CS252746B1 - Živá atenuovaná vakcína proti, panleukopénii mačiek a sposob jej přípravy - Google Patents

Description

252746

Vynález sa týká živej atenuovanej vakcí-ny proti panleukopénii mačiek a sposobu Jejpřípravy.

Panleukopénia mačiek představuje hro-madné ochorenie zažívacích ústrojov, ktorésa klinicky prejavuje nechutenstvom, malát-nosťou, zvracaní-m a hnačkou, ktorá móžebyť krvavá. Zvieratá majú horúčku a pri he-mato-logickom vyšetření sa zisťuje zníženýpočet leukocytov.

Ochorenie sposobuje významné straty vstavoch mačiek, pričom úhyn představuje20 až 50 % z celkového počtu zvierat. Ocho-renie postihuje všetky věkové kategorie zvie-rat, ale najma mláďatá, pričom nástup jeprudký a priebeh velmi rýchly (JOHNSON,R. H.: Feline panleucopenia. Vet. Rec., March29th, 1969,: 338 — 340).

Povodcom ochorenia je virus z čelade Par-voviridae, ktorého částice sú izomerické, ne-obalené a obsahujú dezoxyribonukleovú ky-selinu. Virus sa replikuje v bunkovom jadre,a to iba v určitých fáaach buňkového cy-klu, preto je jeho- pestovanie in vitro poměr-ně obtiažne (O‘REILLY, K. J. — WHITAKER, A. M.: The development of feline cell linešfor the growth of feline infectious enteritis/panleucopaenia/ virus. J. Hyg. Camb., 67,1969, :115; FLAGSTAD, A.: Studies on thegrowth of feline panleucopaenia virus in cellcultures. Acta. Path. microbiol. scand. Séct., B, 1975, 83: 71 — 78; O‘SHEA, J. D. — STUD-DERT, M. J.: Growth of an autonomously rep-licating parvovirus /Feline Panleukopenia/:Kinetics and morphogenesis. Arch. Virol., 57,1978, :107 — 122; ENDO, M. SHINAGAWA,M. — GOTO, Η. — ET AL.: Growth characte-rististics of feline panleukopenia virus insynchronized kitten kidney cells. Jpn. J. Vet.Sci., 43, 1981,: 65 — 70).

Specifická profylaxia je založená na pasív-nej imunizácii podáním hyperimúnneho- séraalebo' imúninych sérových globulínov, alenajčastejšie sa využívá aktívna imunizácia.Spočiatku sa používali očkovacie látky, in-aktivované a skůr živé připravené z viru-su panleukopénie mačiek (ERHARDT, W.:Ober die Anwendung von Passiv- und Aktiv-Impfstoffen gegen die Panleukopenie derKatzen. Berl. Miinch. Tierárztl. Wschr., 90,1977,: 337 — 340; CHAPPUIS, G. — PETER-MANN, H. G.: Zur Prophylaxe von Viruskran-kheiten der Katze. Prakt. Tierarzt. 2, 1979,:112 — 115; POVEY, R. CH. — KOONSE, H. —HAYS, Μ. B.: Immunogenicity and safety ofan inactivated vaccine for the preventi-o-n of rhinotracheitis, caliciviral disease, andpanleukopenia in cats. JAVMA, 177, 19814: 347 — 350).

Nevýhodou inaktivovaných vakcín je, žeich účinnost je významné ovplyvňovaná naj-ma přítomnostem materských protilátek aobsahem účinného antigénu. Imunita trválen krátku dobu — niekofko mesiacov, pri-čom chrání len proti subklinickej infekcii,ale z hradiska tlmenia nákazy je významná skutečnost, že takéto očkovanie nezabrániintenzívnemu vylučovaniu virulentného viru-su do prostredia. V poslednom období získa-li převahu živé vakcíny, ktoré obsahujú vi-rus oslabený sériovým pasážovainím na buň-kových kultúrach. Po ich aplikácii dosahujúhladiny specifických protilátek úroveň, akopo prirodzenej infekcii virulentným kme-ňom. Protilátky sa zisťujú už na 3. deň poinokulácii a perzistujú najmenej 2 roky. Po-tomstvo- od imúnnych matiek je chráněnéproti infekcii materskými protilátkami, z kte-rých 10 % získává transplacentárne a 90 %kolostrom. Na druhej straně tieto protilátkynapriaznivu ovplyvňujú imunitnú odpověďna podanie živých aleboi inaktivovaných vak-cín (SICOTT, F. W. — CSIZA, C. K. — GIL-LESPIE, J. H.: Maternally derived immunityto feline panleukopenia. JAVMA, 156, 1970,4: 439 — 453). Z experimentálnych aj prak-tických skúseností vyplývá, že podmienkoupre dosiahnutie dlhodobej chránenosti jeočkovanie mláďat až vo veku okolo 16 až 18týždňov.

