ES2317869T3 - Procedimiento de cultivo de celulas en una monocapa. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para cultivar células en monocapa que comprende: a. sembrar un recipiente de cultivo con un material de células en un medio mínimo o rico y permitir las células implantarse durante 24-72 horas; b. separar el medio del cultivo de la etapa a y sustituirlo con medio rico nuevo, suplementado con 0,02-0,4 mg/ml de lípidos y que incluye también opcionalmente un suplemento de suero; c. hacer crecer el cultivo de células en medio rico suplementado con lípido; d. sustituir opcionalmente el medio de la etapa c con medio nuevo que no contiene suplemento de lípido, después de 24-72 horas de crecimiento.
Description
Procedimiento de cultivo de células en una
monocapa.
El virus varicella zoster (VZV) causa varicela y
zoster (culebrilla). La viruela es una enfermedad altamente
contagiosa que se presenta en personas sin inmunidad a VZV. Más del
90% de la población está expuesta durante las primeras dos décadas
de vida. La enfermedad es una amenaza grave para las personas
inmunodeprimidas y los adultos.
En muchos casos, el VZV se hace latente en
células de ganglios de raíces dorsales. La culebrilla, un estado
crónico doloroso, tiene lugar cuando se reactiva el VZV desde el
estado latente.
La prevención de la varicela por vacunación es
un objeto deseable, y se prevé la institución de vacunación
universal de la infancia con una vacuna de varicella atenuada. La
técnica anterior ha informado de la propagación de VZV en diversos
sistemas de cultivo de células y el uso como vacuna de VZV libre de
células, atenuado. La Patente de los EE.UU. 3.985.615 describe la
producción en células embrionarias primarias de cobaya de la cepa
Oka atenuada de VZV, adecuada para uso como vacuna. La Patente de
los EE.UU. 4.008.317 describe el cultivo de un mutante de VZV
sensible a la temperatura en células WI-38 para uso
como estabilizante de vacuna. También se conocen en la técnica
composiciones útiles para el mantenimiento de VZV viable, tales como
SPGA.
La principal limitación a la producción
comercial de una vacuna de VZV es el rendimiento de VZV libre de
células de sistemas de cultivo de células conocidos en la técnica.
Los rendimientos de VZV libre de células se mejoran en un factor de
5-20 veces por aplicación del nuevo procedimiento de
esta invención.
Así, la presente invención es un procedimiento
para la producción de una vacuna de VZV libre de células, atenuada,
viva con alto rendimiento.
Los procedimientos de cultivo de células en
monocapas conocidos en la técnica producen típicamente alrededor de
80.000 a 160.000 células/cm^{2} [Mann, Dev. Biol. Stand. 37,
149-152 (1977); Wood y Minor, Biologicals 18,
143-146 (1990)]. El uso de cultivos de células en
monocapas para producción de antígenos víricos se ha impedido por
la densidad restringida a la que podrían crecer estos cultivos en
monocapas.
Los intentos por aumentar las densidades de
cultivos de células en el pasado han vuelto a recipientes de cultivo
de perfusión especializados para aumentar las densidades de
saturación hasta aproximadamente 1 x 10^{6} células por cm^{2}
[Mann, Dev. Biol. Stand. 37, 149-152 (1977)]. La
presente invención ofrece un medio único para aumentar los
rendimientos de células usando sistemas de cultivo de células
existentes.
El documento
FR-A-2 327 793 describe un
procedimiento para cultivar células amnióticas en una monocapa en
el que se usa medio EM suplementado con suero.
Esta invención proporciona un procedimiento por
el que pueden hacerse crecer células agregadas hasta densidades
mucho más altas de lo que ha sido posible hasta ahora, permitiendo
así mayores rendimientos de virus cultivados en monocapas de
células para producción de vacuna.
Esta invención se refiere a un nuevo
procedimiento para cultivo de células en monocapa y a una nueva
composición de uso en el procedimiento. El procedimiento requiere
el uso de un medio de cultivo rico, en oposición a un medio mínimo,
y el suplemento del medio rico con una concentración de lípido
optimizada. Según el procedimiento de esta invención, con el uso de
un nuevo medio de crecimiento que comprende medio
SRFE-199-2 suplementado con
0,02-0,4 g/ml de lípido de haba de soja, son
alcanzables aumentos sustanciales de la densidad de cultivo de
células en monocapa. La densidad de células en monocapa aumentada
conseguida así es útil para una producción aumentada de antígenos
víricos para fabricación de vacuna anti-vírica.
Según se aplica a la producción de una vacuna
particular, se prevé un procedimiento para producir grandes
cantidades de una vacuna de VZV libre de células atenuada, viva,
útil para evitar viruela, que comprende propagar óptimamente VZV en
cultivo de células, y cosechar el virus en condiciones que maximicen
el rendimiento y la estabilidad de VZV. Las etapas del
procedimiento optimizado comprenden:
Fig. 1. Rendimientos en UFP de VZV en medios
suplementados con sacarosa.
Fig. 2. Rendimientos de antígeno de VZV libre de
células.
Fig. 3. Estabilidad de VZV en estabilizante SPGA
a -20ºC o 4ºC.
Fig. 4. Rendimientos en UFP de VZV conseguidos
usando diferentes medios de cultivo.
Fig. 5. Efecto de la MDI asociada con células
entrantes en rendimientos de VZV libre de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención se refiere a un procedimiento
para hacer crecer células en cultivo monocapa. Este objeto se
consigue proporcionando un medio de crecimiento enriquecido,
suplementado con un lípido, en concentraciones optimizadas en el
procedimiento reivindicado. Haciendo crecer cultivos monocapa según
esta invención en la nueva composición de
medio-lípido de esta invención, se permiten
rendimientos sustancialmente aumentados de unidades de formación de
placas (UFPs) o producción de antígenos víricos. Así, las vacunas
del virus de la hepatitis A, el virus varicella zoster, de la
rubéola, rotavirus, sarampión, poliomielitis, paperas y otras
víricas se benefician por aplicación del procedimiento de cultivo de
células de esta invención.
Un medio enriquecido preferido para uso en este
procedimiento es SRFE-199-2
(disponible comercialmente de SIGMA Chemical Co., St. Louis, MO,
S2138 o de Serva Fine Chemicals, Heidelberg, Alemania 47523): Este
medio se describió por Weiss et al. [In Vitro
16(7), 616-628 (1980)].
Puede usarse cualquiera de un cierto número de
suplementos de lípidos conocidos para aprovecharse en esta
invención. Por ejemplo, se han encontrado beneficiosos como
suplementos de medio ricos lípidos ricos en colesterol de suero de
bovino adulto (SIGMA CHEMICAL CO. nº de catálogo
L-4646), lípido EX-VYTE I o lípido
con contenido muy bajo de endotoxinas (VLE) (MILES Inc., nº de
catálogo 82-004-7 a 8 y
82-019-1). Un aditivo lípido
preferido es el extracto de lípido de haba de soja disponible
comercialmente de Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis
IN, nº de catálogo 1074482. Este material, o un material similar, se
describe por Iscove y Melchers [J. al. Exp. Medicine, 147,
923-933, (1979)] como sustituto de suero en cultivo
de linfocitos B. No se hace aquí ninguna sugerencia, ni hay ninguna
sugerencia en la descripción de productos del catálogo de Boehringer
Mannheim, de que el suplemento de lípido de haba de soja sería útil
para suplemento de medio rico. Según estas fuentes, el lípido se
pretende para uso como sustituto del suero en cultivos de medio
mínimo. Según se usa en esta invención, el lípido es un suplemento
de medio rico. Además, según las fuentes publicadas de la técnica
anterior, el lípido se usa en una concentración de aproximadamente
10-100 \mug/ml. Según la presente invención, el
lípido se usa en una concentración que está entre 20 y 400
\mug/ml. Además, según se usa en esta invención, el suplemento de
lípido puede usarse además de, antes que en lugar de, el suplemento
de suero.
En el procedimiento de esta invención, se
siembran en un recipiente de cultivo células MRC-5,
células WI-38, células Vero u otro tipo de células
útil para propagación de virus. La fase de plantación de células
inicial se realiza en un medio mínimo conocido en la técnica tal
como EMEM o EBME, o en un medio rico tal como medio
SRFE-199-2 (en adelante
"SRFE-2") sin suplemento de lípido. Pueden
proporcionarse también ventajosamente aproximadamente 10% de suero
de becerro fetal (FCS), un antibiótico tal como neomicina
(aproximadamente 50 \mug/ml es adecuado) y
L-glutamina (aproximadamente 2 mM). Las células se
hacen crecer a una temperatura permisiva para la célula y el virus,
usualmente 24-37ºC aproximadamente, y
preferiblemente alrededor de 35ºC, dependiendo del virus a fabricar,
durante varios días.
Después de que las células se han agregado
claramente y se desarrollan bien en cultivo monocapa, se separa el
medio mínimo o el medio enriquecido, y se sustituye con medio rico
nuevo, suplementado con dicha concentración de lípido.
Después de un período de crecimiento adicional,
puede separarse de nuevo el medio y sustituirse con medio rico
nuevo, sin suplemento de lípido. Se ha encontrado que el suministro
de lípido después de que las células se han aproximado o alcanzado
confluencia es contraproducente, disminuyendo los rendimientos
máximos de células.
Cuando han de infectarse las células en monocapa
cultivadas con un inóculo vírico, se elimina el suplemento de
lípido y se introduce el material de virus en una parida nueva de
medio rico. La ausencia de lípido en esta realimentación permite un
crecimiento de células extenso sin el problema de disminución de
células inducida por lípido mencionado antes.
Después del procedimiento descrito antes, se
consiguen aumentos sustanciales del rendimiento de células y virus.
Así, para el virus varicella desarrollado en células
MRC-5, se consigue un aumento sustancial de
rendimiento en UFP de VZV, en comparación a cuando se desarrollan
células MRC-5 en medio mínimo o medio
SRFE-2 solo. De igual modo, las células
WI-38, que son útiles para el crecimiento de
varicella o la producción de virus de rubéola, crecen hasta
densidades sustancialmente mayores cuando se cultivan según este
nuevo procedimiento.
