RS50330B - Postupak za kultivisanje ćelija u mono sloju - Google Patents

Abstract

Postupak za kultivisanje ćelija u monosloju, naznačen time što sadrži: a. zasejavanje posude za kulturu ćelijskom šaržom u minimalnom ili bogatom medij umu i dopuštanje da ćelije rastu u toku 24-72 časa; b. uklanjanje medijuma iz kulture iz koraka a. i zamena sa svežim, bogatim medijumom, dopunjenim sa 0.02-0.4 mg/ml lipida i izborno takođe uključujući dodatak seruma; c. rast kulture ćelija u bogatom medijumu dopunjenom sa lipidom; d. izborna zamena medijuma iz koraka c. sa svežim medijumom koji ne sadrži dodatak lipida posle oko 24-72 časa rasta. Prijava sadrži još 1 nezavisan i 7 zavisnih patentnih zahteva.

Description

OPIS PRONALASKA

Prema medjunarodnoj klasifikaciji patenata, ovaj pronalazak spada u grupu A61K-39/25.

Varičela zoster virus (VZV) izaziva ovčje boginje i zoster (ospe). Ovčje boginje su jako zarazna bolest, koja se javlja kod osoba bez VZV imuniteta. Više od 90% populacije je izloženo tokom prve dve dekade života. Bolest je ozbiljna pretnja za imuno-oslabljene i odrasle. U mnogim slučajevima, VZV postaje latentan u dorsalnim korenim ganglionim ćelijama. Kada se VZV reaktivira iz latentnog stanja javljaju se ospe i bolno hronično stanje.

Prevencija ovčjih boginja vakcinacijom je poželjan cilj, i predvidjena je institucija opšte vakcinacije u detinjstvu sa živom oslabljenom varičela vakcinom. U ranijoj tehnici je objavljeno razmnožavanje VZV u različitim sistemima ćelijskih kultura i upotreba živog, oslabljenog bez-ćelijskog VZV kao vakcine. U.S. Patent 3,985,615 opisuje proizvodnju u primarnim embrionim ćelijama zamorčeta oslabljenog Oka soja VZV, pogodnog za upotrebu kao vakcine. U.S Patent 4,008,317 opisuje kultivaciju temperaturno osetljivog mutanta VZV u W[-38 ćelijama za upotrebu kao stabilizatora vakcine. U tehnici su takodje poznate kompozicije za održavanje za život sposobnog VZV, kao što su SPGA.

Osnovno ograničenje za komercijalnu proizvodnju VZV vakcine je prinos bez-celijskog VZV iz sistema đelijskih kultura poznatih u tehnici. Prinosi bez-đelijskoa VZV su poboljšani za oko faktor 5-20 puta primenom novog postupka prema ovom pronalasku.

Prema tome, ovaj pronalazak je postupak za proizvodnju žive, oslabljene bez-đelijske VZV vakcine u visokom prinosu.

Postupci monoslojne đelijske kulture poznati u tehnici tipično daju prinose oko 80,000 do 160,000 ćelija/cm<2>/Mami, Dev. Biol. Štand 37, 149-152 (1977); Wood i Minor, Biologicals 18 , 143-146 (1990)/. Upotreba monoslojnih đelijskih kultura za proizvodnju virusnih antigen je sprečena ograničenom gustinom do koje se ove monoslojne kulture mogu gajiti.

Pokušaji da se povećalu gusnine đelijske kulture

u<p>rošlosti su bili usmereni na specijalizovane prelivne posude za kulture da bi se poveđale gustine zasićenosti do oko 1 x 10 6 ćelija na cm 2 / Mann, Dev. Biol. Štand. 37, 149-152 (1977)/. Ovaj pronalazak nudi jedinstvene načine za povećanje đelijskih prinosa koristeći postojeće sisteme đelijskih kultura.

Ovaj pronalazak obezbedjuje postu<p>ak kojim se vezane delije mogu gajiti do mnogo većih gustina, nego što je to do tada bilo moguće, tako omogućavajuđi veđe prinose virusa kultivisanih na ćeiijskim monoslojevima za proizvodnju vakcine.

Ovaj pronalazak se odnosi na nov postupak za monoslojnu đelijsku kulturu i na novu kompoziciju za upotrebu u postupku. Postupak zahteva upotrebu bogatog medijuma kulture, suprotno minlmalncmmedijumu i dopunjavanje bogatog medijuma sa optimizIranom koncentracijom lipida.Prema postupku iz ovog pronalaska, u<p>otrebom novog medijuma za rast, koji sadrži SRFS-2 medijum dopunjen sa izmedju oko 0.02-0.4 g/ml lipida soje,

može se postidi suštinako povećanje gustine u mono-slo jnoj ćelijskoj kulturi. Tako postignuto povećanje monoslojne ćelijske gustine je korisno za povećanu proizvodnju virusnih antigena za dobijanje anti-virusne vakcine.

Kada je primenjen za proizvodnju odredjene vakcine, ovaj pronalazak je postupak za proizvodnju velikih količina žive, oslabljene bez-ćelijske VZV vakcine, korisne za prevenciju ovčjih boginja, koji obuhvata optimalno razmnožavanje VZV u ćelijskoj kulturi, i sakupljanje virusa pod uslovima koji daju maksimalne VZV prinose i stabilnost. Stu<p>njevi optimiziranog postu<p->ka obuhvataju: a. Kultivisanje na VZV infekciju osetijivih ćelija, odabranih iz humanih diploidnih ćelija, kao što su MRC-5 do konfluentnosti u monoslojnoj kulturi, upotrebljavajući visoke zapremine kulture ili bogat medijum kulture, i dopunjavanje sa đisaha-ridom koji se ne metabolizira, kao što je saharoza; b. Inficiranje ćelija kultivisanih prema stupnju (a) na tački što je moguće bliže konfluentnosti sa visokim maitiplicitetom infekcije VZV-inficiranih ćelija koliko je praktično; c. Održavanje VZV-inficirane kulture u stanju visoke ishranjenosti u toku oko 22-96 sati i sakupljanje na tački najveće (pik) VZV proizvodnje; d. Pranje VZV-inficirane kulture sa fiziološkim rastvorom, koji opciono sadrži iizosomotropno sredstvo, kao što je amonijum hiorid ili hloro-hin, pre sakupljanja VZV inficiranih ćelija;

e. Sakupljanje VZV-inficiranih ćelija u minimalnoj zapremini stabilišućeg rastvora, i razaranje ćelija ili odmah ili zamrzavanje ćelija za

kasnije razaranje;

f. Razaranje VZV-inficiranih ćelija da bi se optimalno oslobodio ćelijski vezani VZV, i uklanjanje ćelijskog otpada, da bi se obezbedio bez-ćelijski VZV preparat.

KRATAK OPIS SLIKA

SI. 1. VZV PFU prinosi u medijumu dopunjenom sa

saharozom

SI. 2, Prinosi bez-ćelijskog VZV antigena

SI. 3. VZV Stabilnost u SPGA stabilizatoru na -20°C

ili 4°C

SI. 4. VZV PFU Prinosi postignuti upotrebljavajući

različite međijume kulture.

SI. 5. Efekat unete količine ćelijski-vezanog MOI na

prinose bez-ćelijskog VZV

SI. 6. Prinosi VZV virusnog antigena kao funkcija unete količine MOI.

Ovaj pronalazak se odnosi na postupak gajenja ćelija u monoslojnoj kulturi. Predmet pronalaska je da se dobije<p>ovećanje đelijske gustine vezanih ćelijskih kultura. Ovaj predmet se<p>ostiže snabdevanjem obogaćenog medijuma za rast, dopunjenog sa lipidom, pri optimiziranim koncentracijama. Gajenjem monoslojnih kultura prema ovom pronalasku u novoj kompoziciji međijum-lipid prema ovom pronalasku,<p>ostižu se povećani prinosi virusnih jedinica koje obrazuju plakove (PFU)("plague-forming unit") ili proizvodnje virusnog antigena.Prema tome, kod hepatitis A virusa, varičela zoster virusa, rubela, rotavirusa, malih boginja, polio, zaušaka i drugih virusnih vakcina postiže se korist primenom postupka đelijske kulture prema ovom pronalsku.

Prvenstven obogaćen medijum za upotrebu u ovom postupku je SRFE-2, (koji se komercijalno može nabaviti od firme SIGMA Chemical Co., St Louis, MO, S2138 ili firme Serva Fine Chemicals, Heićelberg, Nemačka 47523). Ovaj medijum su opisali Weiss i sarad. / In Vitro 16(7) , 616-628 (1980)/. Drugi ekvivalentni medijumi ili male izmene u sastavu SRFE-2, upotrebljene na isti način kao što je opisano ovde, su prirodna proširivanja ovog pronalaska.

Bilo koji broj poznatih lipidnih dodataka može

da bude upotrebljen da bi se unapredio ovaj pronalazak.

Na primer, nadjeno je da su holesterolom bogati lipidi

iz odraslog goveđjeg seruma (SIGMA CHEMICAL CO. katalog§L-4646), EX-CYTE lipid I ili veoma nizak endotoksin (VLE) Very Low Endotoxin") lipid (MILESine, katalog % 82-004-7 do 8 i 82-019-1) korisni kao dodaci bogatom medijumu. Prvenstven lipidni aditiv je komercijalno dostupan lipid ekstrakta soje, koji se može nabaviti od firme Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis IN, katalog " 1074 482. Ovaj materijal, ili sličan materijal, opisali su Iscove i Melchess/ J. al. Exp. Medicine, 147, 923-933, (1979)/ kao zamenu za serum u 3-limfocitnoj kulturi. U ovoj literaturi nije učinjen nikakav nagoveštaj, niti ima bilo kakvog nagoveštaja u opisu Boehringer Mannheim-ovom katalogu proizvoda, da dodatak li<p>ida soje može da bude koristan za dopunjavanje bogatog medijuma. Prema ovim izvorima, lipid je namenjen za upotrebu kao zamena serumu u minimalnom medijumu kultura. Kao što je upotrebljen u ovom pronalasku, lipid je dodatak bogatom medijumu.

Pored toga, prema objavljenim izvorima, lipid se upotrebljava pri koncentraciji od oko 10-100 ug/ml.

Prema ovom pronalasku, lipid se- optimalno upotrebljava

pri koncentraciji koja je 2-3 puta viša nego što su koncentracije predložene u literaturi proizvodjača.

Osim toga, kao što je upotrebijeno u ovom pronalasku, dodatak lipida može da bude upotrebijen pored, pre negu umesto dodatka seruma.

U postupku prema ovom pronalasku, MRC-5 delije, WI-38 delije, Vero delije ili neki drugi tip ćelija korisnih za razmonožavanje virusa, zasejavaju se u posude kulture. Početna faza gajenja se izvodi ili u minimalnom medijumu poznatom u tehnici kao što su EMEM

ili EBME, ili u bogatom medijumu kao što je SRFE-2 bez dodatka lipida. Radi<p>ogodnosti može biti dodato oko 10% fetalnog telećeg seruma (FCS) (!'fetal calf serum"), antibiotik kao što je neomicin (adekvatno je oko 50 ug/ml) i L-glutamin (oko 2 mM). Ćelije se gaje na temperaturi dopuštenoj za ćeliju i virus, obično oko 34-37°C, a prvensveno na oko 35°C, u zavisnosti od virusa koji treba da se proizvede, nekoliko dana.

Pošto su se ćelije jasno vezale i bujno se razmno-žavaju u monoslojnoj kulturi, minmalni medijum ili obogaćen medijum se uklanjaju i zamenjuju se sa svežim bogatim medijumom, dopunjenim sa optimiziranom koncentracijom lipida.

