Patents

Search tools Text Classification Chemistry Measure Numbers Full documents Title Abstract Claims All Any Exact Not Add AND condition These CPCs and their children These exact CPCs Add AND condition
Exact Exact Batch Similar Substructure Substructure (SMARTS) Full documents Claims only Add AND condition
Add AND condition
Application Numbers Publication Numbers Either Add AND condition

Živá atenuovaná vakcína proti parvoviráze psov a spósob jej přípravy

Landscapes

Show more

CS252747B1

Czechoslovakia

Other languages
English
Slovak
Inventor
Tomas Zuffa
Juraj Salaj
Jan Zajac

Worldwide applications
1985 CS 1986 CS CS

Application CS861843A events

Description

232747
Clin. North Amer., 13, 1983, 3: 551 — 556).Pri aktívnej imunizácli získavajú postupnépřevahu živé vakcíny připravené z atenuova-ných homológnych kmeňov. Po ich apliká-cii dosahujú hladiny specifických protilá-tek úroveň, ako po prirodzenej infekcii vi-rulentným kmeňom. Protilátky sa zisťujú užna 3. deň po inokulácii a prezistujú najme-nej 2 roky (CARMICHAEL, L. E. — JOUR-BERT, J. C. — POLLOCK, R. V. H..: A modi-fied live canine parvovirus vaccine. II. Im-mune response. Oornell Vet., 73, 1983,: 13až 29, KALIN, D. E. EMERGY, J. B. — SMITH,M. J. — SPOTTS, A. M.: Safety and efficacyof modiffied-live canine parvovirus vaccine.Vet. Med. Smáli Anim. Clin., 78, 1983,: 1 739až 1746). Potomstvo od imúnnych matiekje chráněné proti infekcii materskými proti-látkami, z kterých 10 % získává transpla-centárne a 90 % kolostrom. Na druhej stra-ně tieto protilátky nepriaznivo ovplyvňujúimunitnú odpověď na podanie živých aleboinaktivovaných vakcín (CARMICHAEL, L. E.— JOUBERT, J. C. — POLLOCK, R. V. H.: Amodified live canine parvovirus vaccine. II.Immune response. Cornell Vet., 73, 1983,:13 — 29; BAKER, J. A. — ROBSON, D. S. —GILLESPIE, J. Η. — ET AL.: A nomographthat predicts the age to vaccinate puppiesagainst distemper. Cornell Vet., 49, 1959,:158 — 167; CARMICHAEL, L. E. — ROBSON, D. S. — BARNES, F. D.: Transfor and dech-ne of maternal infectious canine hepatitisantibody in puppies. Proč. Soc. Exp. Biol.Med., 109, 1962,: 677 — 681). Z experimen-tálnych aj praktických skúseností vyplývá,že podmienkou pre dosiahnutie dlhodobejchránenosti je očkovanie mláďat až vo ve-ku okolo 16 až 18 týždňov.
SpQsob kultivácie parvovírusu v buňko-vých kultúrach za účelom pomnoženia viru-sového materiálu na přípravu pokusnýchvakcín popísali viacerí antori (CARMICHAEL,L. E. — JOUBERT, J. C. — POLLOCK, R. V. H.:A modified live canine parvovirus strainwith novel plaque characteristics. I. Viralattenuation and dog response. Cornell Vet.,71, 1981, 4: 408 — 427; CHURCHILL, A. E.: Apo-tency test for inactivated smáli animialparvovirus vaccines using chicks. J. biol.Standard., 10, 1982,: 1 — 8; NARA, P. L. —WINTERS, K. — RUCE, J. B. et al.: Systemicand Local intestinal antibody response indogs given both infective and inactivatedcanine parvoviruses. Amer. J. Vet. Res., 44,1983, 11: 1989 — 1 995; BERGMAN, R. —SUNDQUIST, B. — STRÍÍMAN, L.: Producti-on of a feline parvoviruses vaccine usingmonolayer cell systems in roller flasks andmicrocarriers. Develop. biol. Standard., 55, 1984,: 77 — 78). Použili najma primárné kul-túry mačacích a psích embryomálnych bu-niek, alebo z nich připravené stabilně buňko-vé linie. Infekciu buniek robili obvykle za4 až 6 hodin po nasadení do kultivačnýchnádob. Nakolko množenie virusu nebolo do-prevádzané pravidelným vývojom cytopatic-kých zmien, kontrolovali obsah virusu v tka-nivových tekutinách na základe přítomnos-ti intranukleárnych teliesok, imunofluores-centnou metodou, připadne výšky hema-glutinačného titru. Pri infekcii buniek sačasto používal oplach fyziologickým rozto-koím a výměna kultivačného média. Velko-výrobná technológia výroby vakcín vyžadujevšak minimálně množstvo operácií a podlámožnosti priamu, pohotovu a presvedčivúmikroskopická kontrolu množenia virusu nazáklade špecifických cytopatických zmien.Táto úloha bola vyriešená následovně:
