PT99838A - Processo para a preparacao de uma composicao farmaceutica contendo interleuquina-4 e metodo para aumentar a resposta imune a imunogenios em vacinas utilizando a referida composicao - Google Patents

Description

FUNDAMENTO DO INVENTO

Este invento está relacionado com cpmposições farmacêuticas compreendendo interleuquina-4 como ingrediente activo, para aumentar a resposta imune primária de um mamífero a imunogénios presentes em vacinas. 0 invento está também relacionado com a utilização de interleuquina-4 para a produção de um medicamento para aumentar a resposta imune primária de um mamífero a imunogénios presentes numa vacina assim como com métodos para aumentar uma resposta imune primária eficaz em mamíferos a imunogénios presentes em vacinas através da administração aos referidos mamíferos de uma quantidade eficaz de interleuquina-4 em associação com a referida vacina.

INTRODUÇÃO A interleuquina-4 [daqui em diante "11-4" mas também conhecida como Factor Estimulador de Células B 1, (BSF-1)] foi originalmente descrita por M. Howard et al., J. Exp. Med. (1982) Vol. 155, pp. 914-23 como factor de crescimento derivado de células T, distinto da IL-2, que permitia a cultura de tecidos a longo prazo de linfócitos B normais de murganho e que interactua-va com linfócitos B activados para manter a sua proliferação até 4 meses. Se bem que os explantes de linfócitos B mistos tenham sido usados para iniciar culturas, parece que os linfócitos B com fenótipo imaturo são especiaficamente aumentados pela IL-4 na cultura de tecidos. Ver por exemplo c. Perchei et al., J. Immunol. (1989), Vol. 142, 1558-1568. Em adição, G. Trenn et al., J. Immunol. (1988), Vol. 140, 1101-1106 descreve que 11-4 estimula o desenvolvimento de células T citotóxicas a partir da subpo-pulação Lyt-2+ dos linfócitos T murinos em repouso. Spits et al., J. Immunol. (1987), Vol. 139, 1142-47 descreve que IL-4 pode -3-

actuar como um factor de crescimento de células T em células humanas in vitro diferente de IL-2. >

0 gene de IL-4 de murganho foi clonado e expresso em células COS-7 [See T. Otsuka et al., Nuc Acids Res. (1987), Vol. 15, 333-334. O factor clonado tinha todas as actividades em cultura de tecidos observadas para o factor purificado a partir de sobrenadantes de culturas de células T. A clonagem e expressão do gene de IL-4 humano foi descrito por N. Arai et al., J Immunol. (1989), Vol. 142, 274-282 e T. Yokota et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1986), Vol. 83, 5844-5848 com o factor produzi-doem células COS-7 tendo actividades semelhantes à molécula nativa conforme estudado em cultura de tecidos. Como IL-4 foi estudado tanto em sistemas celulares murinos e humanos , outras actividades in vitro foram atribuídas â molécula: i) IL-4 desempenhou um papel importante na indução e regulação da síntese de IgE, um processo que ocorreu à medida que foi induzida a proliferação de subpopulações de linfócitos B [Ver Pene, J. Proc. Nat. Acad. Sei. (1988), Vol. 85, 6880-6884]; IL-4 induziu receptores Fce (CD23) em linfócitos B humanos normais em cultura de tecidos [Ver T. De France et al., J. Exo. Med. (1987), Vol. 165, 1459--1457]; iii) IL-4 interactuou com outras linfoquinas, principalmente interferão-gama [Ver R.L. Coffman et al., Imunnol. Res. (1988), Vol. 102, 5-27 e S. Romagnani et al., supra1 e células T [Ver R. L. Coffman et al., supra, s. Romagnani et al. supra e M-D. Widmer et al. Nature, (1987), Vol. 326, 795-98] para resultar na proliferação e alteração de células B; (iv) a secreção aumentada por 11-4 de classes específicas de anticorpos e.g. Ig por células B humanas [Ver K.H. Grabstein et al. J. Immunol. (1987), Vol. 139, 1148-1153; F. Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sei (1986), Vol. 83, 2061; e A. Zlotnik et al., J. Immunol. (1987), Vol. 138, 4275-4279]; e (vi) expressão aumentada do antigénio MHC Classe II por IL-4 em células B em repouso (R. Noelle et al., PNAS 81: 6149-6153, 1984). T.R. Mosmann et al., em J.~~ TMimhnl . r Vol. 138, 1813-1816 descreveu que IL-4 humano e murino que são 50% homólogos na sequência de aminoãcidos 1-90 e 129-149 eram específicos de espécie. A utilização de IL-4 para aumentar a resposta imune a desafios antigénicos infecciosos e.g. infecções crónicas provocadas por vírus, bactérias, fungos ou protozoários está descrito nos Pedidos de Patente U.S. Ns de Série 07/496,832, entregue em 03/21/90 e correspondente Pedido de Patente PCT US-91/01733, entregue em 03/19/91.

