PT573107E

PT573107E - Processo para a producao de uma vacina atenuada do virus varicela zoster

Info

Publication number: PT573107E
Application number: PT93201521T
Authority: PT
Inventors: Philip J Provost; David L Krah; Paul A Friedman
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1992-06-04
Filing date: 1993-05-27
Publication date: 2002-02-28
Also published as: YU49210B; RS50330B; KR100350169B1; SK279387B6; YU7504A; WO1993024616A1; ES2317869T3; ES2161702T3; HU9403473D0; EP0573107A2; PT1097988E; US5607852A; NO944654D0; EP0573107B1; JPH09107958A; NO314068B1; CZ304594A3; EP1097988A1; FI945697A; CZ289690B6

Description

-1 -

I

ÍM

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UMA VACINA ATENUADA DO VÍRUS VARICELA ZOSTER”

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O vírus da varicela zoster (VZV) causa varicela e zoster (herpes-zoster). A varicela é uma doença altamente contagiosa que ocorre em pessoas sem imunidade ao VZV. Mais de 90% da população é exposta durante as duas primeiras décadas de vida. Esta doença é uma ameaça severa em relação aos imuno-suprimidos e aos adultos. Em muitos casos, o VZV toma-se latente nas células dos gânglios da espinha dorsal. O herpes-zoster, uma condição crónica dolorosa, ocorre quando o VZV é reactivado do estado latente. A prevenção da varicela por vacinação é um objectivo desejável e é considera-se a instituição da vacinação universal de crianças com uma vacina viva de varicela atenuada. Estudos anteriores comunicaram a propagação do VZV em vários sistemas de cultura de células e o uso de VZV vivo, atenuado e livre de células como vacina. A Patente Americana U.S. 3.985.615 descreve a produção, em células embrionárias primárias de cobaias, da estirpe de VZV Oka atenuada, adequada para uso em vacinas. A Patente Americana U.S. 4.008.317 descreve a cultura em células WI-38 de um mutante de VZV sensível à temperatura para uso como estabilizador de vacina. Também já são conhecidas composições úteis para a manutenção de VZV viável, tais como SPGA. A maior limitação à produção comercial de uma vacina VZV é o rendimento de VZV livre de células em sistemas de cultura celular conhecidos. -2-

Os rendimentos de VZV livre de células são melhorados por um factor de cerca de 5-20 vezes por aplicação do novo processo desta invenção.

Assim, a presente invenção é um processo de alto rendimento para a produção de uma vacina de VZV, atenuado, livre de células.

Os métodos de cultura de células em monocamada conhecidos até •y agora rendem tipicamente cerca de 80.000 a 160.000 células/cm [Mann, Dev. Biol. Stand. 37, 149-152 (1977); Wood and Minor, Biologicals 18, 143-146 (1990)]. O uso de culturas celulares em monocamada para a produção de antigénios virais tem sido prejudicada pela densidade restrita à qual estas culturas de monocamada podiam ser cultivadas.

No passado as tentativas de aumentar a densidade das culturas de células viraram-se para recipientes de cultura de aspersão especializados para aumentar as densidades de saturação para cerca de 1x10 células por cm [Mann, Dev. Biol. Stand. 37, 149-152 (1977)]. A presente invenção oferece um meio único de aumentar os rendimentos de células usando sistemas existentes de cultura celular.

Esta invenção fornece um processo segundo o qual células imobilizadas podem crescer até densidades muito mais elevadas do que era possível antigamente, permitindo assim maiores rendimentos de vírus cultivados em monocamadas para produção de vacinas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se com um novo processo de cultura de células em monocamada. O processo requer o uso de um meio de cultura enriquecido, por oposição a um meio mínimo, e opcionalmente o suplemento do -3- meio enriquecido com uma concentração de lípidos optimizada. De acordo com uma parte desta invenção, com o uso de um novo meio de crescimento contendo um meio SRFE-2 suplementado com cerca de 0,02-0,4 g/ml de lípidos de soja, são possíveis aumentos substanciais na densidade da cultura de células em monocamada. A densidade aumentada da monocamada celular assim conseguida é útil para melhor produção de antigénios virais para produção de vacinas anti-virais.

Aplicado à produção de uma vacina particular, a presente invenção pode ser usada num processo para a produção de grandes quantidades de uma vacina VZV livre de células, viva e atenuada, útil para a prevenção de varicela, o qual inclui a propagação óptima de VZV na cultura de células, e a colheita do vírus em condições que maximizem o rendimento em VZV e a estabilidade. Os passos do processo optimizado compreendem:

Cultura de células susceptiveis de infeção VZV seleccionadas a partir de células diploides humanas, tais como MRC-5 para confluenciar em cultura de monocamada, em condições de nutrição suficientes para assegurar a replicação celular para a confluência, e suprimento de um dissacárido não metabolizavel, tal como a sacarose; b. Infecção das células cultivadas de acordo com o passo (a) até perto do ponto de confluência com células infectadas com VZV; c. Manutenção da cultura infectada por VZV num estado de nutrição elevado por cerca de 22-96 horas e colheita no ponto máximo de produção de infecção VZV; d. Lavagem da cultura infectada por VZV com uma solução fisiológica, antes da colheita das células infectadas por VZV;

✓“> r > 8 •--------‘Λ*'-*-*^ e. Colheita das células infectadas por VZV para um volume mínimo de solução de estabilização, e ruptura imediata das células ou congelamento das células para posterior ruptura. f. Ruptura das células infectadas com VZV para libertação optimizada do VZV associado às células, e remoção dos detritos celulares, para obter uma preparação VZV livre de células.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1. Rendimentos VZV PFU em Meios Suplementado com

Sacarose

Fig. 2. Rendimentos de Antigénio VZV Livres de Células

Fig. 3. Estabilidade VZV em estabilizador SPGA a -20°C ou 4°C.

Fig. 4. Rendimentos de VZV PFU Obtidos Usando Meios de Cultura Diferentes.

Fig. 5. Efeito da Introdução de MOI associado a Células nos Rendimentos de VZV

DESCRICÂO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito a um método de crescimento de células em cultura em monocamada. O objecto da invenção é conseguir uma densidade melhorada de células de cultura imobilizadas. Este objecto é alcançado pelo fornecimento de um meio de crescimento enriquecido, opcionalmente suplementado com um lípido, em concentrações optimizadas. -5-

/ ' r.:.* 5 ( *-lk

Um meio enriquecido preferido para uso neste processo é SFBE-2, (comercialmente disponível na SIGMA Chemical Co., St. Louis, MO, S2138 ou na Serva Fine Chemicals, Heidelberg, Alemanha 47523). Este meio foi descrito por Weiss el al. [In Vitro 16(7), 616-628 (1990)]. Outros meios equivalentes ou ligeiras alterações na composição do SRFE-2, podem ser usados da mesma forma aqui descrita.

Qualquer um de um número de suplementos de lípidos conhecidos pode ser usado com vantagens nesta invenção. Por exemplo, descobriu-se que lípidos ricos em colesterol provenientes de soro de bovino adulto (SIGMA CHEMICAL CO. catalog # L-4646), o lípido IEX-CYTE ou o lípido Endotoxina Muito Baixa (Very Low Endotoxin VLE) (MILES Inc., catálogo #’s 82-004-7 a 8 e 82-019-1) eram muito benéficos como suplementos de meio enriquecido. Um aditivo lípido preferido é o extracto de soja, disponível comercialmente na Boeringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis IN, catálogo # 1074482. Este material, ou um material semelhante, é descrito por Iscove e Melchers [J. al. Exp.. Medicine, 147, 923-933, 1979)] como um substituto do soro numa cultura de linfócitos-B. Não é aí feita nenhuma sugestão, nem há na descrição do Catálogo de Produtos da Boehringer Mannheim , de que o suplemento de lípido de soja seria útil para suplementar meios enriquecidos. De acordo com estas fontes, o lípido é para ser usado como um substituto do soro em culturas de meio mínimo. Tal como é usado nesta invenção, o lípido é um suplemento de meio enriquecido. Além disso, de acordo com as fontes publicadas, o lípido é usado a uma concentração de cerca de 10-100 pg/mL. De acordo com a presente invenção, o lípido pode ser usado optimamenle numa concentração 2-3 vezes superior às concentrações sugeridas na literatura do fabricante. Além disso, tal como usado nesta invenção, o suplemento de lípido pode ser usado como aditivo, mais do que como substituto, de suplemento de soro.

No processo desta invenção, são inoculadas num recipiente de cultura células MRC-5, células WI-38, células Vero ou outro tipo de células útil para a propagação de vírus. A fase inicial de plantação das células é conduzida, quer num meio mínimo já conhecido tal como EMEM ou EBME, quer num meio enriquecido tal como SRFE-2 sem suplemento de lípido. Cerca de 10% de Soro Fetal de Bovino (Fetal Calf Serum, FCS), um antibiótico tal como a neomicina (cerca de 50 pg/ml é adequado) e L-glutamina (cerca de 2mM) também podem ser fornecidos com vantagem. As células são cultivadas, por vários dias, a uma temperatura tolerável para os vírus, usualmente cerca de 34-37°C, e preferencialmente, a cerca de 35°C, dependendo do vírus a ser produzido.

Após as células se terem claramente imobilizado e estando a desenvolver-se numa cultura em monocamada, o meio enriquecido ou mínimo é removido, e substituído por meio enriquecido fresco, opcionalmente suplementado com uma concentração de lípido optimizada.

Após um período de mais crescimento, o meio pode ser novamente removido e substituído com meio enriquecido fresco, sem suplemento de lípido. Descobriu-se que o fornecimento de lípido, após as células terem aproximado ou atingida a confluência, era contraproducente, diminuindo o rendimento máximo celular.

No caso de as células cultivadas em monocamada forem para ser infectadas com um inoculo virai, o suplemento de lípido é eliminado e o caldo de vírus é introduzido numa nova quantidade de meio enriquecido. A ausência de lípido nesta realimentação permite um crescimento celular acrescido, sem o problema de diminuição celular induzida por lípidos, acima mencionado.

Seguindo o processo acima descrito, são obtidos aumentos substanciais de rendimentos de vírus e de células. Assim, para o vírus de varicela cultivado em células MRC-5, é atingido um aumento substancial no rendimento de Unidades Formadoras de Placas (Plaque Forming Units, PFU) VZV, em comparação com quando as células MRC-5 são cultivadas em meio mínimo ou apenas em meio SRFE-2. Da mesma forma, células WI-38, as quais são úteis para o crescimento da varicela ou para a produção do vírus Rubéola, crescem atingindo densidades substancialmente maiores, quando cultivadas de acordo com este novo processo.