Posle daljeg perioda rasta, medijum može<p>onovo

da se ukloni i da se zameni sa svežim bogatim medijumom, bez dopune sa lipidom. Nadjeno je da je snabdevanje lipidom<p>ošto su se ćelije približile ili dostigle konfluentnost protiv-produktivno, smanjujući prinose ćelija.

Tamo gde kultivisane monoslojne ćelije treba da se inficiraju sa virusnim inokulatom, iipidni dodatak se eliminiše i virusna sirovina se unosi u svažu šaržu bogatog medijuma. Odsustvo lipida u ovom ponovnom napajanju omogućava produžen rast ćelija bez problema da dodje do smanjenja rasta ćelija izazvanog lipidom,

kao što je pomenuto gore.

Radeći prema gore opisanom postupku,<p>ostižu se suštinska povećanja u prinosima ćelija i virusa. Tako se za varičela virus gajen na MRC-5 ćelijama postiže suštinsko povećanje VZV PFU prinosa, u poredjenju kada su MRC-5 ćelije gajene u minimalnom medijumu ili samo u SRFE-2 medijumu. Slično, WI-38 ćelije, koje su korisne za gajenje varičele ili za proizvodnju rubela virusa,

gaje se do suštinski većih gustina, kada se kultivišu prema ovom novom postupku.

Kao što je primenjen za proizvodnju odredjene vakcine, nov postupak prema ovom pronalasku obuhvata razmonožavanje VZV u ćelijskoj kulturi, i sakupljanje dobijenog VZV pod uslovima koji o<p>timiziraju prinos i stabilnost virusa. Prednosti opisane za proizvodnju VZV biće primenljive i na proizvodnju drugih obloženih virusa, uključujući i herpes viruse različite od VZV,

malih boginja, zauški, ili rubela.

Osnovni cilj ovog pronalaska je da se obezbedi<p>ostupak koji omogućava efikasnu proizvodnju VZV za upotrebu kao vakcina. Uspeh postupka se meri prinosom bez-ćelijskog VZV koji se finalno dobija<p>osle optimiza-cija svakog stupnja postupka. Prinos se odredjuje titrom infektivnosti finalnog VZV bez-ćelijskog preparata. Titri infektivnosti varičela zoster virus (VZV) preparata dobijeni su postupcima agaroza-višeg sloja ili tečnog višeg sloja opisanim od strane Krah-a i sarad.,

( J. Virol. Methods . 1990, 2_7: 319-326) . Ukratko, ovaj postupak obuhvata kultivisanje MRC-5 ćelija koje su osetljive na VZV infekciju do aktivno replicirajućeg stanja,

to jest, do tačke kada su ćelije oko 50-30% konfluentne. Virus se tada postavlja na ćelijski monosloj u minimalnoj zapremini, ostavi se da se veže za ćelije i tada se dodaje dodatni medijum za rast. Posle nekoliko dana gajenja, ćelije se izlažu proteinskom bojenju i broje se bezbojne površine, plake..

Prema tome, za poznatu zapreminu virusnog inokulata, broj jedinica koje obrazuju plake (PFU) ("plaaue forming units") na mililitar predstavlja dobru meru za prinos virusa. Ukupan broj PFU može da se izračuna mno-ženjem sa uku<p>nom zapreminom bez-ćelijskog virusa iz bilo kojeg virusnog preparata.

Usled varijabilnosti u samoj analizi, povećanje u PFU dobijeno pomoću bilo koje odredjene optimizacije postupka navedeno je kao odnos prema nekom manje optimiziranom stupnju postupka. Ovo navodjenje višestrukih povećanja u virusnom prinosu stogaooništava bilo koje varijabilnosti u samoj analizi PFU. Najzad, stupnjevi postupka opisani ovde kumulativno dovode do izmeđju oko 16-20 puta povećanih VZV prinosa postignutih koristeći postupke poznate u tehnici. Ovo višestruko povećanje nije navedeno u literaturi i predstavlja značajan doprinos u tehnici proizvodnje VZV vakcine.

Pošto je analiza VZV plaka spora, nije posebno pogodna za kontrolu u toku postupka. Brza VZV antigen ELISA omogućava merenje količina VZV antigena da bi se omogućila kontrola razvoja virusa tokom proizvodnje žive varičela vakcine. Pored toga, ovaj test se može upotrebiti za odredjivanje količine VZV antigena u izbistrenim, ultrazvukom tretiranih količina vakcine, i potencijalno za merenje antigena u napunjenim liofiliziranim ampulama sa vakcinom. Ukratko, ova analiza se izvodi inkubiranjem VZV antigena iz test uzoraka sa anti-VZV serumom u rastvoru.

Dopusti se da se preostalo slobodno antitelo veže za

VZVantigen imobiliziran na ELISA mikrotitarskim pločama. Količina antitela sposobnog da se vezuje na ploče je obrnuto proporcionalna sa količinom antitela u test uzorku. Kvantitativno se odredjuje vezivanje antitela na ploče reakcijom sa enzimski vezanim anti-humanim antitelom i pogodnim substratom da bi se obezbedio obojeni proizvod koji se odredjuje kvantitativno spektrofoto-metrijski.

VZV antigen ELISA i VZV plake analize treba uglavnom da daju korelativne podatke, ali treba imati na umu da VZV antigen analiza detektuje nesposobne za život kao i sposobne za život VZV. Pošto se imuna reakcija stvorena ubijenim VZV nije pokazala tako efikasna kao reakcija na živ oslabljen virus, analiza plaka je kritična analiza za odredjivanje doze virusnog inokuiata za VZV vakcine. Medjutim, anliza antigena je dragocena u tome što obezbedjuje meru ukupne šarže antigena koja je prime-njena na recipijent VZV vakcine, ona je mnogo brža nego što je analiza PFU i stoga omogućava praćenje VZV proiz-vodnjuu toku postupka, i u mećjusobnoj vezi je najmanje do tačke najveće (pik)<p>roizvodnje VZV PFU omogućavajući odredjiKanje-jepElmalaog-vretBena za sakupljanje.

Uspeh postupka prema ovom pronalasku je dodatno povećan svakim od sledećih kritičnih parametara, od kojih su svi unutar okvira ovog pronalaska: a. Kultivisanje na VZV infekciju osetljivih ćelija, odabranih iz humanih diploiđnih ćelija, kao što su MRC-5, do konfluentnosti u monoslojnoj kulturi, upotrebljavajući velike zapremine kulture ili bogatog medijuma kulture da bi se<p>ostigao visok stepen replikacije ćelija i snabdevanje sa di-saharidom koji se ne metaboiiše, kao što je saharoza;

Bilo koji broj različitih sistema ćelijske

kulture poznatih u tehnici da su korisni za VZV proizvodnju može da se upotrebi. Tako su, Vero ćelije, WI-38 ćelije, MRC-5 ćelije, i niz drugih tipova ćelija upotebljene u ovu svrhu 1 Mi smo konzistentno upotreblja-vali MRC-5 ćelije koje su prihvatljive za proizvodnju vakcine namenjene za humanu upotrebu. Medjutim, nije ne-shvatljivo, da se prinosi bez-ćelijskog VZV mogu poveća-ti preko granice navedene ovde ako se iskoriste odredjene produktivne ćelijske linije drugojaČije od MRC-5.

Do granice da se takva ćelijska linija može adaptirati

za upotrebu u sadašnjem postupku, ovaj pronalazak obuhvata priraenu ovog postupka na takve ćelije.

Uporedjivanje prinosa bez-ćelijskog živog virusa bilo u sub-konfluentnim ili konfluentnim MRC-5 ćelijskim monoslojevima inkubiranim na 35°C pod atmosferom od 5%

CC>2u Eagle-ovom minmalnom esencijalnom medijumu (EMEM)

("Eagles Minmal Essential Medium") sa 2% ili 10% fetalnog telećeg seruma (FCS) ("Fetal Calf Serum) otkriva efekat ćelijske konfluentnosti na prinos jedinica koje obrazuju bez-ćelijske VZV plake (PFU) (videti Primar 2, Tabela I).

Upotreba konfluentnih ćelijskih monoslojeva dovodi do oko 2-3 puta povećanja u bez ćelijskom PFU/ml preko prinosa postignutog infekcijom subkonfluentnih monoslojeva bilo da su subkonfluentne kulture aktivno proliferirajuće (10% serum) ili ne (2% serum). Zbog toga, izgleda da su konfluentne ali ne i aktivno proliferirajuće ćelije neophodne za povećane prinose VZV, u postupku proizvodnje vakcine.

Izgleda da<p>rocenat fetalnog telećeg seruma prisut-nog u toku virusnog rasta nema glavni efekat na prinose bez ćelijskog PFU. Prema tome, tipično se, tokom faze rasta ćelija, FCS obezbedjuje na oko 10%, dok se tokom faza virusnog rasta ovog postupka FCS obezbedjuje sa oko 2%, bilo da je upotrebijen minimalni medijum kao što su EMEM ili E3ME ili bogat medijum, kao što je SRFE-2 za rast ćelije i kulturu virusa

Pored FCS i medijuma, tipično se dodaju antibiotik kao što je 50 ul/ml neomicina, i glutamin (oko 2 mM) u ćelijsku kulturu i medijum virusnog rasta.

1. Faza zasejavanja ćelija:

Kontejneri ćelijske kulture (baloni, kotrljajuće boce, ili funkcionalni ekvivalenti ovih posuda za kulture) se zasejavaju sa MRC-5 ili drugim diploidnim ćelijama, tako de je početna koncentracija ćelija izmedju oko 10.000 i 40.000 ćelija/cm 2. Ćelije se hrane sa medijumom za rast dopunjenim sa oko 10% fetalnog telećeg seruma, tretiraju gasom sa oko 5% C02i inkubiraju se na oko 30-37 o C, a prvenstveno oko 35 oC.

Ćelije mogu da se zasejavaju u zapremini tako maloj koliko je neophodna da se prekriju ćelije gajene u stacionarnoj kulturi. Radni odnos zapremine prema površi-ni je oko 0.5 ml medijuma kulture na cm 2 površine za rast. Tamo gde se ćelije gaje u kotrljajucim bocama,

može da bude adekvatno toliko malo kao što je 125 ml na 850 cm 2 , ali je prvenstveno oko 4 25 ml/cm 2.

Komercijalno dostupni minimalni medijum poznat u tehnici za ćelijsku kulturu, kao što su Eagle-ov minimalni esencijalni medijum (EMEM) ("Eagles Minimal Essential Medium") ili Eagle-ov basalni medijum ("Eagles Basal medium") dopunjen sa Earle-ovim solima (EBME), mogu se upotrebiti sa oko 10% FCS za fazu zasejavanja ćelija. Alternativno, ..može se u<p>otrebiti bogatiji medijum kao pogodniji u ovoj fazi. SRFE medijuin /Weiss, i sarad. ,

In Vitro 16(7), 616-628 (1980)/ koji se može nabaviti od firme SIGMA, je bogat medijum koji se može pogodno upotrebiti u ovom stupnju, ali bogat medijum nije kritičan za ovaj stupanj postu<p>ka.

2. Faza razvoja ćelije:

U ovoj fazi postupka je kritično da se obezbedi dovoljno ihranjenosti, da bi se obezbedio razvoj ćelija do velike konfluentnosti. Ovo se može postići obezbeđji-vanjem velike za<p>remina minimalnog medijuma ili manje zapremine bogatog medijuma. Ćelije se gaje (razvijaju)

na oko 30-37°C, a prvenstveno na oko 32-35°C.

