; 6,27
EBME/SRFE-2 +0,2 sl	7,62; 9,7	9,66
EBME/SRFE-2 -0,1 sl	3,52
EBME/SRFE-2 +0,1 sl	4,94
EBME/SRFE-2 -0,04 sl	3,10
EBME/SRFE-2 +0,04 sl	3,16
EBME/SRFE-2 -0,01 sl	2,90
EBME/SRFE-2 +0,01 sl	3,82

995

Datele rezumate mai sus sunt în general consistente, cu observația notată în exemplul 16, că expunerea prelungită a celulelor la concentrații lipidice foarte ridicate nu este benefică, deși efectul toxic remarcat în exemplul 16 este mai puțin pronunțat în acetse date. La concentrații lipidice mai scăzute, expunerea mai îndelungată a celulelor îooo la lipid este mai puțin dăunătoare și poate fi favorabilă creșterii randamentului de celule/cm² de suprafață de creștere.

RO 114906 Bl

Exemplul 18. Efectul concentrației de ser fetal asupra randamentelor celulelor în acest experiment s-a testat adăugarea de 2% sau 10% ser fetal de vițel în prezență de suplimente lipidice. S-au plantat celule MCR-5 în EBME, s-au realimentat 3 zile mai târziu cu SRFE-2 suplimentat cu diferite cantități de lipid de soia și s-au 1005 realimentat 2 zile mai târziu cu aceiași concentrație de lipid în SRFE-2 cum s-a asigurat în prima realimentare. Randamentele celulelor în 10% FCS au fost 9,5, 11,3 și 12,2 x 10⁶ pentru culturile suplimentate cu 0,1,0,2 și respectiv 0,4 mg/ml lichid. Când s-a asigurat 2% FCS, randamentele celulelor au fost 6,5, 8,8 și respectiv 3,2 x 10⁶. Acest experiment scoate în evidență efectul benefic asupra creșterii celulelor prin asigurarea 1010 suplimentării FCS precum și a suplimentării lipidice. Prin urmare, efectele toxice din experiențele celulelor la concentrații ridicate de lipide se atenuează prin asigurarea unei suplimentări FCS suficiente.

Exemplul 19. Efectele diferitelor suplimente lipidice asupra creșterii celulor MCR-5 ioi5

S-au plantat celule MCR-5 în baloane T25 în EBME. în ziua a 3-a celulele s-au realimentat cu mediu SRFE-2, conținând 10% FCS suplimentat cu diferite suplimente lipidice. S-au asigurat la concentrațiile indicate lipide de soia, lipide bogate în colesterol din ser de bovine adulte, sau EX-CYTE I, precum și lipoproteină endotoxină bovină foarte scăzută. Numărătorile de celule la realimentare au fost în milioane: 1,19. Cinci zile mai 102 c târziu s-au numărat celulele. în EMEM, celulele au fost 2,97; în SRFE-2 sau SRFE-2 plus □,4 mg/ml, 0,2 mg/ml și 0,1 mg/ml cu lipide de soia au fost 4,83, 10,44, 8,67 și respectiv 8,04 milioane celule. EX-CYTE I la 1:50, 1:100, 1:200 a generat 5,37, 4,90 și respectiv 4,74 milioane celule. EX-CYTE VLE la 1:25, 1:50, 1:100 a dat o creștere până la 5,49, 7,23 și respectiv 7,92 milioane celule. Lipidele bogate în colesterol la 1025 1:25, 1:50, 1:100 au dat o creștere de până la 6,87, 7,56 și respectiv 7,65 milioane celule. Lipidele de soia au oferit cea mai mare creștere a randamentului celulelor, deși EX-CYTE VLE și lipidele bogate în colesterol au fost aproape la fel de eficiente. Prin urmare efectul nu este doar al lipidelor de soia.

Exemplul 20. Sporirea creșterii celulelor MCR-5 folosind concentrații ridicate de 103o lipide de soia

S-au însămânțat celule MCR-5 în baloane de 25 cm² și s-au realimentat în zilele 3 și 6, ca în exemplul 13. Randamentele celulare/balon în ziua a 6-a pentru culturile EBME/EMEM, SRFE-2 plus 1/100 lipide de soia sau SRFE-2 plus 1/50 lipide de soia au fost 4,3, 9,7 și respectiv 11,7 milioane celule. Viabilitatea celulelor a fost >99% 1035 (judecat prin excludere Tripan blue] pentru toate culturile. Celulele s-au realimentat cu mediu ± lipid de soia, s-au incubat pentru încă 2 zile și s-au determinat randamentele celulelor. Celulele recuperate pe balon pentru aceste culturi au fost 2,9 și 3,5 milioane pentru culturi duplicate EBME/EMEM; 11,65 milioane pentru SRFE-2 plus 1/50 lipide de soia realimentate cu același mediu, în timp ce culturile SRFE-2 plus 1/50 lipide de îoic soia (duplicate) realimentate cu mediu SRFE-2 și fără lipide de soia au dat 13,69 și 11,09 milioane celule; 9,66 milioane pentru SRFE-2 plus 1/100 lipide de soia

