CS203691B1 - Způsob přípravy suspenze atenuovaného viru - Google Patents

Description

Vynález se. týká způsobu přípravy suspenze atenuovaného viru v buněčných, například tkáňových kulturách.

Podle dosud známého způsobu se produkční buňky vypěstují pří teplotě +36 az +37 °C do většího nebo menšího nárůstu, zpravidla v období 1 až 2 týdnů. Narostlé kultury se naočkují zvolenou. dávkou příslušného virového kmene. Udržovací médium v prvém období po infikování obvykle obsahuje inaktívované telecí sérum, podobně jako médium růstové. Inkubace infikovaných kultur se provádí zásadnč při teplotách nižších než +36 °C až +37 °C, snížená teplota v období reprodukce viru je nutná pro zachování atenuace, tj. oslabení toho kterého kmene. V určitém stupni rozvoje infekčního procesu v kultuře se z buněk do média počíná uvolňovat virus. V této době se kultury opláchnou bezproteinovýra médiem, které pak též slouží jako médium, do kterého se virus vyplavuje. Takto získaná virová suspenze je výchozím materiálem k přípravě očkovací látky, pokud pro nedostatečný obsah aktivního viru nebo i z jiných důvodů nemusí být vyřazena.

Při užití dosud známých způsobů přípravy suspenze atenuovaných kmenů je uspokojivé koncentrace aktivního viru dosahováno jen obtížně, zvláště u kmenů více atenuovaných, méně adaptovaných na daný buněčný substrát, nebo při dále snížené reprodukční teplotě. Nízký obsah aktivního viru v získané virové tekutině úměrně limituje množství finálního produktu, jednotlivé zisky nebo eventuálně celé výrobní šarže virové tekutiny o nízkém titru je nutno vyřazovat.

Tím vším se značně zvyšují náklady na přípravu jedné očkovací dávky vakciny.

Málo uspokojivá reprodukce atenuovaných virových kmenů je pravděpodobně odrazem změny teplotního režimu kultury po infikování, teplotního soku, kdy tkáňová kultura narostlá při +36 °C až +37 °C musí komplex svého buněčného metabolismu adaptovat na teplotu nižší, nutnou k reprodukci atenuovaného viru.

Účelem vynálezu je odstranit uvedené nedostatky.

Vynález si klade za úkol vytvořit takový způsob přípravy suspenze atenuovaného viru v.bu203691 něčných, například tkáňových kulturách, u kterého by se dosáhlo zvýšení výtěžku‘aktivního viru pro přípravu živé očkovací látky a u kterého by se téměř zcela zabránilo nutnosti vyřazovat virovou suspenzi pro nedostatečný obsah aktivního viru.

Vytčený úkol se řeší způsobem podle vynálezu, jehož podetata spočívá v tom,, že po celou dobu nárůstu buněk kultury se na kulturu působí stejnou ínkubační teplotou, jako je teplota nutná pro poranožování získávaného atenuovaného viru.

Podle výhodného provedení je teplota, kterou se působí při nárůstu buněk kultury v rozsahu 30,0 až 35,5 °C.

Výhodné rovněž je, pokud se infikování a pomnožování získávaného atenuovaného viru provádí současně s nárůstem buněk kultury. Je samozřejně možné jej provést í po nárůstu buněk kultury.

Hlavní výhody způsobu podle vynálezu spočívají v tom, že přináší podstatné Snížení nákladů na přípravu jedné očkovací dávky vakciny. Z jedné a téže šarže buněk lze získat suspenzi s mnohonásobně vyšším množstvím viru. Podstatně vyšší obsah aktivního viru v získávané suspenzi umožňuje zvýšení počtu očkovacích dávek připravených z j.edné šarže buněčných kultur, tj. zvýšení objemu produkce bez rozšiřování kapacit pro přípravu virové suspenze. Využití ’ se příznivě projeví také úsporou nákladů na kontrolní testy, lepším využitím prostoru hlubokomrazicích zařízení, možností zjednodušení pracovního postupu, zkrácením výrobního cyklu a snížením rizika manipulační kontaminace kultur.

Obecně lze tedy uvést, že buňky produkční kultury se v průběhu nárůstu inkubují při stejné teplotě, jako je teplota, užívaná k reprodukci daného atenuovaného kmene viru, tj. v zásadě vždy při teplotě nižší než +36 až +37 °C . Virové inokulum lze na kultivované buňky aplikovat běžným způsobem na více nebo lépe na méně narostlé kultury, sé zvláštní výhodou již na suspenzi pří zakládání kultury. Ve vhodném období, například před nástupem infekčních změn v kultuře, respektive v době dosažení konfluentního nárůstu buněčného ínokula, se kultury opláchnou a dále udržují v bezproteinovém médiu, do něhož sě uvolňuje virus. Některým ze známých způsobů /Mareš et al. , J. Hyg..Epidemiol. Microbiol. Immunol., 10, 94-101, 1966; Dřevo a časný, A0 142 021/ se pak provádějí zisky virově tekutiny, která po kontrolních zkouškách slouží k přípravě konečného produktu.