Posle dopuštanja adekvatnog perioda za vezivanje ćelija i rast ćelija, ćelije se mogu<p>onovo napajati uklanjanjem i zamenom medijuma i tada nastavljanjem inkubacije. Medijum se može ukloniti usisavanjem ili dekan-tacijom, ili na bilo koji drugi način sve dotle dok integritet ćelijskog monosloja nije ugrožen. Za MRC-5 ćelije zasejane kao što je opisano gore, ponovno napajanje se može prećuzeti oko 72 sata posle unošenja ćelija u posude kultura.

Zapremina medijuma kulture koji je zamenjen može da bude ista kao zapremina upotrebljena za fazu zasejavanja ćelija. Medjutim, prvenstveno, se upotrebljava u fazi rasta ćelija, veća za<p>remina nego što je bila ona upo-ferebljena u toku zasejavanja. Ovo je naročito važno tamo gde se ćelije kultivišu u minimalnom medijumu kao što su EMEM ili EBME plus FCS. Velika zapremina kulture je jedan način da se obezbedi da ćelije dobiju adekvatnu ishranu.

Potreba za velikom zapreminom može da se smanji kada je medijum obezbedjen za fazu razvoja bogat medijum. Jedan naročito pogodan medijum za ovu svrhu je SRFE-2 (SIGMA)- Upotreba bogatog medijuma na ovom stupnju, pre nego Mnimalnoa medijuma, znatno poboljšava gustinu đeliskog monosloja na konfluentnosti. Ova poboljšana ćelijska gustina dovodi do poboljšanja prinosa VZV koji se može dobiti iz inficirane đelijske kulture gajene na obogaćenom medijumu. Prema tome, upotreba obogaćenog medijuma u toku faze razvoja ćelija dovodi do oko 2-4 puta povećanja finalnog prinosa VZV iznad onoga dobijenog kada se ćelije na ovom stupnju razvijaju u minimalnom medijumu.

U<p>rvenstvenoj realizaciji, SRFE-2 se dopunjava

sa lipidom. Bilo koji broj lipidnih dodataka je koristan,, Tako je nadjeno da su holeserolom bogati lipiđi iz odraslog govedjeg seruma (SIGMA CHEMICL CO.) EXCYTE lipid I ili veoma nizak endotoksin (VLS) ("Verv Lov Endotoxin") lipid (MILES) pogodni kao bogat medijum ili kao dopune minimalnog medijuma. Komercijalno dostupan lipid soje (Boehringer Mannheim, takodje videti Iscove i sarad.,

J.Exp.Med. 147, 923-933 (1978)/ se pokazao kao veoma pogodna dopuna kada se obezbedjuje na oko 0.2 mg/ml. Ćelijske gustine koje se približavaju oko 500,000/cm" i su<p>ostignute upotrebljavajući SRFE-2 plus li<p>id i FCS. Povećani prinosi VZV se postižu kada se obezbedjuje lipid bez obzira da li je razvoj ćelija u minimalnom medijumu ili u obogaćenom medijumu. Komercijalno dostupan materijal se dobavlja kao šarža od 20 mg/.ml lipida, 100 mg/ml albumina govedjeg seruma. Ovaj materijal se pogodno upotrebljava pri 1:100 finalnom razbiaženju. Finalni prinos VZV se<p>ovećava za oko devet puta preko prinosa VZV iz samog EMEM, i za oko 3.3 puta prinosa u samom SRFE-2 medijumu, kada se SRFE-2 đopungava sa oko 0.2 mg/ml li<p>ida soje u toku faze razvoja ćelije.

3. Faza pre infekcije

Mi smo otkrili da se finalni prinos VZV može dalje povećati kada se kultivisane ćelije izlože pre VZV infekcije, disaharidu koji se ne metaboliše i koji

je ne-toksičan pri optimalnoj koncentraciji. Jedna veoma uspešna realizacija obezbedjuje od 20-60 mM saharoze oko 72 sata posle unošenja ćelija u posude za kulturu,

i prvenstveno 24 do 96 sati pre infekcije kulture sa VZV. Kao praktičan način, snabdevanje oko 50 mM saharoze u medijumu za ponovno napajanje iz stupnja 2 odgovara ovim kriterijumima i smanjuje broj sterilnih manipula-cija potrebnih da se efikasno učine ovi i raniji stupnjevi konkurentnim.

Drugi disaharidi, uključujući laktozu, celobiozu, i maltozu takodje povećavaju finalni prinos VZV, ali je saharoza prvenstvena. Testirani monosaharidi, kao sto su fruktoza i riboza nisu povećavali prinos VZV (riboza može da bude ćak i toksična) . Izgleda da se disaharidi koncentrišu u iizosomima ćelija koje se razvijaju, bubre ih tako da se obrazuju vakuole /ĐeCourcv i Storrie, Sxp. Cell Res.. 192, 52-60 (1991)/. Ovaj efekat disaharida na prinos VZV može da bude usleđ smanjenja lizosomalnog oštećenja VZV. Pored disaharida, može se očekivati da tri- i tetra- sahariđi imaju pogodne efekte kao što su Cohn i Ehrenreich / J. 5xp. Med. 129 , 201-222 (1969) zapazili identične vakuolizacije kada se ovi viši šećeri ili sakroza napajaju u makrofage, ukoliko se šećeri ne metabolišu ćelijama.

b. Inficiranje ćelija kultivisanih prema stupnju (a)

što je moguće bliže tačci konfluencije koliko je izvodljivosa visokim multiplicitetom infekcije VZV inficiranim ćelijama:

Mi smo utvrdili, ponovljenim eksperimentima, da

u prošeku, ćelije ostavljene da stoje 48 sati pošto su postale konfluentne daju prinos samo od oko 50% VZV

PFU/ml u poredjenju sa prinosom kada se sveže konfluentne ćelije inficiraju sa VZV. Prema tome, važno je da se odredi vrenje unošenja VZV inokulata, da bi se podudaralo što je moguće bliže sa konfluentnošću. Nažalost, konfluentnost je parametar koji varira prema tipu medijuma,

tipu ćelija koje se kultivišu, i drugim uslovima kulture koji su upotrebijeni. Za MRC-5 ćelije zasejane prema stupnju (a) (1) gore, ćelije su tipično inficirane na tačci dostizanja konf1uentnosti.

Varičela zoster virus (VZV) je prvenstveno Oka

soj oslabljenog virusa opisanog u U.S. Patentu 3,985,615

i koji je deponovan 1976 godine kod American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Orive Rockville, Maryland 20852 ,SAO pod brojem VR-795 .

Ovaj virus je prilagodjen da se razvija u embrionim ćelij-skim kulturama zamorčeta i humanim diploidnim plućnim fibroblast ćelijskim kulturama (na pr. , MRC-5 ćelije).

Šarža infektivnih, za život sposobnih varičelom inficiranih ćelija može da se dobije inficiranjem MRC-5 ćelija pri MOI od oko 1:125, održavajući inficirane ćelije tako da se omogući virusna replikacija, tretiranjem ćelija tripsinom, i upotrebljavajući oslobodjene ćelije odmah kao radno seme ili lagerovanjem za kasniju upotrebu i kvantitativnim od redjivanjem PFU laganim zamrzavanjem sa krio zaštitnim sredstvom kao što je DMSO ili glicerin na oko 10^ ćelija/ml. VZV inficirana ćelij-ska šarža može da se odmrzne i da se doda u k^nfluentnu

ćelijsku kulturu da inicira VZV infekciju.

Alternativno, VZV inficirane delije mogu da se liofiliziraju prema postupku koji su opisali Hondo i sarad., / Archiv fur die<g>esamte Virusforschuna 40, 397-399 (1973)/ koji omogućava dugoročno lagerovanje na 4°C liofiliziranog inakulata. Takodje je moouće da se upotrebi bez-ćelijski VZV kao inokulat, ali zbog gubitaka u prinosu virusa pri sakupljanju, prvenstvena je upotreba ćwlijski vezanog inokulata.

Jedna druga mogućnost za proizvodnju virusom inficirane šarže semena je da se inicira ćelijski razvoj za proizvodnju virusnog semena, pre proizvodnog zasejavanja ćelija. Na tačci infekcije ćelija semena sa VZV inficiranim ćelijama, zasejavanje proizvodnih ćelija može da se inicira tako da se dobije konfluentnost u isto vreme kada seme virusa dostiže pik titara VZV. Manje optimalno, ali pogodnije, ćelije semena i ćelije šarže mogu sve da se zaseju istovremeno, u maloj zapremini medijuma kulture (oko 125 ml na 850 cm 2 kotrljajuće boce) . Posle oko đva-tri dana rasta, boce za proizvodnju VZV semena se povećavaju u zapremni na oko 425 ml, ili se ponovo napajaju sa bogatim medijumom, da bi se omogućio rast do konfluentnosti. Produkcione ćelije se ostavljaju u maloj zapremini minimalnog medijuma (uključujući oko 10% FCS), relativno nepomično, sve do oko dva dana pre nego što se radne ćelije semena inficiraju sa VZV inficiranim ćelijama. Tada se, za<p>remina produkcionih ćelija povećava na oko 425 ml ili se ponovno napajaju sa bogatim medijumom, kao što je SRFE-2 plus optimalna količina lipida soje i fetalnog telećeg seruma. Produkcione ćelije će tada rasti do velike konf luentnosti. Dva dana posle ponovnog napajanja produkcionih ćelija, radne ćelije semena, sada pri konfluentnosti, inficiraju se sa VZV inficiranim ćelijama pri MOI od 1:125 ili više, i ostavi se da se replikacija nastavi u toku dva do tri dana. U vreme kada se dostigne pik VZV proizvodnje u kulturama semena, produkcione ćelije će dostići konfluentnost. Tada se sakupljaju ćelije semena i dodaju u produkcione ćelije

Ma kolika da je dužina vremena proizvodnje semena, na pogodnom vremenu posle VZV infekcije, medijum se

usisava iz VZV inficirane kulture semena, VZV inficirano seme se sakuplja tretiranjem sa tripsinom (tripsinacijom)

(oko 0.25% tripsina) ili nekim drugim ne-razarajućim načinima, i kulture produkcionih ćelija se inficiraju pri poznatom MOI.

Schmidt, N.S. i Lennette, E.H., / Infection and Immun, ity 14, 709-715 (1976)/ su uočili značaj visokog MOI za visok prinos VZV, ali nisu učinili nikakvo odredjeno uporedjenje sa niskim MOI infekcije.. Ovaj pronalazak vrši precizno ovo uporedjenje.