Bola připravená živá atenuovaná vakcínaproti parvoviróze psov, monovalentná, lyo-filizovaná, alebo vakcinačný komponent biva-lentnej lyofilizovanej vakcíny aj proti (psin-ke, ktorá obsahuje v 1 ml atenuovaný kmenparvovírusu psov CPVA-BN 80/82 CAMP V--290 v množstve najmenej 103 TKIDso častícvirusu a v případe bivalentnej vakcíny ob-sahuje ešte kmen virusu psinky CDV-F-BN10/83 CAPM V-289 v množstve najmenej 103TKIDso častíc virusu psinky.
Uvedený virusový kmeň bol adaptovanýna kultúry buniek stabilnej mačacej linieFE. Ako rastové médium bolo použité mini-málně esenciálně médium podlá Eaglea o-bohatené o bovinné sérum, v ktorom sa vi-rus pomnožoval pri teplote 36 až 38 °C podobu 4 až 8 dní. Po- vytvoření zřetelných cy-topatických zmien sa virusový materiál zmie-šal s lyofilízačným médiom tak, aby obsa-hoval minimálně 104 TKIDso častíc virusuenteritídy psov v 1 ml.
Virusový kmeň parvovírusu psov s ozna-čením CPVA-BN 80/82 a zbierkovým číslomCAPM V-290, uložený v Československejzbierke mikroorganizmov na Výskumno-m ú-stave veterinárneho lekárstva v Brně, Hud-cova 60, sme získali z povodně virulentnéhovirusu izolovaného z infekčných materiálovcestou sériových pasáží na mačacej bunko-vej linii označenej FE. Homogenita víruso-vej populácie a stabilita imunobiologickýchvlastností atenuovaného kmeňa sa dosiahlaizolováním linie metodou hraničných riede-ní so šesťnásobným opakováním.
Uvedený kmeň CPVA-BN 80/82 CAPM V--290 je charakterizovaný týmito imunobiolo-gickými vlastnosťami: 252747 1. Pri dodržaní definovaných kultivačnýchpodmienok je množenie virusu na stabilně]bunkovej linii FE doprevádzané vývojom vý-razných cytopatických zmien s obsahom 105až 106 TKID50. ml-1. 2. Vakcinačný virus je neškodný pre všet-ky věkové kategorie zvierat, pričom mláďa-tá bez materinských protilátok možu byťúspěšně imunizované počnúc vekom 6 týž-dňov. 3. Vakcinačný virus sa nevylučuje z orga-nizmu očkovaných zvierat a neprenáša sana spolustajnené vnímavé zvieratá. 4. Očkovanie vnímavých zvierat vyvoláchránenosť počnúc 4. dňom po podaní vak-cíny. 5. Imunita vyvolaná jednorázovým očko-váním zvierat starších ako 12 týždňov trvánajmenej jeden rok, a je doprevádzaná prí-tomnosťou špecifických protilátok.
Stabilná buňková línia FE vykazovala prijej získaní nedostatočné rastové vlastnosti,charakterizované pomalým množením bu-niek a neschopnosťou vytvořit súvlslý mo-nolayer. Uvedené vlastnosti bunkovej linienezodpovedali nárokom na intenzívně mno-ženie uvedeného virusu so získáním viruso-vých suspenzi! s dostatočnými titrami po-třebnými pre' výrobu vakcíny. Prejavom ne-dostatočných rastových vlastností bunkovejlinie bolo aj chýbanie vývoja cytopatickýchzmien po infekcii vakcinačným kmeňom, čonedovolovalo sledovat a hodnotit stupeň po-množenia virusu. Sériovým pasážovaním bun-kovej linie FE vo vybraných médiách (MEM,BEM, M199) s obsahom novorodeneckého sé-ra sme po 25 pasážach v, médiu MEM derivo-vali populáciu buniek, ktorá vykazuje ná-sledovně vlastnosti: 1. Líniu je možné pasážovať v pomere 1 : : 3 až 1 : 4 v 72- až 96hodinových interva-loch pomocou roztoku verzén-trypsín. 2. Najvhodnejšie rastové médium je mini-málně esenciálně médium podlá Eaglea sprídavkom 5 až 15 hmot. % bovinného sé-ra. 3. Buňková líniu je možné uchovávat vzmrazenom stave pri teplotách pod —100 °C,s použitím proitekčného média, ktoré obsa-huje 10 až 20 hmot. % dimetylsulfo-xidu. 4. Množenie vakcinačného virusu je pra-videlné sprevádzané výraznými cytopatic-kými změnami na 4. až 8. deň po infekciiv závislosti od dávky virusu.
