CS252747B1 - Živá atenuovaná vakcína proti parvoviráze psov a spósob jej přípravy - Google Patents

Description

232747

Clin. North Amer., 13, 1983, 3: 551 — 556).Pri aktívnej imunizácli získavajú postupnépřevahu živé vakcíny připravené z atenuova-ných homológnych kmeňov. Po ich apliká-cii dosahujú hladiny specifických protilá-tek úroveň, ako po prirodzenej infekcii vi-rulentným kmeňom. Protilátky sa zisťujú užna 3. deň po inokulácii a prezistujú najme-nej 2 roky (CARMICHAEL, L. E. — JOUR-BERT, J. C. — POLLOCK, R. V. H..: A modi-fied live canine parvovirus vaccine. II. Im-mune response. Oornell Vet., 73, 1983,: 13až 29, KALIN, D. E. EMERGY, J. B. — SMITH,M. J. — SPOTTS, A. M.: Safety and efficacyof modiffied-live canine parvovirus vaccine.Vet. Med. Smáli Anim. Clin., 78, 1983,: 1 739až 1746). Potomstvo od imúnnych matiekje chráněné proti infekcii materskými proti-látkami, z kterých 10 % získává transpla-centárne a 90 % kolostrom. Na druhej stra-ně tieto protilátky nepriaznivo ovplyvňujúimunitnú odpověď na podanie živých aleboinaktivovaných vakcín (CARMICHAEL, L. E.— JOUBERT, J. C. — POLLOCK, R. V. H.: Amodified live canine parvovirus vaccine. II.Immune response. Cornell Vet., 73, 1983,:13 — 29; BAKER, J. A. — ROBSON, D. S. —GILLESPIE, J. Η. — ET AL.: A nomographthat predicts the age to vaccinate puppiesagainst distemper. Cornell Vet., 49, 1959,:158 — 167; CARMICHAEL, L. E. — ROBSON, D. S. — BARNES, F. D.: Transfor and dech-ne of maternal infectious canine hepatitisantibody in puppies. Proč. Soc. Exp. Biol.Med., 109, 1962,: 677 — 681). Z experimen-tálnych aj praktických skúseností vyplývá,že podmienkou pre dosiahnutie dlhodobejchránenosti je očkovanie mláďat až vo ve-ku okolo 16 až 18 týždňov.

SpQsob kultivácie parvovírusu v buňko-vých kultúrach za účelom pomnoženia viru-sového materiálu na přípravu pokusnýchvakcín popísali viacerí antori (CARMICHAEL,L. E. — JOUBERT, J. C. — POLLOCK, R. V. H.:A modified live canine parvovirus strainwith novel plaque characteristics. I. Viralattenuation and dog response. Cornell Vet.,71, 1981, 4: 408 — 427; CHURCHILL, A. E.: Apo-tency test for inactivated smáli animialparvovirus vaccines using chicks. J. biol.Standard., 10, 1982,: 1 — 8; NARA, P. L. —WINTERS, K. — RUCE, J. B. et al.: Systemicand Local intestinal antibody response indogs given both infective and inactivatedcanine parvoviruses. Amer. J. Vet. Res., 44,1983, 11: 1989 — 1 995; BERGMAN, R. —SUNDQUIST, B. — STRÍÍMAN, L.: Producti-on of a feline parvoviruses vaccine usingmonolayer cell systems in roller flasks andmicrocarriers. Develop. biol. Standard., 55, 1984,: 77 — 78). Použili najma primárné kul-túry mačacích a psích embryomálnych bu-niek, alebo z nich připravené stabilně buňko-vé linie. Infekciu buniek robili obvykle za4 až 6 hodin po nasadení do kultivačnýchnádob. Nakolko množenie virusu nebolo do-prevádzané pravidelným vývojom cytopatic-kých zmien, kontrolovali obsah virusu v tka-nivových tekutinách na základe přítomnos-ti intranukleárnych teliesok, imunofluores-centnou metodou, připadne výšky hema-glutinačného titru. Pri infekcii buniek sačasto používal oplach fyziologickým rozto-koím a výměna kultivačného média. Velko-výrobná technológia výroby vakcín vyžadujevšak minimálně množstvo operácií a podlámožnosti priamu, pohotovu a presvedčivúmikroskopická kontrolu množenia virusu nazáklade špecifických cytopatických zmien.Táto úloha bola vyriešená následovně:

Bola připravená živá atenuovaná vakcínaproti parvoviróze psov, monovalentná, lyo-filizovaná, alebo vakcinačný komponent biva-lentnej lyofilizovanej vakcíny aj proti (psin-ke, ktorá obsahuje v 1 ml atenuovaný kmenparvovírusu psov CPVA-BN 80/82 CAMP V--290 v množstve najmenej 103 TKIDso častícvirusu a v případe bivalentnej vakcíny ob-sahuje ešte kmen virusu psinky CDV-F-BN10/83 CAPM V-289 v množstve najmenej 103TKIDso častíc virusu psinky.

Uvedený virusový kmeň bol adaptovanýna kultúry buniek stabilnej mačacej linieFE. Ako rastové médium bolo použité mini-málně esenciálně médium podlá Eaglea o-bohatené o bovinné sérum, v ktorom sa vi-rus pomnožoval pri teplote 36 až 38 °C podobu 4 až 8 dní. Po- vytvoření zřetelných cy-topatických zmien sa virusový materiál zmie-šal s lyofilízačným médiom tak, aby obsa-hoval minimálně 104 TKIDso častíc virusuenteritídy psov v 1 ml.

Virusový kmeň parvovírusu psov s ozna-čením CPVA-BN 80/82 a zbierkovým číslomCAPM V-290, uložený v Československejzbierke mikroorganizmov na Výskumno-m ú-stave veterinárneho lekárstva v Brně, Hud-cova 60, sme získali z povodně virulentnéhovirusu izolovaného z infekčných materiálovcestou sériových pasáží na mačacej bunko-vej linii označenej FE. Homogenita víruso-vej populácie a stabilita imunobiologickýchvlastností atenuovaného kmeňa sa dosiahlaizolováním linie metodou hraničných riede-ní so šesťnásobným opakováním.

Uvedený kmeň CPVA-BN 80/82 CAPM V--290 je charakterizovaný týmito imunobiolo-gickými vlastnosťami: 252747 1. Pri dodržaní definovaných kultivačnýchpodmienok je množenie virusu na stabilně]bunkovej linii FE doprevádzané vývojom vý-razných cytopatických zmien s obsahom 105až 106 TKID50. ml-1. 2. Vakcinačný virus je neškodný pre všet-ky věkové kategorie zvierat, pričom mláďa-tá bez materinských protilátok možu byťúspěšně imunizované počnúc vekom 6 týž-dňov. 3. Vakcinačný virus sa nevylučuje z orga-nizmu očkovaných zvierat a neprenáša sana spolustajnené vnímavé zvieratá. 4. Očkovanie vnímavých zvierat vyvoláchránenosť počnúc 4. dňom po podaní vak-cíny. 5. Imunita vyvolaná jednorázovým očko-váním zvierat starších ako 12 týždňov trvánajmenej jeden rok, a je doprevádzaná prí-tomnosťou špecifických protilátok.

Stabilná buňková línia FE vykazovala prijej získaní nedostatočné rastové vlastnosti,charakterizované pomalým množením bu-niek a neschopnosťou vytvořit súvlslý mo-nolayer. Uvedené vlastnosti bunkovej linienezodpovedali nárokom na intenzívně mno-ženie uvedeného virusu so získáním viruso-vých suspenzi! s dostatočnými titrami po-třebnými pre' výrobu vakcíny. Prejavom ne-dostatočných rastových vlastností bunkovejlinie bolo aj chýbanie vývoja cytopatickýchzmien po infekcii vakcinačným kmeňom, čonedovolovalo sledovat a hodnotit stupeň po-množenia virusu. Sériovým pasážovaním bun-kovej linie FE vo vybraných médiách (MEM,BEM, M199) s obsahom novorodeneckého sé-ra sme po 25 pasážach v, médiu MEM derivo-vali populáciu buniek, ktorá vykazuje ná-sledovně vlastnosti: 1. Líniu je možné pasážovať v pomere 1 : : 3 až 1 : 4 v 72- až 96hodinových interva-loch pomocou roztoku verzén-trypsín. 2. Najvhodnejšie rastové médium je mini-málně esenciálně médium podlá Eaglea sprídavkom 5 až 15 hmot. % bovinného sé-ra. 3. Buňková líniu je možné uchovávat vzmrazenom stave pri teplotách pod —100 °C,s použitím proitekčného média, ktoré obsa-huje 10 až 20 hmot. % dimetylsulfo-xidu. 4. Množenie vakcinačného virusu je pra-videlné sprevádzané výraznými cytopatic-kými změnami na 4. až 8. deň po infekciiv závislosti od dávky virusu.