ćelije se inficiraju sa VZV uklanjanjem medijuma za rast iz ćelijskih kultura i zamenom ovoga sa svežim medijumom koji sadrži poznatu količinu VZV inficiranih ćelija dobijenih kao što je gore opisano. Virusna šarža se prvenstveno titruje na jedinice koje obrazuju vari-čela plake (PFU'e), i recipijentne ćelije se broje tako da se omogući kvantitativno ođredjivanje multipliciteta infekcije (MOI) ("multiplicitv of infeation"). MOI<*>i su izraženi kao odnos VZV inficiranih ćelija u inokulatu prema broju ne inficiranih monoslojnih ćelija u kulturi. Prema tome, MOI od 1:10 je visok, dok je 1:625 nizak. Poželjan je poželjan, ali kao praktična stvar, dobri prinosi VZV se mogu postići sa MOI toliko nisko kao 1:125. ;MOI'i od izmedju 1:7 i 1:625 daju izmedju oko 500, 000 PFU/ml pri visokim MOI. do oko 100,000 PFU/ml pri niskom MOI (videti Tabelu 3 iz Primera 5). Što je viši MOI, to je krađe potrebno vreme inkubacije da se dostigne pik PFU i to je veći prinos. Prema tome, oko 5-to struka količina finalnog PFU se može postidi u zavisnosti od MOI i vremena sakupljanja. ;c. Održavanje VZV-inficirane kulture u stanju visoke ishranjenosti u toku oko 22-96 sati i sakupljanje ;na tačci pika proizvodnje VZV: Kultivisanje VZV inficiranih delija se nastavlja približno 22 do 96 sati posle infekcije. Kritično je da se održi adekvatna ishranjenost na ovom stupnju razvoja ;virusa. Pogodno je, bilo snabdevanje kulture sa velikim zapreminama minimalnog medijuma kao što je SMEM plus oko 2-10% FCS, ili sa manjim zapreminama bogatcg medijuma. Naj pogodnije, dodaje se SRFE-2 plus 2-10% FCS bez dodatka lipidne dopune. Uočeno je da lipid smanjuje prinos VZV kada se uključuje u ovom stupnju. ;U toku 22-96 sati post-infekcije kulture, VZV se replicira u delijama koje su inficirane i širi se da inficira susedne delije. Medjutim, stare inficirane delije ne daju bez đelijske PFU'e koje sa mogu regeneri-sati. Kriva rasta VZV i naredni otklon mogu đa budu vrlo oštri, Zbog toga, je korektno odredjivanje dužine vremena trenutka sakupljanja kritičan parametar za posti-zanje maksimalnog infektivnog VZV prinosa, i može se tačno reprodukovati održavanjem stroge kontrole ulazne količineMOI, ishranjenosti, i vremena inkubacije od proizvodne operacije do proizvodne operacije. Pored toga, brza ELISA VZV antigena može da se upotrebi da bi se odredilo optimalno vreme saku<p>ljanja pošto infektivna VZV<p>roizvodnja odgovara proizvodnji VZV antigena, najmanje do trenutka kada počinje da se javlja smrt virusa (videti slike 5 16). ;Za VZV inficirane MRC-5 ćelije sakupljene oko ;72 sata posle infekcije, gde je svaki oć prethodnih stupnjeva optimiziran, (tj., rast u bogatom medijumu i izlaganje ćelija pre infekcije saharozi 50 mM u toku 72 sata) finalni prinos bez-ćelijskog VZV je bio povećan sa oko šesnaest puta u odnosu na prinos postignut u minimalnom medijumu i virusno sakupljanje na 48 sati, i čak pri većoj ivici nego kaca se saku<p>lja na 96 sati (videti Primer 8, Slika 1). Prinos VZV pod istim optimiziranim uslovima je bio samo oko četiri puta veći od prinosa u minimalnom medijumu kada je virus sakupljan 48 sati posle infekcije, ali je bio još uvek zaatno _ jpovećan uč-odnesujna.;.. prinos u minimalnom medijumu na 96 sati. Prema tome, prinos virusa je mnogo veći i smrt virusa je znatno smanjenja u bogatom medijumu i tu nema tako oštrog smanjenja virusnog prinosa u toku vremena. MOI takodje postaje manje kritičan u bogatom medijumu. ;d. Pranje VZV inficirane kulture sa fiziološkim rastvorom, koji opciono sadrži lizosomotropno sredstvo, kao što su amonijum hiorid ili ;hlorohin, pre sakupljanja VZV inficiranih ćelija ;Da bi se uklonili serum, lipid, i celularni otpad, monoslojna kultura se pere sa fiziološkim puferom, koji ne lizira ćelije. Fosfatno puferovan slani rastvor (PBS) ("phosphate buffered saiine") je potpuno prihvatljiv za ovu svrhu. Ćelije mogu da se peru nekoliko puta i rastvor od pranja se dekantira, usisava ili se uklanja na bilo koji drugi način, ukoliko se integritet monosloja ne narušava. ;Ako su ćelije hemijski oslocodjene iz posude za razvoj, one treba da se koncentrišu centrifugiranjem i fiziološki pufer da se<*>zameni sa rastvorom za stabilizaciju.

Nadjeno je, da dodatak amonijum hlorida ili hlorohina pre sakupljanja delija, povećava finalne prinose VZV.Kie.Uan i sarad. / EMBO J. 5, 31303-3 109

(1986)/ su upctrebili amonijum hlorid za kontrolisanje unutrašnjeg pH celularnih endosoma gde inficirajući virusi očevidno provode jedan deo njihovog intracelu-larnog života. Verovatno je mehanizan povećanog prinosa VZV posle izlaganja ćelija lizosomotropnim sredstvima povezan sa indukcijom manje grube endosomalne sredine. Pre infekcije napajanje ćelija sa disaharidima koji su ne toksični i koji se ne metabolišu, kao što je saharoza, i izlaganje ćelija amonijum hloridu ili hlorohinu, mogu stoga da deluju sličnim mehanizmom. U bilo kom slučaju, posmatranje je potvrdjeno empirij-ski da se' finalni prinosi VZV povećavaju kada se dodaje amonijum hlorid pri finalnoj koncentraciji od izmedju 1-100 mM, a najpogodnije u oblasti od 20-50 mM, i prvenstveno se dodaje na oko 4°C u toku od oko 25-50 minuta, pre razaranja ćelija. Jedno drugo lizosomotropno sredstvo, hlorohin, pri koncentraciji od oko 230 p. M. , na sličan način povećava regeneraciju VZV PFU/ml,

e. Sakupljanje VZV inficiranih ćelija u minimalnoj zapremini rastvora za stabilizaciju, i razaranje ćelija ili odmah ili zamrzavanje ćelija za

kasnije razaranje: Jednom kada su VZV inficirane ćelije oprane, one se mogu sakupljati struganjem, ukoliko posuda za razvoj ovo omogućava, ili odcepljivanjem ćelija hemijski. Enzimatsko oslobadjanje ćelija je manje poželjno,<p>ošto zaostali enzim može da smanji virusni prinos jednom'kada su ćelije razorene. Kao što je napomenuto gore, ako se ćelije oslobadjaju u fiziološkom rastvoru, ćelije

se koncentrišu centrifugiranjem i fiziološki slani rastvor se zamenjuje sa minimalnom zapreminom rastvorom za stabilizaciju VZV . Dobra zapremina za površinu za rast ćelija je oko 40 ml stabilizatora

2

na 8 50 cm .

Virusni stabilizatori su poznati u tehnici.

Tako je, stabilizacija sa 5% saharoze u fosfatom puferovanom slanom rastvoru predložena u U.S. Patentu 3,985,615, dok drugi izveštaji preporučuju kompleksnije stabilizatore., kao što je SPGA.

Pošto su VZV inficirane ćelije ponovno suspendo-vane u rastvoru za stabilizaciju, ćelije mogu da se razore odmah, ili u slučaju kada su dobijene velike količine VZV, da se zamrznu na -70°C za kasniju preradu. Prinos VZV na cm" od ćelija koje su se razmnosavale, biće malo veći ako se ćelije razaraju odmah, ali stupanj zamrzavanja ne izaziva gubitak od više od 10% prinosa dobijenog preradom odmah.

f. Razaranje VZV-inficiranih ćelija radi optimalnog oslobadjanja ćeli jski vezanog VZV-, i uklanjanje celularnog otpada, da bi se obezbedio bez ćelij- ski VZV preparat: Kao što je opisano gore, prvenstveno se medijum kulture uklanja iz ćelija pre razaranja i zamenjuje se sa minimalnom zapreminom VZV stabilizatora u koji se ćelije stružu ili se na neki drugi naćin oslobadjaju. Ćelijska suspenzija se ohladi na 0-4°C, i ćelije se tada razaraju pogodnim načinima, kao što su tretiranjem ultrazvukom, DOUNCE homogenizacijom i drugim tipovima smica-nja koji su dostupniji nego DOUNCE, ili kombinacijom ovih tehnika.

Mi smo potvrdili da samo tretiranje ultrazvukom

ne obezbedjuje najbolju regeneraciju bez celijskog VZV.

U stvari, tamo gđe se DOUNCE homogenizacija u<p>otrebljava kao početni stupanj razaranja, a zatim centrifugiranje, zadržavanje gornjeg sloja tečnosti kao gornji sloj tečnosti I, a zatim tretiranje ultrazvukom peleta i centrifugiranje da bi se dobio gornji sloj tečnosti II, VZV prinos razaranja je znatno povećan. Sjedinjeni prinosi gornjeg sloja tečnosti I i II su toliko visoki kao četiri puta prinos kada se samo tretiranje ultrazvukom upotrebi kao tehnika razaranja.

Posle celularnog razaranja, uklanjanje celularnog otpada se vrši centrifugiranjem, filtracijom, ili na bilo koji način poznat u tehnici da bi se uklonio ćelij-ski otpad, dok VZV ostaje neoštećen. Bez ćelijski preparat virusa se tada razblažuje sa rastvorom za stabilizaciju i deii za upotrebu kao vakcina. Za dugotrajno lagerovanje, VZV se prvenstveno liofilizira jednim od postupa-ka poznatih u tehnici.

Ukratko, približan potencijalni prinos raste prateći optimizirane stupnjeve ovog<p>ostupka, u poredjenju sa proizvodnjom VZV rastom ćelija u minimalnom medijumu, kao što je navedeno niže:

Stupanj postu<p>ka Mecti j um/dodaci

Čisto potencijalno povećanje za

kombinovane dodatke medijuiti/stabilizator i optimizirane uslove infekcije >8

Posmatrano povećanje za kombinaciju

3,4, i 5 u kotrljajućim bocama 16

6. Kombinovano struganje/tretiranje ultrazvukom za oslobadjanje ćelijski vezanog VZV 1.5

Ukupno potencijalno<p>ovećanje preko

neoptimiziranog postupka^18

Korist od ovoga postupka za proizvodnju vakcine: Prikazana je korist od oslabljenog, bez-ćelijskog VZV kao vakcine za prevenciju od ovčjih boginja. Više-struke kliničke studije su ubedljivo dokazale ovu koris-nost, i takav dokaz je sada deo ranije tehnike /videti na primer Pediatrics 8 8 (3), 604-507 (1991);Pediatrics 87, (5), 604-610 (1992)/. Prema -one, ogroman doprinos koji ovaj pronalazak čini u tehnici je što on obezbedjuje visoko efikasan postupak za proizvodnju u visokom prinosu živog, oslabljenog VZV. Virus dobijen prema ovom pronalasku može da se formuliše kao vakcina prema postupcima poznatim u tehnici, i da se primenjuje pod kontrolom koja je do sada dobro uspostavljena. Na primer, živ,, oslabljen, bez ćelijski VZV proizvod prema ovom pronalasku može da se razblaži u stabilizatoru, napuni u boce, liofilizira u jediničnim dozama, tako da je posle lagerovanja na oko 4°C ili niže, doza od oko 1000 PFU dostupna u bilo koje vreme za upotrebu. VZV vakcina proizvedena prema postupku iz ovog pronalaska može da se upotrebi u formulacijama jediničnih doza da se inokuliraju ljudska bića da bi se izazvala imuna reakcija zaštitna protiv infekcije virulentnim sojevima VZV. Prvenstveno, na minimumu, doza od oko 2000 PFU/ml

(1000 PFU/0.5 ml doze) se primenjuje subkutano ili intra-muskularno. Primenjene su i doze tako velike kao što su od 15,000 do 20,000 PFU, i one su prihvatljive.

