CS252736B1 - Živá atenuovaná vakcína proti parvovírusovej enteritíde noriek a sposob jej přípravy - Google Patents

Description

ČESKOSLOVENSKA SOCIALISTICKÁ POPIS VYNALEZU K AUTORSKÉMU QSVEDČENIU 252736 (11) (BIJ (51) Int. Cl.4 A 61 K 39/23 R E P U B L 1(19) K A (22) Přihlášené 31 07 85 J21) (PV 5593-85) LJ 1 (40) Zverejnené 12 03 87 OlAO PRO VYNÁIEZY A OBJEVY (45) Vydané 15 10 88 (75)

Autor vynálezu ŽUFFA TOMÁŠ MVDr., SALAJ JURAJ MVDr., ZAJAC JÁN MVDr., NITRA (54) Ži,vá atenuovaná vakcína proti parvovírusovej enteritíde noriek a sposobjej přípravy 1

Vynález sa týká žívej atenuovanej vakcí-ny proti parvovírusovej enteritíde noriek aspdsobu jej přípravy, a vakcinočného kom-ponentu bivalentnej lyofilizovanej vakcíny ajproti psinke pripravenej na buňkových kul-turách.

Parvovírusová enteritída noriek předsta-vuje hromadné ochorenie zažívacích ústro-jov, ktoré sa klinicky prejavuje nechuten-stvem, malátnosťou, zvracením a hnačkou,ktorá může byť krvavá. Zvieratá majú horúč-ku a pri hematologickom vyšetření sa spra-vidla zisťuje znížený počet leukocytov. Ocho-renie sposobuje významné straty vo veíko-chovoch noriek, pričom úhyn představuje20 až 50 % z celkového počtu zvierat. Prizavlečení do chovu postihuje všetky věkovékategorie zvierat, ale najma mláďatá, pri-čom nástup je prudký a priebeh velmi rých-iy.

Povodcom ochorenia je virus z čellade Par-voviridae, ktorého- částice sú izomerické, ne-obalené a obsahujú dezoxyribonukleovú ky-selinu. Virus sa replikuje v bunkovom jadre,a to iba v určitých fázach buňkového cyk-lu, preto je jeho pestovanie in vitro poměr-ně obtiažne.

Specifická profylaxia je založená na pa-sívnej imunizácii podáním hyperimúnnehoséra alebo imúnnych sérových globulínov, 2 ale najčastejšie sa využívá aktívna imuni-zácia. Spočiatku sa používali pre norky očko-vacie látky (inaktivované a živé) připrave-né z virusu panleukopénie mačiek, nakolkosa vychádzalO' z poznatku, že uvedené 2 vi-rusy sú antigénne příbuzné, ale nie identic-ké (FLAGSTAD, A.: Feline panleukopenia vi-rus and mink enteritis virus. Acta vet. scand.,18, 1977, :1 — 9; CARMAN, P. S. _ POVEY,R. C.: Comparison of the viral proteins ofCanine parvovirus-2, Mink enteritis virusand Feline panleukopenia virus. VeterinaryMicrobiology, 8, 1983, :423 — 435; GORHAM,J. R. — HARTSOUGH, G. R. — BURGER, D.— a spol.: The preliminary use of attenua-ted feline panleukopenia virus to protéctcats against panleukopenia and mink aga-inst virus enteritis. Cornell Vet., 1965, :559až 566; POLLOCK, R. V. H.: The parvoviru-ses, Part I. Feline Panleukopenia virus andMink enteritis virus. Compendium on conti-nuing education for the practicing veterina-rian, Vol. 6, 1984, 3: 227 — 236).