Dosiahnuté titry virusu dovofujú realizo-vat efektívnu výrobu očkovacej látky protiparvoviróze psov. Výběr kultivačného média:

Kultivačně sérum s dobrými rastovými vlastnostami pre uvedená buňková líniu mo-že obsahovat nespecifické inhibitory naj-viac v titry 1: 32, stanovenom hemaglutinač-no-inhibičným testom.

Postup výroby vakcíny:

Spósob infekcie buniek linie FE vakcinač-ným vírusom: A.

Suspenzia buniek linie FE o hustotě 5 až10.106 buniek .ml-1 v rastovom médiu sazmieša s vakcinačným vírusom pri multipli-cite infekcie od 0,0001 do 0,001. Zmes viru-su a buniek sa inkubuje pri 36 až 38 °C po-čas 30 až 60 minút. Potom sa zmes virusu abuniek nariedi v rastovom médiu, ktoré před-stavuje minimálně esenciálně médium podláEaglea s pH 6,8 až 7,3 a prídavkom piatichaž desiatich hmot. % bovinného séra s vy-značenou kvalitou. B.

Do bunkovej suspenzie v rastovom médiusa přidá inokulum vakcinačného virusu omultiplicite infekcie 0,0001 až 0 001, ktorása ihned vyleje do kultivačnej nádoby. Tak-to připravená suspenzia buniek za účelompřípravy vakcíny sa kultivuje na skle, plas-tickej hmotě, štacionárnym sposobom, ale-bo v otáčených ffašiach („rolleroch“), při-padne na mikronosičoch, pri 36 až 38 °C po-čas 4 až 8 dní. Množenie virusu je sprevá-dzané výraznými cytopatickými změnami. C.

Infekcia prichytených buniek na kultivač-nom povrchu — po štvor- až šesťhodinovejinkubácii buniek linie FE pri 36 až 38 °C. Dopastového, média sa přidá inokulum vakci-načného virusu pri multiplicite infekcie0,0001 až 0,001. Inkubácia pokračuje pri 36až 38 °C počas 4 až 8 dní. Množenie virusuje rovnako ako v bode A a B sprevádzanévýraznými cytopatickými změnami.

Zmes infekčných tekutin sa získává vtedy,keď 80 až 90 percent monolayeru vykazujespecifické změny. Takto připravená viruso-vá suspenzia sa kontroluje na přítomnostnežiadácich kontaminujúcich mikroorganiz-mov a stanoví sa obsah virusu titráciou nabuňkách linie FE. Po ukončení kultivácie savirusový materiál zmieša s lyofilizačným mé-diom v pomere 50 až 75 hmot. % virusu k50 až 25 hmot. % lyofilizačného média a u-chováva pri —15 až —20 °C až do, lyofilizá-cie. Lyofilizačné médium je možné pri za-chovaní rovnakých hmotnostných pomerov 252747 pridávať až tesne před lyofilizáciou. Na pří-pravu lyofilizovanej vakcíny sa použijú in-fekčně tekutiny s obsahom minimálně 104TKIDso . ml-1 virusu, bakteriologicky steril-ně. Homogenizovaná virusová suspenzia slyofilizačným médiom, ktoré obsahuje sa-charózu, fosforečnanový pufor, glutamátsodný alebo draselný, bovinný albumin ale-bo iný zdroj bielkovín, dextrán alebo želati-nu (BOVARNICK, M. R. — MILLER, J. C. —SYNDER, J. C.: The influence of certain salts,amoinoacids, sugars, and proteins on the sta-bility of rickettsiae. J. Bacteriol., 59, 1950,:509 — 522) sa rozplňuje do ampuliek, aleboliekoviek, lyofilizuje, vzduchotěsně uzatvá-ra a uchovává pri chladničkovej teplote. Vak-cína připravená podlá uvedeného postupuobsahuje najmenej 103 TKIDso. ml-1 vakci-načného virusu, čo· představuje jednu imu-nizačnú dávku.