Tal como se aplica a la producción de una vacuna
particular, el procedimiento comprende propagar VZV en cultivo de
células, y cosechar el VZV resultante en condiciones que optimicen
el rendimiento y la estabilidad del virus. Las ventajas reveladas
para la producción de VZV serán aplicables a la producción de otros
virus envueltos, incluyendo virus herpes distintos de VZV,
sarampión, paperas o rubéola.
\newpage
El objeto final es proporcionar un procedimiento
que permita una producción eficaz de VZV para uso como vacuna. El
éxito del procedimiento se mide por el rendimiento de VZV libre de
células conseguido finalmente por optimización de cada etapa del
procedimiento. El rendimiento se determina por el título de
infectividad de la preparación de VZV libre de células final. Los
títulos de infectividad de preparaciones de virus varivella zoster
(VZV) se obtuvieron por un procedimiento de superposición de
agarosa o superposición de líquido descrito por Krah et al.
(J. Virol. Methods, 1990, 27:319-326). Brevemente,
este método implica cultivar células MRC-5, que son
susceptibles a infección con VZV, hasta un estado de replicación
activo, esto es, hasta un punto en el que las células son
aproximadamente 50-80% confluentes. Se superpone
después el virus sobre la monocapa de células en un volumen mínimo,
se permite que se agregue a las células y se añade después medio de
crecimiento adicional. Después de varios días de crecimiento, se
exponen las células a una coloración de proteína, y se cuentan
áreas claras y placas. Así, para un volumen conocido de inóculo
vírico, el número de unidades de formación de placas (UFP) por
mililitro representa una buena medida del rendimiento de virus.
Multiplicadas por el volumen total de virus libre de células
obtenido de cualquier preparación vírica dada, puede calcularse el
número total de UFP.
Debido a variabilidad en el propio ensayo, el
aumento de UFP obtenido por cualquier optimización del procedimiento
particular se presenta como relación con una etapa del
procedimiento algo menos optimizada. Esta información de aumentos
en veces del rendimiento vírico anula por tanto cualquier
variabilidad del propio ensayo de UFP. Finalmente, las etapas del
procedimiento descritas aquí producen acumulativamente un aumento de
aproximadamente 16-20 veces de los rendimientos de
VZV conseguidos usando procedimientos conocidos en la técnica. Este
aumento de veces no se presenta en la bibliografía y representa una
contribución significativa a la técnica de producción de vacunas de
VZV.
Puesto que el ensayo de placas de VZV exige
mucho tiempo, no es particularmente susceptible a control durante
la fabricación. Un ELISA de antígenos de VZV rápido permite la
medición de cantidades de antígenos de VZV para permitir la
comprobación del crecimiento de virus durante la fabricación de
vacuna de varicella viva. Adicionalmente, este ensayo puede usarse
para estimar las cantidades de antígenos de VZV en volúmenes de
vacuna sonicada clarificada, y potencialmente para medir antígeno
en viales de vacuna liofilizada llenos. Brevemente, este ensayo se
realiza por incubación de antígeno de VZV de muestras de ensayo con
suero anti-VZV en solución. Se deja al anticuerpo
libre restante unirse a antígeno de VZV inmovilizado en placas de
microtitulación ELISA. La cantidad de anticuerpo capaz de unirse a
las placas es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno
en la muestra de ensayo. La unión de anticuerpo a las placas se
cuantifica por reacción con un anticuerpo
anti-humano enlazado a enzima y un sustrato
apropiado para proporcionar un producto coloreado que se cuantifica
espectrofotométricamente.
El ELISA de antígeno de VZV y los ensayos de
placas de VZV deben proporcionar generalmente datos correlativos,
pero debe tenerse en cuenta que el ensayo de antígeno de VZV detecta
VZV no viable así como viable. Puesto que no se ha mostrado que la
respuesta inmune generada por VZV muerto sea tan eficaz como la
respuesta de virus atenuado vivo, el ensayo de placas es el ensayo
crítico para determinar la dosis de inóculo vírico para vacunas de
VZV. Sin embargo, el ensayo de antígeno es valioso porque
proporciona una medida de la carga de antígeno total administrada a
un receptor de vacuna de VZV, es más rápido que el ensayo de UFP y
permite por tanto la comprobación durante la fabricación de la
producción de VZV, y se correlaciona al menos hasta el punto de la
producción de UFP de VZV de pico, que permite estimar el tiempo
óptimo para cosechar.
El éxito del procedimiento es aumentado por
incrementos mediante cada uno de los siguientes parámetros
críticos:
\vskip1.000000\baselineskip
Puede usarse cualquiera de un cierto número de
diferentes sistemas de cultivo de células conocidos en la técnica
por ser útiles para producción de VZV. Así, se han usado con este
fin células Vero, células WI-38, células
MRC-5 y un cierto número de otros tipos de células.
Se han usado consecuentemente células MRC-5 que son
aceptables para producción de vacuna destinada a uso humano. No es
concebible, sin embargo, que puedan aumentarse los rendimientos de
VZV libre de células más allá de la extensión presentada aquí si se
utilizara un linaje celular particularmente productivo distinto de
MRC-5. En la extensión en que tal linaje celular
fuera adaptable al uso en el procedimiento actual, esta invención
abarca la aplicación de este procedimiento a tales células.
Una comparación de rendimientos de virus vivo
libre de células en monocapas de células MRC-5
subconfluentes o confluentes incubadas a 35ºC bajo una atmósfera de
5% de CO_{2} en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) con 2% o
10% de suero de becerro fetal (FCS) revela el efecto de la
confluencia de células en el rendimiento de unidades de formación
de placas (UFP) de VZV libre de células (Véase Ejemplo 2, Tabla
I).
El uso de monocapas de células confluentes da
lugar a un aumento de aproximadamente 2-3 veces en
las UFP libres de células/ml sobre el rendimiento conseguido por
infección de monocapas subconfluentes si los cultivos subconfluentes
se proliferan activamente (10% de suero) o no (2% de suero). Por
tanto, parecen ser necesarias células confluentes pero no que
proliferen activamente para rendimientos de VZV aumentados, en el
procedimiento de producción de vacuna.
El porcentaje de suero de becerro fetal presente
durante el crecimiento vírico no parece tener un efecto principal
en los rendimientos en ufp libres de células. Así, típicamente,
durante la fase de crecimiento de células, se proporciona FCS en
aproximadamente el 10%, mientras que durante las fases de
crecimiento vírico del procedimiento, se proporciona FCS en
aproximadamente el 2%, tanto si se usa un medio mínimo, tal como
EMEM o EBME, como un medio rico, tal como SRFE-2,
para el crecimiento de células y el cultivo del virus.
Además del FCS y el medio, se añaden típicamente
al cultivo de células y al medio de crecimiento vírico un
antibiótico tal como 50 \mug/ml de neomicina y glutamina
(aproximadamente 2 mM).
\vskip1.000000\baselineskip
Se siembran contenedores de cultivo de células
(matraces, botellas de cultivo rotatorias o equivalentes funcionales
de estos recipientes de cultivo) con MRC-5 u otras
células diploides de manera que la concentración inicial de células
esté entre aproximadamente 10.000 y 40.000 células/cm^{2}. Se
alimentan las células con medio de crecimiento suplementado con
aproximadamente 10% de suero de becerro fetal, gasificado con 5% de
CO_{2}, y se incuban a aproximadamente 30-37ºC, y
preferiblemente 35ºC aproximadamente.
Las células pueden plantarse en un volumen tan
pequeño como sea necesario para cubrir completamente células
desarrolladas en cultivo estacionario. Una relación practicable de
volumen a superficie específica es aproximadamente 0,5 ml de medio
de cultivo pos cm^{2} de superficie de crecimiento. Cuando se
hacen crecer células en botellas rotatorias, puede ser adecuado tan
poco como 125 ml por 850 cm^{2}, pero es preferible
aproximadamente 425 ml/cm^{2}.
Pueden usarse medios mínimos disponibles
comercialmente conocidos en la técnica para cultivo de células,
tales como medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) o medio basal de
Eagle suplementado con sales de Earle (EBME), con aproximadamente
10% de FCS para la fase de plantación de células. Alternativamente,
puede usarse un medio más rico para aprovechar en esta fase. El
medio SRFE [Weiss et al., In Vitro 16(7),
616-628 (1980)], disponible de SIGMA, es un medio
rico que puede usarse para aprovechar en esta fase, pero un medio
rico no es crítico en esta fase del procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Es crítico proporcionar nutrición suficiente en
esta fase del procedimiento para asegurar el crecimiento de células
hasta fuerte confluencia. Esto puede conseguirse proporcionando un
gran volumen de medio mínimo o un volumen menor de medio rico. Las
células se desarrollan a aproximadamente 30-37ºC y
preferiblemente a alrededor de 32-35ºC.
Después de permitir un período adecuado para la
agregación de células y el crecimiento de células, las células
pueden realimentarse separando y sustituyendo el medio y continuando
después la incubación. El medio puede separarse por aspiración o
decantación o cualquier otro medio siempre que no se comprometa la
integridad de la monocapa de células. Para células
MRC-5 plantadas como se ha descrito antes, la
realimentación puede emprenderse aproximadamente 72 horas después
de la introducción de las células en el recipiente de cultivo.
El volumen de medio de cultivo sustituido puede
ser el mismo que el volumen usado para la fase de plantación de
células. Preferiblemente, no obstante, se proporciona un volumen
mayor que el usado durante la plantación durante la fase de
crecimiento de células. Esto es particularmente importante cuando se
están cultivando células en un medio mínimo tal como EMEM o EBME
más FCS. Un gran volumen de cultivo es un modo de asegurar que las
células reciben nutrición adecuada.