Dosiahnuté titry virusu dovofujú realizo-vat efektívnu výrobu očkovacej látky protiparvoviróze psov. Výběr kultivačného média:
Kultivačně sérum s dobrými rastovými vlastnostami pre uvedená buňková líniu mo-že obsahovat nespecifické inhibitory naj-viac v titry 1: 32, stanovenom hemaglutinač-no-inhibičným testom.
Postup výroby vakcíny:
Spósob infekcie buniek linie FE vakcinač-ným vírusom: A.
Suspenzia buniek linie FE o hustotě 5 až10.106 buniek .ml-1 v rastovom médiu sazmieša s vakcinačným vírusom pri multipli-cite infekcie od 0,0001 do 0,001. Zmes viru-su a buniek sa inkubuje pri 36 až 38 °C po-čas 30 až 60 minút. Potom sa zmes virusu abuniek nariedi v rastovom médiu, ktoré před-stavuje minimálně esenciálně médium podláEaglea s pH 6,8 až 7,3 a prídavkom piatichaž desiatich hmot. % bovinného séra s vy-značenou kvalitou. B.
Do bunkovej suspenzie v rastovom médiusa přidá inokulum vakcinačného virusu omultiplicite infekcie 0,0001 až 0 001, ktorása ihned vyleje do kultivačnej nádoby. Tak-to připravená suspenzia buniek za účelompřípravy vakcíny sa kultivuje na skle, plas-tickej hmotě, štacionárnym sposobom, ale-bo v otáčených ffašiach („rolleroch“), při-padne na mikronosičoch, pri 36 až 38 °C po-čas 4 až 8 dní. Množenie virusu je sprevá-dzané výraznými cytopatickými změnami. C.
Infekcia prichytených buniek na kultivač-nom povrchu — po štvor- až šesťhodinovejinkubácii buniek linie FE pri 36 až 38 °C. Dopastového, média sa přidá inokulum vakci-načného virusu pri multiplicite infekcie0,0001 až 0,001. Inkubácia pokračuje pri 36až 38 °C počas 4 až 8 dní. Množenie virusuje rovnako ako v bode A a B sprevádzanévýraznými cytopatickými změnami.
Zmes infekčných tekutin sa získává vtedy,keď 80 až 90 percent monolayeru vykazujespecifické změny. Takto připravená viruso-vá suspenzia sa kontroluje na přítomnostnežiadácich kontaminujúcich mikroorganiz-mov a stanoví sa obsah virusu titráciou nabuňkách linie FE. Po ukončení kultivácie savirusový materiál zmieša s lyofilizačným mé-diom v pomere 50 až 75 hmot. % virusu k50 až 25 hmot. % lyofilizačného média a u-chováva pri —15 až —20 °C až do, lyofilizá-cie. Lyofilizačné médium je možné pri za-chovaní rovnakých hmotnostných pomerov 252747 pridávať až tesne před lyofilizáciou. Na pří-pravu lyofilizovanej vakcíny sa použijú in-fekčně tekutiny s obsahom minimálně 104TKIDso . ml-1 virusu, bakteriologicky steril-ně. Homogenizovaná virusová suspenzia slyofilizačným médiom, ktoré obsahuje sa-charózu, fosforečnanový pufor, glutamátsodný alebo draselný, bovinný albumin ale-bo iný zdroj bielkovín, dextrán alebo želati-nu (BOVARNICK, M. R. — MILLER, J. C. —SYNDER, J. C.: The influence of certain salts,amoinoacids, sugars, and proteins on the sta-bility of rickettsiae. J. Bacteriol., 59, 1950,:509 — 522) sa rozplňuje do ampuliek, aleboliekoviek, lyofilizuje, vzduchotěsně uzatvá-ra a uchovává pri chladničkovej teplote. Vak-cína připravená podlá uvedeného postupuobsahuje najmenej 103 TKIDso. ml-1 vakci-načného virusu, čo· představuje jednu imu-nizačnú dávku.