SPMÃRIO DO INVENTO 0 presente invento proporciona uma utilização de IL-4 para a produção de um medicamento que aumenta a resposta imune primária de um mamífero a imunogénios presentes numa vacina por administração aos referidos mamíferos de uma quantidade eficaz de IL-4 em associação com a referida vacina. 0 presente invento também proporciona uma composição farmacêutica para aumentar uma resposta imune primária de um mamífero a imunogénios presentes numa vacina, a referida composição compreendendo uma quantidade de IL-4 eficaz para tal aumento e um veículo farmaceuticamente aceitável. O presente invento também proporciona um método para aumentar uma resposta imune primária em mamíferos a imunogénios presentes numa vacina que compreende a administração aos referidos animais de uma quantidade de IL-4 eficaz para tal prevenção em associação com a referida vacina. o presente invento também proporciona um método para aumentar uma resposta imune primária de um mamífero a imunogénios presentes numa vacina virai que compreende a administração aos referidos mamíferos de uma quantidade de IL-4 eficaz para tal indução em associação com a referida vacina. O presente invento ainda proporciona um método para aumentar uma resposta imune primária em mamíferos a imunogénios presentes numa vacina toxóide do tétano que compreende a administração aos referidos mamíferos de uma quantidade de IL-4 eficaz para tal fim em associação com a referida vacina toxóide do tétano. 0 presente invento também proporciona um método para aumentar uma resposta imune primária em mamíferos a imunogénios presente numa vacina em que a resposta imune primária pelo referido mamífero na ausência de IL-4 não é forte ou suficientemente rápida para evitar doença que se caracteriza pela administração aos referidos mamíferos de uma quantidade de IL-4 eficaz para tal fim em associação com a referida vacina. O presente invento também proporciona um kit para aumentar a resposta de anticorpos primários de um mamífero a imunogénios numa vacina que compreende (1) um recipiente de uma composição farmacêutica de IL-4 e um veículo farmaceuticamente aceitável e (2) um recipiente da composição farmacêutica de uma vacina e um seu veículo farmaceuticamente aceitável.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 ilustra a cronologia da resposta imune conseguida por administração de IL-4 recombinante e uma vacina toxóide do tétano a macacos cinomolgus de acordo com o presente invento.

As Figuras 2-5 ilustram graficamente o aparecimento de anticorpos contra o tétano em função do tempo à vacina de toxóide do tétano no modelo de macaco cinomolgus por administração de 0,5 μ9/Ι^ e 20 /xg/Kg de IL-4 recombinante humana e uma vacina toxóide do tétano de acordo com o presente invento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO E DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS

Surpreendentemente encontrámos que a administração a macacos cinomolgus de IL-4 recombinante humana (daqui em diante "rhIL-4") simultaneamente com uma vacina toxóide do tétano resultou num aumento da resposta imune primária nos macacos. Este resultado é particularmente surpreendente uma vez que quando rhIL-4 foi administrado a macacos cinomolgus durante a inoculação do reforço com o vírus recombinante da hepatite B (rHBVax) cerca de dois meses após a administração da vacina rHBVax e igualmente quando IL-4 foi administrado a macacos cinomolgus durante a inoculação de reforço com a vacina Salk de poliovírus inactivado cerca de um mês após administração da vacina Salk de poliovírus inactivado, não se observou resposta secundária ou de memória. Os métodos deste invento para proporcionar administração de IL-4 com uma vacina tem as vantagens que se seguem. A quantidade antigéni-ca total de vacina a ser administrada pode ser reduzida uma vez que menos antigénio na presença de IL-4 induzirá uma resposta imunológica equivalente à conseguida pela administração da vacina acima. Uma vez que será necessário menos antigénio por vacinação através da administração de IL-4 de acordo com este invento, a probabilidade de efeitos secundários indesejáveis associados a algumas vacinas normalmente usadas seria reduzida. Ainda, uma vez que é necessário menos imunogénio para se conseguir protecção