El requisito de gran volumen puede reducirse
cuando el medio suministrado para la fase de crecimiento es un
medio rico. Un medio particularmente preferido para este fin es
SRFE-2 (SIGMA). El uso de un medio rico en esta
fase, en lugar de un medio mínimo, aumenta en gran medida la
densidad de la monocapa de células en confluencia. La densidad de
células aumentada deja para más tarde aumentar el rendimiento de VZV
obtenible a partir de un cultivo de células infectadas en medio
enriquecido. Así, el uso de medio enriquecido durante la fase de
crecimiento de células ha dado lugar a un aumento de aproximadamente
2-4 veces en el rendimiento de VZV final sobre el
alcanzado cuando se desarrollan células en medio mínimo en esta
fase.
En una realización preferida, se suplementa
SRFE-2 con lípido. Es útil cualquiera de un cierto
número de suplementos de lípido. Así, se ha encontrado que lípidos
ricos en colesterol de suero de bovino adulto (SIGMA CHEMICAL CO.),
lípido EXCITE I o lípido con contenido muy bajo de endotoxinas (VLE)
(MILES) son beneficiosos como suplementos de medio rico o medio
mínimo. Lípido de haba de soja disponible comercialmente [Boehringer
Mannheim, véase también Iscove et al., J. Exp. Med. 147,
923-933 (1978)] ha probado ser un suplemento muy
beneficioso cuando se proporciona en aproximadamente 0,2 mg/ml. Se
han conseguido densidades de células que se acercan a
aproximadamente 500.000/cm^{2} usando SRFE-2 más
lípido y FCS. Se consiguen rendimientos de VZV aumentados cuando se
proporciona lípido independientemente de si el crecimiento de
células es en medio mínimo o medio enriquecido. Se suministra
material disponible comercialmente como material de 20 mg/ml de
lípido, 100 mg/ml de albúmina de suero de bovino. Este material se
usa convenientemente en una dilución final de 1:100. El rendimiento
de VZV final se aumentó en aproximadamente nueve veces sobre el
rendimiento de VZV a partir de EMEM solo, y en aproximadamente 3,3
veces sobre medio SRFE-2 solo cuando se suplementó
SRFE-2 con aproximadamente 0,2 mg/ml de lípido de
haba de soja durante la fase de crecimiento final.
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes inventores han descubierto que
puede aumentarse adicionalmente el rendimiento final de VZV cuando
se exponen células cultivadas a un disacárido no tóxico, no
metabolizable, con una concentración óptima, antes de la infección
con VZV. Una realización con mucho éxito proporciona sacarosa
aproximadamente 20-60 mM alrededor de 72 horas
después de introducir las células en el recipiente de cultivo, y
preferiblemente alrededor de 24 a 96 horas antes de la infección
del cultivo con VZV. En términos prácticos, el suministro de
sacarosa aproximadamente 50 mM en el medio de realimentación de la
etapa 2 anterior cumple estos criterios y reduce el número de
manipulaciones estériles requeridas haciendo esto eficazmente y las
etapas previas concurrentes.
Otros disacáridos, incluyendo lactosa, celobiosa
y maltosa, aumentan también el rendimiento de VZV final, pero se
prefiere sacarosa. Los monosacáridos ensayados, tales como fructosa
y ribosa, no aumentaron el rendimiento de VZV (la ribosa puede ser
incluso tóxica). Parece que los disacáridos se concentran en los
lisosomas de las células en crecimiento, hinchándolas hasta formar
vacuolas [DeCourcy y Storrie, Exp. Cell Res. 192,
52-60 (1991)]. Este efecto de disacáridos en el
rendimiento de VZV puede ser debido a atenuación del daño lisosómico
de VZV. Además de los disacáridos, puede esperarse que los tri y
tetrasacáridos tengan efectos beneficiosos, como Cohn y Ehrenreich
[J. Exp. Med. 129, 201-222 (1969] señalaron
vacuolización idéntica cuando se alimentaron estos azúcares
superiores o sacarosa a macrófagos, en la medida en que los azúcares
no eran metabolizados por las células.
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes inventores han encontrado por
experimentos repetidos que, como media, las células dejadas quietas
durante 48 horas después de hacerse confluentes produjeron sólo
aproximadamente el 50% de las UFP de VZV/ml en comparación con el
rendimiento cuando se infectan con ZVZ células confluentes
recientemente. Así, es importante temporizar la introducción del
inóculo de VZV para que coincida lo más estrechamente posible con la
confluencia. Desgraciadamente, la confluencia es un parámetro que
varía según el tipo de medio, el tipo de células cultivado y otras
condiciones de cultivo usadas. Para células MRC-5
plantadas según la etapa (a)(1) anterior, las células se infectan
típicamente en el punto de alcance de la confluencia.
El virus varicella zoster (VZV) es
preferiblemente la cepa Oka de virus atenuado descrita en la Patente
de los EE.UU. 3.985.615 y que está en depósito en la ATCC. Este
virus está adaptado a crecimiento en cultivos de células en
embriones de cobaya y en cultivos de células de fibroblastos de
pulmón diploides humanos (por ejemplo, células
MRC-5).
Puede prepararse un material de células
infectadas con varicella viables infecciosas infectando células
MRC-5 con una MDI de aproximadamente 1:125,
manteniendo las células infectadas para permitir replicación vírica,
tripsinizando las células y usando inmediatamente las células
liberadas como una semilla de trabajo o guardando para uso
posterior y cuantificación de UFP congelando lentamente con un
crioprotector tal como tal como DMSO o glicerol en aproximadamente
10^{7} células/ml. El material de células infectadas con VZV
congelado puede descongelarse y añadirse a un cultivo de células
confluentes para iniciar la infección con VZV.
Alternativamente, pueden liofilizarse células
infectadas con VZV según el procedimiento descrito por Hondo et
al. [Archiv fur die gesamte Virusforschung 40,
397-399 (1973)] que permite el almacenamiento a 4ºC
a largo plazo del inóculo liofilizado. También es posible usar como
inóculo VZV libre de células, pero debido a pérdidas en el
rendimiento de virus por cosecha, se prefiere el uso de un inóculo
unido a células.
Otra posibilidad para producir el material de
semillas infectadas con virus es iniciar el crecimiento de células
para producción de semillas de virus antes de producir la plantación
de células. En el punto de infección de células de semillas con
células infectadas con VZV, puede iniciarse la plantación de células
de producción para conseguir confluencia al mismo tiempo que la
semilla de virus alcanza títulos de VZV de pico. Menos óptimamente,
pero más convenientemente, las células de semilla y las células en
grueso pueden plantarse todas al mismo tiempo, en un pequeño
volumen de medio de cultivo (aproximadamente 125 ml por 850 cm^{2}
de botella rotatoria). Después de aproximadamente
dos-tres días de crecimiento, se aumenta el volumen
de las botellas para producción de semillas de VZV hasta
aproximadamente 425 ml, o se realimentan con medio rico, para
permitir crecimiento hasta confluencia. Las células de producción
se dejan, relativamente latentes, en un pequeño volumen de medio
mínimo (incluyendo aproximadamente 10% de FCS) hasta aproximadamente
dos días antes de infectar las células de semilla de trabajo con
células infectadas con VZV. En este punto, se aumenta el volumen de
células de producción hasta aproximadamente 425 ml, o se realimenta
con medio rico, tal como SRFE-2 más una cantidad
óptima de lípido de haba de soja y suero de becerro fetal. Las
células de producción se hacen crecer después hasta confluencia
fuerte. Dos días después de realimentar las células de producción,
las células de semilla de trabajo, ahora en confluencia, se
infectan con células infectadas con VZV con una MDI de 1:125 o
superior, y se permite que continúe la replicación de VZV durante
aproximadamente dos a tres días. En el momento de alcanzar la
producción de VZV de pico, en los cultivos de semillas, las células
de producción habrán alcanzado confluencia. Se cosechan después las
células de semillas y se añaden a las células de producción.
Cualquiera que sea el tiempo de producción de
semillas, en un momento apropiado tras la infección con VZV, se
aspira el medio del cultivo de semillas infectadas con VZV, se
cosecha la semilla infectada con VZV por tripsinización
(aproximadamente 0,25% de tripsina) u otro medio no disruptivo, y se
infectan los cultivos de células de producción con una MDI
conocida.
Schmidt, N.S. y Lennette, E.H. [Infection and
Immunity 14, 709-715 (1976)] indicaron la
importancia de alta MDI para alto rendimiento de VZV, pero no
hicieron una comparación estricta con infección con baja MDI. La
presente invención hace precisamente esta comparación.
Se infectan células con VZV separando el medio
de crecimiento de los cultivos de células y sustituyéndolo con
medio nuevo que contiene una cantidad conocida de células infectadas
con VZV preparado como se ha descrito antes. El material de virus
se titula preferiblemente en unidades de formación de placas (UFPs),
y se cuentan las células receptoras para permitir la cuantificación
de la multiplicidad de infección (MDI). Las MDIs se expresan como
la relación de células infectadas con VZV en el inóculo al número de
células de monocapa no infectadas en cultivo. Así, una MDI de 1:10
es alta, mientras que 1:625 es baja. Es deseable una MDI alta,
pero, en términos prácticos, pueden conseguirse buenos rendimientos
de VZV con una MDI tan baja como 1:125.
MDIs entre 1:7 y 1:625 producen entre
aproximadamente 500.000 UFP/ml, en la MDI alta, hasta
aproximadamente 100.000 UFP/ml en el extremo bajo de MDI (véase
Tabla 3 del Ejemplo 5). Cuanto mayor es la MDI, es menor el tiempo
de incubación requerido para alcanzar las UFP de pico y es mayor el
rendimiento. Así, puede conseguirse un intervalo de aproximadamente
5 veces en las UFP finales dependiendo de la MDI y del tiempo de
cosecha.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo de las células infectadas con VZV se
continúa durante aproximadamente 22 a 96 horas tras la infección.
Es crítico mantener una nutrición adecuada en esta fase del
crecimiento del virus. Es deseable proporcionar volúmenes de
cultivo altos de un medio mínimo tal como EMEM más aproximadamente
2-10% de FCS, o un volumen menor de medio rico. Más
preferiblemente, se proporciona SRFE-2 más
2-10% de FCS, sin adición de suplemento de lípido.