Neskór sa přijala zásada, že optimálně rie-šenie bude, ak pre každé ochorenie sa při-praví homológna vakcína. Používajú sa in-aktivované vakcíny připravené z virulent-ných kmeftoy (CARMAN, S. — POVEY, C.:The failure of an Inactivated Mink Enteritisvirus vaccine in f-our preparations to- provi- 252736 252736 de protection to dogs against challengewith Canine parvovirus II. Can. J. comp. Med., 1982, 46: 47 — 50; SHEN, D. T. — GORHAM,J. R. — RYLAND, L. M. — a spol.: Using jetinjection to vaccinate mink and ferrets aga-inst canine distemper, mink virus enteritis,and botulism, type C. Vet. Med. /Smáli Ani-mmal Clinician, 1981, :856 — 859/), ale vposlednom období získali převahu živé vak-cíny, ktoré obsahujú virus oslabený sério-vým pasážovaním na buňkových kulturách.Nevýhodou inaktivovaných vakcín je, že ichúčinnost je významné ovplyvňovaná najmaprítomnosťou materských protilátok a obsa-hom účinného antigénu. Imunita trvá lenkrátku dobu — niekotko mesiacov, pričomchrání len proti subklinickej infekcií, ale zhfadiska tlmenia nákazy je významná sku-točnost, že takéto očkovanie nezabráni in-tenzívnemu vylučovaniu virulentného virusudo prostredia (CARMICHAEL, L. E. — OLIN,J. M.: Immunization strategies in puppies —why failures? Compend. Contin. Educ. Prací.Vet., 5, 1983, 12: 1 043 — 1 051; POLLOCK, R. V. H. — CARMICHAEL, L, E,: Canine vi-ral enteritis. Vet. Clin. North. Amer., 13, 1983, 3: 551 — 556].

Pri aktívnej imunizácii získavajú postup-né převahu živé vakcíny připravené z ate-nuovaných homológnych kmeňov. Po ich a-plikácii dosahujú hladiny specifických pro-tilátok úroveň, ako po prirodzenej infekciivírulentným kmeňom. Protilátky sa zisťujúuž na 3. deň po inokulácii a perzistujú naj-menej 2 roky (CARMICHAEL, L. E. — JOU-BERT, J. C. — POLLOCK, R. V. H.: A modi-fied live canine parvovirus vaccine. II. Irn-mune response. Cornell Vet., 73, 1983,: 13až 29; KALIN, D. E. — EMERGY, J. B. —SMITH, M. J. — SPOTTS, A. M.: Safety andefficacy of modified-live canine parvovirusvaccine. Vet. Med. Smáli Anim. Clin., 78, rok1983,: 1 739 — 1 746).

Potomstvo od imúnnych matiek je chrá-něné proti infekcii materskými protilátkami,z ktorých 10 % získává transplacentárne a90 % kolostrom. Na druhej straně tieto pro-tilátky nepriaznivo ovplyvňujú imunitnú od-pověď na podanie živých alebo inaktivova-ných vakcín (CARMICHAEL, L. E. — JOU-BERT, J. C. -- POLLOCK, R. V. H.: A modi-fied live canine parvovirus vaccine. II. Im-mune response. Cornell Vet., 73, 1983, :13až 29; BAKER, J. A. — ROBSON, D. S. — GIL-LESPIE, J. Η. — ET AL.: A nomograph thatpredicts the age to vaccinate puppiers aga-inst distemper. Cornell Vet., 49, 1959, :185až 167; CARMICHAEL, L. E. — ROBSON, D. S. — BARNES, F. D.: Transfer and declineof maternal infectious canine hepatitis anti-body in puppies. Proč. Soc. Exp. Biol. Med.,109, 1962, :677 — 681). Z experimentálnych aj praktických skúse-ností vyplývá, že podmienkou pře dosiahnu-tie dlhodobej chránenosti je očkovanie mlá-ďat až vo veku okolo 16 až 18 týždňov.