Použité lyofilné médium podfa BOVAR-NICK, M. R. — MILLER, J. C. — SNYDER,J. C.: The influence of certain salts, amino-acids, sugars, and proteins on the stabilityof risketsiae. J. Bacteriol 59, 1950,: 509 až622) je vhodné aj na lyofilizáciu iných dru-hov vakcinačných vírusov. Preto ak sa při-dá do infekčnej suspenzie obsahujúcej inýdruh vakcinačného virusu, například viruspsinky, je možné tieto suspenzie navzájommiešať v íubovoTnom pomere a lyofilizovať.

Uvedené příklady predmet vynálezu nijakneobmedzujú, ani nevyčerpávajú: 1. Sposoto kultivácie:

Suspenzia buniek, připravená pomocoupro-teolytických fermentov v rastovom mé-diu, ktoré obsahuje definované množstvo a-minokyselín, a vitamínov s prídavkom 10hmot. % séra určeného pre tkanivové kul-túry sa kultivuje na skle, plastickej hmotě,štacionárnym sposobom alebo v otáčanýchffašiach (rolleroch), připadne v suspenziina mikronosičoch. 2. Spdsob infekcie buňkových kultúr vakci-načným vírusom:

Buňkové kultúry, připravené a pěstovanépodfa bodu 1, sa infikuji! vakcinačným víru-som pri multiplicite infekcie najmenej 0,001nasledovnými sposobmi: a) suspenzia buniek linie FE o hustotě10.106 buniek .ml"1 v rastovom médiu sazmieša s vakcinačným vírusom pri multipli-cite infekcie 0,001. Zmes virusu a buniek sainkubuje pri 37 °C počas 30 rninút. Potom sazmes virusu a buniek nariedi v rastovom mé-diu, ktoré představuje minimálně esenciál- ně médium podfa Eaglea s pH 7,1 a prídav-kom 10 hmot. % bovinného séra. b) do suspenzie buniek linie FE o husto-tě 5.105 .ml-1 v rastovom médiu sa přidáinokulum vakcinačného virusu o multiplici-te infekcie 0,001, a infikovaná suspenzia saihned' vyleje do- kultivačnej nádoby. Taktopřipravená suspenzia buniek za účelom pří-pravy vakcíny sa kultivuje v Rouxových ffa-šiach pri teplote 37 °C počas 6 dní. Množe-nie virusu je sprevádzané výraznými cyto-patickými změnami. c) infekcia prichytených buniek na kulti-vačnom povrchu — po šesťhodinovej kulti-vácii buniek FE pri 37 °C sa do rastového-média přidá inokulum vakcinačného virusupri multiplicite infekcie 0,001. Inkubácia po-kračuje pri 37 °C počas 6 dní. Množenie vi-rusu je rovnako ako v bode a) a b) sprevá-dzané výraznými cytopatickými změnami. 3. Zber vakcinačného virusu:

Vakcinačný virus sa produkuje v rasto-vom médiu na buňkových kultúrach pěsto-vaných podfa bodu 1 a infikovaných podfabodu 2. Po vytvoření rozsiahlych cytopatic-kých zmien stanovených mikroskopicky sakultivácia ukončí a do rastového média spomnoženým vírusom sa přidá priamo dokultivačných nádob vhodné lyofilizačné mé-dium v pomere 67 hmot. % vírusovej suspen-zie a 33 hmot. % lyofilizačného média. Zmessa ďalej uchovává v kultivačných nádobáchv zmrazenom stave až do lyofilizácie.

Homogenizovaný virusový materiál s po-žadovaným obsahom infekčných jednotiek(najmenej 104 TKIDso. ml-1), ktorý neobsa-huje kontaminujúce mikroorganizmy sa roz-plňuje do ampuliek, lyofilizuje, vzduchotěs-ně uzatvorí a uchovává pri chladničkovejteplote. Vakcína připravená podfa uvedené-ho postupu obsahuje najmenej 103·0 TKIDso. . ml"1 vakcinačného· virusu. 4. Příprava kombinovanej vakcíny:

Lyofilizačné médium, ktoré obsahuje sa-charózu, fosforečnanový pufor, glutamátsodný alebo draselný, bovinný albumin ale-bo iný zdroj bielkovín a želatinu alebo dex-trán vyhovuje aj pre lyofilizáciu iných dru-hov vakcinačných vírusov. Připravená vakcí-na proti parvoviróze psov sa mieša so živouatenuo-vanou vakcínou proti psinke v 1'ubo-vofnom pomere, rozplňuje do ampuliek, lyo-filizuje, vzduchotěsně uzatvorí a uchovávápri chladničkovej teplote. Bivalentná vak-cína připravená podfa uvedeného postupuobsahuje najmenej 103 TKIDso. ml'1 vakci-načných vírusov psinky a parvovírusu psov.