Aplicado à produção de uma vacina específica, o novo processo desta invenção inclui a propagação do VZV na cultura celular, e a colheita do VZV resultante em condições que optimizam a estabilidade e o rendimento do vírus. A vantagem revelada para a produção do VZV será aplicável à produção de outros vírus revestidos, incluindo outros vírus herpes além do VZV, sarampo, papeira ou rubéola. O objectivo último desta invenção é fornecer um processo que permita a produção eficiente de VZV para uso como vacina. O sucesso do processo é avaliado pelo rendimento de VZV livre de células atingido finalmente, depois da optimização de cada passo do processo. O rendimento é determinado pelo título de infecciosidade da preparação final de VZV livre de células. Os títulos de infecciosidade de preparações do vírus de varicela zoster (VZV) foram obtidos por um processo de revestimento de agarose ou revestimento de líquido descrito por Krah et al. (J. Virol. Methods, 1990, 27:319-326). Resumidamente, este método envolve a cultura de células MRC-5, as quais são susceptíveis de infecção pelo VZV, para um estado activo de replicação, isto é, a um ponto em que as células são cerca de 50-80% confluentes. O vírus é, então, sobreposto sobre a monocamada de células no volume mínimo, sendo-lhe permitindo imobilizar-se nas células e então é adicionado meio de crescimento adicional. Após vários dias de crescimento, as células são expostas a uma coloração de proteínas, e as áreas limpas, placas, são contadas. Assim, para um volume conhecido de inoculo de vírus, o número de unidades formadoras de placas (PFU) por milímetro representa uma boa medida do rendimento do vírus. Multiplicando pelo volume total de vírus livre de células obtido a partir de qualquer dada preparação virai, o número total de PFU pode ser calculado.

Devido à variabilidade no próprio ensaio, o aumento de PFU obtido por optimização de qualquer processo particular é reportado como um quociente em relação a algum passo de processo menos optimizado. Por isso, esta forma de expressar os aumentos de rendimento de vírus em temos multiplicativos anula qualquer variabilidade no próprio ensaio de PFU. Em último caso, os passos do processo aqui descritos resultam cumulativamente num aumento entre cerca 16-20 vezes dos rendimentos de VZV obtidos usando métodos conhecidos. Este aumento não é reportado na literatura e representa uma contribuição significativa para o conhecimento da produção de vacina de VZV.

Sendo o ensaio de placas VZV muito demorado, não é particularmente adequado para controlo em processo. Um antigénio rápido ELISA permite a medição de quantidade de VZV para permitir monitorizar o crescimento do vírus durante a produção da vacina da varicela viva. Adicionalmente, este teste pode ser usado para estimar quantidades de antígeno VZV em volumes de vacina sonicados e clarificados, e potencialmente, para medir antígeno em tubos fechados cheios de vacina liofilizada. De uma forma breve, este ensaio é conduzido por incubação do antigénio VZV de amostras de teste com soro anti-VZV em solução. Ao anticorpo livre remanescente é permitido ligar-se ao antigénio VZV imobilizado em placas de microtitulação ELISA. A quantidade de anticorpo capaz de se ligar às placas é inversamente proporcional à quantidade de antigénio na amostra de teste. A ligação do anticorpo às placas é quantificada por reacção com um anticorpo anti-humano ligado a enzima e com um substrato apropriado para fornecer um produto colorido o qual é quantificado espectrofotometricamente. O antigénio VZV ELISA e os ensaios de placa VZV deveriam, geralmente, providenciar dados correlacionados, mas deve ter-se em mente que o ensaio antigénio VZV detecta o VZV não viável tal como o VZV viável. Dado que a resposta imune gerada por VZV morto não se mostrou ser tão efectiva como a resposta a vírus vivo atenuado, o ensaio de placa é o ensaio crítico para a determinação da dose de inoculo de vírus para as vacinas VZV. No entanto, o ensaio antigénio é útil por fornecer uma medida da carga do antigénio total a ser administrada a um receptor de vacina VZV, é mais rápido do que o ensaio PFU e, por isso, permite monitorização em linha da produção de VZV, e correlaciona-se, pelo menos, com o ponto de pico de produção PFU VZV permitindo estimar o momento óptimo para a colheita. O sucesso do processo desta invenção é incrementalmente melhorado por cada um dos seguintes parâmetros críticos: a. Cultivo de células susceptíveis de infecção VZV, seleccionadas a partir de célula diplóides humanas, tais como MRC-5 até à confluência em cultura monocamada, usando elevados volumes de cultura ou meios de cultura enriquecidos para conseguir um elevado grau de replicação de células, e _suplemento de um dissacárido não metabolizável, tal como a sacarose:

Pode ser usado qualquer sistema de um número de sistemas de cultura celular que se saiba ser útil para a produção de VZV. Assim, células Vero, células WI-38, células MRC-5 e um número de outros tipos de células têm sido usados para este propósito. Temos consistentemente usado células MRC-5, as quais são aceitáveis para produção de vacinas para uso humano. Não é inconcebível, no entanto, que os rendimentos de VZV livre de células possam ser - 10- melhorados, para além da extensão aqui reportada, se for utilizada outra linha de células particularmente produtiva que não a MRC-5 . A comparação de rendimentos de vírus vivo livre de células, em monocamadas de células MRC-5, confluentes ou sub-eonfluentes, incubadas a 35°C sob uma atmosfera de 5% de C02 em Eagles Minimum Essential Médium (EMEM) com 2% ou 10% de Soro Fetal de Bovino (FCS) revela o efeito de confluência de células no rendimento de unidades formadoras de placas (PFU) de VZV livre de células (ver Exemplo 2, Tabela I). O uso de monocamadas de células confluentes dá origem a um aumento de cerca de 2-3 vezes no PFU livre de células/ml em relação ao rendimento conseguido por infecção de monocamadas subconfluentes, quer as culturas subconfluentes estejam a proliferar activamente (10% soro) ou não (2% soro). Portanto, células confluentes mas não proliferando activamente parecem ser necessárias para rendimentos de VZV melhorados no processo de produção da vacina. A percentagem de Soro Fetal de Bovino presente durante o crescimento virai não parece ter um grande efeito nos rendimentos de PFU livre de células. Assim, tipicamente, durante a fase de crescimento das células, é fornecido FCS a cerca de 10%, enquanto que durante a fase do crescimento virai do processo, é fornecido FCS a cerca de 2%, quer seja usado para crescimento de células e cultura de vírus um meio mínimo, tal como EMEM ou EMBE, ou um meio enriquecido, tal como SRFE-2 .

Além do meio e do FCS, tipicamente, são adicionados aos meios de cultura de vírus e de cultura de células um antibiótico, tal como 50 pg/ml de Neomicina, e glutamina (cerca de 2 mM). 1. Fase de plantação de céhilas:

Contentores de cultura de células (frascos, garrafas de agitação, ou equivalentes funcionais destes recipientes de cultura) são semeados com MRC-5 ou outras células diplóides, de forma a que a concentração inicial de células esteja entre cerca de 10 000 e 40 000 células/cm2. As células são alimentadas com meio de crescimento suplementado com cerca de 10% de Soro Fetal de Bovino,. gaseadas com CO2 a 5% e incubadas a cerca de 30-37°C, e preferivelmente a cerca de 35°C.

As células podem ser plantadas num volume tão pequeno quanto necessário para cobrir completamente as células cultivadas em cultura estacionária. Um quociente volume/área superficial adequado é cerca de 0,5 ml de meio de cultura por cm2 de superfície de crescimento. Quando as células são cultivadas em garrafas de agitação, uma quantidade tão pequena como 125 ml por 850 cm2 pode ser adequada, mas é preferível cerca de 425 ml/cm2.

Meios de cultura de células já conhecidos, disponíveis comercialmente, tais como Eagles Minimal Essential Médium (EMEM) ou Eagles Basal Médium suplementado com Sais de Earl (EBME), podem ser usados com cerca de 10% de FCS para a fase de plantação de células. Altemativamente, nesta fase, pode ser usado com vantagem um meio mais rico. O meio SRFE [Weiss, et al. In Vitro 16(7), 616-628, (1980)], disponível na SIGMA, é um meio enriquecido que pode ser usado com vantagem neste estágio, mas um meio enriquecido não é crítico para esta fase do processo. 2. Fase de crescimento celular: É crítico que nesta fase do processo seja fornecida suficiente nutrição para assegurar o crescimento de células para elevada confluência. Isto pode ser conseguido fornecendo um grande volume de meio mínimo ou uma quantidade menor de meio enriquecido. As células são cultivadas a ccrca de 30-37°C e, preferivelmente, a cerca de 32-35°C.

Após permitir um período adequado para a imobilização e para crescimento das células, as células podem ser re-alimentadas, por remoção e substituição do meio, e depois continuando a incubação. O meio pode ser removido por aspiração ou decantação, ou qualquer outra forma desde que a integridade da monocatnada de células não seja comprometida. Para células MRC-5 plantadas como descrito acima, a re-alimentação pode ser realizada cerca de 72 horas após a introdução das células no recipiente de cultura. O volume de meio de cultura substituído pode ser o mesmo que foi usado para a fase de plantação de células. No entanto, preferivelmente, um volume maior do que o que foi usado durante a plantação é fornecido durante a fase de cultura celular. Isto é particularmente importante quando as células estão a ser cultivadas num meio mínimo tal como EMEM ou EBME mais FCS. Um grande volume de cultura é uma forma de assegurar que as células recebem a nutrição adequada. A necessidade de um grande volume pode ser reduzida onde o meio fornecido para a fase de crescimento seja um meio enriquecido. Um meio particularmente preferido para este propósito é o SRFE-2 (SIGMA). O uso de um meio enriquecido neste estádio, mais do que um meio mínimo, aumenta consideravelmente a densidade da monocamada de células na confluência. A densidade de células aumentada conduz a melhor rendimento de VZV passível de ser obtido a partir de uma cultura de células infectada cultivada num meio enriquecido. Assim, o uso de um meio enriquecido durante a fase de crescimento celular terá dado origem a um aumento de cerca de 2-4 vezes no rendimento final de VZV, em relação ao que é conseguido quando as células são cultivadas num meio mínimo neste estágio. -13- yjjj , , / /<SS *>·5 '- *

Num modelo de realização preferido, o SRFE-2 c suplementado com lípido. Qualquer de um número de suplementos lípidos são úteis. Assim, descobriu-se que lípidos ricos em colesterol de soro de bovino adulto (SIGMA CHEMICAL CO.), lípido-I EXCYTE ou lípido Veiy Low Endotoxin (VLE) (M1LES) são benéficos como meios enriquecidos ou suplementos de meio mínimo. O lípido de soja comercialmente disponível (Boehringer Mannheim, ver também Iscove et al., J. Exp. Med. 147, 923-933 (1978)] provou ser um suplemento muito benéfico quando fornecido a cerca de 0,2 mg/ml. Usando SRFE-2 mais lípidos e FCS foram conseguidas densidades de células próximas de cerca de 500 000/cm2. Quando são fornecidos lípidos, independentemente de o crescimento celular se dar em meio mínimo ou em meio enriquecido, são obtidos rendimentos melhorados de VZV. É fornecido material comercialmente disponível como 20 mg/ml de lípido, um caldo de soro de albumina de bovino a lOOmg/ml. Este material é usado convenientemente a tuna diluição final de 1:100. O rendimento final de VZV foi melhorado em cerca de 9 vezes, em relação ao rendimento de VZV em apenas EMEM, e em cerca de 3,3 vezes, em relação ao meio SRFE-2 sozinho, quando o SRFE-2 era suplementado com cerca de 0,2 mg/ml de lípido de soja durante a fase de crescimento celular. 3. Fase de pré-infeccão

Descobrimos que o rendimento final de VZV pode ser mais melhorado quando as células cultivadas são expostas a um dissacárido não tóxico, não metabolizável, a uma concentração óptima, antes da infecção VZV. Uma modelo de realização preferido muito bem sucedido fornece cerca de 20-60 mM de sacarose cerca de 72 horas após as células serem introduzidas no recipiente de cultura, e, preferencialmente, cerca de 24 a 96 horas antes da infecção da cultura com VZV. Como facto prático, o fornecimento de cerca de 50mM de sacarose no meio de re-alimentação do passo 2 acima, cumpre estes critérios e reduz o número de manipulações estéreis requeridas ao tomar -14- /"í ®Ά efectivameute simultâneos este e o passo prévio.