Sposob kultivácie parvovírusu v buňko- vých kultúrach za účelom pomnoženia vi-rusového materiálu na přípravu pokusnýchvakcín popísali vlacerí autoři (GORHAM, J.R. — HARTSOUGH, G. R. — BURGER, D. —ET AL.: The preliminary use of attenuatedfeline panleukopenia virus to protéct catsagainst panleukopenia and mink against vi-rus enteritis. Cornell Vet., 55, 1965, :559 až566; MOCHIZUKI, M. — KONISHI, S. — OGA-TA, M.: Studies on feline panleukopenia. II.Antigenicities of the virus. Jpn. J. vet. Sci.,40, 1978, 4: 375 — 383; CARMICHAEL, L. E.— JOUBERT, J. C. — POLLOCK, R. V. H.: Amodifieď live canine parvovirus strain withnovel plague characteristics. I. Viral atte-nuation and dog response. Cornell Vet., 71,1981, 4: 408 — 427; CHURCHILL, A. E.: A po-tency test for inactivated smáli animal par-vovirus vaccines using chicks. J. Biol. Stan-dard., 10, 1982, :1 — 8; NARA, P. L. — WIN-TERS, K. — RIlCE, J. B. et al.: Systemic andlocal intestinal antibody response in dogsgiven both infective and inactivated canineparvovirus. Amer. J. vet. Res., 44, 1983, 11:1 989 — 1 995; BERGMAN, R. — SUNDQUIST, B. — STROMAN, L.: Production of a felineparvovirus vaccine using monolayer cell Sy-stems in roller flasks and microcarriers. De-velop. biol. Standard., 55, 1984, :77 — 78).

Použili najma primárné kultúry mačacícha psích embryonálnych buniek alebo z nichpřipravené stabilně buňkové linie. Infekciubuniek robili obvykle za 4 až 6 hodin po ma-sadení do kultivačných nádob. Nakolkomnoženie virusu nebolo doprevádzané pravi-delným vývojom cytopatických zmien, kon-trolovali obsah virusu v tkanivových teku-tinách na základe přítomnosti intranukleár-nych teliesok, imunofluorescentnou meto-dou, připadne výšky hemaglutinačného titru.Pri infekcii buniek sa často používal oplachfyziologickým roztokom a výměna kulíivač-ného média. Velkovýrobna technológia vý-roby vakcíny vyžaduje však minimálně množ-stvo operách a podlá možnosti priamu, po-hotovu a presvedčivú mikroskopickú kon-trolu množenia virusu na základe specific-kých cytopatických zmien. Táto úloha bola vyriešená následovně:

Bola připravená živá atenuovaná vakcínaproti parvovírusovej enteritíde noriek, mono-valentná, fyofilizovaná, alebo vakcinačnýkomponent bivalentnej lyofilizovanej vakcí-ny aj proti psinke, ktorá obsahuje v 1 mlatenuovaný kmeň virusu enteritídy noriekMEVA-BN 63/82 CAMP V-292 v množstve naj-menej 103 TKIDso častíc virusu a v případebivalentnej vakcíny obsahuje ešte kmeň vi-rusu psinky CDV-F-BN 10/83 CAPM V-289 vmnožstve najmenej 103 TKIDso častíc virusupsinky.

Uvedený virusový kmeň bol adaptovanýna kultúry buniek stiabilnej mačacej linieFE. Ako rastové médium bolo použité mini- 252738 málne esenciálně médium pod/a Eaglea o-bohatené o bovínné sérum, v ktororo sa vi-rus pomnožoval pri teplote 36 až 38 CG podobu 4 až 8 dní. Po vytvoření zřetelných cy-topatických zmien sa virusový materiál zmie-šal s lyofilizačným médiom tak, aby obsa-hoval minimálně 104 TKIDso Častíc virusuenteritídy noriek v 1 ml.

Virusový kmeň enteritídy noriek s ozna-čením MEVA-BN 63/82 a zbierkovým číslomCAMP V-292, uložený v Ceskoslovenskejzbierke mikroorganizmov na Výskumnomústave veterinárneho lekárstva v Brně, Hud-cova 60, sme získali z povodně virulentné-ho virusu izolovaného z infekčných mate-riálov cestou sériových pasáži na mačacejbunkovej linii označenej FE. Homogenita vi-rusové] populácie a stabilita imunobiologíc-kých vlastností atenuovaného kmeňa sa do-siahla izolováním linie metódou hraničnýchriedení so šesťnásobným opakováním.