I eficaz, o custo global da vacina por paciente seria mais baixo. A resposta imune de certo tipo de indivíduos que responde fracamente à vacinação seria aumentada pela administração de IL-4 de acordo com este invento. Tais tipos de indivíduos que deverão beneficiar dos métodos deste invento incluem (1) os tipos tendo impedida a capacidade de resposta imune, tais como crianças nascidas com certas imunodeficiências, (2) indivíduos presumida-mente normais que não respondem a certas vacinas assim como (3) indivíduos que vão sofrer terapias imuno-supressoras incluindo radiação, corticosteróides, etc.

Assim, também descobrimos métodos eficazes de (1) aumentar uma resposta imune primária eficaz em tais mamíferos a imunogénios presentes numa vacina; (2) aumento de um nível eficaz de anticorpos em mamíferos expostos a imunogénios em vacinas; e (3)aumento de uma resposta imune primária em mamíferos a imunogénios presentes numa vacina em que a resposta imune pelo referido mamífero na ausência de IL-4 não é suficientemente forte ou suficientemente rápida para evitar a doença. A resposta imune pelos referidos mamíferos na ausência de IL-4 pode são ser suficientemente forte ou rápida para evitar a doença nos referidos mamíferos mas encontrámos métodos eficazes que compreendem a administração a tais mamíferos de uma quantidade de IL-4, preferencialmente IL-4 recombinante humana, eficaz para tais fins.

As vacinas contempladas para usar de acordo com com este invento incluem vacinas bacterianas, vacinas toxóides (toxinas inactivadas) e vacinas virais ou suas mistruas ("anti-génios múltiplos") usadas para imunização activa no homem. Ver por exemplo o capítulo entitulado "Agentes Imunizantes" em Remington's Pharmaceutical Sciences 14a Edição 1990 Mack Publishing Co. p 1426-1441 e as anti-toxinas, toxóides, vacinas e vacinas vivas aprovadas pela FDA e apresentadas numa lista na p. 210 (Product Category Index) do Physicians' DesK Reference, 44â Ed. 1990. Vacinas bacterianas adequadas incluem vacinas bacteria-nas contra as seguintes entidades ou estados de doenças: cólera, tosse convulsa, peste, febre tifoide, meningite, penumonia pneumocõccica, H. influenza tipo B, lepra, gonorreia, meningoco-cus Grupo B e estreptococus Grupo B, sépsia por Gram-negativos, sêpsia por E. coli e Pseudomonas aerucrinosa. Toxóides adequados incluem toxóide da difteria, toxóide do botulismo e toxõide do tétano. Vacinas virais adequadas incluem vacinas virais vivas e inactivadas contra as seguintes entidades ou estados de doença: poliomielite, sarampo, rubéola, febre amarela, papeira e hepatite B.

Os "antigénios múltiplos1· adequados incluem toxóides da difteria e do tétano, o triplo antigénio dos toxóides da difteria, tosse convulsa e tétano tais como as disponíveis dos Connaught Laboratories, Inc. Swiftevar, PA 18370.. A variedade selvagem das estirpes virais e substratos celulares usados nos diferentes países e protocolos de imunização estão descritos na Tabela 10-6 e 10-7 respectivamente do Capítulo 10 entitulado "Imunização contra doenças virais" na página 4, linha 27, páginas 283-301 de um livro de D.O. White F. Fenner Medicai Virolocry·. (1986) 33 Edição, Academic Press Inc. Orlando, Fia.).