Outros dissacáridos, incluindo a lactose, celobiose e maltose também melhoram o rendimento final de VZV, mas a sacarose é preferível. Os monosacáridos testados, tais como a frutose e ribose, não melhoraram o rendimento de VZV (a ribose pode até ser tóxica). Aparentemente os dissacáridos estão a ser concentrados nos Iisossomas das células em crescimento, inchando estes para formar vacúolos [DeCourcy e Storrie, Exp. Cell. Res. 192, 52-60 (1991)]. Este efeito dos dissacáridos no rendimento de VZV pode ser devido a atenuação do dano de Iisossomas de VZV. Adicionalmente aos dissacáridos, pode-se esperar que os tri- e tetrassacáridos possam ter efeitos benéficos visto que Cohn e Ehrenreich [J. Exp. Med. 129, 201-222 (1969)] notaram vacuolização idêntica quando estes açúcares superiores, ou sacarose, eram alimentados a macrófagos, desde que os açúcares não fossem metabolizados pelas células. b. Infecção das Células Cultivadas de Acordo com o Passo (a) tão perto quanto Possível do Ponto de Confluência com uma Multiplicidade de Infecção de Células Infectadas por VZV tão Elevada Quanto for Praticável:

Descobrimos, por experiências repetidas, que em média, as células permitidas repousar por 48 horas, após se terem tomado confluentes, rendem apenas cerca de 50% do VZV PFU/ml em comparação com o rendimento quando células recentemente confluentes são infectadas com o VZV. Assim, é importante fixar o tempo a introdução do inoculo de VZV para que coincida, tanto quanto possível, com a confluência. Infelizmente, a confluência é um parâmetro que varia de acordo com o tipo de meio, o tipo de célula cultivada e outras condições de cultura usadas. Para células MRC-5 plantadas de acordo com o passo (a) (1) acima, as células são tipicamente infectadas no ponto de atingirem a confluência. O vírus de varicela-zoster (VZV) é preferivelmente a estirpe Oka de vírus atenuados descrita na Patente Americana 3 985 615 e que está em depósito na ATCC. Este vírus é adaptado ao crescimento em culturas de células de embrião de cobaias e culturas de células diplóides de fibroblastos pulmonares humanos (p. ex., células MRC-5).

Pode ser preparado um caldo de células, infecciosas, viáveis, infectadas pela varicela, infectando células MRC-5 num MOI de cerca de 1:125, mantendo as células infectadas para permitir a replicação do vírus, por tripsinização das células, e usando as células libertadas imediatamente como semente de trabalho ou armazenando-as para uso posterior e quantificação PFU por congelamento lento com um crioprotector, tal como o DMSO ou glicerol, a cerca de 107 células/ml. O caldo congelado de células infectadas com VZV pode ser descongelado e adicionado a uma cultura de células confluentes para iniciar a infecção VZV.

Altemativamente, as células infectadas com VZV podem ser liofilizadas, de acordo com o método descrito por Hondo et al., [Archiv fur die gesamte Virusforschung 40, 397-399 (1973)], o qual permite um armazenamento a longo prazo, a 4°C, do inoculo liofilizado. Também é possível usar VZV livre de células como inoculo, mas devido a perdas no rendimento de vírus durante a colheita, é preferido o uso de um inoculo ligado a células.

Outra possibilidade para a produção do caldo de semente infectada de vírus é iniciar o crescimento das células para produção de semente de vírus antes da plantação das células de produção. No ponto de infecção das células semente com células infectadas com VZV, a plantação de células de produção pode ser iniciada para atingir a confluência ao mesmo tempo que as sementes de -16- vírus atingem picos de título de VZV. Menos optimamente, mas mais convcnicn-temente, as células de semente e as células do meio podem todas ser plantadas ao mesmo tempo, num pequeno volume de meio de cultura (cerca de 125 mL por 850 cm2 de garrafa de agitação). Após crescimento por cerca de dois-três dias, as garrafas para produção de semente de VZV são aumentadas em volume para cerca de 425 mL, ou re-alimentadas com com meio enriquecido, para permitir o crescimento para a confluência. As células de produção são deixadas relativa-mente dormentes num pequeno volume de meio mínimo (incluindo cerca de 10% FCS) até cerca de dois dias antes de as células semente de trabalho serem infectadas com células infectadas com VZV. Neste ponto, o volume de produção de células é aumentado para cerca de 425 mL ou re-alimentado com meio enriquecido, tal como SRFE-2 mais uma quantidade óptima de lípido de soja e de soro fetal de bovino. As células de produção crescerão então até grande confluência. Dois dias após a re-alimentação das células de produção, as células semente de trabalho, agora em confluência, estão infectadas com células infectadas com VZV a um MOI de 1:125 ou superior, e é permitida a continuação da replicação de VZV por cerca de dois ou três dias. Na altura de ser atingido o pico de produção de VZV nas culturas de semente, as células de produção terão atingido a confluência. Então as células de semente são colhidas e adicionadas às células de produção.

Seja qual for a altura de produção de semente, um intervalo de tempo apropriado após a infecção por VZV, o meio é aspirado da cultura infectada com VZV, a semente infectada com VZV é colhida por tripsinisação (cerca de 0,25% de tripsina) ou outro meio que não provoque ruptura, e as culturas de produção de células são infectadas a um MOI conhecido.

Schmidt, N. S. e Lennette, E. H., [Infection and Immunity 14, 709-715 (1976)] notaram a importância de um MOI elevado para um rendimento VZV elevado, mas não fizeram nenhuma comparação estrita com a infecção a baixo MOI. A presente invenção faz precisamente essa comparação.

As células são infectadas com VZV por remoção do meio de crescimento das culturas de células e substituindo-o por meio fresco contendo uma quantidade conhecida de células infectadas com VZV, preparadas tal como descrito acima. O caldo de vírus é preferencialmente titulado para determinar unidades formadoras de placas varicela (PFU), e as células receptoras são contadas para permitir quantificação da multiplicidade da infecção (Multiplicity of Infection, MOI). MOFs são expressos como a razão entre as células infectadas com VZV no inoculo e o número de células da monocamada não infectadas na cultura. Assim, um MOI de 1:10 é elevado, enquanto que 1:625 é baixo. Um MOI elevado é desejável, mas como um facto prático, bons rendimentos de VZV podem ser conseguidos com um MOI tão baixo como 1:125. MOIs entre 1:7 e 1:625 rendem entre cerca de 500 000 PFU/ml, no MOI elevado, até cerca de 100 000 PFU/ml, no extremo de baixo MOI (ver Tabela 3 do exemplo 5). Quanto mais elevado for o MOI, mais curto o tempo de incubação requerido para atingir o pico de PFU e maior o rendimento. Assim, uma gama cerca de 5 vezes superior pode ser conseguida nas PFU finais dependendo do MOI e da altura da colheita. c. Manutenção da cultura infectada com VZV num estado de elevada nutrição por cerca de 22-96 horas e colheita no ponto de pico de produção de VZV: O cultivo de células infectadas com VZV é continuado por aproximadamente 22 a 96 horas após a infecção. É crítico que uma nutrição adequada seja mantida neste estádio de crescimento do vírus. É desejável um -18-

fomecimento de elevados volumes de cultura de um melo mínimo, tal como EMEM mais cerca de 2-10% FCS, ou um volume menor de meio enriquecido. Preferivelmente, é fornecido SRFE-2 mais 2-10% FCS sem a adição de suplemento de lípido. Notou-se que o lípido reduz o rendimento em VZV quando incluído neste estágio.

Durante as 22-96 horas de cultura pós infecção, o VZV replica-se nas células que foram infectadas e espalha-se para infectar células adjacentes. No entanto, células antigas infectadas não darão PFU livre de células recuperável. A curva de crescimento de VZV e subsequente declínio podem ser muito acentuados. Por isso, a temporização correcta do ponto de colheita é um parâmetro crítico para a maximização do rendimento de VZV infeccioso, e pode ser reproduzido com precisão mantendo um controlo apertado do MOI de entrada, da nutrição e do tempo de incubação de lote de produção para lote de produção. Adicionalmente, o antigénio VZV rápido ELIZA pode ser empregue para optimizar o tempo de colheita, dado que a produção de VZV infeccioso correlaciona-se com a produção de antigénio de VZV, pelo menos até ao ponto onde a morte do vírus começa a ocorrer (ver figuras 5 e 6).

Para células MRC-5 infectadas com VZV colhidas cerca de 70 horas pós-infecção, onde cada um dos seguintes passos foi optimizado, (i.e. crescimento em meio enriquecido e exposição pré-infecção das células a 50 mM de sacarose por 72 horas), o rendimento final de VZV livre de células foi aumentado em um factor de cerca de dezasseis vezes em relação ao rendimento obtido com um meio mínimo e colheita de viras às 48 horas, e ainda por uma margem superior do que quando a colheita é feita às 96 horas (ver EXEMPLO 8, Figura 1). O rendimento em VZV, sob as mesmas condições optimizadas, foi de apenas o quadruplo do rendimento obtido com meio mínimo quando o vírus foi colhido 48 horas após a infecção, mas foi ainda grandemente aumentado em relaçSo ao rendimento do meio mínimo a 96 horas. Assim, o rendimento de vírus é muito maior e a morte de vírus é grandemente reduzida em enriquecidos e não há um decréscimo tão acentuado do rendimento de vírus ao longo do tempo. O MOI também se toma menos crítico em meio enriquecido. d. Lavagem da Cultura Infectada com VZV com uma Solução Fisiológica, Contendo Opcionalmente um Agente Lisossomotrópico, tal como Cloreto de Amónia ou Cloroquina, Antes da Colheita das Células Infectadas com VZV:

Para remover soro, lípidos, e detritos celulares da cultura, a cultura em monocamada é lavada com um tampão fisiológico que não cause a lise das células. Salina tamponizada com fosfato (Phosphate Buffered Saline, PBS) é bastante aceitável para este propósito. As células podem ser lavadas várias vezes e a solução de lavagem decantada, aspirada, ou removida por qualquer outro meio, desde que a integridade da monocamada não seja comprometida.

Se as células forem quimicamente libertas do recipiente de crescimento, devem ser concentradas por centrifugação, e o tampão fisiológico substituído por uma solução estabilizadora.