Uvedený kmeň MEVA-BN 63/82 CAPM V--292 je charakterizovaný týmito ímunobiolo-gickými vlastnosťami: 1. Pri dodržaní definovaných kultivačnýchpodmienok je množenie virusu na stabilnejbuňkové] linii FE doprevádzané vývojom vý-razných cytopatických zmien s obsahom ΙΟ5·5až 10r’·6 TKIDso. ml“1. 2. Vakcinačný virus je neškodný pre všet-ky věkové kategorie noriek, pričom mláďa-tá bez materinských protílátok můžu byť ú-spešne imunizované počnúc vekom 6 týžd-ňov. 3. Vakcinačný virus sa nevylučuje z orga-nizmu očkovaných zvierat a neprenáša sana spoluustajnené vnímavé zvieratá. 4. Očkovanie vnímavých zvierat vyvoláchránenosť, počnúc 4. dňom po podaní vak-cíny. 5. Imunita vyvolaná jednorázovým očko-váním zvierat straších ako 12 týždňov trvánajmenej jeden rok, a je doprevádzaná pří-tomnostmi specifických protílátok.

Stabilná buňková línia FE, vykazovala prijej získaní nedostatočné rastové vlastnosticharakterizované pomalým množením bu-niek a neschopnosťou vytvořit súvislý mo-nolayer. Uvedené vlastnosti bunkovej linienezodpovedali nárokom na intenzívně mno-ženie uvedeného virusu so získáním viruso-vých suspenzi! s dostatočnými titrami po-třebnými pre výrobu vakcíny. Prejavom ne-dostatečných rastových vlastností bunkovejlinie bolo aj chýbanie vývoja cytopatickýchzmien po infekcii vakcinačným kmeňom, čonedovolovalo sledovat a hodnotit stupeň po-množenia virusu. Sériovým pasážovaním bun-kovej linie FE vo vybraných médiách (MEM,BEM, M199] s obsahom novorodeneckého sé- ra sme po> 25 pasážach v médiu MEM deri-vovali populáciu buníek, ktorá vykazuje ná-sledovně vlastnosti: - 1. Líniu je možné pasážovať v pomere 1:: 3 až 1: 4 v 72- až 96hodinových ihterva-loch pomocou roztoku verzén-trypsin. 2. Najvhodnejšie rastové médium je mini-málně esenciálně médium podlá Eaglea sprídavkom 5 až 15 hmot. % bovínneho- séra. 3. Bunkovú líniu je možné uchovávat vzmrazenom stave pri teplotách pod —100 °C,s použitím protekčného média, ktoré obsa-huje 10 až 20 hmot. °/o dimetylsulfoxidu. 4. Množenie vakcinačného virusu je pravi-delné sprevádzané výraznými cytopatický-mi změnami na 4. až 8. deň po infekcii v zá-vislosti od dávky virusu.

Dosiahnuté titry virusu dovofujú realizo-vat ěfektívnu výrobu očkovacej látky protiparvovírusovej enteritíde noriek. Výběr kultivačného séra:

Kultivačně sérum s dobrými rastovýmivlastnosťami pre uvedenú bunkovú líniu mů-že obsahovat nespecifické inhibitory naj-viac v titry 1 : 32, stanovenom hemagluti-načno-inhibičným testom.

Postup výroby vakcíny:

Spůsob infekcie buniek linie FE vakcinač-ným vírusom: A.

Suspenzia buniek FE o hustotě 5 až 10 . . 10B buniek . ml-1 v rastovom médiu sa zmie-ša s vakcinačným vírusom pri multipliciteinfekcie od 0,0001 do 0,001. Zmes virusu abuniek sa inkubuje pri 36 až 38 °C počas30 až 60 minut. Potom sa zmes virusu a bu-niek nariedi v rastovom médiu, ktoré před-stavuje minimálně esenciálně médium podfaEaglea s pH 6,8 až 7,3 ia prídavkom piatichaž desiatich hmot. °/o bovinného séria s kva-litou vyznačenou v odstavci „Výběr kultivač-ného séra“. B.