Claims (6)

1. 252747 10 PREDMET

   1. Živá atenuovaná vakcína proti parvo-viróze psov monovalentná, lyofilizovaná, a-lebo vakcinačný komponent bivalentnej lyo-filizovanej vskcíny aj proti psinke, vyzna-čujúci sa tým, že obsahuje v 1 ml atenuova-ný kmeň parvovírusu psov CPVA-BN 80/82CAPN V-290 v množstve najmenej 103 TKIDsočastíc virusu a v případe bivalentnej vakcí-ny obsahuje ešte kmeň virusu psinky CDV--F-BN 10/83 CAPM V-289 v množstve najme-nej 103 TKIDso častíc virusu psinky.
2. 2. Živá atenuovaná vakcína podlá bodu 1,alebo vakcinačný komponent bivalentnej lyo-filizovanej vakcíny aj proti psinke, vyzna-čujúci sa tým, že obsahuje lyofilizačné mé-dium v množstve 25 až 50 hmot. %, vztiah-nuté na hmotnost celej vakcíny.
3. 3. Sposob výroby vakcíny pódia bodov 1a 2, vyznačujúci sa tým, že atenuovaný kmeňparvovírusu psov sa pomnožuje na stabil-nej mačacej linii buniek FE v minimálnomesenciálnom médiu pódia Eaglea s pH 6,8až 7,3 obohatenom o bovinné sérum pri tep-lotě od 36 do 38 QC po dobu 4 až 8 dní, aždo vytvorenia výrazných cytopatických zmiena potom sa virusový materiál zmieša s lyo-filizačným médiom tak, aby obsahoval mi-nimálně 104 TKIDso .ml-1.
4. 4. Sposob výroby vakcíny pódia bodu 3,vyznačujúci sa tým, že ako přísada do kul-tivačného média sa použije bovinné sérums definovaným obsahom nespecifických in-hibítorov proti odpovedajúcemu virusu. VYNALEZU
5. 5. Spdsob výroby vakcíny pódia bodov 3a 4, vyznačujúci sa tým, že infekcia buniekna produkciu virusu sa robí buď tak, že buň-ková suspenzia s obsahom 5 až 10.10s. mlna _1 buniek v rastovom médiu sa infikujevírusom pri MOI najmenej 0 0001 na buňku,inkubuje pri 36 až 38 °C počas 30 až 60 mi-nút, potom sa 10 až 20 krát nariedi v rasto-vom médiu, vyleje do' kultivačných nádoba kultivuje pri teplote 36 až 38 °C až do zbe-ru virusu alebo buňková suspenzia s obsa-hom 4 až 8.105. ml·1 buniek v rastovommédiu sa infikuje vírusom pri MOI najme-nej 0,0001 na buňku a inkubuje pri 36 až38 C až do zberu virusu alebo do kultivač-ných nádob sa nasadzuje buňková suspenziav rastovom médiu s obsahom 4 až 8.105.. ml“1 buniek, a kultúry sa po· 4- až 6hodi-novej inkubácii pri 36 až 38 °C infikujú pria-mo do rastového média vírusom pri MOI naj-menej 0,0001 na buňku a inkubujú až dozberu virusu.
6. 6. Sposob výroby vakcíny podl'a bodov 3až 5, vyznačujúci sa tým, že sa k virusovýmsuspenziám přidává po ukončení inkubácielyoifilizačné médium, ktoré obsahuje sacha-rózu, fosforečnanový pufor, glutamát sodnýalebo draselný, bovinný albumin alebo inýzdroj bielkovín a želatinu alebo dextrán azmes sa uchovává až do lyofilizácie v zmra-zenom stave pri teplotách vyšších ako —20stupňov Celzía, alebo sa lyoíilízuje okamži-té.