Obezbedjivanjem optimiziranog postupka za proizvodnju oslabljenog VZV virusa, ovaj pronalazak omogućava da se primeni ono što je poznato u tehnici da bi se formulisala vakcina za povećanje anti-VZV imunih reakcija za sprečavanje ovčjih boginja.

Sledeći<p>rimeri su obezbedjeni u svrhu ilustracije ovog pronalaska i ne treba da se smatraju kao ograničenja u njegovom opsegu.

PRIMER 1

ANALIZA ZA ODREDJIVANJE PRINOSA VZV

Titri infektivnosti preparata varičela zoster virusa (VZV) odredjeni su upotrebljavajući postu<p>ke agaroza-pokrivnog sloja ili tečnog pokrivnog sloja opisane od strane Krah-a i sarađ. ( J. Virol. Methods, 1990, 27: 319-326). Analiza se izvodi na sledeći način: MRC-5 ćelije se seju na ploče za kulture od 60 mm, pri 6 x 10<D>ćelija u 5 ml za<p>remina BME ("Basal Medium Eagle with Hank<1>s balanced salts solution") (Bazalni Eagle-ov medijum sa Hank-ovim rastvorom balansiranih soli) sa 100 mg/i galaktoze, 50 ug/ml neomicina, 2 mM L-glutamina, i inkubiraju se na 35°C u atmosferi od 5% C02-Posle inkubacije u toku 24-48 sati, ćelije dostižu 50-80% konfluencije. Medijum za rast se uklanja usisavanjem, i ćelije se inficiraju sa 100 ui rastvora VZV razblaženog u pogodnom razbiaživaču virusa, kao sto su SPGA pufer, ili medijum za održavanje tečnog stanja (LMM) ("iiguid maintainance medium"). SPGA pufer sadrži 7.5% (tež/zap) saharoze, 11 mM kalijum fosfata, 0.1% (tež/zap) natrijum glutamata i 1% aibumina humanog seruma. Ostavi se da se virus vezuje u toku > 1 sata na 3 5°C u atmosferi od 5% CO2. VZV inficirane ćelijske kulture se tada prekrivaju sa 5 ml agaroza pokrivnog medijuma (AOM)

("agarose overiav medium") ili medijumom za održavanje tečnog stanja (LMM) . Agaroza<p>ok.rivni medijum je smeša dva rastvora, tečnog pokrivnog medijuma (LOM) ("liguid overiav medium") i rastvora agaroze . LOM sadrži minimalni esencijalni medijum sa Earle-ovim solima (MEM)

("minimal esser.tial medium"), 2% toplotom inaktiviranog fetalnog telećeg seruma, 50 ug/mi neomicin sulfata i 2 mM L-glutamina. Rastvor agaroze se dobij a zagrevanjem 4.5 g agaroze koja se želatinira na niskoj tem<p>eraturi

u 100 ml MEM u toku 15 min na 121°C i ostavi se da se rastvor ohladi do 45°C. AOM se dobij a mešanjem jedne zapremine rastvora agaroze sa 4 zapremine 1.25 x kon-centrata LOM na 45°C. Ploče se ohlade na 23 - 25°C da bi se omogućilo da AOM očvrsne. Kultura se inkubiraju da bi se omogućilo da se razviju plake.Posle 6-7 dana,<p>loče koje su dobile LOM se prekrivaju sa 5 ml fosfatom pufe-rovanog slanog rastvora (PBS) i obrube se sa staklenom Paster-ovom pipetom da se oslobodi i ukloni agaroza. Medijum se usisava iz ploča koje su dobile LMM, i plake

se učine vidljivim bojenjem čelija sa rastvorom od 0.2% (tež/zap) "Coomassie Blue R-250" u atanoiu-1% sir-ćetnoj kiselini. Broj plaka je prosečna vrednost sa 4-5 ploče i izražena je kao jedinice koje obrazuju plake na ml (PFU/ml).

Zbog potencijalnih razlika u analizi, povećanja prinosa VZV su navedena u odnosu na neoptimizirane us love identično analizirane.

PRIMER 2

Prinos VZV kao funkcija ćelijske konfluentnosti pri

infekcij i : MRC-b ćelije se nanose na ploče pri 4 x 10 ćelija/150 cm" l os-ave se da se razvijaju 3 dana u Earle-ovim solima dopunjenim sa Eagle-ovim bazalnim medijumoru (E3ME) u<p>risustvu 10% fetalnog telećeg seruma (FCS)

("Fetal Calf Serum"). Po dostizanju subkonfluentne ćelij-

6 2

ske gustine od oko 12 x 10 ćelija/150 cm , ćelije se ponovo napajaju se svežim EBME dopunjenim ili sa 2% FCS ili 10% FCS. Sada se dopusti da subkonfluentne ćelije rastu dalje, bilo u prisustvu ili odsustvu VZV infekcije (M0I=1:125) i registruje posle 43 sati povećanje

ćelijske gustine i prinosa virusa. Nadjeno je, da su

se neinficirane ćelije u 2% FCS povećale u gustirti samo za 33%, dok. je povećanje bilo 92% u 10% FCS. Ćelije u Inficiranim kulturama nisu se povećale u broju. Kao što je prikazano u Tabeli I, na prinose virusa iz subkonfluentnih ćelija nije uticano kapacitetom za replika-ciju ćelija u kulturama,. bilo da je bilo minimalno (2% FCS) ili maksimalno {10% FCS) dopunjeno sa FCS.

Druge ćelijske kulture su razmnožavane još 2 dana

u 10% FCS do oko 20 x 10 ćelija/150 cm boce (konfluentni uslov) , i tada se ponovo napajaju sa svežim E3ME dopunjenim ili sa 2% FCS ili 10% FCS i ili su inficirane sa VZV (MOI 1:125) ili su ostavljene ne inficirane. Povećanja u gustini ćelija i prinosima virusa registro-vani su posle 48 sati. Nadjeno je, da se ne inficirane ćelije u 2% FCS nisu povećale u gustini, dok su se ćelije u 10% FCS povećale samo za oko 15%. Prema tome, ni jedan uslov nije bio pogodan za mnogo đelijske replikacije. Prinosi virusa bilo u 2% FCS ili 10% FCS su bili slični

i oba su bila povećana za oko tri puta od prinosa iz ćelija inficiranih pri subkonfluentnosti (videti Tabelu I) . Prema tome, utvrdjena je<p>rvenstvena upotreba sveže konfluentnih ćelijskih monoslojeva nasuprot aktivno replicirajućim subkonfluentnim ćeiijskim monoslojevima za optimalne prinose bez ćelijskog VZV,

PRIMER 3

Uporedjivanje prinosa VZV iz sveže konfluentnih i

odležanih konfluentnih đelijskih kultura

Kotrljajuđe boce (850 cm") su zasejane sa MRC-5 ćelijama pri koncentraciji od približno 26,500 delija/cm 2. Sve ćelije su gajene u EBME medijumu koji sadrži 10%

-(zap/zap) fetalnog telećeg seruma (FCS1Q) u atmosferi od 5% CO2na 3 5°C. Boce su razdvojene u dve grupe, na bazi vremena infekcije sa VZV. Ćelije grupe I su gajene 5 dana, za koje vreme su ćelijski monoslojevi postali konfluentni. Tada je medijum uklonjen i ćelije su inficirane sa ćelijski vezanim VZV pri MOI od 1:125, suspen-dovanim u EMEM + 2% FCS. Dodat je dodatni medijum i ćelije su inkubirane još 48 sati. Ćelije grupe II su držane još 48 sati pre infekcije priMOI = 1:125.

Proizvodnja VZV ćelijama grupa I i II je odredjena

na sledeći način: medijum je uklonjen iz kotrljajućih boca i ćelije su oprane sa slanim rastvorom koji je puferovan

fosfatom, sastrugane pomoću staklenih kuglica u jednake zapremine stabilizatora i ohladjene do 4°c. Hladna suspenzija ćelija se raskida tretiranjem ultrazvukom. Ćelijski otpad se uklanja od virusa centrifugiranjem pri malim brzinama (325 x g u toku 10 minuta) i zadržava se gornji virusni sloj . Proizvodnja VZV se odredjuje analizom plaka. Kao što je prikazano u Tabeli 2, dobija se povećanje prinosa koje se približava dvo-strukom, kada se sveže konfluentni ćelijski monoslojevi inficiraju sa VZV.

PRIMER 4

Efekat zapremina kulture na prinos VZV PFU/ ml

MRC-5 ćelije (10 miliona) se zaseje u 125 ml zapremine EBME, 10% FCS, 50 jug/tal neomicina, i 2 mM L-glutamina u kotrljajuće boce od S50 cm", i inkubira se na 35°C u toku 3 dana. Dodaje se tri stotine mili-litara svežeg medijuma i kulture se vrate na inkubaciju na 35°C još 4 dana. Tada se uklanja medijum i zamenjuje sa 125 ili 425 ml EMEM, 2% toplotom inaktiviranog FCS, 50 ug/ml neomicina, i 2 mM L-glutamina. Dodaju se VZV inficirane MRC-5 ćelije (MOI oko 1:125), kulture se tretiraju sa 5% gasovitog CO?, i vraćaju na inkubaciju na 35°C u toku 46 sati. Uklanja se medijum, ćelije se peru 4 puta sa zapreminama od 100 ml PBS, i sastružu. pomoću staklenih kuglica, u zapremine od 43 ml stabilizatora. Ćelija se zamrzavaju na -70°C. Bez ćelijski virus se dobij a tretiranjem ultrazvukom. Količine infektivnog virusa u izbistrenim (pomoću centrifugiranja) rastvorima dobijenim tretiranjem ultrazvukom, mere se pomoću analize VZV plaka.

Rezultati:

Zaključak: Upotreba veće zapremine medijuma daje oko dvostruko povećanje prinosa infektivnog VZV iz MRC-5 ćelijskih kultura.

PRIMER 5

Efekat VZV MOI na prinos VZV PFU/ ml:

Kotrljajuće boce su zasejane sa MRC-5 ćelijama i gajene do konfluencije. Medijum za rast je uklonjen i ćelije su inficirane sa VZV pri različitim MOI-a. Proizvodnja VZV inficiranim ćelijskim kulturama odredjuje se analizom plaka, periodičnim sakupljanjem i anali-ziranjem kao u Primeru 1. Kao što je prikazano u Tabeli 3 i Slici 5, regeneracija bez ćelijskog infektivnog VZV je bila veća i postignute ja za kraći inkubacioni periodfkada su upotrebijeni veći MOI-a. Pikovi nivoa antigena su takodje postignuti mnogo brže sa većim MOI. Pri veoma niskim MOI, kao što je 1:525, proizvodnja antigena je odložena i podoptimalna (viđati Sliku 5).

PRIMER 6

Povećana stabilnost VZV u stabilizatoru na - 20°C

Inficirane đelijske kulture su tretirane ultrazvukom u SPGA i oprane su sa sl..nira rastvorom koji je puferovan sa fosfatom, ćelijski vezani virus se osloba-dja tretiranjen ultrazvukom i ćelijski otpad se uklanja centrifugiranjem. Koncentracija bez ćelijskog virusa

je podešena na poznatu PFU/ml koncentraciju, i alikvoti virusa u stabilizatoru su liofilizirani i lagerovani na 4 C ili -20°C. U intervalima od jednog meseca u toku perioda od ukupno 14 meseci, uzorci su rekonstituisani i odredjivan je preostali titar PFU. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na Slici 3.

Evidentna je suštinska prednost za stabilnost VZV dobijena iagerovanjem na -20°C pre nego na 4°C.