Tem-se verificado que o fornecimento de cloreto de amónia ou cloroquina antes da colheita das células melhora o rendimento final de VZV. Kielian et al. [EMBO J. 5, 3103-3109 (1986)] usaram cloreto de amónia para controlar o pH interno de endossomas das células onde os vírus infecciosos passam, aparentemente, parte da sua vida intracelular. Possivelmente o mecanismo de aumento de rendimento de VZV por exposição das células a agentes lisosomotrópicos está relacionado com indução de um meio endosomal menos agressivo. O carregamento pré-infecção das células com dissacáridos não- tóxicos, não-metabolizaveis, tais como sacarose, e a exposição das células a cloreto de amónia ou cloroquina, podem actuar por mecanismos similares. Em qualquer caso, foi confirmada empiricamente a observação de que os rendimentos finais de VZV são melhorados quando cloreto de amónia é fornecido numa concentração final entre 1-100 mM, e é preferencialmente fornecido a cerca de 4°C por mais de cerca de 25-50 minutos, antes da ruptura das células. Um segundo agente lisosomotrópico, cloroquina, numa concentração de cerca de 230 μΜ, aumenta igualmente a recuperação de PFU VZV/ml. e. Colheita das células infectadas com VZV para um volume mínimo de Solução Estabilizadora, e ruptura imediata das células ou congelamento _das células para ruptura posterior:_

Uma vez lavadas as células infectadas com VZV, estas podem ser colhidas por raspagem, se o recipiente de cultura o permitir, ou por libertação das células quimicamente. A libertação enzimática das células é menos desejável dado que a enzima residual pode diminuir o rendimento de viras se as células sofrerem ruptura. Tal como notado acima, se as células forem libertadas em salina fisiológica, as células são concentradas por centrifugação e a salina fisiológica é substituída por um volume mínimo de solução estabilizadora de VZV. Uma boa razão entre o volume e a área superficial de crescimento das células é cerca de 40 ml de estabilizador por 850 cm2.

Os estabilizadores de vírus são já conhecidos. Assim, a estabilização com sacarose a 5% numa salina tamponizada com fosfato é sugerida na Patente Americana U.S. 3 985 615 enquanto que outras comunicações recomendam estabilizadores mais complexos, tais como SPGA.

Após as células infectadas com VZV terem sido resuspensas numa solução estabilizadora, as células podem sofrer ruptura imediatamente, ou no

-21 - A fi ί V 5^4. f i caso de se prepararem maiores quantidades dc VZV, congeladas a -70°C para Λ posterior processamento. O rendimento em VZV por cm de células cultivadas será ligeiramente maior se as células sofrerem ruptura imediatamente, mas o passo de congelamento usualmente não incorre muna de mais de 10% de rendimento obtido com processamento imediato.

Ruptura das Células Infectadas com VZV para Libertação Óptima do VZV Associado, e Remoção de Detritos Celulares, para obter uma preparação de VZV livre de células:_

Tal como descrito acima, o meio de cultura é preferencialmente removido das células antes da ruptura e substituído com um volume mínimo de estabilizador de VZV no qual as células são raspadas ou libertadas de outra forma. A suspensão de células é refrigerada a 0-4°C, e as células sofrem então ruptura por um meio apropriado, tal como sonicação, homogenização DOUNCE, ou uma combinação destas técnicas.

Confirmámos que a sonicação, por si só, não origina a melhor recuperação de VZV livre de células. De facto, quando é usada a homogenização DOUNCE como passo de ruptura inicial, seguido de centrifugação, retenção do sobrenadante como sobrenadante I, seguida de sonicação das péletes e centrifugação para obter o sobrenadante II, o rendimento em VZV da ruptura é grandemente melhorado. O rendimento combinado dos sobrenadantes I e II tem sido tão elevado como quatro vezes o rendimento obtido quando só é usada a sonicação como técnica de ruptura.

Seguindo a ruptura celular, a remoção de detritos celulares é levada a cabo por centrifugação, filtração, ou qualquer outro meio conhecido para remover os detritos celulares deixando o VZV ileso. A preparação de vírus livre de células é então diluída com solução estabilizadora e subdividida para uso *

ξ '

-22-como vacina. Preferivelmente, para armazenamento a longo prazo, o VZV é liofilizado por qualquer dos métodos conhecidos.

Resumindo, os aumentos aproximados de rendimento potenciais obtidos seguindo os passos optimizados deste processo, em comparação com a produção de VZV por crescimento celular em meio mínimo, são apresentados abaixo:

Passo do Processo

Factor de Aumento de PFU

Meio/Suplemento 1. MOI 2-5 2. Confluência de células 2-3 3. Meio SRFE-2 + lipido 2-3 4. Sacarose na fase de pré-acificação 2-5 5. Volume óptimo de meio 1-2 >8

Aumento potencial líquido para combinação meio/ suplementos de estabilizador e condições de infecção optimizadas

Aumento observado para a combinação de 3, 4 e 5 em garrafas de agitação 16 6. Combinação de corte/sonicação para libertação de VZV ligado a células 1,5

Aumento potencial total em relação ao processo não optimizado > 18 -23 - -23 - ‘‘i· 5 R x? /;ν·ν ; A' ,4··

Utilidade deste processo para a Prudueãu de Vacina:

Foi demonstrada a utilidade de VZV atenuado, livre de células, como vacina para prevenir varicela. Múltiplos estudos clínicos têm provado conclusivamente esta utilidade, e essa prova é agora parte do conhecimento adquirido [ver por exemplo Pediatrics 88 (3), 604-607 (1991); Pediatrics 87, (5), 604-610 (1991)]. Assim, a grande contribuição que esta invenção faz para o conhecimento adquirido é que fornece um processo altamente eficiente para produção com grande rendimento de VZV vivo, atenuado. O vírus preparado de acordo com esta invenção pode ser formulado como uma vacina de acordo com métodos já conhecidos, e administrado de acordo com regimes presentemente já bem estabelecidos. Por exemplo, o produto VZV vivo, atenuado, livre de células, pode ser diluído em estabilizador, colocado em frascos, liofilizado em doses unitárias no armazenamento a cerca de 4°C ou abaixo, tal que uma dose de cerca de 1000 PFU esteja disponível na altura da utilização. A vacina VZV produzida de acordo com o processo desta invenção pode ser usada em formulações de dose unitária para inoculação humana para induzir respostas de imunidade protectoras contra a infecção por estirpes virulentas de VZV. Preferivelmente, no mínimo, uma dose de cerca de 2000 PFU/ml (1000 PFU/dose de 0,5 ml) é administrada subcutneamente ou intramuscularmente. Doses tão elevadas como um total de 15 000 a 20 000 PFU foram administradas e são aceitáveis.

Ao fornecer um processo optimizado para a produção de um vírus VZV atenuado, esta invenção toma possível aplicar o que é conhecido até agora para a formulação de uma vacina que aumente as respostas de imunização anti-VZV para prevenir varicela.

Os exemplos seguintes 1-12 são fornecidos com o propósito de ilustrar a presente invenção e não devem ser encarados como limitações do seu ârnbiLu. Os exemplos 13-20 mostram resultados relevantes de testes, mas não estão directamente relacionados com a invenção reivindicada. EXEMPLO 1 ENSAIO PARA DETERMINAÇÃO DO RENDIMENTO EM VZV:

Os títulos de infecciosidade de preparações do vírus varicela zoster (VZV) são estimados usando o procedimento de revestimento de agarose ou revestimento de líquido descrito por Krah et al. (J. Virol. Methods, 1990, 27:319-326). O ensaio é realizado como segue: Células MRC-5 são semeadas em placas de cultura de tecido de 60 mm, com 6 x 105 células em volumes de 5 ml de BME (Basal Médium Eagle com solução balanceada de sais de Hank) com 100 mg lactose/1, 50 pg/ml de neomicina, 2 mM de L-glutamina, e são incubadas a 35°C numa atmosfera de C02 a 5%. Após a incubação por 24-48 horas, as células alcançam 50-80% de confluência. O meio de crescimento é removido por aspiração, e as células são infectadas com 100 μΐ de solução VZV diluída em diluente apropriado para vírus, tal como o tampão SPGA, ou meio de manutenção líquido (Liquid Maintenance Médium, LMM). O tampão SPGA contém 7,5% (peso/volume) de sacarose, 11 mM de fosfato de potássio, 0,1% (peso/volume) de glutamato de sódio e 1% de soro de albumina humana. É permitido ao vírus ligar-se por > 1 hora a 35 °C numa atmosfera de C02 a 5%. As culturas de células infectadas com VZV são então revestidas com 5 ml de meio de revestimento de agarose (Agarose Overlay Médium, AOM) ou meio de manutenção líquido (LMM). O meio de revestimento de agarose é uma mistura de duas soluções, meio de revestimento líquido (Liquid Overlay Médium, LOM) e solução de agarose. LOM contém meio essencial mínimo com sais de Earl (Minimum Essential Médium, MEM), 2% de soro fetal de bovino termicamente inactivado, 50 pg/ml de sulfato de neomicina e 2 mM L-glutamina. A solução de agarose é preparada por aquecimento de 4,5 g de agarose de baixa temperatura de gelificação em 100 ml MEM, por 15 minutos a 121°C, e permitindo à solução arrefecer até 45°C. AOM é preparado por mistura de um volume de solução de agarose com 4 volumes de um concentrado 1,25 x de LOM a 45°C. As placas são arrefecidas a 23-25°C para permitir ao AOM solidificar. As culturas são incubadas para permitir o desenvolvimento das placas. Após 6-7 dias, as placas que receberam LOM são revestidos com 5 ml de salina tamponizada com fosfato (PBS) e cortadas pelo rebordo com uma pipeta de Pasteur de vidro para soltar e remover a agarose. O meio é aspirado das placas que receberam LMM, e as placas são visualizadas por coloração das células com uma solução Azul Coomassie R-250 a 0,2% (peso/volume) em etanol e 1% de ácido acético. As contagens de placas são a média de 4-5 placas réplicas e são expressas como unidades formadoras de placas por ml (PFU/ml)

Devido à variabilidade potencial no ensaio, os melhoramentos no rendimento de VZV são reportados relativamente a condições não optimizadas ensaiadas identicamente. EXEMPLO 2

Rendimento em VZV como função da Confluência das Células na Infecção: Células MRC-5 foram colocadas em placas a 4 x 106 células/150 cm2 e deixadas crescer por 3 dias em Sais de Earl suplementados com Meio Basal de Eagle (EBME) na presença de 10% de Soro Fetal de Bovino (FCS). Ao atingir-se uma densidade de células na subconfluência de cerca de 12 x 106 células/150 cm2, as células foram realimentadas com EBME fresco, suplementado quer com 2% FCS, quer com 10% de FCS. Neste ponto, as células subconfluentes são deixadas crescer ainda mais, quer na presença ou na ausência de infecção VZV (MOI = 1:125), e ao fim de 48 horas são monitorizados o aumento na densidade das células e o rendimento de vírus. Verificou-se que células não-infectadas em 2% FCS aumentaram em densidade apenas 33%, enquanto que em 10% FCS o aumento foi de 92%. As células nas culturas infectadas não aumentaram em número. Tal como mostrado na tabela I, os rendimentos em vírus das células subconfluentes não foram afectados pela capacidade de replicação celular nas culturas, quer estas fossem suplementados com FCS minimamente (2% FCS) ou maximamente (10% FCS).