Sposob kultivácie parvovírusu v buňko-vých kultúrach za účelom pomnoženia viru-sového materiálu na přípravu pokusnýchvakcín popísali viacerí autoři (GORMAN, J.R. — HARTSOUGH, G. R. — BURGER, D. —ET AL.: The preliminary use of attenuatedfeline panleukopenia virus to protéct catsagainst panleukopenia and mink against vi-rus enteritis. Cornell Vet., 55, 1965,: 559 —566; MOCHIZUKI, M. — KONISHI, S. — OGA-TA, M.: Studies on feline panleukopenia. II.Antigenicities of .the virus. Jpn. J. vet. Sci.,40, 1978, 4: 375 — 383; BERGMAN, R. —SUNDQUIST, B. — STROMAN, L. Produc-tion of a feline parvovirus vaccine u-siing mo-nalayer cell systéme in roller flasks and mic-rocarriers. Develop. biol. Standard., 55, 1984,:77 — 78). Použili najma primárné kultúrymačacích a psích embryonálnych buniek a-lebo z nich připravené stabilně buňkové li-nie. Infekciu buniek robili obvykle za 4 až6 hodin po nasadení do· kultivačných nádob.Nakolko množenie virusu nebolo doprevá-dzané pravidelným vývojom cytopatickýchzmien, kontrolovali obsah virusu v tkanivo-vých tekutinách na základe přítomnosti in-tranukleárnych teliesok, imunofluorescent-nou metodou připadne výšky hemaglutinač-ného titru. Pri infekcii buniek sa často po-užíval oplach fyziologickým r-oztokom a vý-měna kultivačného média. Velkovýrobnětechnológia výroby vakcín vyžaduje však mi-nimálně množstvo operácií a pódia možnos-ti priamu, pohotovú a presvedčivú mikro-skopickú kontrolu množenia virusu na zá-klade Specifických cytopatických zmien. Táto úloha bola vyriešená následovně:

Bola připravená živá lyofilizovaná vakcí-na proti panleukopénii mačiek, lyofilizova-ná, ktorá obsahuje v 1 ml najmenej 103 5 TKIDso častíc virusu panleukopénie mačiek,kmeň FPVA-BN 110/83 CAPM V-291.

Uvedený virusový kmeň bol adaptovanýna kultúry buniek stabilně] mačacej linieFE. Ako rastové médium bolo použité mini-málně esenciálně médium podlá Eaglea obo-hatené o bovínne sérum, v ktorom sa viruspomnožoval pri teplote 36 až 38 °C po dobu4 až 8 dní. Po vytvoření zřetelných eytopa-tických zmien sa virusový materiál zmiešals lyofilizačným médiom tak, aby obsahovalminimálně 104 TKIDso častíc virusu enterití-dy mačiek v 1 ml.

Virusový kmeň panleukopénie mačiek soznačením FPVA-BN 110/83 a zbierkovýmčíslom CAPM V-291 uložený v Českosloven-ské] zbierke mikroorganizmov na Výskum-nom ústave veterinárneho lekárstva v Brně,Hudcova 60, sme získali z povodně virulent-ného virusu izolovaného z infekčných mate-riálov cestou sériových pasáži na mačacejbuňkové] linii označené] FE. Homogenita ví-rusovej populácie a stabilita imunohiologic-kých vlastností atenuovaného kmeňa sa do-siahla izolováním linie metodou hraničnýchriedení so šesťnásobným opakováním.

Uvedený kmeň FPVA-BN 110/83 CAPM V--291 je charakterizovaný týmito imunobiolo-gickými vlastnosťami: 1. Pri dodržaní definovaných kultivačnýchpodmienok je množenie virusu na stabilně]buňkové] linii FE doprevádzané vývojom vý-razných cytopatických zmien s obsahom 105až 10e TKIDso . ml-1. 2. Vakcinačný virus je neškodný pre všet-ky věkové kategorie zvierat, pričom mláďa-tá bez materinských protilátok možu byť ú-spešne imunizované počnúc vekom 6 týž-dňov. 3. Vakcinačný virus sa nevylučuje z orga-nizmu očkovaných zvierat a neprenáša sa naspoluustajnené vnímavé zvieratá. 4. Očkovanie vnímavých zvierat vyvoláchránenosť počnúc 4. dňom po podaní vak-cíny. 5. Imunita vyvolaná jednorázovým očko-váním zvierat starších ako 12 týždňov trvánajmenej jeden rok, a je doprevádzaná prí-tomnosťou specifických protilátok.