PRIMER 7

Efekat na finalni prinos VZV količine i vremena dodavanja saharoze u toku faze rasta delija, pre faze infekcije

1. Faza zasejavanja ćelija

MRC-5 ćelije (5 ml) zasejane su pri koncentraciji od 120,000 ćelija/ml (600,000 ćelija ukupno) na ploče od 60 mm u E3ME medijumu koji sadrži 10% FCS, 50 ug/ml neomicina, 2 mM L-glutamina, i inkubira se na 3 5°C pod 5% C02.

2. Razvoj ( rast) ćelija/ pre infekcione faze

Ćelije su bile konfluentne trećeg dana posle zasejavanja. Medijum za zasejavanje je usisan sa 48 ploča i zamenjen je sa zapreminama od 8 mi medijuma za rast koji sadrži ili EBME ili SRFE-2 dopunjen sa 10% FCS, 50 ug/mi neomicina, 2 mM L-glutamina, i 0.2 mg/ml lipida soje/1 mg/ml 3SA, ili sa ili bez 50 mM saharoze. Posle dodatka svežeg medijuma za rast, ćelije su inkubirane još 3 dodatna dana na 35°C pod 5% CC^.

3. VZV infekcija

Medijum je tada uklonjen sa svake ploče i zamenjen sa 8 ml EMEM umesto EBME i SRFE-2 umesto SRFE-2 plus lipidi soje. FCS je smanjen do 2% za sve ploče, ali drugi dodaci, nsomicin, glutamin, i saharoza su bili kao<u>fazi rasta. Svaka ploča je tada dobila 333 ul 1:16 razblaženja VZV inficiranih ćelija (47,000 PFU/ml) u EMEM, 2% FCS, naomicin, glutamin.

VZV je ostavljen da- sa replicira na 35°C pod 5% C09u toku dva dana, i zatim je uklonjen medijum sa 2 ploče iz svakog različitog uslova. ćelije su oprane četiri puta sa PBS. Ćelije su sastrugane u 1.2 ml/ploče ledeno hladnog stabilizatora. Sakupljen materijal sa duplikatnih ploča je sakupljen u konične epruvete od 50 ml za.centrifugu i zamrznut na -70°C.

Isti postupak kao što je opisan u<p>rethodnom paragrafu, ponovljen je za dve ploče iz svakog us lova na treći/četvrti i peti dan posle VZV infekcije, i sakupnjen materijal od svakog seta od dve ploče je lage-rovan na -70°C.

Svaki ćelijski materijal koji je dobijen kao što je gore opisano, kasnije je otopljen, tretiran ultrazvukom na ledu u toku 30 sekunde po epruveti upotrebljavaju-ći "cup-horn" ultrazvučni aparat, i izbistren je centrifugiranjem na 1000 x g u toku 10 minuta na 4 oC. Alikvoti gornjih slojeva tečnosti su uklonjeni radi analize plaka. Rezultati analize plaka, izvedene kao što je opisano u Primeru 1, prikazani su na Slici 1 .

Podaci prikazani na Slici 1, potvrdjuju nekoliko zaključaka.

1. Inkubacija, ćelija', pre infekcije, sa 50 mM saharoze je veoma korisna za finalni prinos VZV. U

svakom medijumu, EMEM ili SRFE-2 , prinosi VZV su bili veći kada su ćelije bile tretirane sa saharozom pre infekcije. Na 72 sata posle infekcije,<p>rinos VZV u SRFE-2 gajenim ćelijama izloženim saharozi bio je oko šesnaest puta veći od prinosa VZV, nego što je bio kod ćelija u minimalnom medijumu bez saharoze, izmeren kao PFU ! 2. Dodatak bogatog medijuma (SRFE-2 plus lipidi soje tokom rasta i SRFE-2 tokom virusnog rasta) korisni su za prinos VZV, ali zajedno sa afektom saharoze, omogućava da se proizvede za stepen više VZV. Prema tome, izgleda da bogat medijum deluje zajednički sa efektom saharoze. 3. Vreme sakupljanja VZV je veoma značajno. Ćak i pod optimalnim uslovima kulture, SRFS-2 i saharoza itd., pik prinosa VZV se ne postiže za 48 sati posle infekcije.

Za to vreme, postiže se samo četvorostruko povećanje

iznad onoga sa minimalnim medijumom. Medjutim, na 72

sata posle infekcije javlja se 16-to struko povećanje u prinosu VZV.

0 odvojenim eksperimentima, prinos VZV nije bio toliko povećan, ako se 50 mM saharoze dodaje u vreme infekcije,, pre nego 72 sata pre infekcije, na taj način ukazujući na značaj duge faze<p>re infekcije za intra-celularnu akumulaciju saharoze. Mi smo takodje utvrdili da je dodatak od 25 mM ili 100 mM saharoze manje korisan nego dodatak 50 mM saharoze. Iste približne koncentracije su primenljive na laktozu, celibiozu i maltozu.

PRIMER 8

EFEKAT VIŠESTRUKO POVEĆANIH PARAMETARA. POSTUPKA NA

PRINOS VZV

Izvršen je eksperiment sa kotrljajućom bocom, da

bi se odredili efekti promena postupka (medijum kulture, dopunjavanje sanarozom, dodatak NH^Cl u stabilizator, "DOUNCE" tehnikom ili tretiranjem sa ultrazvukom za oslobadjanje virusa iz ćelija) na prinose bez ćalijskogVZVPFU • Kulture su zasejane pri 80 :< 10"^ ćelija/ml x 125

ml EBME, 10% FCS na kotrljajuću bocu. Ove su podešene na 425 ml sa E3ME ili su ponovonapajane sa SRFE + medijum lipida soje, i inficirane saradnim semenom VZV u 125 ("mala zapremina") ili 425 (velika zapremina") ml EMEM

ili SRFE medijuma (bez lipida soje) . Dužina vremena za ove izmene medijuma/infekciju bilo je kao što je opisano u Primeru 7. Pri različitim vremenima pre infekcije (96, ili 24 sata pre infekcije, ili u vreme infekcije), doda-vana je saharoza (suc) do 50 mM. Kulture koje su dobile saharozu preinfekcije takodje su dobile saharozu u virusnom infekcionom medijumu. Sve kulture su inficirane

pri priblično MOI = 1:15 sa VZV inficiranim ćelijama u EMEM kulturama i sakupljene su na 46 sati u post-infekcionom stabilizatoru koji sadrži 20 mM NH,CL (N) , ili nikakav dodatak. Svi uzorci su zamrznuti na -70°C i virus je naknadno oslobodjen od ćelija, ili tretiranjem sa ultrazvukom ili DOUNCE homogenizacijom. Svi uzorci su izbistreni centrifugiranjem na 1000a za 10 minuta.

PFU resultati dobijeni za uzorke TRETIRANE ULTRAZVUKOM omogućili su sledeće zaključka: 1 . Upotreba "velike" zapremine medijuma EMEM povećala je VZV PFU dvostruko. Izgleda da se sa SRFE, ovde i u drugim eksperimentima optimalni prinosi PFU dobij aju blizu "male" zapremine medijuma. U nekim slučajevima,<p>rinosi pri "velikim" zapreminama medijuma su prigušeni. 2. NHdCl nije kritičan za visoke regeneracije PFU. 3. Saharoza povećava prinose PFU dvostruko za EBME/ EMEM i petostruko za SRFE kulture. Izgleda da je ovo efekat vremena dodavanja saharoze na PFU.U jednom drucom delu ovog eksperimenta, prinosi PFU su bili 94 x 10<3>

za SRFE+ so'ja/SRFE kulture koje nisu dobile saharozu i 29 6 x 10<3>, 427 x 10<3>, i 671 x IO<3>, za kulture koje su dobile saharozu pri infekciji, 24 sata pre infekcije,

i odnosno 96 sati pre infekcije

4.Saharozom tretirane kulture su pokazale značajno manje citopatičnih efekatanego njihovi duplikati bez saharoze. U jednom drugom eksperimentu, saharozom tretirane kulture još uvek nisu pokazivale degenerativne citopatične efekte jednu nedelju posle infekcije, dok su njihove kontrole bez saharoze potpuno lizirane. Stoga je moguće, da će saharozom tretirane ćelije akumulirati više VZV (antigen i naročito PFU) pri produženim vremenima inkubacije (46 sati posle sakupljanja iz eksperimenta sa kotrljajućom bocom). 5. MOI nije podešen u ovom eksperimentu za veće ćelijske koncentracije u vreme infekcije, usled ćelijskog rasta u SRFE medijumu. Prema tome, čak i veći prinosi PFU mogu da se dobiju ako se ovaj parametar optimizira.

PRIMER 9

PRINOS BEZ ĆELIJSKOG VZV POSTIGNUT MEHANIČKIM CEPANJEM,

TRETIRANJEM ULTRAZVUKOM I KOMBINACIJOM OVIH:

Izvršen je eksperiment velikih razraera, upotreb-ljavajući višestruke različite uslove za proizvodnju VZV, slično eksperimentu opisanom u Primeru 8. U ovom eksperimentu je analiziran jedan nov parametar, način razaranje ćelije. Rezultati su izneti niže uporedjujući prinos bezćelijskog VZV postignut samo sa DOUNCE homogenizacijom, samo sa tretiranjem sa ultrazvukom, i kombinacijom DOUNCE homogenizacije i tretiranja ultrazvukom. Us lovi VZV kulture su navedeni za ćelije gajene u minimalnom medijumu (EBME/EMEM) ili u visokoj ishranjenosti (SRFE-2 plus lipidi soje/SRFE-2<p>lus 50 mM saharoze u fazi pre infekcije). Ćelije su gajene i saku<p>ljene kao što je opisano u Primeru 8, i VZV PFU/ml je odredjen analizom opisanom u Primeru 1:.

Iz ovih podataka, je jasno da se suštinsko povećanje prinosa VZV postiže kada se mehaničko cepanje kombinuje sa ultrazvučnim razaranjem ćelija.

PRIMER 10.

PRIMENA SRFE-2 MEDIJUMA I DOPUNE LIPIDOM SOJE DA BI SE POSTIGLO POVEĆANO REGENERISANJE ŽIVE VARIČELA VAKCINE

IZ MRC- 5 ĆELIJA:

2 MRC-5 ćelije se inokuliraju u T-boce od 25 cm

u EBME i inkubiraju se 3 dana na 3 5°C. Medijum se uklanja, i zamenjuje sa 12.5 mi svežeg EMEM medijuma,

ili SRFE-2 medijuma sa 10% FCS, neornicinom, giutaminom,

i ili bez lipida soje ili sa 1:200 razblaženja lipida. Kulture su inkubirane još 3 dana na 35°C. Medijum je tada uklonjen i ćelije su dobile VZV inficirane MRC-5 ćelije i zapremine od 12.5 ml 2% fetalnog telećeg seruma, neomicina, glutamina u EMEM ili SRFE-2. Uslovi kulture pokazuju da je "SRFE-2" dobio SRFE-2 tokom ćelijske kulture i virusne kulture. "SRFE + sov" uslov ukazuje na uzorke koji su dobili SRFE-2 medijum i 1:200 razbiaženje lipida soje tokom ćelijske kulture, ali samo SRFE-2 mediiumu tokom

virusne kulture. Posle kultivisanja u toku 48 sati, medijum je uklonjen, delije su oprane 4 puta sa zapreminom od 5 ml PBS i sastrugane u zapremine od 1.2 ml stabilizatora. Uzorci iz dvojnih boca su sakupljeni i zamrznuti na -70°C. Posle naknadnog otapanja, ćelije su razorene tretiranjem ultrazvukom, izbistrene centrifugiranjem (1000 g u toku 10 minuta), i gornji slojevi tečnosti su zamrznuti na -70°C za naknadnu analizu titara infektivnosti virusa. Rezulteti su prikazani na Slici 4.