Se ha señalado que el lípido reduce el rendimiento de VZV cuando se
incluye en esta fase.
Durante las 22-96 horas de
cultivo post-infección, VZV se replica en las
células que han sido infectadas y se extiende para infectar células
adyacentes. Sin embargo, las células infectadas antiguas no darán
UFPs de células libres recuperables. La curva de crecimiento de VZV
y el descenso subsiguiente pueden ser bastante fuertes. Por tanto,
un tiempo correcto del punto de cosecha es un parámetro crítico para
maximizar el rendimiento de VZV infeccioso, y puede reproducirse
con precisión por mantenimiento de un control estrecho de la MDI de
entrada, la nutrición y el tiempo de incubación de período de
producción a período de producción. Además, puede emplearse el
ELISA rápido de antígeno de VZV para optimizar el tiempo de cosecha
puesto que la producción de VZV infeccioso está correlacionada con
la producción de antígeno de VZV, al menos hasta el punto en que
comienza a tener lugar muerte del virus (véanse Figuras 5 y 6).
Para células MRC-5 infectadas
con VZV cosechadas aproximadamente 72 horas
post-infección, en las que se optimizó cada una de
las etapas anteriores (es decir, crecimiento en medio rico y
exposición pre-infección de las células a sacarosa
50 mM durante 72 horas), el rendimiento final de VZV libre de
células aumentó en aproximadamente dieciséis veces sobre el
rendimiento conseguido en medio mínimo y cosecha vírica a las 48
horas, y en un margen aún mayor que cuando la cosecha es a las 96
horas (véase Ejemplo 8, Figura 1). El rendimiento de VZV en las
mismas condiciones optimizadas fue sólo aproximadamente cuatro veces
sobre el rendimiento de medio mínimo cuando se cosechó el virus 48
horas post-infección, pero estaba todavía mejorado
en gran medida sobre el rendimiento del medio mínimo a las 96
horas. Así, el rendimiento del virus es mucho mayor y se reduce
fuertemente la muerte del virus en medio rico, y no hay tal caída
brusca del rendimiento vírico a lo largo del tiempo. La MDI se hace
también menos crítica en medio rico.
\vskip1.000000\baselineskip
Para separar suero, lípido y residuos celulares
del cultivo, se lava el cultivo monocapa con un tampón fisiológico
que no lise las células. Solución salina tamponada con fosfato (PBS)
es totalmente aceptable con este fin. Las células pueden lavarse
varias veces y la solución de lavado decantarse, aspirarse o
separarse por cualquier otro medio, en tanto no se comprometa la
integridad de la monocapa.
Si las células se liberan químicamente desde el
recipiente de crecimiento, deben concentrarse por centrifugación, y
sustituirse el tampón fisiológico con una solución
estabilizante.
Se ha encontrado que proporcionar cloruro
amónico o cloroquina antes de la cosecha de células mejora los
rendimientos de VZV finales. Kielian et al. [EMBO J. 5,
3103-3109 (1986)] usaban cloruro amónico para
controlar el pH interno de endosomas celulares mientras que virus
infectantes gastaban aparentemente alguna porción de su vida
intracelular. Posiblemente el mecanismo de rendimiento de VZV
aumentado por exposición de células a agentes lisosomotrópicos está
relacionado con la inducción de un entorno endosómico menos severo.
La carga de células pre-infección con disacáridos
no metabolizables, no tóxicos, tales como sacarosa, y la exposición
de células a cloruro amónico o cloroquina, pueden actuar por tanto
por mecanismos similares. En cualquier caso, la observación ha
confirmado empíricamente que se aumentan los rendimientos de VZV
finales cuando se proporciona cloruro amónico con una concentración
final entre 1 y 100 mM, y más preferiblemente en el intervalo
20-50 mM, y se proporciona preferiblemente a
aproximadamente 4ºC durante aproximadamente 25-50
minutos, antes de la disrupción de células. Un segundo agente
lisosomotrópico, cloroquina, en una concentración de aproximadamente
230 \muM, aumenta igualmente la recuperación de ufp/ml de
VZV.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez que se han lavado las células infectadas
con VZV, pueden cosecharse por raspadura, si el recipiente de
crecimiento permite esto, o desprendiendo las células químicamente.
La liberación enzimática de las células es menos deseable porque la
enzima residual puede disminuir el rendimiento vírico una vez
producida la disrupción de las células. Como se ha indicado antes,
si se liberan las células en solución salina fisiológica, las
células se concentran por centrifugación y la solución salina
fisiológica se sustituye con un volumen mínimo de solución
estabilizante de VZV. Un buen volumen a superficie específica de
crecimiento de células es aproximadamente 40 ml de estabilizante
por
850 cm^{2}.
850 cm^{2}.
Los estabilizantes víricos son conocidos en la
técnica. Así, se sugiere en la Patente de los EE.UU. 3.985.615 la
estabilización con 5% de sacarosa en solución salina tamponada con
fosfato, aunque otros informes recomiendan más estabilizantes
complejos tales como SPGA.
Después de resuspenderse las células infectadas
con VZV en una solución estabilizante, pueden someterse las células
a disrupción inmediatamente o, en caso de que se preparen grandes
cantidades de VZV, congelarse a -70ºC para tratamiento posterior.
El rendimiento de VZV por cm^{2} de células desarrolladas será
ligeramente mayor si se someten las células a disrupción
inmediatamente, pero la etapa de congelación no incurre
habitualmente en una pérdida de más del 10% del rendimiento
obtenido por tratamiento inmediato.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha descrito antes, preferiblemente el
medio de cultivo se separa de las células antes de la disrupción y
se sustituye con un volumen mínimo de estabilizante de VZV en el que
se raspan las células o liberan de otro modo. La suspensión de
células se enfría a 0-4ºC, y se someten después las
células a disrupción por un medio apropiado, tal como sonicación,
homogeneización DOUNCE, otros tipos de cizallamiento que sean más
escalables que DOUNCE, o una combinación de estas técnicas.
Los presentes inventores han confirmado que la
sonicación sola no proporciona la mejor recuperación de VZV libre
de células. De hecho, cuando se usa homogeneización DOUNCE como
etapa de disrupción inicial, seguida por centrifugación, retención
del sobrenadante como sobrenadante I, seguida por sonicación del
glóbulo y centrifugación para obtener sobrenadante II, el
rendimiento de VZV de la disrupción aumenta en gran medida. El
rendimiento combinado de sobrenadantes I y II ha sido tan alto como
cuatro veces el rendimiento cuando se usa sonicación sola como
técnica de disrupción.
Tras la disrupción celular, la separación de
residuos celulares se consigue por centrifugación, filtración o
cualquier otro medio conocido en la técnica para separar residuos de
células dejando VZV indemne. La preparación de virus libre de
células se diluye después con solución estabilizante y se subdivide
para su uso como vacuna. Preferiblemente, para almacenamiento a
largo plazo, el VZV se liofiliza por uno de los procedimientos
conocidos en la
técnica.
técnica.
Para resumir, el rendimiento potencial
aproximado aumenta siguiendo las etapas optimizadas de este
procedimiento, en comparación con la producción de VZV por
crecimiento de células en medio mínimo, como se indica
seguidamente:
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha demostrado la utilidad de VZV libre de
células atenuado como vacuna para evitar varicela. Estudios clínicos
múltiples han probado concluyentemente esta utilidad, y tal prueba
es parte ahora de la técnica anterior[véase, por ejemplo,
Pediatrics 88(3), 604-607 (1991); Pediatrics
87, (5), 604-610 (1991)]. Así, la contribución
tremenda es que proporciona un procedimiento altamente eficaz para
producción con alto rendimiento de VZV atenuado vivo. El virus
preparado puede formularse como una vacuna según procedimientos
conocidos en la técnica, y se administra según regímenes bien
establecidos actualmente. Por ejemplo, el producto de VZV libre de
células atenuado vivo de esta invención diluirse en estabilizante,
llenarse con él botellas y liofilizarse en dosis unitarias tales
que por almacenamiento a aproximadamente 4ºC o inferior, estará
disponible en el momento de uso una dosis de aproximadamente 1000
UFP. La vacuna de VZV producida puede usarse en formulaciones de
dosis unitarias para inocular seres humanos a fin de inducir
respuestas inmunes protectoras contra la infección por cepas
virulentas de VZV. Preferiblemente, como mínimo, se administra
subcutánea o intramuscularmente una dosis de aproximadamente 2000
UFP/ml (1000 UFP/0,5 ml). Se han administrado y son aceptables dosis
tan altas como un total de 15.000 a 20.000 UFP.
Proporcionando un procedimiento optimizado para
la producción de un virus VZV atenuado, es posible aplicar lo que
se conoce en la técnica para formular una vacuna para reforzar
respuestas inmunes anti-VZV para evitar
varicela.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el
fin de ilustrar la presente invención y no deben interpretarse como
limitaciones de su alcance.