V dalším jsou uvedeny dva příklady způsobu přípravy suspenze atenuovaných kmenů podle vynálezu.

Přikladl.

. Příprava suspenze atenuovaného kmene AA viru parotitidy ÚSOL v 5. pasáži na primárních kulturách buněk psích ledvin.

Zdrojem buněk pro kultury k pomnožování viru je zdravé štěně do stáří Šesti měsíců z kontrolovaného chovu psů druhu beagle. Sterilně odebrané ledviny se zbaví pouzdra, pánviček a kalichů a ze zbylé ledvinné kory se běžným způsobem pomocí trypsinizace připraví suspenze buněk v laktolbuminhydrolyzátovém médiu VEL” /komerční produkt SEVAC III/ s 10 % inaktivovaného telecího séra a .94 mg % NaHCO,., tj . 1,25 ml 7,5% roztoku na 100 tni média, která se v médiu * 7 stejného složení naředí na koncentraci 10 buněk ve 150 ml média.

Tato suspenze se po 150 ml rozplní do požadovaného množství lahvi podle Rouxe obsahu 1 200 ml pro kontrolní kultury, Do zbývájící suspenze, určené k vlastní produkci virové tekutiny, se přidá inokulum atenuovaného kmene ΛΑ viru parotitidy ÚSOL v dávce nutné pro dosažení . -3 —2 multiplicity inokula 10 až 10 num TKID^q na jednu buňku. Po dostatečném promícháni se směs distribuuje do kultivačních lahví podle Rouxe v dávce po 150 ml. Kontrolní i infikované kultivační lahve se pak po zazátkování uloží v horizontální poloze a inkubují se při teplotě + 34 °G do nárůstu konfluentní kultury, tj, zpravidla 6^-dní . Pak se kultury i vnitřní povrch kultivační nádoby opláchnou bezproteínovým médiem, Parkerovým médiem 199 s 117 mg % NaHCO^, které pak slouží jako udržovací.

Při nástupu morfologických změn v kulturách vyvolaných počínajícím infekčním procesem se počítá provádění zisků virové suspenze známým způsobem, např, podle čs. autorského osvědčení č. 142 021.

Získaná virová tekutina se dále'zpracovává postupem obvyklým při přípravě vakciny.

V konkrétním případě bylo způsobem podle vynálezu v průběhu 21 dní po infikování provedeno celkem gest zisků o průměrném títťu 5,8 log TKID^ /ml, min. ₌ 5,2, max. = 6,3, zatímco při dosud běžném způsobu, provedeném souběžně, ani jeden ze Šestí zisků, průměrný títr 4,1 log TKlD^₀/ml, neposkytl virovou suspenzi o titru 5,0 log ΤΚΙβ^θ/ιηΙ. Celkový zisk aktivního viru k 21. dni po infikování byl·způsob,em podle vynálezu 65krát vyšší než při postupu dosud známém. ...

Příklad 2

Příprava suspenze atenuovaného kmene BB viru parotitidy ÚSOL v 5. pasáží na primárních kulturách buněk psích ledvin.

Postup shodný s příkladem 1, k infikování však užito stěnovaného kmene BB viru parotitidy ÚSOL v multiplicitě ínokula 10 ⁰ nura ΤΚΙϋ^θ na jednu buňku a inkubační teploty +32 °C.

V konkrétním případe byly v průběhu s1edovanýchg14 dni po infikování titry získávané virové tekutiny-vyšší než 5 log ΤΚΙΟ^θ/ml, průměrná hodnota 6,8 log, zatímco u dosud známého, postupu jen cca 1/3 zisků virové tekutiny dosáhla hodnoty 5 log ΤΚΧϋ^θ/ιηΙ, průměrná -hodnota 4,7 log. Novým způsobem bylo dosaženo cca 50násobne vyššího celkového zisku aktivního víru.

Vynález se pochopitelně neomezuje na uvedené příkladyale lze jej uplatnit při přípravě různých virových očkovacích látek obsahujících aktivní atenuovaný kmen viru.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob přípravy suspenze atenuovaného viru v buněčných, například tkáňových kulturách infikováním a pomnožováním získávaného atenuovaného viru současně s nárůstem buněk kultury, anebo až pó nárůstu buněk kultury, vyznačený tím, že po celou dobu nárůstu buněk,kul tury se- na kulturu působí v rozsahu 30,0 až 35,5 °C stejnou inkubační teplotou, jako je teplota nu.tná pro pomnožování získávaného atenuovaného viru.