Do bunkovej suspenzie v rastovom médiusa přidá inokulum vakcinačného virusu omultiplicite infekcie 0,0001 až 0,001, ktorása ihned' vyleje do kultivačnej nádoby. Tak-to připravená suspenzia buniek za účelompřípravy vakcíny sa kultivuje na skle, plas-tickej hmotě, štacionárnym sposobom, ale-bo v otáčaných flašiach („rolleroch“), při-padne na mikronosičoch, pri 36 až 38 °'C po-čas 4 až 8 dní. Množenie virusu je sprevá-dzané výraznými cytopatickými změnami. 252736 C.

Infekcia prichytených buniek na kultivač-nom povrchu — po štvor- až šesťhodinovejinkubácii buniek linie FE pri 36 až 38 °C. Dorastového média sa přidá inokulum vakci-načného virusu pri multiplicite infekcie0,0001 až 0,001. Inkubácia pokračuje pri 36až 38 °C počas 4 až 8 dní. Množenie virusuje rovnako ako v bode A a B sprevádzanévýraznými cytopatickými změnami.

Zmes infekčných tekutin sa získává vtedy,keď 80 až 90 % monolayeru vykazuje spe-cifické změny. Takto připravená virusovásuspenzia sa kontroluje na přítomnost ne-žiadúcich kontaminujúcich mikroorganizmova stanoví sa obsah virusu titráciou na buň-kách linie FE. Po ukončení kultivácie sa vi-rusový materiál zmieša s lyofilizačným mé-diom v pomere 50 až 75 hmot. % virusu k50 až 25 hmot. % lyofilizačného média a u-chováva pri —15 až —20 °C :až do lyofilizá-cie. Lyofilizačné médium je možné pri za-chovaní rovnakých hmotnostných pomerovpřidávat až tesne před lyofilizáciou. Na pří-pravu lyofilizovanej vakcíny sa použijí in-fekčně tekutiny s obsahom minimálně 104TKIDso . ml"'1 virusu, bakteriologicky steril-ně. Homogenizovaná virusová suspenzia slyofilizačným médiom, ktoré obsahuje sa-charózu, fosforečnanový pufor, glutamát sod-ný, alebo draselný, bovinný albumin aleboiný zdroj bielkovín, dextran alebo želatinu(BOVARNICK, M. R. — MILLER, J. C. — SYN-DER, J. C.: The influence of certain salts, a-monoacids, sugars, and proteins on the sta-bility of rickettsiae. J. Bacteriol., 59, 1950,:509—522] sa rozplňuje do ampuliek, ale-bo liekoviek, lyofilizuje, vzduchotěsně uza-tvára a uchovává pri chladničkovej teplo-tě. Vakcína připravená podta uvedeného po-stupu obsahuje najmenej 103 TKIDso.ml-1vakcinačného virusu, čo představuje jednuimunizačnú dávku.

Použité lyofilizačné médium podfa BOVAR-NICK, M. R. — MILLER, J. C. — SNYDER, J. C.: The influence of certain salts, aminoa-cids, sugars, and proteins on the stabilityof rickettsiae. J. Bacteriol 59, 1950, :509 —522] je vhodné aj na lyofilizáciu iných dru-hov vakcinačných vírusov, Preto ak sa při-dá do infekčnej suspenzie obsahujúcej inýdruh vakcinačného virusu, například viruspsinky, je možné tieto suspenzie navzájommiešať v 1'ubovolnom pomere a lyofilizovať.