Outras culturas celulares foram cultivadas mais 2 dias adicionais em FCS 10% até cerca de 20 x 106 células/150 cm2 recipiente (uma condição de confluência), e depois re-alimentados com EBME suplementado, quer com 2% FCS, quer com 10% FCS e foram, quer infectados com VZV (MOI 1:125), quer deixados não-infectados. O aumento na densidade das células e rendimentos de vírus foram monitorizados após 48 horas. Verifícou-se que as células não-infectadas em 2% FCS não tinham aumentado em densidade enquanto que as células em 10% FCS tinham aumentado em apenas cerca de 15%. Assim, nenhuma das condições foi capaz de muita replicação celular. Os rendimentos de vírus, quer em 2% FCS, quer em 10% FCS, foram similares e ambos aumentaram por um factor de cerca de três vezes em relação ao rendimento de células infectadas na subconfluência (ver tabela I). Assim, para rendimentos óptimos de VZV livre de células, fica estabelecido o uso preferencial de monocamadas de células recentemente confluentes por oposição a monocamadas de células subconfluentes em replicação activa. -27- %_______·

Tábela I PFU livres de células Potencial de /ml Replicação de Células durante o Experiência Crescimento do Vírus A B 44 000 30 000 33% 33 000 27 000 92% 119 000 117 000 0% 123 000 100 000 15%

Estado da monocamada de Células na Infecção % de FCS durante 0 crescimento do vírus Sub-confluente 2 10 Recentemente 2 Confluente 10 EXEMPLO 3

Comparação de rendimentos VZV de culturas recentemente confluentes e de confluência anterior:

Garrafas de agitação (850 cm2) foram semeadas com células MRC-5 a uma concentração de aproxímadamente 26 500 células/cm2. Todas as células foram cultivadas em meio EBME contendo 10% (v/v) de soro fetal de bovino (FCSio) numa atmosfera de CO2 a 5%, a 35°C. Os frascos foram divididos em dois grupos, com base no tempo de infecção com VZV. As células do Grupo I foram cultivadas por 5 dias, e ao fim desse tempo as monocamadas de células eram confluentes. Nessa altura, o meio removido e as células foram infectadas com VZV associado a células a um MOI de 1:125, suspenso em EMEM + 25% FCS. Foi adicionado meio adicional e as células foram incubadas por mais outras 48 horas. As células do Grupo II foram mantidas por mais 48 horas adicionais antes da infecção a um MOI = 1:125. -28- -28-

* % A produção de VZV pelas células dos Grupos I e II foi detemiiuada como se segue: o meio foi removido das garrafas de agitação e as células foram lavadas com salina tamponizada com fosfato, raspadas com esferas de vidro em volumes iguais de estabilizador e refrigeradas a 4°C. As suspensões de células frias sofreram ruptura por sonicação. Os detritos celulares foram removidos do vírus por centrifugação lenta (325 x g por 10 minutos) e o sobrenadante virai foi retido. A produção de VZV foi medida pelo ensaio de placa. Tal como indicado na Tabela 2, foi obtido um aumento no rendimento perto de um factor de 2 quando monocamadas de células recentemente confluentes foram infectadas com VZV.

Tabela 2

Experiência 1 Experiência 2

Condição Recentemente confluentes Anteriormente confluentes PFU/ml 121 000 190 000 82 000 85 000 EXEMPLO 4

Efeito do volume de cultura no rendimento de PFU VZV/ml: Células MRC-5 (10 milhões) foram semeadas em volumes de 125 ml de EBME, 10% FCS, 50pg/ml neomicina e 2 mM L-glutamina em garrafas de agitação de 850 cm2 e incubadas, a 35°C, por 3 dias. Foram adicionados 300 ml de meio fresco e as culturas foram repostas em incubação, a 35°C, por mais 4 dias. O meio foi então removido e substituído por 125 ou 425 ml de EMEM, 2% de FCS Íerrmcameiite inaetivado, 50 pg/ml neomicina e 2 111M L-glutamina. Foram adicionadas células MRC-5 infectadas com VZV (MOI de cerca de 1:125), as culturas foram desgaseifícadas com CO2 a 2% e retomadas à incubação, a 35°C, por 46 horas. O meio foi removido, as células foram lavadas 4 vezes com volumes de 100 ml de PBS, raspadas para volumes de 43 ml de estabilizador, com o auxílio de esferas de vidro. As células foram congeladas a -70°C. O vírus livre de células foi preparado por sonicação. As quantidades de vírus infeccioso nos sonicados clarificados (por centrifugação) foram medidas no ensaio de placa de VZV.

Resultados: VZV PFU/ml* 55 000; 45 000 000; 103 000

Volume de meio ímll 125 425 *Resultados de culturas em duplicado.

Conclusão: o uso de volumes de meio mais elevados resulta em aumentos de um factor de cerca de 2 vezes do rendimento de VZV infeccioso a partir de culturas de células MRC-5. EXEMPLO 5

Efeito do MOI do VZV no rendimento VZV PFU/ml:

Garrafas de agitação foram semeadas com células MRC-5 e cultivadas até à confluência. O meio de cultura foi removido e as células foram infectadas com VZV a MOI variáveis. A produção de VZV pelas culturas de células infectadas foi determinada usando 0 ensaio de placa por colheita -30-

periódica e ensaiando como no Exemplo 1. Tal como mostrado na Tabela 3 e na figura 5, a recuperação de VZV infeccioso livre de células foi maior, e conseguida num menor período de incubação, quando eram empregados MOI mais elevados. Também são atingidos mais rapidamente picos de níveis de antigénio com MOI mais elevados. A um MOI muito baixo, tal como 1:625, a produção de antigénio é retardada e sub-óptima (ver figura 3). TABELA 3. Efeito do MOI associado às células inicial nos rendimentos de VZV livre de células a partir de culturas de células MRC-5 em monocamada MOI_Título de VZV livre de células (PFU/ml) x 10 ~3

Tempo de colheita 22 h 37 h 42 h 60 h 1:25 100 450 50 nd 1:125 nd 150 325 100 1:625 nd nd 100 90 EXEMPLO 6

Estabilidade aumentada de VZV num estabilizador a -20°C

Culturas de células infectadas foram sonicadas em SPGA e lavadas com salina tamponizada com fosfato. O vírus ligado às células foi então libertado por sonicação e os detritos celulares foram removidos por centrifugação. A concentração de vírus livre de células foi ajustada a uma concentração conhecida de PFU/ml, e alíquotas do vírus em estabilizador foram liofilizadas e armazenadas a 4°C. on a -20°C. Em intervalos de 1 mês, durante um período total y"*» -31 - de 14 meses, as amostras foram reconstituídas e o título remanescente de PFU/ml foi determinado. Os resultados desta experiência estão na FIGURA 3. A vantagem substancial para a estabilidade de VZV, obtida pelo armazenamento a -20°C em lugar de 4°C, é evidente. EXEMPLO 7

Efeito no rendimento final de VZV da quantidade e do momento da adição de sacarose durante a fase de pré-infecção do crescimento celular:_ 1. Fase de plantação das células: Células MRC-5 (5 ml) foram plantadas numa concentração de 120 000 células/ml (600 000 células no total) em placas de 60 mm em meio EMBE contendo 10% FCS, 50 μg/ml neomicina, 2 mM L-glutamina e incubadas, a 35°C, em C02 a 5%. 2. Fase de crescimento celular/pré-infeccão:

As células estavam confluentes no terceiro dia pós-plantação. O meio de plantação foi aspirado de 48 placas e foi substituído com volumes de 8 ml de meio de crescimento contendo EMBE ou SRFE-2 suplementado com 10% FCS, 50 pg/ml neomicina, 2 mM L-glutamina e 0,2 mg/ml de lípido de soja/1 mg/ml BSA, com ou sem 50 mM de sacarose. Após a adição do meio de crescimento fresco, as células foram incubadas por 3 dias adicionais, a 35°C, em C02 a 5%. -32-

»«Μ5?ν. 3. Infeecão por VZV: O meio foi então removido de cada placa e substituído com 8 ml de EMEM, em lugar de EMBE, e SRFE-2, em lugar de SFRE-2 mais lípidos de soja. O FCS foi reduzido para 2% em todas os placas, mas os outros suplementos, neomicina, glutamina e sacarose, foram tal como na fase de crescimento. Cada placa, então, recebeu 333μΐ de uma diluição 1:16 de células infectadas com VZV (47 000 PFU/ml) em EMEM, 2% FCS, neomicina, glutamina.

Foi permitido ao VZV replicar-se, a 35°, sob C02 a 5%, por dois dias, e então foi removido o meio de 2 placas de cada condição diferente. As células foram lavadas 4 vezes com PBS. As células foram raspadas para 1,2 ml/placa de estabilizador à temperatura de congelação. A colheita das placas duplicados foi mergulhada em tubos cónicos de centrifugação de 50 ml e congelada a -70°C. O mesmo procedimento descrito no parágrafo precedente foi repetido, para duas placas de cada condição, no terceiro, quarto e quinto dias após a infecção por VZV, e a colheita conjunta de cada conjunto de duas placas foi armazenada a -70°C.

Cada colheita de células, preparada como descrito acima, foi mais tarde descongelada, sonicada em gelo, por 30 segundos por tubo, usando um sonicador de copo-haste ("cup-hom"), e clarificada por centrifugação a 1000 x g por 10 minutos a 4°C. Alíquotas dos sobrenadantes foram removidas para ensaio de placas. Os resultados do ensaio de placas, conduzidos tal como descrito no EXEMPLO 1, são apresentados na FIGURA 1.

Os dados apresentados na FIGURA 1 confirmam várias conclusões: 1. A incubação pré-infecção das células com 50 mM de sacarose é muito benéfica para o rendimento final de VZV. Em cada meio, EMEM ou SRFE-2, os rendimentos de VZV foram superiores quando as células foram tratadas com sacarose antes da infecção. A 72 horas após a infecção, o rendimento em VZV em células cultivadas em SRFE-2 expostas a sacarose rendeu cerca de dezasseis vezes mais que o rendimento em VZV, medido como PFU, das células em meio mínimo com sacarose! 2. A provisão de meio enriquecido (SRFE-2 mais lípidos de soja durante o crescimento e SRFE-2 durante o crescimento virai) é benéfica para o rendimento em VZV, mas em conjunto com o efeito de sacarose, permite que seja produzido VZV em mais uma ordem de grandeza. Assim, o meio enriquecido parece agir em sinergia com o efeito de sacarose. 3. O momento de colheita de VZV é muito significativo. Mesmo sob condições de cultura optimizadas, SRFE-2 e sacarose etc, o pico de rendimento de VZV não é alcançado nas 48 após a infecção. Nesse ponto, é alcançado apenas um aumento por um factor de quatro em relação ao rendimento em meio mínimo. No entanto, 72 após a infecção, há um aumento por um factor de cerca de 16 no rendimento de VZV.