\vskip1.000000\baselineskip
Los títulos de infectividad de preparaciones de
virus varicella zoster (VZV) se estimaron usando el procedimiento
de superposición de agarosa o superposición de líquido descrito por
Krah et al. (J. Virol. Methods, 1990,
27:319-326). El ensayo se realiza como sigue:
Se siembran células MRC-5 en
placas de cultivo de tejidos de 60 mm, a razón de 6 x 10^{5}
células en volúmenes de 5 ml de BME (medio basal de Eagle con
solución de sales equilibradas de Hank) con 100 mg/l de galactosa,
50 \mug/ml de neomicina, L-glutamina 2 mM, y se
incuban a 35ºC en una atmósfera del 5% de CO_{2}. Después de
incubar durante 24-48 horas, las células alcanzan
50-80% de confluencia. El medio de crecimiento se
separa por aspiración y se infectan las células con 100 \mul de
solución de VZV diluido en un diluyente de virus apropiado, tal
como tampón SPGA, o medio de mantenimiento líquido (LMM). El tampón
SPGA contiene 7,5% (p/v) de sacarosa, fosfato potásico 11 mM, 0,1%
(p/v) de glutamato sódico y 1% de albúmina de suero humano. Se deja
agregarse el virus durante \geq 1 hora a 35ºC en una atmósfera del
5% de CO_{2}. Se superponen después los cultivos de células
infectadas con VZV con 5 ml de medio de superposición de agarosa
(AOM) o medio de mantenimiento líquido (LMM). El medio de
superposición de agarosa es una mezcla de dos soluciones, medio de
superposición líquido (LOM) y solución de agarosa. El LOM contiene
medio esencial mínimo con sales de Earle (MEM), 2% de suero de
becerro fetal inactivado con calor, 50 \mug/ml de sulfato de
neomicina y L-glutamina 2 mM. La solución de
agarosa se prepara calentando 4,5 g de agarosa de baja temperatura
de gelificación en 100 ml de MEM durante 15 min a 121ºC y dejando
que se enfríe la solución a 45ºC. El AOM se prepara mezclando un
volumen de solución de agarosa con 4 volúmenes de un concentrado
1,25 x de LOM a 45ºC. Las placas se enfrían a
23-25ºC para permitir que solidifique el AOM. Se
incuban los cultivos para permitir el desarrollo de placas. Después
de 6-7 días, se superponen las placas que recibieron
LOM con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se
bordean con una pipeta Pasteur de vidrio para soltar y separar la
agarosa. Se aspira medio de placas que recibieron LMM, y se
visualizan placas por coloración de células con una solución de 0,2%
(p/v) de azul Coomassie R-250 en
etanol-1% de ácido acético. Las cuentas de placas
son la media de 4-5 placas replicadas y se expresan
como unidades de formación de placas por ml (UFP/ml).
Debido a la variabilidad potencial en el ensayo,
los aumentos del rendimiento de VZV se indican con relación a
condiciones no optimizadas ensayadas de manera idéntica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pusieron en placa células
MRC-5 a razón de 4 x 10^{6} células/150 cm^{2} y
se dejaron crecer durante 3 días en sales de Earle suplementadas
con medio basal de Eagle (EBME) en presencia de 10% de suero de
becerro fetal (FCS). Al alcanzar una densidad de células
subconfluentes de aproximadamente 12 x 10^{6} células/150
cm^{2}, se realimentaron las células con EBME nuevo suplementado
con 2% de FCS o 10% de FCS. En este punto, se dejó a las células
subconfluentes crecer adicionalmente, en presencia o ausencia de
infección con VZV (MDI = 1:125) y se comprobó el aumento de
densidad de células y los rendimientos de virus después de 48 horas.
Se encontró que las células no infectadas en 2% de FCS aumentaban
de densidad en sólo el 33% mientras aumentaban en el 92% en 10% de
FCS. Las células en los cultivos infectados no aumentaban en número.
Como se muestra en la Tabla I, los rendimientos de virus de las
células subconfluentes no fueron afectados por la capacidad para
replicación de células en los cultivos, tanto si eran suplementados
mínimamente (2% de FCS) como máximamente (10% de FCS) con FCS.
Otros cultivos de células se desarrollaron 2
días adicionales en 10% de FCS hasta aproximadamente 20 x 10^{6}
células/matraz de 150 cm^{2} (una condición confluente), y se
realimentaron después con EBME nuevo suplementado con 2% de FCS o
10% de FCS y se infectaron con VZV (MDI 1:125) o se dejaron sin
infectar. El aumento de densidad de células y los rendimientos de
virus se comprobaron después de 48 horas. Se encontró que las
células no infectadas en 2% de FCS no habían aumentado de densidad,
mientras que las células en 10% de FCS habían aumentado en sólo
aproximadamente el 15%. Así, ninguna condición era capaz de mucha
replicación de células. Los rendimientos de virus en 2% de FCS o
10% de FCS fueron similares y aumentaron ambos en aproximadamente
tres veces sobre el rendimiento de células infectadas en
subconfluencia (véase tabla I). Así se establece el uso preferencial
de monocapas de células confluentes recientemente en oposición a
monocapas de células subconfluentes que se replican activamente
para rendimientos óptimos de VZV libre de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron botellas rotatorias (850 cm^{2})
con células MRC-5 con una concentración de
aproximadamente 26.500 células/cm^{2}. Todas las células se
desarrollaron en medio EBME que contenía 10% (v/v) de suero de
becerro fetal (FCS_{10}) en una atmósfera del 5% de CO_{2} a
35ºC. Los matraces se dividieron en dos grupos, en base al tiempo
de infección con VZV. Las células del Grupo I se hicieron crecer
durante 5 días, en cuyo momento las monocapas de células eran
confluentes. En ese momento, se separó el medio y las células se
infectaron con VZV asociado a células con una MDI de 1:125,
suspendido en EMEM + 2% de FCS. Se añadió medio adicional y se
incubaron las células durante otras 48 horas. Las células del Grupo
II se mantuvieron 48 horas más antes de la infección con una MDI =
1:125.
Las producción de VZV por células de los Grupos
I y II se determinó como sigue: se separó medio de las botellas
rotatorias y se enjuagaron las células con solución salina tamponada
con fosfato, se rasparon con perlas de vidrio en volúmenes iguales
de estabilizante y se enfriaron a 4ºC. Las suspensiones de células
frías se sometieron a disrupción por sonicación. Se separaron
residuos de células del virus por centrifugación a baja velocidad
(325 x g durante 10 minutos) y se retuvo el sobrenadante vírico. La
producción de VZV se midió por el ensayo de placas. Como se muestra
en la Tabla 2, se obtuvo un aumento del rendimiento que se
aproximaba a 2 veces cuando se infectaron con VZV monocapas de
células confluentes recientemente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron células MRC-5 (10
millones) en volúmenes de 125 ml de EBME, 10% de FCS, 50 \mug/ml
de neomicina y L-glutamina 2 mM en botellas
rotatorias de 850 cm^{2}, y se incubaron a 35ºC durane 3 días. Se
añadieron trescientos mililitros de medio nuevo y se devolvieron
los cultivos a incubación a 35ºC durante 4 días más. Se separó
después el medio y se sustituyó con 125 o 425 ml de EMEM, 2% de FCS
inactivado con calor, 50 \mug/ml de neomicina y
L-glutamina 2 mM. Se añadieron células
MRC-5 infectadas con VZV (MDI aproximadamente
1:125), se gasificaron los cultivos con 5% de CO_{2} y se
devolvieron a incubación a 35ºC durante 46 h. Se separó medio, se
lavaron las células 4 veces con volúmenes de 100 ml de PBS y se
rasparon, con ayuda de perlas de vidrio, en volúmenes de 43 ml de
estabilizante. Se congelaron las células a -70ºC. Se preparó por
sonicación virus libre de celulas. Se midieron en el ensayo de
placas de VZV las cantidades de virus infeccioso en sonicados
clarificados (por centrifugación).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Conclusión: El uso del volumen de medio más alto
produce un aumento de aproximadamente 2 veces en los rendimientos
de VZV infeccioso de cultivos de células MRC-5.
Se sembraron botellas rotatorias con células
MRC-5 y se desarrollaron hasta confluencia. Se
separó el medio de crecimiento y las células se infectaron con VZV
con MDIs variables. La producción de VZV por los cultivos de
células infectadas se determinó usando el ensayo de placas
cosechando periódicamente y ensayando como en el Ejemplo 1. Como se
muestra en la Tabla 3 y en la Figura 5, la recuperación de VZV
infeccioso libre de células fue mayor y se consiguió en un período
de incubación más corto cuando se emplearon mayores MDIs. Los
niveles de antígeno de pico se consiguen también más rápidamente
con MDI más alta. Con una MDI muy baja, tal como 1:625, la
producción de antígeno se retrasa y es subóptima (véase Figura
6).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sonicaron cultivos de células infectadas en
SPGA y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato. Se
liberó después por sonicación el virus unido a células y los
residuos de células se separaron por centrifugación. La
concentración de virus libre de células se ajustó a una
concentración de UFP/ml conocida, y se liofilizaron partes
alícuotas del virus en estabilizante y guardaron a 4ºC o -20ºC. A
intervalos de un mes durante un total de 14 meses, se
reconstituyeron muestras y se determinó el título de UFP/ml
restante. Los resultados de este experimento se representan en la
Figura 3.
Es evidente la ventaja sustancial para
estabilidad de VZV obtenida por almacenamiento a -20ºC en lugar de
a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se plantaron células MRC-5 (5
ml) con una concentración de 120.000 células/ml (600.000 células en
total) en placas de 60 mm en medio EBME que contenía 10% de FCS, 50
\mug/ml de neomicina, L-glutamina 2 mM, y se
incubaron a 35ºC bajo 5% de CO_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células eran confluentes al tercer día
post-plantación. El medio de plantación se aspiró
desde 48 placas y se sustituyó con volúmenes de 8 ml de medio de
crecimiento que contenía EBME o SRFE-2 suplementado
con 10% de FCS, 50 \mug/ml de neomicina,
L-glutamina 2 mM y 0,2 mg/ml de lípido de haba de
soja/mg/ml de BSA, con o sin sacarosa 50 mM. Después de añadir el
medio de crecimiento nuevo, las células se incubaron durante 3 días
más a 35ºC bajo 5% de CO_{2}.
Se separó después el medio de cada placa y se
sustituyó con 8 ml de EMEM en lugar de EBME y SRFE-2
en lugar de SRFE-2 más lípidos de haba de soja. El
FCS se redujo al 2% para todas las placas pero los otros
suplementos, neomicina, glutamina y sacarosa fueron como durante la
fase de crecimiento. Cada placa recibió después 333 \mul de una
dilución 1:16 de células infectadas con VZV (47.000 UFP/ml) en EMEM,
2% de FCS, neomicina y glutamina.
Se dejó al VZV replicarse a 35ºC bajo 5% de
CO_{2} durante dos días, y se separaron después los medios de 2
placas de cada condición diferente. Las células se lavaron cuatro
veces con PBS. Se rasparon las células en 1,2 ml/placa de
estabilizante enfriado con hielo. La cosecha de las placas
duplicadas se agrupó en tubos cónicos de centrífuga de 50 ml y se
congelaron a -70ºC.