RO 114906 Bl

1045

1050

1055

1060

1065

1070

1075 realimentate cu același mediu, în timp ce realimentate cu SRFE și nici un lipid au dat 8,51 și 6,27 milioane în culturi duplicat.

Din acest experiment este clar că randamentele celulelor MCR-5 au crescut cu creșterea cantităților de lipide de soia. Randamentele maxime ale celuleor s-au obținut folosind o diluție 1/5D de lipide de soia (cea mai ridicată concentrație testată). Inducerea lipidului în cel de-al doilea mediu de realimentare a asigurat creșterea moderată a randamentelor celulelor. Cu toate acestea, datele au arătat că randamentele maxime ale celulelor pot fi obținute prin folosirea lipidului 1/5O în primul mediu de realimentare. Suplimentul lipidic se poate omite apoi din al doilea mediu de realimentare. Suplimentul lipidic poate fi dăunător la concentrații ridicate pentru producerea de virus, fiind poate de dorit să se omită lipidul în timpul creșterii virale.

Claims (8)

1. Procedeu pentru prepararea unui vaccin de varicela zoster (VZV) atenuat, caracterizat prin aceea că cuprinde următoarele etape: (a) cultivarea celulelor susceptibile de infecție VZV până la confluență și atingerea unui înalt grad de replicare celulară; (b) infectarea celulelor cultivate conform etapei (a) cât mai aproape posibil de punctul de confluență cu celulele infectate VZV având o multiplicitate a infecției practic cât mai ridicată; (c) menținerea culturii infectate VZV într-o stare de nutriție ridicată, timp de aproximativ 22..96 h și recoltarea la punctul de vârf al producției VZV infectat; (d) spălarea culturii infectate VZV cu o soluție fiziologică, eventual suplimentată cu un agent lizozomotropic; (e) recoltarea celulelor infectate prin îndepărtarea lichidului, adăugarea unui volum minim de stabilizare, raclarea și eliberarea chimică a celulelor și, opțional, congelarea celulelor eliberate infectate VZV la temperatura de -7D°C; (f) distrugerea celulelor infectate VZV până la eliberarea optimă de celule-asociat VZV și îndepărtarea resturilor celulare, pentru a asigura un preparat VZV lipsit de celule și (g) diluarea produsului din etapa (f) în stabilizator și introducerea produsului într-o unitate dozată pentru liofilizare și stocare la 4°C sau temperaturi mai joase, astfel încât la momentul utilizării ulterioare să fie disponibil nu mai puțin de circa 1ODO PFU.

2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că celulele susceptibile de infecție VZV sunt MRC-5, WI-38 sau celule Vero.

3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că cultivarea celulelor cuprinde o fază de inițiere a culturii celulelor în EBME, o fază de creștere a celulelor în mediul SRFE-2 suplimentat cu aproximativ 0,2 mg/ml lipide de soia, începând aproximativ 3 zile de la inițierea culturii celulelor și o fază de preinfecție care cuprinde expunerea celulelor MRC-5 la 2D...5D mM sucroză pentru aproximativ 24...96 h preinfecție.

4. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că VZV atenuat este tulpina Oka a virusului varicela zoster iar temperatura de cultură este între aproximativ 30. ,.37°C.

1080

RO 114906 Bl

5. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că cultivarea îoss celulelor susceptibile la infecție VZV se face în cultură monostrat cu furnizarea unui dizaharid nemetabolizabil, care este sucroză la concentrație de 20...60 mM.

6. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că MOI este aproximativ 1:25 și 1:625.

7. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că agentul 1090 lizozomotropic este clorură de amoniu între aproximativ 20...50 mM sau clorochină la aproximativ 230 mM.

8. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că distrugerea celulelor infectate VZV eliberate se face prin omogenizare DOUNCE, peletarea resturilor și reținerea supernatantului, sonicarea peletelui și repeletare, iar în final combinarea și 1095 reținerea supernatantelor de la peletarea resturilor și repeletare.