Em experiências separadas, o rendimento em VZV não foi melhorado tanto quanto se fossem adicionados 50 mM de sacarose na altura da infecção, em lugar de 72 horas antes da infecção, indicando assim, a importância de uma fase de pré-infecção longa para acumulação intracelular de sacarose. Também descobrimos que a adição de 25 mM ou 100 mM de sacarose era menos benéfica do que 50 mM de sacarose. As mesmas concentrações aproximadas são aplicáveis a lactose, celobiose e maltose. EXEMPLO 8 EFEITOS DE PARÂMETROS DE PROCESSO MÚLTIPLOS MELHORADOS NO RENDIMENTO DE VZV:

Foi realizada uma experiência de garrafa de agitação para determinar os efeitos de várias modificações no processo (meio de cultura, suplemento de sacarose, adição de NH4CI ao estabilizador, Douncing ou sonicação para libertação de vírus das células) nos rendimentos de PFU VZV livre de células. As culturas foram semeadas a 80 x 103 células/ml x 125 ml EMBE, 10% FCS por garrafa de agitação. Estes foram ajustados a 425 ml com EMBE, ou realimentados com SRFE + lípido de soja, e infectados com semente de trabalho de VZV em 125 ml ("baixo volume") ou 425 ml ("alto volume") de meio EMEM ou SRFE (sem lípido de soja). O momento para estas modificações do meio/infecções foi descrita no Exemplo 7. Em vários momentos antes da infecção (96, ou 24 horas antes da infecção, ou na altura da infecção) foi adicionada sacarose (suc) a 50 mM. As culturas que receberam sacarose antes da infecção também receberam sacarose no meio de infecção do vírus. Todas as culturas foram infectadas a um MOI aproximado de 1:15 com células infectadas com VZV em culturas EMEM, foram colhidas a 48 horas em estabilizador pós-infecção contendo 20 mM NH4CI (N) ou sem suplemento. Todas as amostras foram congeladas a -70°C, e o vírus foi subsequentemente libertado das células, quer por sonicação, quer por homogeneização DOUNCE. Todas as amostras foram clarificadas por centrifugação a 1000 g, por 10 minutos.

Os resultados de PFU alcançados para as amostras sonicadas permitem as seguintes conclusões: 1. O uso do "alto volume" de meio de EMEM aumentou por um factor de 2 o PFU VZV. Com SRFE parece, aqui e noutras experiências, que os rendimentos óptimos de PFU são conseguidos perto de "baixo volume" de meio. Em alguns casos, os rendimentos no "alto volume" são suprimidos. 2. NH4C1 não é crítica para elevadas recuperações de PFU, 3. A sacarose aumentou os rendimentos de PFU por um factor de 2 para culturas EMBE/EMEM e por um factor de 5 para culturas SRFE. Aparentemente, existe um efeito do momento de adição de sacarose no PFU. Em outra parte desta experiência, os rendimentos de PFU foram 94 x 103 para culturas SRFE+soja/SRFE que não receberam sacarose e 296 x 103, 427 x 103 e 671 x 103 para culturas que receberam sacarose na infecção, 24 horas antes da infecção e 96 horas antes da infecção, respectivamente. 4. As culturas tratadas com sacarose mostraram signifícativamente menos efeitos citopáticos do que as suas correspondentes sem sacarose. Em outra experiência, culturas tratadas com sacarose ainda não mostravam sinais de efeitos citopáticos degenerativos 1 semana após a infecção, enquanto que os controlos livres de sacarose tinham sofrido lise completa. Assim, é possível que as células tratadas com sacarose acumulem mais VZV (antigénio e especialmente PFU) a tempos de incubação estendidos (para além da colheita a 46 horas da experiência das garrafas de agitação). 5. Nesta experiência o MOI não foi ajustado para concentrações de células mais elevadas na altura da infecção devido ao crescimento celular no meio SRFE. Assim, rendimentos de PFU ainda maiores poderiam ser obtidos se este parâmetro fosse optimizado. EXEMPLO 9 RENDIMENTO DE VZV LIVRE DE CÉLULAS CONSEGUIDO POR CORTE MECÂNICO, SONICAÇÃO E COMBINAÇÃO DESTAS:_

Foi realizada uma experiência em larga escala usando múltiplas condições diferentes para a produção de VZV, à semelhança da experiência descrita no EXEMPLO S. Um novo parâmetro, a forma de ruptura da célula, foi analisado nesta experiência. Abaixo são reportados resultados que comparam o rendimento de VZV livre de células conseguido por apenas homogeneização DOUNCE, apenas por sonicação e por uma combinação de DOUNCE e sonicação. As condições da cultura de VZV relatadas são para células cultivadas em meio mínimo (EMBE/EMEM) ou nutrição elevada (SRFE-2 mais lípidos de soja/SRFE-2, mais 50 mM sacarose na fase de pré-infecção). As células foram cultivadas e colhidas como descrito no EXEMPLO 8, e o PFU VZV/ml foi determinado pelo ensaio descrito no EXEMPLO 1 : TABELA 4 PFU livres de células/ml (x 10 -3)

Condição DOUNCE PÉLETE DOUNCE SONICADO TOTAL APENAS SONICADO EMBE/EMEM 42 7 49 38 EMBE/EMEM 64 4 66 46 SRFE-2 + 154 47 201 42

SACAROSE

Destes dados, é evidente que um melhoramento substancial no rendimento de VZV é alcançável quando o corte mecânico é combinado com a ruptura sónica das células. EXEMPLO 10 APLICAÇÃO DE UM MEIO SRFE-2 E SUPLEMENTO DE LIPIDO DE SOJA PARA OBTER RECUPERAÇÃO AUMENTADA DA VACINA VIVA DA VARICELA A PARTIR DE CÉLULAS MRC-5: Células MRC-5 foram inoculadas em frascos-T de 25 cm2 em EMBE e incubadas, por 3 dias, a 35°C. O meio foi removido e substituído por 12,5 ml de meio EMEM fresco, ou meio SRFE-2 com FCS 10%, neomicina, glutamina e lipido de soja ou uma diluição 1:200 do lípido. As culturas foram incubadas mais 3 dias adicionais, a 35°C. O meio foi então removido, e as células receberam células MRC-5 infectadas com VZV e volumes de 12,5 ml de soro fetal de bovino a 2%, neomicina, glutamina em EMEM ou SRFE-2. A condição da cultura indicada "SFRE-2" recebeu SRFE-2 durante a cultura das células e cultura de vírus. A condição "SRFE+soja" indicava amostras recebendo meio SRFE-2 e uma diluição de 1:200 de lipido de soja durante a cultura das células, mas apenas meio SRFE-2 durante a cultura do vírus. Após 48 horas de cultura, o meio foi removido, as células foram lavadas 4 vezes com volumes de 5 ml de PBS e raspadas em volumes de 1,2 ml de estabilizador. Amostras de frascos réplica foram juntadas e congeladas a -70°C. Após subsequente descongelação, as células sofreram ruptura por sonicação, clarificadas por centrifugação (1000 g, por 10 min), e os sobrenadantes foram congelados a -70°C, para ensaio subsequente dos títulos de infecciosidade do vírus. Os resultados são mostrados na figura 4. Conclusões: O uso do meio SRFE-2, em lugar de EMEM, resultou num aumento por um factor de 2,5 da recuperação de varicela viva. O uso de SRFE-2 suplementado com soja durante a cultura de células permitiu um aumento adicional por um factor de 2,7 da recuperação de vírus, para um aumento líquido por um factor de 7 acima do obtido usando processos EMEM de crescimento de vírus. EXEMPLO 11 ELISA COMPETITIVO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE ANTIGÉNIO VZV:

Devido ao ensaio de placa VZV ser muito moroso, não é particularmente adequado para controlo do processo. Um antigénio VZV rápido permite a medição quantidades de antigénios VZV, permitindo a monitorização do crescimento do vírus durante a produção de vacina de varicela viva. Adicionalmente, este teste pode ser usado para estimar quantidades de antigénio de VZV em matrizes de vacina clarificadas, sonicadas e potencialmente para medição de antigénio em tubos fechados repletos de vacina liofilizada. Concisamente, este ensaio é conduzido por incubação de antigénio VZV de amostras de teste com soro anti-VZV em solução. Os anticorpos remanescentes são permitidos ligar-se ao antigénio VZV imobilizado em placas de microtítulo ELISA. A quantidade de anticorpo capaz de ligar-se às placas é inversamente proporcional à quantidade de antigénio na amostra de teste. A ligação de anticorpos às placas é quantificada por reacção com um anticorpo anti-humano ligado a enzima e um substrato apropriado para fornecer um produto colorido, o qual é quantificado espectrofotometricamente. O antigénio VZV FUSA e o ensaio de placa VZV devem geialiiiente fornecer dados correlacionados, mas deve ter-se em mente que o ensaio de antigénio VZV detecta o VZV viável tanto como detecta o VZV viável. Dado que a resposta imune gerada por VZV morto não se mostrou ser tão efectiva como a resposta a vírus vivo atenuado, o ensaio de placa é o ensaio crítico para a determinação da dose de inoculo virai para vacinas de VZV. No entanto, o ensaio de VZV também é útil por fornecer uma medida da carga total de antigénio administrada a um receptor de vacina VZV.

Procedimento de teste: 1. Placas ELISA são cobertos com glicoproteínas (gps) de células MRC-5, não infectadas ou infectadas com VZV, e são recobertas com soro de albumina de bovino 1% [fracção V, #A-9647, Sigma], 0,1% NaN3) para reduzir a adsorção não especifica de anticorpos nas placas. Filas alternadas são cobertas com VZV ou antigénio de controlo (i. e. filas A, C, E e G recebem VZV gp e as filas B, D, F e H recebem MRC-5 gp antigénio não infectado). 2. Antigénio de teste clarificado (3250g-min) é diluído em estabilizador em tubos 12 x 75 mm ou microtubos. Uma preparação de antigénio de vírus padrão (26 unidades/ml de antigénio VZV por ensaio de transferência de ponto ("dot blot") é diluída 1:10 vezes e depois serialmente 1:1,25 vezes, para fornecer concentrações de antigénio de 2,6; 2,1; 1;7, 1,3; 1,1; e 0,9 unidades/ml. Diluições adicionais podem ser incluídas para fornecer 0,7 e 0,5 unidades /ml de antigénio. Esta série de diluições é usada para gerar uma curva padrão para a medição de quantidades de antigénio em amostras de teste.

Um soro humano anti-VZV é diluído em estabilizador a duas vezes a diluição final desejada.

Volumes de 300 μΐ de antigénio diluído são dispensadas em microtubos, misturados com 300 μΐ de soro anti-VZV diluído e incubado, a 35°, por 15-22 minutos. Um controlo inclui anti-VZV humano e diluente (sem antigénio).

Alíquotas de 100 μΐ de cada mistura soro-antigénio são adicionados a 2 réplicas de poços revestidos de glicoproteínas VZV (VZV gp) e 2 poços revestidos MRC-5 (4 poços por amostra) (por exemplo: amostra 1 na coluna 1, filas A, B, C, e D; amostra 2 na coluna 2, filas A, B, C e D; etc.).

Placas são incubadas por 15+1 minutos, a 35°C, para permitir ao anticorpo livre (não complexado pelo antigénio em solução) ligar-se ao antigénio de vírus imobilizado nas placas.

Anticorpo não ligado é removido por lavagem e os poços recebem uma IgG anti-humana de cabra conjugada com fosfatase alcalina para detectar anticorpo humano ligado.

Após incubação por 15+1 minutos, a 35°C, o conjugado não ligado é removido por lavagem. O conjugado ligado é detectado por incubação por 15 minutos, a 35°C, com substrato de p-nitrofenil fosfato dissolvido em tampão de dietanolamina. 9. Apús terminação da reaeção do substrato por adição de 50pl/well de NaOH 3 Μ, o desenvolvimento da cor (OD a 405 nm) é quantificado usando um espectrofotometro de microplaca.