Stabilná buňková línia FE, vykazovala prijej získaní nedostatočné rastové vlastnosti,charakterizované pomalým množením bunieka neschopnosťou vytvořit súvislý monolayer.Uvedené vlastnosti bunkovej linie nezodpo-vedali nárokom na intenzívně množenie u-vedeného virusu so získáním virusových sus-penzi! s dostatočnými titrami potřebnými prevýrobu vakcíny. Prejavom nedostatočnýchrastových vlastností bunkovej linie bolo ajchýbanie vývoja cytopatických zmien po in-fekcii vakcinačným kmeňom, čo nedovolo-valo sledovat a hodnotit stupeň pomnoženiavýrusu. Sériovým pasážovaním bunkovej li-nie FE vo vybraných médiách (MEM, BEM, M199) s obsahom novorodeneckého séra smepo 25 pasážach v médiu MEN derivovali po-puláciu buniek, ktorá vykazuje následovněvlastnosti: 1. Líniu je možné pasážovať v pomere 1: : 3 až 1: 4 v 72 až 96 hodinových intervalechpomocou roztoku verzén-trypsín. 2. Najvhodnejšie rastové médium je mini-málně esenciálně médium podl'a Eaglea spřídavkem 5 až 15 hmot. percent bovínné-ho séra. 3. Buňková líniu je možné uchovávat vzmrazenom stave pri teplotách pod —100 °C,s použitím protekčného média, ktoré obsa-huje 10 až 20 hmotnostných percent dime-tylsulfoxidu. 4. Množenie vakcinačného virusu je pra-videlné sprevádzané výraznými cytopatický-mi změnami na 4. až 8. deň po infekcii v zá-vislosti od dávky virusu.

Dosiahnuté titry virusu dovofujú realizo-vat efektívnu výrobu očkovacej látky protipanleukopénii mačiek. Výběr kultivačného séra:

Kultivačně sérum s dobrými rastovýmivlastnosťami pre uvedenu bunkovú líniu mo-že obsahovat nešpecifické inhibitory najviacv titry 1: 32, stanovenom hemaglutinačno--inhibičným testom.

Postup výroby vakcíny:

Spósob infekcie buniek FE vakcinačnýmvírusom: A.

Suspenzia bunieik linie FE o hustotě 5 až10.10s buniek .ml-1 v rastovom médiu sazmieša s vakcinačným vírusom pri multipli-cite infekcie od 0,0001 do 0,001. Zmes viru-su a buniek sa inkubuje pri 36 až 38 °C po-čas 30 až 60 minút. Potom sa zmes virusua buniek nariedi v rastovom médiu, ktorépředstavuje minimálně esenciálně médiumpodlá Eaglea s pH 6,8 až 7,3 a prídavkompiatich až desiatich hmotnostných percentbovinného séra s vyznačenou kvalitou. B.

Do bunkovej suspenzie v rastovom médiusa přidá inokulum vakcinačného· virusu omultiplicite infekcie 0,0001 až 0,001, ktorása ihned' vyleje do kultivačnej nádoby. Tak-to připravená suspenzia buniek za účelompřípravy sa kultivuje na skle, plastickej hmo-tě, štacionárnym sposobom, alebo v otáča-ných ffašiach („rolleroch“), připadne namikronosičoch, pri 36 až 38 °C počas 4 až8 dní. Množenie virusu je sprevádzané vý-raznými cytopatickými změnami. 252746 C.

Infekcia prichytených buniek na kultivač-nom povrchu — po štvor- až šesťhodinovejinkubácii buniek linie FE pri 36 až 38 °C.Do rastového média sa přidá inokulum vak-cinačného virusu pri multiplicite infekcie0,0001 až 0,001. Inkubácia pokračuje pri 36až 38 °C počas 4 až 8 dní. Množenie virusuje rovnako ako v bode A a B sprevádzanévýraznými cytopatickými změnami.