Zaključci: Upotreba SRFE-2 medijuma umesto EMEM dovela je do 2.5-strukog povećanja u regeneraciji žive varičele. Upotreba sojom dopunjenog SRFE-2 tokom ćelijske kulture omogućila je još dodatno 2.7-struko povećanje u regeneraciji virusa, za čisto 7-mo struko povećanje iznad onoga dobijenog upotrebijavajući postupak EMEM rasta virusa.

PRIMER 11

KONKURENTNA ELISA ZA KVANTITATIVNO ODREDJIVANJE ANTIGENA

VZV: Pošto je analiza VZV plaka spora, nije naročito povoljna za kontrolu u toku<p>ostupka. Brza antigen VZV ELISA omogućava merenje količina antigena VZV tako da

je omogućeno registrovanje rasta virusa u toku proizvodnje žive varičela vakcine. Osim toga, ovaj test može da se upotrebi da se odrede količine antigena VZV u izbistrenim, ultrazvukom tretiranim šaržama vakcine, i potencijalno za merenje antigena u napunjenim liofiliziranim ampulama sa vakcinom. Ukratko, ova analiza se sprovodi inkubiranjem antigena VZV iz test uzoraka sa anti-VZV, serumom u rastvoru.Zaostalo slobodno antitelo se ostavi da se veže za antigen VZV imobiliziran na ELISA mikrotitarskim pločama. Količina antitela sposobnog da se

vezuje na ploče je obrnuto proporcionalna količini antigena u test uzorku. Vezivanje antitela za ploče odredjuje se kvantitativno reakcijom sa enzimski vezanim anti humanim antitelom i pogodnim substratom da bi se dobio obojeni proizvod koji se odredjuje kvantitativno spektrofoto-metrijski.

ELISA antigena VZV i analize plaka VZV treba uglavnom da daju korelativne p o datk e, ali treba imati na umu da analiza antigena VZV otkriva nesposobne za život kao i sposobne za život VZV. Pošto se imuna reakcija postignu-ta sa ubijenim VZV nije pokazala toliko efikasnom kao reakcija sa živim oslabljenim virusom, analiza plaka je presudna reakcija za odredjivanje doze virusnog inokulata za VZV vakcine. Medjutim,analiza antigena.je takodje korisna pošto obezbedjuje meru šarže ukupnog antigena koji je dodat u recipijent VZV vakcine.

Test postupak:

1. ELISA ploče su obložene sa glikoproteinima (gpa)

iz VZV inficiranih ili ne inficiranih Mrc-5

delija, i prekrivene su sa 1% albuminom govedjeg seruma /frakcija V, ČA-9647, Sigma/, 0.1% NaN^)

da bi se smanjila ne specifična adsorpcija antitela na ploče. Naizmenični redovi se oblažu sa VZV gp " ili kontrolnim antigenom (tj . redovi A, C, S

i G dobij aju gp, a redovi 3 , D, F i H dobij aju ne inficirani MRC-5 gp antigen) .

2. Izbistreni (3250g-min) test antigen se razblažuje u stabilizatoru u 12 x 75 mrr. epruvetama ili mikro-epruvetama. Standardni virusni antigen preparat

(26 jedinica/ml antigena VZV "dot blot" analizom)

razblažuje se 1:10 i tada serijski 1:1.25-to struko da bi se obezbedile koncentracije antitela

od 2.6, 2.1, 1.7, 1.3, 1.1, 0.9 jedinica/ml. Mogu se uključiti i dodatna razblaženja da bi se obezbedilo 0.7 i 0.5 jedinica/ml antigena. Ova serija razblaženja upotrebljava se da bi se dobila standardna kriva za merenje količina antigena u test uzorcima. 3. Humani anti-VZV serum se razblačuje u stabilizatoru do 2 puta od finalnog željenog razblaženja. 4. Zapremine od tristotine jalrazblaženog antigena se razdeljuje u mikroepruvete, mesa se sa 300 ul razblaženog anti-VZV seruma i inkubira se na 35°C u toku 15-22 minuta. Kontrola obuhvata humani anti-VZV i razbiaživač (bez antigena). 5. " Alikvoti od 100 ul od svake smeše serum-antigen dodaju se u 2 udubljenja obložena replikatnim VZV glikoproteinom (VZV gp) i 2 udubljenja oblo-žena sa MRC-5 gp (4 udubljenja po uzorku) (na pr. : uzorak 1 u koloni 1, redovi A, B, C i D; uzorak 2 u koloni 2, redovi A, B, C i D, itd.) . 6. Ploče su inkubirane u toku 15-1 minuta na 35°C da bi se omogućilo slobodnom antitelu (koje nije kompleksirano za antigen u rastvoru) da se veže za virusni antigen imobiliziran na pločama. 7. Nevezano antitelo se uklanja pranjem i udubljenja dobijaju alkalnom fosfatazom konjugovani kozji anti-humani IgG da bi se detektovalo vezano humano antitelo. 8. Posle inkubacije u toku 15-1 minuta na 35°C, ne-vezani konjugat se uklanja pranjem. Vezani konjugat se detektuje inkubacijom u toku 15 minuta na 35°C sa p-nitrofenil fosfatnim substratom rastvo-renim u dietanolaminskom puferu. 9. Posle završetka reakcije substrata dodatkom 50 ul/ udubljenju 3 M NaOH, razvijanje boje (OD na 405 nm) je kvantitativno odredjeno upotrebljavajući spektrofotometar sa mikropločom.

Izračunavanja testa i interpretacija:

1. Odnosne replikatne OD vrednosti za replikatima VZV i MRC-5 obložena udubljenja su prosečne.

Iskustvo je pokazalo da je MRC-5 OD postojano izmedju različitih uzoraka i razblaženja.

Zbog toga su MRC-5 vrednosti za celokupnu ploču prosečne i upotrebljene da se koriguje ne-speci-fično vezivanje primarnog antitela ili konjugata za ne inficirane ćelijske ekstrakte. ProseČna

MRC-5 OD je oduzeta od odnosnih prosečnih VZV ODa da bi sa dobile VZV-specifične OD (^OD) vrednosti.

2. Obrazovanje standardne krive za merenje količina antigena: /j OD vrednosti standardne krive nanose se prema poznatim koncentracijama antigena (jedinice VZV/ml). Podaci se unose u pogodan grafički program (na' pr.: Cricket Graph versija 1.3, Cricket Software, Malvern, PA) , identifikuje se linearni deo krive (mora da obuhvata najmanje 4 tačke) i dobija se "line fit formula" (y=a +• bx) . 3. Izračunavanje količina antigena test uzoraka: Vrednosti za a i b date su "line-fit formulom", a y ( aOD) je poznato. Preostala nepoznata vrednost, x, koja predstavlja jedinice/ml antigena, može tada da se izračuna, i da se koriguje razbla-živanjem uzorka da bi se dobila koncentracija antigena nerazblaženog uzorka. Opite izračunava-nje uzorka je sleđeđe:

Navedena koncentracija antigena je ona dobijena sa najmanje razbiaženim uzorkom obezbedjujucil\ ODvrednost unutar linearnog dela standardne krive.

PRIMER 12

ELISA ANTIGENA VZV I UPOREDJIVANJS SA PRINOSOM VZV PFU:

Uzorci bez ćelijskog VZV proizvedeni u Primeru 7 za koji je dat prinos PFU/ml u Slikama 1, analizirani su prema ELISA VZV antigena prikazanoj u Primeru 11. Rezultati ove analize dati su u Slici 2.

Značajno je da antigen VZV nastavlja da se penje na 96 sati iako, prema podacima iz Slike 1, PFU/ml opada. Takodje je značajno da nivo antigena VZV u SRFE-2 plus soja plus saharoza nije nikako blizu 16-to strukom nivou antigena u EMEM (slika 2), dok za život sposoban bez ćelijski VZV PFU/ml jeste (Slika 1). Iz ovog u<p>oredjenja, izgleda da je efekat saharoze osnovni doprinos za' održavanje za život sposobnog VZV na 72 sata posle infekcije.

PRIMER 13

Povećanje rasta MRC-5 ćelija upotrebljavajući SRFE-2

medijum i dodatak lipida soje

MRC-5 ćelzje su inokulirane u T-bocama od 25 crn" pri 53,000 ćelija/ml u zapreminama od 12.5 ml EBME, 10% FCS, 50 ug/ml neomicina i 2 mM L-glutamina, i inkubirane su na 35°C. Posle 2-3 dana, medijum se uklanja i zamenjuje (šarža 2) sa 12.5 ml svežeg medijuma ili SRFS-2 medijuma koji sadrži 10% FCS, 50_ug/mlneomicina, 2 mM L-glutamina, i različite količine lipida soje. Nerazbla-žen lipid soje sadržavao je 20 mg/ml lipida i 100 mg/ml albumina govedjeg seruma.

Medijumi su uklonjeni na 6 dana posle početnog zasejavanja ćelija, i zamenjeni sa zapreminama od 12.5 ml 2% FCS, 50 ug/ml neomicina, 2 mM L-glutamina u EMEM, ili je SRFE-2 medijum dopunjen sa različitim količinama lipida soje. Ćelije su disocirane iz odabranih boca tretiranjem sa tripsinom i ćelije su bile prebrojane u hemacitometru. Sroj ćelija je odredjen za preostale kulture posle još 2 dana kultivisanja na 35°C, i pregled rezultata je prikazan u Tabeli 5.

Medijum šarža 1 = medijum je zamenjen sa naznačenim medijumom dopunjenim sa 10% FCS 2-3 dana posle zasejavanja delija.

Medijum šarža 2 = medijum je zamenjen sa naznačenim medijumom dopunjenim sa 2% FCS 6 dana posle zasejavanja.

NO = nije odredjen

Zaključci: Upotreba SRFE-2 medijuma bez dodatka lipida daje približno 2-struko povećanje u broju delija iznad onoga dobijenog samo sa EMEM. Prinosi ćelija su dalje povećani, u zavisnosti od doze, dopunjavanjem medijuma sa lipidom soje. Maksimalni<p>rinosi ćelija se postižu upotrebljavajući kombinaciju SRFS-2 medijuma i oko 200-400 ug/ml lipida.

PRIMER 14

RAST WI- 38 ĆELIJA PREMA POSTUPKU IZ OVOG PRONALASKA

WI-38 ćelije su inokulzrane u T-boce od 25 cm<2>pri 53,000 delija/mi u zapreminama od 12.5 ml EBME, 10% FCS, 50 mg/ml neomicina, i 2 mM L-glutamina, i inkubirane na 35 QC. Posle 2 dana, medijum je uklonjen, i zamenjen sa 12.5 ml SRFE-2 medijuma dopunjenog sa 50 mg/ml neomicina, 2 mM L-glutamina, i 1:200 razblaženjem lipida soje. Kontrole su dobile medijum bez dodatka lipida.Posle 5 dana kultivisanja na 35°c-, medijum je uklonjen, delije su disccirane iz boca tretiranjem sa tripsinom, i izbrojane u hemacitometru. Preostale boce su držane još

3 dana pre brojanja delija. Sledi pregled rezultata:

Zaključak: Dopunjavanje bogatog medijuma kulture sa li<p>idom soje povećava prinose WI-38 ćelija za približno dvostruko. Očekuje se da upotreba ovih ćelija za proizvodnju VZV protiće slično sa upotrebom MRC-5 ćelija.