O termo "em associação com" tal como aqui é usado refere-se â administração de IL-4 em simultâneo, durante ou imediatamente antes ou após a administração da vacina. Por exemplo, IL-4 pode ser administrado durante 10 a 14 dias antes e apôs a administração da vacina adequada. Normalmente, adminis-trar-se-ia IL-4 antes da administração da vacina adequada durante um tempo suficiente para se obter níveis estáveis de IL-4 no tecido linfóide no mamífero. Tais níveis são determinados pela utilização de medições farmacocinéticas convencionais. A administração de IL-4 seria continuada após a vacina ser administrada no período durante o qual os imunogénios presentes na vacina a serem processados pelo sistema imune do mamífero e durante um tempo suficiente para permitir que IL-4 proporcione uma maior resposta imune. A vacina a ser administrada pela via e força recomendada para cada espécie usada.

Qualquer IL-4 adequada pode ser empregue no presente invento. DNAs complementares (cDNAs) para IL-4 foram recentemente clonados e sequenciados por uma série de laboratórios, e.g. Yokota et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. (1986) Vol. 83:5894--5898 (humano); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1986) Vol. 83.:2061-2065 (murganho); Noma et al., Nature (1986) Vol. 319: 640-646 (murganho); e Genzyme Corporation, Boston, Massa-chutsetts (humano e murganho). Ainda, IL-4 não recombinante foi purificada a partir de vários sobrenadantes de cultura, e.g. Sanderson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1986) Vol. 83: 437-440 (murganho); Grabstein et al., J. Exp♦ Med♦ 81985) Vol. 163: 1405-1413 (murganho); Ohara et al., J. Immunol. (1985) Vol. 135:2518-2523 (BSF-1 de murganho); Butler et al., J. Immunol. 133: (1984) Vol. 251-255 (BCGF humano); e Farrar et al., J. Immunol.. (1983) Vol. 131: 1838-1842 (BCGF de muragnho). A descrição de todos os artigos acima referidos são aqui incluídos como referência pelos seus ensinamentos de sequências de DNA e aminoácidos e dos métodos de obtenção de materiais de IL-4 adequados para usar no presente invento.

Preferencialmente, a IL-4 usada no presente invento é IL-4 humana e mais preferencialmente ela é a versão humana com a sequência descrita em Yokoto et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1986), Vol. 83: 5894-5898 e Pedido de Patente PCT N2 87/02990 publicada em 21 de Maio 1987 que é expressa e isolada a partir de E. coli (Pedido de Patente U.S. N2 079,666, entregue em 29 de

Julho de 1987 e Pedido de Patente U.S. N2 194,799, entregue em 12 de Julho, 1988). A produção de IL-4 a partir de células CHO está descrita no Pedido de Patente U.S. SN 386,937, entregue em 28 de Julho, 1989. A produção de IL-4 a partir de E. coli está descrita no Pedido de Patente U.S. SN 429,588 entregue em 31 de Outubro, 1989. As descrições do artigo acima, Pedido de Patente PCT e Pedidos de Patente U.S. são aqui incluídos como referência. 0 termo "quantidade eficaz" como aqui é usado relativa-mentre à quantidade eficaz de 11-4 administrada de acordo com este invento significa uma quantidade de IL-4 que produz um aumento no nível de anticorpos suficiente para proporcionar uma maior protecção do agente infeccioso. 0 aumento preciso no nível de anticorpos que poderá ser considerado significativo pode ser pequeno. A quantidade eficaz de IL-4 administrada é tipicamente 0,25 a 15 microgramas de IL-4, preferencialmente IL-4 humana produzida por via recombinante a partir de E. coli ou células CHO, por quilograma de peso de corpo por dia é prencialmente administrada. Mais preferencialmente, administra-se a mamíferos 0,25 a 5 microgramas de rhIL-4 por quilograma de peso de corpo por dia e mais preferencialmente administra-se a mamíferos 0,25 a 1 microgrma de hIL-4 por quilograma de peso de corpo por dia. A quantidade, frequência e período de administração variará dependendo de factores tais como o nível dos títulos de anticorpos específicos, a classe de anticorpos a ser induzida, o tipo de vacina assim como a idade do doente, nutrição, etc. Geralmente, a administração de IL-4 será diária inicialmente e poderá continuar periodicamente durante a vida do doente. A quantidade e frequência da dosagem pode ser determinada durante despistes iniciais do título do anticorpo específico e do grau de efeito da IL-4 sobre o aumento dos títulos de anticorpos. A administração da dose pode ser intravenosa, nasal, parenteral, oral, subcutânea, intramuscular, tópica, transdérmica ou qualquer outro método adequado. A IL-4 pode ser administrada por uma série de formas de dosagem convencionais. As preparações parenterais incluem soluções estéreis ou suspensões. A administração por inalação pode ser na forma de um vaporizador nasal ou oral ou por insuflação. As formas de dosagem tópicas incluem cremes, pomadas, loções, sistemas transdérmicos (e.g., do tipo reservatório convencional ou matrix de implante) e similares.