Zmes infekčných tekutin sa získává vte-dy, keď 80 až 90 percent monolayeru vyka-zuje specifické změny. Takto připravená vi-rusová suspenzia sa kontroluje na přítom-nost' nežiadúcich kontaminujúcich mikro-organizmov a stanoví sa obsah virusu titrá-ciou na buňkách linie FE. Po ukončení kul-tivácie sa virusový materiál zmieša s lyofi-lizačným médiom v pomere 50 až 75 hmot-nostných percent virusu k 50 až 25 hmot-nostným percentám lyofilizačného média auchovává pri —15 až —20 °C až do lyofili-zácie. Lyofilizačné médium je možné pri za-chovaní rovnakých hmotnostných pomerovpřidávat až tesne před lyofilizáciou. Na pří-pravu lyofilizovanej vakcíny sa použijú in-fekčně tekutiny s obsahom minimálně 104TKIDso . ml"1vírusu, bakteriologicky steril-ně. Homogenizovaná virusová suspenzia slyofilizačným médiom, ktoré obsahuje sacha-rózu, fosforečnanový pufor, glutamát sod-ný alebo draselný, bovinný albumin aleboiný zdroj bielkovín, dextran alebo želatinu(BOVARNICK, M. R. — MILLER, J. C. — SYN-DER, J. C.: The influence of certain salts, a-monoacidis, sugars, aMd proteins on the sta-bility of rickettsiae. J. Bacteriol., 59, 1950,:509 — 522) sa rozplňuje do ampuliek, ale-bo liekoviek, lyofilizuje, vzduchotěsně uza-tvára a uchovává pri chladničkovej teplote.Vakcína připravená podl'a uvedeného po-stupu obsahuje najmenej 103 TKIDso. ml"1vakcinačného virusu, čo představuje jednuimunizačnú dávku.

Použité lyofilné médium podlá BOVAR-NICK, M. R. — MILLER, J. C. — SNYDER, J. C.: The influence of certain salts, aminoa-cids, sugars, and proteins on the stability ofrickettsiae. J. Bacteriol 59, 1950,: 509 — 552)je vhodné aj na lyofilizáciu iných druhovvakcinačných vírusov, Preto ak sa přidá doinfekčnej suspenzie obsahujúcej iný druhvakcinačného virusu, například virus psin-ky, je možné tieto suspenzie navzájom mie-šať v 1'ubovoínom pomere a lyofilizovať.

Uvedené příklady predmet vynálezu nijakneohmedzujú ani nevyčerpávajú: 1. Sposob kultivácie:

Suspenzia buniek, připravená pomocouproteolytických fermentov v rastovom mé-diu, ktoré obsahuje definované množstvo a-minokyselín, a vitamínov s prídavkom 10hmot. % séra určeného pre tkanivové kul- tury sa kultivuje na skle, plastickej hmotě,štacionárnym sposobom alebo v otáčanýchflašiach (rolleroch), připadne v suspenziina mikronosičoch. 2. Sposob infekcie buňkových kultúr vakci-načným virusem:

Buňkové kultúry, připravené a pěstovanépodlá bodu 1. sa infikujú vakcinačným ví-rusom pri multiplicite infekcie najmenej0,001 nasledovnými spósobmi: a)

Suspenzia buniek linie FE o hustotě 10. . 10tí buniek .ml"1 v rastovom médiu sa zmie-ša s vakcinačným vírusom pri multipliciteinfekcie 0,001. Zmes virusu a buniek sa in-kubuje pri 37 °C počas 30 minút. Potom sazmes virusu a buniek nariedi v rastovommédiu, ktoré představuje minimálně esen-ciálně médium podlá Eaglea s pH 7,1 a prí-davkom 10 hmot. % bovinného séra. b)

Do suspenzie buniek linie FE o hustotě5 .105. ml“1v rastovom médiu sa přidá ino-kulum vakcinačného virusu o multipliciteinfekcie 0,0001, a infikovaná suspenzia saihned' vyleje do- kultivačnej nádoby. Taktopřipravená suspenzia buniek za účelom pří-pravy vakcíny sa kultivuje v Rouxových fTa-šiach pri teplote 37 °C počas 6 dní. Množe-nie virusu je sprevádzané výraznými cyto-patickými změnami. c)

Infekcia prichytených buniek na kultivač-noím povrchu po šesťhodinovej kultivácii bu-niek linie FE pri 37 °C sa do rastového mé-dia přidá inokulum vakcinačného virusu primultiplicite infekcie 0,001. Inkubácia pokra-čuje pri 37 aC počas 6 dní. Množenie virusuje rovnako ako v bode a] a b) sprevádzanévýraznými cytopatickými změnami. 3. Zber vakcinačného virusu:

Vakcinačný virus sa produkuje v rastovommédiu na buňkových kulturách pěstovanýchpodlá bodu 1 a infikovaných podfa bodu 2. Po vytvoření rozsiahlych cytopatickýchzmien stanovených mikroskopicky sa kulti-vácia ukončí a do rastového média s po-množeným vírusom sa přidá priamo do kul-tivačných nádob vhodné lyofilizačné médi-um v pomere 67 hmot. % vírusovej suspen-zie a 33 hmot. percent lyofilizačného mé-dia. Zmes sa ďalej uchovává v kultivačnýchnádobách v zmrazenom stave až do lyofili-zácie.