Interpretação e cálculos de teste: a. É feita a média respectiva das replicas dos valores OD para as réplicas de poços revestidos de VZV e MRC-5. A experiência mostrou que o OD de MRC-5 é consistente entre amostras e diluições diferentes.

Assim, é feita a média dos valores de MRC-5 para a placa inteiro e usada para corrigir para a ligação não especifica do anticorpo primário ou conjugado para extractos de células não infectados. A média de OD de MRC-5 é subtraída da média respectiva de OD de VZV para fornecer os valores de OD especifico de VZV ( AOD). 2. Construção de uma curva padrão para a medição de quantidades de antigénio.·

Os valores de AOD da curva padrão são representados em função das concentrações de antigénio conhecidas (unidades VZV/ml).

Os dados são fornecidos a um programa de gráficos apropriado (p. ex.: Criquet Graph versão 1.3, Criquet Software, Malvem, PA), a porção linear da curva é identificada (deve incluir pelo menos 4 pontos), e é obtida a fórmula de ajuste da linha (y=a+bx). -42-

I Λ* 3. Cálculo das quantidades de antigénio de amostras de teste:

Os valores para a e b são dados pela fórmula de ajuste da linha, e o y (AOD) é conhecido. O valor desconhecido remanescente, x, representando as unidades /ml de antigénio, pode então ser calculado, e corrigido pela diluição da amostra para obter a concentração de antigénio na amostra não diluída. Segue-se um cálculo geral de uma amostra:

Antigénio Diluição AOD unidades/mL de antigénio a unidades/mL corr da amostra partir da fórmula limear para diluição A 1:2 Y X = (y-a)/b (x)*(factor de dil A concentração de antigénio reportada é a obtida com a amostra menos diluída fornecendo um valor de AOD dentro da porção linear da curva padrão. EXEMPLO 12 ANTIGÉNIO VZV ELISA E COMPARAÇÃO COM O RENDIMENTO DE PFUVZV:

Os exemplos de VZV, livre de células, gerados no EXEMPLO 7, para o qual o rendimento de PFU/ml é apresentado nas FIGURAS 1, foram ensaiados de acordo com o antigénio VZV ELIZA apresentado no EXEMPLO 11. Os resultados deste ensaio apresentam-se na FIGURA 2. É de notar que o antigénio VZV continua a subir às 96 horas, / 1 -43 - ί * \ **·. mesmo apesar de, de aeordo com os dados da FIGURA 1, o PFU/ml estar a declinar. Também é de notar que o nível de antigénio VZV em SRFE-2 mais soja, mais sacarose não se aproxima de 16 vezes o nível de antigénio em EMEM (FIGURA 2), no entanto o VZV viável livre de células PFU/ml aproxima-se (FIGURA 1). Desta comparação, parece que o efeito da sacarose é uma contribuição principal para a manutenção de VZV viável 72 horas após a infecção. EXEMPLO 13

Melhoramento do crescimento das células MRC-5 usando meio SRFE-2 e suplemento de soja_ Células MRC-5 foram inoculadas em frascos-T de 25 cm2 a 53 000 células/ml em volumes de 12,5 ml de EBME, 10% FCS, 50 pg/ml neomícina, e 2 mM L-glutamina, e incubadas a 35°C. Após 2-3 dias, o meio foi removido e substituído (turno 2) por 12,5 ml de meio fresco, ou meio SRFE-2 contendo 10% FCS, 50 pg/ml de neomicina, 2 mM L-glutamina e diferentes quantidades de lípido de soja. O lípido de soja não diluído continha 20 mg/ml de lípido e 100 mg/ml de soro de albumina de bovino.

Os meios foram removidos no dia 6 após plantação inicial de células, e substituídos com volumes de 12,5 ml de 2% FCS, 50 pg/ml neomicina, 2 mM L-glutamina em EMEM ou meio SRFE-2 suplementado com quantidades diferentes de lípido de soja. Células foram dissociadas de frascos seleccionados por tratamento com tripsina e foram contadas num hemacitometro. As contagens celulares foram determinadas para as restantes culturas após 2 dias adicionais de cultura, a 35°C, e um resumo dos resultados apresenta-se na Tabela 5. -44-

Tabcla 5

Uso de Meio SRFE e Lipidos de Soja para Melhorar as Densidades de Células MRC-5

Meio Exner. 1 Exper. 2 EMEM (E) 2,3 1,5 SRFE (S) 4,0 3,8 S + 1:100 soja ND 7,6 S + 1:200 soja 7,9 7,6 S + 1:500 soja 5,9 3,7 S + 1:2000 soja 5,0 3,8

Meio do turno 1= meio substituído pelo meio indicado suplementado com 10% FCS, 2 a 3 dias após a plantação de células.

Meio do turno 2 = meio substituído pelo meio indicado suplementado com 2% FCS, 6 dias após a plantação de células. ND = não determinado.

Conclusões: O uso de meio SRFE-2 sem suplemento de lipidos resultou num aumento, por um factor próximo de 2, do número de células, em relação ao que se atingiu só em EMEM. Os rendimentos foram mais aumentados, de uma forma dependente da dose, por suplemento do meio com lípido de soja. Os rendimentos máximos de células foram obtidos usando a combinação de meio SRFE-2 e cerca de 200-400 pg/ml de lípido. EXEMPLO 14 CRESCIMENTO DE CÉLULAS WI-38 DE ACORDO COM O PROCESSO DESTA INVENÇÃO:_ Células WI-38 foram inoculadas em frascos-T de 25 cm2 a 53 000 células/ml em volumes de 12,5 ml de EBME, 10% FCS, 50 mg/ml neomicina e 2 mM L-glutamina, e incubadas a 35°C. Após 2 dias, o meio for removido e substituído por 12,5 ml de meio SRFE-2 suplementado com 50 mg/ml neomicina, 2 mM L-glutamina e uma diluição 1:200 de lípido de soja. Os controlos receberam meio sem suplemento de lípido. Após 5 dias de cultura a 35°C, o meio foi removido, as células foram dissociadas dos frascos com tratamento por tripsina e contadas num hemacitometro. Os frascos remanescentes foram mantidos por 3 dias adicionais antes da contagem de células. Segue-se um resumo dos resultados: TABELA 6

Linha de células Suplemento de Células/frasco x 10~6 após lípido 5 dias 8 dias 1 - 4,2 4,8 + 9,5 10,2 3 - 4,1 4,9 + 9,3 12,5

Conclusão: O suplemento de meio de cultura enriquecidos com lípido de soja aumenta o rendimento em células WI-38 para cerca do dobro. Espera-se, assim, que o uso desta linha de células para a produção de VZV prossiga similarmente ao das células MRC-5 EXEMPLO 15 PROCEDIMENTO PARA AVALIAÇÃO DO MELHORAMENTO DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS MRC-5: Células MRC-5 são plantadas em frascos-T de 25 cm2 a cerca de 53 000 células/ml em volumes de 12,5 ml de Meio Básico Eagle com sais de Eagle (EBME), 10% FCS, 50 pg/ml sulfato de neomicina (neo) e 2 mM glutamina (Gin). As culturas são incubadas a 35°C, por 3 dias, tempo ao fim do qual as monocamadas celulares são tipicamente cerca de 50-75% confluentes. O meio é removido e substituído por volumes de 10 a 12,5 ml de 10% FCS, 50 pg/ml neo e 2 mM Gin ± soja ou outro lípido, em meio SRFE-2, e as culturas são retomadas à incubação a 35°C. As contagens das células são determinadas a vários tempos por tripsinização das células (volumes de 2,5 ml de solução de citrato de tripsina 0,25%) e contagem num hemacitometro. A viabilidade das células é monitorizada por exclusão de células 0,2% de azul de tripano. As contagens de células são usadas para derivar uma concentração de células que, por seu lado, é corrigida para o volume total de suspensão de células para obter o rendimento de células por frasco. Em algumas experiências, as culturas são deslocadas para meio com 2% FCS, 3 a 4 dias após a substituição do meio, e as contagens de células são determinadas após incubação por 2 dias adicionais. EXEMPLO 16 EFEITO DA EXPOSIÇÃO PROLONGADA DE CÉLULAS CULTIVADAS A SUPLEMENTOS DE LÍPIDOS: Células MRC-5 foram plantadas em frascos T25, alimentadas após 3 dias (primeira realimentação), e as contagens de células foram determinadas -47- ÁÃÍ‘ ·; "v ^

I X após 3 dias de crescimento adicional. Em frascos T25 adicionais foi permilida a continuação do crescimento por realimentação ± lípido (segunda realimentação), e o crescimento permitido por mais 2 dias adicionais. As células foram recuperadas com tripsina. Os rendimentos foram 2,6 x 106 para células plantadas em EBME e cultivadas em EMEM, enquanto que células cultivadas em SRFE-2 mais diluição 1:100 de lípidos de soja atingiram 6,6 x 106 e 7,7 x 106. As células cultivadas por 2 dias adicionais renderam 2,76 x 106 para células cultivadas em EBME/EMEM, enquanto que células cultivadas em EBME/EMEM sem suplemento de lípidos renderam 9,2 x 106 e 7,88 x 106 células por frasco T25.

As células cultivadas em EBME/SRFE-2 + 1:100 lípido de soja renderam apenas 2,48 e 2,28 x 106 células. Estes dados indicam que a exposição prolongada (cerca de 5 dias após a segunda realimentação) a concentrações elevadas de lípidos pode, eventualmente, levar a rendimentos de células reduzidos, presumivelmente devido a morte celular. Assim, em geral, as células são realimentadas com meio enriquecido com ausência de suplemento de lípido. Esta mudança para um meio enriquecido, livre de lípidos é particularmente importante quando é iniciada uma fase de crescimento virai, visto que o lípido pode ser tóxico para o crescimento virai ou para a viabilidade celular contínua em presença de ataque virai. EXEMPLO 17 EFEITOS DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE LÍPIDOS NO CRESCIMENTO CELULAR EM MEIOS ENRIQUECIDO E MÍNIMO:

Seguindo essencialmente o mesmo procedimento e esquema de quantidade realimentação/célula descrito no EXEMPLO 16 para a cultura MRC-5, foram atingidos os seguintes rendimentos (nota: os símbolos + e - após a descrição do meio indicam a presença ou ausência de suplemento da quantidade indicada, em mg/ml de lípido de soja (ls.) no meio da segunda realimentação):

Meio Rendimento celular de Frascos T-25 total x 10”6 Dias aoós a 2a realimentação 3 5 EBME/EMEM (3 EXPER 4,3; 2,46; 1,52 2,49; 3,50 EBME/SRFE-2 3,80 EBME/SRFE-2 - 0,4 sl 13,69; 11,09 EBME/SRFE-2 + 0,4 sl 11,7 11,65 EBME/SRFE-2 - 0,2 sl 5,10 8,51; 6,27 EBME/SRFE-2 + 0,2 sl 7,62; 9,7 9,66 EBME/SRFE-2 - 0,1 sl 3,52 EBME/SRFE-2 + 0,1 sl 4,94 EBME/SRFE-2 - 0,04 sl 3,10 EBME/SRFE-2 + 0,04 sl 3,16 EBME/SRFE-2 - 0,01 sl 2,90 EBME/SRFE-2 + 1:0,1 sl 3,82