As formulações das composições farmacêuticas contempladas pelas formas de dosagem acima podem ser preparadas com excipientes convencionais farmaceuticamente aceitáveis e aditivo usando técnicas convencionais.

Presentemente, a IL-4 é preferencialmente administrada por via intravenosa. A solução a ser .administrada pode ser reconstituída a partir de pós liofilizados e eles podem adicio-nalmente conter preservativos, tampões, dispersantes, etc.

Preferencialmente, IL-4 é reconstituído com tampão citrato 10 milimolar de pH adequado e água estéril sem preservativos com a concentração máxima não excedendo 100 μg por mililitro e administrado por infusão intravenosa continua ou por injecção intravenosa. Para infusão contínua, a dose diária pode ser adicionada a 5 ml de soro fisiológico normal e a solução infundida por bombeamento mecânico ou por gravidade. MATERIAIS E MÉTODOS: A IL-4 recombinante humana usada nas experiências que se seguem foi derivada de células CHO e o método da sua -12-

preparação está descrito no Pedido de Patente U.S., SN 386,937, entregue em 29 de Julho, 1989. PROJECÇÃQ DAS EXPERIÊNCIAS ϊ MACACOS:

Macacos Cinomolgus, machos adultos adquiridos do Sudeste Asiático foram adquiridos de uma fonte comercial, e.g. Hazelton e Charles River Laboratories. Todos os macacos estiveram em quarentena durante um mínimo de 90 dias antes de serem usados. TOXÔIDE DO TÉTANO E INOCULAÇÃO DE ANIMAIS: A vacina toxõide do tétano usada nesta experiência foi

R o fluido de toxóide do tétano purgonado obtido dos laboratórios Ledele, Pearl River, NY 10965.

Quinze (15) macacos cinomolgus adultos foram infectados com citomegalovírus de primatas (PCMV) antes deste estudo começar. Naquela altura, todos os animais apresentaram um título mensurável de anticorpo do PCMV. A finalidade de incluir este controle interno foi testar se o tratamento com IL-4 afectaria inespecificamente os níveis de anticorpos. Não se esperaria que IL-4 produzisse um aumento dos anticorpos contra PCMV uma vez que não foi administrada uma vacina. Os processos convencionais usados para medir as respostas de anticorpos foram radioimuno-ensaio para PCMV e radioimunoensaio em fase sólida (ver Berzo-fasky, J.A. et al. "Antigen-Antibody Interactions and Monoclonal Antibodies" p315-356 de 11 In Fundamental Iromunoloav". (1982) 2^ Edição (W.E. Paul ed.) Raven Press N.Y., N.Y. para a vacina rHBVax e Salk de poliovírus inactivado. A colheita de sangue para ensaios de PCMV e anticorpos contra toxóide do tétano foram feitos uma vez por semana durante nove semanas (2 a 7 da Figura 1) antes da admninistração de IL-4 e duas vezes por semana durante 22 semanas do estudo (8 a 30). A administração intravenosa de rhIL-4 duas vezes por dia (níveis de dose entre 5,0 e 20,0 jug/Kg/dia. B.I.D.) e placebo foi iniciada no meio da semana 8 até ao meio da semana 12 e continuou durante um total de 25 dias. A vacina de toxóide do tétano (0,5 ml contendo 5 unidades Lf de toxóide do tétano) foi administrado por injecção intramuscular a cada um de 15 macacos no dia 11 da administração de rhIL-4. Os resultados da determinação do título de anticorpo do tétano para os três grupos (resultados médios do grupo) estão apresentados na Figura 2 e Tabela I. A Figura 2, ilustra graficamente a resposta aumentada do grupo de 5^g/Kg/dia comparado com a testemunha e grupos de 20 ^g/Kg/dia. A respostado grupo 5μg/Kg (mostrado nas Figuras 2 e 4) foi estastiticamente significativa comparado com a resposta do grupo controle apresentado nas Figuras 2 e 3. A Tabela I mostra que (1) nas semanas 4-6 após a vacinação contra toxóide do tétano, o grupo recebendo 5^g/Kg de IL-4 tinha um título de anticorpos estatisticamente superior ao grupo testemunha de placebo; (2) nas semanas 7-9 após vacinação, ambos os grupos que tinham recebido IL-4 (5,0 Mg/Kg e 20 μg/Kg) tinha um título mais alto de anticorpos contra o tétano que os grupos testemunha placebo.