El mismo procedimiento descrito en el párrafo
precedente se repitió para dos placas de cada condición al tercer,
cuarto y quinto días post-infección con VZV, y la
cosecha agrupada de cada grupo de dos placas se guardó a -70ºC.
Cada cosecha de células preparada como se ha
descrito antes se descongeló después, se sonicó en hielo durante 30
segundos por tubo usando un sonicador de tipo taza, y se clarificó
por centrifugación a 1000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Se
separaron partes alícuotas de los sobrenadantes para ensayo de
placas. Los resultados del ensayo de placas, realizado como se
describe en el Ejemplo 1, se presentan en la Figura 1.
Los datos presentados en la Figura 1 confirman
varias conclusiones:
- 1.
- La incubación de células pre-infección con sacarosa 50 mM es muy beneficiosa para el rendimiento final de VZV. En cada medio, EMEM o SRFE-2, los rendimientos de VZV eran más altos cuando se trataron las células con sacarosa antes de la infección. A las 72 horas post-infección, el rendimiento de VZV en células desarrolladas en SRFE-2 expuestas a sacarosa ¡produjo aproximadamente dieciséis veces el rendimiento de VZV, medido como UFP, de células en medio mínimo sin sacarosa!.
- 2.
- Proporcionar medio rico (SRFE-2 más lípidos de haba de soja durante el crecimiento y SRFE-2 durante el crecimiento vírico) es beneficioso para el rendimiento de VZV, pero conjuntamente con el efecto de la sacarosa, permite un orden de magnitud más de VZV a producir. Así, el medio rico parece actuar sinérgicamente con el efecto sacarosa.
- 3.
- El tiempo de cosecha de VZV es muy significativo. Incluso en las condiciones de cultivo optimizadas, SRFE-2 y sacarosa, etc., el rendimiento de VZV de pico no se consigue a las 48 horas post-infección. En ese punto, sólo se consigue un aumento de cuatro veces sobre el rendimiento del medio mínimo. Sin embargo, a las 72 horas post-infección, hay un aumento de aproximadamente 16 veces del rendimiento de VZV.
En experimentos separados, el rendimiento de VZV
no aumentó tanto si se añadía sacarosa 50 mM en el momento de la
infección, en lugar de 72 horas antes de la infección, indicando así
la importancia de una fase de pre-infección larga
para acumulación intracelular de sacarosa. Los presentes inventores
encontraron también que la adición de sacarosa 25 mM o 100 mM era
menos beneficiosa que sacarosa 50 mM. Las mismas concentraciones
aproximadas son aplicables a lactosa, celobiosa y maltosa.
Se hizo un experimento con botella rotatoria
para determinar los efectos de diversos cambios del procedimiento
(medio de cultivo, suplemento de sacarosa, adición de NH_{4}Cl al
estabilizante, homogeneización Dounce o sonicación para liberación
de virus de células) en los rendimientos en UFP de VZV libre de
células. Se plantaron cultivos a razón de 80 x 10^{3} células/ml
x 125 ml de EBME, 10% de FCS por botella rotatoria. Éstos se
ajustaron a 425 ml con EBME o se realimentaron con medio SRFE +
lípido de soja, y se infectaron con VZV de semilla de trabajo en
125 ("bajo volumen") o 425 ("alto volumen") ml de medio
EMEM o SRFE (sin lípido de soja). El tiempo para estos cambios de
medio/infección fue como se ha descrito en el Ejemplo 7. En diversos
momentos antes de la infección (96 o 24 h antes de la infección, o
en el momento de la infección), se añadió sacarosa (sac.) hasta 50
mM. Los cultivos que recibieron sacarosa antes de la infección
recibieron también sacarosa en el medio de infección con virus.
Todos los cultivos se infectaron con una MDI aproximada = 1:15 con
células infectadas con VZV en cultivos de EMEM y se cosecharon a
las 46 h en estabilizante post-infección que
contenía NH_{4}Cl 20 mM (N) o sin suplemento. Todas las muestras
se congelaron a -70ºC y se liberó a continuación virus de las
células por sonicación u homogeneización DOUNCE. Todas las muestras
se clarificaron por centrifugación a 1000 g durante 10 min.
Los resultados de UFP conseguidos para muestras
sonicadas permitían las siguientes conclusiones:
- 1.
- El uso del volumen de medio "alto" de EMEM aumentó las UFP de VZV 2 veces. Con SRFE, aparece aquí y en otros experimentos que los rendimientos en UFP óptimos se consiguen cerca del volumen de medio "bajo". En algunos casos, se suprimen los rendimientos en el volumen de medio "alto".
- 2.
- NH_{4}Cl no es crítico para altas recuperaciones de UFP.
- 3.
- La sacarosa aumentó los rendimientos en UFP 2 veces para cultivos en EBME/EMEM y 5 veces en SRFE. Parecen ser un efecto del tiempo de adición de sacarosa en las UFP. En otro brazo de este experimento, los rendimientos en UFP fueron 94 x 10^{3} para cultivos en SRFE + soja/SRFE que no recibían sacarosa y 296 x 10^{3}, 427 x 10^{3} y 671 x 10^{3} para cultivos que recibieron sacarosa en la infección, 24 h antes de la infección y 96 horas antes de la infección, respectivamente.
- 4.
- Los cultivos tratados con sacarosa mostraron significativamente menos efectos citopáticos que sus equivalentes exentos de sacarosa. En otro experimento, cultivos tratados con sacarosa no mostraban todavía efectos citopáticos degenerativos 1 semana después de la infección, mientras que sus testigos exentos de sacarosa estaban completamente lisados. Es posible por tanto que las células tratadas con sacarosa acumulen más VZV (antígeno y especialmente UFP) con tiempos de incubación extensos (más allá de la cosecha a las 46 h del experimento de botellas rotatorias).
- 5.
- La MDI no se ajustó en este experimento para mayores concentraciones de células en el momento de la infección debido al crecimiento de células en medio SRFE. Así, podrían obtenerse rendimientos en UFP aún mayores si se optimizara este parámetro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un experimento a gran escala usando
múltiples condiciones diferentes para producción de VZV, similar al
experimento descrito en el Ejemplo 8. Se analizó en este experimento
un nuevo parámetro, la manera de disrupción de células. Se indican
después resultados que comparan el rendimiento de VZV libre de
células conseguido por homogeneización DOUNCE sola, sonicación
sola, y una combinación de DOUNCE y sonicación. Las condiciones de
cultivo de VZV indicadas son para células desarrolladas en medio
mínimo (EBME/EMEM) o alta nutrición (SRFE-2 más
lípidos de haba de soja/SRFE-2 más sacarosa 50 mM en
la fase de pre-infección). Se desarrollaron las
células y se cosecharon como se describe en el Ejemplo 8, y se
determinaron las UFP de VZV/ml por el ensayo descrito en el Ejemplo
1:
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estos datos, está claro que es
alcanzable un aumento sustancial del rendimiento de VZV cuando se
combina cizallamiento mecánico con disrupción sónica de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon células MRC-5 en
matraces en T de 25 cm^{2} en EBME y se incubaron durante 3 días
a 35ºC. Se separó el medio y se sustituyó con 12,5 ml de medio EMEM
nuevo, o medio SRFE-2 con 10% de FCS, neomicina,
glutamina y sin lípido de haba de soja o una dilución 1:200 de
lípido. Se incubaron los cultivos 3 días más a 35ºC. Se separaron
después los medios y las células recibieron células
MRC-5 infectadas con VZV y volúmenes de 12,5 ml de
suero de becerro fetal al 2%, neomicina, glutamina en EMEM o
SRFE-2. La condición de cultivo indicada
"SRFE-2" recibió SRFE-2 durante
el cultivo de células y el cultivo del virus. La condición "SRFE
+ soja" indica muestras que recibieron medio
SRFE-2 y una dilución 1:200 de lípido de haba de
soja durante el cultivo de células, pero sólo medio
SRFE-2 durante el cultivo del virus. Después de
cultivar durante 48 horas, se separaron los medios, se enjuagaron
las células 4 veces con volúmenes de 5 ml de PBS y se rasparon en
volúmenes de 1,2 ml de estabilizante. Se agruparon muestras de
matraces duplicados y se congelaron a -70ºC. Tras la descongelación
subsiguiente, se sometieron las células a disrupción por sonicación,
se clarificaron por centrifugación (1000 g durante 10 min) y se
congelaron los sobrenadantes a -70ºC para ensayo a continuación de
títulos de infectividad del virus. Los resultados se muestran en la
Figura 4. Conclusiones: el uso de medio SRFE-2 en
lugar de EMEM produjo un aumento de 2,5 veces en la recuperación de
varicella vivo. El uso de SRFE-2 suplementado con
haba de soja durante el cultivo de células permitió un aumento
adicional de 2,7 veces en la recuperación de virus, para un aumento
neto de 7 veces por encima del conseguido usando el procedimiento
de crecimiento del virus en EMEM.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que el ensayo de placas de VZV exige
mucho tiempo, no es particularmente susceptible a control durante
la fabricación. Un ELISA de antígeno de VZV rápido permite la
medición de cantidades de antígeno de VZV para permitir la
comprobación del crecimiento del virus durante la fabricación de la
vacuna de varicella viva. Adicionalmente, este ensayo puede usarse
para estimar cantidades de antígeno de VZV en materiales de vacuna
clarificada sonicada, y potencialmente para medir antígeno en viales
llenos de vacuna liofilizada. Brevemente, este ensayo se realiza
por incubación de antígeno de VZV a partir de muestras de ensayo con
suero anti-VZV en solución. Se permite al
anticuerpo libre restante unirse a antígeno de VZV inmovilizado en
placas de microtitulación ELISA. La cantidad de anticuerpo capaz de
unirse a las placas es inversamente proporcional a la cantidad de
antígeno en la muestra de ensayo. El anticuerpo que se une a las
placas se cuantifica por reacción con un anticuerpo
anti-humano enlazado a enzima y un sustrato
apropiado para proporcionar un producto coloreado que se cuantifica
espectrofotométricamente.