Homogenizovaný virusový materiál s po-žadovaným obsahom infekčných jednotiek(najmenej 104 TKIDso. ml"1), ktorý neobsa-

Claims (6)

1. 252746 10 huje kontaminujúce mikroorganizmy sa roz-plňuje do ampuliek, lyofilizuje, vzduchotěs-ně uzatvorí a uchovává pri chladničkovej teplote. Vakcína připravená pódia uvedené-ho postupu obsahuje najmenej 103-° TKIDso.. ml"1 vakcinačného virusu. PREDMET

   1. Živá atenuovaná vakcína proti panleu-kopénii mačiek, vyznačujúca sa tým, že ob-sahuje v 1 ml najmene] 103 TKIDso častíc vi-rusu panleukopénie mačiek, kmen FPVA-BN110/83 CAPM V-291 adaptovaný na buňkovékultury.
2. 2. Živá atenuovaná vakcína proti panleu-kopénii mačiek podlá bodu 1, vyznačujúcasa tým, že obsahuje lyofilizačné médium vmnožstve 25 až 50 hmot. percent, vztiahnu-té ;na hmotnost celej vakcíny.
3. 3. Sposob víroby vakcíny pódia bodov 1a 2, vyznačujúci sa tým, že atenuovaný kmeňpanleukopénie mačiek sa pomnožuje na sta-bilnej mačacej linii buniek FE v minimál-nom esenciálnom médiu pódia Eaglea s pH 6,8 až 7,3 obohatenom o bovinné sérum priteplote od 36 do 38 °C po dobu 4 až 8 dní,až do vytvorenia výrazných cytopatickýchzmien a potom sa virusový materiál zmiešas lyofilizačným médiom tak, aby obsahovalminimálně 104 TKIDso . ml“1.
4. 4. Sposob výroby vakcíny pódia bodu 3,vyznačujúci sa tým, že ako přísada do kul-tivačného média sa použije bovinné sérums definovaným obsahom nespecifických inhi-bítorov proti odpovedajúcemu virusu.
5. 5. Sposob výroby vakcíny pódia bodov 3 a4, vyznačujúci sa tým, že infekcia buniek naprodukciu virusu sa robí buď tak, že bun- ynAlezu ková suspenzia s obsahom 5 až 10.10B .ml-1buniek v rastovom médiu sa infikuje viru-sem pri MOI najmenej 0,0001 na buňku, in-kubuje pri 36 až 38 °C počas 30 až 60 minút,potom sa 10- až 20krát nariedi v rastovommédiu, vyleje do kultivačnej nádoby a kul-tivuje pri teplote 36 až 38 °C až do zberu vi-rusu, alebo buňková suspenzia s obsahom4 až 8.105.ml_1 buniek v rastovom médiusa infikuje vírusom pri MOI najmenej 0,0001na buňku a Inkubuje pri 36 až 38 °C až dozberu virusu, alebo do kultivačných nádobsa nasadzuje buňková suspenzia v rastovommédiu s obsahorn 4 až 8.105.ml_1 buniek,a kultúry sa po 4- až 6hodinovej inkubáciipri 36 až 38 °C infikujú priamo do rastovéhomédia vírusom pri MOI najmenej 0,0001 nabuňku a inkubujú až do zberu virusu.
6. 6. Sposob výroby vakcíny pódia bodov 3až 5, vyznačujúci sa tým, že sa k virusovýmsuspenziám přidává po ukončení inkubácielyofilizačné médium, ktoré obsahuje sacha-rózu, fosforečnanový pufor, glutamát sodnýalebo draselný, bovinný albumin alebo inýzdroj bielkovín a želatinu alebo dextrán azmes sa uchovává až do lyofilizácia v zmra-zenom stave pri teplotách vyšších ako —20stupňov Celsia, alebo sa lyofilizuje okamži-té.