Os dados acima resumidos são geralmente consistentes com a observação, notada no EXEMPLO 16, de que a exposição prolongada de células a concentrações elevadas de lípidos não é muito benéfica, apesar de o efeito tóxico notado no EXEMPLO 16 seja menos pronunciado nestes dados. A concentrações de lípido mais baixas, a exposição mais prolongada ao lípido é menos prejudicial e pode ser benéfica para aumentar o rendimento das células/cm 2 de superfície de crescimento. -49- * .-"Λ, A.i EXEMFLO 18 EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE SORO FETAL DE BOVINO NOS RENDIMENTOS CELULARES:

Nesta experiência foi testada a adição de 2% ou 10% de soro fetal de bovino na presença de suplementos de lípidos. Células MRC-5 foram plantadas em EBME, realimentadas 3 dias mais tarde com SRFE-2 suplementado com quantidades diferentes de lípido de soja, realimentadas 2 dias depois com a mesma concentração de lípido em SRFE-2, como fornecido na primeira realimentação. Os rendimentos celulares em FCS 10% foram 9,5; 11,3 e 12,2 x 106 para culturas suplementadas com 0,1; 0,2 e 0,4 mg/ml de lípido, respectivamente. Onde foi fornecido 2% FCS, os rendimentos das células foram 6,5; 8,8 e 3,2 x 106 respectivamente. Esta experiência revela o efeito benéfico no crescimento celular do fornecimento de suplemento de FCS bem como de suplemento de lípidos. Quaisquer que sejam os efeitos tóxicos que as células sofram a concentrações de lípidos elevadas estes são atenuados pelo fornecimento de suficiente suplemento FCS. EXEMPLO 19 EFEITOS DE DIFERENTOS SUPLEMENTOS DE LÍPIDOS NO CRESCIMENTO DE CÉLULAS MRC-5: Células MRC-5 foram plantadas em frascos T25 em EBME. No terceiro dia, as células foram realimentadas com meio SRFE-2contendo 10% FCS, suplementado com diferentes suplementos de lípido. Foram fornecidos, nas concentrações indicadas, lípido de soja Boehringer Mannheim, lípidos ricos em colesterol de soro de bovino adulto Sigma, ou Miles/Pentex EX-CYTE ou * *

-50-lipoproteína bovina Very Low Endotoxine. As contagens celulares na realimentação foram, em milhões: 1,19. Cinco dias mais tarde, as células foram contadas. As células em EMEM foram 2,97; em SRFE-2, ou SRFE-2 mais 0,4 mg/ml, 0,2 mg/ml, e 0,1 mg/ml mais lípidos de soja geraram 4,83; 10,44; 8,67 e 8,04 milhões de células, respectivamente. EX-CYTE I a 1:50; 1:100; 1:200 geraram 5,37; 4,80 e 4,74 milhões de células, respectivamente. EX-CYTE VLE a 1:25; 1:50; 1:100 deram origem a 5,49; 7,23 e 7,92 milhões de células, respectivamente. Lípidos de elevado colesterol Sigma a 1:25; 1:50; 1:100 deram origem a 6,87; 7,56 e 7,65 milhões de células, respectivamente. Os lípidos de soja da Boehringer Manneheim resultaram no maior melhoramento do rendimento celular, apesar dos lípidos EX-CYTE VLE e Sigma serem quase tão efectivos. O efeito de melhoramento não é portanto único dos lípidos de soja. EXEMPLO 20

Melhoramento de crescimento de células MRC-5 usando concentrações elevadas de lípido de soja:___ Células MRC-5 foram semeadas em frascos de 25 cm 2 e realimentadas nos dias 3 e 6, como no Exemplo 13. Os rendimentos celulares por frasco, no dia 6, para culturas EBME/EMEM, SRFE-2 mais 1/100 lípido de soja ou SRFE-2 mais 1/50 lípido de soja, foram 4,3 milhões, 9,7 milhões e 11,7 milhões, respectivamente. A viabilidade celular foi > 99% (avaliada por exclusão azul de tripano) para todas as culturas. As células foram realimentadas com meio ± lípido de soja, incubadas por 2 dias adicionais e os rendimentos celulares foram determinados. As recuperações por frasco, para estas culturas, foram de 2,9 e 3,5 milhões para culturas EBME/EMEM em duplicado; 11,65 milhões para SRFE-2 mais 1/50 de lípido de soja realimentado com o mesmo meio, enquanto que as culturas (em duplicado) SRFE-2 mais 1/50 lípido de soja realimentadas com meio SRFE-2 e sem lípido de soja renderam 13,69 e 11,09 milhões de células; 9,66 milhões de células para SRFE-2 mais 1/100 lípido de soja realimentado com o mesmo meio, enquanto que realimentado com SRFE-2 e sem lípido renderam 8,51 e 6,27 milhões em culturas duplicadas.

Desta experiência, é claro que os rendimentos de células MRC-5 foram aumentados com quantidades crescentes de lípidos de soja. Os rendimentos máximos foram atingidos usando uma diluição 1/50 de lípido de soja (concentração mais elevada testada). A inclusão de lípido no meio da segunda realimentação resultou em aumentos moderados dos rendimentos celulares. No entanto, os dados mostram que os rendimentos máximos podem ser atingidos pelo uso de 1/50 lípido no meio da primeira realimentação. O suplemento de lípido pode, então, ser omitido do segundo meio de realimentação. Visto que concentrações elevadas de lípido podem ser deletérias para a produção de vírus, pode ser desejável omitir o lípido durante o crescimento do vírus.

Lisboa, 20 de Novembro de 2001

ALBERTO CANELAS

Agente Oficia! da Propriedade industrial RUA ViCTOR CORDON, 14 1200 LISSOA

Claims

- 1 - -.-¾. I ΙΛ REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para preparação de um vacina viva de vírus varicela zoster (VZV) que compreende: a. Cultura de células susceptíveis à infecção pelo VZV, seleccionadas de células diplóides humanas, para confluência em cultura em monocamada, sob condições de nutrição suficiente para assegurar a replicação celular para a confluência, e fornecendo um dissacárido não metabolizável; b. Infecção das células cultivadas de acordo com o passo (a), perto do ponto de confluência, com células infectadas com VZV; c. Manutenção da cultura infectada com VZV num estado de elevada nutrição por cerca de 22-96 horas e colheita no ponto de pico de produção de VZV infeccioso; d. Lavagem da cultura infectada com VZV com uma solução fisiológica antes de colheita das células infectadas com VZV; e. Colheita das células infectadas com VZV num volume mínimo de uma solução estabilizadora e ruptura imediata das células, ou congelamento das células para ruptura posterior; f. Ruptura das células infectadas com VZV para libertar optimamente o VZV associado às células, e remoção dos detritos celulares, para obter uma preparação de VZV livre de células.
2. Um processo para preparar uma vacina viva atenuada de vírus varicela zoster (VZV) livre de células o qual compreende: a. Cultura das células susceptíveis de infecção por VZV para a confluência, onde a dita cultura compreende: 1. uma fase de plantação de células 2. uma fase de crescimento de células num volume de meio suficiente para assegurar a replicação das células à confluência, e 3. uma fase de pré-infecção compreendendo exposição das células a um dissacárido não tóxico e não metabolizável; b. Infecção das células cultivadas de acordo com o passo a, perto do ponto de confluência, com células infectadas com VZV atenuado; c. Manutenção da cultura infectada com VZV num grande volume de meio mínimo, ou num volume menor de meio enriquecido, por 22-96 horas, até ao ponto de pico de produção de VZV; d. Lavagem da cultura infectada por VZV com uma solução fisiológica antes da colheita; e. Colheita da cultura infectada com VZV por remoção do líquido, 1. adição de um volume mínimo de solução estabilizadora, 2. raspagem ou libertação química das células infectadas com VZV, 3. congelamento opcional das células infectadas com VZV libertadas a cerca de -70°C; f. Ruptura das células infectadas com VZV libertadas, para libertação -3-

I) ^Χ óptima do VZV ligado a células, remoção dos detritos celulares, e liofílização opcional do VZV livre de células ou armazenamento na forma de líquido congelado.
3. O processo da Reivindicação 1 ou da Reivindicação 2 onde as células susceptíveis de infecção por VZV são células MRC-5, o VZV é da estirpe OKA de vírus varicela zoster atenuado, a temperatura da cultura é de 30-37°C, e o dissacárido é sacarose fornecida a cerca de 20-60 mM.
4. Um processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-3 onde o meio de cultura é SRFE-2 suplementado optimamente com cerca de 0,02-0,4 mg/ml de lípidos de soja, e o vírus é libertado das células por sonicação ou homogeneização DOUNCE, ou ambas.
5. Um processo de preparação de uma vacina viva de vírus varicela zoster (VZV) livre de células, o qual compreende: a. Cultura de células MRC-5 à confluência, onde a dita cultura compreende: 1. uma fase de plantação de células em EBME, 2. uma fase de crescimento em SRFE-2 suplementado com cerca de 0,2 mg/ml de lípidos de soja, iniciando-se cerca de 3 dias após a plantação das células, 3. uma fase de pré-infecção, compreendendo a exposição das células MRC-5 a 20-50 mM de sacarose por cerca de 24-96 horas pré-infecção; b. Infecção das células cultivadas, de acordo com o passo a., perto do ponto de confluência, com células MRC-5 infectadas com VZV atenuado; c. Manutenção da cultura infectada por VZV, num estado de elevada nutrição, por cerca de 37-96 horas e colheita no ponto de pico de produção de VZV, d. Lavagem da cultura com salina tamponizada com fosfato suplementada optimamente com 1-100 mM NH4CI ou cloroquinona; e. Colheita das células MRC-5 infectadas com VZV por: 1. remoção do líquido, 2. adição de um volume mínimo de estabilizador contendo opcionalmente cerca de 1-100 mM de NH4CI, ou cloroquinona a cerca de 230 μΜ; 3. raspagem ou libertação química das células, 4. congelamento opcional das células infectadas por VZV libertadas a -70°C; f. Ruptura das células infectadas por VZV libertadas por 1. homogeneização DOUNCE, 2. peletização dos detritos e retenção do sobrenadante, 3. sonicação dos péletes e repeletização, e 4. combinação dos sobrenadantes dos passos f-2 e f-3; g. Diluição do produto do passo (f) em estabilizador e enchendo 0 produto em doses unitárias para liofílização e armazenamento a 4°C, ou abaixo, tal que não menos que cerca de 1000 PFU estejam disponíveis por dose na altura de uso posterior.
6. O processo da reivindicação 1, onde as ditas condições de nutrição elevada, no passo a. , compreendem quer um elevado volume de meio mínimo ou um volume menor de meio enriquecido. -5-
7. Um processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-4 onde a dita solução fisiológica do passo d. contém um agente lisossomotrópico seleccionado entre cloreto de amónia e cloroquinona.
8. Um processo de acordo com qualquer das reivindicações prévias onde a dita infecção com células infectadas com VZV no passo b fornece uma multiplicidade de infecção de 1:125 ou superior. 4» Lisboa, 20 de Novembro de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON. 14 1200 LISBOA