El ELISA de antígeno de VZV y los ensayos de
placas de VZV deben proporcionar generalmente datos correlativos,
pero debe tenerse en cuenta que el ensayo de antígeno de VZV detecta
VZV no viable así como viable. Puesto que la respuesta inmune
generada por VZV muerto no se ha mostrado que sea tan eficaz como la
respuesta a virus atenuado vivo, el ensayo de placas es el ensayo
crítico para la determinación de la dosis de inóculo vírico para
vacunas de VZV. No obstante, el ensayo de antígeno también es
valioso porque proporciona una medida de la carga de antígeno total
administrada a un receptor de vacuna de VZV.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Se revisten placas ELISA con glicoproteínas (gps) de células MRC-5 infectadas con VZV o no infectadas, y se recubren con albúmina de suero de bovino al 1% [fracción V, A-9647, Sigma], 0,1% de N_{3}Na para reducir la adsorción no específica de anticuerpos a las placas. Se revisten alternativamente filas con VZV o antígeno testigo (es decir, las filas A, C, E y G reciben gp de VZV y las filas B, D, F y H reciben antígeno de gp de MRC-5 no infectadas).
- 2.
- Se diluye antígeno de ensayo clarificado (3250 g-min) en estabilizante en tubos de 12 x 75 mm o microtubos. Una preparación de antígeno de virus estándar (26 unidades/ml de antígeno de VZV por ensayo de manchas puntuales) se diluye 1:10 y después en serie 1:1,25 veces para proporcionar concentraciones de antígeno de 2,6, 2,1, 1,7, 1,3, 1,1 y 0,9 unidades/ml. Pueden incluirse diluciones adicionales para proporcionar 0,7 y 0,5 unidades/ml de antígeno. La serie de diluciones se usa para generar una curva estándar para la medición de cantidades de antígeno en muestras de ensayo.
- 3.
- Se diluye un suero anti-VZV humano en estabilizante hasta 2 veces la dilución final deseada.
- 4.
- Se dispensan a microtubos volúmenes de trescientos \mul de antígeno diluido, mezclados con 300 \mul de suero anti-VZV diluido y se incuba a 35ºC durante 15-22 minutos. Un testigo incluye anti-VZV humano y diluyente (sin antígeno).
- 5.
- Se añaden partes alícuotas de 100 \mul de cada mezcla de suero-antígeno a 2 pocillos revestidos con glicoproteína de VZV (gp de VZV) y 2 pocillos revestidos con gp de MRC-5 replicados (4 pocillos por muestra) (por ejemplo, muestra 1 en la columna 1, filas A, B, C y D; muestra 2 en la columna 2, filas A, B, C y D; etc.).
- 6.
- Se incuban placas durante 15 \pm 1 minutos a 35ºC para permitir unirse anticuerpo libre (no acomplejado a antígeno en solución) a antígeno de virus inmovilizado en las placas.
- 7.
- Se separa anticuerpo no unido por lavado y los pocillos reciben una IgG anti-humana de cabra conjugada a fosfatasa alcalina para detectar anticuerpo humano unido.
- 8.
- Después de incubación durante 15 \pm 1 minutos a 35ºC, se separa por lavado conjugado no unido. Se detecta conjugado unido por incubación durante 15 min a 35ºC con sustrato de fosfato de p-nitrofenilo disuelto en tampón de dietanolamina.
- 9.
- Después de terminar la reacción del sustrato por adición de 50 \mul/pocillo de NaOH 3 M, se cuantifica el desarrollo de color (densidad óptica (DO) a 405 nm) usando un espectrofotómetro de microplacas.
- 1.
- Se promedian valores de DO replicados respectivos para los pocillos revestidos con VZV y MRC-5 replicados. La experiencia ha demostrado que la DO de MRC-5 es consecuente entre diferentes muestras y diluciones. Por tanto, los valores de MRC-5 para la placa completa se promedian y usan para corregir la unión no específica del anticuerpo o conjugado primario a extractos de células no infectadas. La DO de MRC-5 promediada se sustrae de las DOs de VZV promediadas respectivas para proporcionar valores de DO específicos de VZV (\DeltaDO).
- 2.
- Generación de una curva estándar para medición de cantidades de antígeno: Se representan los valores de \DeltaDO de la curva estándar frente a las concentraciones de antígeno conocidas (unidades VZV/ml). Se introducen los datos en un programa de gráficos apropiado (por ejemplo, Cricket Graph versión 1.3, Cricket Software, Malvern, PA), se identifica la porción lineal de la curva (debe incluir al menos 4 puntos) y se obtiene la "fórmula de ajuste de línea" (y = a + bx).
- 3.
- Cálculo de cantidades de antígeno de muestras de ensayo:
- Se dan valores para a y b por la fórmula de ajuste de línea e y (\DeltaDO) es conocido. El valor desconocido restante, x, que representa las unidades/ml de antígeno puede calcularse después y corregirse por la dilución de muestra para obtener la concentración de antígeno de la muestra no diluida. Sigue un cálculo general de muestra:
-
6
La concentración de antígeno indicada es la
obtenida con la muestra menos diluida que proporcione un valor de
\DeltaDO dentro de la porción lineal de la curva estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de VZV libre de células generadas
en el Ejemplo 7 para las que se presenta el rendimiento en UFP/ml
en la Figura 1 se ensayaron según el ELISA de antígeno de VZV
presentado en el Ejemplo 11. Los resultados de este ensayo se
presentan en la Figura 2.
Es notable que el antígeno de VZV continúe
subiendo a las 96 horas incluso aunque, según los datos de la Figura
1, las UFP/ml disminuyan. También es notable que el nivel de
antígeno de VZV en SRFE-2 más soja más sacarosa no
esté nunca cerca de 16 veces el nivel de antígeno en EMEM (Figura
2), aunque lo estén las UFP/ml de VAZ libre de células viable
(Figura 1). De esta comparación, aparece que el efecto de la
sacarosa es un contribuyente principal al mantenimiento de VZV
viable a las 72 horas post-infección.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon células MRC-5 en
matraces en T de 25 cm^{2} a razón de 53.000 células/ml en
volúmenes de 12,5 ml de EBME, 10% de FCS, 50 \mug/ml de neomicina
y L-glutamina 2 mM, y se incubaron a 35ºC. Después
de 2-3 días, se separó el medio y se sustituyó
(cambio 2) con 12,5 ml de medio nuevo o medio SRFE-2
que contenía 10% de FCS, 50 \mug/ml de neomicina,
L-glutamina 2 mM y diferentes cantidades de lípido
de haba de soja. El lípido de haba de soja no diluido contenía 20
mg/ml de lípido y 100 mg/ml de albúmina de suero de bovino.
Se separaron los medios a los 6 días tras la
plantación inicial de células y se sustituyeron con volúmenes de
12,5 ml de 2% de FCS, 50 \mug/ml de neomicina,
L-glutamina 2 mM en EMEM, o medio
SRFE-2 suplementado con diferentes cantidades de
lípido de haba de soja. Se disociaron células de matraces
seleccionados por tratamiento con tripsina y se contaron células en
un hemacitómetro. Se determinaron cuentas de células para los
cultivos restantes después de 2 días más de cultivo a 35ºC, y un
sumario de los resultados se presenta en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio cambio 1 = medio sustituido con medio
indicado suplementado con 10% de FCS 2-3 días
después de la plantación de células.
Medio cambio 2 = medio sustituido con medio
indicado suplementado con 2% de FCS 6 días después de la plantación
de células.
ND = no determinado.
Conclusiones: El uso de medio
SRFE-2 sin un suplemento de lípido produjo un
aumento aproximado de 2 veces en los números de células sobre los
conseguidos en EMEM solo. Los rendimientos de células se
incrementaron adicionalmente, de una manera dependiente de la
dosis, por suplemento de medio con lípido de haba de soja. Los
rendimientos de células máximos se consiguieron usando la
combinación de medio SRFE-2 y aproximadamente
200-400 \mug/ml de lípido.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon células WI-38 en
matraces en T de 25 cm^{2} a razón de 53.000 células/ml en
volúmenes de 12,5 ml de EBME, 10% de FCS, 50 mg/ml de neomicina y
L-glutamina 2 mM, y se incubaron a 35ºC. Después de
2 días, se separó el medio y se sustituyó con 12,5 ml de medio
SRFE-2 suplementado con 50 mg/ml de neomicina,
L-glutamina 2 mM y una dilución 1:200 de lípido de
haba de soja. Los testigos recibieron medio sin un suplemento de
lípido. Después de 5 días de cultivo a 35ºC, se separó medio, se
disociaron células de matraces por tratamiento con tripsina y se
contaron en un hemacitómetro. Los matraces restantes se mantuvieron
durante 3 días más antes de contar las células. Sigue un sumario de
los resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Conclusión: El suplemento de medios de cultivo
ricos con lípido de haba de soja aumentó los rendimientos de
células WI-38 en aproximadamente 2 veces. El uso de
este linaje celular para producción de VZV se espera así que
transcurra de modo similar al uso de células
MRC-5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se plantaron células MRC-5 en
matraces en T de 25 cm^{2} a razón de aproximadamente 53.000
células/ml en volúmenes de 12,5 ml de medio basal de Eagle con
sales de Earle (EBME), 10% de FCS, 50 \mug/ml de sulfato de
neomicina (neo) y glutamina 2 mM (Gln). Se incuban los cultivos a
35ºC durante 3 días, en cuyo momento las monocapas de células son
típicamente aproximadamente 50-75% confluentes. Se
separa el medio y se sustituye con volúmenes de 10 a 12,5 ml de 10%
de FCS, 50 \mug/ml de neo y Gln 2 mM \pm lípido de haba de soja
u otro, en medio SRFE-2, y se devuelven los
cultivos a incubación a 35ºC. Se determinan cuentas de células en
diversos momentos tripsinizando células (volúmenes de 2,5 ml de
solución de tripsina citrato al 0,25%) y se cuentan en un
hemacitómetro. La viabilidad de células se comprueba por exclusión
de células de azul tripan al 0,2%. Se usan cuentas de células para
derivar una concentración de células que se corrige a su vez para
el volumen total de suspensión de células para obtener el
rendimiento de células por matraz. En algunos experimentos, se
cambian cultivos a medio con 2% de FCS 3-4 días
después de la sustitución del medio, y se determinan cuentas de
células después de incubación durante 2 días
más.
más.