Uvedené příklady predmet vynálezu nijakneobmedzujú, ani nevyčerpávajú: 1. Spůsob kultivácie:

Suspenzia buniek, připravená pomocouproteolytických fermentov v rastovom mé-diu, ktoré obsahuje definované množstvo a-mínokyselín, a vytamínov s prídavkom 10 hmot. % séra určeného pre tkanivové kultú-ry sa kutivuje na skle, plastickej hmotě, šta-cionárnym spQsobom alebo v otáčaných fla-šiach (rolleroch), připadne v suspenzii namikronosičoch. 2. Sposob infekcie buňkových kultúr vakci-načným vírusom:

Buňkové kultúry připravené a pěstovanépodlá bodu 1, sa infikujú vakcinačným ví-rusom pri multiplicite infekcie najmenej0,001 nasledovnými sposobmi: a) suspenzia buniek linie FE o hustotě 10. . 106 buniek .ml-1 v rastovom médiu sa zmie-ša s vakcinačným vírusom pri multipliciteinfekcie 0,001. Zmes virusu a buniek sa in-kubuje pri 37 CC počas 30 minut. Potom sazmes virusu a buniek nariedi v rastovommédiu, ktoré představuje minimálně esen-ciálně médium podlá Eaglea s pH 7,1 a prí-davkom 10 hmot. % bovinného séra. b) do suspenzie buniek linie FE o hustotě 5 . . 105. ml"1 v rastovom médiu sa přidá ino-kulum vakcinačného virusu o multipliciteinfekcie 0,001, a infikovaná suspenzia sa i-hned vyleje do kultivačnej nádoby. Taktopřipravená suspenzia buniek za účelom pří-pravy vakcíny sa kultivuje v Rouxových ffa-šiach pri teplote 37 °C počas 6 dní. Množe-nie virusu je sprevádzané výraznými cyto-patickými změnami. c) infekcia prichytených buniek na kultivač-nom povrchu — po šesťhodinovej kultiváciibuniek linie FE pri 37 °C sa do rastovéhomédia přidá inokulum vakcinačného virusupri multiplicite infekcie 0,001. Inkubácia po-kračuje pri 37 °C počas 6 dní. Množenie vi-rusu je rovnako ako v bode a] a b] sprevá-dzané výraznými cytopatickými změnami. 3. Zber vakcinačného virusu:

Vakcinačný virus sa produkuje v rasto-vom médiu na buňkových kulturách pěsto-vaných podlá bodu 1 a infikovaných podfabodu 2. Po vytvoření rozsiahlych cytopatic-kých zmien stanovených mikroskopicky sakultivácia ukončí a do rastového média spomnoženým vírusom sa přidá priamo dokultivačných nádob vhodné lyofilizačné mé-dium v pomere 67 hmot. % vírusovej suspen-zie ia 33 hmot. % lyofilizačného média. Zmessa ďalej uchovává v kultivačných nádobáchv zmrazenom stave až do lyofilizácie.

Claims (6)

252738 10 Homogenizovaný virusový materiál s po-žadovaným obsahom infekčných jednotiek[najmenej 104 TKIDso. ml“1), ktorý neobsa-huje kontaminujúce mikroorganizmy sa roz-plňuje do· ampuliek, lyofilizuje, vzduchotěs-ně uzatvorí a uchovává pri chladničkovejteplote. Vakcína připravená pódia uvedené-ho postupu obsahuje najmenej 103-° TKIDso .. ml“1 vakcinačného virusu.

1. Živá atenuovaná vakcína proti parvoví-rusovej enteritíde noriek, monovalentná, lyo-íilizovaná, alebo vakcinačný komponent bi-valentnej lyofilizovanej vakcíny aj proti psin-ke, vyznačujúci sa tým, že obsahuje v 1 mlatenuovaný kmen virusu enteritídy noriekMEVA-BN 63/82 CAPM-292 v množstve naj-menej 103 TKIDso častíc virusu a v případebivalentnej vakcíny obsahuje ešte kmeň vi-rusu psinky CDV-F-BN 10/83 CAPM V-289 vmnožstve najmenej 103 TKIDso častíc virusupsinky.