PIRMER 15

POSTUPAK ZA ODREDJIVANJE POVEĆANJA RASTA MRC- 5 ĆELIJA

MRC-5 đalije se zasejavaju u T-boce od 25 cm"

pri oko 53,000 delija/ml u zapremine od 12.5 ml bazalnog Eagle-ovom medijuma sa Earle-ovim solima (EBME), 10% FCS, 50 ;ag/ml neomicin sulfata (neo) i 2 mM glutamina (Gln) . Kulture su inkubirane na 35°C 3 dana, za koje vreme su ćelijski monoslojevi tipično oko 50-75% konfluentni. Medijum se uklanja i zamenjuje sa zapreminama od 10 do 12.5 10% FCS, 50 ug/ml neomicina i 2 mM glutamina - lipida soje ili nekog drugog lipida, u SRFE-2 medijumu i kulture se vraćaju na inkubaciju na 35°C. Broj ćelija je odredjivan na različitim vremenima tretiranja ćelija

sa tripsinom (zapremine od 2.5 ml 0.25% rastvora citrata tripsina) i brojanjem u hemacitometru. Sposobnost delija za preživljavanje registruje se pomoću ćelijskog isklju-čivanja 0.2% tripan plavog. Odredjivanje broja ćelija je upotrebijeno da se izvede koncentracija ćelija koja je pak korigovana za ukupnu zapreminu ćelijske suspen-zije da bi se dobio ćelijski prinos po boci. U nekim eksperimentima, kulture su premeštene u medijum sa 2% FCS 3-4 dana posle zamene medijuma, i odredjivanje broja ćelija je izvršeno posle inkubacije u toku još 2 dana.

PRIMER 16

EFEKAT PRODUŽENOG IZLAGANJA KULTIVISANIH ĆELIJA LIPIDNIM

DODACIMA

MRC-5 ćelije su zasejane u T25 boce, hranjene posle 3 dana (prvo ponovno hranjenje) i izvršeno je odredjivanje broja ćelija posle još 3 dana rasta. Dopušteno je da se u dodatnim T25 bocama produži rast ponovnim hranjenjem - lipid (drugo ponovno hranjenje) i ostavi se da rastu još 2 dana. Ćelije se regenerišu sa tripsinom. Prinosi su bili 2.6 x 10° za delije zasejane u EBME i koje su gajene u EMEM, dok su delije koje su gajene u SRFE-2 plus 1:100 razblaženje lipida soje, dostigle 6.6 x 10 6 i 7.7 x 10 6, Ćelije koje su gajene još 2 dana dale su prinos od 2.76 x 10 g za EBME/ EMEM gajene delije dok su EBME/SRFE-2, bez dodatka lipida

6 6 soje, gajene delije dale prinos od 9.2 x 10 i 7.88 x 10 delija po T25 boci. EBME/SRFE-2 + 1:100 lipida soje gajene delije dale su prinos od samo 2.48 i 2.28 x 10g delija. Ovi podaci pokazuju da<p>roduženo izlaganje

(oko 5 dana posle drugog ponovnog hranjenja) visoke koncentracije lipida mogu eventualno da dovedo do smanje-nih đelijskih prinosa, verovatno usled smrti delija. Prema tome, uglavnom, sa delije<p>onovo hrane sa bogatim medijumom,' kod koga je odsutan dodatak lipida. Ovaj prelazak na bogat medijum, bez lipida, je naročito važan kada je virusna faza rasta inicirana, pošto lipid može da bude toksičan za virusni rast ili produženu sposobnost za život u prisustvu virusnog ubijanja.

PRIMER 17

EFEKAT RAZLIČITIH KONCENTRACIJA LIPIDA MA ĆELIJSKI RAST

U BOGATIM I MINIMALNIM MEDIJUMIMA:

Radeđi suštinski prema istom postupku i ponovnom hranjenju/delija i kvantitativnoj listi opisanoj u Primeru 16 za MRC-5 kultura, dobijaju se sledeđi ćelijski prinosi, (beleška: + i - simboli posle opisa medijuma pokazuju<p>risustvo ili odsustvo navedene koli-čine, u mg/ml dodatka lipida soje (ls) u drugom medijumu za ponovno hranjenje) :

Podaci sakupljeni gore su uglavnom u saglasnosti sa posmatranjima navedenim u Primeru 16 da produženo "izlaganje delija visokim koncentracijama lipida nije veoma korisno, mada je toksični efekat naveden u Primeru 16 manje izražen u ovim podacima. Pri niskim koncentracijama lipida, duže izlaganje delija lipidu je manje štetno i može da bude korisno za povećanje prinosa ćelija/cm<2>površine za rast.

PRIMER 18

EFEKAT KONCENTRACIJE FETALNOG TELEĆEG SERUMA NA PRINOSE

ĆELIJA

U ovom eksperimentu, testiran je dodatak 2% ili 10% fetalnog telećeg seruma u prisustvu dodatka lipida. MRC-5 delije su zasejane u EBME, ponovo na<p>ajane 3 dana kasnije sa SRFE-2 dopunjenim sa različitim količinama lipida soje, ponovo napajanja 2 dana kasnije sa istom koncentracijom lipida u SRFE-2 kao što je dodato u prvom na<p>ajanju. Ćelijski prinosi u 10% FCS su bili 9.5, 11.3, i 12.2 x 10 za kulture dopunjene sa 0.1, 0.2, i odnosno 0.4 mg/ml lipida. Tamo gde je dodato 2% FCS, ćelijski prinosi su bili 6.5, 8.8, i odnosno 3,2 x 10^. Ovaj eksperiment ističe koristan efekat na ćelijski rast snabdevanja sa FCS dodatkom kao i dodavanja lipida. Ma koji toksični afekti kod ćelija uočeni pri povećanim koncentracijama lipida, umanjeni su dodatkom dovoljno FCS dodatka.

PRIMER 19

EFEKTI RAZLIČITIH DODATAKA LIPIDA NA RAST MRC- 5 ĆELIJA

MRC-5 ćelije su zasejane u T25 bocama u EBME. Na treći dan, ćelije su ponovo napajane sa SRFE-2 medijumom koji sadrži 10% FCS, dopunjen sa različitim dodacima lipida. Boehringer Mannheim lipid soje, Sigma holesterolom bogat lipid iz odraslog govedjeg seruma, ili Miles/Pentex EX-CYTE I ili govedji lipoprotain sa niskim endotoksinom, se dodaju pri navedenim koncentracijama. Broj ćelija pri<p>onovnom napajanju je iznosio, u milionima:1.19. Pet dana kasnije ćelije su izbrojana Ćelije u EMEM su bile 2.97; u SRFE-2, ili SRFE-2 plus 0.4 ml/mg, 0.2 mg/ml, i 0.1 mg/ml lipida soje, dale su 4.83, 10.44, 8.67, i odnosno 8.04 miiiona delija. EX-CYTE I pri 1:50, 1:100, 1:200 daje 5.37, 4.80 i odnosno 4.74 miliona ćelija: EX-CYTE VLE pri 1:25, 1:50, 1:100 daje 5.49, 7.23, i odnosno 7.92 miliona ćelija. Sigma lipidi sa visokim holesterolom pri 1:25, 1:50, 1:100 dali su 6.87, 7.56, i odnosno 7.65 miliona ćelija. Boehringer Manneheim-ovi lipidi soje nude najveće<p>ovećanje ćelij-skog prinosa, mada su EX-CYTE VLE i Sigma lipidi bili skoro isto toliko efikasni. Efekat povećanja zbog toga nije jedinstven za lipide soje.

PRIMER 20

Povećanje rasta MRC-5 ćelija upotrebljavajući visoke

koncentracije lipida soje:

MRC-5 ćelije su zasejane u boce od 25 cm i ponovo na<p>ajanje na dane 3 i 6 kao u Primeru 13. Ćelijski prinosi,po boci na dan 6 za EBME/EMEM, SRFE-2 plus 1/100 lipida soje ili SRFE-2 plus 1/50 lipida soje, kultura su bili 4.3 miliona, 9.7 miliona, i odnosno 11.7 miliona. Sposobnost delija za život je bila > 99% {ocenjeno isklju-čenjem sa tripan plavim) za sve kulture.Ćelije su ponovo napajanja sa medijumom - lipidom soje, inkubirane još 2 dana, i odredjeni su ćelijski prinosi. Regeneracije ćelija po boci za ove kulture su bile 2.9 i 3.5 miliona za duplicirane EBME/EMEM kulture; 11.65 miliona za SRFE-2 plus 1/50 lipida soje,ponovo napajanje sa istim medijumom dok su SRFE-2 plus 1/50 lipida soje kulture (du<p>likati) ponovo napajanje, sa SRF-2 medijumom i bez lipida soje dali prinose od 13.69 i 11.09- miliona ćelija; 9.66 miliona za SRFE-2 plus 1/100 lipida soje, ponovo na<p>ajanje sa istim medijumom, dok su ponove<napa>j<an>j<e>sa srfe-2 i bez lipida dale prinos od 8.51 i 6.27 miliona u dupli-ciranim kulturama.

Iz ovog eksperimenta je jasno, da se prinosi MRC-5 -delija povećavaju sa povećanjem količina lipida soje. Maksimalni ćelijski prinosi se postižu upotreblja-vajući 1/50 razblaženja lipida soje (test najviše koncentracije). Inkluzija lipida u drugom medijumu za ponovno napajanje obezbedjuje umereno povećanje ćelijskih prinosa. Medjutim, podaci pokazuju da se maksimalni ćelijski prinosi mogu postići upotrebom 1/50 lipida u prvom medijumu za ponovno napajanje. Dodatak lipida može tada da se izostavi iz drugog medijuma za ponovno napajanje. Pošto visoke koncentracije lipida mogu da budu štetne za proizvodnju virusa, može da bude poželjno da se izostavi lipid tokom virusnog rasta.

Claims (9)

1. Postupak za kultivisanje ćelija u monosloju, naznačen time što sadrži: • a. zasejavanje posude za kulturu ćelijskom šaržom u minimalnom ili bogatom medijumu i dopuštanje da ćelije rastu u toku 24-72 časa; • b. uklanjanje medijuma iz kulture iz koraka a. i zamena sa svežim, bogatim medijumom, dopunjenim sa 0.02-0.4 mg/ml lipida i izborno takođe uključujući dodatak seruma; • c. rast kulture ćelija u bogatom medijumu dopunjenom sa lipidom; • d. izborna zamena medijuma iz koraka c. sa svežim medijumom koji ne sadrži dodatak lipida posle oko 24-72 časa rasta.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što su ćelije korisne za razmnožavanje virusa.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je dodatak lipida lipid bogat u holesterolu iz adultnog goveđeg seruma, EX-CYTE lipid I i veoma nizak endotoksin (VLE) lipid.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je dopuna lipida sojin lipid.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 1, 2 ili 4, naznačen time što je bogati medijum SFRE-199-2, izborno dopunjen sa fetusnim telećim serumom, dopuna lipida je obezbeđena u između oko 0.02 mg/ml i 0.4 mg/ml i ćelije su MRC-5, WI-38 ili Vero ćelije.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 1, 2, 3 ili 4, naznačen time što su ćelije MRC-5, WI-38 ili Vero ćelije.

7. Kompozicija naznačena time što je korisna za rastuće ćelije u monosloju kulture koja sadrži SFRE-199-2 medijum dopunjen sa 0.02-0.4 mg/ml lipida.

8. Kompozicija prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što je dopuna lipida lipid bogat u holestrolu iz adultnog goveđeg seruma, EX-CYTE lipid I ili veoma nizak endotoksin (VLE) lipid.

9. Kompozicija prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što je dopuna lipida sojin lipid.