\vskip1.000000\baselineskip
Se plantaron células MRC-5 en
matraces T25, se alimentaron después de 3 días (primera
realimentación) y se determinaron cuentas de células después de 3
días de crecimiento adicionales. Se permitió a matraces T25
adicionales continuar el crecimiento por realimentación \pm
lípido (segunda realimentación), y se dejó crecer 2 días más. Se
recuperaron las células con tripsina. Los rendimientos fueron 2,6 x
10^{6} para células plantadas en EBME y desarrolladas en EMEM,
mientras que las células desarrolladas en SRFE-2 más
una dilución 1:100 de lípidos de haba de soja alcanzaron 6,6 x
10^{6} y 7,7 x 10^{6}. Las células desarrolladas los 2 días
adicionales produjeron 2,76 x 10^{6} para células desarrolladas
en EBME/EMEM, mientras que EBME/SRFE-2, sin
suplemento de lípido de haba de soja, produjeron 9,2 x 10^{6} y
7,88 x 10^{6} células por matraz T25. Las células desarrolladas
en EBME/SRFE-2 en EBME/SRFE-2 +
1:100 de lípido de haba de soja produjeron sólo 2,48 y 2,28 x
10^{6} células. Estos datos indican que la exposición prolongada
(aproximadamente 5 días después de la segunda realimentación) a
altas concentraciones de lípido puede conducir eventualmente a
rendimientos de células reducidos, debido presumiblemente a muerte
de células. Así, en general, se realimentan células con medio rico
ausente suplemento de lípido. Este cambio a medio rico exento de
lípido es particularmente importante cuando se inicia una fase de
crecimiento vírico porque el lípido puede ser tóxico para
crecimiento vírico o viabilidad continuada de células en presencia
de ataque vírico.
\vskip1.000000\baselineskip
Siguiendo esencialmente el mismo procedimiento y
el programa de realimentación/cuantificación de células descrito en
el Ejemplo 16 para cultivo de MRC-5, se consiguieron
los siguientes rendimientos de células (nota: los símbolos + y -
después de la descripción del medio indican presencia o ausencia de
la cantidad indicada, en mg/ml de suplemento de lípido de haba de
soja (sl.) en el segundo medio de realimentación):
Los datos resumidos antes son consecuentes en
general con la observación indicada en el Ejemplo 16 de que una
exposición prolongada de células a altas concentraciones de lípido
no es muy beneficiosa, aunque el efecto tóxico señalado en el
Ejemplo 16 es menos pronunciado en este dato. Con concentraciones de
lípido más bajas, una exposición más larga de células a lípido es
menos dañina y puede ser beneficiosa para aumentar el rendimiento
de células/cm^{2} de superficie de crecimiento.
Se ensayó en este experimento la adición de 2% o
10% de suero de becerro fetal en presencia de suplementos de
lípido. Se plantaron células MRC-5 en EBME, se
realimentaron 3 días después con SRFE-2 suplementado
con diferentes cantidades de lípido de haba de soja, y se
realimentaron 2 días después con la misma concentración de lípido
en SRFE-2 proporcionada en la primera
realimentación. Los rendimientos de células en 10% de FCS fueron
9,5, 11,3 y 12,2 x 10^{6} para cultivos suplementados con 0,1, 0,2
y 0,4 mg/ml de lípido, respectivamente. Cuando se proporcionó 2% de
FCS, los rendimientos de células fueron 6,5, 8,8 y 3,2 x 10^{6}
respectivamente. Este experimento señala el efecto beneficioso
sobre el crecimiento de células del suministro de suplemento de FCS
así como suplemento de lípido. Cualquier efecto tóxico que
experimenten las células con concentraciones de lípido elevadas es
atenuado por el suministro de suplemento de FCS suficiente.
Se plantaron células MRC-5 en
matraces T25 en EBME. El día 3, se realimentaron las células con
medio SRFE-2 que contenía 10% de FCS, suplementado
con diferentes suplementos de lípido. Se proporcionaron en las
concentraciones indicadas lípido de haba de soja de Boehringer
Mannheim, lípidos de suero de bovino adulto ricos en colesterol de
Sigma o lipoproteína de bovino EX-CYTE I o de muy
bajo contenido de endotoxinas de Miles/Pentex. Las cuentas de
células en la realimentación fueron, en millones: 1,19. Cinco días
después, se contaron las células. Las células en EMEM fueron 2,97;
en SRFE-2 o SRFE-2 más 0,4 mg/ml,
0,2 mg/ml y 0,1 mg/ml con lípidos de haba de soja generaron 4,83,
10,44, 8,67 y 8,04 millones de células respectivamente.
EX-CYTE I en 1:50, 1:100 y 1:200 generaron 5,37,
4,80 y 4,74 millones de células respectivamente.
EX-CYTE VLE en 1:25, 1:50 y 1:100 dieron lugar a
5,49, 7,23 y 7,92 millones de células respectivamente. Los lípidos
de alto contenido de colesterol de Sigma en 1:25, 1:50 y 1:100
dieron lugar a 6,87, 7,56 y 7,65 millones de células
respectivamente. Los lípidos de haba de soja de Boehringer Mannheim
ofrecían el mayor aumento del rendimiento de células, aunque los
lípidos EX-CYTE VLE y de Sigma fueron casi tan
eficaces. El efecto de aumento no es único por tanto para lípidos de
haba de soja.
Se sembraron células MRC-5 en
matraces de 25 cm^{2} y se realimentaron los días 3 y 6 como en el
Ejemplo 13. Los rendimientos de células por matraz el día 6 para
cultivos de EBME/EMEM, SRFE-2 más 1/100 de lípido
de haba de soja o SRFE-2 más 1/50 de lípido de haba
de soja fueron 4,3 millones, 9,7 millones y 11,7 millones
respectivamente. La viabilidad de células fue >99% (juzgado por
exclusión de azul tripan) para todos los cultivos. Las células se
realimentaron con medio + lípido de haba de soja, se incubaron
durante 2 días más y se determinaron los rendimientos de células.
Las recuperaciones de células por matraz para estos cultivos fueron
2,9 y 3,5 millones para cultivos en EBME/EMEM duplicados, 11,65
millones para SRFE-2 más 1/50 de lípido de haba de
soja realimentado con el mismo medio, mientras que los cultivos en
SRFE-2 más 1/50 de lípido de haba de soja
(duplicados) realimentados con medio SRFE-2 y sin
lípido de haba de soja produjeron 13,69 y 11,09 millones de
células; 9,66 millones para SRFE-2 más 1/100 de
lípido de haba de soja realimentado con el mismo medio, mientras
que realimentados con SRFE-2 y sin lípido produjeron
8,51 y 6,27 millones en cultivos duplicados.
Está claro por este experimento que los
rendimientos de células MRC-5 aumentaron con
cantidades crecientes de lípido de haba de soja. Los rendimientos
de células máximos se consiguieron usando una dilución 1/50 de
lípido de haba de soja (la concentración más alta ensayada). La
inclusión de lípido en el segundo medio de realimentación
proporcionó rendimientos de células aumentados moderadamente. Sin
embargo, los datos muestran que pueden conseguirse los rendimientos
de células máximos mediante el uso de 1/50 de lípido en el primer
medio de realimentación. Puede omitirse después el suplemento de
lípido del segundo medio de realimentación. Puesto que altas
concentraciones de lípido pueden ser perjudiciales para la
producción de virus, puede ser deseable omitir el lípido durante el
crecimiento vírico.
Claims (9)
1. Un procedimiento para cultivar células en
monocapa que comprende:
- a.
- sembrar un recipiente de cultivo con un material de células en un medio mínimo o rico y permitir las células implantarse durante 24-72 horas;
- b.
- separar el medio del cultivo de la etapa a y sustituirlo con medio rico nuevo, suplementado con 0,02-0,4 mg/ml de lípidos y que incluye también opcionalmente un suplemento de suero;
- c.
- hacer crecer el cultivo de células en medio rico suplementado con lípido;
- d.
- sustituir opcionalmente el medio de la etapa c con medio nuevo que no contiene suplemento de lípido, después de 24-72 horas de crecimiento.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que las células son útiles para propagación de virus.
3. El procedimiento según las reivindicaciones 1
o 2, en el que el suplemento de lípido es un lípido rico en
colesterol de suero de bovino adulto, lípido EX-CYTE
I o lípido de muy bajo contenido de endotoxinas (VLE).
4. Un procedimiento según las reivindicaciones 1
o 2, en el que el suplemento de lípido es lípido de haba de
soja.
5. El procedimiento de las reivindicaciones 1, 2
o 4, en el que el medio rico es
SRFE-199-2, opcionalmente
suplementado con suero de becerro fetal, el suplemento de lípido se
proporciona entre aproximadamente 0,02 mg/ml y 0,4 mg/ml, y las
células son células MRC-5, WI-38 o
Vero.
6. El procedimiento de las reivindicaciones 1,
2, 3 o 4, en el que las células son células MRC-5,
WI-38 o Vero.
7. Una composición útil para hacer crecer
células en cultivo monocapa que comprende medio
SFRE-199-2 suplementado con
0,02-0,4 mg/ml de lípidos.
8. Una composición según la reivindicación 7, en
la que el suplemento de lípido es un lípido rico en colesterol de
suero de bovino adulto, lípido EX-CYTE I o lípido de
muy bajo contenido de endotoxinas (VLE).
9. Una composición según la reivindicación 7, en
la que el suplemento de lípido es lípido de haba de soja.
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