2. Živá atenuovaná vakcína pódia bodu 1,alebo vakcinačný komponent bivalentnej lyo-filizovanej vakcíny aj proti psinke, vyzna-čujúci sa tým, že obsahuje lyofilizačné mé-dium v množstve 25 až 50 hmot. %, vztiah-nuté na hmotnosť celej vakcíny.

3. Sposob výroby vakcíny pódia bodov 1a 2 vyznačujúci sa tým, že atenuovaný kmeňvirusu enteritídy noriek sa pomnožuje nastabilnej mačacej linii buniek FE v minimál-nom esenciálnom médiu pódia Eaglea s pH 6,8 až 7,3, obohatenom o bovinné sérum priteplote od 36 do 38 °C po dobu 4 až 8 dní,až do vytvorenia výrazných cytopatickýchzmien a potom sa virusový materiál zmiešas lyofilizačným médiom tak, aby obsahovalminimálně 104 TKIDso . ml“1.

4. Sposob výroby vakcíny pódia bodu 3,vyznačujúci sa tým, že ako přísada do kulti-vačného média sa použije bovinné sérums definovaným obsahom nespecifických inhi-bítorov proti odpovedajúcemu virusu. Y N A L E Z U

4. Příprava kombinovanej vakcíny: Lyofilizačné médium, ktoré obsahuje sa-charózu, fosforečnanový pufor, glutamát sod- ný alebo draselný, bovinný albumin aleboiný zdroj bielkovín a želatinu alebo dextránvyhovuje aj pre lyofilizáciu iných druhovvakcinačných vírusov. Připravená vakcínaproti vírusovej enteritíde noriek sa miešaso živou atenuovanou vakcínou proti psinkev iubovolnom pomere, rozplňuje do ampu-liek, lyofilizuje, vzduchotěsně uzatvorí a u-chováva pri chladničkovej teplote. Bivalent-ná vakcína připravená pódia uvedeného po-stupu obsahuje najmenej IQ3 TKIDso. ml“1vakcinačných vírusov psinky a vírusovej en-teritídy noriek. PŘEĎME T

5. Sposob výroby vakcíny pódia bodov 3a 4, vyznačujúci sa tým, že infekcia buniekna produkciu virusu sa robí buď tak, že buň-ková suspenzia s obsahom 5 až 10.106. ml“1buniek v rastovom médiu sa infikuje víru-som pri MOI najmenej 0,0001 na buňku, in-kubuje pri 36 až 38 °C počas 30 až 60 minút,potom sa 10 až 20 krát nariedi v rastovommédiu, vyleje do kultivačnej nádoby a kulti-vuje pri teplote 36 až 38 °C až do zberu vi-rusu, alebo buňková suspenzia s obsahom4 až 8. 105. ml“1 buniek v rastovom médiusa infikuje vírusom pri MOI najmenej 0,0001na buňku a inkubuje pri 36 až 38 °C až dozberu virusu, do kultivačných nádob sa na-sadzuje buňková suspenzia v rastovom mé-diu s obsahom 4 až 8.105 . ml“1 buniek, akultúry sa po 4- až 6hodinovej inkubácii pri36 až 38 °C infikujú priamo do rastového mé-dia vírusom pri MOI najmenej 0,0001 na buň-ku a inkubujú až do zberu virusu.

6. Sposob výroby vakcíny pódia bodov 1až 5, vyznačujúci sa tým, že sa k virusovýmsuspenziam přidává po ukončení inkubácielyofilizačné médium, ktoré obsahuje sacha-rózu, fosforečnanový pufor, glutamát sod-ný alebo draselný, bovinný albumin aleboiný zdroj bielkovín a želatinu alebo dextrána zmes sa uchovává až do lyofilizácie vzmrazenom stave bez straty obsahu infekč-ného virusu pri teplotách vyšších ako —20stupňov Celsia, alebo sa lyofilizuje okamži-té.