Tabela 1

Resposta de anticorpos à vacina primária do tétano:

Efeito de IL-4.

Grupo Nivel da Dose de IL-4(1) Sem.11 Sem.12-13 Sem.14-16 Sem.17-19 I 0 37±2i(2) 21271606 24561488 12231139 II 5 49130 21781529 53331697 39731631 III 20 46120 15601228 23551152 16771227 (1) - Mg/Kg de peso do animal. (2) - Os valores representam o título médio de anticorpos durante o período de tempo; N=5 macacos por grupo. (± = S.E.M.).

Face aos resultados das Experiências acima espera-se que IL-4, preferencialmente rhIL-4, aumente uma resposta imune em mamíferos após exposição primária a uma vacina em que a resposta imune pelos referidos mamíferos não é suficientemente forte ou rápida para evitar a doença.

Resultados semelhantes seriam de esperar para as vacinas bacterianas e virais e suas misturas com toxõides.

Claims (3)

1. \ ; REIVINDICAÇÕES ia. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para aumentar uma resposta imune primária de um mamífero a imunogênios presentes numa vacina, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade de interleuqui-na-4 (IL-4) eficaz para tal aumento e um veículo farmaceuticamen-te aceitável, em que a IL-4 é administrada parentericamente e a quantidade de IL-4 administrada está na gama de 0,25 a 15 micro-gramas por quilograma de peso do corpo por dia.
2. 2^. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a IL-4 ser administrada ao referido mamífero juntamente com a referida vacina.
3. 3&. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por ser administrada IL-4 humana, preferencialmente IL-4 humana recombinante derivada de E. coli. 4ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a vacina ser uma vacina virai ou uma vacina bacteriana ou uma vacina toxóide. 5â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a vacina toxóide ser a vacina toxóide do tétano. 6—. - Método para aumentar uma resposta imune priméria de um mamífero a imunogênios presentes numa vacina, caracterizado por compreender a administração ao referido mamífero de uma quantidade eficaz de IL-4 em associação com a referida vacina, em que a IL-4 é administrada parentericamente e a quantidade de IL-4 administrada está na gama de 0,25 a 15 microgramas por quilograma de peso do corpo por dia. 7 s. - Método de acordo com a reivindicação 6, caracte-rizado por a IL-4 ser administrada ao referido mamífero juntamente com a referida vacina. 8â. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 e 7, caracterizo por se administrar IL-4 humana, preferencialmente IL-4 humana recombinante derivada de E. coli. ga. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado por a vacina ser uma vacina virai ou uma vacina bacteriana ou uma vacina toxóide. 10§. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a a vacina toxóide ê a vacina toxóide do tétano. I lis. - Equipamento ("Kit”) para aumentar a resposta de anticorpos primária de um mamífero a imunogénios numa vacina, caracterizado por compreender (1) uma embalagem de uma composição farmacêutica de IL-4 e um veículo farmaceuticamente aceitável para ela e (2) uma embalagem de composição farmacêutica de uma vacina e um seu veículo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 18 de Dezembro de 1991

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