Použité lyofilné médium podfa BOVAR-NICK, M. R. — MILLER, J. C. — SNYDER,J. C.: The influence of certain salts, amino-acids, sugars, and proteins on the stabilityof risketsiae. J. Bacteriol 59, 1950,: 509 až622) je vhodné aj na lyofilizáciu iných dru-hov vakcinačných vírusov. Preto ak sa při-dá do infekčnej suspenzie obsahujúcej inýdruh vakcinačného virusu, například viruspsinky, je možné tieto suspenzie navzájommiešať v íubovoTnom pomere a lyofilizovať.
Uvedené příklady predmet vynálezu nijakneobmedzujú, ani nevyčerpávajú: 1. Sposoto kultivácie:
Suspenzia buniek, připravená pomocoupro-teolytických fermentov v rastovom mé-diu, ktoré obsahuje definované množstvo a-minokyselín, a vitamínov s prídavkom 10hmot. % séra určeného pre tkanivové kul-túry sa kultivuje na skle, plastickej hmotě,štacionárnym sposobom alebo v otáčanýchffašiach (rolleroch), připadne v suspenziina mikronosičoch. 2. Spdsob infekcie buňkových kultúr vakci-načným vírusom:
Buňkové kultúry, připravené a pěstovanépodfa bodu 1, sa infikuji! vakcinačným víru-som pri multiplicite infekcie najmenej 0,001nasledovnými sposobmi: a) suspenzia buniek linie FE o hustotě10.106 buniek .ml"1 v rastovom médiu sazmieša s vakcinačným vírusom pri multipli-cite infekcie 0,001. Zmes virusu a buniek sainkubuje pri 37 °C počas 30 rninút. Potom sazmes virusu a buniek nariedi v rastovom mé-diu, ktoré představuje minimálně esenciál- ně médium podfa Eaglea s pH 7,1 a prídav-kom 10 hmot. % bovinného séra. b) do suspenzie buniek linie FE o husto-tě 5.105 .ml-1 v rastovom médiu sa přidáinokulum vakcinačného virusu o multiplici-te infekcie 0,001, a infikovaná suspenzia saihned' vyleje do- kultivačnej nádoby. Taktopřipravená suspenzia buniek za účelom pří-pravy vakcíny sa kultivuje v Rouxových ffa-šiach pri teplote 37 °C počas 6 dní. Množe-nie virusu je sprevádzané výraznými cyto-patickými změnami. c) infekcia prichytených buniek na kulti-vačnom povrchu — po šesťhodinovej kulti-vácii buniek FE pri 37 °C sa do rastového-média přidá inokulum vakcinačného virusupri multiplicite infekcie 0,001. Inkubácia po-kračuje pri 37 °C počas 6 dní. Množenie vi-rusu je rovnako ako v bode a) a b) sprevá-dzané výraznými cytopatickými změnami. 3. Zber vakcinačného virusu:
Vakcinačný virus sa produkuje v rasto-vom médiu na buňkových kultúrach pěsto-vaných podfa bodu 1 a infikovaných podfabodu 2. Po vytvoření rozsiahlych cytopatic-kých zmien stanovených mikroskopicky sakultivácia ukončí a do rastového média spomnoženým vírusom sa přidá priamo dokultivačných nádob vhodné lyofilizačné mé-dium v pomere 67 hmot. % vírusovej suspen-zie a 33 hmot. % lyofilizačného média. Zmessa ďalej uchovává v kultivačných nádobáchv zmrazenom stave až do lyofilizácie.
Homogenizovaný virusový materiál s po-žadovaným obsahom infekčných jednotiek(najmenej 104 TKIDso. ml-1), ktorý neobsa-huje kontaminujúce mikroorganizmy sa roz-plňuje do ampuliek, lyofilizuje, vzduchotěs-ně uzatvorí a uchovává pri chladničkovejteplote. Vakcína připravená podfa uvedené-ho postupu obsahuje najmenej 103·0 TKIDso. . ml"1 vakcinačného· virusu. 4. Příprava kombinovanej vakcíny:
Lyofilizačné médium, ktoré obsahuje sa-charózu, fosforečnanový pufor, glutamátsodný alebo draselný, bovinný albumin ale-bo iný zdroj bielkovín a želatinu alebo dex-trán vyhovuje aj pre lyofilizáciu iných dru-hov vakcinačných vírusov. Připravená vakcí-na proti parvoviróze psov sa mieša so živouatenuo-vanou vakcínou proti psinke v 1'ubo-vofnom pomere, rozplňuje do ampuliek, lyo-filizuje, vzduchotěsně uzatvorí a uchovávápri chladničkovej teplote. Bivalentná vak-cína připravená podfa uvedeného postupuobsahuje najmenej 103 TKIDso. ml'1 vakci-načných vírusov psinky a parvovírusu psov.

Claims (6)
Hide Dependent

  1. 252747 10 PREDMET
    1. Živá atenuovaná vakcína proti parvo-viróze psov monovalentná, lyofilizovaná, a-lebo vakcinačný komponent bivalentnej lyo-filizovanej vskcíny aj proti psinke, vyzna-čujúci sa tým, že obsahuje v 1 ml atenuova-ný kmeň parvovírusu psov CPVA-BN 80/82CAPN V-290 v množstve najmenej 103 TKIDsočastíc virusu a v případe bivalentnej vakcí-ny obsahuje ešte kmeň virusu psinky CDV--F-BN 10/83 CAPM V-289 v množstve najme-nej 103 TKIDso častíc virusu psinky.
  2. 2. Živá atenuovaná vakcína podlá bodu 1,alebo vakcinačný komponent bivalentnej lyo-filizovanej vakcíny aj proti psinke, vyzna-čujúci sa tým, že obsahuje lyofilizačné mé-dium v množstve 25 až 50 hmot. %, vztiah-nuté na hmotnost celej vakcíny.
  3. 3. Sposob výroby vakcíny pódia bodov 1a 2, vyznačujúci sa tým, že atenuovaný kmeňparvovírusu psov sa pomnožuje na stabil-nej mačacej linii buniek FE v minimálnomesenciálnom médiu pódia Eaglea s pH 6,8až 7,3 obohatenom o bovinné sérum pri tep-lotě od 36 do 38 QC po dobu 4 až 8 dní, aždo vytvorenia výrazných cytopatických zmiena potom sa virusový materiál zmieša s lyo-filizačným médiom tak, aby obsahoval mi-nimálně 104 TKIDso .ml-1.
  4. 4. Sposob výroby vakcíny pódia bodu 3,vyznačujúci sa tým, že ako přísada do kul-tivačného média sa použije bovinné sérums definovaným obsahom nespecifických in-hibítorov proti odpovedajúcemu virusu. VYNALEZU
  5. 5. Spdsob výroby vakcíny pódia bodov 3a 4, vyznačujúci sa tým, že infekcia buniekna produkciu virusu sa robí buď tak, že buň-ková suspenzia s obsahom 5 až 10.10s. mlna _1 buniek v rastovom médiu sa infikujevírusom pri MOI najmenej 0 0001 na buňku,inkubuje pri 36 až 38 °C počas 30 až 60 mi-nút, potom sa 10 až 20 krát nariedi v rasto-vom médiu, vyleje do' kultivačných nádoba kultivuje pri teplote 36 až 38 °C až do zbe-ru virusu alebo buňková suspenzia s obsa-hom 4 až 8.105. ml·1 buniek v rastovommédiu sa infikuje vírusom pri MOI najme-nej 0,0001 na buňku a inkubuje pri 36 až38 C až do zberu virusu alebo do kultivač-ných nádob sa nasadzuje buňková suspenziav rastovom médiu s obsahom 4 až 8.105.. ml“1 buniek, a kultúry sa po· 4- až 6hodi-novej inkubácii pri 36 až 38 °C infikujú pria-mo do rastového média vírusom pri MOI naj-menej 0,0001 na buňku a inkubujú až dozberu virusu.
  6. 6. Sposob výroby vakcíny podl'a bodov 3až 5, vyznačujúci sa tým, že sa k virusovýmsuspenziám přidává po ukončení inkubácielyoifilizačné médium, ktoré obsahuje sacha-rózu, fosforečnanový pufor, glutamát sodnýalebo draselný, bovinný albumin alebo inýzdroj bielkovín a želatinu alebo dextrán azmes sa uchovává až do lyofilizácie v zmra-zenom stave pri teplotách vyšších ako —20stupňov Celzía, alebo sa lyoíilízuje okamži-té.